RAPPORTO S UL LAVORO DEL GRUPPO DI RICERCA SULL'EPATITE VIRA LE

presentato dal Prof. BRENNO BAB UDIERI il 6 aprile 1965

Indagini sull'agente eziologico dell'epatite virale umana

Hanno partecipato alle ricerche qui riportate:

BRENNO BA BUDIERI (Laboratori di Microbiologia) ; ENRICO FIASCHI (Istituto di Patologia medica dell'Università di Padova) ; REMo NACCARATO (Istituto di Patologia medica dell'Università di Padova\; Luoov1co A. SCURO (Istituto di Patologia medica dell'Università di Padova); GENEVIÈVE PAPA (Borsista dei Laboratori di Microbiologia);

con l 'assistenza tecnica di:

}UTTA HAASE (Ospite dei Laboratori di Microbiologia) ; FRANCO T.\NGUCCI (Laboratori di fisica) .

Le ricerche sono state svolte dal 1963 al 1965 presso i Laboratori di Microbiologia ed i Laboratori di Fisica.

PREMESSA

L'epatite virale è certamente una delle malattie infettive ch e maggior­mente h anno attirato in questi ultimi anni l 'attenzione del clinico e del virologo. Ciò per tre ragioni principalmente : p er la sua frequenza progressi­vamente crescente, non solo in Italia, ma in quasi tutti i paesi del mondo, per la su a non rara t endenza ad evolvere verso processi cirrotici, evoluzione prima inus uale o per lo meno non riconosciuta, ed infine perchè essa è una delle poche malattie infettive di maggior importan za di cui sia ancora ignoto l'agente eziologico.

Quest 'ultima affermazione potrà sorprendere chi, n on interessato diret­t amente a questo argomento, ricordi le frequenti segnalazioni di questi ultimi anni, spesso riech eggiate dalla stampa d 'informazione, sull'identifica­zione o l'isolamento d el «vero)) v irus dell'epatite infettiva. Molti «veri)) agenti d eli ' epati te virai e sono st ati isolati, ma purtroppo, pur avendo ciascuno di essi argomenti validi in proprio favore, essi sono, p er caratteri fondamentali, ciascuno diverso dall'altro . Nelle due riunioni ch e il Comitato degli esp erti dell'epatite virale dell'OMS h a tenuto, nel 1963 a Ginevra e nel 1964 a Praga, tutti questi r eperti sono stati criticamente considerati e p er nessuno di essi si è ritenuto ch e le preve addotte fossero sufficienti per considerar e

.-1 11 >>. l st . .Supcr. Sani tà (1965) 1, H S·486.

EPATITE VHIALE 479

risolto il problema eziologico dell'epatite v irale . Ciò vale anche per il virus, il cosidetto << Hemovirus n, isolato da RIGHTSEL et al. (1"3) nei la bora­tori della Parke e Davis, studiato con grandi mezzi e considerato per alcuni anni come il candidato provvisto di maggiori titoli. Ad alcune perplessità riguardanti alcune t ecniche seguite da quei ricercatori c certi risultati da essi ottenuti, si è aggiunto di recente il p eso negativo della m ancata con­ferma da parte di altri laboratori che hanno voluto ripetere tali prove.

Non è nostro intendimento enumerare qui i vari r ep erti virologici esi­st enti n ella letteratura; rinviamo p er questo alla b ella rassegn a fatta da DARDANONI (4) al congresso della Società italiana d 'igien e, tenuto a Catania n ell'autunno del 1963. Dopo tale data qualche altro reperto s'è aggiunto, come quello di LIEBHABER et al. (6 ) negli Stati Uniti, di BucnNER e SuREEVE (6) nel Canadà, di CASSEL (1) in Getmania. Si tratta in genere di effetti citopatogeni ottenuti inoculando in colture cellulari estratti ottenuti da feci, urine o, in un caso, dal siero di pazienti. CASSEL invece ha ripreso precedenti ricerch e attribuendo significato virale ad alcuni elementi che aveva già precedentemente descritto.

