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SeenfatizalarecomendaciónquetodaslasmuestrasdeinfluenzatipoAnosubtificablesseanenviadasdeinmediatoparaeldiagnósticoylacaracterizaciónadicionalaunodeloscincoCentrosColaboradoresdelaOMSparalagripe.
21demayodel2009EstedocumentopresentainformaciónsobrelosmediosdediagnósticodisponiblesalafechaindicadaparaelvirusdelainfluenzatipoAhumana(H1N1)A/California/4/2009yvirussimilares.Lainformaciónsobreeldiagnósticoseactualizarácuándoéstaseencuentredisponible.Muestras Lasmuestrasmásapropiadassegúnlorecomendadoporlasinvestigacionesdelainfluenzaestacionalsonaquellasdeltractorespiratoriosuperior.Lasmuestrasdebentomarsedelosorificiosnasalesprofundos(hisoponasal),nasofaringe(hisoponasofaríngeo),aspiradonasofaríngeo,gargantaoaspiradobronquial.Todavíanosesabequémuestraclínicaproporcionaelmejorrendimientoeneldiagnóstico.La(s)persona(s)quetome(n)lamuestradebe(n)cumplirconlasprecaucionesapropiadasdetomademuestrasyaquepuede(n)exponerseasecrecionesrespiratoriasdelospacientes.Hastaahora,noexisteningunainformaciónsobreelvalordediagnósticodelasmuestrasnorespiratorias,porejemplo,muestrasdeheces.Muestrasdesueroagudoyconvalecientedebenusarseparaladeteccióndelostítulosascendentesdeanticuerpo.Pruebas de laboratorio Diagnostico molecular LosmediosdediagnosticomolecularsonactualmenteelmétodopreferidoparalainfluenzaA(H1N1)linajeporcino(swl)virus(A/California/4/2009yvirussimilares).Elusodeensayoscondiferentesgenesblancosesmásapropiadoparalaidentificacióndeestevirus.Lossiguientesgenesblancossonimportantes:genmatrizdelaInfluenzadetipoA;elgendelahemaglutininaespecíficodelvirusdelaInfluenzaA(H1N1)swlyelgendelahemaglutininaespecíficodelaInfluenzaestacionalAH1/H3yotrossubtipos.
Información de la OMS para diagnóstico de laboratorio del nuevo virus de la Influenza A (H1N1) en seres humanos
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Lossiguientesprotocolosestánactualmentedisponibles:PCRconvencionalespecíficoparainfluenzatipoAyRT‐PCRentiemporeal(véaseanexos1y2);RT‐PCRentiemporealdelosCDC(rRT‐PCR)paraladetecciónycaracterizacióndelainfluenzatipoA(H1N1)(versión2009)1ElanálisissecuencialdelproductodelPCRdelgenmatrizdelainfluenzatipoAusandoloscebadoresdelosprotocolosdelaOMS(véaseanexo1)diferenciaráentregenesMdelinajeporcinoyvirusH1N1estacionales.Sinembargo,unanálisisadicionaldebeserrealizadoparaconfirmarelorigendelvirus.Enestemomento,laspruebasdeRT‐PCRconvencionalestánsiendoevaluadas.Unaactualizaciónsepublicarácuandoestedisponible.Aislamiento y tipificación del virus mediante la inhibición de hemaglutinina o la inmunofluorescencia: SepuedenutilizarlosprotocolosvigentesparaelaislamientodevirusdelainfluenzaestacionalusandocélulasdeMDCKeinoculación devirusenhuevosembrionados,aunquesusensibilidadestáaúnpendientededeterminarse(véaseseccióndebioseguridadabajo).Loseritrocitosdepavos,pollos,conejillosdeindiasyhumanosseaglutinaránconelvirusdelainfluenzaA(H1N1)swl.LosanticuerpospoliclonalesespecíficosparaelsubtipoH1delosvirusdelainfluenzaestacionaldelkitdelaOMSnoreaccionaránconlapruebadeinhibicióndehemaglutinación(HAI)delvirusactualdelainfluenzaA(H1N1).LosresultadosobtenidosutilizandolosanticuerposmonoclonalesH1delkitdelaOMSnodebetomarsecomocomprobaciónconcluyenteyserecomiendarealizarunaverificaciónadicional.Pruebas de inmunofluorescencia rápida: Lasensibilidadyespecificidaddelaspruebasdeinmunofluorescenciarápidaenellugardeatención,diseñadasparaladeteccióndirectadelosvirusdelainfluenzatipoAsonactualmentedesconocidas.Unaactualizaciónsepublicarácuándoexistaevidenciadisponible.DeberecalcarsequeestaspruebasnodiferenciaránlainfluenzaestacionaldeladelvirusdeinfluenzadetipoA(H1N1)swl.
