in vitro inhibition of α-chymotryptic activity by phenolic compounds

10
In vitro inhibition of a-chymotryptic activity by phenolic compounds Sascha Rohn, Harshadrai M Rawel, Nadine Pietruschinski and Ju ¨rgen Kroll* Institute of Nutritional Science, University of Potsdam, A Scheunert Allee 114–116, D-14558 Bergholz-Rehbruecke, Germany Abstract: a-Chymotrypsin was modi®ed by covalent attachment of selected phenolic and related compounds caffeic acid, chlorogenic acid, ferulic acid, gallic acid, quinic acid, m-/o-/p-dihydroxy- benzene and p-benzoquinone) at pH 9. The derivatives formed were characterised in terms of their activity and selected physicochemical properties. In vitro experiments showed that the proteolytic digestion of food proteins with a-chymotrypsin derivatives was adversely affected. This decrease depended on the reactivity of the phenolic and related substances tested as well as on the kind of substrate applied. The derivatisation was accompanied by a reduction in the amount of free lysine and tryptophan residues. Moreover, the solubility of the derivatives decreased over a broad pH range, with a parallel increase in the hydrophobicity. The isoelectric point was shifted to a lower pH value, and formation of high-molecular-weight fractions was documented by sodium dodecyl sulphate poly- acrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). # 2001 Society of Chemical Industry Keywords: plant phenolic substances; a-chymotrypsin; enzyme derivatisation; proteolytic activity; physico- chemical characterisation INTRODUCTION To optimise the biological utilisation of food proteins, a better understanding is needed of the various interrelated parameters that in¯uence their breakdown and nutritional value. 1 Enzyme-catalysed reactions of amino acids, proteins and enzymes with oxidised plant phenols, such as browning reactions, may cause deterioration of food during storage and processing, leading to a loss of enzyme activity and nutritional quality of food proteins. 2 Plant phenols may also display other possible detrimental effects, including inhibition of iron absorption 2 and irreversible com- plexation of gut enzymes and dietary proteins. 2±4 Consequently, polyphenol-rich foods may be nutri- tionally poor because of the poor digestibility and bioavailability of the food proteins consumed. Pheno- lic compounds have also been attributed with positive properties including antimutagenic and anticancero- genic effects as well as antioxidant activityÐa possible mechanism by which dietary components protect the body from free radicals and reactive oxygen species. 5,6 Accurate data on population-wide intakes of phe- nolic compounds are not available. Recent studies show that the human dietary intake of chlorogenic acids and other cinnamates ranges from 25 mg up to 1gday 1 depending upon the diet consumed. 7 The occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods are well reported. 8 Cinnamic acid conjugates eg caffeic, chlorogenic and feruloylquinic acids) are widely distributed in the plant kingdom, and their content in many beverages, fruits and vegetables has recently been reviewed. 7 The content of chlorogenic acid is relatively high, with 6±10% in green coffee beans, and a cup of coffee may contain up to 675 mg. 7 The absorption, metabolism and bioavailability of phenolic compounds are also controversial. Data on these aspects of phenolics are scarce and the limited data available have recently been reviewed. 9,10 The phenolic compounds are susceptible to both enzymatic and non-enzymatic oxidation in the presence of oxygen. 6,11 Much attention has been devoted to determining the exact pathway by which enzymatic browning may occur. It is now generally accepted that two reaction steps are involved: the hydroxylation of monophenols into o-diphenols and the oxidation of the o-diphenols into o-quinones. These two reactions consume oxygen and are cata- lysed by the enzymes monophenolase or cresolase, EC 1.14.18.1) and o-diphenolase or catecholase, EC 1.10.3.1). A third enzyme system, laccase EC 1.10.3.2), oxidises o-diphenols as well as p-diphenols, forming their corresponding quinones. The unique ability to oxidise p-diphenols is used to distinguish laccase activity from that of the other polyphenoloxi- dases. 12 The quinones resulting as the primary products of enzymatic oxidation represent a species of highly reactive substances which normally react (Received 8 November 2000; revised version received 26 March 2001; accepted 22 August 2001) * Correspondence to: Ju ¨rgen Kroll, Institute of Nutritional Science, University of Potsdam, A Scheunert Allee 114–116, D-14558 Bergholz- Rehbruecke, Germany E-mail: [email protected] # 2001 Society of Chemical Industry. J Sci Food Agric 0022±5142/2001/$30.00 1512 Journal of the Science of Food and Agriculture J Sci Food Agric 81:1512±1521 online: 2001) DOI: 10.1002/jsfa.977

Upload: sascha-rohn

Post on 15-Jun-2016

215 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

���� �� �� ��� ���� �� �� ���� � � ��������� � ��� ���� ��� 2/7�(�"$�("� /�����7 "11�03<67 �1��11":.����4,,

�� ����� inhibition of �-chymotryptic activity byphenolic compoundsSascha Rohn, Harshadrai M Rawel, Nadine Pietruschinski and Jurgen Kroll�Institute of Nutritional Science, University of Potsdam, A Scheunert Allee 114–116, D-14558 Bergholz-Rehbruecke, Germany

(Rec

� CoRehbE-ma

� "

��������� ��� �������� ��� ������ �� �������� ������ ��� �� �������� �������� ��� �������

�� ������ �������� ����� ����������� ����� ������� ����� ������ ����� ������ ����� ��������������

��� ��� ��� ���� ��������! �� �" #$ %�� ����������� ��� �� ���� ������������� �� ��� � �� �����

�������� ��� �������� ���������� ���� ����������$ �� ���� ������ ���� ������ ���� ��� �����������

��������� �� ���� �������� ���� ���� �������� ����������� ��� ��������� ��������$ %��� ��������

�������� �� ��� ���������� �� ��� �������� ��� ������� ���������� ������ �� ���� �� �� ��� &��� ��

��������� �������$ %�� �������������� ��� ���� ������ �� � ��������� �� ��� � ���� �� ���� ������ ���

���������� ��������$ '�������� ��� ���������� �� ��� ����������� ��������� ���� � ����� �" ������ ����

� �������� �������� �� ��� ��������������$ %�� ����������� ����� ��� ������� �� � ����� �" ������ ���

��� ����� �� ���� �������������� ��������� ��� ���� ����� �� ����� ������� �������� ����

