4  

II. BAHAN DAN METODE

Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan. Tahapan –tahapan

tersebut terdiri dari proses penyiapan dan ekstraksi tanaman, penyediaan bakteri,

pengujian sensitivitas bakteri S. agalactiae dan A. hydrophila terhadap tanaman

yang telah diekstraksi, dan pengujian minimum inhibitory concentration (MIC).

2.1 Penyediaan Tanaman

Tanaman uji diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan

Aromatika (BALITTRO) Cimanggu, Bogor (Lampiran 1). Tanaman tersebut

dibersihkan dari kotoran yang melekat dengan air mengalir, kemudian dipilih

bagian yang akan digunakan. Untuk penyiapan umbi dan rhizoma dengan cara

diiris tipis terlebih dahulu. Bagian tanaman yang telah dipilih selanjutnya

dilakukan proses pengeringan dengan menggunakan blower (Lampiran 2) pada

kisaran suhu 55-60oC. Sediaan bahan yang telah kering tersebut kemudian

dihaluskan dengan blender. Setelah itu disimpan dalam wadah tertutup dan

terhindar dari cahaya matahari. Sampel tumbuhan sebanyak 18 tanaman disajikan

pada Tabel 1 di bawah ini:

Tabel 1. Sampel tumbuhan dan bagian yang diekstraksi

No. Nama lokal Nama ilmiah Bagian yang digunakan

1. Kunyit Curcuma domestica Rhizoma 2. Ketapang Terminalia catappa Daun 3. Kipahit Tithonia diversifolia Daun 4. Babandotan Ageratum conyzoides Semua bagian 5. Kirinyuh Eupatorium inulaefolium Daun 6. Meniran Phyllanthus niruri Semua bagian 7. Temu lawak Curcuma xanthorrhiza Rhizoma 8. Talas Colocasia esculenta Daun 9. Sirih Piper betle Daun

10. Kunyit putih Curcuma zedoaria Rhizoma 11. Kimanila Cassia alata Daun 12. Jawer kotok Plectranthus scutellaroides Daun 13. Combrang Etlingera elatior Daun 14. Jambu monyet Anacardia occidentale Daun

5  

Lanjutan Tabel 1

No. Nama lokal Nama ilmiah Bagian yang digunakan

15. Cebreng Gliricidia sepium Daun 16. Petai Parkia speciosa Daun 17. Bawang putih Allium sativum Umbi 18. Petai cina Leucaena leucocephala Daun

2.2 Ekstraksi Tanaman

Ekstraksi tanaman dilakukan dengan metode maserasi atau perendaman

dari Pachanawan et al. (2008) dengan beberapa modifikasi. Ekstraksi komponen

bioaktif tanaman pada Tabel 1 di atas menggunakan metode maserasi dengan

pelarut etanol 95% (Pro Analis) dan double distilled water (ddH2O).

a) Maserasi dengan Etanol 95%

Serbuk tanaman direndam pada pelarut dengan perbandingan 1:10 (w/v),

pada penelitian ini digunakan 10 gram serbuk /100 mL. Masing-masing tanaman

dilakukan sebanyak tiga ulangan. Diagram alir maserasi dengan pelarut etanol

disajikan sebagai berikut (Gambar 1).

Gambar 1. Diagram alir metode maserasi komponen bioaktif tanaman dengan pelarut etanol 95%.

Sebanyak 10 gram serbuk tanaman direndam pada 100 mL etanol 95%

selama 72 jam pada suhu ruang, untuk melarutkan komponen bioaktif pada

tanaman tersebut. Setelah 72 jam larutan tersebut difilter dengan saringan teh

ukuran ±1,2 mm (filter 1). Penyaringan selanjutnya digunakan saringan yang lebih

Sebuk tanaman dimaserasi 72 jam dengan etanol 95% (100 mL)

Hasil maserasi difiltrasi (filter 1,2,3)

Filtrat dievaporasi

Ekstrak kasar

Serbuk tanaman (10 gram)

