inf1. observacion de bacterias

I. INTRODUCCIÓN

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos.En esta primera clase aprenderemos y practicaremos la preparación de una muestra para tinción simple de bacterias, el procedimiento y posterior reconocimiento de sus estructuras individuales y en grupo.Se trabajaron con tres bacterias Escherichia coli, Staphylococcus sp y Bacillus sp, que nos ayudaron a lograr la tinción simple con facilidad, este método constituye una técnica simple y directa que a través del uso de colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno.

II. OBJETIVOS

- Ejecutar una preparación de muestra fija de bacterias para posterior tinción.- Observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos

aplicando un método simple de tinción.

III. MARCO TEÓRICO

PREPARACION DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS PARA TINCION Los microorganismos especialmente las bacterias, tienen poco contraste cuando se observan sin teñir al microscopio, por lo que se acostumbra teñirlos para aumentar el contraste con su entorno.La tinción es un método para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En la tinción generalmente se utiliza un colorante en el cual sus moléculas se absorben a una superficie. El uso de colorante permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. (Rodríguez, 2005)

COLORANTEEn esencia los colorantes son sales en las que uno de sus iones tiene color y se denomina cromóforo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica. Se pueden presentar en dos formas fundamentales: en sistemas conjugados pi o complejos metálicos; la tinción se da cuando se une el cromóforo a un componente celular. Los auxócromos es otro componente del colorante, son grupos funcionales o radicales que constituyen una molécula y poseen carga parcial positiva; tienen la función de intensificar la formación de color mediante la acción de grupos de átomos no saturados.Los colorantes se clasifican en básico, ácidos y neutros, según sea la carga del grupo cromógeno. La nigrosina y la fucsina acida son colorantes ácidos; en tato el azul de metileno, la fucsina básica (carbolfucsina), el cristal violeta, la safranina, el verde malaquita y el rojo neutro son colorantes básicos; algunos colorantes son neutros, como el Giemsa, el Wright y el Leishman. (Rodríguez, 2005)Los colorantes tienen las siguientes funciones:

1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes. 2. Revelan su forma y tamaño.3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas. 4. Producen reacciones químicas específicas.

En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos, secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Observación de bacterias UNALMcelulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Esta tinción dependerá de la compasión química de la célula microbiana (así como el pH del material que lo rodea) determina el colorante tomado por la célula. (Rodríguez, 2005)

TIPOS DE TINCION: De acuerdo a la reacción que ocurre

- Tinción Simple: Esta es una tinción directa que utiliza solo un colorante, el cual debe ser básico para que la célula bacteriana se tiña. Permite demostrar la morfología general de una célula de manera rápida; al emplearse un único colorante, todas las células se observaran del color del colorante empleado. (Rodríguez, 2005)La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán. Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde malaquita. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.

- Tinción Diferencial:El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción. Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.

BACTERIAS QUE OBSERVAMOS EN LABORATORIO

- Bacillus sp Los microorganismos del genero Bacillus son bacilos de gran tamaño (4-10 µm), Gram

positivos, aerobios estrictos o anaerobios facultativos encapsulados. Una característica importante es que forman esporas extraordinariamente resistentes a condiciones desfavorables.

Son móviles por la presencia de flagelos laterales, son catalasa positiva, presentando hemolisis variables y un crecimiento activo en un rango de pH 5.5 – 8.5. (Corrales, 2011)

- Staphylococcus sp Los miembros del genero Staphylococcus son catalasa positivos, son Gram positivos.

- Escherichia coli Es una bacteria que integra parte de la flora intestinal del hombre y de los demás animales.

Las Escherichia coli son inofensivas, sim embargo algunas pueden producir enfermedades.IV. PARTE EXPERIMENTAL

Ejercicio Nº1: Preparación de una muestra fija de bacterias para tinción

Materiales“La ciencia es el alma de la prosperidad de las naciones y la fuente de vida de todo progreso”

Louis Pasteur

Observación de bacterias UNALM Asa de kolle

Lámina porta objeto

Mechero de alcohol

Muestra conteniendo bacterias

Piseta con agua

Métodos

1. Coloque una gota de agua sobre una lámina porta objeto completamente limpia. Con ayuda del asa de kolle coloque sobre la gota una pequeña porción de la muestra a fijar. SI la muestra que contiene al microorganismo es líquida, puede aplicarse directamente sin la gota de agua.

2. Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película delgada.

