imagerie de la paroi - station biologique de...
TRANSCRIPT
![Page 1: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/1.jpg)
Imagerie de la paroiimmunohistochimie des polysaccharides
de paroi chez les végétaux
Atelier GlycoOuest, Interactions sucres-protéines14-18 Avril 2014, Roscoff
Cécile HervéUMR8227, Roscoff
![Page 2: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/2.jpg)
I. Sondes moléculaires pour la détection des polysaccharides de paroi
• production et caractérisation d’anticorps monoclonaux• utilisation de modules naturels de reconnaissance
(carbohydrate-binding modules, CBM)
II. Utilisation des sondes de paroi en immunohistochimie et microscopie
• principes de l’immunohistochimie
• préparation du matériel végétal
• immunofluorescence indirecte
• microscopie électronique
• observation, interprétation et mise en forme
TP. Imagerie de la paroi par immunofluorescence
![Page 3: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/3.jpg)
Anticorps monoclonaux et CBMs
![Page 4: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/4.jpg)
Interface
Intégrité
Différenciation
Expansion
Signalisation
Adhérence
Morphogenèse
Pourquoi la paroi ?• entoure chaque cellule végétale (algues & plantes)
• rôles dans de nombreuses réponses physiologiques
(compartiment dynamique)
![Page 5: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/5.jpg)
Type cellulaire & diversité pariétale(plasticité spatiale/temporelle)
![Page 6: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/6.jpg)
• les parois végétales sont des structures compactes
composées d’assortiments de polysaccharides complexes
Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)
Somerville et al. (2004) Science 306, 2206
dictoylédones
![Page 7: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/7.jpg)
• les parois végétales sont des structures compactes
composées d’assortiments de polysaccharides complexes
Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)
+ polysaccharides matriciels(pectines)
Somerville et al. (2004) Science 306, 2206
dictoylédones
![Page 8: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/8.jpg)
• les parois végétales sont des structures compactes
composées d’assortiments de polysaccharides complexes
Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)
+ polysaccharides matriciels(alginates/fucanes)
algues brunes
Deniaud-Bouët et al. (2014) Annals of Botany, in press
![Page 9: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/9.jpg)
• La plupart des connaissances dérivent de méthodes
biochimiques, utilisant des polysaccharides purifiés ou des
parois fractionnées sur plantes entières:
� perte de l’information spatiale et de développement� connaissance limitée des configurations in situ
• Quels sont les polymères présents ? En quelles quantités
relatives ? Comment sont-ils organisés les uns par rapport
aux autres ? Quelles variations physiologiques ? –
architectures pariétales & dynamiques
Pourquoi des anticorps ?
� sondes moléculaires pour des analyses in situ
![Page 10: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/10.jpg)
chaîne
légère
région variable
région constante
chaîne
lourde
antigène
épitopes
antisérum
Qu’est-ce qu’un anticorps ?
![Page 11: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/11.jpg)
Sérum d’anticorps polyclonaux
• Facile à obtenir –à partir d’un échantillon sanguin
• Si l’antigène est pur, possible d’obtenir un volume
suffisant d’antisérum à titre élevé et à forte affinité
• Contient des anticorps dirigés contre toute une
série d’épitopes
• Pas 2 animaux identiques
• Quantités limitées
![Page 12: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/12.jpg)
Immunogènes
• Les protéines sont directement immunogènes
• Les glycanes donnent une faible réponse immunitaire
• Les oligosaccharides sont conjugués à une protéine (BSA, KLH) avant injection
![Page 13: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/13.jpg)
chaque lymphocyte secrète un type
d’anticorps, à spécificité unique
cellule 1
cellule 2
cellule 3
![Page 14: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/14.jpg)
Anticorps monoclonaux
• Technologie de l’hybridome
• Les lignées cellulaires secrétant les anticorps de spécificités appropriées sont immortalisées� rate � source de lymphocytes
généralement rongeurs (rats, souris)
� myélome � lignées cellulaires immortelles
• Quantités illimitées• Spécificité définie
![Page 15: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/15.jpg)
Schéma général de production
FUSION
criblage des puits donnant une réponse positive
sélection clonale des lignées
propagation des lignées sélectionnées
anticorps à spécificité unique (un épitope) dans le surnageant hybridomal
cellules Bculture cellulaire de
myélome
![Page 16: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/16.jpg)
Sélection des hybridomes (1)
• les cellules myélomateuses sont immortelles mais
ne synthétisent leurs nucléotides que par la voie de
novo car elles sont HPRT- (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, i.e. voie de sauvetage)
–génie génétique
• sélection sur milieu HAT (hypoxanthine,
aminopterine, thymidine) : l’aminoptérine bloque la
synthèse de novo, l’hypoxanthine et la thymidine
sont les substrats de la voie de sauvetage
![Page 17: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/17.jpg)
Sélection des hybridomes (2)
• seules les cellules fusionnées pourront survivre : les lymphocytes apportent la HPRT et les cellules du
myélome la capacité à proliférer ���� hybridomes
• les cellules B non fusionnées et les cellules du
myélome (sur milieu HAT) sont éliminées
![Page 18: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/18.jpg)
Anticorps monoclonaux
• Reconnait un épitope –correspond à une région du
polymère cible
• Connaissance a priori de la structure de l’épitope et
de l’antigène
• Difficile dans le cas de polymères où la
connaissance structurale est limitée (cf. algues)
• Une caractérisation après coup est possible, à
l’aide d’haptènes, d’enzymes, etc.