������ ��� ��� ��������������� �()(*�+,!$

� -../ (������ �� �� ���� 0�������

1�������� ����� ������ �� ������� ������������� ������ ������������ ��������� ������ ����������� ������������

INTRODUCTION�� ������ ��� ������ �������� �� ���� ��������

� ����� ������������ � ������ �� ��� ������

����������� ���������� ���� ������ ���� ��������

��� ��������� ������� ��������������� ������� ��

���� ���� ������� ��� ������� ��� � ���� �����

�������� ��� �� ������ �������� ��� ����

����������� �� ���� ����� ������� ��� ���������

������ �� � ���� �� ������ ����� ��� ���������

!����� �� ���� ��������" #���� ������� ��� ����

������ ����� ���� �� ���������� ������� ������

�� ��� �� ��� � �������" ��� ������� �� ���

��� ���� �� ��� ������� ��� ������ ��������"$%

&����!������� ������������� ����� ��� � �����

������� ���� ����� �� ��� ���� ����� ��� ���

������ ��� �� ��� ���� ������� �������� #�����

� �������� ���� ���� ��� ���� ���� ��� ������

��������� ������ ���������� ��� ���������

��� ������ �� ���� �� ���� ���� �����'� ���� ��

������� � ��� ������ ��������� ������ ���

��� ���� ���� ������ ��� ������ � ���� ������(�)

*����� ���� �� ������������� ������ �� ����

��� �������� ��� ��� ����� ��� +���� ������

���� ���� ��� ����� ������ ����� �� ��������

��� ��� ����� �������� ������ ���� "(�� �� ��

������� �������� ���� ��� ��� ��������, ���

������� ��� ������ �� ����� ����� ���

����� � ���� �� �������� � ����� ��� ����

���������- &���� �� ��.������ /�� �����

eived 8 November 2000; revised version received 26 March 2001; ac

rrespondence to: Jurgen Kroll, Institute of Nutritional Science, Univeruecke, Germanyil: [email protected]

11� 9���� �� &����� 6�������� � ��� ���� ��� 11""$(�%":"

�������� ��� ��������!�� ���0 ��� �����

���� ���� � ��� ����� ������� ��� ���� ������

� ���� ��������� ����� ��� ������ ��� ��� �������

��� ��������, ��� ������ �� �������� �� �

��������� ���� ��� )$�12 � ����� ����� ����� ���

� �� �� ����� ��� ����� �� �� ),(���, ���

� �������� ���� ���� ��� ������ ��� �� ������

�������� ��� ���� ������������ 3��� �� �����

������ �� ������� ��� ���� ��� ��� ����� ����

����� �� ���� ������� ��� ��������4��1

��� ������ �������� ��� ������ �� �� ���

������� ��� ����������� � ����� � ���

������� �� � �����)��� 5�� �������� ��� ���

������� �� ��������� ��� � �� ������� � ���

������� ������ ��� ���� 6� � ��� ���������

������ ���� ��� ������ ����� ��� �������7 ���

����� ������ �� ����������� ��� ���������� ���

��� � ����� �� ��� ���������� ��� ��!������������ ��� ������� ������ � ���� ��� ��� ����

����� � ��� ������� ������������� /�� ���������

�& ���%��-��0 ��� ������������ /�� ���������� �&

���1�8��0� * ���� ������ ������� ����� /�&

���1�8�"0� � ���� ���������� �� ���� �� ����������������� ���� ����������� !������� ��� ��!��

� ��� �� � ��� ���������� � ���� �� ��������

����� ����� ���� ���� �� ��� ����� ����������� �

�������" ��� !������ �������� �� ��� ������

������� �� ������� � ����� ��������� � �����

�� ����� ������ �� ������ ��� �������� ����

cepted 22 August 2001�

rsity of Potsdam, A Scheunert Allee 114–116, D-14558 Bergholz-

11�:;81�11 �(�"

� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��

������� ��� ����� !������ �� ������ ���� ������

��������4 ����� ������ � ����������� �� �������

����� ��� ��������� !����� �� ������ ��� !������

��� � ������ ��������� ����������� �� ����

������ ������� ����� � ���������� ��� �� ������

��������� ������ ��� ���������� ������� � �

������ �����8 ��� "������� �� ��� ������ ��� ��

� ��� ���� �� ������� � ��� ���� ����������

��� �������� ������ ���� ������������� ������%

=��� ������� � ����� �� ��� ������ ������ �� �

����� �� ���� �� !������ � ����� ������

������( ��� ��� ���� �� �������� �� ����������

������ ����������)��, ��� ������� �� ������ ���

������ � ����� ��� �������� ������� � �������� ��

���������� ���� �� ����� ���� ��������� �� ����

������� ��� ���������������� >������ ��������

����� �� ��������� �� ������� ��� ������� �����

��������� ������ �������� � �� ����� ��� ��

��������� �� ����� ��� ������� ���������,

6� ��� ������� �� ��������� ��� ������� �� ����

������� ��� �������� ����� ���� ������ �� �����

������ ��� ������� �� �������� ��� �������� ��

�� �������� �? ������ /%� , ��� �10� ������ ����

������� �� ���� ���� �� ����� �?� ���� ���������

��� �������� �� ���� ���� ���������- ��� ���

� .���� �� ��� ������� ����� ��� �� ���� ��� ������ ��

������� ������ ������������ ��� ����� ������

�� ��� ������� �������� �� ��� ����������

��������� ��� ����� � � ����� ������ �� �? 4� ��

��� �? ��� ������ ��� ������ �������� �

����� �� �����- *������ �������� �� ������� �

���� � ���������� �� ����� ��� ����� ��� ���� ������

��� ���@���� �������� �� ������� �� ������

����� ���:�� �� � ��� �������� ���������� ������

��� �������� �� �� ����� ������ �� ������ @ ����

&�������� ��� �? �� ��� ���� �� ��� ��������������

���� ������ ������� � ��� ,�(� A� ������ �? 4 ���

��� ����������� �� ������ ��� ������� �� �������

��� ������������ ��� �� ��������� ���� ������ ���

����� �� ������ ������ * ������� ������� ��� ��

��������� ��� ������ �� ��� ������ ��� ��� �� ��

��� ����� �� ������ ������� � ��� �������� ��������

��� ������ �������� ������ ������ ���� ���

�������� �� ��� ��:��:�������� � ���������� ���� ������� �� ����� ��� ����������� �

��������� �������� ��� ���� ��� �� � ������� ��

������� ��B����!������ ��� � ����� ������ ��

�������� � ������� ��� !�� ��� ����������� ���

������� ��� ��� ���� �� � �����@�� ��

�������� �� /(��������!�� ��0� ���� ����

������ � ��� ������ <�� ������� � ��������

������� ��� �������� ����������� �� ������

�������� ��� ������ ��4 ��� ��������� /���� �

����� �������0 ������ ���� ������� ��� ���� �� ���

������ ������������ *�������� ���� �� ��

����� �� ������ �� ������ �� �11�������� ���

������ ��� ������ �� �� �� ������ � ��� �����

������

��&����������� �� ������ �� ��� ��������������

����� ������ ���� ��� ��� ����������� ���� �� ��

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

���������� �������� ��� ��������������� ���������

� ���������� ��� �� ��� �� ���� ��� ����� ��� ����

�� ���������� ��������� �� ���� �� ������

������ ��� �������������� ������������ ��� ���

���������� ��� ������ �� ��� ������ �� ���

����������� ���������� �� ��� ��������� ������

���� �������� ���� ������� �� ������ �� ��������

����� ������� ������ ���� ������ � ��� ������

����� ���������� * ������� �� ����������

��������� /��� ����� �������� �� ��� ���� ��

������� �����0 ���� �����������

6� ��������� ������������ ������� �� ������

��� �� ��� ����� ������ �� ������ ��� �����

���� ���� ������������-�"1 >������ � ��������

������ ���� ��������� ������� ��� �������� ������

�������� �� �������� �? ������ /(� , ��� 40 ��������

� � ������� � ������ ������ >�� � ������ ���

������� ����� /������� ��� ��� ��������� ���

����0 �� ��������� �������� ���������� ��� ������

��� �� �������� �� -,�)� -%�% ��� )��82 �� �? (�

, ��� 4 ����������� 9������� ��������� �� ���������

��� ���� �� �������� ��� ��������� ����� ��

-%�"� -1�" ��� ))�)2 �� �? (� , ��� 4 ����������

/������� ��� ��� �����@�� ��������� ������0�

��� ����� � � ��������� �� ��� ������� �� �����

����� ��� ����������� ������� �� ���� ������� ��

���� �� ������� ��� �������� ����� ���� ������

EXPERIMENTALMaterials��&���������� /8�0 ���� ���� ������� /�&

8�%�"���� ������ ������ 4)2� >���� &���� *C�

B���� 9���������')1���� ����� ���� ��� ������

���� ����� 9��*���*���#���#���%���������� ����

�� �? ,�- ��� "(°&� ���@ ����� ��� ��@����

!����� ���� ���� ���� � ��� ��������0 ���

�������� � ������� ����� ��� ��� �? ����� ���

��.����� �� 4 ���� 1�(5 D�<? /@��� ������ ",1��0�

<� ��� ��� �� �� ������� ����� �� ������

�� ������ �� �11������� /�!������� �� 1�"-����

�������� ��0� ��� ��� ��������� ���� ��������

��� 1�"-���� ������ �� ������� ������� ���

������ �� �������7

� ",�� �� ������������ ������� �8�� �� �������

�����:������� /�7� �:�0 ��� ��� �����@�� ������

������'��� ���������� �� �-111���� �� ���������� ������

� ",�� �� ������������ ������� �1�"-���� ��

������ �� ������� ������� � 8�� �� �������

�����:������� /�7� �:�0'��� ������� ������ ����

��������� ����� ������ ���� ��� !�� ����

��:��:�������� � ������ ��� �� ����!����� /���

���� >���� &���� *C� B���� 9���������0�

6� ��� ���� ����� ������ �� ��� ������ �� �������

������� ��� �? ��� ����.����� �� 4� *���� "%�

������ ��� ����� �������� ������ �� %°& ���

���� � ������ �� ��� ��� ������� ���� ������� ��� "%�

������ 1�11�5 ��������� �� �� %°& ��� @�����

�(�8

� ��� �� ��

���������� ��� ������������� ������������

/������0 ��� �������� ����� ��� ���� �������

�� ������ ������ �� ������ �� ������� ��������

��� �� ������� ������ ��� ������ ��� ���������

������� ���� �� �������7

� 9��*���*���#���#�������������� /9��� &����

�� &�� 9� E���� 5<� =9*0�

� ������ � ���� ����� ����� />���� &���� *C�

B���� 9���������0�

� ?��������� ����� ���� /5���� 3���������

C������0�

� ���� ������� 39� �(4� /D�� F������ 5��

#������� +�������� C������0�

� ������ ���� ���� ���� /� ������ ��� ����

������ ���� ����� ���� E0�"�

Proteolytic activity��� ��������� ��������� �� � �������� �� ������

/9��*���*���#���#��������������0 ��� ���������

������ �� � ��������������� ������ ��������

��� ������ �� ������������ �� �� ����������""

6� ������ �� ��� ������� ��� ���������

��������� /�11�� �� ������� ��� ����0 �� ��������

������ �� ������� /����� ���� �������� ������ ���

������ �� ��� )�� ��� ��(��� "5 ����� 1��5 ����

?&� �? -� 1�1"5 &�&�"0 ��� ���������� �

�� ���� �� 8(°& /������:�� ������ ���� �7)10�

*���� (� �(� 81� %( ��� )1�� � 811�� ������ ���

������� ���� ��� �� ���� � ���� ��� ���

������ ��� ������� � ������ �� 811�� �� "12

���������� �� /�&*0� ��� ������ � �����

���� ������� �� ����� ��� �1�� ��� ���� ���������

�� 41--� ��� �1�� /5������� "�1+� ?�������

?����� C������0� ��� �&*����� �� ������� ����

�������� � +#�?#E& ��������� �� � 56&+*�D#9�

&�- ����� /88���%�)��� ��(��� ��� ����

1�(�� ����� =G ������� �� ""1��0 ��� � �����

����������� �� "(°& ���� � 9������ /3�� ����

C������0 ������������ ������� * ������� �����:

��������� /����� ��@�� ��� 1��2 ����������

��� �:�0 ������� ��� ������ ����� ��� ��������

�������7 �112 ����� ��� "��� 1$,12 ���������

���� �1��� ,12 ��������� ��� %��� ,12 �����

����� �� �112 ����� ���� %��� �112 ����� ���

�1�� /�����������:�!�� �����0� ��� �.����

������ �� ��� ������� ��� �1��� ��� ����� ���� ����

�� ��� ������� ��� ���� �� !������ ��� � ���� ��

������� ��������

Physicochemical characterisation��� ������ ������ � ��� �������� ��� ���������

������ �� � ���@�� E���� �������"8

��� ���� ��� ���@�� �� ��� ��������� �������

����� ������ �? ������� ��� ��������� � �

1�1(5 D� ��������� ����� ������ � ������� ���

����� �� ������� � ����������� �� 41--� ���

�1�� /5������� "�1+� ?������� ?����� C������0�

&������ � ��� ������ �� ���� ���� ������ ����

��������� ���� ������ ������������� ��

�(�%

/�DB90 � � �2 ����� ������ �������� /9390

������� �� ��� ��������"% ���������� ��������� �

-5 ���� ��� �������� ���� � H��� ># 4"1 �����

����� ������� /C�����=������� C������� ������

H����0�"( ��� ������ /1�(�� ���� ���� �������0 ���

� ��� �� "41�� /��� �-��0 ��� ��� ������ ���

������� ���� ��� ���������� ����� 811$411�� /���

%1��0� ��� ���� ���� ����� ��� ������ ���� ����

8"1 �� 8-1�� ��� ���� �� !������ ��� ����������

������� ��� ����� � �������� :��������

������� ��� ���������� � +#�?#E& ���� �

9������ /3�� ���� C������0 ������������

������ ��� � 56&+*�D#9�&�- ����� /88���%�)��� ��(��� ��� ���� 1�(�� ����� =G �������

�� ""1 ��� 8"(��0 �� � ����� ����������� �� "(°&�

* ������� �����:��������� /����� ��@�� ���

1��2 ���������� ��� �:�0 ������� ��� ������

����� ��� �������� �������7 "12 ��������� ���

"��� "1$%12 ��������� ���� �)��� %1$,12

��������� ���� "��� ,12 ��������� ��� "���

,1$"12 ��������� ���� "��� "12 ��������� ���

�1�� /�����������:�!�� �����0� ��� �.����

������ �� ��� ������� ��� �1���5������� ����� ����������� ��� � 939�

#*C��") ��� ����� � ��� ��� ������� ��� ����

����� ���� ����������� ������ �������� /B��+��

>�����9 5���6������ ?������� &*� =9*0� 6������

�� ������ /6�>0 �� ��� ������� ��� ����� ��� �

��� �? ����� ���� 8 �� �1 /#*C�� ����� ��������

���������� �120� 9���� ����� �� ��� �����

���� �� ���� ���� �� �������� ������ �����������

#���������������� ��� ���� �� �111G ��� 8�* ���

��� ��� (1��� ����� ������ ��� ���� �� �111G

��� (�* ��� 41��� ��� ������� ���� @ �� � ���

��� ��� ���������� �� ��� ������� ����

������� ������ ��� C "(1 /9����� ?���� ����

C������0�",

Statistical analysis��� �������� �� ��� ���� ���� ������ ��� ��� �����

�� ��� �������� �� ������ ���� �������� ����� ����

��� �������� � �������� �������� ��� ������� ��

��� ���������� ��������� ��� ��������� * 9���

���� ������ ��� *D<G* ���� ��� ���� ���� ���������

����� ����� ��� * �� ��� �� � (2 ��������

������� ���� ��� �������� ������ ��� ���������

� ������ ��� �������� ������ ��� ��������� �

��� �������� @������

RESULTS AND DISCUSSIONCharacterisation of physicochemical properties������� �� ���� ��� � �������� ������ �� ������������ ��� ������ ���

������ ������� � ����������� ������� � ���

������ �� ���� ���� ������ � �������� �� ���

�����@�� ������ ������������ �� ���������

���� �DB9 ������� />� �0� ������������ �������

������ ������� �������� ���� �� ��!�����

�(4)���� ���� ���� ���������� �������"- ���

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��

����� ��������� ��� ��� �����@�� ������������

��� )���������� ������� � ��� ��� ��� !�� ��

��������� ��� ������ � ����� ��� ��� ��������� ����

���@����� �������� ���� ��� ������ �����������

��� �� ����� � ������� ��� ������ ��� ������� ��

������� ��&���������� ������� ��� ��������

�� �������� � � �)2 ������� � ���� ���� ������

/����� -� >� �0� ��� ������� ������ ���� ����

������ ��� ��� �������� �� ���� ������ ��� �����7

�������� �� � �� ����!����� � ��3?B � ����

�� � ���� �� � ��3?B � ����� �� � ��3?B

� !�� ��� A� �� ��������� ���� ��� ������� ��

����� ������ �������� � ������� � ���

��� �� �� ����� �� ������� ���� ������ ��� ���

� ���� �� ��� ��� �� ������ ���� ��� � �����

9�� ��� ������ �� ���� ���� ������ ��� ������

���� � ��� ������� �� �2 939 /� ���������� �����

��� �������� ����������� ������ ���������0� ��

�� ������ ���� ��� �������� ��� ������ �������

������� ����� C��������� ������ �� ������ ���

� ������ � ���� � ������� �������� �� � ���

������� �� ����������� ���� �� ��� ��������

!������� ��� � ���� �� ���� ��� ���� ����

������ �� �������� ��� ������� ������ �� �������

���� ���� ������ �� �� � ���� ��3?B ��

Figure 1. Content of free amino groups of �-chymotrypsin derivatives(nmolmg�1 protein): 1, unmodified control �-chymotrypsin; 2, quinic acidderivative; 3, ferulic acid derivative; 4, m-DHB derivative; 5, o-DHBderivative; 6, p-DHB derivative; 7, caffeic acid derivative; 8, chlorogenicacid derivative; 9, gallic acid derivative; 10, p-benzoquinone derivative.