3. Seque la lámina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.

Ejercicios Nº2: Tinción simple con colorantes básicos

Materiales

Aceite de inmersión

Colorantes básicos: azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta

Láminas fijadas de microorganismos

Papel secante

Piseta con agua

Soporte para tinción

Métodos

1. Coloque las láminas fijadas de microorganismas sobre el soporte para tinción.

2. Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que actúen por un tiempo de: 30 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta y 5 segundos para la carbolfucsina.

3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lámina con la piseta de agua.

4. Seque las láminas al aire o con papel secante.

5. Examine las preparaciones teñidas bajo el objetivo de inmersión (100-150X) de un microscopio compuesto.

“La ciencia es el alma de la prosperidad de las naciones y la fuente de vida de todo progreso”Louis Pasteur

Observación de bacterias UNALM6. Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamaño, forma y agrupaciones que

se presenten.

V. RESULTADOS

Antes del desarrollo de las técnicas de tinción el material debe ser fijado, esto es lo que hicimos en el ejercicio N°1, los resultados fueron los siguientes:

Resultados de las muestras fijadas con colorantes básicos para el ejercicio N°2:

1° Muestra vista en microscopio

Género: Staphylococcus sp

Colorante: Cristal violeta Forma: Cocos Agrupación: Racimo Grado de aumento: 1000x

Muestra vista en microscopio


La muestra del microrganismo ha sido fijada en el portaobjetos.

Muestra fijada de Escherichia coli usando el colorante carbolfucsina.

Muestra Colorante usado Tiempo de Reacción

Observaciones

Staphylococcus sp Cristal violeta 10 segundos Tinción apropiada

Bacillus sp Azul de metileno 20 – 30 segundos Tinción apropiada

Escherichia coli Carbolfucsina 5 segundos Tinción apropiada

Observación de bacterias UNALM

Género: Bacillus sp Colorante: Azul de metileno Forma: Bacilos (alargado) Agrupación: Estreptobacilos

(En cadena) Grado de aumento: 1000x

3° Muestra vista en microscopio

Especie: Escherichia coli Colorante: Carbolfucsina Forma: Cocobacilo Agrupación: No tiene Grado de aumento: 1000x

VI. DISCUSIONES

Observación de Escherichia coli

Se observó que presentan forma de coco bacilo y que carece de agrupación. Brock (2004), señala que entre las bacterias entéricas se encuentran especies patógenas para el hombre, animales y plantas. Son bacilos rectos gram negativos; móviles por flagelos peritricos o inmóviles; no esporulados; anaerobios facultativos, producen glucosa, catalasa positivo, pertenecen a la gamma Proteobacteria. Siendo una de ellas la Escherichia coli.

Brock (2004) afirma que los miembros del género Escherichia son habitantes universales de todos los animales de sangre caliente, incluido el hombre. Escherichia tienen una función nutricional en el intestino sintetizando vitaminas y en especial vitamina K. Como anaerobio facultativo que es, probablemente también contribuye a la anaerobiosis del ambiente del intestino grueso. Algunas cepas son patógenas y han sido implicadas en el desarrollo de cuadros diarreicos en niños. En personas de edad avanzada, es relativamente frecuente que ciertas estirpes de Escherichia causen infecciones de las vías urinarias o en aquellos pacientes que han sido tratados con radiaciones ionizantes. Estas cepas forman antígeno K, que permite la colonización del intestino delgado y producción de una enterotoxina que es la responsable de los cuadros diarreicos.

Observación de Staphylococcus sp

Según Brock (2004), bacteria gram positiva no esporulada con un bajo contenido de GC (guanina y citosina). Anaerobios facultativos y producen ácido de la glucosa tanto en aerobiosis como anaerobiosis. Son catalasa “La ciencia es el alma de la prosperidad de las naciones y la fuente de vida de todo progreso”

Louis Pasteur

Observación de bacterias UNALMpositivo, lo que permite diferenciarlos de las especies del género Streptococcus y otros géneros de cocos Gram positivos, que son relativamente tolerantes de medios con baja actividad de agua, resistiendo bastante bien hábitats secos y salinos. A menudo son pigmentados, lo que da una herramienta adicional para su identificación. Los estafilococos son parásitos comunes de los humanos y animales y ocasionalmente causan infecciones serias: se reconocen dos especies importantes en relación con los humanos, Staphylococcus epidermis, no patógeno y apigmentado que normalmente se encuentran en la piel y las mucosas y Staphylococcus aureus, de color amarillo y normalmente asociado con patologías como forúnculos, neumonía, osteomilitis, meningitis y artritis. Poseen tendencia a agruparse en racimos, tienen una forma esférica y un diámetro alrededor de 1 u.

