ĐẠi hỌc quỐc gia hÀ nỘi - hus.vnu.edu.vn (201).pdf · lêi c¶m ¬n lêi ®Çu tiªn, em...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------

Ngô Thị Kim Toán

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU NITƠ, PHOTPHO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -----------

Ngô Thị Kim Toán

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU NITƠ, PHOTPHO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2012

Lêi C¶m ¬n

Lêi ®Çu tiªn, em xin göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh ®Õn TS. NguyÔn Quang Huy, ngêi

ThÇy ®· tËn t×nh híng dÉn, chØ b¶o em trong suèt thêi gian häc tËp vµ thùc hiÖn luËn v¨n.

Em xin göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh ®Õn çc thÇy c« gi¸o trong Khoa Sinh häc, Trêng

§¹i häc Khoa häc Tù Nhiªn, §HQGHN ®· dµnh t©m huyÕt gi¶ng d¹y, trang bÞ kiÕn thøc cho

chóng em trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp vµ thùc hiÖn luËn v¨n.

Trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ thùc hiÖn luËn v¨n, em ®· nhËn ®îc rÊt nhiÒu sù gióp ®ì,

hç trî. Em xin göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh ®Õn çc thÇy c«, çn bé, häc viªn, sinh viªn trong Bé

m«n Sinh lý thùc vËt vµ Hãa sinh, Khoa Sinh häc; Phßng Enzym häc vµ Ph©n tÝch ho¹t tÝnh

sinh häc, Phßng thÝ nghiÖm träng ®iÓm C«ng nghÖ Protein vµ Enzym.

§Ò tµi thùc hiÖn cã sù hç trî kinh phÝ cña ®Ò tµi Nghiªn cøu ph¸t triÓn c«ng nghÖ mµng

sinh häc trong xö lý níc th¶i giµu nit¬ vµ photpho cña Bé C«ng th¬ng

Cuèi cïng, em xin göi lêi c¶m ¬n ®Õn gia ®×nh, b¹n bÌ ®· lu«n ë bªn ®éng viªn, gióp ®ì

em trong suèt thêi gian häc tËp vµ thùc hiÖn luËn v¨n, gióp em trëng thµnh h¬n khi s¾p bíc

®i trªn nh÷ng con ®êng míi.

Hµ Néi, th¸ng 12 n¨m 2012

Häc viªn

Ng« ThÞ Kim To¸n

Luận văn thạc sĩ

Ngô Thị Kim Toán i K19 – Sinh học thực nghiệm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường nước hiện nay ở Việt Nam và thế giới ........... 3

1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ, photpho

hiện nay ................................................................................................................... 5

1.2.1. Phương pháp hóa học ........................................................................... 5

1.2.1.1. Xử lý các hợp chất chứa nitơ bằng phương pháp hóa học .............. 5

1.2.1.2. Xử lý các hợp chất photpho bằng phương pháp hóa học. ............... 6

1.2.2. Phương pháp sinh học .......................................................................... 7

1.3. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, photpho trong

xử lý ô nhiễm nước thải. .........................................................................................10

1.3.1. Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ ............... 10

1.3.2. Vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho ............................................ 12

1.4. Màng sinh học và ứng dụng của màng sinh học trong việc xử lý ô nhiễm nước

thải giàu nitơ, photpho. ...........................................................................................14

1.4.1. Màng sinh học ................................................................................... 14

1.4.1.1. Định nghĩa về màng sinh học ...................................................... 14

1.4.1.2. Thành phần và quá trình hình thành màng sinh học ..................... 14

1.4.2. Vai trò và ứng dụng của sự hình thành màng sinh học ........................ 18

1.4.2.1. Vai trò của sự hình thành màng sinh học ..................................... 18

1.4.2.2. Ứng dụng của màng sinh học trong xử lý ô nhiễm ....................... 20

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 23

2.1. Nguyên liệu ...................................................................................................23

2.2. Hóa chất, thiết bị ...........................................................................................23

2.2.1. Môi trường nuôi cấy .......................................................................... 23

2.2.2. Máy móc thiết bị ................................................................................ 24

2.3. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................25


Ngô Thị Kim Toán ii K19 – Sinh học thực nghiệm

2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn ......................................................... 25

2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng hình thành biofilm ........................... 25

2.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét

(SEM) 26

2.3.4. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự hình thành

màng sinh học ................................................................................................ 26

2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy .............................. 26

2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ...................................... 27

2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram. ............................................................... 27

2.3.6. Phương pháp sử dụng kit APi ............................................................ 28

2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ .......... 28

2.3.7.1. Phương pháp phân tích nitơ tổng số............................................. 28

2.3.7.2. Phương pháp phân tích hàm lượng amoni (NH4+) ........................ 29

2.3.7.3. Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite ............................. 30

2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tích lũy photpho .............................. 31

2.3.8.1. Phương pháp phân tích photpho tổng .......................................... 32

2.3.8.2. Phương pháp phân tích hàm lượng Ortho photphate (PO43-) ........ 32

2.3.9. Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA ................ 33

2.3.10. Phương pháp thống kê sinh học ......................................................... 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 34

3. 1. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ ....................34

3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ và có khả năng

hình thành màng sinh học ............................................................................... 34

3.1.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ ....... 34

3.1.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập ....... 36

3.1.2. Khả năng chuyển hóa nitơ .................................................................. 38

3.1.2.1. Khả năng chuyển hóa amoni ....................................................... 38

3.1.2.2. Khả năng chuyển hóa nitrite ........................................................ 39

3. 2. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho. ...................40


Ngô Thị Kim Toán iii K19 – Sinh học thực nghiệm

3.2.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho và có khả

năng hình thành màng sinh học. ..................................................................... 40

3.2.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho ....... 40

3.2.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập ....... 41

3.2.2. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu. ........................... 42

3. 3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nghiên cứu..............43

3.3.1. Khả năng tạo hình thành màng sinh học trên một số giá thể ............... 43

3.3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu .................................... 45

3.3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự hình thành màng sinh

học .......................................................................................................... 46

3.3.4. Khả năng chuyển hóa một số chất trong bộ kit APi ............................ 48

3.3.5. Trình tự 16S rRNA và cây phát sinh chủng loại ................................. 50

KẾT LUẬN ........................................................................................................... 54

KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 55


Ngô Thị Kim Toán iv K19 – Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Hàm lượng thành phần nitơ và photpho trong mẫu phân tích. .......................... 34

Bảng 3.2. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ ........ 35

Bảng 3.3. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho ........ 41

Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh hoá của các chủng theo kit APi (BioMérieus)................. 48


Ngô Thị Kim Toán v K19 – Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên ................................................................... 8

Hình 1.2. Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm ...................... 16

Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập trên môi trường .................................. 35

Hình 3.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường

Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải thu từ bể biogas .................... 36


Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải khu tập trung rác thải ............ 37

Hình 3.4. Khả năng tạo hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường

Winogradsky 2 được phân lập ở bể biogas ............................................................. 37

Hình 3.5. Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng nghiên cứu. ........................ 38

Hình 3.6. Khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng nghiên cứu .......................... 39

Hình 3.7. Một số khuẩn lạc phân lập trên môi trường AMM .................................. 40

Hình 3.8. Khả năng hình thàng màng sinh học của các chủng vi sinh vật có khả

năng tích lũy photpho ............................................................................................ 41

Hình 3.9. Khả năng tích lũy photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường

với hàm lượng photpho 6mg/l ................................................................................ 42

Hình 3.10. Khả năng tích lũy photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường

hàm lượng photpho18mg/l ..................................................................................... 43

Hình 3.11. Khả năng hình thành biofilm trên giá thể nhựa ống eppendorf. ............ 44

Hình 3.12. Màng biofilm nổi của chủng B11.11, B21.10, B23.2, A4.2. ................. 44

Hình 3.13. Ảnh nhuộm Gram các chủng nghiên cứu ở độ phóng đại 1000 lần. ... 45

Hình 3.14. Cấu trúc hiển vi màng biofilm của chủng nghiên cứu .......................... 45

Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng hình thành màng sinh học ......... 46

Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH môi trường ............................................................ 47

Hình 3.17. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B11.11 ................................ 50

Hình 3.18. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B21.10 ................................ 51

Hình 3.19. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B23.2 .................................. 52

Hình 3.20. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng A4.2 .................................... 53


Ngô Thị Kim Toán vi K19 – Sinh học thực nghiệm

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ADH L-arginine

ADI Axit adipic

AMM Acetate mineral medium

ARA L-arabinose

BOD Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh học)

BTNMT Bộ Tài nguyên Môi trường

CAP Axit capric

CIT Trisodium citrate

COD Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học)

EPS Mạng lưới các hợp chất ngoại bào (Extracellular polymeric

substances)

ESC Esculin ferric citrate

GEL Gelatine

GLU D-glucose

GNT Potassium gluconate

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic

LB Môi trường Luria betani

MAL D-mantose

MAN D-mannitol

MLT Axit malic

MNE D-mannose

NAG N- acetyl- glucosamine

PAC Axit phenyl acetic

PNPG 4-nitrophenyl β D –galactopyranoside

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

SEM Ảnh vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope)

TRP L- tryptophan

URE Urea


Ngô Thị Kim Toán 1 K19 – Sinh học thực nghiệm

MỞ ĐẦU

Hiện nay, ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm của nhiều quốc

gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Ô nhiễm nguồn nước không chỉ ảnh hưởng

đến đời sống con người mà còn ảnh hưởng đến đa dạng sinh học. Tình trạng ô

nhiễm nước thải trong đó có nguyên nhân từ các hợp chất nitơ và photpho đang có

chiều hướng gia tăng trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của kinh tế,

xã hội. Để làm giảm mức độ ô nhiễm từ nước thải giàu nitơ và photpho, nhiều

phương pháp đã và đang nghiên cứu bằng cách kết hợp các biện pháp vật lý, hóa

học và sinh học. Xử lý nước thải dựa vào phương pháp hóa học, vật lý thường có

hiệu quả cao, nhanh nhưng chi phí lớn, không mang tính bền vững.

Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học dựa trên cơ sở sử dụng các vi

sinh vật là một phương pháp được quan tâm nghiên cứu. Nhiều nhóm vi sinh vật

trong tự nhiên có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và photpho trong

nước thải thành các chất không độc hại với môi trường. Màng sinh học được định

nghĩa là dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên và khác biệt với dạng tế bào sống

tự do bởi mạng lưới các hợp chất ngoại bào bao quanh và những thay đổi, biệt hóa

trong tế bào để vi sinh vật thích nghi với môi trường sống. Vi sinh vật hình thành

màng sinh học không chỉ giúp chúng tồn tại và chống chịu được với những điều

kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của môi trường mà còn thông qua

mối quan hệ hợp tác giữa các loài khác để tăng quá trình phân giải các chất độc hại

trong môi trường.

Việc nghiên cứu xử lý ô nhiễm nguồn nước thải nói chung và nước thải có

hàm lượng nitơ, photpho cao bằng việc sử dụng các vi sinh vật tạo màng sinh học là

hướng nghiên cứu mới mang tính bền vững. Tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều

công trình công bố về kết quả phân lập cũng như khả năng chuyển hóa nitơ,

photpho của các các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học. Chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài :”Nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh

vật ứng dụng xử lý nước thải giàu Nitơ, Photpho” nhằm mục đích góp phần tìm



hiểu sự đa dạng về các chủng vi sinh vật tạo màng trong tự nhiên cũng như khả

năng ứng dụng trong xử lý nước ô nhiễm.



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường nước hiện nay ở Việt Nam và thế giới

Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở

Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Nước thải là một trong những

nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường hiện nay. Ô nhiễm nguồn nước không chỉ ảnh

hưởng đến môi trường sống của con người, mà còn ảnh hưởng đến đa dạng sinh

học, đến môi trường sống của các loài động, thực vật trên trái đất.

Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi

Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trường nước mặt ở tất cả các chỉ

số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 08:2008. Các chỉ số COD, BOD

đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 đến 10 lần. Hàm lượng NH4+ trong môi trường nước

mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN

08:2008/BTNMT cho nước mặt phù hợp với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là

là 0,2 mg/l. Năm 2009, hàm lượng NH4+ trong nước sông Nhuệ đo tại Cự Đà trên

10 mg/l vượt quá tiêu chuẩn 50 lần, sông Đáy đo tại Cầu Hoàng 3 mg/l vượt quá

tiêu chuẩn 15 lần, sông Cầu đo tại Thái Nguyên trên 22 mg/l vượt quá tiêu chuẩn

110 lần [2].

Theo Mulder, lượng hợp chất nitơ trong chuỗi thức ăn là 15 kg/người/năm,

một phần trong đó được con người tiêu thụ, phần lớn được thải ra ngoài môi trường.

Tính theo đầu người, mỗi người thải ra 4,75 kg nitơ một năm. Lượng nitơ trong

nước thải chiếm 30% lượng nitơ tiêu thụ [41]. Nước thải ở các đô thị chủ yếu ở

dạng nitơ hữu cơ và amoni, trong đó 60% ở dạng hữu cơ và 40% ở trạng thái amoni.

Ở Mỹ, hàm lượng nitơ có trong nước thải phụ thuộc vào số dân và lưu lượng nước

thải hằng ngày. Lượng nitơ thải vào nguồn nước trung bình là 16 g/người/ngày.

Hàm lượng và các loại hợp chất chứa nitơ thay đổi trong từng loại nước thải khác

nhau. Hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 đến 85

mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 đến 35 mg/l, hàm lượng

N-NH3 từ 12 đến 50 mg/l [56].



Photpho là yếu tố quan trọng trong quá trình trao đổi chất và năng lượng của

sinh vật, khi nồng độ photpho quá cao trong môi trường làm tăng sinh của các loại

tảo gây hiện tượng phú dưỡng. Nồng độ photpho trong nước thải trung bình từ 6

đến 20 mg/l. Việc sử dụng các chất tẩy rửa trong sinh hoạt và sản xuất là một trong

số các nguyên nhân làm tăng hàm lượng photpho trong nước thải. Trong môi trường

nước mặt, nitrate, photphate là hai hợp chất của nitơ và photpho cần thiết cho sự

phát triển của rong, tảo. Hàm lượng photphate trong nguồn nước không ô nhiễm

nhỏ hơn 0,01 mg/l. Giá trị này ở sông Mêkông là nhỏ hơn 0,05 mg/l nhưng ở những

kênh rạch bị ô nhiễm nước thải do sinh hoạt và công nghiệp hàm lượng photphate

có thể lên tới 5 mg/l . Photphate là chất có nhiều trong phân, sản xuất phân lân, thực

phẩm, nước thải của các nhà máy chế biến phân lân, chế biến thủy sản. Theo quy

định của Hà Lan cũng như tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng photphate trong

nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng đồng chung châu

Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphate không được vượt quá 2,18 mg/l [4].

Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn

nước. Ô nhiễm nước thải chăn nuôi đặc trưng là ô nhiễm hữu cơ, hàm lượng nitơ,

photpho cao và vi sinh vật gây bệnh, hàm lượng nitơ tổng số nằm trong khoảng từ

512 đến 594 mg/l, trong đó N-NH3 trong nước thải từ 304 đến 471 mg/l, hàm lượng

photpho tổng số dao động trong khoảng từ 13,8 đến 62 mg/l [6].

Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia

tăng. Ở Việt Nam, phương pháp xử lý rác thải chính vẫn là sử dụng các hố chôn lấp.

Nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến đời

sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm quanh

khu vực. Trong nước thải rỉ rác chứa rất nhiều thành phần độc hại khác nhau trong

đó đặc biệt là hàm lượng chất hữu cơ cao. Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ

rác dao động trong khoảng từ 200 đến 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình

200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l[6].



1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ, photpho

hiện nay

Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải được áp dụng như phương

pháp cơ học, phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học. Tất

cả các phương pháp xử lý hiện nay đều có những ưu, nhược điểm. Trong thực tế,

quá trình xử lý nước thải cần có sự kết hợp của nhiều phương pháp nhằm nâng cao

hiệu quả và giảm thời gian xử lý. Ví dụ, có thể sử dụng phương pháp cơ học giúp

loại bỏ các chất thải có kích thước lớn ban đầu, sau đó có thể áp dụng các phương

pháp hóa học, sinh học nhằm loại bỏ các chất độc bảo đảm tính bền vững cho môi

trường.

1.2.1. Phương pháp hóa học

Cơ sở của phương pháp hóa học là dựa trên các phản ứng hóa học. Các phản

ứng hóa học được ứng dụng trong xử lý nước thải như phản ứng oxy hóa, phản ứng

trung hòa, phản ứng keo tụ… giữa chất ô nhiễm và các hóa chất bổ sung.

1.2.1.1. Xử lý các hợp chất chứa nitơ bằng phương pháp hóa học

Quá trình xử lý nước thải chứa nitơ dựa trên nguyên tắc hóa học, nước thải

được đưa đến pH trong khoảng từ 10 đến 11 bằng cách thêm vào Ca(OH)2 để tạo

thành NH4OH, khi đó amoni chuyển từ trạng thái lỏng sang khí và sau đó được đưa

ra ngoài không khí qua các tháp làm lạnh [56]. Cheung và cộng sự đã sử dụng

Ca(OH)2 với nồng độ là 10 g/l, sau thời gian xử lý là 24 giờ và ở nhiệt độ từ 20 đến

23oC. Kết quả cho thấy, đã xử lý 65 – 75% NH4+ khi lưu lượng không khí bằng với

môi trường, và 86 – 93% NH4+ khi lưu lượng không khí là 5l/ phút [16]. Ozturk và

cộng sự đã áp dụng phương pháp này, sau 2 giờ, đã xử lý được 72 – 85% lượng

amoni trong nước thải rỉ rác khi bổ sung Ca(OH)2 với hàm lượng là 8 g/l và lưu

lượng không khí là 7,6 l/phút. Tuy nhiên phương pháp này có chi phí xử lý cao vì

đòi hỏi lượng không khí lớn và lượng Ca(OH)2 sau đó phải được xử lý với H2SO4

trước khi thải ra môi trường [48].

Li và cộng sự đã thử nghiệm một phương pháp để loại bỏ amoni trong nước

thải thông qua việc kết tủa amoni dưới dạng (NH4)MgPO4.6H2O khi thêm MgCl2 và



Na2HPO4 trong quá trình xử lý. Bằng phương pháp này, với tỷ lệ

Mg:NH4:PO4=1:1:1 và pH trong nước từ 8,5 đến 9, nồng độ amoni trong nước thải

rỉ rác giảm từ 5.600 mg/l xuống chỉ còn 110 mg/l trong 15 phút [38]. Phương pháp

này cũng đã được Yangin và cộng sự áp dụng đối với nước thải sinh hoạt, kết quả đã

loại bỏ được 66% lượng amoni trong nước thải và phương pháp này còn có thể ứng

dụng cho việc loại bỏ hợp chất chứa photpho trong nước thải [66]. Một phương

pháp để xử lý nitơ khác là bổ sung thêm clo vào nước thải trong quá trình xử lý. Khi

cho clo vào nước thải, NH3 sẽ phản ứng với clo dưới dạng HOCl để tạo ra các sản

phẩm trung gian là NH2Cl, NHCl2, NCl3. Quá trình xử lý sẽ diễn ra liên tục khi

thêm HOCl vào phản ứng để tạo ra sản phẩm cuối cùng là nitơ phân tử [56]. Quá

trình này diễn ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, thời gian xử lý và tỷ lệ

HOCl/NH3 [49]. Với tỷ lệ HOCl/NH3 được tính theo mol bằng 1 tại pH trong

khoảng từ 7 đến 8 tất cả NH3 đều chuyển hóa thành NH2Cl. Với tỉ lệ HOCl/NH3

bằng 2 sản phẩm chủ yếu là NHCl2, khi tỉ lệ trên bằng 3 thì sản phẩm xử lý tạo ra

chủ yếu là NCl3 [3].

1.2.1.2. Xử lý các hợp chất photpho bằng phương pháp hóa học.

Photphate là một trong các hợp chất của photpho chiếm tỷ lệ cao trong nước

thải. Quá trình xử lý nước thải có chứa hợp chất photpho bằng phương pháp hóa

học dựa trên nguyên tắc chủ yếu là kết tủa photphate với các ion nhôm, sắt, canxi

tạo ra các muối có độ tan thấp và tách chúng dưới dạng chất rắn [4], [6].

Phương pháp hóa học được sử dụng trước tiên trong xử lý nước thải là sử

dụng kiềm hóa bằng Ca(OH)2. Khi thêm Ca(OH)2 vào nước thải, pH sẽ tăng làm

dịch chuyển cân bằng về PO43-. Tỷ lệ Ca/P nằm trong khoảng 1,33 đến 2,0 và ion

Ca2+ có khả năng loại bỏ photphate do nó tạo với photphate những hợp chất kém

hoà tan. Hydroxy apatit C10(PO4)6(OH)2 không xuất hiện ngay trong quá trình hình

thành dù nó là thành phần ổn định nhất về mặt nhiệt động và kém hòa tan nhất trong

số các kết tủa của photphate canxi. Photphate canxi Ca3(PO10)2 vô định hình là dạng

có cấu trúc tinh thể không ổn định và có độ tan thấp [4].



Khả năng loại bỏ photphate trong nước thải có hiệu quả cao khi ở pH >10,

đặc biệt khi ở pH từ 10,5 đến 11. Đặc điểm của phương pháp dùng Ca(OH)2 là làm

tăng độ kiềm của nước, thuận lợi cho phản ứng phân hủy sinh học của NH4+, không

đưa anion mới vào nước thải so với cách dùng muối để kết tủa photphate. Ngoài

phương pháp sử dụng Ca(OH)2, loại bỏ phosphate bằng phương pháp hóa học có

thể bằng việc kết tủa sử dụng muối sắt, nhôm, các muối sắt sử dụng là: FeCl3,

FeClSO4, FeSO4 khi bổ sung vào nước thải, sẽ xảy ra quá trình thủy phân tạo ra các

phức chất mang điện tích dương như Fe(OH)2+, Fe(OH)2+ và một số dimer, polymer

tích điện dương. Tại một giá trị pH không đổi, với tỷ lệ Fe3+/P từ 1,4 đến 1,6 có thể

kết tủa hoàn toàn photphate. Nếu tỷ lệ Fe3+/P tăng, sản phẩm kết tủa tạo thành là

Fe(OH)3 tăng lên như vậy kết tủa đó không phải là kết tủa của muối photphate. Do

vậy nếu tỷ lệ Fe3+/P tăng lên thì hiệu suất của quá trình xử lý không thay đổi[55].

Quá trình xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho bằng phương pháp hóa

học chủ yếu là thêm một số chất làm đông tụ, keo tụ chất thải thành các muối kết

tủa. Tuy nhiên, việc tách các muối này ra khỏi nước thải phải dùng đến các màng

lọc: màng nano, màng thẩm thấu ngược, màng thẩm điện tích. Các màng lọc thường

có giá thành cao nên việc áp dụng phương pháp hóa học chưa phù hợp với nhu cầu

ứng dụng trong xử lý nước thải hiện nay. Do vậy, cần có phương pháp khác có khả

năng xử lý tốt ô nhiễm mà chi phí phù hợp [4].

1.2.2. Phương pháp sinh học

Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH4+),

nitrate (NO3-), ít hơn ở dạng nitrite (NO2

-) và trong một số hợp chất hữu cơ khác.

Thành phần được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi

trường là khí nitơ (N2). Nitơ hữu cơ có thể tồn tại trong các sinh vật sống hoặc các

sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy các vật chất hữu cơ [53], [54], [70]. Xử

lý nước thải có chứa hợp chất nitơ dựa trên các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa

thành các chất không độc như khí N2, trả lại môi trường không khí. Phương pháp

sinh học có những ưu điểm so với các phương pháp vật lý hóa học như: hiệu suất



khử nitơ cao, sự ổn định và tương đối dễ vận hành, quản lý, chi phí đầu tư hợp lý và

quan trọng cho sự phát triển bền vững, bảo vệ môi trường và hệ sinh thái.

Để xử lý nước thải chứa nitơ theo phương pháp sinh học. Các nghiên cứu

dựa trên cơ sở là trong tự nhiên luôn tồn tại các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa

hợp chất nitơ. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên được trình bày ở hình 1.1

[53], [57].

Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng

khác đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng

lượng hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng.

Các dạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni

hóa chuyển hóa thành dạng NH4+ ; sau đó NH4

+ được chuyển hóa thành NO2- nhờ vi

khuẩn nitrite hóa; NO2- sinh ra được nhóm sinh vật nitrate hóa chuyển hóa thành

NO3-; cuối cùng nitrate được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử

nhờ quá trình khử nitrate (Hình 1.1) [53], [54], [70].

Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên [69], [70]



Xử lý nước thải có chứa các hợp chất photpho bằng phương pháp sinh học

dựa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích lũy lượng photpho nhiều hơn

mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí. Thông thường hàm lượng photpho

trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 đến 2,5% khối lượng tế bào khô, một số loài có khả

năng hấp thu cao hơn, từ 6 đến 8%. Vì các hợp chất chứa photpho tồn tại trong

nước thải dưới ba dạng: photphate đơn (PO43-), polyphotphate và hợp chất hữu cơ

chứa photphate, hai hợp chất sau chiếm tỉ lệ lớn trong nước thải. Trong quá trình xử

lý vi sinh, lượng photpho hao hụt từ nước thải duy nhất là lượng được vi sinh vật

hấp thu để xây dựng tế bào. Trong quá trình xử lý hiếu khí, một số loài vi sinh vật

có khả năng hấp thu photphate cao hơn mức bình thường trong tế bào và tồn tại ở

dạng dự trữ [3], [14].

Nghiên cứu Van Bethum và cộng sự, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh

vật được tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphate. Trong cơ thể của chúng,

photphate có thể chiếm đến 12% trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy

polyphotphate, và với vi khuẩn không tích lũy polyphotphate, chỉ chiếm khoảng

1đến 3% trọng lượng tế bào [63]. Trong điều kiện yếm khí, với sự có mặt của chất

hữu cơ, lượng photphate dư lại được thải ra ngoài cơ thể vi sinh dưới dạng

photphate đơn. Một vài loại tảo cũng có khả năng tích trữ một lượng photphate dư

so với nhu cầu của tế bào [3].

Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photpho

trong nước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới. Trong nghiên cứu của

Jorgensen và Pauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng có

khả năng khử nitrate [33]. Phương pháp kết hợp sử dụng bùn hoạt tính, các hợp

chất trong các quá trình xử lý thiếu khí (anoxic), xử lý hiếu khí (aerobic), xử lý yếm

khí (anaerobic) kết hợp hoặc riêng biệt trong quá trình khử nitơ và photpho [3].



1.3. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, photpho

trong xử lý ô nhiễm nước thải.

1.3.1. Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ

Trong nước thải có nhiều thành phần khác nhau, bao gồm các hợp chất hữu

cơ và vô cơ. Trong đó các hợp chất chứa nitơ và photpho chiếm tỷ lệ lớn.

Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH4+ thành NO3

-, cung cấp năng lượng cho

vi sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa

CO2. Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc

đều có khả năng thực hiện quá trình này. Nitrate hóa qua 2 giai đoạn:

Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa amoni (NH4+) thành nitrite (NO2

-) bởi một số

đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis,

Nitrosococcus, Nitrosolobus... Tất cả chúng khá giống nhau về mặt sinh lý, sinh

hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào. Các đại diện của chi

Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường

lỏng, quá trình phát triển của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas trải qua một số giai

đoạn và phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường [12], [27].

Giai đoạn 2 của quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite (NO2-) thành nitrate

(NO3-) bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter Winogradsky, Nitrospina gracilis,

Nitrococcus mobilis.

NH4+ + 1,5 O2 Nitrosomonas NO2

- + H2O + 2 H+

NO2- + 0,5 O2

Nitrobacter NO3

-

NH4+ + 2 O2 NO3

- + H2O + 2 H+

4 NO3- + 4 H+ + 5 Chữu cơ 5 CO2 + 2 N2 + 2 H2O

Tế bào đặc trưng của nhóm vi khuẩn Nitrobacter trong dịch nuôi là dạng

hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động.

Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể liên kết với nhau thành tập đoàn.

Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, thỉnh thoảng có dạng hình cầu,

không di động, và có đặc trưng là liên kết tạo thành tập đoàn. Nitrococcus mobilis

thì có dạng hình tròn, có tiêm mao [5].



pH thích hợp cho nhóm vi khuẩn Nitrosomonas là từ 7,8 đến 8, Nitrobacter

là từ 7,3 đến 7,5. Nitrobacter sẽ tăng trưởng chậm hơn ở các mức pH cao đặc trưng

cho các thủy vực nước mặn. Nitrosomonas sống ở những nơi giàu NH3 và các muối

vô cơ như trong bùn đáy ao, nước cống, nước ngọt, các thủy vực bị ô nhiễm chứa

nhiều hợp chất nitơ nhằm tránh ánh sáng. Nitrobacter không có khả năng di động và

cần phải bám vào bề mặt giá thể như đá, cát, hoặc một giá thể sinh học …

Nitrobacter không thể sống trong môi trường khô. Trong môi trường nước, chúng

có thể tồn tại trong khoảng thời gian ngắn ở các điều kiện bất lợi nhờ vào việc sử

dụng các chất dự trữ bên trong tế bào [31].

