in vitro inhibition of α-chymotryptic activity by phenolic compounds
TRANSCRIPT
���� �� �� ��� ���� �� �� ���� � � ��������� � ��� ���� ��� 2/7�(�"$�("� /�����7 "11�03<67 �1��11":.����4,,
�� ����� inhibition of �-chymotryptic activity byphenolic compoundsSascha Rohn, Harshadrai M Rawel, Nadine Pietruschinski and Jurgen Kroll�Institute of Nutritional Science, University of Potsdam, A Scheunert Allee 114–116, D-14558 Bergholz-Rehbruecke, Germany
(Rec
� CoRehbE-ma
� "
��������� ��� �������� ��� ������ �� �������� ������ ��� �� �������� �������� ��� �������
�� ������ �������� ����� ����������� ����� ������� ����� ������ ����� ������ ����� ��������������
��� ��� ��� ���� ��������! �� �" #$ %�� ����������� ��� �� ���� ������������� �� ��� � �� �����
�������� ��� �������� ���������� ���� ����������$ �� ���� ������ ���� ������ ���� ��� �����������
��������� �� ���� �������� ���� ���� �������� ����������� ��� ��������� ��������$ %��� ��������
�������� �� ��� ���������� �� ��� �������� ��� ������� ���������� ������ �� ���� �� �� ��� &��� ��
��������� �������$ %�� �������������� ��� ���� ������ �� � ��������� �� ��� � ���� �� ���� ������ ���
���������� ��������$ '�������� ��� ���������� �� ��� ����������� ��������� ���� � ����� �" ������ ����
� �������� �������� �� ��� ��������������$ %�� ����������� ����� ��� ������� �� � ����� �" ������ ���
��� ����� �� ���� �������������� ��������� ��� ���� ����� �� ����� ������� �������� ����
������ ��� ��� ��������������� �()(*�+,!$
� -../ (������ �� �� ���� 0�������
1�������� ����� ������ �� ������� ������������� ������ ������������ ��������� ������ ����������� ������������
INTRODUCTION�� ������ ��� ������ �������� �� ���� ��������
� ����� ������������ � ������ �� ��� ������
����������� ���������� ���� ������ ���� ��������
��� ��������� ������� ��������������� ������� ��
���� ���� ������� ��� ������� ��� � ���� �����
�������� ��� �� ������ �������� ��� ����
����������� �� ���� ����� ������� ��� ���������
������ �� � ���� �� ������ ����� ��� ���������
!����� �� ���� ��������" #���� ������� ��� ����
������ ����� ���� �� ���������� ������� ������
�� ��� �� ��� � �������" ��� ������� �� ���
��� ���� �� ��� ������� ��� ������ ��������"$%
&����!������� ������������� ����� ��� � �����
������� ���� ����� �� ��� ���� ����� ��� ���
������ ��� �� ��� ���� ������� �������� #�����
� �������� ���� ���� ��� ���� ���� ��� ������
��������� ������ ���������� ��� ���������
��� ������ �� ���� �� ���� ���� �����'� ���� ��
������� � ��� ������ ��������� ������ ���
��� ���� ���� ������ ��� ������ � ���� ������(�)
*����� ���� �� ������������� ������ �� ����
��� �������� ��� ��� ����� ��� +���� ������
���� ���� ��� ����� ������ ����� �� ��������
��� ��� ����� �������� ������ ���� "(�� �� ��
������� �������� ���� ��� ��� ��������, ���
������� ��� ������ �� ����� ����� ���
����� � ���� �� �������� � ����� ��� ����
���������- &���� �� ��.������ /�� �����
eived 8 November 2000; revised version received 26 March 2001; ac
rrespondence to: Jurgen Kroll, Institute of Nutritional Science, Univeruecke, Germanyil: [email protected]
11� 9���� �� &����� 6�������� � ��� ���� ��� 11""$(�%":"
�������� ��� ��������!�� ���0 ��� �����
���� ���� � ��� ����� ������� ��� ���� ������
� ���� ��������� ����� ��� ������ ��� ��� �������
��� ��������, ��� ������ �� �������� �� �
��������� ���� ��� )$�12 � ����� ����� ����� ���
� �� �� ����� ��� ����� �� �� ),(���, ���
� �������� ���� ���� ��� ������ ��� �� ������
�������� ��� ���� ������������ 3��� �� �����
������ �� ������� ��� ���� ��� ��� ����� ����
����� �� ���� ������� ��� ��������4��1
��� ������ �������� ��� ������ �� �� ���
������� ��� ����������� � ����� � ���
������� �� � �����)��� 5�� �������� ��� ���
������� �� ��������� ��� � �� ������� � ���
������� ������ ��� ���� 6� � ��� ���������
������ ���� ��� ������ ����� ��� �������7 ���
����� ������ �� ����������� ��� ���������� ���
��� � ����� �� ��� ���������� ��� ��!������������ ��� ������� ������ � ���� ��� ��� ����
����� � ��� ������� ������������� /�� ���������
�& ���%��-��0 ��� ������������ /�� ���������� �&
���1�8��0� * ���� ������ ������� ����� /�&
���1�8�"0� � ���� ���������� �� ���� �� ����������������� ���� ����������� !������� ��� ��!��
� ��� �� � ��� ���������� � ���� �� ��������
����� ����� ���� ���� �� ��� ����� ����������� �
�������" ��� !������ �������� �� ��� ������
������� �� ������� � ����� ��������� � �����
�� ����� ������ �� ������ ��� �������� ����
cepted 22 August 2001�
rsity of Potsdam, A Scheunert Allee 114–116, D-14558 Bergholz-
11�:;81�11 �(�"
� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��
������� ��� ����� !������ �� ������ ���� ������
��������4 ����� ������ � ����������� �� �������
����� ��� ��������� !����� �� ������ ��� !������
��� � ������ ��������� ����������� �� ����
������ ������� ����� � ���������� ��� �� ������
��������� ������ ��� ���������� ������� � �
������ �����8 ��� "������� �� ��� ������ ��� ��
� ��� ���� �� ������� � ��� ���� ����������
��� �������� ������ ���� ������������� ������%
=��� ������� � ����� �� ��� ������ ������ �� �
����� �� ���� �� !������ � ����� ������
������( ��� ��� ���� �� �������� �� ����������
������ ����������)��, ��� ������� �� ������ ���
������ � ����� ��� �������� ������� � �������� ��
���������� ���� �� ����� ���� ��������� �� ����
������� ��� ���������������� >������ ��������
����� �� ��������� �� ������� ��� ������� �����
��������� ������ �������� � �� ����� ��� ��
��������� �� ����� ��� ������� ���������,
6� ��� ������� �� ��������� ��� ������� �� ����
������� ��� �������� ����� ���� ������ �� �����
������ ��� ������� �� �������� ��� �������� ��
�� �������� �? ������ /%� , ��� �10� ������ ����
������� �� ���� ���� �� ����� �?� ���� ���������
��� �������� �� ���� ���� ���������- ��� ���
� .���� �� ��� ������� ����� ��� �� ���� ��� ������ ��
������� ������ ������������ ��� ����� ������
�� ��� ������� �������� �� ��� ����������
��������� ��� ����� � � ����� ������ �� �? 4� ��
��� �? ��� ������ ��� ������ �������� �
����� �� �����- *������ �������� �� ������� �
���� � ���������� �� ����� ��� ����� ��� ���� ������
��� ���@���� �������� �� ������� �� ������
����� ���:�� �� � ��� �������� ���������� ������
��� �������� �� �� ����� ������ �� ������ @ ����
&�������� ��� �? �� ��� ���� �� ��� ��������������
���� ������ ������� � ��� ,�(� A� ������ �? 4 ���
��� ����������� �� ������ ��� ������� �� �������
��� ������������ ��� �� ��������� ���� ������ ���
����� �� ������ ������ * ������� ������� ��� ��
��������� ��� ������ �� ��� ������ ��� ��� �� ��
��� ����� �� ������ ������� � ��� �������� ��������
��� ������ �������� ������ ������ ���� ���
�������� �� ��� ��:��:�������� � ���������� ���� ������� �� ����� ��� ����������� �
��������� �������� ��� ���� ��� �� � ������� ��
������� ��B����!������ ��� � ����� ������ ��
�������� � ������� ��� !�� ��� ����������� ���
������� ��� ��� ���� �� � �����@�� ��
�������� �� /(��������!�� ��0� ���� ����
������ � ��� ������ <�� ������� � ��������
������� ��� �������� ����������� �� ������
�������� ��� ������ ��4 ��� ��������� /���� �
����� �������0 ������ ���� ������� ��� ���� �� ���
������ ������������ *�������� ���� �� ��
����� �� ������ �� ������ �� �11�������� ���
������ ��� ������ �� �� �� ������ � ��� �����
������
��&����������� �� ������ �� ��� ��������������
����� ������ ���� ��� ��� ����������� ���� �� ��
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
���������� �������� ��� ��������������� ���������
� ���������� ��� �� ��� �� ���� ��� ����� ��� ����
�� ���������� ��������� �� ���� �� ������
������ ��� �������������� ������������ ��� ���
���������� ��� ������ �� ��� ������ �� ���
����������� ���������� �� ��� ��������� ������
���� �������� ���� ������� �� ������ �� ��������
����� ������� ������ ���� ������ � ��� ������
����� ���������� * ������� �� ����������
��������� /��� ����� �������� �� ��� ���� ��
������� �����0 ���� �����������
6� ��������� ������������ ������� �� ������
��� �� ��� ����� ������ �� ������ ��� �����
���� ���� ������������-�"1 >������ � ��������
������ ���� ��������� ������� ��� �������� ������
�������� �� �������� �? ������ /(� , ��� 40 ��������
� � ������� � ������ ������ >�� � ������ ���
������� ����� /������� ��� ��� ��������� ���
����0 �� ��������� �������� ���������� ��� ������
��� �� �������� �� -,�)� -%�% ��� )��82 �� �? (�
, ��� 4 ����������� 9������� ��������� �� ���������
��� ���� �� �������� ��� ��������� ����� ��
-%�"� -1�" ��� ))�)2 �� �? (� , ��� 4 ����������
/������� ��� ��� �����@�� ��������� ������0�
��� ����� � � ��������� �� ��� ������� �� �����
����� ��� ����������� ������� �� ���� ������� ��
���� �� ������� ��� �������� ����� ���� ������
EXPERIMENTALMaterials��&���������� /8�0 ���� ���� ������� /�&
8�%�"���� ������ ������ 4)2� >���� &���� *C�
B���� 9���������')1���� ����� ���� ��� ������
���� ����� 9��*���*���#���#���%���������� ����
�� �? ,�- ��� "(°&� ���@ ����� ��� ��@����
!����� ���� ���� ���� � ��� ��������0 ���
�������� � ������� ����� ��� ��� �? ����� ���
��.����� �� 4 ���� 1�(5 D�<? /@��� ������ ",1��0�
<� ��� ��� �� �� ������� ����� �� ������
�� ������ �� �11������� /�!������� �� 1�"-����
�������� ��0� ��� ��� ��������� ���� ��������
��� 1�"-���� ������ �� ������� ������� ���
������ �� �������7
� ",�� �� ������������ ������� �8�� �� �������
�����:������� /�7� �:�0 ��� ��� �����@�� ������
������'��� ���������� �� �-111���� �� ���������� ������
� ",�� �� ������������ ������� �1�"-���� ��
������ �� ������� ������� � 8�� �� �������
�����:������� /�7� �:�0'��� ������� ������ ����
��������� ����� ������ ���� ��� !�� ����
��:��:�������� � ������ ��� �� ����!����� /���
���� >���� &���� *C� B���� 9���������0�
6� ��� ���� ����� ������ �� ��� ������ �� �������
������� ��� �? ��� ����.����� �� 4� *���� "%�
������ ��� ����� �������� ������ �� %°& ���
���� � ������ �� ��� ��� ������� ���� ������� ��� "%�
������ 1�11�5 ��������� �� �� %°& ��� @�����
�(�8
� ��� �� ��
���������� ��� ������������� ������������
/������0 ��� �������� ����� ��� ���� �������
�� ������ ������ �� ������ �� ������� ��������
��� �� ������� ������ ��� ������ ��� ���������
������� ���� �� �������7
� 9��*���*���#���#�������������� /9��� &����
�� &�� 9� E���� 5<� =9*0�
� ������ � ���� ����� ����� />���� &���� *C�
B���� 9���������0�
� ?��������� ����� ���� /5���� 3���������
C������0�
� ���� ������� 39� �(4� /D�� F������ 5��
#������� +�������� C������0�
� ������ ���� ���� ���� /� ������ ��� ����
������ ���� ����� ���� E0�"�
Proteolytic activity��� ��������� ��������� �� � �������� �� ������
/9��*���*���#���#��������������0 ��� ���������
������ �� � ��������������� ������ ��������
��� ������ �� ������������ �� �� ����������""
6� ������ �� ��� ������� ��� ���������
��������� /�11�� �� ������� ��� ����0 �� ��������
������ �� ������� /����� ���� �������� ������ ���
������ �� ��� )�� ��� ��(��� "5 ����� 1��5 ����
?&� �? -� 1�1"5 &�&�"0 ��� ���������� �
�� ���� �� 8(°& /������:�� ������ ���� �7)10�
*���� (� �(� 81� %( ��� )1�� � 811�� ������ ���
������� ���� ��� �� ���� � ���� ��� ���
������ ��� ������� � ������ �� 811�� �� "12
���������� �� /�&*0� ��� ������ � �����
���� ������� �� ����� ��� �1�� ��� ���� ���������
�� 41--� ��� �1�� /5������� "�1+� ?�������
?����� C������0� ��� �&*����� �� ������� ����
�������� � +#�?#E& ��������� �� � 56&+*�D#9�
&�- ����� /88���%�)��� ��(��� ��� ����
1�(�� ����� =G ������� �� ""1��0 ��� � �����
����������� �� "(°& ���� � 9������ /3�� ����
C������0 ������������ ������� * ������� �����:
��������� /����� ��@�� ��� 1��2 ����������
��� �:�0 ������� ��� ������ ����� ��� ��������
�������7 �112 ����� ��� "��� 1$,12 ���������
���� �1��� ,12 ��������� ��� %��� ,12 �����
����� �� �112 ����� ���� %��� �112 ����� ���
�1�� /�����������:�!�� �����0� ��� �.����
������ �� ��� ������� ��� �1��� ��� ����� ���� ����
�� ��� ������� ��� ���� �� !������ ��� � ���� ��
������� ��������
Physicochemical characterisation��� ������ ������ � ��� �������� ��� ���������
������ �� � ���@�� E���� �������"8
��� ���� ��� ���@�� �� ��� ��������� �������
����� ������ �? ������� ��� ��������� � �
1�1(5 D� ��������� ����� ������ � ������� ���
����� �� ������� � ����������� �� 41--� ���
�1�� /5������� "�1+� ?������� ?����� C������0�
&������ � ��� ������ �� ���� ���� ������ ����
��������� ���� ������ ������������� ��
�(�%
/�DB90 � � �2 ����� ������ �������� /9390
������� �� ��� ��������"% ���������� ��������� �
-5 ���� ��� �������� ���� � H��� ># 4"1 �����
����� ������� /C�����=������� C������� ������
H����0�"( ��� ������ /1�(�� ���� ���� �������0 ���
� ��� �� "41�� /��� �-��0 ��� ��� ������ ���
������� ���� ��� ���������� ����� 811$411�� /���
%1��0� ��� ���� ���� ����� ��� ������ ���� ����
8"1 �� 8-1�� ��� ���� �� !������ ��� ����������
������� ��� ����� � �������� :��������
������� ��� ���������� � +#�?#E& ���� �
9������ /3�� ���� C������0 ������������
������ ��� � 56&+*�D#9�&�- ����� /88���%�)��� ��(��� ��� ���� 1�(�� ����� =G �������
�� ""1 ��� 8"(��0 �� � ����� ����������� �� "(°&�
* ������� �����:��������� /����� ��@�� ���
1��2 ���������� ��� �:�0 ������� ��� ������
����� ��� �������� �������7 "12 ��������� ���
"��� "1$%12 ��������� ���� �)��� %1$,12
��������� ���� "��� ,12 ��������� ��� "���
,1$"12 ��������� ���� "��� "12 ��������� ���
�1�� /�����������:�!�� �����0� ��� �.����
������ �� ��� ������� ��� �1���5������� ����� ����������� ��� � 939�
#*C��") ��� ����� � ��� ��� ������� ��� ����
����� ���� ����������� ������ �������� /B��+��
>�����9 5���6������ ?������� &*� =9*0� 6������
�� ������ /6�>0 �� ��� ������� ��� ����� ��� �
��� �? ����� ���� 8 �� �1 /#*C�� ����� ��������
���������� �120� 9���� ����� �� ��� �����
���� �� ���� ���� �� �������� ������ �����������
#���������������� ��� ���� �� �111G ��� 8�* ���
��� ��� (1��� ����� ������ ��� ���� �� �111G
��� (�* ��� 41��� ��� ������� ���� @ �� � ���
��� ��� ���������� �� ��� ������� ����
������� ������ ��� C "(1 /9����� ?���� ����
C������0�",
Statistical analysis��� �������� �� ��� ���� ���� ������ ��� ��� �����
�� ��� �������� �� ������ ���� �������� ����� ����
��� �������� � �������� �������� ��� ������� ��
��� ���������� ��������� ��� ��������� * 9���
���� ������ ��� *D<G* ���� ��� ���� ���� ���������
����� ����� ��� * �� ��� �� � (2 ��������
������� ���� ��� �������� ������ ��� ���������
� ������ ��� �������� ������ ��� ��������� �
��� �������� @������
RESULTS AND DISCUSSIONCharacterisation of physicochemical properties������� �� ���� ��� � �������� ������ �� ������������ ��� ������ ���
������ ������� � ����������� ������� � ���
������ �� ���� ���� ������ � �������� �� ���
�����@�� ������ ������������ �� ���������
���� �DB9 ������� />� �0� ������������ �������
������ ������� �������� ���� �� ��!�����
�(4)���� ���� ���� ���������� �������"- ���
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��
����� ��������� ��� ��� �����@�� ������������
��� )���������� ������� � ��� ��� ��� !�� ��
��������� ��� ������ � ����� ��� ��� ��������� ����
���@����� �������� ���� ��� ������ �����������
��� �� ����� � ������� ��� ������ ��� ������� ��
������� ��&���������� ������� ��� ��������
�� �������� � � �)2 ������� � ���� ���� ������
/����� -� >� �0� ��� ������� ������ ���� ����
������ ��� ��� �������� �� ���� ������ ��� �����7
�������� �� � �� ����!����� � ��3?B � ����
�� � ���� �� � ��3?B � ����� �� � ��3?B
� !�� ��� A� �� ��������� ���� ��� ������� ��
����� ������ �������� � ������� � ���
��� �� �� ����� �� ������� ���� ������ ��� ���
� ���� �� ��� ��� �� ������ ���� ��� � �����
9�� ��� ������ �� ���� ���� ������ ��� ������
���� � ��� ������� �� �2 939 /� ���������� �����
��� �������� ����������� ������ ���������0� ��
�� ������ ���� ��� �������� ��� ������ �������
������� ����� C��������� ������ �� ������ ���
� ������ � ���� � ������� �������� �� � ���
������� �� ����������� ���� �� ��� ��������
!������� ��� � ���� �� ���� ��� ���� ����
������ �� �������� ��� ������� ������ �� �������
���� ���� ������ �� �� � ���� ��3?B ��
Figure 1. Content of free amino groups of �-chymotrypsin derivatives(nmolmg�1 protein): 1, unmodified control �-chymotrypsin; 2, quinic acidderivative; 3, ferulic acid derivative; 4, m-DHB derivative; 5, o-DHBderivative; 6, p-DHB derivative; 7, caffeic acid derivative; 8, chlorogenicacid derivative; 9, gallic acid derivative; 10, p-benzoquinone derivative.
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
������ �� � +����� ���) ��� ���� �� � ����� �
��������� �� ��� �? �� ��������� ��� ���� �����
�� � ������� ���� ��� ������� ������ ��� ��������
���� ������ ��� ������������� ������� ��
� ������ ��� �������� ����- ��� �������� ��
��������� ��� � ������ �� � �������� ��� ���
�������� �� �� ���������� ���!����� ��� ���
������� ������� ���������� ��3?B ��� ���� ��
���� � � ����� �����8�"4�81 ��� ������� ������
������ ���� ����� ��� ���� ��� !������ ���
������ � ������������ �� ������ ��������� ������
�� �������� �� ����� ������� /+����� �0��)
=���� ����� ������������ ��� ��3?B ���
����� �� ����� � � ���� �� ��� �����������
!������� ��� ������� ���� ���� ��� ���@��� ������������ ��� ��������� �� � ���� �� ������ �� ��3?B
��� ����� �� ��� �������� ���� ������� <��
�(�(
� ��� �� ��
���� �� � �������� �� � ���� � �������� ���
�������� �� � ���!����� ������ ��� � ���� ��
����� � �������� ������ ������� �� �������� �
+����� " ��� ��3?B ��� � +����� 8 ��� �����
���"1 ��� ���!������ ���� ������ ���� �������
��� ������ ������ �� ������ ��� ����!���� ��
����� � ����� ������� �� ������ ��������
������ �� ��� ���� ���� �� ��� ����� ������
������ � ������������ � � ����� � ��� ��������
��� �� ��� ������� ��� ���� �� ������ �� �� ������
��� �� � ��������� ��������� ��* ���� �� ������ �� � ���� ������ �������� ��
��� �������� D ���� �� ���������� ��� ���� ���
�������� �� +����� % �������) ��� !������ ��
��� ��������� ������� �� �� ������ �� ����������
������ ��� ������ ����� ������� �� "41�� ���
����������� �� ��� ������ ������ 8"1 ���
841��� *�� ������ � ����� ��� ��� ���������� � ���
��� ��� !�� ��� ����� �� ��� ��3?B ������
����� ��� ���@����� �������� ���� ��� ������
������������� �� ����� � ������� ��� ������� ���
������� �� ��� ������ �������� ��� ��� ��������
�� ���� ������ ��� �����7 �������� �� � ����
�� � �� ����!����� � ���� �� � ��3?B � ��3?B � ����� �� � ��3?B � !�� �� />� "0�
?��� ��� ������� �� ��� ������ �������� ������
���� ��� ������ �� ��� ������ �� ��� ����� ��
������7 �� ����!����� /��� � ���� ���� �� ��3?B0
� ��3?B � ��3?B � ��3?B� 9�� ��� ����������
��������� ��� �������� � ��� ������� �� -5 ����
/��������� ����������� ������ ���������0� � ��
�(�)
� ������� ���� ������� ����� ���� ������ ��
���������� � +����� %� ��� ������� ������� ����
��� ����� �������� �� ���������� � ��� �������
������ ��������� � ���� ����� �� � ������� � ���
������ ��� ��� ������ �� ������� 9���� �� ���
������� ��� ����� ������ ������� ��� ����!����
�� ����� ������� ��� ���������� ������ ��� ���� � �
����� � ��� ���������� �� ��� ������� ���
���� �� ������ �� �� ������
��� �� � ������������� ������ �� ������������ ��� ������ �� �
������ �� � ���� ������������ ������� ��� �����
��� ���@�� �� ����� � >� 8� ��� �����@��
������ ������������ ��� ���� ���� ��� ���� ���
���������� �? ����� /���� �� >�� 8* ��� 8B0�
9�� ��� ������ �� ������������ ��� ��� ������
���� �� ������ � �������� � � �����������
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
Figure 2. Content of tryptophan of �-chymotrypsin derivatives (nmol mg�1
protein): 1–10, see legend to Fig 1.