6  

kecil ±0,6 mm (filter 2). Setelah tahapan filter kedua, digunakan kertas saring

Whatman no. 125 sebagai filter ke tiga. Kemudian tahapan terakhir adalah

dilakukan evaporasi. Rendemen ekstrak hasil evaporasi tersebut kemudian

disimpan di freezer.

b) Maserasi dengan ddH2O

Serbuk tanaman direndam dengan ddH2O dengan perbandingan 1:10

(w/v). Digunakan 10 gram serbuk /100 mL ddH2O dan dilakukan sebanyak tiga

ulangan. Diagram alir maserasi dengan pelarut ddH2O disajikan sebagai berikut

(Gambar 2).

Gambar 2. Diagram alir metode maserasi komponen bioaktif tanaman dengan pelarut ddH2O.

Sebanyak 10 gram serbuk tanaman dilarutkan pada 100 mL ddH2O selama

72 jam pada suhu ruang. Setelah 72 jam larutan tersebut disaring dengan

menggunakan saringan teh ukuran ±1,2 mm (filter 1). Saringan yang lebih kecil

±0,6 mm digunakan sebagai filter ke dua. Selanjutnya setelah melewati filter ke

dua, difilter kertas saring Whatman no.125 (filter 3). Untuk mendapatkan

supernatan, ekstrak yang telah melewati filter ke tiga disentrifugasi dengan

kecepatan 5.000 g selama 10 menit. Supernatan kemudian diambil dengan

menggunakan syringe 50 mL dan difiltrasi dengan saringan bakteri ukuran 0,22

dan 0,20 µm. Kemudian supernatan tersebut disimpan di freezer.

Serbuk tanaman dimaserasi 72 jam dengan ddH2O (100 mL)

Hasil maserasi difiltrasi (filter 1,2,3)

Filtrat disentrifugasi 5.000 g (10 menit)

Supernatan

Supernatan difiltrasi dengan saringan bakteri 0,22 dan 0,20 µm

Serbuk tanaman (10 gram)

7  

2.3 Penyediaan Bakteri

Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah A. hydrophila dan

S. agalactiae. Kedua bakteri ini adalah koleksi Laboratorium Patologi BPPBAT

Sempur, Bogor. Sebelum dipergunakan bakteri tersebut diidentifikasi terlebih

dahulu dengan metode pewarnaan Gram dan uji Biokimia. Bakteri A. hydrophila

ditumbuhkan pada media Müller Hinton Agar (MHA) dan Müller Hinton Broth

(MHB), sedangkan untuk bakteri S. agalactiae ditumbuhkan pada media

brain heart infusion agar (BHIA) dan brain heart infusion broth (BHIB).

2.4 Pengujian Sensitivitas Bakteri S. agalactiae dan A. hydrophila terhadap Ekstrak Tanaman

a) Persiapan Suspensi Bakteri

Persiapan bakteri untuk uji sensitivitas dilakukan dengan metode

direct colony suspension (NCLLS 2005). Bakteri digores pada cawan petri yang

telah berisi medium MHA untuk A. hydrophila dan medium BHIA untuk

S. agalactiae, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 34o C. Setelah

24 jam, dipilih beberapa koloni dengan ose dan dihomogenkan dengan vortex

pada phosphate buffer saline (PBS) steril. Selanjutnya suspensi bakteri disamakan

turbiditasnya dengan McFarland 0,5 yaitu dengan nilai absorbansi 0,08-0,1 pada

panjang gelombang 625 nm. Nilai absorbansi tersebut kira-kira setara dengan

1,5x108 CFU/mL (NCLLS 2005). Suspensi bakteri tersebut diupayakan disebar

dengan waktu pengerjaan tidak lebih dari 15 menit.