Oxy hóa amoni bao gồm hai phản ứng kế tiếp nhau nên tốc độ oxy hóa của

quá trình bị khống chế bởi gian đoạn có tốc độ thấp hơn. Tốc độ phát triển của

Nitrosomonas chậm hơn Nitrobacter do đó nồng độ NO2- thấp hơn trong giai đoạn

ổn định. Vì vậy trong quá trình động học người ta chỉ sử dụng các thông số liên

quan đến vi khuẩn Nitrosomonas để đặc trưng cho quá trình oxy hóa amoni [31].

Quá trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ không chỉ diễn ra do các chi vi

khuẩn nói trên mà trong tự nhiên còn nhiều nhóm vi sinh vật khác cũng có khả năng

chuyển hóa như vậy. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa amoni, nitrite, nitrate,

Zhang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri không

chỉ có khả năng chuyển hóa nitrite mà còn có khả năng chuyển hóa amoni. Sau thời

gian 18 giờ, chủng vi khuẩn này đã chuyển hóa được amoni hoàn toàn thành dạng

khí N2 với hiệu suất là 39% [67]. Một Nghiên cứu khác của Zhang và cộng sự về

việc sử dụng vi khuẩn Bacillus methylotrophicus trong xử lý nitơ cho thấy trong

môi trường ở điều kiện pH từ 7 đến 8 và nhiệt độ là 37oC, chủng B.

methylotrophicus đã làm nồng độ NH4+ ban đầu 146,71mg/l giảm xuống 38,29 mg/l

sau 9 ngày nuôi cấy, với tốc độ chuyển hóa là 51,58 mg/l/ngày [68].

Nghiên cứu của Broda cho thấy sự tồn tại của các vi khuẩn gọi là anammox

[15]. Các vi khuẩn này có thể oxy hoá amoni trong điều kiện kị khí (Anaerobic

Amoni Oxidation) hay còn gọi là anammox. Các nhà khoa học Hà Lan và Đức đã

nghiên cứu và phát hiện ra các vi khuẩn này thuộc năm chi gồm Brocadia,



Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia và Scalindua, bộ Planctomycetales, ngành

Planctomycetes [42], [52]. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử cũng như đặc điểm

sinh lý, sinh hóa Schmid cùng cộng sự đã phân loại được vi khuẩn Kuenenia

stuttgartiensis thuộc nhóm vi khuẩn anammox [53]. Ngoài phương pháp xử lý sinh

học kết hợp hai quá trình nitrate hoá và khử nitrate có thể loại bỏ được amoni ra

khỏi nước thải trong thực tế còn tồn tại một số vi khuẩn có khả năng oxy hoá amoni

thành dạng khí N2 sử dụng nitrite được hình thành từ quá trình xử lý thay thế cho

việc phải sử dụng oxy cấp từ nguồn bên ngoài vào [42], [52].

Trong tự nhiên, ngoài các chi Nitrosomonas, Nitrobacter có khả năng chuyển

hóa hợp chất chứa nitơ có trong nước thải là NH4+, NO2

-, NO3- còn có một số chi vi

sinh vật khác như Bacillus, Pseudomonas….

NO3- là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa amoni chưa được coi là

bền vững và còn gây độc cho môi trường nên cần phải chuyển hóa về dạng khí N2.

Vi sinh vật thực hiện quá trình chuyển hóa là các vi sinh vật khử nitrate bao gồm

một số vi sinh vật thuộc các chi như Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas,

Thiobacillus [22]. Các vi sinh vật khử nitrate sử dụng oxy hoặc nitrate, nitrite làm

chất oxy hóa để cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh hóa.

Quá trình khử nitrate thường được nhận dạng là khử nitrat kị khí, tuy nhiên

diễn biến quá trình sinh hóa không phải là quá trình lên men kị khí mà nó giống quá

trình hô hấp hiếu khí nhưng thay vì sử dụng oxy, vi sinh vật sử dụng nitrate, nitrite.

Để khử nitrate, vi sinh vật cần có chất khử (nitrate là chất oxy hóa), chất khử có thể

là chất hữu cơ hoặc vô cơ như H2, S, Fe2+. Phần lớn vi sinh vật khử nitrate thuộc

loại dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon hữu cơ để xây dựng tế bào ngoài phần sử dụng

cho phản ứng khử nitrate. Rất ít vi sinh vật khử nitrate thuộc loại tự dưỡng, ví dụ

Thiobacillus denitrificant sử dụng lưu huỳnh làm chất khử [3], [27].

1.3.2. Vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho

Hợp chất photpho trong môi trường nước thải tồn tại trong các dạng:

photpho hữu cơ, muối photphate của các dạng H2PO4-, HPO4

2-, PO43- tan trong

nước, polyphotphate hay còn gọi là photphate trùng ngưng, muối photphate và



photpho trong tế bào sinh khối. Tất cả các dạng polyphotphate đều có thể chuyển

hóa về dạng orthophotphate (PO43-) trong môi trường nước đặc biệt là trong điều

kiện môi trường axit và ở nhiệt độ cao [4], [6].

Nhiều loài vi sinh vật tham gia vào quá trình hấp thu, tích lũy photpho vào

cơ thể của chúng được quy chung về nhóm vi sinh bio-P mà vi khuẩn thuộc chi

Acinetobacter là chủ yếu. [51], [60].

Trong điều kiện hiếu khí (O2) vi sinh bio-P tích lũy, tổng hợp photphate

trong cơ thể chúng từ photphate đơn tồn tại trong nước thải theo phương trình phản

ứng:

C2H4O2 + 0,16 NH4+ + 1,2 O2 + 0,2 PO4

3- 0,16 C5H7NO2 + 1,2 CO2 +

0,2 (HPO3) + 0,44 OH- + 1,44 H2O.

HPO3 là photphate ở dạng trùng ngưng tồn tại trong cơ thể vi sinh vật. Trong

điều kiện thiếu khí (không có oxy, chỉ có mặt nitrat) quá trình tích lũy photpho xảy

ra:

C2H4O2 + 0,16 NH4+ + 0,2 PO4

3-+0,96 NO3- 0,16 C5H7NO2+ 1,2 CO2

+ 0,2 (HPO3) + 1,4 OH- + 0,48 N2 + 0,96 H2O

Từ phương trình chuyển hóa trên cho thấy, các chủng vi sinh vật có khả năng

tích lũy photpho cũng có khả năng khử nitrate [36], [58].

Đã có nhiều công trình nghiên cứu, phân lập đối với các chủng vi sinh vật có

khả năng tích lũy photpho và khử nitrate trong việc loại bỏ một số hợp chất chứa

nitơ, photpho trong nước thải. Acinetobacter thường được quan tâm bởi khả năng

tích lũy photpho trong cơ thể, ít được biết đến hơn với vai trò khử nitrate. Một số

chi vừa có khả năng tích lũy photpho vừa có khả năng khử nitrate như:

Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, nhóm Comamonas –

Pseudomonas, nhóm Flavobacterium – Cytophaga, Moraxella, Xanthomonas,

Paracoccus, Bacillus, Corynebacterium và nhiều chủng vi khuẩn Gram dương

khác nữa. Acinetobacter là một trong những chi vi khuẩn được biết đến với khả

năng tích lũy photpho cao [33], [59], [61]. Bao và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

khả năng thu nhận photpho của các vi khuẩn khác nhau trong điều kiện hiếu khí và



thiếu khí [11], sau 20 giờ nghiên cứu, vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng

thu nhận đến 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều kiện thiếu khí. Các chi

Enterobacteriaceae, Alcaligenes, Staphylococcus và Bacillus trong điều kiện hiếu

khí có khả năng thu nhận photpho lần lượt tương ứng là 8,91 mg/l, 6,43 mg/l, 6,23

mg/l và 4,41 mg/l.

1.4. Màng sinh học và ứng dụng của màng sinh học trong việc xử lý ô nhiễm

nước thải giàu nitơ, photpho.

1.4.1. Màng sinh học

1.4.1.1. Định nghĩa về màng sinh học

Màng sinh học (biofilm) được định nghĩa là một tập hợp của vi sinh vật liên

kết với nhau thông qua mạng lưới polymer ngoại bào [21].

Màng sinh học có thể hình thành do tập hợp các tế bào của cùng một vi sinh

vật hay các vi sinh vật khác nhau. Trong tự nhiên, màng sinh học thường là sự liên

kết của vi khuẩn, nấm, tảo, xạ khuẩn. Trong màng sinh học các tế bào tập hợp thành

các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng

trong quá trình hình thành màng sinh học đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy

định đặc tính hình thành màng cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết

các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi,

lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể [44].

1.4.1.2. Thành phần và quá trình hình thành màng sinh học

Cấu trúc của màng sinh học trong tự nhiên gồm hai thành phần chính là các

tập hợp tế bào vi sinh vật và mạng lưới các chất ngoại bào (Extracellular Polymeric

Substances - EPS). Các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám

dính trên bề mặt nhất định (có thể là hữu sinh hay vô sinh). Các tế bào liên kết với

nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế

bào. Có thể nói màng sinh học là dạng sống khá phổ biến của nhiều loài vi sinh vật

[37], [39].

Mạng lưới các chất ngoại bào (EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc

đặc trưng cho biofilm. Mạng lưới ngoại bào có độ dày từ 0,2 đến 1 µm. Ở một vài



loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn nằm trong khoảng từ 10 đến 30 nm

[19]. Mạng lưới các chất ngoại bào có vai trò quy định sự sắp xếp tế bào đồng thời

tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong biofilm nhờ đó mà các chất dinh

dưỡng cũng như nước có thể lưu thông trong biofilm tạo điều kiện cho việc khuếch

tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các tế bào vi sinh vật trong biofilm cũng

như loại bỏ đi những chất thải không cần thiết [35].

Về cơ bản màng sinh học được cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một

loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm từ 2 đến

5% tổng khối lượng biofilm. Trong biofilm ngoài thành phần tế bào thì có tới 97%

là nước, 3 đến 6% còn lại là EPS và ion. Một tế bào vi khuẩn tùy thuộc vào điều

kiện môi trường khác nhau có thể hình thành biofilm ở các dạng khác nhau. Thành

phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và điều kiện

hình thành nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysaccharide chiếm khoảng từ 40

đến 95%, từ 1 đến 60% là protein, từ 1 đến 10% là axit nucleic, và từ 1 đến 40%

lipit về khối lượng [19], [25]. Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời

gian tồn tại của màng sinh học. Về cơ bản màng sinh học càng dày và thời gian tồn

tại càng lâu thì có hàm lượng EPS càng nhiều.

Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ

sâu. Trái lại, thành phần EPS lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm. Thành

phần EPS trong biofilm cũng khác biệt so với ở dạng sống tự do của chính vi khuẩn

đó [19]. EPS có thể chiếm 50% đến 90% của tổng cacbon hữu cơ của các màng sinh

học và có thể coi là thành phần chính của màng sinh học. EPS có thể thay đổi một

vài tính chất hóa học và vật lý, nhưng thành phần chính của nó chủ yếu vẫn gồm các

polysaccharides. Có thể là các polysaccharides trung tính hay là polyanionic là

thành phần chính của EPS vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn gram dương, thành

phần hóa học của EPS có thể khác nhau và chủ yếu là cation [62].

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, sinh học phân tử, cùng

với những phân tích về mặt cấu trúc của màng sinh học, các nhà khoa học đã đưa ra

một mô hình cấu trúc màng sinh học cơ bản [18]. Trong mô hình này, vi khuẩn hình



thành nên các vi khuẩn lạc và được bao quanh bởi một mạng lưới chất ngoại bào

giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi

thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền

dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó, dịch tế bào có thể đi qua màng

sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các

tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải. Sự hình thành biofilm là quá trình

phát triển mà trong đó vi khuẩn trải qua những thay đổi trong cách thức tồn tại để

chuyển từ dạng sống đơn bào, riêng rẽ sang dạng tập hợp nhiều tế bào, cố định một

chỗ và có sự sinh trưởng cũng như biệt hóa tế bào khác với dạng sống trôi nổi. Có

năm giai đoạn chính trong quá trình hình thành và phát triển của một biofilm (Hình

1.2) [40].

Hình 1.1. Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm [40]

1. Giai đoạn gắn kết, 2. Hình thành lớp tế bào, 3. Hình thành mạng lưới ngoại bào,

4. Hình thành màng sinh học hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời

Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch lên giá thể

Trong một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn

có thể di chuyển hướng đến bề mặt bởi hóa ứng động và hình thành mối tương tác

tạm thời với bề mặt thông qua các lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lực hút



tình điện, liên kết hydro. Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút

tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế

bào riêng rẽ được bao bọc trong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh

vật. Giai đoạn gắn kết thuận nghịch có vai trò quyết định một màng sinh học có thể

được hình thành hay không [8], [46].

Giai đoạn 2: Hình thành lớp tế bào

Khi các tế bào đầu tiên bám dính chặt hơn trên bề mặt giá thể, lúc này các tế

bào sử dụng các chất hữu cơ trên bề mặt giá thể và trong môi trường để sinh trưởng

phát triển tạo nên các vi khuẩn lạc đồng thời cũng trải qua những thay đổi về số

lượng tế bào, số lượng loài cũng như cấu trúc tế bào nhất định. Sản sinh ra các hợp

chất ngoại bào, giúp cho các tế bào bám dính chặt, không thuận nghịch trừ khi có

tác động của các tác nhân vật lý, hóa học. Các tế bào giảm mức độ sinh trưởng, tiêu

giảm các phần phụ trợ tế bào.

Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới ngoại bào

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên

kết các tế bào một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các khuẩn lạc.

Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều

loài khác nhau) trong môi trường. Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh

học cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một màng sinh học dần

được hình thành.

Giai đoạn 4: Hoàn thành một màng sinh học hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình

trưởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Các tế bào phân chia và phát triển, hình

thành các cụm tế bào vi khuẩn và mở rộng về không gian, hình thành một cấu trúc

màng sinh học hoàn chỉnh. Từ một phạm vi ban đầu màng sinh học có thể mở rộng

về không gian cũng như độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Một màng

sinh học hoàn chỉnh có cấu trúc giống như tháp hình nấm được bao quanh bởi các

kênh vận chuyển nước có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất

dinh dưỡng và oxy vào bên trong màng [28].



