GenPoint HPV

MOLECULAR PATHOLOGY

in situ hybridization 用高リスク型 HPV プローブカクテル／ビオチン標識

■ 13 種類の高リスク型 HPV（タイプ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68）を検出します。

■ GenPoint System (Code No. K0620) により、コピー数の少ない、宿主DNA に組み込まれた (Integrated) HPV DNA の検出が可能です。

■ Hybridizer (Code No. S2450) および ダコ Autostainer /ダコ Autostainer plus (Code No. S3400/S3800) の使用により自動化が可能です。

子宮頸部中等度異形成（HPV 16/31 型感染） 40x

子宮頸部扁平上皮癌（HPV 31 型感染） 20x

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GenPoint HPV in situ hybridization 検出概要

Hybridizer による

自動化が可能

STEP 1ビオチン標識プローブをハイブリダイズ

ダコ Autostainer/

ダコ Autostainer

plus による自動化が

可能

STEP 2ストレプトアビジン/HRP の反応　

STEP 3ビオチン標識タイラマイドの反応

STEP 4ストレプトアビジン/HRP の反応

STEP 5DAB を用いて発色

＜研究用試薬＞

1. 標的遺伝子の賦活化1) あらかじめ95℃に温めておいた Target Retrieval Solution (Code No.

S1699/S1700)にスライドを浸漬し、温浴槽にて熱処理を行います。 95℃, 40 分間

2) 温浴槽からドーゼごと取出し、常温放置します。 常温, 20 分間3) スライドをオートクレーブ水に浸漬します。 1 分間, 5 回4) 濃縮プロテイナーゼ K (Code No. S3004) を TBS*1 で6000～

10000 倍に希釈した溶液*2にスライドを浸漬します。 常温, 10 分間5) スライドをオートクレーブ水に浸漬します。 1 分間, 5 回

2. 内因性パーオキシダーゼのブロッキング1) 0.3%過酸化水素水／メタノールにスライドを浸漬します。 常温, 20 分間2) スライドをオートクレーブ水に浸漬します。 1 分間, 5 回

3. ハイブリダイゼーション1) スライドを95％エタノール、100％エタノールに順次各々1 分間浸漬し、その後ドライヤーの冷風にて乾燥します。

2) GenPoint HPV プローブ／ビオチン標識 (Code No. Y1443) を1～2

滴切片上に滴下し、カバーガラスで切片を覆います。

3) ラバーセメント等を用いて、カバーグラス周囲をシールします。4) スライドを Hybridizer*3 にセットし、プログラムをスタートさせます。

ディネーチャー ：90℃, 5 分間ハイブリダイゼーション：37℃、16～18 時間

4. プローブの洗浄 (Stringent Wash)1) ピンセットでシールをはずしてからスライドを洗浄液 (TBST)*4 に浸漬し、カバーグラスをはずします。 5 分間程度

2) あらかじめ48℃に温めておいたStringent Wash Solution*5 にスライドを浸漬し、30 分間洗浄します。 48℃, 30 分間

3) スライドを精製水に浸漬します。 1 分間, 5 回4) スライドを TBST に浸漬します。 1 分間

ダコAutostainer plus

025-

0905

Cダコ・ジャパン株式会社 www.dako.jp〒112-0004　東京都文京区後楽 2-5-1 住友不動産飯田橋ファーストビル

GenPoint HPV in situ hybridization 染色手順

脱パラフィン・親水化後以下の染色ステップを実施してください。

プローブの洗浄操作までは、in situ hybridization 対応の器具、試薬、水をご使用ください。

5. 一次抗体試薬の反応1) 希釈液にて100倍希釈したストレプトアビジン /HRP一次酵素試薬を切片上に滴下します。 常温, 30 分間

2) TBSTで切片上の試薬を洗い流し、TBST に浸漬します。 5 分間, 3 回

6. ビオチン標識タイラマイドの反応1) ビオチン標識タイラマイドを切片上に滴下します。 常温, 15 分間2) TBSTで切片上の試薬を洗い流し、TBST に浸漬します。 5 分間, 3 回

7. 二次酵素試薬の反応1) ストレプトアビジン /HRP二次酵素試薬を切片上に滴下します。

常温, 15 分間2) TBSTで切片上の試薬を洗い流し、TBST に浸漬します。 5 分間, 3 回

8. DAB 発色基質溶液の反応1) 基質緩衝液にて50倍希釈したDAB発色基質溶液を切片上に滴下します。 常温, 5 分間

2) 精製水で切片上の試薬を洗い流し、精製水 に浸漬します。

9. 対比染色十分に水洗後、ヘマトキシリンによる対比染色を行い色出しします。

以下の染色ステップでは、GenPoint System (Code No. K0620) 内の試薬を使用します。

また、ダコAutostainer/ダコ Autostainer plus (Code No. S3400 /S3800)での自動染色が可能です。

その後、定法に従い、脱水、透徹し、非水溶性封入剤で封入します。

*1 : TBS (Code No. S1968 /S3001 等) の使用をお奨めします。*2 :プロテイナーゼ K の希釈は、使用直前に行ってください。*3 : Hybridizer (Code No. S2450) の代わりに、ヒートブロックなどでディネーチャー処理を、スライドを湿潤箱に入れ、ふらん器などで

ハイブリダイゼーション反応をさせることも可能です。

*4 : 0.1% Tween20, 0.3mol/L NaCl 含有 0.05mol/L トリス塩酸緩衝液 pH7.6 (Code No. S3306) をご使用ください。

*5 : GenPoint System (Code No. K0620) 内の Stringent Wash Concen-trate をオートクレーブ水にて 50 倍希釈してご使用ください。

※ 内因性ビオチンのブロッキングを行う場合は、内因性パーオキシダーゼのブロッキング操作の後に、内因性ビオチンブロッキング試

薬 (Code No. X0590) を用いて行ってください。

Hybridizer

参考文献

1. Munoz N, et al. N Engl J Med 2003; 348: 518-527.2. Birner P, et al. Mod Pathol 2001; 14(7): 702-709.3. Cooper K, et al. J Clin Pathol 1991; 44: 990-996.4. Evans MF, et al. Mod Pathol 2002; 15: 1339-1347.5. Klaes R, et al. Cancer Res 1999; 59: 6132-6136.6. Sano T, et al. Mod Pathol 1998; 11: 19-23.

Code No. 容量

Y1443 GenPoint HPV 1mLK0620 GenPoint System 100 テスト

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