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IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS VARIANTES GENOTÍPICAS DEL
SÍNDROME DE MARFAN, UN ESTUDIO DE CASO.
KAREN XIOMARA CRUZ MENDOZA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTÁ
2017
2
IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS VARIANTES GENOTÍPICAS DEL
SÍNDROME DE MARFAN, UN ESTUDIO DE CASO.
KAREN XIOMARA CRUZ MENDOZA
Proyecto de trabajo de grado para optar al título de Licenciado en Biología.
Modalidad Investigación-Innovación
Director
Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTÁ
2017
3
Artículo 117 Acuerdo 029 del Estatuto Estudiantil
La Universidad Distrital Francisco José de Caldas
No se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, expuesto
por sus autores.
Expedido en Junio de 1988 por el Consejo Superior de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas.
4
AGRADECIMIENTOS
Culminar este proceso no habría sido posible sin el acompañamiento de aquellas
personas que aportaron a mi crecimiento personal y profesional. En primer lugar, quiero
agradecer a mi familia por su apoyo incondicional y paciencia durante este ciclo de
formación, principalmente en este último proceso para alcanzar mi sueño y título profesiona l.
Al Profesor Luis Francisco Becerra quien desde el inicio de mi carrera me acogió
con cariño, me dió la oportunidad de ingresar al grupo de investigación BIOMOL y me apoyó
en el desarrollo de este trabajo.
A mis compañeros del grupo de investigación y semillero por sus enseñanzas y el
apoyo a este trabajo. A mis amigos, Dianny, Sebastián, Andrés, Stefany, Camilo, Angie,
Juan, Asdrubbal y todos aquellos que me acompañaron y guiaron este recorrido, soportando
y haciendo más amenas todas las situaciones vividas en este viaje.
Finalmente, a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por su colaboración en este
proyecto de investigación; por ser testigo y causante de todas las experiencias que me
enriquecieron como persona.
A todos ¡Gracias!
5
CONTENIDO
RESUMEN…………………………………………………………………………………12
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………13
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................... 15
2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 16
3. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 17
3.1 OBJETIVO GENERAL.................................................................................................. 17
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 17
4. MARCO REFERENCIAL................................................................................................ 18
4.4 SINDROME DE MARFAN ........................................................................................... 18
4.4.1 Historia……………………………………………………………………………….18
4.4.2 Criterios diagnósticos para el síndrome de Marfan (MFS) ......................................... 19
4.4.3 Tratamiento y pronostico ............................................................................................. 23
4.4.4 Herencia………………………………………………………………………………24
4.5 FIBRILINA Y EL GEN FBN1 ....................................................................................... 24
4.6 TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN ............................................................................. 25
4.6.1 Secuenciación masiva de nueva generación (NGS) .................................................... 26
4.7 ESTUDIOS RELACIONADOS ..................................................................................... 27
5. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 28
5.1 MATRIZ DE CARACTERES RELACIONADOS CON SINDROME MARFAN ...... 28
5.2 OBTENCIÓN DE ADN ................................................................................................. 29
5.2.1 Venopunción ………………………………………………………………………...29
5.2.2 Extracción de ADN a secuenciar ................................................................................. 29
5.2.3 Cuantificación .............................................................................................................. 31
6
5.2.4 Verificación de ADN ................................................................................................... 31
5.3 SECUENCIACIÓN MASIVA DE NUEVA GENERACIÓN (NGS) ........................... 31
5.4 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO .................................................................................. 31
5.4.1 Pretratamiento .............................................................................................................. 32
5.4.2 Mapeo ………………………………………………………………………………..34
5.4.3 Llamado de SNPs ........................................................................................................ 34
5.4.4 BLAST……………………………………………………………………………….34
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS ......................................................................................... 36
6.1 MATRIZ DE CARACTERES SUGERENTES DE SINDROME DE MARFAN ........ 36
6.2 EXTRACCIÓN DE ADN............................................................................................... 43
6.2.1 Cuantificación de las muestras .................................................................................... 43
6.3 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO................................................................................... 47
6.3.1 Calidad de la secuencia................................................................................................ 48
6.4 VARIANTES GENOTÍPICAS....................................................................................... 55
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 58
8. RECOMENDACIONES................................................................................................... 59
9. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 60
10. ANEXOS ........................................................................................................................ 65
7
LISTA DE IMÁGENES
Imagen 1 principales plataformas de secuenciación masiva (Metzker 2010) en Furió (2012)
.............................................................................................................................................. 26
Imagen 2 Abrir el Programa FastQc. .................................................................................... 33
Imagen 3 Abrir archivo de lectura. ....................................................................................... 33
Imagen 4. Comparar secuencias en BLAST. ........................................................................ 35
Imagen 5. Verificación de ADN total en gel de agarosa al 2%. .......................................... 47
Imagen 6. Datos básicos de la secuencia en el programa FastQC ........................................ 49
Imagen 7. 287 secuencias sobre-representadas de 75000 totales. ........................................ 53
Imagen 8 BLASTx ............................................................................................................... 56
Imagen 9. Árbol genealógico. ............................................................................................. 57
Imagen 10. Secuencias definitivas para cada individuo del estudio de caso. ....................... 67
Imagen 11. BLASTn comparación de la secuencia query 01 con el GH Ch15 en NCBI. ... 68
Imagen 12. BLASTn comparación de la secuencia query 02 con el GH Ch15 en NCBI. ... 68
Imagen 13. BLASTn comparación de la secuencia query 03 con el GH Ch15 en NCBI. ... 69
Imagen 14. BLASTn comparación de la secuencia query 04 con el GH Ch15 en NCBI. ... 69
Imagen 15. BLASTn comparación de la secuencia query 05 con el GH Ch15 en NCBI. ... 70
8
LISTA DE FOTOGRAFÍAS
Fotografía 1. Signo de Walker-Murdoch o signo de la muñeca positivo para Individuo 01,
característica esquelética del síndrome de Marfan. .............................................................. 36
Fotografía 2. Signo de Gowers positivo (con protrusión del pulgar en oposición forzada, más
allá del borde cubital con el puño cerrado) positivo para aranodactilia en Individuo 01. .... 37
Fotografía 3. Signo de Gowers positivo (con protrusión del pulgar en oposición forzada, más
allá del borde cubital con el puño cerrado) positivo para aranodactilia en Individuo 02. .... 37
Fotografía 4. Signo de Walker-Murdoch o signo de la muñeca positivo para Individuo 02,
característica esquelética del síndrome de Marfan. .............................................................. 38
Fotografía 5. Estrías atróficas criterio menor para síndrome de Marfan .............................. 38
Fotografía 6.. Individuo 02. Estrías atroficass criterio menor para síndrome de Marfan ..... 39
Fotografía 7. Individuo 04. Estrías atróficas ........................................................................ 39
Fotografía 8. Hiperextensión de rodillas se observa que la curvatura al extender la rodilla
sobresale más de lo normal; también es evidente el pie plano, la contextura delgada y fina de
las extremidades inferiores. .................................................................................................. 40
Fotografía 9. Individuo 01. Flexibilidad de la muñeca. Aposición pasiva de los pulgares a la
cara flexora del antebrazo ..................................................................................................... 40
Fotografía 10. Individuo 02. Flexibilidad de la muñeca. Aposición pasiva de los pulgares a
la cara flexora del antebrazo………………………………………………………………..41
9
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Resumen de los criterios de Ghent. Criterios de diagnóstico para cada sistema de
órganos afectados por el Síndrome de Marfan Tomado de Loja et al. (2001). .................... 22
Tabla 2. Modelo de la matriz de características del síndrome de Marfan. ........................... 29
Tabla 3. Alteraciones musculoesqueléticas presentes en el grupo familiar de estudio. ....... 41
Tabla 5. Relación de la brazada con respecto a la estatura de cada individuo. .................... 42
Tabla 4. Criterios de Beighton (1973). Tomada de Institut Ferran de Reumatología (2013)
.............................................................................................................................................. 43
Tabla 6. Cuantificación de ADN (concentración de ADN por muestra ng/μL). .................. 44
Tabla 7. Mapeo de la secuencia tratada. Resultados arrojados por Bowtie2. ....................... 54
Tabla 8 Variantes genotípicas obtenidas con la herramienta BLASTn de NCBI ................. 55
Tabla 9. Variaciones registradas para el Síndrome de Marfan.Tomado de OMIM (2017). . 71
10
LISTA DE GRAFICAS
Gráfica 1. Extracción de DNA. Muestra 3 utilizando el kit del grupo BIOMOL. ............... 45
Gráfica 2. Extracción de DNA. Muestra 9 utilizando el kit del grupo BIOMOL ................ 46
Gráfica 3. Extracción de DNA. Muestra 33 utilizando el kit del grupo BIOMOL ............. 46
Gráfica 4 Calidad de las Bases. ............................................................................................ 50
Gráfica 5. Índice de calidad por secuencia ........................................................................... 50
Gráfica 6.Calidad de secuencia por Tile. .............................................................................. 51
Gráfica 7. Contenido de bases por secuencia.. ..................................................................... 51
Gráfica 9 Contenido de Bases N casi nulo para las llamadas de bases. ............................... 52
Gráfica 10 Distribución de la Longitud de las Secuencias. .................................................. 53
Gráfica 11.Contenido de adaptadores .................................................................................. 54
11
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A. PCR INDIVIDUO 01 ............................................................................ 65
ANEXO B. SECUENCIAS QUERY FORMATO FASTA .................................... 67
ANEXO C. BLASTn ................................................................................................ 68
ANEXO D. VARIANTES GENETICAS DEL SINDROME DE MARFAN .......... 71
ANEXO E. AMPLIACIÓN DEL ÁRBOL GENEALÓGICO ................................. 72
12
RESUMEN
El síndrome de Marfan es uno de los trastornos fibrinógenos que modifican a las
proteínas estructurantes del tejido conectivo al presentarse mutaciones en el Gen FBN1
ocasionando desordenes que generalmente son hereditarios. La diversidad de variantes
genéticas que puede presentar este gen dificulta el diagnóstico de la enfermedad; por lo tanto,
esta investigación tuvo como objetivo realizar un estudio a un grupo familiar con
características afines al síndrome con el fin de identificar más variantes genotípicas que
influyen en la expresión de los fenotipos compatibles con el Marfan para incluir en el
diagnostico a pacientes con rasgos leves de la enfermedad; Para ello se hizo un anális is
molecular, partiendo de la obtención de ADN con la técnica Salting out. Las muestras
obtenidas fueron secuenciadas a través del método secuenciación masiva de nueva
generación (NGS) en la plataforma Illumina 1.9 que permitió conseguir las secuencias del
grupo de estudio. Obtenidas las secuencias se les realizó un análisis bioinformático para
relacionar las variantes genéticas resultantes con el Síndrome de Marfan por medio de
herramientas como: FastQc de análisis de calidad, Bowtie2 para el mapeo de secuencias ,
SamTools para el llamado de variantes, BLASTn para la comparación de las secuencias
obtenidas con lo reportado en las bases de datos; Finalmente, se utilizó BLASTx para observar
si las proteínas codificadas por dichas secuencias tienen cambios afines con la enfermedad
de Marfan. Obteniendo la localización de 5 variantes entre transiciones y tranversiones no
reportadas en la base de datos OMIM, una de esta hallada en todo el grupo familiar. Al dar
la lectura proteica se comprobó la existencia de un cambio en la codificación de la proteína
dada por FBN1 lo que puede explicar los rasgos fenotípicos característicos del Marfan que
la familia expreso.