Giai đoạn 5: Quá trình tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh học bị giới hạn do nhu cầu dinh dưỡng

của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các

phân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng, sự

tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn

cung cấp cacbon, oxy [45]. Trong một số trường hợp, khi màng sinh học đạt đến

khối lượng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời

và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc. Sự phân

hủy các polymer ngoại bào có thể diễn ra trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng hay

oxy bên trong màng sinh học. Quá trình này liên quan đến sự tăng cường biểu hiện

của các gen mã hóa cho enzyme phân hủy carbohydrate tạo nên các lực liên kết yếu

hơn trong màng sinh học, dẫn đến sự phân tách các tế bào riêng rẽ đồng thời operon

mã hóa cho protein lông roi được tăng cường biểu hiện để chuẩn bị cho các tế bào

sống tự do khi tách rời khỏi màng [43], [45].

1.4.2. Vai trò và ứng dụng của sự hình thành màng sinh học

1.4.2.1. Vai trò của sự hình thành màng sinh học

Sự hình thành màng sinh học mang lại lợi ích cho chính bản thân vi sinh vật.

Trong quá trình hình thành màng sinh học, các tế bào phải trải qua một số thay đổi

về hình thái, đặc tính sinh lý và một trong những thay đổi quan trọng là việc hình

thành mạng lưới các chất ngoại bào bao quanh. Mạng lưới này giúp giữ lại chất hữu

cơ không hòa tan từ môi trường nước xung quanh tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh

trưởng, phát triển. Đồng thời nó cũng có vai trò trong việc kiến tạo cấu trúc không

gian 3 chiều đặc trưng cho màng sinh học bằng cách tạo nên một mức độ ổn định,

một sự cân bằng nội môi cho các vi sinh vật.

Bên cạnh đó một vai trò quan trọng của mạng lưới ngoại bào là đem lại khả

năng chống lại các tác nhân kháng khuẩn cho các tế bào sinh sống trong một màng

sinh học. Theo Flemming, vi khuẩn có thể có khả năng kháng đối với các tác nhân

gây hại (chất kháng sinh, chất hoạt động bề mặt...) cao gấp 1000 lần khi gắn kết với

nhau tạo thành màng sinh học so với tế bào sống trôi nổi. Mạng lưới các hợp chất



ngoại bào cũng được ghi nhận có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của kim

loại nặng, các ion và chất độc, giúp tế bào tránh khỏi rất nhiều yếu tố gây tác động

xấu tới vi sinh vật từ môi trường như tia UV, pH, sốc thẩm thấu và sự khô hạn [23].

Những kênh vận chuyển nước nằm xen kẽ trong cấu trúc của màng sinh học,

giữa các vùng bao quanh vi khuẩn lạc được ví như là một hệ thống tuần hoàn.

Chúng hoạt động hiệu quả trong quá trình trao đổi chất với môi trường xung quanh,

do đó làm tăng hiệu quả trong việc sử dụng nguồn dinh dưỡng cũng như loại bỏ các

sản phẩm chuyển hóa có khả năng gây độc hại. Nhờ vậy quá trình chuyển hóa các

chất trong đó cũng mang những đặc trưng khác so với dạng sống tự do [7].

Mặt khác quá trình hình thàng màng sinh học giúp vi sinh vật tận dụng được

nguồn chất hữu cơ bám dính trên bề mặt giá thể cũng như các cơ chất, chất dinh

dưỡng tạo ra từ các loài vi sinh vật khác sống chung.

Một màng sinh học có thể được hình thành do sự hợp tác cùng chung sống

của nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu trúc không gian phức tạp.

Các loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về

dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong biofilm. Chẳng

hạn như những vi sinh vật nằm phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí

cao trong khi những loài nằm phía trung tâm biofilm có xu hướng chịu được nồng

độ oxy thấp (vi hiếu khí).

Khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các loài

vi sinh vật tận dụng được nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hỗ trợ lẫn

nhau theo hướng cùng có lợi trong quá trình chuyển hóa vật chất. Mối quan hệ hợp

tác giữa các loài trong biofilm cũng có ảnh hưởng lớn đến chu trình tuần hoàn của

các nguyên tố trong tự nhiên. Hầu hết các quá trình trong tự nhiên đòi hỏi sự phối

hợp của nhiều nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải

một hợp chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau cùng cư

trú trong biofilm sẽ góp phần thúc đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [35].

Quá trình truyền gen ngang đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự

tiến hóa của các cộng đồng vi sinh vật. Trong đó cơ chế truyền gen phổ biến ở vi



sinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp hợp. Tuy nhiên từ những hiểu

biết rằng hầu hết các vi khuẩn trong tự nhiên định cư dưới dạng biofilm, liên kết với

nhau bởi mạng lưới các chất ngoại bào thì việc tiếp hợp giống như là cơ chế mà nhờ

đó vi khuẩn trong biofilm có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác [35].

1.4.2.2. Ứng dụng của màng sinh học trong xử lý ô nhiễm

Màng sinh học tác động đến rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày.

Do vậy nhiều nghiên cứu hiện nay về màng sinh học có ý nghĩa thực tiễn quan trong

và ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Một số ứng dụng cụ thể

của màng sinh học nói riêng và các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học nói chung

là xử lý ô nhiễm.

Trong công nghiệp lên men tại các bể lên men là nơi giữ lại sinh khối vi sinh

vật. Thông thường các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng được giữ lại trong các

bồn lên men sau mỗi mẻ xử lý. Khi đó để tiếp tục một qui trình mới lại phải bổ sung

thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh

trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Qui trình này gây tốn kém ở khâu

nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành. Ngược lại khi đã được bám

giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới biofilm sinh khối vi sinh vật có thể được giữ

lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý. Những giá thể chất mang có sẵn mạng

lưới biofilm có thể được tái sử dụng ở những lần xử lý tiếp theo mà không phải bổ

sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển [29].

Dầu thô và các sản phẩm từ dầu được loại bỏ bởi các vi khuẩn phân hủy

hydrocarbon. Các vi khuẩn được sử dụng có thể được thả trực tiếp xuống vùng dầu

tràn hoặc có thể thả ở vùng ven bờ mà dầu tràn bị sóng đánh vào. Lý do chính ở đây

là biofilm giúp tăng hiệu quả lọc nước và làm tăng độ kết dính của vi sinh vật với

bề mặt giá thể nơi có dầu tràn. Trong nghiên cứu của Radwan và cộng sự, khi sử

dụng các vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter và dùng một lớp phủ làm giá thể cho vi

khuẩn là tảo, kết quả đã làm giảm được 64-98% n-octadecane và khoảng 38-56%

phenanthrene từ môi trường có chứa 0,03% của hydrocarbon sau 2 tuần [50]. Trong

nghiên cứu của Lê Thị Nhi Công cùng cộng sự, đã phân lập từ biển nhóm vi khuẩn



tạo biofilm và có hoạt tính chuyển hóa các chất hydrocacbon thơm đa vòng như

napthalene, anthracene, pyren [17].

Một trong những ứng dụng của màng sinh học đang được quan tâm liên quan

đến việc làm sạch nguồn nước thải, nguồn nước ngầm bằng công nghệ sinh học.

Ứng dụng này bắt nguồn từ thực tế là bản thân vi sinh vật có khả năng phân hủy các

chất hữu cơ trong môi trường tự nhiên thành các chất vô cơ đơn giản, ít độc. Đã có

nhiều phương pháp xử lý nước thải bao gồm những giai đoạn xử lý mà trong đó

nước thải được lọc qua các biofilm nhằm mục đích tách và đồng hóa các hợp chất

hữu cơ có hại. Một lượng sinh khối lớn các vi sinh vật trong mạng lưới biofilm làm

tăng sự hợp tác trong quá trình trao đổi chất, giúp cho quá trình loại bỏ các chất gây

ô nhiễm trong nước diễn ra hiệu quả hơn so với dạng sống tự do. Quá trình phân

hủy các chất cũng tỏ ra hiệu quả hơn khi thường sản phẩm của chủng này lại là cơ

chất cho một chủng khác trong mạng lưới biofilm, ví dụ trong một mạng lưới

biofilm xử lý nước thải có chứa hợp chất nitơ, ion NH4+ được nhóm Nitrosomonas,

Nitrobacter chuyển hóa thành ion NO3-, rồi tiếp tục được các nhóm vi khuẩn yếm

khí khác sử dụng để cuối cùng tạo thành N2 đi vào khí quyển [37].

Một số nghiên cứu về vi khuẩn anammox có khả năng xử lý nitơ trong nước

thải, đã chỉ ra rằng trong hệ thống các lớp siêu mỏng của lớp màng biofilm của

chủng vi khuẩn Planctomycetes có sự phân bố oxy theo lớp. Các lớp phía trên là

những lớp giàu oxy trong khi các lớp ở phía dưới cùng nằm trong trạng thái kị khí.

Sự phân chia theo lớp màng sinh học sẽ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình ứng

dụng xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ vì giai đoạn nitrate hóa là giai đoạn hiếu

khí, giai đoạn khử nitrate là giai đoạn kị khí [52].

Những nghiên cứu về biofilm trong xử lý nước thải có chứa các hợp chất

nitơ và photpho của Boelee và cộng sự, các nhà nghiên cứu đã sử dụng màng sinh

học của vi tảo để thực hiện nghiên cứu này. Kết quả cho thấy, màng sinh học được

thiết kế dựa vào các vi tảo đã xử lý được nitơ là 1.0 g/m2/ngày và photpho là 0.13

g/m2/ngày [13].



Wellander và cộng sự khi sử dụng một vật liệu bám sinh khối, thả nổi trong

hệ thống xử lý làm giá thể cho các vi sinh vật có khả năng nitrate hóa, đã loại bỏ

được đến 90% lượng nitơ tổng số [64]. Hoilijoki và cộng sự đã nghiên cứu khả năng

nitrate hóa của vi sinh vật thuộc nhóm nitrate hóa. Kết quả cho thấy, quá trình

nitrate hóa chỉ xử lý được 61% amoni khi không có vật liệu bám cho vi sinh vật, và

quá trình nitrate hóa xảy ra hoàn toàn khi có vật liệu bám cho vi sinh vật trong bể

phản ứng bùn hoạt tính [30]. Kết quả này cho thấy, quá trình xử lý nước thải sử

dụng màng sinh học sẽ tăng hiệu quả xử lý khi có mặt vật liệu bám cho vi sinh vật.

Bernet và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng khả năng chuyển hóa nitơ và tạo

màng sinh học của vi sinh vật. Mẫu ban đầu có hàm lượng NH4+ là 250 mg/l, sau 2

ngày, hàm lượng NH4+ giảm xuống chỉ còn 5 mg/l, hiệu quả của quá trình xử lý lên

đến 98% [12].

Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học

trong xử lý ô nhiễm nước thải đặc biệt là nước thải giàu nitơ và photpho hiện nay

chưa nhiều. Các công trình công bố liên quan đến lĩnh vực ứng dụng nghiên cứu

này chưa nhiều, còn thiếu cả về số lượng lẫn chất lượng. Tại Việt Nam tình hình ô

nhiễm nước thải ngày một gia tăng do đó việc cấp thiết là tìm một phương pháp xử

lý hiệu quả là cần thiết. Vì vậy, để phù hợp với mục đích nghiên cứu và ứng dụng

xử lý ô nhiễm tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài phân lập nghiên

cứu các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học và có khả năng xử lý nước

thải giàu hợp chất nitơ, photpho với mục tiêu:

Phân lập các chủng có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có khả năng xử

lý nitơ và photpho

Bước đầu nghiên cứu tối ưu các điều kiện cho sự sinh trưởng phát triển của

các chủng vi sinh vật này để có thể áp dụng trong công nghệ xử lý nước thải giàu

nitơ và photpho



CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

Các mẫu nước thải từ bể Biogas tại Vĩnh Yên – Vĩnh Lộc – Thanh Hóa với

vị trí thu mẫu và được ký hiệu là các mẫu số 1,2, 3:

Nước thải lấy từ tầng giữa bể biogas đã ngưng sử dụng: mẫu số 1

Nước thải lấy từ tầng đáy bể biogas đã ngưng sử dụng: mẫu số 2

Nước thải trực tiếp chảy ra từ bể biogas đang sử dụng: mẫu số 3

Mẫu nước thải rỉ rác ở khu tập trung xử lý rác thải Vạn Phúc – Hà Đông –

Hà Nội với hai vị trí thu mẫu là trong và ngoài khu tập trung xử lý rác thải được ký

hiệu là mẫu số 4 và số 5.

Các mẫu sau khi lấy được chuyển về Phòng thí nghiệm Trọng điểm công

nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên phân tích.

2.2. Hóa chất, thiết bị

2.2.1. Môi trường nuôi cấy

Môi trường Winogradsky được sử dụng để phân lập vi sinh vật trong quá

trình nitrate hóa.

Môi trường Winogradsky 1 Môi trườngWinogradsky 2

(NH4 )2SO4 2 g NaNO2 1 g

MgSO4 0,5 g MgSO4 0,5 g

NaCl 2 g NaCl 0.3 g

K2HPO4 1 g K2HPO4 1 g

CaCO3 0,001 g NaCO3 1 g

FeSO4 0,4 g FeSO4 0,03 g

Thạch 15 g Thạch 15 g

Nước cất 1 lít Nước cất 1 lít

Môi trường acetate mineral medium (AMM) được sử dụng để phân lập vi

sinh vật có khả năng xử lý photpho:

CH3COONa: 3,68 g



Na2HPO4: 28,73 mg

NH4Cl: 57,27 mg

MgSO4: 131,82 mg

K2SO4: 26,74 mg

CaCl2. 2H2O: 17,2 mg

HEPES: 12 g

Dung dịch khoáng: 2 ml

Thạch: 15 g

Nước cất: 1 lit

Dung dịch khoáng gồm:

EDTA: 50 g

FeSO4. 7H2O: 5 g

CuSO4. 5H2O: 1,6 g

MnCl2. 4H2O: 5 g

(NH4)6Mo7O24. 4H2O: 1,1 g

H3BO3: 50 mg

KI: 10 mg

CoCl2. 6H2O: 50 mg

Nước cất: 1 lit

Môi trường Luria Betani (LB) (g/l)

Peptone 10 g

Cao nấm men 5 g

NaCl 10 g

Nước cất 1 lit

Các môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút.

