ImageJ を使った画像解析実習 2値化・領域抽出

第１８５回農林交流センターワークショップ 「 植物科学・作物育種におけるフェノーム解析 - はじめて画像解析を行う研究者のための入門実習 - 」

2014-10-03 9:15-10:30 (実習75分)

朽名 夏麿1,2，湖城 恵1,2 ，林 世莉3 ，相阪 有理2 1.東京大学， 2. エルピクセル(株)，3. 東京理科大学

基本画面とメニューの構成

ImageJ のメニュー と 画像解析の流れ

大雑把な流れ

cf. 実験のプロトコル，料理のレシピ

画像処理1 画像処理2…

ImageJ の基本画面 ← メニューバー ← ツールバー ← ステータスバー

← 画像ウインドウ

http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html

ツールバー

赤い三角形の付く アイコンは右クリック で機能切り替え可．

赤い線: 頻用するもの． 青い線: selection (ROI)．

← 画像タイトル 画像情報(サイズ等)

タバコBY-2 液胞膜

File メニュー: ファイルの読み込み・書き込み等

New: 新規作成． System Clipboard で他アプリから画像の ペーストができる． Open...: 画像ファイル等を開く． Import: 各種フォーマットのファイルを開く． Save: 画像ウインドウの内容をファイルに 保存する． ※ 保存するまで画像データを変更しても ファイルは書き変わらない．

Edit メニュー: 画像の切り貼り，描画 Undo: 直前の作業の取消し． 1ステップ限定かつ 一部のみ対応． Cut, Copy, Paste: 画像の切り貼り． 対象は画像全域かROI ． Copy to System: 他アプリへのコピー． Clear, Fill, Draw: 単色描画． Color Pickerで色は設定． Selection: ROI の制御． (Selection = ROI) Add To Manager: 複数のROI を管理．

Image メニュー: 種別，色，スタック，変形，複製等，色々 Type: 輝度タイプの変換． 8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color... Adjust: 表示上の明るさの調整や二値化等． Color: グレイスケール画像とカラー画像の 変換等． Stacks: 時系列画像(動画像)，立体画像の 処理．輝度投影，スライス一覧(montage) の作成等． Crop: ROI 部分の切り出し． Duplicate: 画像ウインドウの複製． Rename: 画像ウインドウのタイトル変更． Scale: 画像解像度の変更．つまり画像サイズ の拡大・縮小． ※表示の拡大・縮小と混同しないよう注意．

Process メニュー: 基礎的な画像処理(フィルタ等) Find Edges: 輪郭強調． Binary: 2値画像(白黒画像)処理． Math: 加減乗除等による 各画素の輝度変更． Filters: ノイズ抑制等のフィルタ． Image Calculator: 画像と画像の間 の演算． 加減乗除等．

Analyze メニュー: 測定やグラフ関係 Measure: ROI 部分の諸パラメタの測定． Analyze Particles...: 粒子解析． Set Measurements...: 'Measure' で測定する パラメタの選択． Set Scale...: 1画素が何 µm かを設定する． Histogram: 輝度ヒストグラムの表示． Plot Profile: 輝度プロファイルの表示．

他のメニュー

Plugins: プラグイン，マクロ，ショートカット キー設定等． Window: 画像ウインドウ，ログウインドウ等 の一覧や並び換え． Help:ブラウザにウェブ上のマニュアルを 表示する等．

デジタル画像の基本

←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K 画素と画素数

(3200%) ： 拡大・縮小率

画像ウインドウ左上に青い枠が表示されている場合， ウインドウに画像全域が収まっていない． 現在表示されている部位が，画像全域のどこに相当する かを示している．

159

153

画素, pixel (picture element)

+ キーで拡大 - キーで縮小

* Voxel * Binning

座標系と画素と輝度

←画像情報: 159x153 pixels; 8-bit; 24K

y

x

(x,y) = (0, 0) 輝度 35

(3, 0) 輝度30

(3, 2) 輝度 21

ImageJ では左上を原点(0, 0)とし，右に X 軸，下にY軸が伸びる 各画素には輝度 (強度，intensity．明度 brightness とも言う) が割り当てられている． ※ 「0 から数えること」「左上が原点であること」 に注意．

座標系と画素と輝度

y

(x,y) = (0, 0) 輝度 35

(3, 0) 輝度30

(3, 2) 輝度 21

x

Excel で開いた例 表示を縮小

159列

159 153

153行

File > Save As > Text Image...

座標系と画素と輝度

y

(x,y) = (0, 0) 輝度 35

(3, 0) 輝度30

(3, 2) 輝度 21

x

Excel で開いた例 表示を縮小

159列

159 153

153行

File > Save As > Text Image...

