imobilizace a stabilizace enzymů
DESCRIPTION
Imobilizace a stabilizace enzymů. Pou žití rozpustných enzymů. Nevýhody Jednorázová aplikace Nízká stabilita rozpustného enzymu Značně drahé Možné řešení Imobilizace enzymu. Imobilizace enzymů. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/1.jpg)
![Page 2: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/2.jpg)
Použití rozpustných enzymů
Nevýhody • Jednorázová aplikace• Nízká stabilita rozpustného enzymu • Značně drahé
Možné řešení• Imobilizace enzymu
![Page 3: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/3.jpg)
Imobilizace enzymů
• Definice: enzymy, které jsou fyzikálně uzavřeny v omezené oblasti za zachování jejich enzymové aktivity, a které mohou být použity opakovaně a kontinuálně
![Page 4: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/4.jpg)
Imobilizace enzymů• Imobilizace je proces, který převádí rozpustný
biopolymer (enzym) na formu nerozpustnou nebo oddělenou většinou tvorba heterogenního biokatalyzátoru
• Vazba na pevný nosič, zabudování do (bio)polymeru, vazba na membrány, zesítění...
• Zvýšení stability imobilizovaného enzymu• Odpadá náročná izolace produktu (z heterogenní směsi
je možno získat produkt po filtraci, centrifugaci ....)• Imobilizovaný enzym je možno použít opakovaně • Enzymové procesy mohou být prováděny kontinuálně• Imobilizace může pozitivně ovlivnit stabilitu enzymu
![Page 5: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/5.jpg)
Imobilizace enzymů
• Podmínka úspěšného použití imobilizovaných enzymů dostatečný kontakt reaktantů s katalyzátorem
• Nejčastější uspořádání reaktant (a následný produkt) je ve vodné fázi, která prochází přes pevnou fázi obsahující katalyzátor
• Existují případy, kdy je reaktant ve fázi plynné nebo v kapalné fázi, která je nemísitelná s vodou
![Page 6: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/6.jpg)
Metody imobilizace
Vazba na pevné nosiče – požadavky• Velký povrch• Hydrofilní charakter• Nerozpustnost • Chemická, mechanická a teplotní stabilita• Vhodný tvar a velikost částic • Odolnost proti mikrobiálnímu působení• Možnost opakovaného použití
![Page 7: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/7.jpg)
Vazba na pevné nosiče
• Fyzikální adsorpce – nejstarší metoda imobilizace (1916 – invertasa na alumině) často dochází k uvolňování enzymů
• Vazba na ionexy (nutná volba optimálního pH pro navázání)
• Kovalentní imobilizace na nosiče nesoucí vhodné funkční skupiny
![Page 8: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/8.jpg)
Příklad kovalentní imobilizace
• Nosič nesoucí aminoskupiny, aktivace glutaraldehydem, vazba enzymu přes aminoskupinu
Si CH2 CH2 CH2 NH2 H C
O
CH2 CH2 CH2 C
O
H+
Si CH2 CH2 CH2 N CH CH2 CH2 CH2 C
O
H
CH CH2 CH2 CH2 C
O
HSi CH2 CH2 CH2 N + H2N Protein
N ProteinSi CH2 CH2 CH2 N CH CH2 CH2 CH2 CH
![Page 9: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/9.jpg)
Skupiny v molekulách proteinů využitelné pro kovalentní imobilizaci
• -NH2 (N-koncová, ε-NH2 lysinového zbytku)
• -COOH (C-koncový, β-, γ- COOH asparagové a glutamové kys.)
• -SH cysteinu• -OH serinu a tyrosinu• cyklický systém tyrosinu a histidinu
![Page 10: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/10.jpg)
Oxidace polysacharidů
• Polysacharidová matrice oxidovaná jodistanem
• Reakce s aminoskupinou proteinu
![Page 11: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/11.jpg)
Epoxidová metoda
• Reakce polysacharidové matrice (celulosa, agarosa, dextran) s epichlorhydrinem tvorba glycidového derivátu (obsahuje oxiranový kruh)
• Reakce s NH2, SH skupinou enzymu
![Page 12: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/12.jpg)
Orientovaná a náhodná imobilizace
![Page 13: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/13.jpg)
Zesítění
• Reakce molekul enzymů s bifunkčním činidlem (např. glutaraldehyd)
• Navázání aminoskupin patřících k různým molekulám enzymu zesítění tvorba nerozpustného produktu
![Page 14: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/14.jpg)
Zabudování enzymů
• Zabudování enzymů do struktury (bio)polymerního gelu
• Zabudování enzymů do polopropustné membrány
![Page 15: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/15.jpg)
Zabudování enzymů do geluPoužívané gely
• Polyakrylamid• Alginát (Na+ forma je rozpustná převod do
nerozpustné Ca2+ formy)• Karrageenan (jednomocné ionty (např. K+)
způsobí převod do nerozpustné formy) • Agarosa (tekutá při 45 – 50 °C), převod do
nerozpustné formy ochlazením• Želatina (převod do nerozpustné formy
zesítěním glutaraldehydem)
![Page 16: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/16.jpg)
Zabudování enzymů do membrán
• Umístění enzymu do fyzikálně odděleného prostředí mezi semipermeabilní membrány
• Výhoda použití enzymů v nativním stavu
• Dutá semipermeabilní vlákna, ultrafiltrační membrány
![Page 17: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/17.jpg)
Imobilizace na magnetické nosiče
• Magnetické nosiče polymerní částice obsahující magnetické oxidy železa, silanizovaný magnetovec
• Příprava podobná jako v případě nemagnetických nosičů
• Výhoda možnost práce v suspenzních systémech, po skončení enzymové reakce je možné odstranění imobilizovaného enzymu pomocí magnetického separátoru (všechny ostatní složky jsou diamagnetické)
![Page 18: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/18.jpg)
Zesítěné enzymové krystaly a agregáty
• Příprava krystalů enzymů, následné zesítění glutaraldehydem
• Precipitace proteinů (enzymů) vhodným činidlem tvorba proteinových agregátů následné zesítění glutaraldehydem
![Page 19: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/19.jpg)
Stabilizace enzymů
• Enzym zůstává v rozpustné formě, váží se různé vysokomolekulární sloučeniny
• Vazba polysacharidů (např. dextranu) na molekuly enzymů tvorba umělých glykoproteinů (glykoproteiny jsou obvykle stabilnější než neglykosylované proteiny)
• Přídavek nízko- nebo vysokomolekulárních látek do prostředí (anorganické ionty, polyethylenglykol, polyoly ...)
![Page 20: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/20.jpg)
Aplikace imobilizovaných enzymů
• Použití imobilizovaných enzymů pro provedení specifických reakcí ve vhodných reaktorech
míchané reaktory plněné kolony fluidní lože ultrafiltrační membránové systémy Použití při přípravě antibiotik, steroidních
látek, specifických aminokyselin
![Page 21: Imobilizace a stabilizace enzymů](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062816/56814cf6550346895dba0078/html5/thumbnails/21.jpg)
J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11242−3
Imobilizace a nanotechnologie• Zabudování
enzymů do nanopórů vhodných nosičů
• Stabilizace pomocí iontových interakcí
• Takto zabudované enzymy jsou velmi stabilní po dlouhou dobu