Se observó en la práctica que presentan forma de cocos (redondos) y se agrupan en racimos, tal como se señala.

Observación de Bacillus sp

Según Zamudio (1998), el género Bacillus consta de bacilos grandes grampositivos, esporógenos con endospora generalmente central de forma cilíndrica o helicoidal; son aerobios estrictos o facultativos, catalasa positiva. Están ampliamente distribuidos en la naturaleza: suelos, vegetación, agua y aire. Únicamente nueve especies se han relacionado a procesos infecciosos en el humano.

Brock (2004) señala que las especies del género Bacillus presentan un bajo contenido de GC (guanina y citosina), crecen bien en medios definidos utilizando una pléyade de fuentes de carbono. Muchos producen enzimas extracelulares, como hidrolasas, que rompen polisacáridos complejos, ácidos nucleicos o ácidos grasos hasta unidades asimilables por las células; estos productos sirven como fuentes de carbono y donadores de electrones. Muchos producen antibióticos como son la bacitracina, poliximina, tirocidina, gramicidina y circulina. Las especies del género Bacillus son bastones con extremidades rectas o redondeadas de tamaños variables (0.5 * 1.2 um hasta 2.5*10 um), generalmente móviles gracias a sus cilios peritricos, lo cual se comprueba al observarse en la práctica que su forma era alargada y la agrupación en la que se distribuían era en forma de cadena.

VII. CONCLUSIONES

- A través del microscopio se pudo observar con ayuda del colorante las diversas agrupaciones: E. coli (no definida), estreptobacilos (lineal) y estafilococo (en racimos), además se puede observar los diversos tamaños de las bacterias.

- Para lograr una tinción exitosa para bacterias pequeñas, es importante la velocidad de reacción del colorante en términos de investigación.

- La tinción simple que se realizó ayudo a incrementar el contraste, debido a que las bacterias absorbieron el colorante y quedarán teñidas del mismo color.



VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las asociaciones más frecuentes en bacterias?

Al observarse al microscopio, las bacterias de una especie dada pueden encontrarse como células separadas (individuales) o formando agrupamientos característicos. Según las especies, las células pueden estar en parejas, en grupos irregulares, en cadenas o filamentos, en paquetes regulares de cuatro, ocho o más células o en forma de empalizada, un cierto número de células alargadas dispuestas adyacentemente en hilera lateral. Estas diferentes disposiciones de las células no resultan de la agregación de células previamente individuales; se forman debido a que las células de las diferentes especies se dividen (reproducen) de modos diferentes, y a que dos o más células pueden permanecer unidas tras el proceso de división celular. (Paul Singleton ,1999)Las células de muchos procariotas se mantienen juntas después de la división celular formando grupos, y estas asociaciones frecuentes son características de diferentes organismos. Los cocos que después de la división permanecen unidos en pares se denominan diplococos y los que permanecen unidos en forma de cadena se denominan estreptococos. Los cocos que se dividen en dos planos y permanecen unidos en grupos de cuatro se conocen con el nombre de tétradas, los que se dividen en tres planos y permanecen unidos en grupos de configuración cúbica se llaman sarcinas y los que se dividen en planos múltiples y forman grupos similares a racimos de uva o láminas amplias se denominan estafilococos.Los bacilos se dividen exclusivamente a través de sus ejes menores, de manera que la cantidad de grupos de bacilos es menor que la de cocos. La mayoría de bacilos se observan como bastones aislados. Los diplobacilos permanecen unidos en pares después de la división, mientras que los estreptobacilos forman cadenas. Otros bacilos son ovalados y se parecen mucho a los cocos, por lo que recibieron el nombre de cocobacilos.

2. ¿En qué rango de tamaños se definen las bacterias?


Observación de bacterias UNALMLas células bacterianas se miden habitualmente en micrómetros, µm (antes llamados micras, µ); 1 µm = 0,001 mm. Las bacterias más pequeñas miden en torno a 0,2 µm (por ej., las células de Chlamydia); en el otro extremo de la escala, algunas células de Spirochaeta son de unos 250 µm de longitud, pero la mayor bacteria ( 600 µm) es Epulopiscium fishelsoni, que habita en el intestino de pez cirujano (Acanthurus˂ nigrofuscus) [Angert, Claments y Pace (1993) Nature 362 239 - 241].Sin embargo, estos son casos extremos; en la mayoría de las especies las máximas dimensiones de una célula se encuentran en el rango de 1 a 10 µm. Nótese que las bacterias más pequeñas están en el mismo orden de tamaño que el límite de resolución de un buen microscopio óptico, en torno a 0,2 µm. (Paul Singleton ,1999)

3. ¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes?