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

������ �� � +����� ���) ��� ���� �� � ����� �

��������� �� ��� �? �� ��������� ��� ���� �����

�� � ������� ���� ��� ������� ������ ��� ��������

���� ������ ��� ������������� ������� ��

� ������ ��� �������� ����- ��� �������� ��

��������� ��� � ������ �� � �������� ��� ���

�������� �� �� ���������� ���!����� ��� ���

������� ������� ���������� ��3?B ��� ���� ��

���� � � ����� �����8�"4�81 ��� ������� ������

������ ���� ����� ��� ���� ��� !������ ���

������ � ������������ �� ������ ��������� ������

�� �������� �� ����� ������� /+����� �0��)

=���� ����� ������������ ��� ��3?B ���

����� �� ����� � � ���� �� ��� �����������

!������� ��� ������� ���� ���� ��� ���@��� ������������ ��� ��������� �� � ���� �� ������ �� ��3?B

��� ����� �� ��� �������� ���� ������� <��

�(�(

� ��� �� ��

���� �� � �������� �� � ���� � �������� ���

�������� �� � ���!����� ������ ��� � ���� ��

����� � �������� ������ ������� �� �������� �

+����� " ��� ��3?B ��� � +����� 8 ��� �����

���"1 ��� ���!������ ���� ������ ���� �������

��� ������ ������ �� ������ ��� ����!���� ��

����� � ����� ������� �� ������ ��������

������ �� ��� ���� ���� �� ��� ����� ������

������ � ������������ � � ����� � ��� ��������

��� �� ��� ������� ��� ���� �� ������ �� �� ������

��� �� � ��������� ��������� ��* ���� �� ������ �� � ���� ������ �������� ��

��� �������� D ���� �� ���������� ��� ���� ���

�������� �� +����� % �������) ��� !������ ��

��� ��������� ������� �� �� ������ �� ����������

������ ��� ������ ����� ������� �� "41�� ���

����������� �� ��� ������ ������ 8"1 ���

841��� *�� ������ � ����� ��� ��� ���������� � ���

��� ��� !�� ��� ����� �� ��� ��3?B ������

����� ��� ���@����� �������� ���� ��� ������

������������� �� ����� � ������� ��� ������� ���

������� �� ��� ������ �������� ��� ��� ��������

�� ���� ������ ��� �����7 �������� �� � ����

�� � �� ����!����� � ���� �� � ��3?B � ��3?B � ����� �� � ��3?B � !�� �� />� "0�

?��� ��� ������� �� ��� ������ �������� ������

���� ��� ������ �� ��� ������ �� ��� ����� ��

������7 �� ����!����� /��� � ���� ���� �� ��3?B0

� ��3?B � ��3?B � ��3?B� 9�� ��� ����������

��������� ��� �������� � ��� ������� �� -5 ����

/��������� ����������� ������ ���������0� � ��

�(�)

� ������� ���� ������� ����� ���� ������ ��

���������� � +����� %� ��� ������� ������� ����

��� ����� �������� �� ���������� � ��� �������

������ ��������� � ���� ����� �� � ������� � ���

������ ��� ��� ������ �� ������� 9���� �� ���

������� ��� ����� ������ ������� ��� ����!����

�� ����� ������� ��� ���������� ������ ��� ���� � �

����� � ��� ���������� �� ��� ������� ���

���� �� ������ �� �� ������

��� �� � ������������� ������ �� ������������ ��� ������ �� �

������ �� � ���� ������������ ������� ��� �����

��� ���@�� �� ����� � >� 8� ��� �����@��

������ ������������ ��� ���� ���� ��� ���� ���

���������� �? ����� /���� �� >�� 8* ��� 8B0�

9�� ��� ������ �� ������������ ��� ��� ������

���� �� ������ � �������� � � �����������

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

Figure 2. Content of tryptophan of �-chymotrypsin derivatives (nmol mg�1

protein): 1–10, see legend to Fig 1.

Figure 3. Solubility profiles of �-chymotrypsin derivatives (%): 1, 4–10, seelegend to Fig 1.

� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��

����� �� ��� �������� ���� ������� � ��������

����� � ���� ��� ������ � � ������ ��� �������

������ ��������� ��� !�� ��� ����� �� ���

��3?B ������ � ����� ����� � ���� ��� � ��� �?

����� "$)�(� ��� �������� � �������� ��� ���

�����@�� ������ ������������� 9������� ���

���� ��� �� ��� ����� ������������ ���������

/����� (� ) ��� �1� >� 8*� ����� ,$4� >� 8B0

�������� ���� �������� � ��������� ��� ��� ���

��������� ����� ������� �� ���� ���� ������ ���

���������� ������ ����� ������ � ���� ��� �����

��� ���� ��� �������� ������ � ��� ������ ��

������ ������ �� ��������� ��� ���� ���� ������

/>� �0 ��� ����!���� ����������� �� ���� ���

��������� �� �� � �� ������ �������� ��� ����

���� ��������� �� ��� ������ ���� ����� ������

� ���� ��� ���� ����� ��� ��������� �� ��� �������

��� �� � ����������������������� ���������* ������� �������� �������� �� ������������ ����

�� � ������� � ��� ������ ��� ������ �� �

������ � �� ��������:�������� ��������

��� �� � ���������� � +#�?#E& />�� %* ���

%B0� *� ������ � �������� �� ��� � ������ ��

��������� � ��� ����������� ������� � ���

��� ���� ��� ��� ��� �� ��� ����� �� ����� ��������

����� 6� ��������� ��� ��� ������� ������� � ����

��� ������������ �������� ��� ��� �����@��

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

������ ������������ ��� ��� !�� ��� �����

�� ��� ��3?B ��������� ������ �� ��������

������ /����� �$%� >� %*0� ��� ����������� ���

��� ��3?B �������� /���� (� >� %*0 ������ ���

������ �� � ������� � ��� ��� ���� ��� � ��������

������� ������ �� ��� ���@�� �� ������ �� �����

�������� ����� ��� � ���� � � �� � �����������

����� � ��� �������� ��� ��� �������� �� ���

��� ����� ��� ����� �������� ��� � ��� ��������

������������ �� ��� ����������� ����� ������

���� ������������ ���������� ��� �������� ������ �

��� �������� �� �� ��������� � >� %* /�����

($�10� < ������� ����� � � ���� ���������� ������

��� ������� ����� ��� �� ��� ������� />�� 8* ���

8B0 ��� ��� ������� �������� ��� * ����

��������� ������ ����� ��� ��� �������� ��

��� ���� ��� �������� ��� �������� ������� ��� ��

��� ��� ��� ��������8� #��� ������� �� 8"(�� �

��������� ���� �� ��������� ��� � ����� �������

�(�,

� ��� �� ��

�� ������ ���������8" ��� �������� �� �����

������������ ��� ������ � ����� �� ""1�� ������

�� ������ � ��� ������ �� ������ �� ������

���� � ��� ���������� ������ �����������

������ � ��� ������� />� %B0�

��� �� � ����������� ��� ���� ����������� ������ ��� ������ �� ������

������ �� ��������� � �������� ��� ���� ����

������ />� �0� C��������� � ���� �� ������ ������ ���

�� ������ �� ��� � ���� ������ ����� �� �� ��� ������ ������ �� ����� ��� ����� �� ���� ���

��������� �� �� � �� ������ �������� ��� ����

���� ��������� �� ��� ������ �� ������� � ����

����� � � ����� � ��� ������� ���� �� ���

�������� ��� � ��������� ��� �������� �������

���� �� �������������� * ������� / ���� ����

����0 ��� ��� �������� �� � �� �6 4�)1 /"(°&0�88 *�

Figure 4. RP-HPLC of �-chymotrypsin derivatives: A, detection at 220nm;B, detection at 325nm; 1–10, see legend to Fig 1.

Figure 5. IEF of �-chymotrypsin derivatives: 1–10, see legend to Fig 1.

�(�-

����� � >� (� ��� ���������� ������������

������� �������� ��� ��� ����� ������ ������

��� ������� �� ������ /!�� ��� ����� �� ���

��3?B0 ��� ��� ������ ������� ��� ������� ���

������� ����� �� �6 ,�8 ��� ,�% /����� �$%� >�

(0�8% 6� ��.����� ��� ��� ������� � ��� ������

�� �������� ������ ���� ���� ������ �� �������

������ />� �0 ��� ��� ��������� �� �� � ��

������ �������� ��� ������� ��������� �� ���

������ �������� /���� �� ���� ��� ���0� ���

��� ������� ����� �� ��� ������� ��� �������

�������� �� ��� ������ �� ��� � ��� ���

��������� � ��� � ���� ������ �� ������� *

�� ��!���� ������ �� ��� ����� ������ �� ������

��� ������������ ����� ��� ������� ���� ���� �6

,�8$,�% � ��� ������ �� ��� ����� �6 )�($,�1 ��� ���

������ ������� /����� ($�1� >� (0� A� ����

� ����� � ��� �� ������� ����������� � ��������

� ���� �� ��� � ��� ��� ���������� ����� �

�������� ������������ �� ��� ��� �������������

� �������� ������� ����� ��� ��� ����� ����

��� �6 (�% ��� ��������� ��� ��� ��������� ������

��� ��� ����� ������ ������ ��� ������� �� �

������ ��� ������� � ��� �������� �����7 ������

��� �� � ���� �� � ���� �� � ��3?B ���3?B � �� ����!������ C��������� �� �� ����

����� �� �������7 � ���� �� ��� ������ ������ ��� ��

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

Figure 6. SDS-PAGE of �-chymotrypsin derivatives: 1–10, see legend toFig 1.

� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��

������ �� ��� � ���� ������ ����� �� ������� �

�������� � � ����� � ���� ������� ����� �

��� ������� ���� ���� �� � �������

���� !" � ������939�#*C� ����������� �� ��� ������ �������

������ ������ � ��� ������ ��� � ��������

����� �� ��� "(-113� /���� �� >� )0� ����� �� ���

����� ��� � ��� ��������� /"(�483�0�"- <��� ��

��� �������� �� ������ �������� ����� �� ����

���� ��� �������� ������ � ��� ����� �1111$

�(1113� ���� � �������� ��� !�� ��� �����

�� ��� ��3?B ��������� ������� � ��������

��� �����@�� ������������� �� ���@���

������ � �������� �������� /����� �$%� >�

)0� ��� ����������� ����� �� ��� �������� �� �

�������������������� ������ ��� �� ����� ����

����� �� �111113�� ������ � ���� �� ����������

��� �� ���� ���������� �������� /����� ($- ���

�1� >� )0� 5�������� ���� �� ��� �� ����!������������� ��� ������� �� ���� ����� ��������

������� ��� ������� �� ��� ������ �� ���

��������� ��� �� �� ��� ����� ��� ��� �� ���� �����

������������������ ����� �� ���� ��� ��������

�������� ��������� ��� 939 ��� ���������������

��� ������ ������� � ��������� ���� �� ���� ��������

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

���� ����� ������ ����������� ��� � � �������

������ ���� ��� ���� ������ ������ ��� ����

����� ���� � �������� �� ��� �������� ������

��� �������� �� ���������� ������� �� � ������ ��

��� ������� �� ������ �������� ��� �������

������ ������� ��� �����7 �� ����!����� � ������

��� �� � ��3?B � ��3?B � ���� �� � ����

�� � ����� �� � ��3?B�!�� ��� *�������

���� �� ������ � ��� ������� ������ ���� ����

������ ��� ���������� �� ������������ />�� � ���

"0� ��� �������� �� ���������� ������� ����� ��

������ ���� �� � ������ � ���� �� ������� �� ����

� ������ ��� �������� �� ��� �� ����!�����/������ ����� -$�1� >� )0� #����������� ��

������ �������� �� � ���� �� �� ��!���� ������

�� �������� ������� ��� ������ �� ������ ���

������� ��� ����������8��)�"4�81 #������ ��� �

� ���� ��� ���� � �� ������� ������� �� ����

����������� !������� ��� !������� ��� ������

��������� ������������ �� ������ ������� �����

� ���������� ��� �� ������ ����������� ������

��� �������� ������� � � ������ �����8 *����

��� @��� �������� ������ ��� ������� � ����� ��

��� ������ �� ���� �� !������ � ����� ������

���� ��� ����� �� �������� �� ����������

������ �������� �� ����� � +������ � ��� %�

��� ���� ��� �� ��� ����!���� ������� �����

����� �� � ������ �� ������� �� ��� ���� ���� ������

��� ���������� ������� � ��� ���� � ��@����

� 939�#*C� �� ��� ������������ ����������

Effect of derivatisation on enzyme activity:proteolytic hydrolysis��� ����� �� ������������ ����������� ���

������ �������� �� �� � ����� ����� ���

���������� � ��� �������� ����������

6� ��� @��� ������� ��� ��������� ��������� ��

� �������� �� ������ /9��*���*���#���#���������������0� � ���� ����� ������� ��� ���������� ���

������� ��� ���������� � >� ,� <��� �� �������

��������� �� ��� ������ �� ������� ��� ���������

����� �� ������������ ��� ���@����� ������

/>� ,0� ��� ����� �� ��� ������ ��� !�� �� ���

��3?B� ��� ������ �� ��� ������� � ��� ������� ��

���� ���� ������ ��� ���������� />�� � ��� "0� ���

����������� ����� ���� � ����� ��� ��� �����

������ �������� ���������� /������ " ��� %�

>� ,0� *� � ������� ���� ������� ��� ��� ����� �� ���

��������� ����� ������ ��� �����7 �� ����!������ �������� �� � ��3?B � ���� �� � ��3?B

� ���� �� � ����� �� � ��3?B � !�� ���

A�� ������ �� ��� ������� � ��� ��������� ������

� ���� ��������� ��� � ����� ��� ��� ������ ��

���� ���� ������ ����� ��� ��� �����������

������� � ���������� �������

�� ������� ����� ������������ �� ������ � �

����� ������� ��� ������� ��������� �� �����

�� ������� ��� �� ���� ������� /���� ��������

����� ������ � ��� ������0 �� ���� ��� ������

�� ��� ��������� ��������� �� ������ �� ������� �

�(�4

� ��� �� ��

�������� �� ��� ����� �������� �� ������ ��������

� ���� >�� ��� ������� � ��� �������� �� ������

�������� ��� �� ������� ��� ���� ���� �� ����

����� ��� ���� ��������� C��������� ������� �����

��� ��� ��� ��� ���� ������ ��������� �� � ������ ��

�������� ��� ������ *� �� � ������ ��� ������� ��

��� ������� �� ���� ������� ��� ��� ������������

��������� ��� ����� � >� -� 6� �������� ��� ���

�����@�� ������ ������������� ��� ������ ��

����������� ����� ��� ��������� �� ���� �������

����� ��� � ����������� ����� ������ �� �������

���� ������� �� ������� /������� �� ��� �������

�� �����@�� ������������ ���������0 � ������

����� ��� ������� />� -0� ��� � ������ ����� � ���

���������� ������������� �������� ��� ���

���� �� ��� ������� � ��� ������ �� ���������� ���

���� ���� ������� ���� � ��@����� ��� ���

� ����� �� ��� �������� �� ��������� ���

��������� ��� ������������ ��������� ��� !��

�� ��� ��3?B � ������ � ��� ��� �����

������� �� ���������� ������� �� ������� ��

��� �����@�� ������ ������������ /���� �� >��

-* ��� -B0� ��� ��@��� ��� ����� ���� �� � ����

?������� � ��� ��� �� ��� �������� �� ������

���� ��� ������ ������ �� ��� ����������

����������� ��� ��������� �������� ��� ���������

��� ��� ������� ���� ��� /���� -� >� -B0� ���

Figure 7. Proteolytic activity of �-chymotrypsin derivatives againstSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (1unit will hydrolyse 1�molSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide min�1 at pH 7.8 and 25°C): 1–10, seelegend to Fig 1.

�("1

���� � � ������ � ��� ��� �� ��� �������� ��

�������� ��� � �������� ��� ��� �����

������� ������ ��� ��� ������ �������� ������

��� �������� ��������� ������ ��� �� ����� ����

�� ��� ������ ������ ���� �� ��� �� �������� 9�������

�� ��� ������� �� � ������ ���� ��� ��������� ������

��� ��� ������� ������ �� ������ /���� ���

���� ��� ��:��3?B ��� �� ����!�����0 ���� ���

��������� �� ��� �� ��� ��������� ���������

/����� ($,� 4 ��� �1� >�� -* ��� -B0� A�� ������ ��

��� �������� ����� �� ������ �� �������� ��� �������

������ ��������� ���� ��� ���� ������ � ���

������� �������7 �� ����!����� � ��3?B � ��3?B � ���� �� � ���� �� � �������� �� ���3?B � ����� �� � !�� ��� A� ����� ����

��� ������� ��� �� ����� ������ �� ������� �����

��� ������ �� ��� ������������ ��������� ��

��������

Figure 8. Proteolytic activity of �-chymotrypsin derivatives against wheyproteins (peak area of TCE-soluble peptides): 1, 4–10, see legend to Fig 1.

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��

CONCLUSIONS����� ��� ��� ��������� ��������-$"1 ���� ���� �����

������ �� ������ ���� ��� �������� ������

�������� ��� ������ ���� ���������� �������

��� ��� � ����� ������� ������ ��� ������� ����

����� �� ��� �� ����� ��� ���� ��� �� ��� �����

��� �� ���������� ������� � ������������� �� ���

������� ���� ��� �������� ��� ��� ��� ��� �������

������ ���� ���� ����� /�)2 ���� ���� ������

�����0� ��� � ������� �� ����� ��� ��� ���

������� ���� ��� ���� ��� �� �������������

������ ����� � �������� �� ��@�� ���� ���

������ ������� ������� ��� ���� ����������

���� �� ���� ����� ���������� ��� �������

��������� �� ������������ ��� ������ ��������

������� ���@����� ����� ������� ����� ����

������� ������� �� � ���@�� � ����� ��������

��� ��� ���� �� ���������� ���:�� �� ������

�������

REFERENCES� >������ 5� D�������� ����� �� ������� ���� �������� ����

������� * ������ � ��� ���� ���� 337)$"4 /�44)0�

" 5������� ?� B����� EC ��� &������ 35� 3����� ������ ���

������� ������ �� �������7 ���������� ������� ���

������� ��������� ��� #��� 47%"8$%%1 /�4-,0�

8 +� �� &�� ?������� *�� *���� #H� 5*����� & ��� ?�����

�*� G������ � �������� ���������� ��������� �� �

�������� ����� ��� �� ������� ��������� � $���

4-7%-1$%-) /�44�0�

% 9�� ��� *� +���� ����� ��� �� )8� ������ �� ��������� ��

������� ������������� 5.78-,($8--8 /�44�0�

( 5�������� &� ?���������� *� #������� B� ������� C� G��� #

��� B����� ?� 3����� ������� �� ������������ ��� ���

���� �� �� ���������� 3D* ������� � ��� ��������� ��

�������� ����� �� ���� /47"�48$""11 /�44)0�

) >������ 5� &�������� �������� ��� ������ ���� �� ������

������������ * ������ � ��� ���� ���� 367�("8$�(%1

/�44,0�

, &������ 5D� &�������� ��� ��� ����� ��������'�������

������� ��� ������ ������ � ��� ���� ��� 4#78)"$8,"