1 http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html
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Serología SeesperaquelaspruebasdeHAIylasreaccionesdemicro‐neutralizaciónempleandoelvirusdelainfluenzaA(H1N1)swlpuedandetectarrespuestasdeanticuerposdespuésdelainfección.Interpretación de los resultados de laboratorio
• PCR:UnamuestraseconsiderapositivasilosresultadosdelaspruebasusandodosdiferentesblancosdePCR(porejemplo,iniciadoresespecíficosparagenMygenporcinodehemaglutininaH1)sonpositivosperoelPCRparavirushumanoH1+H3esnegativo.SielPCRentiemporeal(RT‐PCR)parahemaglutininamúltiple(HA)(esdecir,H1,H3yH1delinajeporcino)daresultadospositivosenlamismamuestra,laposibilidaddecontaminacióndePCRdebeserprimeramenteexcluidaalrepetirelprocedimientodePCRusandoARNnuevoextraídodelamuestraoriginaloARNextraídodeotramuestra.SiserepitenlosresultadospositivosparalosblancosmúltiplesdeHA,existeentonceslaposibilidaddecoinfección,quedebeconfirmarsemediantesecuenciaciónocultivoviral.ElAnexo3muestraundiagramadeflujoparafacilitarlainterpretacióndelosresultadosdePCR.
• RT‐PCR en tiempo real de los CDC:Losresultadosdebeninterpretarsesegúnlo
descritoenelmanualdepruebasdeH1N1entiemporealdelosCDC.1
• Un resultado de PCR negativo no permite descartar que la persona pueda estar infectada por el virus de la influenza A (H1N1):Losresultadosdebeninterpretarseconjuntamenteconlainformaciónclínicayepidemiológicadisponible.LasmuestrasdelospacientescuyosresultadosdePCRsonnegativosperoparaquieneshayunaaltasospechadeinfecciónconH1N1debeninvestigarsemásafondoyseranalizadasporotrosmétodoscomoelcultivooserologíaviral,paradescartarinfecciónporinfluenzaA(H1N1)swl(véasediagramadeflujoenAnexo3).
• Serología:Unincrementocuádrupleenlosanticuerposneutralizantes
específicosdelvirusdelainfluenzaA(H1N1)indicainfecciónrecienteconelvirus.
• Secuenciación:enestaetapa,lasecuenciacióndealmenosunodelosblancos
esesencialparalaconfirmaciónporPCRconvencional.
• Aislamiento del virus:LaidentificaciónytipificacióndelcultivodevirusdeinfluenzapuedelevarseacaboporPCR,porlatécnicadelanticuerpofluorescenteindirecto(IFA),lapruebausandoanticuerposmonoclonales
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específicosdeNP,oelanálisisdeHAyelanálisisantigénico(subtipificación)porHAIusandoantisuerosdereferenciaseleccionados.
