IL “PACCHETTO CHIMICO ” A

SUPPORTO DELLA DIAGNOSI

IL “PACCHETTO CHIMICO ” A

SUPPORTO DELLA DIAGNOSI

Torino, 29 giugno 2017

Pierluigi CapraPierluigi CapraPierluigi CapraPierluigi Capra

L’ Unità Operativa Tossicologia e ricerca

anabolizzanti presso CAD

Introduzione

Centro Regionale AntiDoping «A. Bertinaria»

Espressione del Consorzio di Enti pubblici:

- Regione Piemonte

- Università di Torino

- AOU San Luigi di Orbassano

- IZSPLVA

Introduzione

Introduzione

All’interno del centro creata ed equipaggiata

l’U.O.

Le attività dell’U.O.

Attività dell’U.O.

• Ricerca residui cat. A e B in esecuzione del

PNR Extrapiano regionale

• Tossicologia Veterinaria

Le attività dell’U.O.

Il progressivo incremento dell’ operatività

dell’U.O. ha «coinciso» con la prima

emanzione dell’Ordinanza Martini

(Dicembre 2008)

L’ O.M. Stabilisce tempistiche per l’iter di

accertamento routinarizzando l’esecuzione

degli esami chimici tossicologici sugli

animali domestici, selvatici e da reddito.

Protocollo chimico - Generalità

Tipo di campioni:

• Materiale autoptico: pool fegato e

rene,contenuto gastrico, contenuto del

gozzo

• Presunte esche: materiali di varia natura

• Altro: sangue, urina feci, api e parti di

alveare,….

Protocollo chimico - Generalità

L’esame o gli esami chimici sono orientati

dalle indicazioni ottenute in sede

diagnostica o anatomopatologica

(anamnesi, individuazione di lesioni agli

organi o presenza di materiali sospetti)

Protocollo chimico - Generalità

Metodi di analisi:

TOSSSC: Rodenticidi LC-MS/MS - Product

Ion Scan

TOSSA : α-cloralosio LC-MS/MS - Product

Ion Scan

TOSSCRO: Biocidi GC-MS - Full Scan

La fase preparativa è unica per i 3 esami

strumentali.

Protocollo chimico - Generalità

Quechers: figura e 2 paroleFamily (chemical type

or use)Components

PYRETHROIDS (GC-MS)cypermethrin, decamethrin, permethrin I and

II

CARBAMATES (GC-MS)carbofuran, desmedipham, mercaptodimethur (methiocarb), methomyl, oxamyl, propoxur

ORGANOPHOSPHATES (GC-MS)

chlorpyrifos-ethyl, chlorpyrifos-methyl, coumaphos, diazinon, dimethoate, ethion, isophenphos, malathion, methamidophos, mevinphos (phosdrin), parathion-ethyl,

parathion-methyl, phorate, pirimiphos-methyl, sulfotep, terbufos

ORGANOCHLORIDES (GC-MS)

α-endosulfan, β-endosulfan, endosulfan sulfate, lindane, tetradifon

ANTICOAGULANTS (LC-MS/MS)

acenocoumarol, brodifacoum, bromadiolone, chlorophacinone, coumachlor, coumafuryl,

coumatetralyl, dicoumarol, difenacoum, diphacinone,

flocoumafen, pindone, warfarin

α-CHLORALOSE (LC-MS/MS)

α-chloralose

MISCELLANEOUS (GC-MS)lenacil, metaldehyde, piperonyl butoxide,

strychnine, monoethylene glycol

Protocollo chimico - Generalità

Convegno Nazionale

L’AVVELENAMENTO DEGLI ANIMALI

IN ITALIA

Il fenomeno degli avvelenamenti degli

animali in Italia a cinque anni

dall’emanazione della Ordinanza

Ministeriale

Roma, 10 Dicembre 2013

Protocollo chimico – Preparazione del campione

Estrazione/Purificazione:

1)Sospetto «veleno» trattato direttamente con

solvente organico (polverizzatura se

necessario) mediante agitazione e ultrasuoni

centrifugato e se necessario filtrato

2)Materiale organico che non presenti tracce

macroscopiche di materiale sospetto:

QuECheRS

Protocollo chimico – Preparazione del campione

Protocollo chimico – Preparazione del campione

Protocollo chimico – Acquisizione LC-MS/MS

Protocollo chimico – Acquisizione LC-MS/MS

GC-MS: Agilent 6890 + Agilent 5975

• Column: HP5 – 30m x 0,25 mm x 0,25µm

• Carrier: He 1ml/min (constant flow)

• Injection: 1 µl splitless • T° injector: 280°C

Ramp (°C/min)

Final temp (°C)

Dwell time

(min)

0 40 1.50

25 260 3.00

25 300 10.00

Total time: 24.90 min

Protocollo chimico – Acquisizione GC-MS

Protocollo chimico – Acquisizione GC-MS

Protocollo chimico – Acquisizione GC-MS

stricnina

Protocollo chimico – Acquisizione GC-MS

α-endosulfano

β-endosulfano

Protocollo chimico – Acquisizione GC-MS

embutramideGC-MS Full Scan metodo «aperto»

Protocollo chimico – Prestazioni dei metodi

Validazione:

- Verificate specificità e capacita di

rivelazione su campioni di pool di organi

(varie specie) a 50 microgrammi/Kg per i

rodenticidi, 100 microgrammi/Kg per l’alfa-

cloralosio e 4000 microgrammi/Kg per gli

analiti relativi al metodo GC-MS.

Protocollo chimico – Prestazioni dei metodi

Controlli di Qualità:

- Utilizzati standard interno («di processo»

secondo le linee guida II.ZZ.SS) deuterati,

per entrambi i metodi strumentali

- Per il metodo LC-MS/MS (rodentici e

cloralosio), inseriti in ogni batch analitico

controlli negati e positivi (matrice:fegato) a

concentrazione pari alla capacità di

rivelazione.

Protocollo chimico – Limitazioni e possibili sviluppi

Attuali limiti/possibili sviluppi

- Rodenticidi non anticoagulanti (Es.

vitamina D, azione tossica cumulativa a

livello di fegato e reni.

- Cianuri (cromatografia ionica o test

colorimetrico al «blu di prussia»)

- Fosfuro di zinco (GC spazio di testa)

P.Capra

M.Leporati

P. BrizioS. Falsetti

V. Ciccotelli

M. Scavo

A. Trossi

F. Fioravanti

R.Avolio

Grazie per l’attenzione!