PALABRAS CLAVE: Síndrome de Marfan, Secuenciación masiva de nueva generación
(NGS), Análisis bioinformático, Variantes genéticas.
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INTRODUCCIÓN
El síndrome de Marfan es un trastorno genético de herencia mendeliana, clasificado
por el Ministerio de Salud de Colombia como una de las enfermedades huérfanas; es decir,
una enfermedad rara y/o desatendida (Mateus, s.f). Este síndrome afecta al tejido conectivo
de los organismos pues ocasiona anormalidades en genes que codifican las proteínas
estructurantes de este tejido, donde se ve principalmente comprometido el gen FBN1.
Diversos estudios han demostrado que este gen tiene una amplia variabilidad genética,
registrándo 1847 mutaciones tanto benignas como patológicas y 1096 variantes proteicas
hasta el momento; siendo algunas de ellas únicas por grupo familiar (Tjeldhorn, et al., 2015).
Por tanto, es relevante hallar el mayor número de variantes posibles y determinar si estas son
patológicas o no.
La secuenciación masiva de nueva generación (NGS) permite observar los cambios
en los nucleótidos que presentan los genomas, los cuales pueden ser analizados mediante
herramientas bioinformáticas para establecer cuáles de estos cambios son patológicos o
cuales no han sido reportados. Y así, facilitar futuros diagnósticos diferenciales en las
enfermedades genéticas, que permitan otorgar a los pacientes una atención médica adecuada
y oportuna.
En el caso de esta investigación se utilizaron seis herramientas bioinformáticas a fin
de determinar la calidad de la secuencia cruda y el tratamiento de esta para obtener una
secuencia limpia y fácil de analizar en formato Fasta, realizando la comparación contra la
base de datos OMIM para cumplir con el objetivo de investigación.
El grupo familiar de estudio tiene una F3 con características fenotípicas relacionadas
con el síndrome de Marfan, hecho que motivo la realización de esta investigación. El
individuo principal de estudio o probando fue una mujer de 25 años que porta una mutación
en el gen FBN1 cuyo diagnostico patológico fue inconcluso. Por consiguiente, se
relacionaron a sus familiares directos para el estudio genético, en este caso haciendo una
identificación de Polimorfismos de Nucleótidos Simples (SNPs) Estas variaciones se han
identificado en diversas especies incluyendo al hombre, siendo de gran importanc ia
biológica; ya que, determinan la mayor parte de la variabilidad genética de los individuos
14
(Frazer et al. 2009). Al desarrollar investigaciones en estos polimorfismos se promueve el
avance de las nuevas tecnologías médicas, pues la susceptibilidad, resistencia individual y
los cambios proteicos relacionados con distintas enfermedades son ocasionados
principalmente por estas variantes y con menor frecuencia por inserciones, deleciones,
secuencias repetitivas y/o arreglos cromosómicos (Harismendy et al. 2009).
15
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El diagnóstico para el Síndrome de Marfan está relacionado con el gen FBN1; sin
embargo, es difícil de conceder; ya que, se han encontrado diversas variaciones en este gen
relacionadas con el síndrome; tal como menciona Faiver et al. (2007) en el texto “Effect of
Mutation Type and Location on Clinical Outcome in 1,013 Probands with Marfan Syndrome
or Related Phenotypes and FBN1 Mutations: An International Study” donde indica que se
han reportado 559 mutaciones patológicas del FBN1 siendo en su mayoría mutaciones únicas
por grupo familiar. Por ende, es necesario identificar la mayor cantidad posible de variantes
genotípicas causales o potencialmente causales del Síndrome para realizar un rápido
diagnóstico y un seguimiento clínico adecuado para los pacientes y su descendencia. Por lo
tanto, se realizó un estudio a un grupo familiar en el que uno de sus miembros presenta una
mutación del FBN1, pero cuyo análisis de PCR realizado por The John Welsh
Cardiovasculary Diagnostic Laboratory resultó inconcluso (ver Anexo A.).
En consecuencia, al evaluar al grupo familiar mediante la secuenciación masiva del
DNA de los individuos cabe preguntarse: ¿Cuantas variables genotípicas relacionadas con el
Síndrome de Marfan tiene este grupo familiar?
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2. JUSTIFICACIÓN
Este trabajo surge de la necesidad de ampliar la información acerca del síndrome de
Marfan; debido a que en la actualidad no se encuentran registros completos de las variantes
del gen FBN1; Pues, con el tiempo las variables genéticas cambian acorde a cada grupo
familiar. Teniendo en cuenta lo escrito anteriormente este trabajo extiende el conocimiento
sobre la genética molecular del gen FBN1 y el síndrome de Marfan al aportar nuevos
Polimorfismos de Nucleótidos Simples (SNPs) para robustecer las bases de datos sobre las
variantes genotípicas en que modifiquen las proteínas estructurantes del tejido conectivo y
de esta manera facilitar el diagnóstico de la enfermedad para mejorar la calidad de vida de
los individuos.
Con el avance de la biotecnología y la generación de nuevas herramientas
informáticas aplicadas a la biología molecular se pueden establecer nuevos estándares que
permitan el desarrollo de la investigación no sólo en el campo de la genética médica sino de
la biología en general.
17
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
3.1.1 Identificar las variantes genotípicas que influyen en la expresión de fenotipos
compatibles con el síndrome de Marfan en un grupo familiar.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.2.1 Extraer ADN en Sangre mediante el método Salting out disminuyendo los niveles de
contaminación en los individuos pertenecientes a un grupo familiar con características que
corresponden a fenotipos relacionados con el Síndrome de Marfan.
3.2.2 Realizar un análisis Bio-informático de la secuenciación de ADN de individuos con
caracteres fenotípicos afines con de Síndrome de Marfan pertenecientes al mismo grupo
familiar.
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4. MARCO REFERENCIAL
4.4 SINDROME DE MARFAN
El síndrome de Marfan es un trastorno hereditario autosómico dominante del tejido
conectivo cuyas manifestaciones clínicas más prominentes se producen en los sistemas
esquelético, ocular y cardiovascular (Kainulainen, 1990). Los individuos con este síndrome
presentan alteraciones faciales como: una forma facial (cara larga) y paladar ojival (paladar
profundo) y articulaciones hiperlaxas (De Coster, 2002). El defecto es causado por la
alteración del gen FBN1, ubicado en el brazo largo del cromosoma 15 (15q21.1); el FBN1
es el responsable de la síntesis de fibrilina-1, proteína que compone las microfibrillas del
tejido conectivo (Malambo & Mora, 2011). Sin embargo, este síndrome se encuentra
asociado mutaciones en otros genes como el FBN2 causante de aranodactilia contractural
(MFS; OMIM 154700). Se estima que el 90% de las mutaciones documentadas son de tipo
único y afectan a un individuo o familia. Se calcula que su incidencia es de 2 a 3 casos por
cada 10.000 individuos siendo un trastorno estructural frecuente que no afecta a una
población o género en específico (Muñoz et al., 2014).