![Page 19: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/19.jpg)
Centres de ressources
• BioSupplies Abs, Australia
• CCRC-Mx –Georgia, USA
• JIMx (1989-1994) –John Innes, UK
• LMx (1991-onwards) –Leeds, UK
• BAMx (in progress) –Leeds, UKBrown Algae http://www.plantcellwalls.net
http://www.plantprobes.net
http://www.biosupplies.com.au/
http://www.ccrc.uga.edu/
![Page 20: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/20.jpg)
EX. d’anticorps monoclonaux• anti-pectines
JIM5 partially Me-esterified HG
JIM7 partially Me-esterified HG
PAM1 blockwise de-esterified HG
LM7 non-blockwise de-esterified HG
2F4 unesterieid, calcium cross-linked HG
LM8 xylogalacturonan
LM5 (1�4)-b-D-galactan
LM6 (1�5)-a-L-arabinan
LM13 (1�5)-a-L-arabinan
CCRC-M2 RGI
![Page 21: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/21.jpg)
Sous-structure pectique (LM7)homogalacturonan partiellement Me-esterifié
Willats et al. (2001) J. Biol. Chem.; Clausen et al. (2003) Carbohdr. Res.
pea stem
![Page 22: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/22.jpg)
LM11
LM10
LM11
LM10 LM11
• anti-xylanes
![Page 23: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/23.jpg)
Caractérisation des anticorps (1)
• principe de l’ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
-dosage immuno-enzymatique
HRP
S P
HRP
fixation de
l’antigène
reconnaissance
par l’Ac
spécifique
liaison du
conjugué
révélation
lavages lavages lavages
![Page 24: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/24.jpg)
100 %
0 %
concentration en anticorps
90 % du maximum
de fixation
fra
ctio
n l
iée
concentration en
anticorps à utiliser
100 %
0 %
concentration en haptène
50 %fra
ctio
n l
iée
IC50
100 %
0 %
inh
ibit
ion
de
la
fix
ati
on
de
l’a
nti
corp
s
1. déterminer la dilution
appropriée en anticorps
2. déterminer les haptènes
compétiteurs (ELISA compétitif)
Caractérisation des anticorps (2)
![Page 25: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/25.jpg)
LM15, a rat monoclonal antibody directed to the XXXG oligosaccharide of xyloglucan –developed from a XXXG-BSA neoglycoprotein
(Marcus S., Verhertbruggen Y., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol 8: 60)
XXXG
![Page 26: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/26.jpg)
forêt tropicale forêt de Laminaires
La dégradation de la biomasse végétale par les microorganismes
est une étape clé dans le recyclage de la matière carbonée
���� évolution de protéines reconnaissant les polysaccharides de paroi
Carbohydrate-binding modules (CBMs)
![Page 27: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/27.jpg)
Glycosyl hydrolases microbiennes
• Structure modulaire :
� module catalytique
� module(s) de fixation des polysaccharides : CBMs –carbohydrate binding module
• module catalytique et CBM associé ont
généralement la même spécificité
• Cellulose et autres polysaccharides de paroi
• le CBM dirige l’enzyme à proximité de son substrat
et la maintien en contact prolongé avec celui-ci
![Page 28: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/28.jpg)
domaine catalytique
séquence
de liaison
Carbohydrate Binding Module
(CBM)
Himmel et al., “Cellulase Animation”, NREL (2000).http://genomics.energy.gov/gallery/b2b/detail.np/detail-24.html
![Page 29: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/29.jpg)
• classés en 68 familles suivant une base de similitude de séquence protéique
http://www.cazy.org
• cellulose, xylane, mannane, glucomannane, β-1,3-glucanes
(callose, laminarine), β-1,3-1,4-glucanes (MLG, lichenane),
xyloglucanes, galactanes, chitine, amidon, agar, etc.
![Page 30: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/30.jpg)
• utilisation analogue aux anticorps
monoclonaux :� test immuno-enzymatique (ELISA, etc.)