Gli studi sulle lesioni subcellulari che l'epatite v irale umana determina nell'epatocita sono poco numerosi . Ricordiamo le osservazioni di BRAUN­STEINER et al. (8), di CASSEL (1· 9) , di BEARCROFT et al. (1°· 11

), di TAYLOR et al. (3) , tra di loro in complesso concordanti. Le lesioni più evidenti sono a carico dei mitocondri, che appaiono rigonfiati e con le cristae ridotte o frammentate. I vacuoli del reticolo citoplasmatico sono ipertrofici e si nota un aumento sp esso con sider evole, n el r eticolo, dei gr anuli di Palade. Le aree ergastoplasmatiche sono di solito ridotte c male delimitabili. Il nucleo appare scarsamente interessato dall' infezione.

Gli scopi che ci siamo proposti nelle nostre ricerche sono stati due: studiare al microscopio elettronico le lesioni dell'epatocit a in corso di epatite virale e identificare nelle cellule epatich e l ' ancora ignoto virus responsabile

dell'infezione.

PRELEVAMESTO E PREPARUIO:\E DELLE BrOP lE

I pazienti da noi presi in considerazione provengono tutti da episodi epidemici di epatite v ira le, manifestatisi sia in Sardegna ch e n el Veneto. Non abbiamo preso in considerazione soggetti ammalatisi all'infuori delle zone epidemiche, i quali avrebbero potuto offrir e qualche dubbio diagnostico . La diagnosi è stata posta in base a criteri clinici , biochimici (transaminasi, prove di funzionalità ep ati ca e di !abilità serica) e, almeno in parte, sierologici

(reazione di Hoyt-Morrison). Il materiale di studio è stato prelevato mediante biopsia epatica prati­

cata con l 'ago di Silvermann. II frammento destinato a1l'esame ultramicro-

All •l. l•t . Sapa. S fl>•iloì 0 9GJ) t , 4i8·!SG.

480 RAPPORTI DEI GRUPPI DI RICERCA

scopico è stato immediatamente fissato con acido osinico all'l% in tampone di Michaelis a pH = 7,2, passato nella serie degli alcool-acetone e successi­vamente incluso in metacrilato o in araldite. L e inclusioni sono stat e sezio­nate con un ultramicrotomo P orter-Blum ed osservate con il microscopio elettronico Sicmens E liniskop I. Raramente le sezioni sono state osservate senza trattam ento ; più spesso sono state colorate con acetato d'uranile o con Karnow ski.

Altri frammenti di tessuto sono stati osservati con il microscopio ottico, impiegando le abituali tecniche istologich e o sono stati sottoposti all'osser­vazione al microscopio a fluorescenza dopo trattamento con acridin-orange o con gamma-globuline di convalescente coniugate con l 'isotiocianato di fiuoresceina.

Come controlli sono stati studiati frammenti bioptici tratti da fegati di soggetti affetti da malattie diverse dall'epatite virale.

OSSERVAZIONI AL MICROSCOPIO ELETTRONICO

Il nucleo della cellula epiteliale epatica non vien e particolarmente alterato dall 'infezione. Esso è ricco di cromatina come di norma e questa è uniformemente distribuita in esso. Contrariamente all' opinione di BEAR· CROFT (10), non riteniamo che questa distribuzione uniforme sia caratteri­stica dell'epatite virale . Abbiamo osservato aspetti perfettamente uguali anche in nuclei di cellule epat iche di controllo.

Nei casi non gravi di epatite virale le lesioni submicroscopich e del cito­plasma della cellula epatica non sono molto considerevoli. L'alterazione più evidente consiste in un rigonfiamento dei canalicoli costituenti il r eticolo citoplasmatico (Fig. l). Alle volte su sezioni trasverse essi appaiono come vacuoli vuoti.

Il num ero dei Initocondri appare modicamente aumentato ed essi si presentano rigonfi e rotondeggianti. L e cristae sono diminuite di numero e spesso frammentate. Essi contengono uno scarso numero di granuli opachi, presenti del resto anche in cellule normali (Fig. 2).