4.4.1 Historia
El Síndrome de Marfan fue informado por primera vez alrededor de unos 100 años
atrás por el médico pediatra Antoine-Bernard de Marfan en 1896, quien se percató de la
asociación de dígitos largos y delgados y otras anormalidades esqueléticas en una paciente
de 5 años. Como muchos de los descubrimientos hoy día este trastorno monogénico lleva su
nombre (Judge & Dietz 2005). Sin embargo, fue descrito en detalle muchas décadas después;
a lo largo de la historia se fueron asociando signos y sintomatologías de este síndrome hasta
establecer unos criterios de diagnóstico por De Paepe y colaboradores en 1996 para que en
la actualidad se haga uso de las técnicas moleculares como ayuda diagnostica del Marfan
(OMIN). Debido a que las afecciones que conlleva tener esta enfermedad son multisistémicas
se han realizado gran variedad de investigaciones clínicas y moleculares entorno a esta en
busca de una mejor calidad de vida para estos individuos (Domínguez et al., 2000).
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4.4.2 Criterios diagnósticos para el síndrome de Marfan (MFS)
El síndrome de Marfan se diagnostica actualmente mediante criterios basados en una
evaluación de la afectación de diferentes sistemas de órganos, antecedentes familiares y los
datos moleculares de individuo (Radonic et al., 2011).
Los criterios de Ghent constan de criterios mayores y menores. Los criterios mayores
son las características o síntomas que son comunes en las personas con síndrome de Marfan,
siendo de gran importancia para el diagnóstico. cabe aclarar que se debe distinguir entre un
criterio mayor presente en un sistema y que el sistema esté involucrado sin presentar un rasgo
relevante de la enfermedad (De Paepe et al., 1996). Los criterios menores son características
o síntomas que están presentes en las personas con síndrome de Marfan, pero también están
presentes en las personas que no lo tienen. Según los criterios de Ghent para ser diagnosticado
con el síndrome el paciente debe tener presente algunas de las siguientes características:
Antecedentes familiares de síndrome de Marfan, tener uno de los criterios mayores y
uno de los criterios menores que afectan a diferentes sistemas del cuerpo, como el esqueleto
y los vasos sanguíneos. Si no tiene antecedentes familiares de síndrome de Marfan, tendrá
que tener dos criterios mayores y uno de los criterios menores que afecten a diferentes
sistemas del cuerpo (De Paepe et al., 1996).
Para diagnosticar el Síndrome de Marfan en un caso índice el paciente debe tener
criterios mayores en dos sistemas de órganos diferentes; y el compromiso de un tercer sistema
de órganos. Mientras que en un caso relativo debe tener: un criterio mayor en historia
familiar, un criterio mayor en un sistema de órganos, más el compromiso en un segundo
sistema de órganos (De Paepe et al., 1996).
Los siguientes ítems son los presentados en 1996 por De Paepe y colaboradores como
los criterios de Ghent para el diagnóstico de Síndrome de Marfan:
4.4.2.1 Rasgos esqueléticos:
Criterio mayor (presencia de al menos 4 de las siguientes manifestaciones):
• Pectus carinatum.
• Pectus excavatum que requiere cirugía.
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• Relación entre segmentos superior e inferior reducido o relación envergadura y
estatura elevado (>1,05).
• Signos del pulgar y muñeca positivos.
• Escoliosis >20° o espondilolistesis.
• Reducida extensión de los codos (<170°).
• Desplazamiento medial del maléolo medial causando pie plano.
• Protrusión de acetábulos de cualquier grado (comprobado en radiografías).
Criterio menor:
• Pectus excavatum de moderada severidad.
• Hiperlaxitud articular.
• Paladar ojival con aglomeración de dientes.
• Apariencia facial característica.
• Dolicocefalia.
Hipoplasia malar.
Enoftalmos.
• Retrognatia.
• Fisuras palpebrales bajas.
4.4.2.2 Afección ocular:
Criterio mayor: Ectopia lentis.
Criterio menor:
• Córnea plana.
• Aumento de la longitud axial del globo.
• Hipoplasia del iris o del músculo ciliar hipoplásico causando miosis disminuida.
4.4.2.3 Sistema Cardiovascular
Criterio mayor:
• Dilatación de la aorta ascendente, con o sin regurgitación aórtica y comprometa al
menos los senos de valsalva.
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• Disección de la aorta ascendente.
Criterio menor:
• Prolapso de la válvula mitral con o sin regurgitación de la válvula mitral.
• Dilatación de la arteria pulmonar, en ausencia de estenosis valvular o pulmonar
periférica por debajo de los 40 años la edad.
• Calcificación del anillo mitral por debajo de 40 años.
• Dilatación o disección de la aorta torácica descendente o abdominal por debajo de 50
años.
4.4.2.4 Sistema Pulmonar
Criterio menor:
• Neumotórax espontáneo.
• Bullas apicales.
4.4.2.5 Piel y tegumentos
Criterio menor:
• Estrías atróficas.
• Hernia recurrente o incisional.
4.4.2.6 Duramadre
Criterio mayor:
• Ectasia dural lumbosacra por Tc o rnm.
4.4.2.7 Historia familiar/genética
Criterio mayor
• Familiar de primer grado que cumpla independientemente el criterio diagnóstico.
• Presencia de la mutación en FBN1 conocida que causa el Síndrome de Marfan.
• Presencia del haplotipo alrededor del fbn1 heredado por la descendencia e
inequívocamente asociada con el Síndrome de Marfan diagnosticado en la familia.
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La presencia de dos criterios importantes en diferentes sistemas de órganos y la
participación de un tercer sistema son suficientes para establecer el diagnóstico. Los criterios
mayores: dilatación de la raíz aórtica o disección, ectopia lentis o luxación del cristalino, en
combinación de al menos cuatro de las ocho principales características del esqueleto, la
ectasia dural y una mutación en el gen FBN1 o un familiar de primer grado en cumplimiento
los mismos criterios para el diagnóstico pueden establecerse como un diagnóstico diferenc ia l
del Síndrome (Radonic et al., 2011).
Como resumen se puede presentar la siguiente tabla de criterios propuesta por Loja et al.
(2001):
Tabla 1 Resumen de los criterios de Ghent. Criterios de diagnóstico para cada sistema de órganos afectados
por el Síndrome de Marfan Tomado de Loja et al. (2001).
Criterios de GHENT
I. Esqueleto A.- Criterios mayores:
1.- Pectus carinatum.
2.- Pectus excavatum quirúrgico.
3.- S ignos de la muñeca y de Gowers.
4.- Segmento inferior > segmento superior o brazada/talla >1,05
5.- Escoliosis >20º o espondilolistesis.
6.- Extensión del codo <170º.
7.- Pie plano.
8.- Protrusión del acetábulo. B.- Criterios menores:
1.- Pectus excavatum moderado.
2.- Hipermovilidad articular.
3.- Paladar ojival con apelotonamiento dental.
4.- Dolicocefalia, hipoplasia malar, enoftalmos, retrognatia y abertura palpebral oblicua.
II. Cardiovascular
A.- Criterios mayores:
1.- Dilatación de la aorta ascendente con o sin
regurgitación aórtica o compromiso del seno de Valsalva.
2.- Disección de la aorta ascendente.
B.- Criterios menores:
1.- Prolapso valvular mitral con o sin
regurgitación mitral. 2.- Dilatación de la arteria pulmonar, en
ausencia de estenosis pulmonar valvular o
periférica en <40 años.
3.- Calcificación del anillo mitral en <40 años.
4.- Dilatación o disección de la aorta torácica descendente o de la aorta abdominal en <50 años.
III. Ojos A.- Criterio mayor:
1.- Luxación del cristalino
B.- Criterios menores:
1.- Córnea plana.
2.- Globo ocular elongado. 3.- Iris o músculos ciliares
hipoplásicos.
IV. Pulmones
A.- Criterio mayor:
1.- Ninguno B.- Criterios menores:
1.- Neumotórax espontáneo.
2.- Bulas apicales
V. S istema nervioso
A.- Criterio mayor: 1.- Ectasia dural lumbosacra
B.- Criterio menor:
1.- Ninguno
VI. Piel y faneras
A.- Criterio mayor: 1.- Ninguno
B.- Criterios menores:
1.- Estrias atróficas.
2.- Hernia o eventración recurrente.
VIII. Historia familiar/genética A.- Criterios mayores:
1.- Padre, hijo o sobrino que reúna
estos criterios independientemente.
2.- Mutación en FBN-1.