� microscopie (localisation des ligands in
planta)
• les CBMs sont produits de façon recombinante,
avec une étiquette permettant leur (purification et)
immunodétection
Utilisation des CBMs en tant que sondes moléculaires
S P
CBM
HRP
ex. His-tag
![Page 31: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/31.jpg)
• spécificité connue• quantité illimitée• immunisation
animale
• protéine recombinante
• reconnaissance différentielle in situ
• couverture polysaccharidique
Anticorps monoclonaux
CBMs
![Page 32: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/32.jpg)
②Utilisation des sondes sur matériel végétal
![Page 33: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/33.jpg)
particules d’or
• La détection des antigènes d’intérêt par l’utilisation
des sondes (anticorps/CBM) nécessite l’emploi d’un
système de révélation
• tests immuno-enzymatiques = enzymes telles que
peroxydase et phosphatase alcaline
• microscopie à fluorescence = fluorochromes tels
que FITC, Alexafluors
• microscopie électronique =
• Dans la majorité des cas un protocole
d’immunomarquage indirect est utilisé
![Page 34: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/34.jpg)
Immunohistochimie indirecte• incubation avec un anticorps
primaire/CBM contre l’antigène
d’intérêt
• puis incubation avec un anticorps secondaire qui reconnait la région
constante de l’anticorps primaire
(étiquette dans le cas d’un CBM),
couplé au traceur
• Ce système est très versatile : combinaisons
multiples pour un même AcI + nombreux AcII
disponibles commercialement
![Page 35: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/35.jpg)
• Des témoins doivent toujours être réalisés lors d’un
protocole d’immunomarquage
• Un CONTRÔLE NEGATIF peut inclure un anticorps
primaire qui ne reconnait pas le matériel d’étude
où, plus simplement, omettre l’anticorps primaire
• Un contrôle positif est un anticorps primaire qui
reconnait le matériel d’étude ; il peut être utile dans
la phase initiale d’immunohistochimie sur des
antigènes encore non étudiés
![Page 36: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/36.jpg)
Préparation pour la microscopie
• fixation
• coupes
• immunomarquages
La littérature sur la préparation des échantillons pour
la microscopie (fixation/inclusion/coupes) est très
abondante. Le choix dépend du but recherché.
![Page 37: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/37.jpg)
• Fixer = rester le plus proche possible de l’état vivant,
stabiliser l’ultrastructure et protéger des dommages
• aldéhydes fréquemment utilisés
• attention aux conditions physicochimiques, notamment équilibre osmotique
plante ~300 mOsm, algue marine ~1100 mOsm
• échantillons aussi petits que possibles <2x2x2 mm
• plusieurs types d’inclusion/coupes suivant la
résolution souhaitée (à la main, inclusion en
paraffine/résine LR-white, etc.) -plus elle est
importante, plus le temps de préparation sera long
![Page 38: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/38.jpg)
Immunomarquage
• le matériel doit fermement adhérer à la lame : certains réactifs tels que la poly-L-lysine et le
Vectabond améliorent l’adhérence
• des immunomarquages en tubes eppendorf sont
également possibles (coupes à la main, graines, etc.)
• Le matériel végétal doit toujours resté hydraté
• l’immunomarquage peut être combiné à des
marquages chimiques (ex. anticorps couplé au FITC
+ calcofluor white pour la cellulose) –longueurs
d’onde d’émission différentes
![Page 39: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/39.jpg)
Microscope à fluorescence
1. seule la lumière bleue ayant une longueur d’onde comprise entre 450 et 490 nm passe à travers le filtre
2. reflète la lumière en dessous de 510 nm et transmet celle au-dessus de 510 nm
3. ne laisse passer que les longueurs d’onde comprises entre 500 et 550 nm, dont le signal fluorescent vert
![Page 40: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/40.jpg)
Asplenium aethiopicumred channel
![Page 41: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/41.jpg)
Asplenium aethiopicumCalcofluor stain
![Page 42: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/42.jpg)
Asplenium aethiopicumanti-1,5-arabinan
![Page 43: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/43.jpg)
![Page 44: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/44.jpg)
![Page 45: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/45.jpg)
calcofluor (cellulose)
LM10 (xylane)
![Page 46: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/46.jpg)
fibres phloémiennes
vaisseaux xylémiens
![Page 47: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/47.jpg)
Les inclusions permettent de réaliser des coupes fines
ou semi-fines et offrent une résolution intéressante.
Néanmoins les coupes manuelles sont rapides et
peuvent permettre un premier criblage. Certains
échantillons peuvent même être utilisés entiers.