b) Prosedur uji sensitivitas bakteri terhadap bahan

Pengujian sensitivitas bakteri S. agalactiae dan A. hydrophila terhadap

tanaman yang telah diekstraksi dilakukan dengan metode Kirby Bauer

(NCLLS 2005). Tahap pertama pada pengujian sensitivitas bakteri terhadap bahan

uji ini adalah persiapan ekstrak pada kertas cakram. Ekstrak kasar dilarutkan

dengan etanol 95% hingga konsentrasinya 100.000 ppm, kemudian ekstrak

diteteskan pada kertas cakram yang berdiameter 6 mm sebanyak 20 µL dan

ditunggu hingga pelarut etanol 95% menguap (± 3 menit). Konsentrasi ekstrak

tiap kertas cakram adalah 2000 µg/kertas cakram (Lampiran 3).

Tahap kedua adalah mempersiapkan bakteri A. hydrophila dan

S. agalactiae pada masing-masing medium agar. Sebanyak 100 µL bakteri yang

8  

telah disamakan nilai absorabansinya dengan McFarland 0,5 diteteskan pada

permukaan medium agar yang telah mengeras. Bakteri yang telah diteteskan

tersebut disebar secara merata pada permukaan agar dengan teknik swabbing.

Digunakan cotton bud steril sebagai alat penyebarnya. Masing-masing kertas

cakram yang telah berisi ekstrak kemudian ditempelkan pada permukaan agar

yang telah disebar bakteri dengan bantuan pinset steril secara aseptik. Cawan petri

tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 34°C. Ekstrak tanaman

yang positif memiliki zat antibakteri, akan terbentuk zona bening pada sekeliling

kertas cakram (Lampiran 4). Diameter zona bening dihitung secara total

menggunakan jangka sorong. Metode untuk uji sensitivitas bakteri terhadap bahan

uji dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Tahapan uji sensitivitas antibakteri

2.5 Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Uji minimum inhibitory concentration (MIC) ini dilakukan dengan metode

Macrodilution (NCLLS 2005) dengan beberapa modifikasi. Uji MIC ini dilakukan

pada dua macam hasil ekstraksi yakni ekstraksi dengan ddH2O dan dengan etanol

95%.

Suspensi bakteri diukur absorbansinya 0,08-0,1 pada 625 nm Kertas cakram ditetesi ekstrak 20 µL

Suspensi bakteri disebar dengan teknik swabbing pada permukaan agar sebanyak 100 µL

Kertas cakram diuapkan hingga pelarut menguap atau hingga permukaannya kering

Kertas cakram diletakkan secara aseptik pada permukaan agar yg telah disebar bakteri uji

Agar yang berisi bakteri dan kertas cakram diinkubasi selama 24 jam

Pengamatan dan pengukuran zona bening

9  

a) Persiapan Suspensi Bakteri

Persiapan bakteri untuk uji MIC dilakukan dengan mengkultur bakteri uji

pada masing-masing media cair, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Media

MHB untuk bakteri A. hydrophila dan BHIB untuk S. agalactiae. Setelah

diinkubasi selama 24 jam, kultur bakteri diukur turbiditasnya pada panjang

gelombang 625 nm. Dicari nilai absorbansi 0,08-0,1 atau disetarakan dengan

McFarland 0,5. Bakteri dengan nilai absorbansi 0,08-0,1 dikatakan setara dengan

108 CFU/mL. Setelah itu kultur bakteri tersebut diencerkan sehingga didapatkan

stok 106 CFU/mL.

b) Prosedur uji MIC dengan metode macrodilution pada ekstraksi dengan ddH2O. Ekstraksi dengan ddH2O dilakukan tanpa melalui proses evaporasi,

sehingga nilai konsentrasinya didapat dari perbandingan serbuk tanaman dengan

pelarutnya. Untuk uji MIC pada ekstrak hasil maserasi dengan ddH2O, digunakan

double strength broth atau media cair dengan kuantitas serbuk medianya dua kali

dosis (Lampiran 5). Pertama-tama dipersiapkan larutan stok dari ekstrak tanaman

yang diperoleh dengan mencampurkan 1 mL larutan ekstrak dengan 1 mL media

cair double strength untuk masing-masing bakteri. Larutan stok ini nilai

konsentrasinya setengah dari nilai konsentrasi awal, konsentrasinya adalah sebesar

50.000 ppm.