Nel citoplasma si osservano alcune inclusioni di notevole opacità, pro­b abilmente costituite da lipidi. Esse sono di dimensioni notevolmente mag­giori di quelle presenti n egli epatociti normali e talvolta comprendono n ella loro struttura un certo numero di vacuoli vuoti (Fig. 3) .

I lisosoini sono piuttosto numerosi e raggiungono spesso dimensioni maggiori che nella cellula normale. Alcuni lisosoini alterati contengono al loro centro un materiale di notevole opacità, di probabile natura lipidica, circondato da una zona trasparente ch e è probabilmente da considerarsi un artefatto dovuto al trattamento subito dai t essuti con l ' acetone (Fig. 4) . Altri lisosoini contengono invece ammassi di ferritina intensamente opachi,

.Jnn. ]$t. Su.per. Sanità (1965) 1, 478-486.

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65) 1, 478·486.

EPATITE VI RALE 481

e questi non differiscono in maniera apprezzabile d a quelli, simili , presenti anche in cellule normali.

Nel citoplasma si possono osservar e anch e alcuni vacuoli dovuti a feno­m eni di autolisi. Essi contengono abitualmente una piccola p orzione di citoplasma più o meno alterato, racchiuso da una m embran a. Con not evole frequenza questi frammenti sono stipati di ribosomi (Fig. 5) . Alle volte nel vacuolo è contenuto anche un intero mitocondrio, in cui i processi litici sono appena all'inizio (Fig. 6).

I microsomi non mostrano particolari alterazioni. Le zone contenenti gli­cogeno hanno un aspetto normale ma sono r idotte di numero e di est ensione.

Nel citoplasma si possono inoltre osserv are gr anuli di ferritina , sia isolati che r accolti in piccoli ammassi, all'infuor i dei lisosomi . In alcune sezioni sono st at e vist e inclusioni costituite d a lamelle concent rich e mielino­simili. Esse sono probabilmente formate da colest erolo.

Accanto a quest e strutture più o m eno alterate, ma agevolmente rife­ribili a componenti citoplasmatici not i, abbiamo osservat o alcune forma­zioni che altri AA. hanno creduto di poter riferire al ricercato agente del­l'epatite infettiva. Abbiamo così osservato con una certa frequenza le forma­zioni a rosetta d escritte da BEARCROFT (10) . Form azioni d el tutto simili sono state da noi trov at e anche in cellule normali . L e riteniam o dovute general­m ente a piccoli ammassi di granuli di glicogeno o, alle volte li identifichiamo con polisomi, costituiti dall'aggregazione di un certo numero di ribosomi.

Abbiamo pure osservato, non raramente, in cellule lese, corpiccioli con

un diametro di 420-2500 A, circondati d a una m embrana singola o doppia, intensamente opaca (Fig . 8). E ssi mostrano al cen tro un granulo opaco. Queste formazioni corrispondono risp ettivamente ai corpiccioli piccoli ed a quelli grandi descritti da BRAUNSTEINER et al. (8) e da CASSEL (1• 9), e con· siderati com e possibili elementi virali. In effetti essi ricordano notevol­m ente l'aspetto di alcuni virus di grosse o medie dimensioni e soprattutto quello dell'esantema coitale vescicolare dei bovini, descritto recentemente da SCHULZE et al. (12) . Quest e formazioni, a nostro parere, non hanno nulla a che vedere con il virus d ell'epatite infettiva, p erchè, a parte altre consi­derazioni, il loro diametro è notevolmente m aggiore di quello che il virus dell'epatite deve avere in base alle prove di filtrazione eseguite da Mc CoLLUM (18 ) attraverso membrane gradua te e successiva inoculazione del filtrato a volontari umani.

Del resto già nell958 DE HARVEN e F RIEND (u) hanno descritto, quali artefatti, in cellule epatiche normali, formazioni alquanto simili a queste sopradescritte.