3.- Haplotipo heredado en FBN-1. B.- Criterio menor:
1.- Ninguno
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Existen caracteres subjetivos que dependen del examinador y no son patognomónicos
del síndrome de Marfan siendo así se realizó una revisión de los criterios de diagnóstico de
Ghent se le otorgó más relevancia peso a dos características cardiacas, dilatación de la aorta
y ectopia lentis (EL), que se consideró suficiente para hacer el diagnóstico (Loeys et al.,
2010). De igual modo se les asignó un papel importante en el diagnostico a las mutaciones
en el FBN1, así como a las mutaciones con genes relacionados como el del factor de
crecimiento transformante beta (Loeys et al., 2010).
De acuerdo con la revisión de los criterios de Marfan en 2010, Radonic et al. (2011)
resalta las siguientes características como criterios de diagnóstico :
“El diagnóstico de MFS en un individuo afectado puede establecerse en la presencia de:
a. Dilatación de la raíz aórtica (Z-score ≥ 2) y EL.
b. Dilatación de la raíz aórtica (Z ≥ 2) y la mutación FBN1. c. Dilatación de la raíz aórtica (Z ≥ 2) y sistémico anotar ≥7 puntos. d. EL y FBN1 mutación conocida que se asocia con dilatación aórtica en
miembros de la familia. “pág. 347
Sin embargo, es importante realizar pruebas diagnósticas adicionales en caso de
hallazgos sospechosos de trastornos relacionados, para diferenciar estas enfermedades como
y así mismo establecer los riesgos de salud y hacer el seguimiento médico adecuado (Loeys
et al., 2006).
4.4.3 Tratamiento y pronostico
La expectativa de vida de un individuo con Síndrome de Marfan varía dependiendo
de la severidad del mismo pues dependiendo de la mutación que se tenga se van a ver
afectados los sistemas en mayor o menor gravedad. Los individuos con cardiopatías severas
tienen una expectativa de vida menor a la de aquellos que presentan únicamente afecciones
musculoesqueléticas u oculares (Gray et al., 1998). Pues en su mayoría las muertes son dadas
por muerte cardiovascular; ya sea por disección aórtica, insuficiencia cardíaca congestiva o
enfermedad de la válvula cardíaca (Gatzoulis et al., 2007). Sin embargo, al avanzar la
investigación en esta enfermedad se han reportado datos de supervivencia acumulativa media
entre los 53,4 años para los hombres y 71,8 años para las mujeres en el año 1998 (Gray et al.,
1998), que en comparación con el año de 1972 era de 41 y 49 años, respectivamente
24
(Murdoch et al. 1972). Como es observado la mejora en la tasa de supervivencia y la
esperanza media de vida de la población con Marfan en general es cada vez mayor dados los
avances producidos en el área de diagnóstico médico, la terapia médica y el avance en
técnicas quirúrgicas y la realización de las mismas como las cirugías cardiovasculares por
dilatación aortica de 5,15 mm o regurgitación valvular progresiva (Silveman et al., 1995).
Sin embargo, no hay estudios realizados minuciosamente pues la inclusión de sujetos con
síndrome de Marfan severo con rasgos de menor severidad en la misma estadística contribuye
al sesgo de la información (Silveman et al., 1995). Pero no por ello se desconoce el avance
científico y por ende la mejora en la calidad de vida de los individuos con síndrome de
Marfan.
Actualmente se trata quirúrgicamente la dilatación aortica grave con sustitución que
dependiendo del grado puede ser sustitución del anillo aórtico o sustitución de la mayor parte
de la válvula; para casos leves se recomienda realizar evaluaciones regulares
(ecocardiogramas) y/o tratamiento con betabloqueantes, en algunos casos es dejada a
consideración del paciente la cirugía electiva (Gatzoulis et al., 2007). También se recomienda
profilaxis de endocarditis cuando hay prolapso e insuficiencia de la válvula mitral tras la
sustitución valvular aórtica y después de la sustitución del anillo aórtico (por 6 meses); como
recomendaciones se deben evitar deportes de contacto y actividad física isométrica para
reducir la tensión en la aorta. En cuanto al embarazo existe el riesgo de la progresión de los
trastornos cardiovasculares sumado a la probabilidad que el bebé podrá de heredar este
desorden es del 50% (Gatzoulis et al., 2007).
4.4.4 Herencia
El síndrome de Marfan es clasificado como un trastorno monogénico mendeliano, es
decir que, existe la alteración de un gen; dicha alteración puede condicionar la producción de
la proteína de forma anormal o en la reducción de la cantidad (Kumar et al., 2010).
4.5 FIBRILINA Y EL GEN FBN1
La fibrilina es una glucoproteína extracelular que compone las microfibrillas, estas
fibrillas aportan un andamiaje sobre el cual se deposita la tropoelastina para formar las fibras
elásticas. De esta proteína existen dos formas homologas, la fibrilina 1 y la fibrilina 2
codificadas por los genes FBN1 (cromosoma 15q21.1) y FBN2 (cromosoma 2q23.31)
25
respectivamente (Kumar & Aster, 2010). Como se dijo anteriormente las mutaciones en el
gen FBN1 son las responsables del desarrollo del síndrome de Marfan debido a cambios en
las propiedades mecánicas de la matriz extracelular dadas por mutaciones en sentido erróneo,
de las cuales se han reportado alrededor de 600 diferentes; la anormalidad en las
microfribrillas puede dar lugar a la activación del factor de crecimiento transformante β (TGF
– β) cuyo exceso tiene efectos sobre el musculo liso vascular resultando en cardiopatías
congénitas (Kumar et al., 2010).
El gen FBN1 es responsable de la producción correcta de la proteína esencial para
una fibrogénesis elástica normal; tiene la particularidad de ser rico en secuencias de cisteína
siendo estas homólogas al factor de crecimiento epidérmico (EGF); en cuanto a su tama ño
se puede decir que este gen consta de 65 exones de los cuales 47 exones codifican un dominio
completo de EGF (Barriales-Villa et al. 2011).
4.6 TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN
La secuenciación del ADN consiste en determinar el orden de las bases de A, C, G y
T en un fragmento de ADN, el primer método utilizado para ello y que aún se maneja es la
secuenciación Sanger la cual permite obtener la secuencia de un fragmento determinado de
ADN, un gen o parte de un exoma. Sin embargo, tras la necesidad de secuenciar múltip les
secuencias paralelamente surgió la secuenciación masiva NGS siendo está más rápida y
económica que la de Sanger. Cuando se tienen ensambladas estas secuencias a un genoma de
referencia, se puede secuenciar, en lugar de un gen, múltiples genes o incluso un genoma
completo y aunque contiene más errores que la de Sanger la habilidad de repetición permite
una calidad de la secuencia plena (Jiménez et al. 2012)
En la actualidad existen diferentes plataformas de secuenciación masiva que permiten
obtener datos de mayor cantidad y calidad, bajo costo y menor tiempo (Metzker 2010). De
estas nuevas plataformas se destacan tres: Illumina, 454 (Roche) y SOLiD (Applied
Biosystems) (ver Imagen 1); no obstante, existen otras como: PacBio (Pacific BioSciences),
el Personal Genome Machine y el Ion Proton (Ion Torrent), así como, de forma muy reciente,
el Oxford Nanopore (Furió, 2012).
26
Imagen 1 principales plataformas de secuenciación masiva (Metzker 2010) en Furió (2012)
4.6.1 Secuenciación masiva de nueva generación (NGS)
Es una técnica de alta especificidad y sensibilidad para la detección de mutaciones
puntuales como pequeñas delaciones e inserciones lo que la hace una herramienta eficaz para
el diagnóstico de enfermedades genéticas (Martínez-Barrios et al. 2014); este proceso se
realiza mediante plataformas automáticas para este caso se hará uso de la plataforma Illumina
utilizando el kit “Truseq Rapid Exome Library Prep Kit” el cual proporcionará un método
sencillo, eficaz para realizar llamadas de variantes exónicas de alta confianza entregando las
bibliotecas en 1 día sin necesidad de equipo adicional (Illumina, 2017).
27
4.7 ESTUDIOS RELACIONADOS
EXOME SEQUENCING IDENTIFIED NEW MUTATIONS IN A MARFAN
SYNDROME FAMILY (Li et al. 2014)
Este estudio identificó dos nuevas variantes en el grupo familiar ya diagnosticado, en
el cual fue alta la heredabilidad de la enfermedad, se corroboró el diagnostico mediante los
criterios de Ghent y se procedió a realizar una secuenciación al azar de los genomas de los
individuos mediante la plataforma Illumina HiSeq 2000 (Illumina, CA, EE.UU.). los
resultados fueron analizados mediante herramientas informáticas donde ser realizoó un
llamado de variantes para seleccionar aquellas que estuvieran relacionadas con el síndrome,
estas fueron validadas mediante PCR y secuenciación Sanger. De esta investigación se
concluyó: “el análisis de secuenciación del exoma nos ofrece una nueva visión de los eventos
moleculares que regulan el mecanismo molecular del síndrome de Marfan. Las variantes
que hemos identificado aquí pueden proporcionar nuevas dianas terapéuticas para las
posteriores investigaciones.”