Figure 3. Solubility profiles of �-chymotrypsin derivatives (%): 1, 4–10, seelegend to Fig 1.
� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��
����� �� ��� �������� ���� ������� � ��������
����� � ���� ��� ������ � � ������ ��� �������
������ ��������� ��� !�� ��� ����� �� ���
��3?B ������ � ����� ����� � ���� ��� � ��� �?
����� "$)�(� ��� �������� � �������� ��� ���
�����@�� ������ ������������� 9������� ���
���� ��� �� ��� ����� ������������ ���������
/����� (� ) ��� �1� >� 8*� ����� ,$4� >� 8B0
�������� ���� �������� � ��������� ��� ��� ���
��������� ����� ������� �� ���� ���� ������ ���
���������� ������ ����� ������ � ���� ��� �����
��� ���� ��� �������� ������ � ��� ������ ��
������ ������ �� ��������� ��� ���� ���� ������
/>� �0 ��� ����!���� ����������� �� ���� ���
��������� �� �� � �� ������ �������� ��� ����
���� ��������� �� ��� ������ ���� ����� ������
� ���� ��� ���� ����� ��� ��������� �� ��� �������
��� �� � ����������������������� ���������* ������� �������� �������� �� ������������ ����
�� � ������� � ��� ������ ��� ������ �� �
������ � �� ��������:�������� ��������
��� �� � ���������� � +#�?#E& />�� %* ���
%B0� *� ������ � �������� �� ��� � ������ ��
��������� � ��� ����������� ������� � ���
��� ���� ��� ��� ��� �� ��� ����� �� ����� ��������
����� 6� ��������� ��� ��� ������� ������� � ����
��� ������������ �������� ��� ��� �����@��
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
������ ������������ ��� ��� !�� ��� �����
�� ��� ��3?B ��������� ������ �� ��������
������ /����� �$%� >� %*0� ��� ����������� ���
��� ��3?B �������� /���� (� >� %*0 ������ ���
������ �� � ������� � ��� ��� ���� ��� � ��������
������� ������ �� ��� ���@�� �� ������ �� �����
�������� ����� ��� � ���� � � �� � �����������
����� � ��� �������� ��� ��� �������� �� ���
��� ����� ��� ����� �������� ��� � ��� ��������
������������ �� ��� ����������� ����� ������
���� ������������ ���������� ��� �������� ������ �
��� �������� �� �� ��������� � >� %* /�����
($�10� < ������� ����� � � ���� ���������� ������
��� ������� ����� ��� �� ��� ������� />�� 8* ���
8B0 ��� ��� ������� �������� ��� * ����
��������� ������ ����� ��� ��� �������� ��
��� ���� ��� �������� ��� �������� ������� ��� ��
��� ��� ��� ��������8� #��� ������� �� 8"(�� �
��������� ���� �� ��������� ��� � ����� �������
�(�,
� ��� �� ��
�� ������ ���������8" ��� �������� �� �����
������������ ��� ������ � ����� �� ""1�� ������
�� ������ � ��� ������ �� ������ �� ������
���� � ��� ���������� ������ �����������
������ � ��� ������� />� %B0�
��� �� � ����������� ��� ���� ����������� ������ ��� ������ �� ������
������ �� ��������� � �������� ��� ���� ����
������ />� �0� C��������� � ���� �� ������ ������ ���
�� ������ �� ��� � ���� ������ ����� �� �� ��� ������ ������ �� ����� ��� ����� �� ���� ���
��������� �� �� � �� ������ �������� ��� ����
���� ��������� �� ��� ������ �� ������� � ����
����� � � ����� � ��� ������� ���� �� ���
�������� ��� � ��������� ��� �������� �������
���� �� �������������� * ������� / ���� ����
����0 ��� ��� �������� �� � �� �6 4�)1 /"(°&0�88 *�
Figure 4. RP-HPLC of �-chymotrypsin derivatives: A, detection at 220nm;B, detection at 325nm; 1–10, see legend to Fig 1.
Figure 5. IEF of �-chymotrypsin derivatives: 1–10, see legend to Fig 1.
