Efek secara in vivo senyawa fenolik pada parameter darah dari ikan laut (Dicentrarchus labrax)

Sea bass (Dicentrarchus labrax) disuntikkan intraperitoneal sekali (tunggal dosis) atau tiga kali (dosis difraksinasi) dengan fenol atau OH-fenol (hidroquinon, resorsinol, dan pirokatekol). Atas dasar dosis mematikan, OH-fenol lebih beracun dari fenol, dan pirokatekol adalah senyawa yang paling kuat. Hematologi, metabolisme dan parameter darah antioksidan diukur 3 hari setelah penyuntikan. Variasi metabolik spesifik efek pada eritrosit diturunkan dan perbedaan antara dosis tunggal dan difraksinasi diamati. OH-phenolstreated ikan menunjukkan gangguan dalam indikator toksisitas metabolik seperti hipoglikemia, tingkat urea nitrogen darah rendah (BUN) dan penurunan aktivitas alkali fosfatase (ALP). Selain itu, hubungan struktur-aktivitas kuantitatif yang dikembangkan dengan menggunakan n-oktanol: koefisien partisi air (log Kow). Korelasi positif yang ditemukan dengan ALP, plasma glukosa dan hemoglobin.

1. Introduction

Senyawa fenolik adalah model yang baik dari luas xenobiotik. Senyawa ini lipofilikmemiliki banyak aplikasi industri, yang meningkatkan risiko terhadap lingkungan dan manusia untukkesehatan (Bradbury et al., 1989). Mereka umumnya ditemukan di lingkungan laut dan dijaringan ikan (Mukherjee et al., 1990) di mana mereka menginduksi toksisitas akut atau kronis. tindakan mereka adalah beberapa dan sering antagonis. Mereka genotoksik (Jagetia dan Aruna, 1997), karsinogenik (Tsutsui dkk., 1997), immunotoxic (Taysse et al., 1995), tetapi mereka juga menyampaikan perlindungan terhadap kerusakan genetik atau pengembangan kanker diinduksi oleh karsinogen lain (Stich, 1991). Beberapa mereka adalah pemulung untuk spesies radikal bebas, sementara lain dianggap sebagai spesies oksigen reaktif menghasilkan agen (Winston, 1991).

Penelitian ini menganalisis efek racun dari fenol dan hydroxyphenols (OH-fenol) - hydroquinone, resorsinol dan pirokatekol (o-, m-, p-OH-fenol) - parameter darah ikan di laut Sbass, Dicentrarchus labrax. Parameter darah ikan adalah biomarker cocok untuk mengevaluasi potensi risiko bahan kimia (Roche dan Boge', 1996). Sejak keracunan kimia dapat dianggap sebagai potensi sumber hormon stres, plasma, substrat metabolik, volume sel, atau aktivitas enzim pertama kali diukur (Adams et al., 1989; Panduranga-Rao et al., 1990). indikator stres seperti tingkat plasma kortisol dan glukosa, hemoglobin darah (Hb), Volume dikemas sel (PVC), berarti konsentrasi hemoglobin corpuscular (MCHC), jumlah protein plasma, urea darah nitrogen (BUN), dan alkali fosfatase (ALP) aktivitas.

Tanggapan seluler spesifik enzim yang terlibat dalam perlindungan terhadap eritrositspesies oksigen reaktif juga diselidiki. Fenolat sering dianggap sebagai reaktif agen oksigen spesies yang menghasilkan mengarah ke utama kerusakan sel, seperti oksidasi membran lipid tak jenuh ganda (Pradhan et al., 1990). Radikal dan bentuk diaktifkan lainnya mengandung anion superoksida yang (O2-), hidrogen peroksida (H2O2), radikal hidroksil (-OH) dan singlet oksigen (1O2) (Winston, 1991). Sel darah ikan memiliki tingkat pertahanan antioksidan yang relatif tinggi (Wilhelm-Filho, 1996) termasuk enzimatik dan nonenzimatik sistem (Winston dan Di Giulio, 1991).Enzim-enzim kunci dalam perlindungan terhadap 'stres oksidatif' terdiri dari mitokondria dan sitosol

superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT) dan glutathione peroxidase (GPx) (Rochedan Boge', 1993). Evaluasi toksikologi sifat bahan kimia ini dilakukan dengan cara suntikan intra-abdominal dari xenobiotik dan pengumpulan sampel darah.