Referencia para la confirmación y caracterización adicionales: AloslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddediagnósticodelvirusdelainfluenzaAselesrecomiendaenviarlasmuestrasrepresentativasdeloscasossospechososdeinfluenzaA(H1N1),deacuerdoaladefinicióndecasodelaOMS2,aunodelosCentrosColaboradoresdelaOMSparainfluenza(WHOCCs).LasmuestrasconresultadosdelaboratoriopositivasparainfluenzaAperonosubtipificables(esdecir,negativasparainfluenzaA(H1)yA(H3));seconsiderancomonoconfirmadasdeacuerdoaloscriteriosdelaOMS)debenremitirseaunodelosWHOCCsparalaconfirmación.Loslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddeaislamientodelvirus(oquenotenganelnivelnecesariodemedidasdebioseguridad)debenremitirlasmuestrasacualquieradelosWHOCCs.EnadiciónalosreglamentospertinentesdeIATA,sedebenseguirlasnormasordinariasdealmacenamiento,envasadoyenvíodemuestrasdeinfluenza.Bioseguridad EltrabajodelaboratorioconmuestrasclínicasdepacientesconsideradoscomocasossospechososdeinfecciónporvirusdeinfluenzaA(H1N1)swlsedebenrealizaraplicandolasnormasyprocedimientosdeniveldebioseguridad2utilizandoelequipodeprotecciónpersonalapropiado(PPE).Todamanipulacióndemuestrasdebehacersedentrodeunacabinadebioseguridadcertificada(BSC).VerManualdebioseguridadenellaboratoriodelaOMS,3.ªed.3Actualmente,elaislamientoviralrequieremayoresmedidasdebioseguridad.Paralasrecomendacionesespecíficasver:GestióndelosriesgosbiológicosenloslaboratoriosdondesemanipulanmuestrashumanasquecontienenopuedencontenerelvirusdelagripeA(H1N1)queestácausandolasactualesepidemiasinternacionales.4
2 http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/interim_guidance/en/index.html 3 http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/ 4 http://www.who.int/entity/csr/resources/publications/swineflu/Laboratorybioriskmanagement_es.pdf
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Prueba de los algoritmos ElmétodogeneraldeladeteccióndevirusdelainfluenzaporPCR‐RTdebeconsiderarseenelcontextodelasituaciónnacional,porejemplo,cuántasmuestraspuedenprocesarse(producto),elblancoutilizadoparalasecuenciadelgenporPCR‐RT,ysiseutilizalacomprobaciónconcurrenteosecuencialdeM,NPygenesdeHAporPCR‐RT.Buenas prácticas de laboratorio Losprotocolosestándarparatodoslosprocedimientosdebenexistiryserrevisadosregularmente.Esfundamentalasegurarsequelosreactivosrecomendadosseusenymanejenadecuadamenteyaquelasreaccionessoncomplejasyproblemasinclusosóloconunreactivopuedentenerefectossignificativossobrelosresultadosobtenidos.Validación Todoslosprotocolosdebenservalidadosencadaunodeloslaboratoriosparaevaluarquesuespecificidadysensibilidadalusarlosmismoscontrolesencadarondaseanadecuadas.Aseguramiento de la calidad Losprotocolosdeaseguramientodelacalidadybuenasprácticasdelaboratoriodebenexistir.LaparticipaciónenlosejerciciosdeevaluacióndelosCentrosNacionalesdeInfluenza(Proyectodeevaluaciónexternadelacalidad)esaltamenterecomendadaparaconfirmarqueloslaboratoriosestánalcanzandounniveladecuadodesensibilidadyespecificidadensuspruebas.Capacitación del personal Lafamiliaridaddelpersonalconlosprotocolosyexperienciaenlainterpretacióncorrectadelosresultadossonpiedrasangularesparalaejecuciónexitosadelaspruebasdiagnósticas.Instalaciones y áreas de manejo Debenexistirinstalacionesadecuadasparaelmanejodemuestrasyreactivos(incluyendocadenasdefrío)conunaseparaciónapropiadaparalasdiferentesetapasdeRT‐PCRafindeprevenirlacontaminacióncruzada.Lasinstalacionesyelequipodebencumplirconelniveldebioseguridadapropiado.ElRT‐PCRdeberealizarseenunespacioseparadodelusadoparalastécnicasdeaislamientodevirus.