![Page 48: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/48.jpg)
graine d’Arabidopsis embryon de Fucus
filaments d’Ectocarpus
poil absorbant
de carotte
![Page 49: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/49.jpg)
Pour des analyses très fines au niveau cellulaire, la
microscopie électronique est requise.
Le principe d’immunomarquage est identique.
L’anticorps secondaire est couplé à des particules d’or
denses aux électrons.
![Page 50: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/50.jpg)
Knox et al., 1990. Planta 181(4):512
espace
intercellulaire
cellule 1
cellule 2
cellule 3
paroi
JIM5/7 – reconnaissent des pectines (HG) ayant différents
degrés d’estérification
![Page 51: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/51.jpg)
L’observation d’échantillons
prélevés à différents temps
permet de suivre la
localisation des polymères
au cours du développement
–lien fonctionnel?
0 24h
cellulose
M-alginate
fucanes sulfatés
![Page 52: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/52.jpg)
Un échantillon soumis à des
conditions
environnementales
différentes peut présenter
des variations pariétales
–lien fonctionnel?
1 cm
1 cm
100 % edm
5 % edm
fucanes sulfatés
fucanes sulfatés
![Page 53: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/53.jpg)
Distinguer autofluorescence & fluorescence !
• certains composés cellulaires peuvent émettre de la
fluorescence à des longueurs d’onde qui interfèrent
avec le fluorochrome
• le glutaraldéhyde intensifie cet artéfact
• ce problème est particulièrement marqué chez les algues brunes et rouges
• le choix préalable du fluorochrome et du mode de détection ne doit pas être négligé
![Page 54: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/54.jpg)
filtre d’émission >515 nm
Chondrus
Ceramiale
filtre d’émission 500-550 nm
Ex. autofluorescence chez les algues rouges
![Page 55: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/55.jpg)
Prudence sur l’interprétation !
• le signal observé est-il bien lié au fluorochrome ?
(témoin négatif pour contrôler l’autofluorescence)
• l’absence de détection ne signifie pas forcement absence d’épitopes
� antigène soluble
� expression transitoire liée au développement
� épitope non accessible/masqué par d’autres polymères
![Page 56: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/56.jpg)
cp
x
LM15
_
+
PL
Xyloglucan detection
&
pectate lyasetreatment
cl ppcp xe ipMarcus S., Verhertbruggen Y., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol 8: 60
![Page 57: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/57.jpg)
JIM5 – pectic HG LM15 – xyloglucan
C
C
is
![Page 58: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/58.jpg)
pectate lyase/JIM5 pectate lyase/LM15
HG-masked xyloglucan
![Page 59: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/59.jpg)
+ pectate lyase+
pfx
cl
JIM5 JIM5
CjCBM15 CjCBM15
pf
x
cl
pfx
cl pfx
cl
- pl
Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3): 413-422
![Page 60: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/60.jpg)
nu
mb
er
of
pix
els
fluorescence intensity
34%
Quantification de l’immunofluorescence
nu
mb
er
of
pix
els
fluorescence intensity
100%
Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3): 413-422
+ enzyme + enzyme
![Page 61: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/61.jpg)
Autres sondes/utilisations
• anticorps par phage display, autres protéines
recombinantes d’origine bactérienne (SusD),
évolution dirigée de modules d’intérêt (ex.
aptamères par SELEX), enzymes modifiées, etc.
• ces sondes moléculaires sont également des outils performants pour détecter des épitopes dans des mélanges complexes
� glycoarrays (CoMPP)
� Epitope Detection Chromatography (EDC)
![Page 62: Imagerie de la paroi - Station Biologique de Roscoffapplication.sb-roscoff.fr/download/umr7139/glycobiologie/czjzek/... · • entoure chaque cellule végétale ... La dégradation](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030409/5a939af27f8b9a18628bf607/html5/thumbnails/62.jpg)
Pour aller plus loin• protocoles : Hervé C., Marcus S.E. and Knox J.P. (2011) Monoclonal
antibodies, carbohydrate-binding modules, and the detection of
polysaccharides in plant cell walls. Methods Mol Biol, 715, 103-113.
• évolution et diversité des parois de plantes et macroalgues : Popper Z.A., Michel G., Hervé C., Domozych D.S., Willats W.G.T., Tuohy M.G., Kloareg B. and Stengel D.B. (2011) Evolution and diversity of plant
cell walls: from algae to flowering plants. Annual Review of Plant
Biology, 62, 567-590.
• les sondes pariétales (très exhaustif avec production, utilisation,
articles scientifiques) : sites de J. P. Knox avec
http://www.plantprobes.net et http://www.personal.leeds.ac.uk
Most of my talk’s content has been inspired by Paul’s lectures, so
thanks Paul ☺
• My email: [email protected]