Experimental procedures

Organisme

Sea bass (D. labrax, sekitar 125g) yang diperoleh dari DEVA-Sud, Pertanian eksperimentalIFREMER (Perancis Lembaga Penelitian dan Eksploitasi Laut, Palavas-les-Flots, Prancis).Adaptasi selama minimal 15 hari pada 15±1 ° C sebelum digunakan dalam percobaan. Selama pendingin ini periode, mereka diberi makan setiap hari dengan komersial pelet ikan bass makanan (Aqualim), bahkan selama Tentu saja dari periode keracunan. Mereka dipuasakan 48 jam sebelum pengambilan sampel darah.

Chemicals

Xenobiotik yang fenol dan monosubstituted OH-fenol (Gambar. 1). Fenol (C6H4OH), hydroquinone(1,4-dihydroxybenzene), resorsinol (1,3-dihydroxybenzene) dan pirokatekol (1,2-dihydroxybenzene)dibeli dari Riedel-de- Haen (Seelze, Jerman).

administrasi kimia

Larutan stok disiapkan di isotonik NaCl (170 mM). Dosis yang diberikan bahan kimiadihitung atas dasar mematikan awal Studi toksisitas dan berkisar antara 1/10 dan 1/5dari dosis yang mematikan (Tabel 1). Oleh karena itu 125 µl larutan stok fenolik disuntik intra-abdomenper 100 g ikan sekali (dosis tunggal) atau tiga kali (dosis fraksinasi). Dalam hal ini, jedah waktu 4 hari disimpan antara setiap injeksi. Kontrol kelompok menerima Volume setara isotonik NaCl. Setiap kasus mematikan yang terjadi selama pengobatan tercatat.

Tabel 1

Dosis mematikan dan diberikan (dalam mg per 100 g berat badan (BB)) fenolat di D. Labrax

sampel darah

Darah dikumpulkan dengan suntikan di ekor. Sampel diambil dari vena ekor dengan heparinizedsuntik setelah3 hari injeksi. darah disentrifugasi untuk memisahkan eritrositdari plasma. Sel darah merah yang dicuci menggunakan larutan isotonik NaCl (170mM), maka diperlakukan sedemikian rupa mendapatkan homogen hemolisat. PVC dan jumlah kadar Hbditentukan segera.

Blood parameters

Isi hemoglobin (Hb) yang ditentukan dengan menggunakan cyanomethemoglobin dengan solusi Drabkin ini. PVC ditentukan dengan metode hematokrit. MCHC dihitung dengan membagi konsentrasi Hb(g l-1) oleh Ht (11-1). Glukosa plasma (Glu) diukur dengan metode oksidase glukosa (Hugget dan Nixon, 1957). Konsentrasi kortisol plasma (Cort) dinilai oleh radioimmuno assay (RIA) (Foster dan Dunn, 1974) dan ALP kegiatan sesuai dengan Bessey dkk. (1946). Indikator metabolik lainnya diperkirakan menggunakan Sigma kit diagnostik: BUN ditentukan oleh metode Berthelot (Sigma ref 67-50) danprotein konten dengan metode Biuret (Sigma ref 541-2). Kegiatan antioksidan (Jumlah peroksidase(Px), CAT, GPx, dan SOD) ditentukan sebagai dilaporkan sebelumnya (Roche dan Boge', 1996). enzimatikkegiatan yang terkait dengan sel konten Hb. Semua nilai yang dilaporkan dalam teks tersebut merupakan rata-rata dari penentuan selama lima hewan (means ± standard error).

Struktur kuantitatif hubungan aktivitas (QSAR)

QSAR ini umumnya dipelajari untuk mengkorelasikan efek biologis dari xenobiotik dengan fisikokimia dan sifat struktural ditentukan oleh pemodelan molekul seperti lipofilisitasnya. Kami pernah terutama tertarik pada partisi oktanol-air koefisien (Kow) dari senyawa fenolik yang ditemukan dalam literatur (Leo dkk., 1971; Schultz, 1987; Xu et al., 1994) atau secara khusus diukur (Tabel 1).

Statistical analysis

ANOVA dilakukan untuk membandingkan cara dari yang berbeda menggunakan sebuah program Statview (Statview 4,02 untuk konsep Macintosh Abacus, California). Perbedaan yang signifikan (PB0.05) yang diperkirakan atas dasar Fisher, Scheffe, Dunnett atau tes Mahasiswa untuk data berpasangan. untuk QSAR analisis, tes parametrik dilakukan dan signifikansi statistik yang diberikan oleh Pearsonkoefisien.