Un aspetto morfologico molto caratteristico della cellula epatica in corso di epatite virale, e che potrebbe anche aver e un certo riferimento con il virus della malattia, è quello ch e riguarda i ribosomi. Già altri AA.

.4nn. l st. Supe:~·. Sanità (1965) 1, 478·486.

482 RAPPORTI DEI GRl ' PPI D I RICERCA

e fra questi sp ecialmente BEARCROFT e PEACHEY (11) avevano n otato che nel citoplasma degli epatociti in cor so di epatite virale c'è un forte aumento di R NA. P oich è lo R NA aumenta anche in casi di intossicazione non ecces­sivamente gr ave da veleni epatotropi, qualcuno ha ritenuto che questo aumento potesse essere messo in rapporto con un aumentato passaggio n el citoplasma di RNA messaggero, in rapporto ai processi di sintesi proteica connessa a fenomeni rigen erativi d ella cellula danneggiata.

Noi abbiamo potuto confermar e questo aumento dello RNA citopla­smatico colorando le cellule epatiche infette con acridin-orange dopo fissa ­zione con Carnoy . Abbiam o anche potuto constatare, e cr edo che questa sia una osservazione originale, che nell'epatite virale le cellule epatich e colorate semplicemente con ematossilina Carazzi ed eosina, mostrano il loro citoplasma come velato da una granulosità basofila uniformem ente diffusa ed estrema­m ente fine. È p ossibile che essa sia dovuta allo RNA diffuso n el citoplasma.

Pur non potendosi escludere quest o presunto aumento dello R NA mes­saggero, si deve ritenere che l'aumento dello R NA citoplasmatico sia essen­zialmente legato ad un notevole aumento dei granuli di Palade. Questi spiccano con maggior nitidezza ch e di norma, caratteristica questa rilevata anche da T A YLOR el al. (3} , ed accanto a quelli ordinati come di norma lungo le p ar eti dei canalicoli del r eticolo o ader enti ai sacchi m embranosi piatti d el citoplasma, se ne osservano altri che formano piccoli aggregati n el citoplasma o ch e in certe zone si dispongono ordinatamente in più file parallele, con regolari intervalli tra i singoli granuli, sì da assumer e alle volte una struttura similcristallina ch e richiama strutture intracellulari similari caratteristiche di certi virus (Fig. 7) .

Questo notevole e caratteristico aumento dei ribosomi ed il loro pecu­liare ordinamento in certe zone del citoplasma ci portano all'ipotesi che essi possano avere rapporto con la sintesi del virus.

Desideriamo infine descrivere un altro tipo di formazioni ch e rite­niamo, sia pure con le debite riserve, di poter identificare con il virus ricer­cato (Figg. 9, 10, ll, 13).

Quest e formazioni sono state da noi ritrovat e in 6 soggetti, su puntati epatici praticati da un minimo eli 9 ad un massimo di 33 giorni d all' inizio clinico della malattia.

Si tratta di formazioni granulari, rotondeggianti , con un diametro che

s'aggira intorno ai 200 A. Ri cordiamo ch e Mc COLLUM (13) ha valutato con

prove di filtrazione, ch e il virus dell 'epatite B deve misurare circa 260 A di diametro. Qualora si tenga presente che n ei processi di disidratazione con­seguenti alla fissazione e nell' inclusione del preparato per l 'osservazione al microscopio elettronico, le particelle virali subiscono una riduzione del loro diametro che arriva fino al 20 %, si constata che le nostre formazioni granulari misurano esattamente quanto t eoricamente ci si doveva attendere .

.Min. l st . Suptr. Sanità (1965) 1, 478·486.

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965) t , 478-486.