Các hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết cho nghiên cứu.

2.2.2. Máy móc thiết bị

Nồi khử trùng (ALP–Nhật).

Máy lắc (Satorius–Đức).



Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–Ý).

Máy đo mật độ quang học (Bionate–Anh).

Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản).

Cân Kern (Satorius–Đức).

Cân phân tích (Presica, Ý)

Tủ ấm (Memmert–Đức).

Máy ly tâm sigma 3K30 (Sartorius–Đức).

Tủ sấy (Memmert–Đức).

Máy khuấy từ (IKA–Đức).

Kính hiển vi điện tử quét JSM–5421LV (Nhật Bản).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn

Dùng các đĩa petri có chứa môi trường Winogradsky và môi trường AMM

đã khử trùng. Pha loãng các mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3

, 10-4 và 10-5. Dùng

pipet lấy 100 µl dịch mẫu đã pha loãng cho lên mặt thạch. Dùng que cấy gạt đã vô

trùng gạt đều trên mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khô thì dừng lại. Các mẫu

đã cấy gạt cho vào tủ ấm ở 37oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày.

2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng hình thành biofilm

Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi trường nuôi cấy

tĩnh các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể. Phát hiện, quan sát

biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế bào.

Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [46], [47]. Các

chủng vi khuẩn được lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa môi trường LB trong

24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào tại bước sóng 620 nm (OD620) ở vào khoảng

0,2 đến 0,3. Hút 100 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700 µl LB lỏng trong

các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.

Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá

mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp so màu ở bước

sóng 620 nm dịch nuôi cấy vi khuẩn.



Quan sát khả năng hình thành biofilm: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2

lần bằng nước cất khử trùng. Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 1 ml dung dịch tím

kết tinh 1% và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và

quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh.

Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất

khử trùng các tinh thể tím bám trên thành eppenodorf đươc hòa tan trong 1 ml

etanol 70%. Mật độ tế bào trong biofilm được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại

bước sóng 570 nm.

2.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét

(SEM)

Chuẩn bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuôi cấy lắc vi khuẩn vào bình tam

giác chứa 20 ml môi trường LB. Nuôi cấy tĩnh 24 giờ ở 37oC.

Gắn mẫu biofilm lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu.

Rửa nhẹ bằng nước cất khử trùng.

Gắn mẫu lên đế. Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC–1200 trong 5 phút ở

30 mA.

Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi quét điện tử JSM–5421LV (Nhật Bản) tại

phòng chụp Hiển vi điện tử quét – Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu – Trường

Đại học Khoa học Tự Nhiên.

2.3.4. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự hình thành

màng sinh học

Vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học tốt ở những điều kiện khác

nhau. Nhiệt độ, pH không thích hợp sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển

của vi sinh vật và khả năng tạo màng sinh học của chúng.

2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy

Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong

môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC.

Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi

khuẩn nghiên cứu.



2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong

môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở các pH: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9. Sau 1 ngày nuôi

cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của chủng vi

khuẩn nghiên cứu.

2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram.

Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và

Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm

thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu vi khuẩn được nhuộm bằng

tím kết tinh sau đó được xử lý bằng iôt để tăng độ giữ màu. Sau đó được tẩy màu

bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh

và iot được giữ lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất

mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Sự xử lý bằng cồn có thể loại lipit khỏi thành

Gram (-) đủ để làm tăng hơn kích thước của lỗ. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đã loại

bỏ phức chất màu tím của tím kết tinh-iôt. Khi nhuộm lại bằng safain thì vi khuẩn

có màu hồng [1].

Phương pháp tiến hành:

Tạo vết bôi bằng cách nhỏ một giọt nước lên lam kính sạch, đốt nóng que

cấy trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hoặc

trong ống giống, đưa vào giọt nước, cố định vết bôi bằng cách hơ khô trên

ngọn lửa đèn cồn.

Cho một giọt tím kết tinh bao phủ hoàn toàn vết bôi, nhuộm trong thời

gian 1 phút. Sau đó rửa bằng nước cất và thấm khô.

Nhuộm với lưugôn (chứa KI và I2) tương tự như với tím kết tinh.

Rửa bằng cồn trong 30 giây. Thấm khô.

Nhuộm safain trong 2 phút. Rửa bằng nước cất, thấm khô.

Soi trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 100 lần.

Quan sát kết quả và đưa ra kết luận.



2.3.6. Phương pháp sử dụng kit APi

Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng

vi khuẩn, chúng tôi đã tiến hành thử với Kit thử APi 20NE của hãng BioMérieus.

Hóa chất và thuốc thử cần thiết được cung cấp cùng với bộ kit.

Kết quả được ghi lại và phân loại với phần mềm của hãng BioMérieus .

2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ

Mỗi chủng được nuôi lắc ở 37°C trong các khoảng thời gian từ 0, 5, 10, 15,

20 ngày. Môi trường nuôi lắc là dung dịch môi trường Winogradsky có bổ sung 1%

pepton [34].

2.3.7.1. Phương pháp phân tích nitơ tổng số

Nguyên tắc của việc phân tích nitơ tổng số là chuyển toàn bộ nitơ ở cả dạng

vô cơ và hữu cơ về dạng nitrate nhờ chất oxi hóa mạnh sau đó tiến hành so màu ở

bước sóng 220 nm [9].

Phương pháp làm như sau:

Xử lý mẫu

Lấy 50 ml mẫu vào bình chịu nhiệt 100 ml

Thêm 10 ml dd A (dd A : 4 g NaOH + 3 g K2S2O8)/100ml nước cất.

Nút chặt và đun trong nồi khử trùng ở 120°C trong 30 phút.

Sau đó lấy 30 ml mẫu vào bình định mức 50 ml, lọc loại bỏ vẩn đục.

Thêm 6,5 ml HCl (HCl:H2O = 1:15 về thể tích).

Lắc và định mức tới 50 ml bằng nước khử ion.

Lập đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn gồm 4 điểm bằng bình định mức 50ml

Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,722 g KNO3 bằng nước cất, sau đó

định mức lên 1000 ml, đựng trong chai màu nâu, bảo quản trong tủ lạnh.

Dung dịch chuẩn 10 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc ra 10 lần

Cách tiến hành: lấy thể tích dung dịch chuẩn theo tỷ lệ vào 4 bình định

mức, thêm vào mỗi bình 0,5 ml dung dịch HCl, định mức tới 50 ml bằng

nước cất, lắc đều. Sau đó đo ở bước sóng 220 nm



Với mẫu sau khi thực hiện bước xử lý mẫu xong cũng tiến hành tương tự

như bước lập đường chuẩn

Tính toán kết quả

mgN- T = mgN- T đo 2

Chú ý: giới hạn của phép đo là < 3 mg/l, nếu hàm lượng nitơ trong mẫu

nằm quá giới hạn thì phải pha loãng mẫu .

2.3.7.2. Phương pháp phân tích hàm lượng amoni (NH4+)

Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng vi khuẩn được phân tích dựa trên

nồng độ amoni trong môi trường theo các khoảng thời gian nuôi.

Nguyên tắc:

Phản ứng của NH4+ và hypochloride với sự có mặt của xúc tác phenol tạo

thành hợp chất indophenol blue. So màu ở bước sóng 640 nm [9].

Chuẩn bị thuốc thử:

Hypochloride: 15 g NaOH khan + 500 ml NaClO 0.1% sau đó định mức

đến 1000ml bằng nước khử ion.

Dung dịch phenol- sodium nitroprusside: 5 g phenol (C6H5OH) + 0.025 g

nitroprusside (Na2[Fe(CN)5.NO].2H2O), định mức đến 500 ml bằng nước khử

ion.

Dung dịch chuẩn:

Dung dịch chuẩn được lấy từ NH4Cl tinh khiết sấy ở 105°C trong 3 giờ, đẻ

nguội trong bình hút ẩm. Cân 3,819 g NH4Cl, hòa tan và định mức đến 1000 ml

bằng nước khử ion. Dung dịch có nồng độ N- NH4+ là 1 g/l. Chuẩn bị dung dịch có

nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dung dịch gốc.

Lập đường chuẩn: tương ứng với các nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 mg/l.

Lấy 5 ml mẫu vào ống thủy tinh.

Thêm 3 ml thuốc thử phenol- sodium nitroprusside.

Lắc trên máy rung 30 giây.

Thêm 3 ml hypochloride.

Lắc trên máy rung 30 giây.



Điều nhiệt ở 37°C trong 25 phút.

Đo ở bước sóng 640 nm.

Với mẫu cũng làm các bước tương tự như lập đường chuẩn.

2.3.7.3. Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite

Khả năng chuyển hóa nitrite (NO2-) thành nitrate (NO3

-) của các chủng được

đánh giá thông qua sự giảm nồng độ nitrite trong môi trường nuôi cấy.

Nguyên tắc:

Phản ứng giữa nitrite và hỗn hợp sulfanylamide với naphtylendiamine tạo

phức màu hồng ở pH 2. So màu ở bước sóng 540 nm [9].


Dung dịch sunfanylamide: cân 0,6 g NH2C6H4SO2NH2 hòa tan trong 50 ml

nước cất nóng, làm lạnh, thêm 40 ml HCl đặc và định mức đến 100 ml.

Dung dịch naphtylendiamine dihydrochloride: cân 0.1 g

C10H7NHCH2NH2.2HCl hòa tan trong 100 ml nước cất, đựng trong chai màu

nâu, bảo quản 4oC.

Lập đường chuẩn:

Chuẩn bị các ống thí nghiệm.

Hòa tan 1,23 g NaNO2 trong 1000 ml nước cất. Dung dịch gốc có nồng độ

N- NO2 là 250 mg/l.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/l bằng cách pha loãng dd gốc.

Lập các nồng độ khác nhau từ 0; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 mg/l.

Lấy 10 ml mỗi nồng độ vào các ống nghiệm khác nhau.

Thêm 0,2 ml NH2C6H4SO2NH2.

Trộn đều và giữ yên trong 5 phút.

Thêm 0,2 ml C10H7NHCH2NH2.2HCl.

Trộn đều và giữ yên trong 10 phút.

So màu ở bước sóng 540 nm.

Với các dung dịch mẫu làm tương tự như lập đường chuẩn.



2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng xử lý photpho

Khả năng tích lũy photpho của các chủng được đánh giá thông qua sự giảm

nồng độ của PO4- trong môi trường nuôi cấy theo thời gian.


Chuẩn bị dung dịch (NH4)6Mo6

Hòa tan 7,27 g amonium molydat (NH4)6Mo7O2.4H2O (sấy ở 105oC trong 3

giờ) vào 150 ml nước cất.

Hòa tan 0,0945 g Kaly antimon tactrat (C8H8O12K2.Sb2O2.H2O) trong 50ml

nước cất.

96 ml H2SO4 đặc vào bình chứa 600 ml nước cất sau đó làm lạnh đến nhiệt

độ phòng.

Trộn các dung dịch trên với nhau

Thêm vào 10 g amonium amidosulfat (NH4OSO2NH2) vào hỗn hợp dung

dịch trên

Định mức đến 1000 ml

Chuẩn bị dung dịch C6H8O6: Hòa tan 1.8 g C6H8O6 trong 25 ml nước, sử dụng

trong vòng 2 tuần.

Lập đường chuẩn

Chuẩn bị dãy các dung dịch gồm 5 điểm vào 5 ống nghiệm có chia vạch

Dung dịch gốc 100 mg/l: hòa tan 0,4394g KH2PO4 trong 100 ml nước cất.

Dung dịch chuẩn: pha loãng dung dịch gốc 20 lần ta được dung dịch chuẩn 5

mg/l. Lấy dung dịch chuẩn theo tỷ lệ nồng độ sau:

Nồng độ (mg/l) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Vdd chuẩn (ml) 0 2 4 6 8 10

Sau khi tiến hành lấy dung dịch chuẩn và lấy mẫu vào ống nghiệm định mức

tới 40 ml

Thêm 1 ml dung dịch C6H8O6

Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6

Định mức tới 50 ml



Điều nhiệt trong khoảng từ 30 đến 40oC trong thời gian từ 10 đến 20 phút

Đo mẫu tại bước sóng 710 nm

2.3.8.1. Phương pháp phân tích photpho tổng

Nguyên tắc: Amonium molydat và kali antimon tatrat phản ứng với PO43-

trong môi trường axit trung bình tạo thành axit photpho molipdic có màu xanh đậm

đo màu ở bước sóng 710 nm trên máy quang phổ UV – VIS [9].

Xử lý mẫu:

Lấy 10 ml mẫu vào bình có nút 100 ml

Thêm 5 ml K2S2O8 (4 g K2S2O8 trong 100 ml nước)

Thêm 1 ml H2SO4 30%

Đun ở 120oC trong 30 phút

Sau đó chuyển toàn bộ mẫu đã đun vào trong bình định mức tới 50 ml bằng

nước cất. Lấy 10 ml mẫu này cho vào bình định mức 50 ml

Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml


Định mức tới 50 ml bằng nước cất.


Đo mẫu tại bước sóng 710 nm

Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả.

Tính toán kết quả

C= Cđo 50/10 50/10 (mg/l)

Trong đó: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)

Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).

2.3.8.2. Phương pháp phân tích hàm lượng Ortho photphate (PO43-)

Lấy 10 ml mẫu cho vào bình định mức 50 ml

Thêm 5 ml dung dịch (NH4)6Mo6 vào ống và chuẩn về 40 ml


Định mức tới 50 ml bằng nước cất.




Đo tại bước sóng 710 nm

Mẫu đối chứng được làm tương tự để đối chiếu lại kết quả.

C= Cđo 50/10 (mg/l)

Trong đó: C: nồng độ dung dịch mẫu thực (mg/l)

Cđo: nồng độ dung dịch mẫu đo từ ống nghiệm (mg/l).

2.3.9. Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA

Các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý nitơ và photpho được phân tích

trình tự gen 16S rRNA để xác định cây phân loại.

Trình tự gen đoạn 16S rRNA được đọc trên máy đọc trình tự tự động ABI

PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.

Kết quả phân tích trình tự 16S rRNA được so sánh với trình tự đoạn gen

tương tưng của các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phương pháp Clustal X.

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên phần mềm njplot.

2.3.10. Phương pháp thống kê sinh học

Các kết quả thu được được xử lý bằng thông kê sinh học thông qua các phần

mềm Excel, Microsoft Word để đảm bảo độ tin cậy.



CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3. 1. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ.