28
5. METODOLOGÍA
Este trabajo se centra en la descripción de las variantes del gen FBN1 relacionadas
con el Síndrome de Marfan (Cazau, 2006) la secuenciación de ADN permite ver el orden en
que se encuentran cada uno de los nucleótidos lo cual es útil para observar los cambios
específicos en una cadena; por lo tanto, se secuenció el ADN de los 5 individuos de un grupo
familiar con características fenotípicas sugerentes de síndrome de Marfan que se
evidenciaron al construir una Matriz siguiendo la nosología de Ghent.
El ADN fue obtenido al seguir dos procedimientos el primero fue la venopunción
para la extracción de sangre de cada uno de los individuos; y el segundo, la extracción de
ADN mediante el proceso de Salting Out que se describe en párrafos posteriores. Las
muestras obtenidas fueron secuenciadas en la plataforma Illumina 1.9 obteniendo una
biblioteca de datos que fueron tratados con herramientas bioinformáticas para determinar la
relación de estás secuencias con la enfermedad.
5.1 MATRIZ DE CARACTERES RELACIONADOS CON SINDROME MARFAN
Se desarrolló una matriz para evidenciar los criterios positivos que corresponden a
caracteres del síndrome de Marfan o MASS, basándose en la nosología de Ghent, los criterios
enunciados por Domínguez (2000) y la revisión de Radonic (2011). La tabla construida
muestra dos columnas principales: la primera corresponde al criterio evaluado y las segunda
al individuo, marcando con rojo los criterios positivos de los individuos tomando como base
la historia clínica del individuo 01.A continuación se muestra la Matriz construida para tal
propósito.
29
Tabla 2. Modelo de la matriz de características del síndrome de Marfan.
5.2 OBTENCIÓN DE ADN
Para obtener las muestras de ADN de la familia estudio fue necesario realizar varios
procedimientos con el consentimiento de cada uno de los individuos.
5.2.1 Venopunción
La venopunción o flebotomía es un proceso en el que se realiza una punción en una
vena usando una aguja para extraer sangre o inyectar algo en la vía parenteral; para el caso
de este estudio se realizó extracción de sangre, pues de este tejido se realizó la extracción de
ADN. La sangre fue colectada en tubos con EDTA siendo este procedimiento el paso inic ia l
para realizar la extracción como se muestra en la Figura 1 (Ventura et al. 2010).
5.2.2 Extracción de ADN a secuenciar
Para este procedimiento se utilizó el Kit de extracción del grupo BIOMOL. Como
primer paso se almacenaron las muestras de sangre en tubos colectores con anticoagulante
EDTA de los cuales se tomarán 300 µl de las muestras para realizar la extracción. Luego
como indica la Figura 1 se llevó a cabo la lisis celular con 900 µl de LISIS 1, se agitó por
inversión 10 veces; posteriormente se centrifugó por 12 minutos 12000 rmp durante 10
minutos y luego se descartó el sobrenadante; se limpió el pellet con la micropipeta y se
agregaron de 300 µl a 900 µl de LISIS 1 para obtener el mega-pellet, se repitió la inversión
y el centrifugado. Luego, se descartó nuevamente el sobrenadante. Seguido a esto se calentó
la LISIS 2 entre los 40 – 65 °C cuando esta se encontraba precipitada hasta que tomara un
color transparente, al estar lista se agregaron 300 µl de LISIS 2 al tubo ependorff con el
pellet; se agitó en el vórtex durante 2 minutos o más hasta disolver el pellet; se agregaron
300 µl de LISIS 3 al tubo y se agitó durante 2 minutos en el vórtex. La mezcla se llevó a la
INDIVIDUO
CRITERIO 01 02 03 04 05
Hiperlaxitud de las articulaciones
Pie plano
Aranodactilia
Escoliosis
Estrías
Anomalías cardiacas
Mutación en el FBN1
30
centrifuga durante 10 minutos a 12000 rpm esta vez se recolectó el sobrenadante en un tubo
colector de 1.5 ml; consecutivamente se agregaron 300 µl de isopropanol en grado molecular
(99.9%) frio y se agito por inversión 10 veces dejando incubar a temperatura ambiente por 2
minutos (MO BIO, 2016); seguido a esto se centrifugó por 10 minutos a 12000 rpm. Después
el sobrenadante fue descartado en un papel absorbente, para dejar el pellet intacto se dejó
secar durante 10 minutos; cumplido el tiempo se añadieron 300 µl de etanol 70% se agito por
inversión 5 veces para lavar el pellet, se llevó a la centrifuga a 12000 rpm como sugiere Riera
et al. 2010 para mejorar la pureza de la extracción; Después, se descartó el residuo, se dejó
secar el tubo por 20 minutos; Al cumplir este tiempo se agregaron de 15-20 µl de la solución
6 para re-suspender el ADN. Finalmente se almacenaron las muestras a -20 °C.
Figura 1 Extracción de ADN Modificada de (Alejos et al. 2014)
31
5.2.3 Cuantificación
Una vez re-suspendido el pellet se cuantificó, es decir, se determinó el rendimiento
mediante una espectrofotometría usando el Nanodrop 2000c thermo scientific; debido a que
el ADN absorbe la luz UV que está en un rango de 260 nm – 280 nm el equipo pudo indicar
si el ADN se encuentró puro o contaminado y la cantidad en ng/µl que contenía el mismo
(Leninger 1975).
5.2.4 Verificación de ADN
Las muestras 6,21,19,8 y 33 fueron evaluadas en gel de agarosa al 2%, usando como
tampón una solución TBE 1X (Tris base, ácido bórico y EDTA), teñidas con 1.0 μl GEL
RED. Para la separación se utilizó una fuente de poder a 110 V y 70 mA durante un periodo
de tiempo que osciló entre los 30 a 40 minutos, este gel fue fotografiado bajo luz ultravio leta
con el equipo mini sub cell GT BIORAD y con la fuente de poder power pac basic BIORAD.
5.3 SECUENCIACIÓN MASIVA DE NUEVA GENERACIÓN (NGS)
Se utilizó la plataforma automática Illumina 1.9 mediante el kit “Truseq Rapid Exome
Library Prep Kit” siendo el método más sencillo y eficaz para realizar llamadas de variantes
exónicas de alta confianza obteniendo las bibliotecas en corto tiempo sin necesidad de equipo
adicional (Illumina).
5.4 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
Se usaron varias herramientas bioinformáticas para analizar los datos que otorga el
secuenciador. En primer lugar, se hizo un pretratamiento con el uso de FastQC para
comprobar la calidad de las lecturas crudas, es decir, recién salidas del secuenciador y Un
trimming con Trimomantic para cortar las bases de baja calidad; en seguida se realizó un
alineamiento contra genoma de referencia (Mapeo) mediante la herramienta Bowtie 2 de
TopHat; posteriormente, se usó el paquete de SAMtools para seleccionar las variantes
mpileup y GIB para el llamado de SNPs de donde se obtuvieron las secuencias definit ivas
que fueron analizadas por la herramienta BLASTn para identificar los SNPs reconocidos en
las bases de datos OMIM , finalmente se realizó un BLASTx para observar la relación de
estos SNPs con la enfermedad al cambiar esta secuencia de nucleótidos por la codificac ión
proteica en NCBI.
32
5.4.1 Pretratamiento
Antes de analizar los datos se debe asegurar que estos son correctos y si no lo son
eliminar los datos defectuosos para ello se hizo uso del programa FastQc restringiendo el
control de calidad con un largo mínimo de 55 pb y un phred score de 33 lo que se refiere a
una aceptación de un 0,000631% de error.
Este programa es una herramienta libre que puede obtenerse del sitio web de
Babraham Bioinformatics (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/), en esta
página se descarga el archivo rar que se utilizó con la aplicación Java Versión 8 Update 131
con JRE para Windows 10 disponible en https://www.java.com, se descomprimió el archivo,
se corrió el programa (ver imagen 2) y se cargó el archivo de la secuencia (ver imagen 3)
desplegando el menú file, open, y buscando el archivo en la carpeta correspondiente
seleccionando la opción abrir.
Para finalizar el pretratamiento se hizo un trimming para eliminar los nucleótidos de
baja calidad de la secuencia cruda, estos corresponderán a los adaptadores de la secuencia
cruda, este proceso se realizó con el sistema operativo Linux ejecutando la siguiente línea de
comandos:
Paired End Mode:
java -jar <path to trimmomatic.jar> PE [-threads <threads] [-phred33 | -phred64] [-
trimlog <logFile>] <input 1> <input 2> <paired output 1> <unpaired output 1> <paired
output 2> <unpaired output 2> <step 1> ...
Terminado el proceso anterior se volvió a correr FastQc para evaluar la secuencia recortada
que fue la utilizada para el mapeo por sus rangos de calidad.
33
Imagen 2 Abrir el Programa FastQc.
Imagen 3 Abrir archivo de lectura.
34
5.4.2 Mapeo
Se realizó un mapeo contra la nueva referencia de del Genoma Humano versión 38
cromosoma 15 utilizando la herramienta Bowtie2 es una herramienta rápida y eficiente para
alinear lecturas secuenciales a secuencias de referencia largas como son las de los mamíferos
(SOURCEFORGE.NET, 2017). utilizando un phred score de 30 para el mapeo. Los datos
del mapeo se observan utilizando IG, previamente se transformaron las librerías mapeadas al
formato sorted.bam.