�(�-
����� � >� (� ��� ���������� ������������
������� �������� ��� ��� ����� ������ ������
��� ������� �� ������ /!�� ��� ����� �� ���
��3?B0 ��� ��� ������ ������� ��� ������� ���
������� ����� �� �6 ,�8 ��� ,�% /����� �$%� >�
(0�8% 6� ��.����� ��� ��� ������� � ��� ������
�� �������� ������ ���� ���� ������ �� �������
������ />� �0 ��� ��� ��������� �� �� � ��
������ �������� ��� ������� ��������� �� ���
������ �������� /���� �� ���� ��� ���0� ���
��� ������� ����� �� ��� ������� ��� �������
�������� �� ��� ������ �� ��� � ��� ���
��������� � ��� � ���� ������ �� ������� *
�� ��!���� ������ �� ��� ����� ������ �� ������
��� ������������ ����� ��� ������� ���� ���� �6
,�8$,�% � ��� ������ �� ��� ����� �6 )�($,�1 ��� ���
������ ������� /����� ($�1� >� (0� A� ����
� ����� � ��� �� ������� ����������� � ��������
� ���� �� ��� � ��� ��� ���������� ����� �
�������� ������������ �� ��� ��� �������������
� �������� ������� ����� ��� ��� ����� ����
��� �6 (�% ��� ��������� ��� ��� ��������� ������
��� ��� ����� ������ ������ ��� ������� �� �
������ ��� ������� � ��� �������� �����7 ������
��� �� � ���� �� � ���� �� � ��3?B ���3?B � �� ����!������ C��������� �� �� ����
����� �� �������7 � ���� �� ��� ������ ������ ��� ��
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
Figure 6. SDS-PAGE of �-chymotrypsin derivatives: 1–10, see legend toFig 1.
� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��
������ �� ��� � ���� ������ ����� �� ������� �
�������� � � ����� � ���� ������� ����� �
��� ������� ���� ���� �� � �������
���� !" � ������939�#*C� ����������� �� ��� ������ �������
������ ������ � ��� ������ ��� � ��������
����� �� ��� "(-113� /���� �� >� )0� ����� �� ���
����� ��� � ��� ��������� /"(�483�0�"- <��� ��
��� �������� �� ������ �������� ����� �� ����
���� ��� �������� ������ � ��� ����� �1111$
�(1113� ���� � �������� ��� !�� ��� �����
�� ��� ��3?B ��������� ������� � ��������
��� �����@�� ������������� �� ���@���
������ � �������� �������� /����� �$%� >�
)0� ��� ����������� ����� �� ��� �������� �� �
�������������������� ������ ��� �� ����� ����
����� �� �111113�� ������ � ���� �� ����������
��� �� ���� ���������� �������� /����� ($- ���
�1� >� )0� 5�������� ���� �� ��� �� ����!������������� ��� ������� �� ���� ����� ��������
������� ��� ������� �� ��� ������ �� ���
��������� ��� �� �� ��� ����� ��� ��� �� ���� �����
������������������ ����� �� ���� ��� ��������
�������� ��������� ��� 939 ��� ���������������
��� ������ ������� � ��������� ���� �� ���� ��������
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
���� ����� ������ ����������� ��� � � �������
������ ���� ��� ���� ������ ������ ��� ����
����� ���� � �������� �� ��� �������� ������
��� �������� �� ���������� ������� �� � ������ ��
��� ������� �� ������ �������� ��� �������
������ ������� ��� �����7 �� ����!����� � ������
��� �� � ��3?B � ��3?B � ���� �� � ����
�� � ����� �� � ��3?B�!�� ��� *�������
���� �� ������ � ��� ������� ������ ���� ����
������ ��� ���������� �� ������������ />�� � ���
"0� ��� �������� �� ���������� ������� ����� ��
������ ���� �� � ������ � ���� �� ������� �� ����
� ������ ��� �������� �� ��� �� ����!�����/������ ����� -$�1� >� )0� #����������� ��
������ �������� �� � ���� �� �� ��!���� ������
�� �������� ������� ��� ������ �� ������ ���
������� ��� ����������8��)�"4�81 #������ ��� �
� ���� ��� ���� � �� ������� ������� �� ����
����������� !������� ��� !������� ��� ������
��������� ������������ �� ������ ������� �����
� ���������� ��� �� ������ ����������� ������
��� �������� ������� � � ������ �����8 *����
��� @��� �������� ������ ��� ������� � ����� ��
��� ������ �� ���� �� !������ � ����� ������
���� ��� ����� �� �������� �� ����������
������ �������� �� ����� � +������ � ��� %�
��� ���� ��� �� ��� ����!���� ������� �����
����� �� � ������ �� ������� �� ��� ���� ���� ������
��� ���������� ������� � ��� ���� � ��@����
� 939�#*C� �� ��� ������������ ����������
Effect of derivatisation on enzyme activity:proteolytic hydrolysis��� ����� �� ������������ ����������� ���
������ �������� �� �� � ����� ����� ���
���������� � ��� �������� ����������
6� ��� @��� ������� ��� ��������� ��������� ��
� �������� �� ������ /9��*���*���#���#���������������0� � ���� ����� ������� ��� ���������� ���
������� ��� ���������� � >� ,� <��� �� �������
��������� �� ��� ������ �� ������� ��� ���������
����� �� ������������ ��� ���@����� ������
/>� ,0� ��� ����� �� ��� ������ ��� !�� �� ���
��3?B� ��� ������ �� ��� ������� � ��� ������� ��
���� ���� ������ ��� ���������� />�� � ��� "0� ���
����������� ����� ���� � ����� ��� ��� �����
������ �������� ���������� /������ " ��� %�
>� ,0� *� � ������� ���� ������� ��� ��� ����� �� ���
��������� ����� ������ ��� �����7 �� ����!������ �������� �� � ��3?B � ���� �� � ��3?B
� ���� �� � ����� �� � ��3?B � !�� ���
A�� ������ �� ��� ������� � ��� ��������� ������
� ���� ��������� ��� � ����� ��� ��� ������ ��
���� ���� ������ ����� ��� ��� �����������
������� � ���������� �������
�� ������� ����� ������������ �� ������ � �
����� ������� ��� ������� ��������� �� �����
�� ������� ��� �� ���� ������� /���� ��������
����� ������ � ��� ������0 �� ���� ��� ������
�� ��� ��������� ��������� �� ������ �� ������� �
�(�4
� ��� �� ��
�������� �� ��� ����� �������� �� ������ ��������
� ���� >�� ��� ������� � ��� �������� �� ������
�������� ��� �� ������� ��� ���� ���� �� ����
����� ��� ���� ��������� C��������� ������� �����
��� ��� ��� ��� ���� ������ ��������� �� � ������ ��
�������� ��� ������ *� �� � ������ ��� ������� ��
��� ������� �� ���� ������� ��� ��� ������������
��������� ��� ����� � >� -� 6� �������� ��� ���
�����@�� ������ ������������� ��� ������ ��
����������� ����� ��� ��������� �� ���� �������
����� ��� � ����������� ����� ������ �� �������
���� ������� �� ������� /������� �� ��� �������
�� �����@�� ������������ ���������0 � ������
����� ��� ������� />� -0� ��� � ������ ����� � ���
���������� ������������� �������� ��� ���
���� �� ��� ������� � ��� ������ �� ���������� ���
���� ���� ������� ���� � ��@����� ��� ���
� ����� �� ��� �������� �� ��������� ���
��������� ��� ������������ ��������� ��� !��
�� ��� ��3?B � ������ � ��� ��� �����
������� �� ���������� ������� �� ������� ��
��� �����@�� ������ ������������ /���� �� >��
-* ��� -B0� ��� ��@��� ��� ����� ���� �� � ����
?������� � ��� ��� �� ��� �������� �� ������
���� ��� ������ ������ �� ��� ����������
����������� ��� ��������� �������� ��� ���������
��� ��� ������� ���� ��� /���� -� >� -B0� ���
Figure 7. Proteolytic activity of �-chymotrypsin derivatives againstSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (1unit will hydrolyse 1�molSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide min�1 at pH 7.8 and 25°C): 1–10, seelegend to Fig 1.
�("1
���� � � ������ � ��� ��� �� ��� �������� ��
�������� ��� � �������� ��� ��� �����
������� ������ ��� ��� ������ �������� ������
��� �������� ��������� ������ ��� �� ����� ����
�� ��� ������ ������ ���� �� ��� �� �������� 9�������
�� ��� ������� �� � ������ ���� ��� ��������� ������
��� ��� ������� ������ �� ������ /���� ���
���� ��� ��:��3?B ��� �� ����!�����0 ���� ���
��������� �� ��� �� ��� ��������� ���������
/����� ($,� 4 ��� �1� >�� -* ��� -B0� A�� ������ ��
��� �������� ����� �� ������ �� �������� ��� �������
������ ��������� ���� ��� ���� ������ � ���
������� �������7 �� ����!����� � ��3?B � ��3?B � ���� �� � ���� �� � �������� �� ���3?B � ����� �� � !�� ��� A� ����� ����
��� ������� ��� �� ����� ������ �� ������� �����
��� ������ �� ��� ������������ ��������� ��
��������
Figure 8. Proteolytic activity of �-chymotrypsin derivatives against wheyproteins (peak area of TCE-soluble peptides): 1, 4–10, see legend to Fig 1.
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
� ������� �� �������������� �������� �� ��� ���� ������ ��
CONCLUSIONS����� ��� ��� ��������� ��������-$"1 ���� ���� �����
������ �� ������ ���� ��� �������� ������
�������� ��� ������ ���� ���������� �������
��� ��� � ����� ������� ������ ��� ������� ����
����� �� ��� �� ����� ��� ���� ��� �� ��� �����
��� �� ���������� ������� � ������������� �� ���
������� ���� ��� �������� ��� ��� ��� ��� �������
������ ���� ���� ����� /�)2 ���� ���� ������
�����0� ��� � ������� �� ����� ��� ��� ���
������� ���� ��� ���� ��� �� �������������
������ ����� � �������� �� ��@�� ���� ���
������ ������� ������� ��� ���� ����������
���� �� ���� ����� ���������� ��� �������
��������� �� ������������ ��� ������ ��������
������� ���@����� ����� ������� ����� ����
������� ������� �� � ���@�� � ����� ��������
��� ��� ���� �� ���������� ���:�� �� ������
�������
REFERENCES� >������ 5� D�������� ����� �� ������� ���� �������� ����
������� * ������ � ��� ���� ���� 337)$"4 /�44)0�
" 5������� ?� B����� EC ��� &������ 35� 3����� ������ ���
������� ������ �� �������7 ���������� ������� ���
������� ��������� ��� #��� 47%"8$%%1 /�4-,0�
8 +� �� &�� ?������� *�� *���� #H� 5*����� & ��� ?�����
�*� G������ � �������� ���������� ��������� �� �
�������� ����� ��� �� ������� ��������� � $���
4-7%-1$%-) /�44�0�
% 9�� ��� *� +���� ����� ��� �� )8� ������ �� ��������� ��
������� ������������� 5.78-,($8--8 /�44�0�
( 5�������� &� ?���������� *� #������� B� ������� C� G��� #
��� B����� ?� 3����� ������� �� ������������ ��� ���
���� �� �� ���������� 3D* ������� � ��� ��������� ��
�������� ����� �� ���� /47"�48$""11 /�44)0�
) >������ 5� &�������� �������� ��� ������ ���� �� ������
������������ * ������ � ��� ���� ���� 367�("8$�(%1
/�44,0�
, &������ 5D� &�������� ��� ��� ����� ��������'�������
������� ��� ������ ������ � ��� ���� ��� 4#78)"$8,"
/�4440�
- ?������� I� <������ ��� ������ �� ����� ����� ���
����� � ���� �� �������� � ������ ���� ��� ���� ���
#��� -278�($8%, /�4-40�
4 +� ���� I� #������� #3� ����� C� 9�������� # ��� C����� A�
#����� �������� ��� ���� ���� � � ����� �������� �
������ ���� ���� 777%1�$%8) /�4440�
�1 &������ *� #����� CH� +����� A+� 9� � E� +������� *H
��� 9������ &� ?���� ����� ��� � ��� ������� ���� ��
������� ��� ������� � ��� ���� ��� 4#78,8$8,- /�4440�
�� &����� HHE ��� 9������� GE� &������������ �� ��� �������
�� ���������� ���� ����� ������ ������� � � ���� ��
����� ������� � ��� ���� ���� 5#7�"4-$�818 /�44�0�
�" D���� HH� +�����>����� >&� C���� #&� *��� 5H ���
*� ��� 9J� ������� ������ ������� � ����� ��� �����
�������� ���� ��� ���� ��� #��� 537�14$�(, /�44%0�
�8 ?����� +> ��� >��� #*� D�������� ����!����� �� ���
������� ������ ������� ��� � ���� ���������� ����
�� "%� $�� &��� /447%"8$%8( /�4-%0�
�% &������ G>� ��������� �I� 9������� GE� 9������ H ���A����
� ��� ���� ��� ����(�"$�("� /�����7 "11�0
+� &������������ �� "������������������� �� ��� ��
��������� � ������� �� ����� ����� � ��� ���� ����
537"�,$""� /�4-)0�
�( 9������ 5� &������ G� C����� F ��� A���� +� < ����� ��
����� .�� "�������������� ������� ������ �� � &�������
�� ���� ����� ��� ������������ �� � ��� �� �����7 "�(���
������������� ������� ������ ��� � ���� ��� 6/7��4�$��4%
/�4-)0�
�) 5������ + ��� E������� ?H� '��� ���������%�(������ 9�������
B����� �� "")$"8� /�4-40�
�, B� ��� DH� E���� �?� ?����� � ��� A������� 5#� 5������
��������� ������ ����������� ��� � ������� ���������
������ ������ ������ � ����� ���� ��� ����������
&����������� 577(())$((,, /�44,0�
�- +���� ?� I���� H ��� +��� B� +������ �� �������� �� ���
��������'���������� ������������ ��� ���������
������� �� ��� ���������� � ���� ��� 767�14�$�14- /"1110�
�4 +���� ?� I���� H ��� 9�������� D6� #��������� �������
��� ��� ������ ��� �� ��������� ������� �� ������ �$
������ ���������� � ��� ���� ���� 327�(-1$�(-, /"1110�
"1 +���� ?� I���� H ��� +��� 9� +������ �� ������ �� ������
��� ��������'���������� ������������ ��� �������
��� ������� �� ��� ���������� ���� ���� 4-7(4$,� /"11�0�
"� B�� �� �5� 3������� *D� #������� 5C� C����� 5E�
G����������� �#� C�� ��� GJ� E������� *E ��� ���������
��� GB� 9������ ������� ����������� �� � ������ ��
���������� ������� �� ��9 ��� ���� ���� ����� ������ � ���
���� ���� 537"4,$81" /�4-)0�
"" C���� +� &����������� � $������ �� " )������ ������� G��
G� 8�� ���� �� � B�������� ?=� G����� &����� A������
�� 44$�14 /�4-80�
"8 E���� <?� +��� ����� DH� >��� *E ��� +������ H� #�����
����������� ��� >��� ������ �������� � &��� ���� /#57")($
", /�4(�0�
"% *�����D���� H� 3���������� �� ��� ������ �� ��������� �� ����
������ ������������ � ������ ������������ ��� � ���
���� ���� -47�"()$�")" /�4,"0�
"( H����� HE ��� J��� +J� =��������� � ������� ��� �����
����� ��������� �� ����$������ ��� ����$��� ������
��������� �� � �� ���� ��� *��� �� � --7"("$"(4 /�4-40�
") E����� =I� &������� �� ��������� ������� ����� ���
����� �� �� ��� ���� �� ���������� �%� #����� -447)-1$
)-( /�4,10�
", I���� H ��� +���� ?� +������ �� ����� ����������� ���
������ �� � ��� ���� ��� 4-78,)$8-% /�44)0�
"- ������� ? ��� B��� 35� 9������� �� ����������������
��@��� �� ��)-*K ���������� � $�� &��� /237,18$,�� /�4-(0�
"4 #������ A9� ��L������ ������ � ����� � �����'����
������� ��� ���� ��� ��� �������� &������ � //-7)14$
)�, /�4)40�
81 #������ A9� ��L������ ������ � ����� � �����'����
������� ��� ���� ����� �� ���� &������ � //-7)�4$
)"4 /�4)40�
8� ?������� 9 ��� D��� 9� 9��� ��� �� ��� ��� ��� �������� �
���� ��� 6.7%-)$%4� /�4-(0�
8" +����� *� #��� &3 ��� 3���� ?� #���������������� ���
>������M���� ��� A���� ������ ?#E&:=G:�&3 �� ����
��������� +#�#����� �� '��� �� ������� #378)8$8)(
/�44-0�
88 #������ &9 ��� J������ �D� #��������� ���� ��
�������� ��� ������� ����'66� &�������� ������
� ������� ��� ������� �� &������ -5/7-"$4� /�44(0�
8% +���� ?� I���� H� +����9������ B ��� ?�� �� 9� #�����
����� ��� ������� ��������� �� ����� �����������
��������� ����������� � ��� ���� ���� 377(1%8$(1(�
/�44-0�
�("