3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ và có khả năng

hình thành màng sinh học

3.1.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ

Các mẫu sau khi đưa về phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích hàm

lượng nitơ và photpho ban đầu có trong các mẫu. Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.1. Hàm lượng thành phần nitơ và photpho trong mẫu phân tích.

Mẫu

Hàm lượng các hợp chất nitơ trong

mẫu phân lập (mg/l)

Hàm lượng

photpho tổng

(mg/l) Nitơ tổng NH4+ NO2

-

1 140,74 ± 2,1 71,58 ± 1,43 5,31 ± 0,032 16,97 ± 1,02

2 111,93 ± 1,68 78,42 ± 2,35 1,44 ± 0,009 18,76 ± 1,13

3 83,12 ± 1,25 68,26 ± 1,36 1,01 ± 0,006 46,05 ± 2,76

4 71,60 ± 0,71 65,14 ± 1,30 2,59 ± 0,016 10,68 ± 0,64

5 100,41 ±1,50 75,10 ± 1,50 7,33 ± 0,044 31,33 ± 1,88

Kết quả phân tích mẫu ban đầu cho thấy, các mẫu ban đầu đều có hàm lượng

nitơ và photpho cao hơn nhiều so với mức trung bình và quy định cho phép đối với

nước thải (Bảng 3.1).

Từ những mẫu thu được, chúng tôi đã phân lập được 65 chủng vi sinh vật có

khả năng phát triển trên môi trường Winogradsky. Trong đó, 41 chủng có khả năng

phát triển trên môi trường Winogradsky 1, 24 chủng có khả năng phát triển trên môi

trường Winogradsky 2. Kết quả phân lập ở bảng 3.2 cho thấy trên hai môi trường

Winogradsky phân lập được các chủng từ nước thải bể biogas nhiều hơn so với các

mẫu lấy ở khu tập trung rác thải. Số lượng các chủng thu được ở tầng giữa bể

biogas đang sử dụng và đã không sử dụng nhiều hơn ở tầng đáy bể biogas đã ngưng

sử dụng. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu cho rằng các chủng vi

khuẩn có khả năng chuyển hóa NH4+ và NO2

- là những vi khuẩn hiếu khí [69], [71].



Bảng 3.2. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ

Địa điểm lấy mẫu

Số chủng phân lập

Ký hiệu chủng Môi trường

W1

Môi trường

W2

Nước thải

bể biogas

Tầng giữa bể biogas

đã ngưng sử dụng 11 15

Từ B11.1 đến B11.11

Từ B21.1 đến B21.15

Tầng đáy bể biogas đã

ngưng sử dụng 4 0 Từ B12.1 đến B12.4

Tầng giữa bể biogas

đang sử dụng 13 9

Từ B13.1 đến B13.13

Từ B23.1 đến B23.9

Nước thải

khu tập

trung rác

thải

Ngoài bãi rác 5 0 VP1.1, VP1.4, VP1.5,

VP1.8, VP1.9,

Trong bãi rác 8 0

VP2.2, VP2.3, VP2.4,

VP2.5, VP2.7, VP2.9,

VP2.10, VP2.11

Các chủng phân lập trên môi trường Winogradsky 1 (Hình 3.1A) có đặc

điểm chủ yếu là khuẩn lạc tế bào tròn hay có hình tia, có màu trắng đục hay vàng.

Các chủng phân lập trên môi trường Winogradsky 2 khuẩn lạc chủ yếu giống trên

môi trường Winogradsky 1, có hình tia hay tròn, màu trắng đục (Hình 3.1B).

Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập trên môi trường Winogradsky 1(A) và

Winogradsky 2 (B)



3.1.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập

Bằng phương pháp nhuộm với tím kết tinh bước đầu đã chúng tôi đánh giá

được khả năng hình thành màng sinh học của 28 chủng vi khuẩn phân lập trên môi

trường Winograky 1 từ mẫu nước thải ở bể biogas. Kết quả cho thấy hầu hết các vi

khuẩn phân lập được đều có khả năng hình thành biofilm, trong đó các chủng

B11.8, B11.11 và B13.1 có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất với số OD

đo ở bước sóng 570 nm lần lượt tương ứng là 1,824; 2,775 và 2,235 (Hình 3.2).


Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải thu từ bể biogas

Khi tiến hành đánh giá 13 mẫu thu được ở khu tập trung rác thải Vạn Phúc

bằng phương pháp tương tự, chúng tôi thu được hai chủng VP1.1 và VP2.11 là hai

chủng có chỉ số OD đo ở bước sóng 570 nm cao hơn các chủng còn lại với số đọc

tưng ứng là 4,65 và 3,24 (Hình 3.3).

Từ những kết quả thu được như trên, chúng tôi đã tuyển chọn được 5 chủng

có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất và có khả năng phát triển trên môi

trường Winogradsky 1 là : VP1.1, VP2.11, B11.8, B11.11, B13.1.




Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải khu tập trung rác thải

Hình 3.4. Khả năng tạo hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường

Winogradsky 2 được phân lập ở bể biogas

Đối với các chủng phân lập được trên môi trường Winogradsky 2, chúng tôi

cũng tiến hành các thí nghiệm tương tự để đánh giá khả năng hình thành biofilm.

Kết quả cho thấy, trong 24 chủng thu được, 3 chủng B21.1, B21.10 và B23.2 có khả



năng tạo màng biofilm tốt nhất. Chúng tôi lựa chọn 3 chủng này cho các nghiên cứu

tiếp theo để phân tích khả năng chuyển hóa NO2- (Hình 3.4).

3.1.2. Khả năng chuyển hóa nitơ

8 chủng vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất được

chúng tôi chọn để thử hoạt tính chuyển hóa các hợp chất nitơ. Trong đó 5 chủng

B11.8, B11.11, B13.1, VP1.1 và VP2.11 được thử khả năng chuyển hóa amoni, 3

chủng B21.1, B21.10 và B23.2 được thử khả năng chuyển hóa nitrite.

3.1.2.1. Khả năng chuyển hóa amoni

Khả năng chuyển hóa amoni được đánh giá thông qua hàm lượng NH4+ trong

mẫu nghiên cứu theo thời gian. Chủng vi sinh vật nào có khả năng chuyển hóa

amoni thì hàm lượng NH4+ sẽ giảm đi trong quá trình nghiên cứu. 5 chủng B11.8,

B11.11, B13.1, VP1.1 và VP2.11 được nuôi lắc trong môi trường Winogradsky 1,

sau mỗi khoảng thời gian nghiên cứu, lấy mẫu phân tích.

Hình 3.5. Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng nghiên cứu.

Với hàm lượng amoni trong mẫu ban đẫu là 450 mg/l. Kết quả (Hình 3.5)

cho thấy, sau 5 ngày, bốn chủng B11.8, B13.1, VP1.1 và VP2.11 nồng độ NH4+

giảm đi không nhiều, trong khi đó, với chủng B11.11, nồng độ NH4+ giảm 58,93%

so với mẫu ban đầu. Nồng độ NH4+ tiếp tục giảm đi, sau 10, 15 ngày, hàm lượng

trong mẫu của chủng B11.8 giảm đi 12,2%, B13.1 giảm đi 28,53%, VP1.1 giảm đi



14,44% và VP2.11 giảm đi 10,52%. Sau 20 ngày, chủng B11.11 hàm lượng NH4+

có trong mẫu đã giảm đi 85,21%. Trong khi đó, 4 chủng còn lại hàm lượng NH4+

trong dung dịch chỉ giảm đi vào khoảng từ 20-50% so với mẫu ban đầu. Từ kết quả

trên cho thấy chủng B11.11 có khả năng chuyển hóa amoni tốt nhất. Do vậy, chúng

tôi đã lựa chọn chủng B11.11 cho các nghiên cứu tiếp theo của mình.

3.1.2.2. Khả năng chuyển hóa nitrite

Với các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường Winogradsky 2, chúng tôi

cũng tiến hành các thí nghiệm tương tự. Khả năng chuyển hóa nitrite được đánh giá

thông qua hàm lượng NO2- giảm theo thời gian nghiên cứu. 3 chủng B21.1, B21.10,

B23.2 được nuôi lắc trong môi trường Winogradsky 2.

Hình 3.6. Khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng nghiên cứu

Với hàm lượng nitrite trong mẫu ban đầu là 80 mg/l. Kết quả hình 3.6 cho

thấy cả ba chủng nghiên cứu đều có khả năng chuyển hóa nitrite, sau 5 ngày, nồng

độ NO2- trong dịch nuôi lắc của chủng B21.10 giảm đi 75.23% so với mẫu ban đầu,

tương ứng, hai chủng B23.2 và B21.1 là 69.07% và 7.26%. Chủng B21.1 có khả

năng chuyển hóa NO2- nhưng khả năng chuyển hóa chậm hơn, sau 20 ngày hàm

lượng NO2- trong dung dịch giảm đi 75% so với mẫu ban đầu trong khi hai chủng

B21.10 và B23.2 đã chuyển hóa gần như hoàn toàn lượng NO2- có trong mẫu lắc.



Kết quả, sau 20 ngày hai chủng B21.10 và B23.2 đã chuyển hóa được trên 97%

lượng NO2- có trong mẫu. Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn ra hai chủng

B21.10 và B23.2 cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.

3. 2. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý photpho.

3.2.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng xử lý photpho và có khả năng

hình thành màng sinh học.

3.2.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý photpho

Mẫu nước thải từ bể biogas và nước thải khu xử lý rác thải khi phân lập trên

môi trường AMM thu được các khuẩn lạc chủ yếu màu trắng đục, hơi vàng, khuẩn

lạc tròn (Hình 3.7). Dựa vào kích thước, màu sắc và hình dạng, chúng tôi đã thu

được 21 chủng với ký hiệu như bảng 3.3.

Hình 3.7. Một số khuẩn lạc phân lập trên môi trường AMM: mẫu khu vực biogas

(A) và khu tập trung rác thải (B)

Kết quả phân lập ở bảng 3.3 cho thấy, câc chủng phân lập ở tầng giữa bể

biogas cao hơn so với tầng đáy, trong khu vực tập trung rác thải cao hơn so với bên

ngoài khu vực.



Bảng 3.3. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho

Địa điểm thu mẫu Mẫu thu được Ký hiệu

Nước thải từ bể biogas 13 chủng

Từ A1.1 dến A1.8

Từ A2.1 đến A2.2


Nước thải từ khu tập trung

rác thải 8 chủng



3.2.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập

Tiến hành các thí nghiệm tương tự về xác định khả năng hình thành màng

sinh học của các chủng phân lập từ môi trường AMM. Kết quả trên hình cho thấy,

chủng A4.2, A5.1, A5.2, A5.3 là bốn chủng có khả năng hình thành màng sinh học

tốt nhất (Hình 3.8). Do vậy chúng tôi đã lựa chọn 4 chủng này cho các nghiên cứu

tiếp theo.

Hình 3.8. Khả năng hình thàng màng sinh học của các chủng vi sinh vật có khả

năng tích lũy photpho



3.2.2. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu.

Đánh giá khả năng giảm hàm lượng photpho, chúng tôi đánh giá thông qua

hàm lượng photphate tích lũy trong vi sinh vật. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy lắc các

chủng nghiên cứu trong môi trường AMM trong thời gian 10 ngày ở các điều kiện

tối ưu về pH và nhiệt độ. Để đánh giá khả năng tích lũy photpho của vi sinh vật,

chúng tôi phân tích, đánh giá thông qua hàm lượng photphate còn lại trong môi

trường.

Hình 3.9. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường với

hàm lượng photpho 6mg/l

Kết quả hình 3.9 cho thấy, với hàm lượng photpho trong dung dịch AMM

ban đầu là 6mg/l, các chủng vi sinh vật đều có khả năng tích lũy photpho, sau 10

ngày, lượng photpho trong dung dịch nuôi lắc gần như không còn được phát hiện.

Các chủng A5.1, A5.2 và A5.3 sau 5 ngày đã không còn phát hiện thấy photphate có

trong dung dịch nuôi cấy, tương ứng với chủng A4.2 là 7 ngày.

Từ kết quả như vậy, chúng tôi đã tiến hành tăng hàm lượng photphate trong

môi trường nuôi cấy lên 18mg/l (Hình 3.10). Kết quả phân tích cho thấy, sau 5

ngày, hàm lượng photphate trong dịch nuôi của 2 chủng A4.2 và A5.1 giảm đi cao

nhất trong khoảng 25%. Hàm lượng photphate tiếp tục giảm sau 5, 7 và 10 ngày.



Sau 10 ngày, chủng A4.2 có hàm lượng photphate giảm đi lớn nhất, lượng

photphate giảm đi là 39,32% so với dịch mẫu ban đầu. Các chủng A5.1, A5.2 và

A5.3 hàm lượng photphate giảm đi trong dịch mẫu lần lượt là 34,88%, 21,78% và

17,95%. Từ các kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn chủng A4.2 cho các nghiên cứu

tiếp theo. Đây là những kết quả bước đầu cho nghiên cứu, ứng dụng màng biofilm

vào xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho từ các chủng vi sinh vật phân lập tại

Việt Nam.

Hình 3.10. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường

hàm lượng photpho18mg/l

3. 3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nghiên cứu

3.3.1. Khả năng tạo hình thành màng sinh học trên một số giá thể

Bốn chủng có khả năng chuyển hóa hợp chất chứa nitơ và photpho tốt nhất là

B11.11, B21.10, B23.2 và A4.2 được chúng tôi xác định khả năng tạo biofilm trên

một số giá thể, chất mang.

Để xác định khả năng hình thành màng sinh học trên giá thể nhựa (ống

eppendorf) chúng tôi dựa vào phương pháp nhuộm tím kết tinh.

Kết quả nhuộm tím kết tinh trên ống eppendorf cho thấy cả 4 chủng đều tạo

biofilm tốt trên giá thể nhựa, trong đó chủng B11.11 có khả năng tạo biofilm tốt



nhất. Điều này cho thấy các chủng này ngoài khả năng tạo biofilm trong môi trường

dịch thể thì cũng có thể tạo biofilm trên các giá thể khác nhau (Hình 3.11, 3.12).

Kết quả nảy tương tự như kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự

trước đây về các chủng vi sinh vật tạo màng phân lập tại các khu vực ô nhiễm làng

nghề hay rỉ rác [26], [32] .

Hình 3.11. Khả năng hình thành biofilm trên giá thể nhựa ống eppendorf.