5.4.3 Llamado de SNPs
Una vez que cada genotipo fue mapeado con el genoma de referencia creado de HG
38 cr15, se utilizaron diferentes herramientas de SAMTools, para identificar las variantes.
Mediante la herramienta –mpileup se realizó el llamado de SNPs. El primer filtro realizado
con vcfutils.pl se basó a los datos de profundidad de mapeo (-d5). Posteriormente mediante
el software 18 vcftool, se realizó un segundo filtro eliminando los InDels (--indels), y un
tercer filtro, de aquellas variantes que no están presentes en el 1% de cada población (MAF
>0,01) dejando solo aquellos SNPs informativos.
5.4.4 BLAST
Para realizar la comparación de las secuencias definitivas contra la base de datos se
utilizó BLAST, una herramienta de búsqueda de alineación local; es decir que, encuentra
regiones de similitud entre secuencias biológica al comparar las secuencias de nucleótidos o
proteínas con bases de datos de secuencias para deducir las relaciones funcionales y
evolutivas entre las secuencias, así como ayudar a identificar a los miembros de las familias
de genes (The National Library of Medicine, 2017).
En primer lugar, se hizo una comparación entre nucleótidos con BLASTn para ver la
posición de los SPNs de las secuencias definitivas se ingresando a la página
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, seleccionando la opción de nucleótidos e ingresando
la secuencia en formato fasta, siendo el genoma humano la referencia, finalmente se hizo
clic en el botón BLAST para correr la herramienta (ver Imagen 4), este proceso se repite
seleccionando la herramienta BLASTx para ver la relación causal de las proteínas generadas
por los nucleótidos.
35
Imagen 4. Comparar secuencias en BLAST.
36
6. RESULTADOS Y ANÁLISIS
6.1 MATRIZ DE CARACTERES SUGERENTES DE SINDROME DE MARFAN
La tabla Matriz de Caracteres sugerentes de Síndrome de Marfan se obtuvo al evaluar
cada uno de los criterios enunciados en esta, los cuales son mostrados a continuación con
evidencia fotográfica para aquellos que pertenecen a rasgos físicos.
Fotografía 1. Signo de Walker-Murdoch o signo de la muñeca positivo para Individuo 01, característica
esquelética del síndrome de Marfan.
37
Fotografía 2. Signo de Gowers positivo (con protrusión del pulgar en oposición forzada, más allá del borde
cubital con el puño cerrado) positivo para aranodact ilia en Individuo 01.
Fotografía 3. Signo de Gowers positivo (con protrusión del pulgar en oposición forzada, más allá del borde
cubital con el puño cerrado) positivo para aranodactilia en Individuo 02.
38
Fotografía 4. Signo de Walker-Murdoch o signo de la muñeca positivo para Individuo 02,
característica esquelética del síndrome de Marfan.
SIGNOS DE SINDROME DE MARFAN EN PIEL Y TEGUMENTOS
.
Fotografía 5. Estrías atróficas criterio menor para síndrome de Marfan
39
Fotografía 6.. Individuo 02. Estrías atróficas criterio menor para síndrome de Marfan
Fotografía 7. Individuo 04. Estrías atróficas
40
Fotografía 8. Hiperextensión de rodillas se observa que la curvatura al extender la rodilla sobresale más de
lo normal; también es evidente el pie plano, la contextura delgada y fina de las extremidades inferiores.
Fotografía 9. Individuo 01. Flexibilidad de la muñeca. Aposición pasiva de los pulgares a la cara flexora del
antebrazo
41
Fotografía 10. Individuo 02. Flexibilidad de la muñeca. Aposición pasiva de los pulgares a la cara flexora del
antebrazo.
Tabla 3. Alteraciones musculoesqueléticas presentes en el grupo familiar de estudio.
La Tabla 3. muestra los criterios positivos para cada uno de los individuos, tomando
como referencia al individuo 01 que presenta una mutación en el gen FBN1 según su historia
clínica, pero cuya PCR no fue suficiente para el diagnóstico del Síndrome (ver Anexo A); 02
Hermano;03 Padre; 04 Madre y 05 Abuela Materna. en la columna CRITERIO se exponen
algunas características relacionadas con el Marfan tomadas de Loja (2001), utilizados en el
diagnóstico de Ghent y señalados en la revisión de los criterios de Marfan de Radonic et al.
(2011).
INDIVIDUO
CRITERIO 01 02 03 04 05
Hiperlaxitud de las articulaciones
Pie plano
Aranodactilia
Escoliosis
Estrías
Estatura vs Envergadura <1cm
Anomalías Cardiacas
Mutación en FBN1
42
La aranodactilia como criterio positivo se determinó utilizando el signo de Gowers
que es la protrusión del pulgar en oposición forzada, más allá del borde cubital con el puño
cerrado y el signo Walker-Murdoch que corresponde a la sobre-posición de los dedos pulgar
y meñique en más de 1 cm, en prensión proximal de la muñeca proximal a nivel de la apófisis
estiloides radial con la otra mano (ver fotografía 1 y 4) (Aviña Fierro & Hernández Aviña,
2011).
Estrías atróficas: son aquellas marcas o estrías en la piel espontáneas sin causa
definida (Aviña Fierro & Hernández Aviña, 2011). Este tipo de marcas son hereditarias y no
corresponden a cambios bruscos en la piel como los causados por el aumento de peso o el
embarazo como se evidencia en las fotografías 5-7, resaltando la fotografía 6 pues allí es
observable la espalda de un hombre que muestra dichas marcas.
La envergadura o brazada corresponde a la relación entre la estatura y la longitud de
los brazos abiertos que teóricamente en adultos debe ser la equivalente; sin embargo, en todos
los individuos se presenta la longitud mayor a la estatura respectiva (ver Tabla 5) (Aviña
Fierro & Hernández Aviña, 2011).
Tabla 4. Relación de la brazada con respecto a la estatura de cada individuo.
Individuo Estatura (cm) Envergadura (cm) Estatura/Envergadura
01 162 169 7 cm
02 179 180,5 1,5 cm
03 166,5 173 6,5 cm
04 156 164 8 cm
05* No aplica No aplica No aplica
* No fue posible hacer la medición de estos criterios debido a que el paciente falleció durante el desarrollo de esta metodología.
La hiperlaxitud de las articulaciones es un criterio positivo cuando presentan 4 signos
menores siendo el primero obtener una Puntuación de Beigthon (ver Tabla 4) de 1-3 (Bulbena
et al. 2008). Esta puntuación corresponde a un punto por cada una de las siguientes
características (ver Fotografías 8-10): la aposición pasiva de los pulgares a la cara flexora del
antebrazo, la hiperextensión de las rodillas que sobrepase los 10º, la flexión del tronco hacia
adelante con las rodillas en extensión de modo que las palmas de las manos se apoyen sobre
43
el suelo; el segundo la dislocación en más de una articulación o en una articulación en más
de una ocasión; el tercero hábito marfanoide (alto, delgado, aracnodactilia) y el ultimo estrías
o hiperextensibilidad de la piel (Grahame, 1998) de los cuales la F3 presenta varios de puntos
incluyendo la dislocación de alguna articulación en más de una ocasión y la la flexión del
tronco hacia adelante con las rodillas en extensión de modo que las palmas de las manos se
apoyen sobre el suelo.
Tabla 5. Criterios de Beighton (1973). Tomada de Institut Ferran de Reumatología (2013)
Criterios de Beighton
Dorsiflexión pasiva del 5 o dedo que sobrepase los 90º. (un punto por cada mano)
Aposición pasiva de los pulgares a la cara flexora del antebrazo. (un punto por cada lado)
Hiperextensión activa de los codos que sobrepase los 10º. (un punto por cada lado)
Hiperextensión de las rodillas que sobrepase los 10º. (un punto por cada lado)
Flexión del tronco hacia adelante, con las rodillas en extensión,
de modo que las palmas de las manos se apoyen sobre el suelo.
(un punto)
6.2 EXTRACCIÓN DE ADN
Las extracciones de ADN en sangre se realizaron con el protocolo para el kit de
extracción del grupo de investigación BIOMOL, de la Universidad Distrital Francisco José
de Caldas similar al de la casa comercial MO BIO variando las cantidades y el uso de la Lisis,
así como el tiempo de suspensión en isopropanol y de secado develando que al realizar un
nuevo lavado con 900 μL de la LISIS 1 se obtiene un mega pellet; sin embargo dicho mega
pellet no cumplió con los niveles de contaminación para obtener muestras de calidad. Las
extracciones fueron evaluadas y cuantificadas por el Nanodrop 2000 c. arrojando los
siguientes resultados de lectura, cantidad de ADN extraído (ver Tabla 6) y calidad (ver
Gráficas 1 -3).
6.2.1 Cuantificación de las muestras
En la siguiente tabla se muestran las concentraciones obtenidas por cada muestra y su
calidad; es decir, si se encontraron contaminadas. Las muestras señaladas con color azul
fueron las escogidas para realizar la secuenciación de cada individuo; la flecha negra indica
la repetición del uso de la LISIS 1 una vez más de lo descrito en la metodología y la flecha
roja la repetición del uso de la LISIS 1 dos veces más.