PowerPoint 等での強拡大に注意

PowerPoint や Photoshop 等で補間を ともなう"強拡大"をするとデジタル的 な解像度や分解能と関係なく擬似的 にズームしたようになるが，解像度や 分解能が上がる訳ではない． データ解釈を誤らないよう注意．

PowerPoint で拡大

補間なし

補間あり

Brightness & Contrast による表示状態の変更 ( Shift + c キー)

スライドバーを動かすことによる調整は，表示上の"明るさ"を 変えているに過ぎない．→ 輝度は変化しない． 8-bit 画像の場合は Apply ボタンを押すことによって，その時の 表示範囲が0～255にスケールされる．→ 輝度が変化する．

真っ白

真っ黒

ImageJ で最初に(?)とまどう所 Brightness & Contrast や Image > Lookup Tables による 「見ため」の変化は，画像データの加工を必ずしも意味しない． ImageJ における操作の多くは - 読み込んだ画像データを加工するもの Image > Transform > Rotate... など - ImageJ 上での表示の仕方を変えるもの Image > Zoom > ... など に大別できる． サイズ: Image > Scale... Image > Zoom > ... 明るさ: Process > Enhance Contrast Image > Adjust > Brightness & Contrast

輝度ヒストグラム ( h キー )

h

位置情報を無視した上で，全画素について 輝度の分布を可視化したもの． 輝度の基本的な統計量(最小，最大，平均， 標準偏差等)も表示されている．

輝度ヒストグラム ( h キー )

輝度プロファイル (k キー)

線分上の輝度を「形 (プロファイル)」として可視化． 横軸が距離 or 位置，縦軸が輝度． 多重蛍光標識像から局在関係を示す直観的手法．

輝度プロファイル Plugins > Graphics > RGB Profile Plot

RGB 信号のうち主に Blue が果皮の位置により 変化していることがわかる．

Higaki T et al. (2006) Plant Cell Physiol 47(7): 839-852.

輝度のタイプ

(0, 0) 輝度 35

(3, 0) 輝度30

(3, 2) 輝度 21

8-bit: 0～255 の整数(integer) 16-bit: 0～65535 の整数(integer) 32-bit: 浮動小数点数(float) 実数の近似値．±3.4*1038 の 範囲で7桁位の精度．

グレイスケール画像, 濃淡画像

輝度のデータ型． ビット深度(bit depth), bits per pixel, 量子化ビット数等とも呼称．

カラー画像

≠白黒画像

8-bit Color: 使わない． RGB Color: 赤緑青の3チャネルを 重ねることによるカラー表現． 各チャネルのデータ型は8-bit， 16-bit, 32-bit のいずれかで， チャネル間では統一されている．

輝度のビット深度

8-bit: 0～255 の整数(integer) 16-bit: 0～65535 の整数(integer) 32-bit: 浮動小数点数(float) 実数の近似値．±3.4*1038 の 範囲で7桁位の精度．

グレイスケール画像, 濃淡画像 ≠白黒画像

原画像のビット深度はカメラによって異なる． 顕微鏡用のモノクロカメラでは 8～16 bits グレイスケール /pixel デジタルカメラやスキャナでは 8 * 3 bits RGB /pixel 12 bits/pixel (212 , 0～4095) や 14 bits/pixel (214 , 0～16383)の カメラで得た画像は 16 bits/pixel の画像フォーマットとして扱う． 画像処理的には内部で 32-bit (float) を用いることも多い (浮動小数点数やマイナスの値が扱えるので) ．

輝度

位置(pixel) 8 bits/pixel

28 ＝256 段階

0

255

画像情報の修正 (ビット深度，スケール情報) ビット深度: Image > Type

スケール情報: Analyze > Set Scale...

この章のまとめ: デジタル画像の基本 まず解析対象をさまざまな「見方」で見よう． 表示上の"明るさ"をさまざまに設定し，必ず一度は「サチる」状態 までコントラストを上げる． Shift + c キー ズーム機能によって，必ず「画素」の大きさが認識できる倍率まで 拡大する． 回転(Image > Transform)， 白黒反転や擬似色表示(Image - Lookup Tables - ...)も有効． 画像処理・画像解析の基本的概念を覚えておこう． 画素(pixel)，輝度(intensity)，ビット深度(bit depth)， 輝度ヒストグラム(intensity histogram)， 輝度プロファイル(intensity profile)

+ キーで拡大，- キーで縮小

二値化・領域抽出

手作業でのROI設定を介した形状解析： 長さ

線分や曲線をマウスで引き， t キーで ROI Manager に登録，を繰返す． ROI Manager の「Show All」をチェックしておくと見やすい． Measure ボタンで登録済の ROI 全部をまとめて測定． 角度や長さ(画素単位)が得られる． Excel等でμmに変換し，統計処理．

Excel 等にペースト or テキストファイルに保存して R スクリプトで統計処理 等.

t

ROI: region of interest，関心領域，注目領域

手作業でのROI設定を介した形状解析： 面積

or

測定項目は Analyze > Set Measurements... で決定． 「測定対象領域をマウスで指定し， t キーで ROI Manager に登録」を繰返す． Measure ボタンで測定．

t

二値化による領域抽出 ( Shift + t キー)

or

蛍光像の場合，「高い輝度の領域」が「測定対象領域」の 場合が多い．閾値となる輝度を決め，二値画像(白黒画像) に変換することで，領域抽出(領域分割， segment)ができる． ではどのように閾値を決めればいいのか?

グレイスケール画像 (濃淡画像)

二値画像 (白黒画像)

人間の目視による閾値決定

作業者の感覚が頼り． 同じ人が作業しても， 閾値が同じになるとは 限らない(部屋やモニタ の明るさの影響など)．

Threshold ウインドウでは， 人間による閾値決定だけでなく 自動閾値決定もできる． 右図のように， 複数のアルゴリズムから選択する． いずれも輝度ヒストグラムをもとに 「ある明るさ」を閾値として 背景と背景(解析対象)を分ける． 画像自体と解析対象に関する 輝度分布の性質によって， 適切なアルゴリズムは異なる． ※形状情報は用いていない． → 前処理による ヒストグラム形状の変化

自動閾値決定