HASIL

Efek Kematian

Injeksi intra-abdominal dari 50 mg fenol per 100 g ikan membunuh semua ikan di 2 jam. Lima miligram per 100 g ikan tidak, bahkan setelah 1 seminggu. Suntikan baik 5,8 mg hydroquinone atau resorsinol per 100 g ikan yang fatal dalam 2 jam atau kurang, sedangkan suntikan 0,58 mg tidak fatal. Ikan disuntik dengan 0,58 mg per 100 g pirokatekol mati tetapi mereka disuntik dengan 0,06 mg per 100 g lakukan tidak (Tabel 1).

Efek non lethal

Efek non-mematikan dari senyawa fenolik pada parameter darah ikan yang dipantau setelah satu injeksi (dosis tunggal) atau tiga suntikan (dosis fraksinasi) 1/10 dari diadministrasikan dosis mematikan maksimal. Rinci Hasil disajikan dalam Gambar. 2-4. Tiga jenis efek yang dipilih:

1. efek metabolik terdeteksi seluruh pengukuran BUN, ALP, Glu dan Cort;

2. efek erythrotoxic terdeteksi seluruh Hb dan PVC; dan

3. Stres oksidatif dideteksi melalui detoksifikasi enzim pengukuran aktivitas.

Phenol

Metabolisme dan marker erythrotoxic dari pada aktivitas enzim antioksidan yang masuk akal untuk fenol. Administrasi tunggal atau fraksinasi dosis menghambat aktivitas ALP dan merangsang kortisol rilis. Hb lebih tinggi pada ikan diobati dengan dosis tunggal, sedangkan dosis difraksinasi tidak memiliki efek yang signifikan (Gambar. 3). Sebaliknya,BUN tertekan karena suntikan dari dosis fraksinasi (Gbr. 2).

Kegiatan enzim antioksidan berubah setelah pengobatan fenol. Pengamatan utama bersangkutan yang superoxide dismutase mangan-dependent (MnSOD) aktivitas, yang sedikit tertekan setelah pemberian dosis tunggal. Di Selain itu, aktivitas peroksidase dan GPx yang meningkat dengan dosis difraksinasi (Gambar. 4).

OH Phenols

OH-fenol diberikan pengaruh yang lebih besar pada metabolisme dan spidol erythrotoxic dari pada enzim kegiatan. Konsentrasi glukosa secara signifikan menurun setelah suntikan dosis tunggalhydroquinone, resorsinol, dan pirokatekol. Ini efek hipoglikemik diintensifkan dalam kasus suntikan fraksinasi. Modifikasi tersebut tidak berkorelasi dengan perubahan kadar kortisol, yangyang meningkat secara signifikan pada ikan telah menerima dosis difraksinasi dari resorsinol. Plasma ALPKegiatan itu juga sensitif terhadap OH-fenol dan rendah kegiatan yang ditampilkan di bass diobati dengan fraksinasi dosis resorsinol dan pirokatekol atau dosis tunggal hydroquinone dan resorsinol (Gambar. 2). Suntikan tunggal fenolat ini menyebabkan sedikit peningkatan parameter hematologi sebagai Hb konten dan PCV, yang tidak diamati setelah suntikan fraksinasi. Prosedur tersebut dihasilkanpenurunan rendah konsentrasi darah Hb dengan pirokatekol dan pengurangan PVC pada ikan diperlakukan dengan resorsinol, sedangkan MCHC meningkat setelah suntikan berulang dari hydroquinone dan resorsinol (Gambar. 3). Mengenai kegiatan antioksidan, resorsinol dihambat dari total SOD dan MnSOD kegiatan dan aktivitas peroksidase dirangsang.

Injeksi dosis fraksinasi menyebabkan stres tertentu pada ikan dengan kemungkinan konsekuensi parameter darah. Bahkan, plasma klasik stres seperti kortisol atau glukosa tidak lebih tinggi pada ikan kontrol setelah menerima beberapa suntikan isotonik NaCl (Gambar. 2). parameter eritrosit tidak terpengaruh dengan pengecualian MnSOD Kegiatan yang lebih rendah pada ikan telah menerima suntikan difraksinasi (Gambar. 4).

Hubungan aktivitas struktur

Hubungan struktur-aktivitas dikembangkan menggunakan log n-oktanol: koefisien partisi air(log Kow) sebagai deskriptor (Tabel 1). Log Kow menurun dengan urutan sebagai berikut: fenol (1,46);pirokatekol (1,0); resorsinol (0,8); hydroquinone (0.59). Uji Pearson mengungkapkan bahwa di antara yang tidak mematikan efek, glikemia sangat berhubungan dengan koefisien partisi dari semua senyawa fenolik, bahan kimia memiliki koefisien partisi yang lebih rendah menjadi lebih aktif (OH-fenol danterutama hydroquinone). Dalam kasus OH-fenol, Kegiatan ALP dan Hb secara signifikan berkorelasi berikut injeksi dosis fraksinasi sedangkan tidak ada korelasi telah ditemukan setelah satu dosis (Gambar. 5).