Bằng phương pháp quan sát màng biofilm nổi, chúng tôi nhận thấy các

chủng khác nhau thì khả năng hình thành màng sinh học khác nhau trong môi

trường lỏng, chủng B21.10 và A4.2 màng sinh học trải đều khắp bề mặt của môi

trường lỏng, trong khi đó, màng sinh học của hai chủng B11.11, B23.2 không tập

trung toàn bộ trên bề mặt môi trường (Hình 3.12).

Hình 3.12. Màng biofilm nổi của chủng B11.11, B21.10, B23.2, A4.2.



3.3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu

Để bước đầu nghiên cứu, phân loại các chủng có khả năng xử lý nước thải

giàu nitơ, photpho, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi

quang học có độ phóng đại 1000 lần.

Hình 3.13. Ảnh nhuộm Gram các chủng nghiên cứu ở độ phóng đại 1000 lần.

Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi

thấy, các chủng nghiên cứu đều có hình que, xếp thành chuỗi (Hình 3.13).

Chúng tôi cũng tiến hành quan sát hình thái màng sinh học và tế bào vi

khuẩn qua kính hiển vi điện tử quét JSM – 5421LV ở độ phóng đại 10000 lần.

Hình 3.14. Cấu trúc hiển vi màng biofilm của chủng nghiên cứu ở độ phóng đại

10000 lần

Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 10000 lần, nhận

thấy các tế bào có hình dạng khác biệt nhau rất rõ và màng sinh học tạo thành cũng

có sự khác biệt. Chủng B11.11 có màng sinh học dày, lớp EPS ngoại bào bao xung

quanh tế bào, khi thu nhận thì nhận thấy lớp màng khá nhầy, rất dai, lớp màng

không đồng đều trên bề mặt, màu vàng nhạt. Chủng B21.10 lớp màng sinh học



tương đối đồng nhất, không gian ba chiều phức tạp, nhiều lớp cuộn vào nhau, khi

thu nhận thì biofilm dễ bị cắt nhỏ hơn của chủng B11.11, có màu trắng đục. Chủng

B23.2, màng sinh học hình thành lớp rất mỏng, trong suốt, sần sùi. Chủng A4.2 các

tế bào xếp sít nhau, hình trực khuẩn, khi thu nhận biofilm dễ bị phân mảnh, đứt gẫy,

màu trắng đục (Hình 3.14).

3.3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự hình thành màng sinh

học

Quá trình hình thành màng sinh học trải qua nhiều giai đoạn và chịu ảnh

hưởng của nhiều yếu tố môi trường. Trong đó nhiệt độ và pH là hai yếu tố ảnh

hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật lớn nhất.

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng trong sự phát triển của vi sinh

vật, sự hình thành màng sinh học, yếu tố nhiệt độ đóng một vai trò không thể thiếu

trong sự hình thành màng. Khi tiến hành nghiên cứu màng sinh học ở các điều kiện

nhiệt độ khác nhau của vi khuẩn Salmonella enteritidis, Giaouris và cộng sự đã chỉ

ra khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất của vi khuẩn này khá thấp, chỉ là

20oC [24]. Trong nghiên cứu của Di Bonaventura cùng cộng sự, vi khuẩn

Stenotrophomonas maltophilia có khả năng tạo màng sinh học tốt nhất ở 32oC [20].

Những nghiên cứu này cho thấy mỗi chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh

học tốt nhất ở các nhiệt độ khác nhau.

Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng hình thành màng sinh học



Kết quả thử khả năng hình thành màng sinh học ở các điều kiện nhiệt độ

khác nhau (Hình 3.15) cho thấy, hai chủng B11.11 và B21.10 có khả năng hình

thành màng sinh học tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ là 37oC, chủng B23.2 có khả năng

hình thành màng sinh học tốt trong dải nhiệt độ khá rộng từ 37 đến 50oC, điều kiện

nhiệt độ tốt nhất cho sự hình thành màng sinh học của chủng A4.2 là 50oC.

Khi nghiên cứu các điều kiện cho vi sinh vật phát triển thì một trong những

yếu tố được quan tâm là giá trị pH. Ở các pH khác nhau, mức độ sinh trưởng của vi

sinh vật cũng rất khác nhau và điều này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của vi

sinh vật và hình thành màng sinh học của bản thân chúng. Vi sinh vật chỉ có thể

phát triển trongmột khoảng pH nhất định, khi pH môi trường nằm ngoài khoảng cho

phép, vi sinh vật sẽ phát triển yếu đi hoặc có thể bị ức chế hoàn toàn. Các chủng vi

sinh vật khác nhau có khoảng pH phát triển khác nhau do đó ảnh hưởng tới khả

năng tạo màng sinh học.

Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng hình thành màng sinh học

Kết quả thử khả năng tạo màng của các chủng nghiên cứu cho thấy, hầu hết

các chủng đều có khả năng tạo màng sinh học tốt ở điều kiện pH kiềm khoảng 7,5,

chủng A4.2 có khả năng tạo màng tốt ở pH 7, chủng B21.10 có khả năng tạo màng

sinh học tốt ở pH 8 (Hình 3.16). Theo nghiên cứu của Wulff và cộng sự [65] đối với

sự phát triển và hình thành màng sinh học của vi khuẩn Xylella fastidiosa nhận thấy



rằng sự hình thành màng sinh học chịu ảnh hưởng lớn của giá trị pH, với vi khuẩn

này, khả năng hình thành màng sinh học tốt nhất ở pH 6.8, và bị ức chế hình thành

màng ở pH dưới 6.6. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu, các chủng phân lập từ

nước thải bể biogas và khu tập trung xử lý rác thải thường phát triển tốt ở pH trong

khoảng từ 7 đến 8.5 [10].

3.3.4. Khả năng chuyển hóa một số chất trong bộ kit APi

Để nghiên cứu một số tính chất về mặt sinh hóa, chúng tôi đã sử dụng kit thử

APi. Các chất trong bộ kit dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các vi sinh vật là các

nguồn cacbon khác nhau (D-glucose, L-arabinose, D- mannose, D- mannitol, N-

acetyl- glucosamine…), urea, L-tryptophan, L-arginine, gelatine…Kết quả được

trình bày ở bảng 3.4:

Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh hoá của các chủng theo kit APi (BioMérieus)

Ký hiệu chất

kiểm tra Các chất chuyển hóa

Các chủng vi sinh vật nghiên cứu

B11.11 B21.10 B23.2 A4.2

NO3 KNO3 + + + +

TRP L- tryptophan - - - -

ADH L- arginine + - + +

URE Urea - - + -

ESC Esculin ferric citrate + + + +

GEL Gelatine + + - +

PNPG 4-nitrophenyl β D –

galactopyranoside + + + +

GLU D- glucose + + + +

ARA L- arabinose - + - +

MNE D- mannose + + + +



Chú thích (-): phản ứng âm tính, (+) phản ứng dương tính

Với kí hiệu dấu (-) biểu thị cho phản ứng âm tính, dấu (+) biểu thị cho phản

ứng dương tính với sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ. Kết quả cho thấy, các

chủng B11.11, B21.1, B23.2 và A4.2 có thể sử dụng nhiều cơ chất khác nhau, đặc

biệt chủng A4.2 và B23.2 có khả năng sử dụng hầu hết các loại đường, chủng

B11.11 không có khả năng sử dụng L – arabinose, chủng B21.10 không sử dụng

được L – arabinose, N – acetyl – glucosamine và D – mantose (Bảng 3.4). Khi tiến

hành phân tích trên phần mềm của BioMérieus, chủng B23.2 có khả năng thuộc chi

Pseudomonas.

Với khả năng sử dụng các loại đường khác nhau, các chủng vi sinh vật này

có khả năng sử dụng nhiều nguồn cacbon thay thế khác nhau, việc thay thế nguồn

cacbon từ vật liệu có chi phí và giá thành cao sang có chi phí phù hợp sẽ giúp cho

quá trình đưa sản phẩm vào ứng dụng rộng rãi hơn. Các chủng nghiên cứu xử lý

nước thải có chứa nitơ đều có khả năng khử NO3- cho thấy phù hợp với nghiên cứu,

chủng A4.2 là chủng có khả năng xử lý photpho, tuy nhiên, kết quả trên bảng cho

thấy, chủng này cũng có khả năng khử NO3-, theo nghiên cứu của Jorgensen và

Pauli cho rằng các chủng có khả năng tích lũy photphate cũng có khả năng chuyển

hóa nitơ [33].

MAN D- mannitol + + + +

NAG N- acetyl- glucosamine + + - +

MAL D- mantose + + - +

GNT Potassium gluconate - - + +

CAP Axit capric - - + -

ADI Axit Adipic - - - -

MLT Axit Malic + - + +

CIT Trisodium Citrate - - + +

PAC Axit phenyl acetic - + - -



3.3.5. Trình tự 16S rRNA và cây phát sinh chủng loại

Chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự gen mã hóa 16S rARN. Kết quả giải

trình tự gen 16S rARN được so sánh với các trình tự gen 16S rARN trong ngân

hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X. Trên cơ sở đó, chúng tôi xây dựng

cây chủng loại phát sinh dựa vào phần mềm njplot

Trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng B11.11 tương đồng 99,9 %

(1399/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus

licheniformis_X68416; tương đồng 99,6 % (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN

của vi khuẩn Bacillus sonorensis_AF302118; tương đồng 99,4 % (1391/1400 bp)

với đoạn 16S rARN của vi khuẩn Bacillus aerius_AJ831843 (Hình 3.17). Theo

nghiên cứu của Kim và cộng sự, cùng với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và

Bacillus cereus, Bacillus licheniformis là một trong các chủng thuộc chi Bacillus có

khả năng nitrate hóa và khử nitrate trong điều kiện hiếu khí, và lượng amoni đã

chuyển sang khí N2 là 33% sau 4 giờ nuôi cấy [34].

Hình 3.17. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B11.11

Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus altitudinis_AJ831842

99

Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus safensis_AF234854

99

100Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416 B11.11

100

Bacillus sonorensis_AF302118

63

Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus siamensis_GQ281299

Bacillus amyloliquefaciens_AB255669 Bacillus methylotrophicus_EU194897

57

Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus mojavensis_AB021191 Bacillus subtilis_AB042061

Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF

54

78

88

52

81

100

97

100

99

0.01




Kết quả giải trình tự gen 16S rARN của chủng B21.10 tương đồng 99,8%

(1397/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens_AB255669 và Bacillus methylotrophicus_EU194897; tương

đồng 99,6% (1395/1400 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus

vallismortis_AB021198; tương đồng 99,6% (1394/1400 bp) với đoạn gen 16S

rARN của vi khuẩn Bacillus siamensis_GQ281299 (Hình 3.18). Trong nghiên cứu

của Zhang cùng cộng sự, Bacillus methylotrophicus có khả năng chuyển hóa cả

NH4+ và NO2

- thành khí N2O với hiệu suất tương ứng là 51,58 và 5,81 mg/l/ngày

[68].

Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 Bacillus altitudinis_AJ831842

99

Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus safensis_AF234854

99

100Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus sonorensis_AF302118

100

Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus mojavensis_AB021191

Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970 Bacillus subtilis_AB042061

77

Bacillus vallismortis_AB021198

Bacillus amyloliquefaciens_AB255669 Bacillus siamensis_GQ281299

Bacillus methylotrophicus_EU194897

B21.10

50

8089

79

6880

100

97

100

99

0.01




Kết quả giải rình tự gen 16S rARN của chủng B23.2 tương đồng 97,8%

(1370/1401 bp) với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Pseudomonas

pseudoalcaligenes_Z76666; tương đồng 97,6% (1368/1401 bp) với đoạn gen 16S

rARN của vi khuẩn Pseudomonas mendocina_D84016 (Hình 3.19). Kết quả này

cho thấy, chủng B23.2 có thể thuộc chi Pseudomonas. Đây là kết quả được công bố

đầu tiên về vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes có khả năng chuyển hóa

nitrite trong môi trường so với nghiên cứu của Zhang và cộng sự về khả năng

chuyển hóa của chủng Pseudomonas stutzeri có khả năng chuyển hóa nitrite [67].

Azorhizophilus paspali_AJ308318 Azotobacter beijerinckii_AJ308319

Azotobacter chroococcum_AB175653 Pseudomonas aeruginosa_X06684

Pseudomonas otitidis_AY953147 Pseudomonas resinovorans_Z76668

73

Serpens flexibilis_GU269546 Pseudomonas tuomuerensis_DQ868767

Pseudomonas stutzeri_AF094748 Pseudomonas xanthomarina_AB176954

Pseudomonas oleovorans subsp. lubricanti_DQ842018 Pseudomonas alcalophila_AB030583

Pseudomonas pseudoalcaligenes_Z76666

100

Pseudomonas mendocina_D84016

B23.2

66

76

71

50

100

57

92

68

93

89

0.01



.

Hình 3.20. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng A4.2

Trình tự gen 16S rARN của chủng A4.2 tương đồng 99.9% (1411/1413 bp)

với đoạn gen 16S rARN của vi khuẩn Bacillus licheniformis_X68416 khi so sánh

với các trình tự gen 16S rARN của các vi sinh vật trong ngân hàng gen quốc tế

(Hình 3.20). Điều này cho chúng tôi kết luận: chủng A4.2 thuộc chi Bacillus. Đây là

công bố đầu tiên ở Việt Nam, chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis có khả năng xử

lý photpho trong nước thải bằng việc tích lũy vào cơ thể vi sinh vật, một phần cung

cấp năng lượng cho các quá trình sinh hóa và trao đổi chất.

Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033

100

Bacillus isabeliae_AM503357 100

Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus stratosphericus_AJ831841

99

Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289

99

97

Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 A4.2 100

Bacillus sonorensis_AF302118 100

Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus malacitensis_AY603656

Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus mojavensis_AB021191

59

Bacillus subtilis_AB042061

77

Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus nematotocita_AY820954

Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus siamensis_GQ281299

Bacillus amyloliquefaciens_NR041455 Bacillus methylotrophicus_EU194897

6866

62

81

5971

100

100

100

99

68

89

0.01



KẾT LUẬN

1. Đã phân lập và được 65 chủng vi sinh vật trên môi trường Winogradsky và

21 chủng trên môi trường AMM từ các mẫu nước thải ở Thanh Hóa và Hà Nội.

2. Đã tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh

học và có khả năng xử lý nitơ và photpho tốt nhất là các chủng có ký hiệu B11.11,

B21.10, B23.2 và A4.2. Các chủng có khả năng hình thành màng sinh học ở nhiệt

độ trong khoảng từ 37 đến 50oC, pH từ 7 đến 8.