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Equipo Elequipodeequipodebeusarseymantenersedeacuerdoalasrecomendacionesdelfabricante.Anexo 1: Análisis de RT‐PCR convencional del gen matriz de los virus de Influenza de tipo A Protocolo Convencional de RT‐PCR 5 Acontinuaciónsepresentanlosprotocolosycebadores(oprimers)dePCRconvencionalyelectroforesisengeldeproductosparadetectarvirusdeinfluenzatipoAenmuestrasdesereshumanos.EstosprotocoloshandemostradoserampliamenteefectivosparalaidentificacióndelvirusdeinfluenzadetipoAcuandoselesutilizaconlosreactivosycebadoresindicados.SerecomiendaqueloslaboratoriosquetengandudassobrelaidentificacióndelosvirusactualmentecirculantescontactaraunodelosLaboratoriosdeReferenciaH5delaOMS6oaunodeWHOCCsparalainfluenza7afinderecibirayudaparalaidentificacióndeloscebadoresóptimosparasuusoMateriales requeridos • QIAamp®ViralRNAMiniKit(QIAGEN,Cat#52904.Otroskitsdeextracciónpueden
serusadosdespuésdehabersidosujetosaunaevaluaciónapropiada).• OneStepRT‐PCRKit(QIAGEN,,Cat#210212)• InhibidordeRNase20U/μl(AppliedBiosystems,Cat#N8080119)• Aguadestilada(libredeRNase)• Ethanol(96–100%)• Microcentrífuga(ajustablehasta13000rpm)• Pipetasajustables(10,20,200,and100μl)• Puntasparapipetaestériles(libresdeRNase)conbarreradeaerosol• Vortex• Tubosparamicrocentrífuga(0.2,1.5ml)• Termociclador(equipodePCR)• Conjuntodecebadores• Controlpositivo(estepuedesolicitarsealWHOCCenlosCDCdeAtlanta,EEUU)
5 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China (WHO H5 Reference Laboratory). 6 http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/referencelabs/en/ 7 http://www.who.int/csr/disease/influenza/collabcentres/en/
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Cebadores Gen:MVirusInfluenzaASecuenciasdecebadoresM30F2/08: 5`‐ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG‐3`M264R3/08: 5`‐TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG‐3`Tamañoesperadodelproducto244bp(referencia:NIID8) Procedimiento
1. ExtraerARNviraldelamuestraclínicaconelMiniKitQIAampViralRNAokitdeextracciónequivalente,deacuerdoalasinstruccionesdelfabricante.
2. RealiceelRT‐PCRdeunaetapa.• Sacarlosreactivosdesualmacén,déjelosdescongelaratemperatura
ambiente.Unavezdescongelados,manténgalosenhielo.• Prepararlamezclamaestra(operadaenhielo)• Agregarlosiguienteauntuboparacentrífugaymezclarlobien
agitándoloparaarribayparabajo10veces,(Nota:Afindeevitardiferenciaslocalizadasenlaconcentracióndesales,esmuyimportantemezclarlassolucionesantesdesuuso).
Reacción sin solución Q Aguadestilada(sinRNasa)9.5μlAmortiguador5xQIAGENRT‐PCR5.0μlMezcladedNTP1.0μlCebadorsentido(+)(10μM)1.5μlCebadorantisentido(‐)(10μM)1.5μlMezclaenzimática1.0μlInhibidordelaRNasa(20U/μl)0.5μlVolumentotal20.0μl/pruebaDistribuir20μldelamezclamaestraencadatubodereaccióndePCR.Añadir5μldeRNAdelamuestraalamezclamaestra.Paralasreaccionesdecontrol,usar5 μldeaguadestiladalibredeRNaseparacontrolnegativoy5μldelosRNAviralesadecuadosparacontrolpositivo.Programareltermocicladordeacuerdoalascondicionesdetermociclado.IniciarelprogramadeRT‐PCRmientraslostubosdePCRseencuentrenaúnenelhielo.Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzadolos50˚C.LuegocolocarlostubosdePCReneltermociclador.
8 Primers designed by Laboratory at National Institute of Infectious Diseases (NIID), Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)
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Condiciones de ciclado de la temperatura para PCR Transcripcióninversa30min,50°CActivacióndelaPCRinicial15min,95°CCicladoentresetapasDesnaturalización30seg,94°CTemplado30seg,50°CExtensión1min,72°CNúmerodeciclos45Extensiónfinal10min,72°CMantener4°C3. Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT‐PCR Prepararelgeldeagarosa,cargarlosproductosdePCRyelmarcadordepesomolecular,ejecutardeacuerdoconlosprotocolosestándar.Visualizarlapresenciadelmarcadorconluzultravioleta.Materiales requeridos • Bandejaparageldeagarosaycámaradeelectroforesis• Suministroeléctricoyelectrodos• CajadeluzUV(302nm)• CámaraypelículaPolaroidocomputadoraconectadaalacámara• Pipetasajustables• Geldeagarosaal2%en1×TAE• Amortiguador1×TAE• Bromurodeetidio(10mg/ml)• 6xSoluciónamortiguadoraconcargadegel(GLB)Procedimiento A)Fundirungeldeagarosa:I. Colocarunabandejaparafundicióndelgeldentrodeunabaseparafundiciónde
gel.Inserteunpeineynivelelabase.II. Prepararagarosaal2%pesando4gdepolvodeagarosaydisuélvalaen200ml1×
amortiguadorTAE.Disuelvaelagarcalentándoloenhornodemicroondas.III. Enfriarelagarderretidohastaaproximadamente60°C,yluegoagregue10μlde
bromurodeetidio.IV. Verterlaagarosaderretidaenunabandejaparafundicióndegel.V. Dejarqueelgelsesolidifiqueatemperaturaambiente.VI. Retirarelpeinedelmarco.