44
Tabla 6. Cuantificación de ADN (concentración de ADN por muestra ng/μL).
Concentración de ADN por Muestra
Número de la Muestra Número Asignado en el estudio Concentración de ADN ng/μL
1 01 Contaminado
2 01 Contaminado
3 01 1485.6
4 01 1605.2
5 01 748.8
6 01 11508,3
7 01 Contaminada
8 02 757.9
9 02 781.2
10 02 788.5
11 01 121.4 contaminado
12 01 31.0
13 02 344.4
14 01 547.1
15 01 60.9
16 01 8.3
17 01 8.1
18 03 13.2
→19 03 26.7
→20 04 51.1
→21 04 28.1
→22 03 30.5
→23 03 11.3
→24 02 68.9
→25 02 131.6
→26 01 35.5
→27 01 23.2
45
→28 05 Isopropanol
→29 01 Contaminado
→30 04 772.6
→31 03 456.8
→32 02 1.7 contaminado
→33 05 23.8 contaminado
Se observaron diferencias entre las muestras con variaciones en la aplicación de la
LISIS 1. En la Grafica 1 y 2 se observan las lecturas de los individuos 01 y 02
respectivamente, a estas muestras se les aplico 900 μL de LISIS 1 y se les llevo a centrifugar
por 10 minutos a 12000 rpm, posteriormente se descartó el sobrenadante y se les aplicó 300
μL de esta Lisis nuevamente. Diferente de las muestras 32 y 33 a las que se les aplicó 900
μL de LISIS 1 tres veces, centrifugando y descartando el sobrenadante entre cada aplicación;
arrojando lecturas de concentración de ADN y revelando una contaminación del ADN al
mostrar una curva imperfecta e irregular (ver Gráfica 3).
Gráfica 1. Extracción de DNA. Muestra 3 utilizando el kit del grupo BIOMOL, en la parte superior se observa
el espectro de lectura mostrando una curva de absorbancia óptima. En la parte superior derecha se encuentran
los datos de lectura del Nanodrop 2000c. la lectura de esta muestra es de 1485.6 ng/ul.
46
Gráfica 2. Extracción de DNA. Muestra 9 utilizando el kit del grupo BIOMOL, en la parte superior se observa
el espectro de lectura mostrando una curva de absorbancia óptima. En la parte superior derecha se encuentran
los datos de lectura del Nanodrop 2000c. la lectura de esta muestra es de 781.2 ng/ul.
Gráfica 3. Extracción de DNA. Muestra 33 utilizando el kit del grupo BIOMOL, se observa el espectro de
lectura mostrando una curva de absorbancia irregular indicando contaminación de la muestra. En la parte
superior derecha se encuentran los datos de lectura del Nanodrop 2000c. La lectura de esta muestra es de 23.8
ng/ul.
47
La imagen 5 es el resultado del gel de agarosa al 2% que muestra la iluminación del
gel red positivo para la verificación de la presencia de ADN en las muestras, con los carriles
A y D muy brillantes debido a la alta concentración de ADN en estas muestras (11508,3 ng/ul
y 757.9 ng/ul respectivamente); así mismo, los otros pozos se iluminan tenues, pero
corroboran la presencia de ADN y son consistentes con la Tabla 6.
Imagen 5. Verificación de ADN total en gel de agarosa al 2%.los pozos o carriles están numerados por las
letras A-E cada una correspondiendo a una muestra: A, 6: B,21; C,19; D,8 y E,33.
6.3 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
Se obtuvieron 75000 secuencias en la plataforma Illumina 1.9 las cuales fueron
tratadas para obtener unas secuencias conceso definitivas, donde se evaluó la calidad de la
secuencia en FastQc se realizó un mapeo en Bowtie 2 contra la referencia del genoma
humano en su versión 38 teniendo en cuenta el cromosoma 15 que es donde se encuentra la
anomalía correspondiente al Síndrome de Marfan obteniendo las secuencias definitivas (ver
Imagen 8), luego se obtuvieron los SNPs Polimorfismo de Nucleótido Simple usando el
paquete de herramientas de SamTools.
A
B
48
6.3.1 Calidad de la secuencia
Las secuencias obtenidas presentan un largo entre los 35 y 151 pares de bases con un
porcentaje global de 35 bases como se observa en la Imagen 6; la calidad de cada secuencia
se observa en la Gráfica 5 cuya media tiene un puntaje de calidad mayor a 27 mostrándose
de mejor calidad de manera exponencial.
En cuanto a la calidad del llamado de bases es bastante alta para cada lectura de base,
ubicándose la mayoría en la franja superior color verde (ver Gráfica 4) siendo esta la franja
de alta calidad y la franja roja representa mala calidad, siendo evidente que la mayoría de
llamados de base son de alta calidad. En el mismo lugar, se encuentra la línea media de
calidad soportando la calidad óptima de cada base. Esta evaluación también es mostrada por
la gráfica de calidad de secuencia Tile (ver Gráfica 6) que consiste en baldosas o pixeles de
colores cálidos a fríos para mostrar la calidad de las cualidades para cada base, entre más fría
sea la coloración de cada pixel mayor será la calidad; por lo tanto, una Gráfica totalmente
azul es la de mejor calidad como la que se obtuvo en los resultados (FastQc, 2017). En el
llamado de las bases también se evaluó la proporción de cada base para el archivo mostrando
una diferencia evidente en la relación entre Adeninas y Timinas y/o Guaninas y Citocinas
(ver Gráfica 7) de lo que se puede interpretar.
Para indicar la contaminación de alguna biblioteca se midió el contenido de GC a lo
largo de toda la longitud de la secuencia siendo visible la distribución irregular de GC en las
secuencias obtenidas indicadas con color rojo y comparadas con una distribución normal
modelada señalada con azul en la Gráfica 8. También fue posible hacer un monitoreo a las
sustituciones de llamadas N las cuales resultaron se mínimas con un valor cercano a 0 como
muestra la Gráfica 9; esto quiere decir que no fue necesario reemplazar ninguna base por una
base N; ya que, el llamado y la calidad de las llamadas de base fue óptimo.
En la Grafica 10 se muestra la proporción del largo de todas las secuencias
manifestando en la curva que la longitud no es uniforme en las secuencias; Sin embargo,
obtener este resultado no representa contaminación de la muestra como señala el manual de
FastQc. De las secuencias totales (75000) la imagen 7 revela la existencia 287 secuencias
que representan más del 0.1% que para este caso representan que las secuencias adaptador
49
son muy similares entre sí por lo que puede obtener una advertencia al ejecutar el programa
mostrándose como duplicados de las secuencias (FastQc, 2017).
Se evaluó si la biblioteca contiene una cantidad significativa de adaptadores, es decir
las uniones entre cada uno de los Kmers que son sub-secuencias o definido de otro modo el
conjunto de posibles fragmentos de una longitud dada (De Santis, y otros, 2011) para decidir
si estos necesitaban ser modificados. La Gráfica 11 muestra el porcentaje acumulativo de
proporción de adaptadores en cada posición y las secuencias mostrando que la proporción no
es elevada, es casi nula; por lo que, se puede determinar que no es necesario hacer cambios
en los adaptadores.
Imagen 6. Datos básicos de la secuencia en el programa FastQC
50
Gráfica 4 Calidad de las Bases. La caja amarilla representa el rango intercuartílico (25-75%), la línea azul es
la calidad media del llamado y el color de las franjas representan la calidad del llamado de la base. Para este
caso la gráfica muestra alta calidad en el llamado de las bases.
Gráfica 5. Índice de calidad por secuencia, en el eje X se muestra el puntaje de calidad de cada secuencia y el
eje Y el número de lecturas de las secuencias.
51
Gráfica 6.Calidad de secuencia por Tile. Todas las baldosas se observan de tono azul para cada calidad de
base
Gráfica 7. Contenido de bases por secuencia. Indica el porcentaje de cada base T (rojo), C (azul), A (verde) y
G (negro). Aumento del porcentaje de Adenina y Guanina.
52
Gráfica 8 Contenido de GC por secuencia. La distribución de GC (X) por Lectura (Y) se muestra mayor a la
distribución teórica.
Gráfica 9 Contenido de Bases N casi nulo para las llamadas de bases.
53
Gráfica 10 Distribución de la Longitud de las Secuencias. Las secuencias obtenidas en la plataforma son de
diversas longitudes como se observa en la parte derecha de la gráfica.
Imagen 7. 287 secuencias sobre-representadas de 75000 totales.
54
Gráfica 111.Contenido de adaptadores
Después del recorte de adaptadores de la secuencia cruda se utilizó Bowtie2 contra la
nueva referencia del genoma humano versión 38 cromosoma 15, el cual mostró una cobertura
de 0,28 y mapeo 762049 lecturas con una calidad de 2,5 (ver Tabla 7) valor que indica alta
calidad pues el valor considerado como superior parte de 1,7 (Bowtie2, 2017). Los datos del
mapeo se observan en IGV arrojando las secuencias definitivas o query (ver ANEXO B) con
el llamado de SNPs.