Las células bacterianas varían ampliamente en forma, de acuerdo con las especies. Las células redondas o <esféricas>, de cualquier especie son llamadas cocos. Las células alargadas de cualquier especie se denominan bacilos. Los cocos no necesariamente tienen una forma esférica perfecta, y no todos los bacilos tienen exactamente la misma forma. Por ejemplo, algunos cocos tienen una forma más o menos arriñonada y algunos bacilos son afilados por los extremos (bacilos fusiformes) o son curvados (vibrios). Las células ovoides de forma intermedia entre cocos y bacilos, se llaman cocobacilos. Hay también dos tipos de células espirales unas que son más o menos rígidas (espirilos), y otros que son más flexibles (espiroquetas). Existen las llamadas “bacterias cuadradas”(bacterias cuadradas y planas) y “bacterias tipo caja” (bacterias angulares de formas variadas). Finalmente están los actinomicetos la mayoría de cuyas especies crecen como filamentos finos parecidos a hongos llamados hifas; un agrupamiento o masa de hifas se denominan micelio. (Paul Singleton, 1999)

4. ¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa?

En la tinción directa el microorganismo o tejido se tiñe por inmersión en el colorante mientras que en una tinción negativa el microorganismo permanece sin teñir y destaca de una coloración de fondo. Para ello se utilizan los colorantes ácidos como la negrosina. (Baker ,1970)La tinción directa simple permite observar la forma, el tamaño y los agrupamientos de las bacterias usando un único colorante (normalmente básico), pues estos microorganismos absorben el colorante. Mientras que en la tinción negativa, uso de colorantes neutros o ácidos, la célula bacteriana no absorbe el colorante quedando incolora y transparente, sólo se tiñe el fondo. Y debido a que no necesitan del calor, las morfologías de las células no son alteradas. (Covadonga ,2010)



5. ¿Qué importancia le atribuyen a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados?

A parte de diferenciar y hacer visibles los constituyentes de una célula, la tinción ayuda a identificar los microorganismos y a situarlos en su propio grupo particular, en virtud de su comportamiento frente a determinados colorantes.El motivo en virtud del cual tienen lugar las reacciones de tinción no está actualmente esclarecido, pero parece que se trata de una combinación de reacciones físicas y químicas.Recuérdese la electrolisis en que al electrodo cargados positivamente o ánodo atrae a los aniones cargados negativamente y el electrodo cargado negativamente o cátodo atrae a los cationes cargados positivamente. Como las células bacterianas son ricas en ácidos nucleídos que poseen carga negativa, es natural que los colorantes básicos depositen su material colorante en el catión positivo, de esa suerte el organismo que lo atrae se coloreará. Los colorantes ácidos, sin embargo en los cuales la materia colorante está en el anión con carga negativa no tiñen las bacterias y se usan principalmente para la tinción de fondo o para coloración de contraste. (Baker ,1970)

6. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?La función del aceite de inmersión es restringir el movimiento de la muestra, además de evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza cuando vamos a observar con el objetivo 100x. Otra función del aceite de inmersión es evitar que la luz se desvíe; al contrario lo que se pretende es que la luz llegue concentrada hacia la muestra.Cuando se utilizan objetivos de aceite de inmersión, una gota de aceite como ocurre a menudo, entre la lente y el frotis. (Paul Singleton ,1999)

7. ¿Cuál es la función del lente objetivo de inmersión?En bacteriología frecuentemente existe la necesidad de utilizar un elevado número de aumentos (por ej., 1000 X), para lo cual el microscopio debe poseer un objetivo de aceite de inmersión (aumento alrededor de 100 X) y un ocular apropiado (alrededor de 10 X).El máximo aumento útil que se puede conseguir con un objetivo determinado es 1000 veces su apertura numérica (NA).(Paul Singleton ,1999)El objetivo es la lente de mayor importancia de un microscopio, pues de sus propiedades depende que se consiga o se frustre la imagen final. Las principales funciones del lente objetivo son: (Salle, 1957)

a) Reunir los rayos luminosos de cualquier punto del objeto.b) Concentrar la luz en un punto de la imagen.

c) Ampliar la imagen.


inf1. observacion de bacterias

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