Setelah larutan stok dipersiapkan, selanjutnya dipersiapkan tabung reaksi

sebanyak 12 buah untuk masing-masing ekstrak tanaman. Tabung reaksi diisi

dengan media cair double strength untuk masing-masing bakteri sebanyak 1 mL

dimulai dari tabung nomor 2 hingga tabung nomor 12. Tabung pertama dan kedua

diisi dengan larutan stok, tabung ke-2 yang telah berisi larutan ekstrak 1 mL dan

media cair double strength sebanyak 1 mL dihomogenasi vortex kemudian

diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung nomor 3, dilakukan seterusnya

hingga tabung ke-11. Pada tabung ke-11, sebanyak 1 mL larutan tidak

dimasukkan ke tabung ke-12 tetapi dibuang. Tabung ke-12 merupakan kontrol

yang berisi media saja. Setelah keduabelas tabung tersebut berisi masing-masing

konsentrasi larutan, kemudian masing-masing tabung diisi suspensi bakteri

10  

dengan kepadatan 106 CFU/mL sebanyak 1 mL (Lampiran 6). Pengenceran

konsentrasi dilakukan dengan deret geometrik (Lampiran 7).

Tabung-tabung yang telah berisi ekstrak dan bakteri tersebut diinkubasi

pada suhu 34°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, diamati tabung yang relatif

bening dibandingkan kontrol (tabung 12) secara visual. Kemudian campuran

ekstrak dan suspensi bakteri tersebut disebar sebanyak 50 µL di media agar BHIA

untuk S. agalactiae dan MHA untuk A. hydrophila pada cawan petri, dimulai

dari tabung yang relatif bening hingga tabung ke-1. Kemudian diinkubasi selama

24 jam, selanjutnya dihitung jumlah koloninya. Jumlah bakteri pada uji MIC ini

dalam bentuk log koloni/mℓ. Berdasarkan Pankey dan Sabath (2010), MIC adalah

konsentrasi terendah ekstrak tanaman uji yang dapat menghambat pertumbuhan

mikroba sebanyak 90%-99% (1 log koloni dari jumlah koloni awal).

c) Prosedur uji MIC dengan metode Macrodilution pada ekstrak hasil maserasi dengan etanol 95%.

Ekstraksi hasil maserasi dengan etanol 95% dilakukan melalui tahap

evaporasi sehingga didapatkan ekstrak kasar. Untuk membuat larutan stok,

dilakukan pencampuran ekstrak kasar dengan pelarut broth sehingga didapatkan

konsentrasi yang diinginkan yaitu 50.000 ppm. Karena ekstrak kasar hasil

evaporasi dengan ethanol 95% sebagian besar berupa pasta yang agak berminyak.

Pencampuran ekstrak kasar dengan broth ditambahkan emulsifier Polysorbate 80

(Tween 80) supaya ekstrak terlarut sempurna. Hal ini menurut Purseglove et al.

(1981) dalam Fadhilla (2010), penggunaan alkohol dengan konsentrasi lebih dari

70% akan menghasilkan ekstrak dengan kandungan fixed oil tinggi. Broth

dipanaskan terlebih dahulu pada suhu sekitar 45o C sebelum ekstrak dilarutkan.

Ditambahkan Tween 80 sebanyak 0,1 gram untuk melarutkan 0.1 gram ekstrak

kasar. Setelah ekstrak kasar dan broth terlarut sempurna, sebelum dimasukkan ke

dalam tabung reaksi dilakukan filtrasi terlebih dahulu menggunakan filter bakteri

dengan ukuran pori-pori 0,20 µm. Langkah selanjutnya relatif sama dengan

prosedur uji MIC dengan metode macrodilution pada ekstrak hasil maserasi

dengan ddH2O.

11