Tabla 7. Mapeo de la secuencia tratada. Resultados arrojados por Bowtie2.
MAPEO BOWTIE2 READ ALIGNMENT
ENSAMBLE CON REFERENCIA
PROMEDIO DE READS A MAPEAR
NÚMERO DE READS MAPEADOS
PORCENTAJE READS MAPEADOS
DUPLICACIÓN
COBERTURA
CALIDAD DE MAPEO
GH 38 Chr15
1.172.240
762.049
53%
35,29
0,28
2,5
55
6.4 VARIANTES GENOTÍPICAS
A continuación, se presentan las variantes genotípicas obtenidas al realizar el
BLASTn; es decir, la comparación de las secuencias query con la referencia del GH Chr 15
(ver ANEXO C).
Tabla 8 Variantes genotípicas obtenidas con la herramienta BLASTn de NCBI
INDIVIDUO
POSICIÓN DE
REFERENCIA EN
CRH15
VARIACIÓN
(REF.VS OBS.) TIPO DE SNP
ANOTACIÓN EN
OMIN
01 48838744 G/A Transición No
02 48838744 G/A Transición No
02 48838662 T/A Transversión No
03 48838744 G/A Transición No
03 48838611 A/G Transición No
04 48838744 G/A Transición No
04 48838623 G/C Transversión No
04 48838624 A/T Transversión No
05 48838744 G/A Transición No
05 48838623 G/C Transversión No
05 48838624 A/T Transversión No
De tal comparación se obtuvo un total de 5 variantes diferentes en todo el grupo de estudio
que se pueden observar señalas en rojo en la Tabla 8, estas variaciones en estas ubicaciones
no están reportadas en ninguna base de datos para el síndrome de Marfan (ver ANEXO D).
Esto puede deberse a que las mutaciones suelen ser diferentes para cada grupo familiar
(Faiver et al. 2007); encontrando que una de las variantes localizada en el Chr 15: 48,838,744
es presentada por todos los individuos del grupo familiar mostrando la conservación de esta
cambio en la familia por la línea maternal.
56
Al comparar la secuencia query en BLASTx se encontró una referencia correspondiente al
síndrome de Marfan como se observa en la imagen 8, aunque la cobertura de la secuencia de
aminoácidos producida por la secuencia query no es idéntica a la referencia “Fibrillin 1
(Marfan syndrome), isoform CRA_a [Homo sapiens]” los marcos de lectura alcanza ser
similar a la proteína de esta isoforma en un puntaje de 36; ya que, esta herramienta sirve para
identificar productos proteicos potenciales codificados por una consulta de nucleótidos; es
decir, que traduce la secuencia de nucleótidos query en los posibles marcos de lectura y
contrasta la traducción con las base de datos para proteínas (The National Library of
Medicine, 2017) se puede decir que la proteína Fibrillin-1 en la familia si ha sido modificada.
Dado el llamado de SNPs y debido a que la consulta a las bases de datos fue
infructuosa solo fue posible determinar el tipo de SNP con la información obtenida del
alineamiento en BLASTn. Los SNPs suelen tener dos alelos que están representados por una
sustitución de una base por otras como lo son el cambio de purina-purina (A-G) o pirimidina-
pirimidina (C-T) nominado como las transiciones y de purina-pirimidina o pirimidina-pur ina
(A-C, A-T, G-C o G-T) como las transversiones (Rao & Gu, 2008) como es evidente en la
columna 4 de la Tabla 8 se encontraron 2 transiciones y 3 transversiones.
Imagen 8 BLASTx se observa la coincidencia de la secuencia query con una isoforma de Síndrome de Marfan.
La expresión fenotípica encontrada en el grupo de estudio se puede deber a la presencia
de estos SNPs; ya que, cuando se encuentran en regiones codificantes y alteran la secuencia de
57
aminoácidos como mostro el BLASTx (ver Imagen 8) generan un cambio en la función de la
proteína o en la expresión de esta (Ramensky et al. 2002). Por esta razón, la posibilidad de que
algunas variaciones funcionales en las proteínas produzcan alguna patología es muy amplia,
pues estas variaciones SNPs en general pueden estar localizadas de diversas regiones como:
“en la región promotora del gen, alterando la actividad transcripcional del gen (modulando
la unión de factores de transcripción), en intrones (modulando la estabilidad de la proteína)
o en sitios de splicing o en regiones intragénicas” (MUNNIER GONZÁLEZ, 2015).
Obtenidas las variantes se construyó un árbol genealógico teniendo como característica
principal la variación ubicada en: Chr15: 48,838,744. Como se observa la variación ha sido
transmitida en todas las generaciones (ver Imagen 9) expresada más agresiva en la F3. Lo
anterior se puede explicar en la posibilidad de que los alelos sean heterocigotos pues se han
presentado dominancia y conservación en el tiempo (Urbina & Lerner, 2009).
Imagen 9. Árbol genealógico. Se muestra el pedigree de la familia; los cuadrados y los círculos indican los
hombres y las mujeres respectivamente, y los símbolos oscurecidos representan a los miembros afectados. El
paciente sobre la flecha es el individuo 01 (ver ampliación en ANEXO E) .
58
7. CONCLUSIONES
Se identificaron 5 variantes en el grupo familiar, 2 de tipo transición y 3 de tipo
transversión no descritas en la base de datos OMIM.
La variante localizada en Chr15:48,838,744 se halló en todos los individuos del grupo
familiar, incluyendo al Padre lo que puede explicar la expresión más agresiva en el individuo
01.
Al realizar el BLASTx se comprobó la existencia de un cambio leve en la lectura de
la proteína codificada por FBN1.
El hallazgo de Polimorfismos de Nucleótidos Simples (SNP) puede explicar las
características fenotípicas observadas en del grupo familiar señaladas en la Tabla 3, siendo
estos la razón de la modificación de la Proteína.
59
8. RECOMENDACIONES
Para futuros estudios de genética molecular se recomienda utilizar un kit de
extracción de ADN comercial pues este facilita la realización de este procedimiento con altos
niveles de concentración y libres de contaminación acelerando los procesos consecutivos a
la extracción.
De no ser posible el uso de un Kit comercial para la extracción de ADN sólo se debe
repetir una vez el lisado celular con la LISIS 1 en volúmenes de 900 µL y 300 µL pues de
este modo se evita la contaminación de la muestra con sales.
En futuras investigaciones sobre el Síndrome de Marfan se recomienda ampliar la
búsqueda de SNPs en otros genes codificantes de proteínas estructurantes del tejido
conectivo, ya que en ocasiones se encuentra asociado a otros genes como el FBN2.
60
9. BIBLIOGRAFÍA
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65
10. ANEXOS
ANEXO A. PCR INDIVIDUO 01
Ilustración 1. Imagen Scanner del resultado de la PCR (página1) del Paciente con
mutación en el FBN1 sin diagnosticar.
66
Ilustración 2 Imagen Scanner del resultado de la PCR (página 2) del Paciente con mutación
en el FBN1 sin diagnosticar. Individuo 01.
67
ANEXO B. SECUENCIAS QUERY FORMATO FASTA
Imagen 10 Secuencias definitivas para cada individuo del estudio de caso.
68
ANEXO C. BLASTn
Imagen 11. BLASTn comparación de la secuencia query 01 con el GH Ch15 en NCBI.
Imagen 12. BLASTn comparación de la secuencia query 02 con el GH Ch15 en NCBI.
69
Imagen 13. BLASTn comparación de la secuencia query 03 con el GH Ch15 en NCBI.
Imagen 14. BLASTn comparación de la secuencia query 04 con el GH Ch15 en NCBI.
70
Imagen 15. BLASTn comparación de la secuencia query 05 con el GH Ch15 en NCBI.
71
ANEXO D. VARIANTES GENETICAS DEL SINDROME DE MARFAN
Tabla 9. Variaciones registradas para el Síndrome de Marfan.Tomado de OMIM (2017).
Cytogenetic location
Genomic coordinates (From NCBI/GRCh38)
Gene/Locus Gene/Locus name
Gene/Locus MIM number
Com
ments
Phenotype
Phenotype
MIM number
Inheritance
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS,
GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-
1
134797
Weill-Marchesani
syndrome 2,
dominant
608328 Autosomal
dominant
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS,
GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-
1
134797
Ectopia lentis,
familial
129600 Autosomal
dominant
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS,
GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-
1
134797
Stiff skin syndrome 184900 Autosomal
dominant
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS,
GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-
1
134797
Acromicric dysplasia 102370 Autosomal
dominant
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS,
GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-
1
134797
MASS syndrome 604308
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS, GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-1
134797
Marfan syndrome 154700 Autosomal dominant
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS, GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-1
134797
Marfan lipodystrophy syndrome
616914 Autosomal dominant
15q21.1 15:48408305-48645787 FBN1, MFS1, WMS2, SSKS, GPHYSD2, ACMICD, ECTOL1,
MFLS
Fibrillin-1
134797
Geleophysic dysplasia 2
614185 Autosomal dominant
72
ANEXO E. AMPLIACIÓN DEL ÁRBOL GENEALÓGICO
73