EPATITE VIRALE 483

Questi granuli, in qualche caso notevolmente e irregolarmente adden­sati, ma più spesso r elativamente disper si, occupano uno spazio citoplasma­t ico rotondeggiante od ovalare, scarsamente opaco ai raggi elettronici, del diametro di 0,3-1 fi, racchiuso da una membrana semplice, simile a quella che delimita abitualmente i vacuoli citoplasmatici. La massima parte dei presunti elementi virali si trova r acchiusa in questi sacculi, ma uno scarso numero di essi si trova irregolarmente disseminato n el citoplasma circostante. In un caso abbiamo osservato quello che potrebbe forse essere considerato come lo stadio iniziale di formazione di un ammasso virale. Si tratta di un'area citoplasmatica simile a quelle sopra descritte, delimitata da una membrana non bene definita in tutta la sua estensione, opaca e piuttosto omogen ea d'aspetto. P erò alle due estremità di tale spazio si osservano due vacuoli, non circondati da membrana, chiari e contenenti un certo numero di granuli con le caratteristich e di quelli sopra descritti ~Fig. 12).

Questi sacculi contenenti granuli da noi osservati, sono molto simili alle immagini descritte recentement e da RICHTER et al. (15} negli epatociti dell'anatra affetta da epatite virale, e considerate come ammassi del virus r esponsabile di quella infezione (Fig. 14).

I granuli da noi descritti si distinguono agevolmente dai ribosomi, sia per le loro dimensioni lievemente superiori, sia perchè non mostrano un ordinamento regolare in linee, sia perchè sono contenuti in sacculi delimitati da una membrana. Inoltre essi sono chiaramente rotondeggianti, m entre i riliosomi assumono spesso una forma triangolare molto caratteristica.

Anche una confusione con granuli di glicogeno è facilmente evitabile. Ad ogni modo, p er maggior sicurezza, abbiamo fatto ricorso sia al tratta­mento delle se7.ioni con l'acetato d 'uranile che, com'è noto, differenzia n et ­tamente il glicogeno dagli acidi nucleici, sia al trattamento d ei tessuti con diastasi. Questa, che dissolve il glicogeno, non intacca invece i granuli da noi descritti.

Non abbiamo mai osservato formazioni di questo genere in cellule epatiche di controllo, prelevate a pazienti affetti da altre malattie.

Le formazioni da noi descritte sono generalmente situate negli epatociti, ma la presenza, in qualche caso, nelle cellule infette, di numerose fini fibrille, fa riten er e che esse possano essere situate anche in elementi di natura istio­citaria, forse in cellule di Kupffer.

RICERCHE CO IL METODO DELLA fMMU OFLUORESCENZA

Per accertare se questo presunto virus abbia caratteristiche antigeniche riferibili a quelle che dovrebbero essere proprie del virus dell'epatite infettiva, abbiamo fatto ricorso alla tecnica dell 'immunofluorescenza. A questo scopo abbiamo estratto le gamma-globuline dal siero di alcuni soggetti convale-

.Ann. 1st. Super. Sanitd (1965) t , 478·486 .

484 RAPPORTI DEI GRUPPI DI RICER CA

scenti di epatite virale tipica, con r eazione di Hoyt-Morrison nettamente positiva. Le gamma-globuline sono stat e coniugat e con isotiocianato di fluoresceina e, previo adsorbimento con polver e di fegato umano normale, esse sono stat e messe a contatto, sia con sezioni, sia con preparati per impronta di frammenti epatici prelevati per biopsia da quei pazienti in cui avevamo visto al microscopio elettronico il presunto virus. Abbiamo così ottenuto delle aree di fluorescenza intracellulare, aree che molto spesso risultano costi­tuite da un insieme di piccoli spazi rotondeggianti, che potrebbero corrispon­dere ai sacculi da noi osservati al microscopio elettronico. (Figg. 15 e 16)

TE "TATIVI DI COLTIVAZfONE DEL VIRUS I COLTURE DI CELLULE

Il passo successivo al quale ci siamo accinti è stato quello di tent ar e la coltivazione del virus su colture cellulari. Questi t entativi sono ancora in corso e non ci hanno dato finora risultati definitivi. Gli stipiti cellulari impie­gati per questo scopo sono stati soprattutto quelli H eLa, KB e lo stipite RC, gentilmente fornitoci d al Prof. Rita. Questo ceppo, le cui cellule sopravvi­vono in coltura per molti giorni, è quello ch e ci ha dato i risultati più inco­raggianti.