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VII. Colocarlabandejadentrodelacámaradeelectroforesisconlasfosasdelladodeloscátodos.
VIII. Llenarlacámaraamortiguadoracon1×TAEaunnivelquepuedacubrirlapartesuperiordelgel.
B)Cargadelasmuestras:I. Agregar5μldeGLBdePCR.II. Cargarelmarcadordepesomolecularenlafosadelgeldeagarosa.III. Pipetear15μldelproductodePCR/GLBenelgel.IV. Cerrarlatapadelacámarayconecteloselectrodos.Correrelgela100Vdurante
30–35min.V. VisualizarlapresenciadebandasdemarcadoresyproductosdePCRconluzUV.VI. Documentarlaimagendelgelconunafotografía.Interpretación de los resultados EltamañodelosproductosdePCRobtenidosdebecompararseconeltamañoesperadodelosproductos.Silapruebaseejecutasinuncontrolpositivo,losproductosdebenserconfirmadosmediantesecuenciaciónycomparaciónconlassecuenciasdisponibles.Anexo 2: Análisis de RT‐PCR en tiempo real de la matriz de los virus de Influenza de tipo A LaRTPCRentiemporealpresentadiferentesdesafíosencomparaciónconlaRT‐PCRconvencional.AdemásdelasconsideracionessobreRT‐PCRdescritasenelAnexo1,lasconsideracionesespecíficasparaRT‐PCRentiemporealincluyen:• Garantizarqueseusenymanipulencorrectamentelosequipos,elsoftwareylos
reactivosparafluorescenciaadecuados.• Garantizarlacapacitaciónadecuadadelpersonalparalainterpretacióndelos
resultados(esesenciallaexperienciaparareconocerlosverdaderospositivos,interpretacióndeloscontroles/valorCtyfluorescenciaaberrante,etc.).
• Parahacerdeterminacionescuantitativas,esesenciallavalidaciónenellaboratorioylaoptimizacióndelasreacciones.
• Haypocaprobabilidaddecontaminacióncuandosedescartanlasreaccionesdespuésderealizarlaspruebas.Sinembargo,muchoslaboratorioshacenanálisispostreacciónadicionales(porej.,polimorfismodelongituddefragmentosderestricciónusandogeles,secuenciación)quepuedenreintroducirlacontaminación.
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Protocolo de RT‐PCR en tiempo real9 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicosegúnsedescribeenelAnexo1:AnálisisdeRT‐PCRconvencionalMateriales requeridos TranscripciónInversaAmortiguadorI10XPCRcon15mMMgCl(AppliedBiosystems)Hexámeroaleatorio50μM(AppliedBiosystems)TranscriptasaInversadeMuLV50U/μl(AppliedBiosystems)InhibidordelaRNasa20U/μl(AppliedBiosystems)PCRentiemporealKitLightCycler®–FastStart™DNAMasterHybProbes(Roche)Cebadoresymezcladesondas:AgregarigualvolumendelossiguientescomponentesparaprepararloscebadoresylamezcladesondasparaH5ygenMCebadoresysondasVirusdeinfluenzatipoASecuenciadecebadoresFLUAM‐1F:5'‐AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA‐3'(10μmol/l)FLUAM‐2F:5'‐CATTGGGATCTTGCACTTGATATT‐3'(10μmol/l)FLUAM‐1R:5'‐CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC‐3'(10μmol/l)FLUAM‐2R:5'‐AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA‐3'(10μmol/l)FLUA‐1P:5'‐(FAM)‐TTTGTGTTCACGCTCACCGT‐(TAMRA)‐3'(5μmol/l)FLUA‐2P:5'‐(FAM)‐TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA‐(TAMRA)‐3'(5μmol/l)Elcebadoractivoylamezcladesondassepreparamezclandolos6reactivosenvolúmenesiguales.
9 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China, WHO H5 Reference Laboratory
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Procedimiento 1.RealizarRTutilizandolosreactivosquesemuestranenlasiguientetablaylasinstrucciones1‐3alcalcedelatabla.