Pembahasan

Karya ini menunjukkan perbedaan yang cukup besar dalam efek mematikan dan non-mematikan senyawa fenolik pada ikan laut dan informasi yang diberikan tentang hubungan struktur-aktivitas sepertibahan kimia. Atas dasar dosis mematikan, OH fenol dan fenol yang lebih beracun dari alkyland NO2-fenol. Selain itu, OH-fenol yang lebih beracun dari fenol. Di antara OH-fenol, pirokatekoladalah senyawa kuat. Hal ini pada Setidaknya 100-kali lebih beracun dari fenol, dan sepuluh kali lebih beracun dari hydroquinone dan resorsinol.

Sebagian besar fenol monosubstituted diuji di penelitian ini adalah metabolit utama dari benzena sebagai fenol, katekol dan hydroquinone (Tsutsui dkk., 1997). Mereka bertanggung jawab untuk efek fisiologis benzena di hematotoxicity tertentu (Briviba et al., 1993). Mekanisme metabolik toksisitas ini mencakup baik oksidasi dan konjugasi dengan persaingan potensial antara berbagai terlibat enzim. Ini juga mencakup interaksi antara beberapa metabolit dan akhirnya oleh intermediet lain termasuk reaktif spesies oksigen (Witz et al., 1996). fenolat yang terlibat dalam mekanisme oksidatif baik dalam berbagai langkah dalam jalur untuk biodegradasi mereka sebagai agen menghasilkan spesies oksigen reaktif atau sebagai antioksidan (Gut et al, 1996;. Hiraku dan Kawanishi, 1996).

Efek non-mematikan dari senyawa ini memiliki ditandai pada parameter darah yang cocokuntuk mengungkapkan gangguan metabolisme, atau efek tertentu pada eritrosit. Studi ini menunjukkan bahwa fenol dan OH-fenol memiliki efek metabolik. Di dasar kadar kortisol, fenol adalah stressor yang lebih aktif daripada OH-fenol; pada kenyataannya, tingkat yang lebih tinggi setelah dosis tunggal atau difraksinasi (Gbr. 2). Pengamatan ini sesuai dengan Gluth dan Hanke (1976) yang menemukan

peningkatan yang signifikan kortisol serum pada ikan mas terkena konsentrasi yang lebih tinggifenol (1-10 mg-l -1). Tiba-tiba di D. labrax, stimulasi ini tidak terhubung ke peningkatan glukosa plasma, seperti yang biasanya kasus. Banyak penulis menganggap bahwa, pada ikan, stres akut menginduksi hypercortisolemia, hiperglikemia dan hyperproteinemia sedangkan kronis stres menyebabkan hipoglikemia, sebagai konsekuensi dari cadangan gula (Hrubec et al., 1997a). Ini bisa menjadi kasus di bass laut, terutama jika stres penanganan berturut bertanggung jawab atas modifikasi dalam status makan. Selain itu, OH-fenol yang secara struktural analog dengan katekolamin dan karena itu mereka bisa bersaing dengan adrenalin ke glikemia rendah (Kaila, 1982; Cajina- Quezada dan Schultz, 1990). Lainnya metabolik tanggapan terhadap fenol seperti penurunan BUN tingkat dan aktivitas ALP (Gbr. 2) bisa menjadi mungkin konsekuensi dari nefrotoksisitas dan eliminasi yang lebih penting dalam urin (Peters et al., 1997). Pada ikan, BUN umumnya rendah (Hrubec et al., 1997b), kami telah mengamati bahwa, di bass laut, nilai-nilai hanya tiga kali lebih rendah daripada di mamalia. Penurunan tingkat BUN setelah fenolik keracunan menunjukkan kemungkinan efek pada metabolisme protein. Efek seperti yang disarankan oleh Gupta et al. (1983) pada Notopterus notopterus. Para penulis ini mengamati efek stimulasi dari senyawa fenolik pada aktivitas transaminase, yang berarti gangguan proteinmetabolisme. Namun, kita tidak pernah menemukan mengubah isi protein plasma di D. labrax

Konsentrasi Hb meningkat plasma tanda dari gangguan sel (Gambar. 3). Efek yang signifikan yang ditampilkan setelah suntikan tunggal fenol dan Ohphenols yang mengkonfirmasi erythrotoxicity iniSenyawa (Boge' dan Roche, 1996). Sebagai imbalannya, fenol kurang beracun di dasar Hb ini rilis.