/�4440�

- ?������� I� <������ ��� ������ �� ����� ����� ���

����� � ���� �� �������� � ������ ���� ��� ���� ���

#��� -278�($8%, /�4-40�

4 +� ���� I� #������� #3� ����� C� 9�������� # ��� C����� A�

#����� �������� ��� ���� ���� � � ����� �������� �

������ ���� ���� 777%1�$%8) /�4440�

�1 &������ *� #����� CH� +����� A+� 9� � E� +������� *H

��� 9������ &� ?���� ����� ��� � ��� ������� ���� ��

������� ��� ������� � ��� ���� ��� 4#78,8$8,- /�4440�

�� &����� HHE ��� 9������� GE� &������������ �� ��� �������

�� ���������� ���� ����� ������ ������� � � ���� ��

����� ������� � ��� ���� ���� 5#7�"4-$�818 /�44�0�

�" D���� HH� +�����>����� >&� C���� #&� *��� 5H ���

*� ��� 9J� ������� ������ ������� � ����� ��� �����

�������� ���� ��� ���� ��� #��� 537�14$�(, /�44%0�

�8 ?����� +> ��� >��� #*� D�������� ����!����� �� ���

������� ������ ������� ��� � ���� ���������� ����

�� "%� $�� &��� /447%"8$%8( /�4-%0�

�% &������ G>� ��������� �I� 9������� GE� 9������ H ���A����

� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0

+� &������������ �� "������������������� �� ��� ��

��������� � ������� �� ����� ����� � ��� ���� ����

537"�,$""� /�4-)0�

�( 9������ 5� &������ G� C����� F ��� A���� +� < ����� ��

����� .�� "�������������� ������� ������ �� � &�������

�� ���� ����� ��� ������������ �� � ��� �� �����7 "�(���

������������� ������� ������ ��� � ���� ��� 6/7��4�$��4%

/�4-)0�

�) 5������ + ��� E������� ?H� '��� ���������%�(������ 9�������

B����� �� "")$"8� /�4-40�

�, B� ��� DH� E���� �?� ?����� � ��� A������� 5#� 5������

��������� ������ ����������� ��� � ������� ���������

������ ������ ������ � ����� ���� ��� ����������

&����������� 577(())$((,, /�44,0�

�- +���� ?� I���� H ��� +��� B� +������ �� �������� �� ���

��������'���������� ������������ ��� ���������

������� �� ��� ���������� � ���� ��� 767�14�$�14- /"1110�

�4 +���� ?� I���� H ��� 9�������� D6� #��������� �������

��� ��� ������ ��� �� ��������� ������� �� ������ �$

������ ���������� � ��� ���� ���� 327�(-1$�(-, /"1110�

"1 +���� ?� I���� H ��� +��� 9� +������ �� ������ �� ������

��� ��������'���������� ������������ ��� �������

��� ������� �� ��� ���������� ���� ���� 4-7(4$,� /"11�0�

"� B�� �� �5� 3������� *D� #������� 5C� C����� 5E�

G����������� �#� C�� ��� GJ� E������� *E ��� ���������

��� GB� 9������ ������� ����������� �� � ������ ��

���������� ������� �� ��9 ��� ���� ���� ����� ������ � ���

���� ���� 537"4,$81" /�4-)0�

"" C���� +� &����������� � $������ �� " )������ ������� G��

G� 8�� ���� �� � B�������� ?=� G����� &����� A������

�� 44$�14 /�4-80�

"8 E���� <?� +��� ����� DH� >��� *E ��� +������ H� #�����

����������� ��� >��� ������ �������� � &��� ���� /#57")($

", /�4(�0�

"% *�����D���� H� 3���������� �� ��� ������ �� ��������� �� ����

������ ������������ � ������ ������������ ��� � ���

���� ���� -47�"()$�")" /�4,"0�

"( H����� HE ��� J��� +J� =��������� � ������� ��� �����

����� ��������� �� ����$������ ��� ����$��� ������

��������� �� � �� ���� ��� *��� �� � --7"("$"(4 /�4-40�

") E����� =I� &������� �� ��������� ������� ����� ���

����� �� �� ��� ���� �� ���������� �%� #����� -447)-1$

)-( /�4,10�

", I���� H ��� +���� ?� +������ �� ����� ����������� ���

������ �� � ��� ���� ��� 4-78,)$8-% /�44)0�

"- ������� ? ��� B��� 35� 9������� �� ����������������

��@��� �� ��)-*K ���������� � $�� &��� /237,18$,�� /�4-(0�

"4 #������ A9� ��L������ ������ � ����� � �����'����

������� ��� ���� ��� ��� �������� &������ � //-7)14$

)�, /�4)40�

81 #������ A9� ��L������ ������ � ����� � �����'����

������� ��� ���� ����� �� ���� &������ � //-7)�4$

)"4 /�4)40�

8� ?������� 9 ��� D��� 9� 9��� ��� �� ��� ��� ��� �������� �

���� ��� 6.7%-)$%4� /�4-(0�

8" +����� *� #��� &3 ��� 3���� ?� #���������������� ���

>������M���� ��� A���� ������ ?#E&:=G:�&3 �� ����

��������� +#�#����� �� '��� �� ������� #378)8$8)(

/�44-0�

88 #������ &9 ��� J������ �D� #��������� ���� ��

�������� ��� ������� ����'66� &�������� ������

� ������� ��� ������� �� &������ -5/7-"$4� /�44(0�

8% +���� ?� I���� H� +����9������ B ��� ?�� �� 9� #�����

����� ��� ������� ��������� �� ����� �����������

��������� ����������� � ��� ���� ���� 377(1%8$(1(�

/�44-0�

�("