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MARINA MORA
Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta
Rimini - 15/16 giugno 2019
Il pesce zebrafish: utile modello per testare possibili composti atti a migliorare la malattia di Pompe
CONVEGNO A.I.G. - 2019
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Malattia di Pompe
Glycogen storage type II
Incidenza: 1: 40.000
Deficit enzimatico: -glucosidasi acida (GAA)
Difetto genetico: Mutazioni nel gene GAA
Età di esordio: Infantile, giovanile, adulta.
Accumulo generalizzato
di glicogeno,
prevalentemente in:• cuore
• muscolo scheletrico
• fegato
• vasi sanguigni
• cervello
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Zebrafish (Danio rerio)
• Vertebrato
• Rapido sviluppo
• Prolifico• Fecondazione esterna
• Sempre disponibile durante l’anno
• Trasparente
• Embriologia ben conosciuta
• Facile da iniettare
• Facile da manipolare geneticamente
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Rapido sviluppo
Ciclo vitale dello Zebrafish
• Morpholino iniettato nel tuorlo allo stadio di una cellula;• Co-iniezione di un tracciante per identificare gli embrioni
correttamente iniettati;• Come controllo negativo si usa un morpholino senza target.
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Fenotipi nello zebrafish Pompe
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Sezioni trasverse semifini
Scale bar = 40 um
Sezioni trasverse colorate con blu di toluidina, a 4 dpf
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Microscopia elettronica
STD-MO ATGgaa-MO I9E10gaa-MO
Scale bar = 2 um
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Muscolo di pazienti con malattia di Pompe
Microscopia elettronica
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Glicogeno e lisosomi
Glicogeno Lisosomi
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Touch-evoked response test
Standard Control
Embrioni
a 3 dpf
Morfante
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Autofagia
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Nei morfanti trascritti e proteine dell’autofagia sono alterati
Autofagia
Beclin 1 Lc3b
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Rescue
L’iniezione di gaa mRNA wild type ripristina il fenotipo sano
Glicogeno
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Test di composti chimici
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Trattamento
Acido 3-Bromo piruvico 3-BrPA
Esochinasi II è uno dei
maggiori target di 3-BrPA
3-BrPA è efficace come
antitumorale nei tumori che
dipendono dalla glicolisi per
produrre ATP.
3-BrPA ha una struttura simile
al lattato ed è verosimilmente
trasportato all’interno delle
cellule attraverso un
trasportatore
monocarbossilato
Modula
l’autofagia
Riduce il
glicogeno
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Trattamento
3-BrPA passa attraversa il chorion
Acido 3-Bromo piruvico 3-BrPA
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Trattamento
Acido 3-Bromo piruvico 3-BrPA
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Trattamento
Acido 3-Bromo piruvico 3-BrPA
Glicogeno
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Trattamento
3-BrPA migliora l’effetto rescue
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Trattamento
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Trattamento
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Touch-evoked response test
Embrioni
a 3 dpf
Standard
Morfante Morfante trattato con 3-BrPA
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Conclusioni
• Il modello zebrafish ricapitola le caratteristiche patologiche della malattia di
Pompe
• 3-BrPA potrebbe essere un adiuvante della
terapia enzimatica
• Lo zebrafish rappresenta un tool efficace e poco costoso per testare in
modo veloce composti con potenziale terapeutico
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Prospettive future
• Utilizzare il modello transiente per selezionare altri composti
• Validare i nostri risultati nel modello stabile fino all’adulto
• Verificare l’effetto del trattamento a lungo termine
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Silvia CarraFranco CotelliMonica Beltrame
Cinzia Bragato Flavia Blasevich
Alessia Brix