Modifikasi dalam detoksifikasi radikal bebas kegiatan ikan diobati dengan fenol dan OH-fenolagak terbatas. Observasi tersebut tak terduga karena senyawa ini menghasilkan reaktifspesies oksigen. Suntikan tunggal fenol dan OH-fenol gagal mempengaruhi aktivitas SOD(Gambar. 4). Tidak adanya efek hydroquinone adalah mengherankan karena ini metabolit benzena utama menunjukkan spesies oksigen menghasilkan potensial dan kemudian dapat menyebabkan kerusakan DNA melalui H2O2 generasi dalam sel (Hiraku dan Kawanishi, 1996; Yu dan Anderson, 1997). Dalam bass laut, tidak adanya ini perubahan dalam kegiatan SOD bisa memperkuat efek spesifik H2O2 pada DNA.

Suntikan fraksinasi memiliki lebih berpengaruh pada Aktivitas SOD terutama resorsinol (Gambar. 4). Resorsinol adalah inducer sintesis monooxygenase dan senyawa methemoglobinizing kuat(Hachet, 1989). Dalam D. labrax, itu sangat mengurangi Kegiatan SOD. Namun, konsekuensi merusakperlindungan sel bisa diimbangi oleh stimulasi aktivitas total peroksidase. Sebelumnya percobaan dilakukan pada eritrosit diinkubasi dengan resorsinol selama 24 jam tidak mengkonfirmasi sepertipenurunan drastis dari total aktivitas SOD (Boge' dan Roche, 1996). Perbedaan ini bisa menjadidianggap berasal dari suatu biotransformasi in vivo dan interaksi dengan metabolit (Lemaire et al., 1990;Medinsky dkk., 1996; Bratton et al., 1997).

Kegiatan antioksidan yang jauh lebih masuk akal untuk alkilfenol dan Nitrophenol daripada OH-fenol atau fenol. Jumlah aktivitas SOD meningkat Berikut suntikan alkilfenol (o-kresol dan o-ethylphenol dan o-propilfenol), dan Nitrophenol (o-, m- dan p-nitrofenol; pribadi pengamatan).

Efek dosis tunggal tertentu diamati terutama pada Hb dengan fenol dan OH-fenol (Gambar. 3).Efek dosis fraksinasi tertentu juga diungkapkan, terutama pada aktivitas peroksidase dan BUN(Gambar. 2 dan 4). Perbedaan antara satu dan dosis fraksinasi terpengaruh terutama glukosa

dan PCV dengan OH-fenol, Hb, BUN, peroksidase dan kegiatan SOD dengan semua senyawa (Gambar.2-4). Pengamatan ini menunjukkan bahwa biotrans biotransformasi Reaksi bisa efisien untuk inisenyawa terutama dalam dosis fraksinasi. Ini Reaksi yang terkenal untuk OH-fenol (Sawahatadan Neal, 1983; Wallin dan Morgenstern, 1990; Cravedi et al., 1999). Mereka menyebabkan menengahproduk yang bisa lebih reaktif yang senyawa awal seperti dalam kasus hydroquinone (Bratton et al, 1997;.. Peters et al, 1997).

Senyawa fenolik umumnya terkonsentrasi melalui rantai makanan karena akumulasi merekalipid (Mukherjee et al., 1990). lebih rendah mereka koefisien partisi menunjukkan bahwa OH-fenolbisa dikurangi akumulasi dari fenol dan lebih bioavailable (Tabel 1). Kami mendirikan sebuahstruktur hubungan aktivitas dengan glukosa untuk fenol dan OH-fenol dan dengan ALP dan Hbuntuk OH-fenol dengan dosis fraksinasi (Gbr. 5). Akibatnya, karakter lipofilik fenoldan OH-fenol (Ancerewicz et al., 1998) bisa mempengaruhi parameter ini. Untuk parameter lainnya,khususnya BUN, yang sangat tertekan dengan dosis fraksinasi dari semua senyawa, yangtoksisitas bisa lebih tergantung pada lainnya sifat kimia dan mungkin dengan kemungkinanhubungan dengan katekolamin dalam kasus OH-fenol.

Kesimpulannya, pekerjaan ini menegaskan bahwa toksisitas fenol sangat tergantung pada struktur mereka. Efek utama mereka adalah pada beberapa plasma parameter, tetapi interaksi dengan metabolisme radikal bebas dapat berkontribusi toksisitas mereka