Premettiamo che in nessun caso abbiamo osservato un effetto citopato­geno, m a a questo risultato negativo non abbiamo dato eccessiva importanza perchè, a parte la dimostrata possibilità che un virus si sviluppi in cellule senza portarle alla degenerazione, ci siamo prospettati la possibilità che il virus dell'epatite virale, in considerazione anche del lungo periodo d'incuba­zione caratteristico di questa malattia, si sviluppi molto lentamente nelle cellule, sì che l'eventuale effetto citopatogeno potrebbe anche coincidere con i fatti degenerativi che normalmente si manifest ano nelle colture cel­lulari eccessivamente invecchiate. Non volendo ricorrere, p er ragioni etiche, all'impiego dei cosidetti (( volontari umani n e non potendo utilizzare, per la loro non ricettività, gli animali di laboratorio, abbiamo fatto ricorso, anche in questo caso alla tecnica dell 'immunofluorescenza. Diciamo brevemente che siamo riusciti ad identificare zone di fluorescenza anche in colture al 2° o 40 passaggio. Queste compaiono in genere verso la 15a giornata e raggiun­gono il massimo verso la 20a-2sa. D evo dire però ch e in qualche caso abbiamo avuto fluorescenza anche con l'impiego di gamma-globuline provenienti da un siero di soggetto presumibilmente sano.

A questo riguardo, data la grande diffusione delle form e clinicamente mute dell'epatite virale, occorre osservare che è molto difficile poter essere certi che un siero prelevato ad un soggetto ritenuto sano non contenga anticorpi per il virus epatitico. Ricordiamo a questo riguardo le recenti inda­gini di SPo G ( 16

) che trovò valori di transaminasi superiori alla norma nel

Amo. 1st. Sr.per. Sani tà (1965) l , 478-486.

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965) l , 47 8-486.

l EPATITE VIRALE 485

76% di 737 soggetti apparent emente sani, ch e avevano vissuto in un ambiente dove c'erano stati casi di epatite virale.

Ad ogni modo quest e nostr e ricerche culturali, anche se incoraggianti, sono incomplete e non possono essere assolutamente considerate probative . Esse debbono essere proseguite perchè solo un risultato sicuramente positivo in questo campo ci potrebbe aprire la strada allo studio delle caratteristich e biologich e del virus, primo passo verso ricerche indirizzate a trovar e armi terapeutiche e profilattich e contro una malattia la cui importanza pratica va di giorno in giorno aumentando.

E sprimiamo la nostra più viva riconoscenza alla Prof. D. Steve Boc­ciarelli per i consigli datici nel corso delle nostre ricerche.

Riassunto. - Le lesioni submicroscopiche della cellula epatica in corso di epatite virale consistono in un rigonfiamento dei mitocondri ed in una frammentazione e diminuzione delle loro cristae, in una dilatazione dei canalicoli del reticolo citoplasmatico, in una ipertrofia dei lisosomi conte­nenti pigmenti lipidici ed in un forte aumento d el numero dei ribosomi, che inv adono alcune zone citoplasmatiche disponendosi su più file parallele.

Nel citoplasma delle cellule infette vengono descritti ammassi di granuli

di 200 A di diametro, racchiusi in sacculi ovalari circondati da una mem­brana semplice. Gli AA. ritengono che questi granuli possano corrispondere all'agent e dell'epatite virale.

Vengono descritti i risultati di prove di immunofluorescenza e dei primi t entativi di cultura del presunto virus su cellule .

Summary. - The most evident lesions of the human epit helial liver celi, in viral hepatitis, consist in an enlargement of the canalicula of the endo­plasmic reticulum and in an increase of the size and, perhaps, of the number of the mitochondria, which contain only some scarce an d fragmented << cristae ».