Reactivo Volumen(μl)porreacciónAmortiguador10xPCRIcon15mmol/lMgCl2 2Extra25mmol/lMgCl2 2.82.5mmol/ldNTPs 8Hemámeroaleatorio50μM 1InhibidordelaARNasa20U/μl 1TranscriptasaInversa50U/μl 1ARNextraído 4.2
I. AgitarenVortexycentrifugareltuboconlamezclabrevemente(aprox.3seg.)II. Mantenereltuboatemperaturaambientedurante10minutosyluegoincubara
42°Cporlomenosdurante15minutosIII. Incubareltuboa95°Cdurante5minutosyluegoenfriarenhielo.
2.RealizarPCRentiemporeal
I. Prepararlamezcladereacción“HotStart”pipeteandosuavemente60μldeSondasdeHibridaciónparaMezcladeReacciónLC‐FastStart™(frascoampolla1b)enelLC‐EnzimaFastStart™(frascoampolla1a).
II. Paracadamuestradepruebaycontrolespositivosynegativos,prepararlamezcladelreactivoconcebadoresymezcladesondasdeacuerdoconlosiguiente
Mezclamaestra:
Reactivo Volumen(μl)H2OgradoPCR 7.6MgCl2(25mmol/l) 2.4Cebadoresymezclaparasondas 3Mezclaparareacción“HotStart” 2Volumentotal 15Cadareacción:Mezclamaestra 15ADNc: 5
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CondicionesdecicladodelatemperaturadePCR
Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)
No.deciclos
95 10:00 195 0:1056 0:1572 0:10
}50
40 0:30 1Protocolo de RT‐PCR en tiempo real10 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicocomosedescribeenAnálisisdeRT‐PCRconvencionalMateriales requeridos • QIAGEN®QuantiTect,EquipodeSondaparaRT‐PCR(#204443):
o 2xQuantiTect®,MezclaMaestradeSondadeRT‐PCRo QuantiTect®,MezclaRTo AguasinRNasa
• InhibidordelaARNasa• Cebadores• SondaTaqMan®MGB• Equipo:SistemadeDeteccióndePCRentiemporealChromo‐4™(BioRad);
LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche)PCRentiemporealLaPCRentiemporealserealizamedianteRT‐PCRdeunsolopasousandounasondaTaqMan®Cebadoresysondas:Gen:TipoA(M)SecuenciasdecebadoresMP‐39‐67For 5'‐CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC‐3'(10μmol/l)MP‐183‐153Rev 5'‐TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA‐3'(10μmol/l)
10 Protocol provided by National Institute of Infectious Diseases (NIID), Center for Influenza Virus Research, Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza).
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SecuenciadesondasMP‐96‐75ProbeAs 5'(FAM)‐ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG‐(MGB)‐3'(5pmol/μl)MezcladeReacción
Reactivo Volumen(μl)MezclaMaestraparaSondadeRT‐PCR2xQuantiTect® 12.5CebadorDirecto(10μM) 1.5CebadorInverso(10μM) 1.5SondaTaqMan®MGB(5pmol/μl) 0.5MezclaQuantiTect® 0.25AguasinRNasa 3.75Total 20Procedimiento
1) Distribuir20μldelamezcladereacciónencadaplacadereacciónparaRT‐PCR.
2) Agregar5μlARNdemuestraalamezcladereacción.Parareaccionesdecontrol,usar5μldeaguadestiladaparacontrolnegativo,y5μldeARNviralespositivosadecuadosparacontrolpositivo.
3) Programareltermocicladordeacuerdoconelprogramaquesedescribeacontinuación.
4) IniciarelprogramadeRT‐PCRentiemporealmientrasquelasplacasdereacciónparaRT‐PCRtodavíaestánenhielo.
5) Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzado50C.Luego,colocarlasplacasdereacciónparaRT‐PCReneltermociclador.
CondicionesdecicladodetemperaturadeRT‐PCR:SistemadedeteccióndePCRChromo‐4‐Real‐time(BioRad)
Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)
No.deciclos
50 30:00 195 15:00 194 0:1556 1:00
}45
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CondicionesdecicladodetemperaturadeRT‐PCR:LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche)
Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)
No.deciclos
50 30:00 195 15:00 194 0:15
(ramprate1.2oC/seg)56 1:00
(ramprate1.2oC/seg)Recopilacióndedatos
}45
Anexo 3: Algoritmo de prueba por PCR e interpretación de resultados