Characterist ic of the liver celi in the coursc of virai hepatitis is also the large amount of ribosomes, which constitute many clust ers or ar e ordered in more parallel lines, v.ith a r egular interval between the granules.

In roany patients the AA. have observed some cytoplasmatic u saccula »,

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The AA. h clieve that t hese hodics could corrcspond to the agent of the human virai h epatitis.

Ann. I st. Supe1·. Sanità (1965) 1, 478 -486.

486 RAPPORTI DEI GRUPPI DI RICERCA

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SPIEGAZIONE DELLE FIGURE

l. - Rigonfiamento dei canalicoli del reticolo citoplasmat ico. lpertrofìa dei mitoeondri e frammentazione delle a eristae ».

2. - Rigonfiamento dei mitocondri e frammentazione delle « cristae ».

3. - Inclusioni citoplasmatiche costituite presumihilmente da lipidi. 4. - Lisosomi alterati contenenti pigmento. 5. - Fenomeni di autolisi di porzioni citoplasmatiche stipate di ribosomi. 6. - Vacuolo da citolisi contenente un mitocondrio. 7. - Aumento numerico dei r ibos01ni e loro disposizione in file parallele. 8. - Formazioni pseudovirali. 9, 10, Il. - Sacculi contenenti elementi virus-simili.

12. - Possibile stadio iniziale di un sacculo in una cellula di natura istiocitaria. 13. - Sacculi contenenti elementi virus-simili. 14. - Virus dell'epatite dell'anatra [ da Richter et al. (15) ]. 15. - Striscio di puntato epatico di paziente 1.300 x. Fissazione con acetone. 16. - Sezione di puntato epatico di paziente 1.300 x. Fissazione con Bouin.

Le Figg. 1-13 riguardano cellule epatiche di pazienti affetti da epatite virale (complessiva­mente 8 soggetti).

Le sezioni di cui alle Figg. l , 2, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 sono state colorate con Karnowski. I preparati delle Figg. 15 e 16 sono stati trattati con y-globuline coniugate con isotiocianato

di fluoresceina, colorate per contrasto con Evans blu. Si notino le piccole aree circo­lari di fluorescenza, probabilmente corrispondenti ai « sacculi ».

A nn. I st. Super. S anità. (1965) 1, ~78·486 .

]r. • Science, 124,

~- Mc LEAN, Jr ..

). Appl. Physiol.,

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lin. Wochschr., 36,

3'13 (1962). iniirmed., 16, 375

:). t).

a dei mitocondri

ti.

le.

it aria.

o ne. n.

al e (complessiva-

: con K arnowski. con isotiocianato iccole ar ee circo-

1965) f , .78·486.

E PATIT.F; VIRALE

F ig. L

F ig. 2.

Ann. I st. Super. Sanità. (1965) f , 478-486.

€ PATITE VlllALE

F ig. 3.

Fig. 4.

Ann. I st . Super . Snni llì ( 1965 ) 1, 47 8-•l s r,.

EPATITE VIRAI.~.

Fig. 5.

F ig. 6.

Ann. Ist. Super. Sanità (1965) t , 478·486.

EPATITE V IRALE

Fig. 7.

"Jn n . f s/. Super . Sanità (1965) t , 4 78-4RG.

E PATI TE V IRALE

F ig. 8.

Fig. 9.

. lnn. 1st. Sllpcr. Sanità ( l !HI;;) 1, 478·~86.

E P ATITE VIIIA I.E

Fig. I O.

Fig. Il.

Ann. ! st. Su71er. Sanilù. ( l%;;) t , 478·486.

EPAT ITE VIRALE

Fig. 12 .

.tJnn. Isl. Super. Sanità (1965) 1, 478·486 .

EPAT11'E V IRALE

Fig. 13.

Fig. 14.

Ann. 1st. Super. Sanità ( 1965) 1, 47 8·48G.

EPATITE VIRA J, I"

Fig . 15.

Fig. 16 .

• 11111. / $/. :Sttpet. Sanittl ( l9G:i) 1. 17 · I ~G