3. Đã phân loại và xác định được 3 chủng có khả năng xử lý nitơ tốt nhất,

trong đó, chủng B11.11 có khả năng chuyển hóa 85.21% NH4+ sau 20 ngày nuôi

cấy, chủng B21.10 chuyển hóa 97,28% và B23.2 chuyển hóa 97,14% lượng NO2-

sau 20 ngày nuôi cấy.

4. Đã phân loại và xác định được chủng A4.2 có khả năng xử lý photpho tốt

nhất, sau 10 ngày, hàm lượng photpho trong môi trường giảm đi 39.32% tương ứng

với môi trường có hàm lượng photpho là 18 mg/l.

5. Dựa trên trình tự gen 16S rARN, đặc điểm khuẩn lạc, tế bào, các đặc điểm

sinh lý, sinh hóa, chủng B11.11 và A4.2 được xác định gần với loài Bacillus

licheniformis, chủng B21.10 được xác định gần với loài Bacillus amyloliquefaciens,

chủng B23.2 xác định gần với loài Pseudomonas pseudoalcaligenes.

KIẾN NGHỊ

1. Thay đổi hàm lượng nitơ và photpho phù hợp với nghiên cứu. Kiểm tra khả

năng chuyển hóa các chất trong môi trường và sự hình thành màng sinh học khi

thay đổi hàm lượng.

2. Nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện chuyển hóa các hợp chất nitơ và photpho,

nghiên cứu và lựa chọn giá thể, chất mang phù hợp cho sự hình thành màng sinh

học của các chủng nghiên cứu.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Kiểu Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học, phần 1, NXB Đại học

Quốc Gia Hà Nội

2. Bộ Tài Nguyên và Môi trường (2010), Báo cáo môi trường Quốc gia 2010,

Hà Nội.

3. Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ và photpho, NXB

Khoa học tự nhiên và Công nghệ.

4. Lương Đức Phẩm (2003), Công nghệ xử lý nước thải bằng biện pháp sinh

học, NXB Giáo dục.

5. Nguyễn Hoài Hương (2009), Giáo trình thực hành vi sinh ứng dụng, NXB

Đại học Quốc Gia TPHCM.

6. Nguyễn Văn Phước (2007), Xử lý nước thải sinh hoạt và công nghiệp bằng

phương pháp sinh học, NXB Xây dựng.

Tiếng Anh

7. Anderson I.C., Poth M., Homstead J., and Burdige D. (1993), “A comparison

of NO and N2O production by the autotrophic nitrifier Nitrosomonas

europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis”, Applied and

Environmental Microbiology, 59 (11), pp. 3525-3533.

8. Annachhatre A.P. and Bhamidimarri S.M.R. (1992), “Microbial attachment

and growth in fixed-film reactors: Process startup considerations”,

Biotechnology Advances, 10 (1), pp. 69-91.

9. APHA (2001), Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewate., 20th edition, American Public Health Association, Washington,

DC.

10. Asgari M.J., Safavi K., and Mortazaeinezahad F. (2011), “Landfill biogas

production process”, International Conference on Food Engineering and

Biotechnology, 9, pp. 208-212



11. Bao L.-L., Li D., Li X.K., Huang R.X., Zhang J., Yang L., and Xia G.Q.

(2007), “Phosphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous-

flow two-sludge system”, Journal of Environmental Sciences, 19 (4), pp.

391-395.

12. Bernet N., Dangcong P., Delgenès J., and Moletta R. (2001), “Nitrification at

low oxygen concentration in biofilm reactor”, Journal of Environmental

Engineering, 127 (3), pp. 266-271.

13. Boelee N.C., Temmink H., Janssen M., Buisman C.J.N., and Wijffels R.H.

(2011), “Nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater

effluent using microalgal biofilms”, Water Research, 45 (18), pp. 5925-5933.

14. Boyd C.E. and Tucker C.S. (1998), Pond Aquaculture Water Quality

Management, Kluwer Acad. Publ.

15. Broda E. (1977), “Two kinds of lithotrophs missing in nature”, Zeitschrift für

allgemeine Mikrobiologie, 17 (6), pp. 491-493.

16. Cheung K.C., Chu L.M., and Wong M.H. (1997), “Ammonia stripping as a

pretreatment for landfill leachate”, Water, Air, and Soil Pollution, 94 (1-2),

pp. 209-221.

17. Cong L.T.N., Huyen H.T., and Minh N.N. (2012), “Phenol degradation of

biofilm formed by mixing - marine bacteria”, VNU. Journal of Science, 28

(2S), pp. 75-81.

18. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin-

Scott H.M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology,

49, pp. 711-745.

19. Czaczyk K. and Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric

substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal

of Environmental Studies, 16 (6), pp. 799-806.

20. Di Bonaventura G., Stepanovic S., Picciani C., Pompilio A., and Piccolomini

R. (2007), “Effect of environmental factors on biofilm formation by clinical



Stenotrophomonas maltophilia isolates”, Folia Microbiologica., 52 (1), pp.

86-90.

21. Donlan R.M. (2002), “Biofilms: microbial life on surfaces”, Emerging

Infectious Diseases Journal, 8 (9), pp. 881-890.

22. Federation W.E. (1998), Biological and chemical systems for nutrient

removal, Water Environment Federation, Alexandria, VA.

23. Flemming H.-C. (1993), “Biofilms and Environmental Protection”, Water

Science & Technology, 27 (7-8), pp. 1-10.

24. Giaouris E., Chorianopoulos N., and Nychas G.J.E. (2005), “Effect of

temperature, pH, and water activity on biofilm formation by Salmonella

enterica enteritidis PT4 on stainless steel surfaces as indicated by the bead

vortexing method and conductance measurements”, Journal of Food

Protection, 68 (10), pp. 2149-2154.

25. Gilbert P., Das J., and Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to

antimicrobials”, Advances in Dental Research, 11 (1), pp. 160-167.

26. Hang T.T. and Huy N.Q. (2011), “Isolate biofilm forming Bacillus strains

from contamination site in trade villages in Viet Nam”, VNU. Journal of

Science, 27 (2S), pp. 157-162.

27. Henze M., Harremoes P., Jansen J.C., and Arvin E. (2001), Wastewater

Treatment: Biological and Chemical Processes, Springer.

28. Heydorn A., Nielsen A.T., Hentzer M., Sternberg C., Givskov M., Ersboll

B.K., and Molin S. (2000), “Quantification of biofilm structures by the novel

computer program COMSTAT”, Microbiology (Reading, England), 146

(10), pp. 2395-2407.

29. Ho K.L., Pometto A.L., and Hinz P.N. (1997), “Optimization of L-(+)-lactic

acid production by ring and disc plastic composite supports through

repeated-batch biofilm fermentation”, Applied and Environmental

Microbiology, 63 (7), pp. 2533-2542.



30. Hoilijoki T.H., Kettunen R.H., and Rintala J.A. (2000), “Nitrification of

anaerobically pretreated municipal landfill leachate at low temperature”,

Water Research, 34 (5), pp. 1435-1446.

31. Hunik J.H., Van Den Hoogen M.P., De Boer W., Smit M., and Tramper J.

(1993), “Quantitative determination of the spatial distribution of

Nitrosomonas europaea and Nitrobacter agilis cells immobilized in kappa-

carrageenan gel beads by a specific Ffuorescent-antibody labelling

technique”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (6), pp. 1951-

1954.

32. Huy N.Q., Lien N.T.P., and Hang T.T. (2011), “Characterization of biofilm-

forming bacteria isolated from soil in Viet Nam”, VNU. Journal of Science,

27 (2S), pp. 187-193.

33. Jørgensen K.S. and Pauli A.S.L. (1995), “Polyphosphate accumulation

among denitrifying bacteria in activated sludge”, Anaerobe, 1 (3), pp. 161-

168.

34. Kim J.K., Park K.J., Cho K.S., Nam S.-W., Park T.-J., and Bajpai R. (2005),

“Aerobic nitrification–denitrification by heterotrophic Bacillus strains”,

Bioresource Technology, 96 (17), pp. 1897-1906.

35. Kokare C.R.C., Khopade A.N., and Mahadik K. (2009), “Biofilm :

importance and applications”, Indian Journal of Biotechnology, 18, pp. 159-

168.

36. Lacko N., Drysdale G.D., and Bux F. (2003), “Anoxic phosphorus removal

by denitrifying heterotrophic bacteria”, Water science and technology : a

journal of the International Association on Water Pollution Research, 47

(11), pp. 17-22.

37. Lazarova V. and Manem J. (1995), “Biofilm characterization and activity

analysis in water and wastewater treatment”, Water Research, 29 (10), pp.

2227-2245.



38. Li X.Z., Zhao Q.L., and Hao X.D. (1999), “Ammonium removal from

landfill leachate by chemical precipitation”, Waste Management, 19 (6), pp.

409-415.

39. Lopez D., Vlamakis H., and Kolter R. (2010), “Biofilms”, Cold Spring

Harbor Perspectives in Biology, 2 (7), pp. a000398.

40. Monroe D. (2007), “Looking for chinks in the armor of bacterial biofilms”,

PLoS Biology, 5 (11).

41. Mulder A. (2003), “The quest for sustainable nitrogen removal

technologies”, Water science and technology : a journal of the International

Association on Water Pollution Research, 48 (1), pp. 67-75.

42. Mulder A., Van De Graaf A.A., Robertson L.A., and Kuenen J.G. (1995),

“Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed

reactor”, FEMS Microbiology Ecology, 16 (3), pp. 177-183.

43. Nadell C.D., Xavier J.B., Levin S.A., and Foster K.R. (2008), “The evolution

of quorum sensing in bacterial biofilms”, PLoS biology, 6 (1), pp. e14.

44. O'toole G., Kaplan H.B., and Kolter R. (2000), “Biofilm formation as

microbial development”, Annual Review of Microbiology, 54, pp. 49-79.

45. O'toole G.A., Gibbs K.A., Hager P.W., Phibbs P.V., Jr., and Kolter R.

(2000), “The global carbon metabolism regulator Crc is a component of a

signal transduction pathway required for biofilm development by

Pseudomonas aeruginosa”, Journal of Bacteriology, 182 (2), pp. 425-431.

46. O'toole G.A. and Kolter R. (1998), “Flagellar and twitching motility are

necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development”, Molecular

Microbiology, 30 (2), pp. 295-304.

47. O'toole G.A. and Kolter R. (1998), “Initiation of biofilm formation in

Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent

signalling pathways: a genetic analysis”, Molecular Microbiology, 28 (3),

pp. 449-461.



48. Ozturk I., Altinbas M., Koyuncu I., Arikan O., and Gomec-Yangin C.

(2003), “Advanced physico-chemical treatment experiences on young

municipal landfill leachates”, Waste Management, 23 (5), pp. 441-446.

49. Pressley T.A., Bishop D.F., and Roan S.G. (1972), “Ammonia-nitrogen

removal by breakpoint chlorination”, Environmental Science & Technology,

6 (7), pp. 622-628.

50. Radwan S.S., Al-Hasan R.H., Salamah S., and Al-Dabbous S. (2002),

“Bioremediation of oily sea water by bacteria immobilized in biofilms

coating macroalgae”, International Biodeterioration & Biodegradation,

50 (1), pp. 55-59.

51. Rieger L., Koch G., Kühni M., Gujer W., and Siegrist H. (2001), “The eawag

bio-p module for activated sludge model no. 3”, Water Research, 35 (16),

pp. 3887-3903.

52. Schmid M.C., Maas B., Dapena A., Pas-Schoonen K.V.D, Vossenberg

J.V.D, Kartal B., Niftrik L.V, Schmidt I., Cirpus I., Kuenen J. G., Wagner

M., Damsté J.S.S., Kuypers M., Revsbech N. P, Mendez R., Jetten M. S., and

Strous M. (2005), “Biomarkers for in situ detection of anaerobic ammonium-

oxidizing (anammox) bacteria”, Applied and Environmental Microbiology,

71 (4), pp. 1677-1684.

53. Schmidt I. and Bock E. (1997), “Anaerobic ammonia oxidation with nitrogen

dioxide by Nitrosomonas eutropha”, Archives of Microbiology, 167 (2-3),

pp. 106-111.

54. Schmidt I. and Bock E. (1998), “Anaerobic ammonia oxidation by cell-free

extracts of Nitrosomonas eutropha”, Antonie Van Leeuwenhoek, 73 (3), pp.

271-278.

55. Sedlak R.I. (1991), Phosphorus and Nitrogen Removal From Municipal

Wastewater: Principles and Practice, Lewis Publication.

56. Sedlak R.I. (1991), Phosphorus and Nitrogen Removal from Municipal

Wastewater: Principles and Practice, 2nd Edition, CRC Press, English.



57. Sharma B. and Ahlert R.C. (1977), “ Nitrification and nitrogen removal”,

Water Research, 11, pp. 897-925.

58. Shoji T., Satoh H., and Mino T. (2003), “Quantitative estimation of the role

of denitrifying phosphate accumulating organisms in nutrient removal”,

Water science and technology : a journal of the International Association on

Water Pollution Research, 47 (11), pp. 23-29.

59. Sidat M, Bux F., and Kasan H. (1999), “Polyphosphate accumulation by

bacteria isolated from activated sludge”, Water South Africa, 25 (2), pp. 175-

180.

60. Siegrist H., Rieger L., Koch G., Kuhni M., and Gujer W. (2002), “The eawag

bio-P module for activated sludge model No. 3”, Water science and

technology : a journal of the International Association on Water Pollution

Research, 45 (6), pp. 61-76.

61. Streichan M., Golecki J.R., and Schön G. (1990), “Polyphosphate-

accumulating bacteria from sewage plants with different proceses for

biological phosphorus removal”, FEMS Microbiology Letters, 73 (2), pp.

113-124.

62. Sutherland I. (2001), “Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky

framework”, Microbiology (Reading, England), 147 (Pt 1), pp. 3-9.

63. Van Benthum W.A.J., Van Loosdrecht M.D.M., and Heijnen J.J. (1997),

“Control of heterotrophic layer formation on nitrifying biofilms in a biofilm

airlift suspension reactor”, Biotechnology and Bioengineering, 53 (4), pp.

397-405.

64. Welander U., Henrysson T., and Welander T. (1998), “Biological nitrogen

removal from municipal landfill leachate in a pilot scale suspended carrier

biofilm process”, Water Research, 32 (5), pp. 1564-1570.

65. Wulff N.A., Mariano A.G., Gaurivaud P., De Almeida Souza L.C., Virgilio

A.C., and Monteiro P.B. (2008), “Influence of culture medium pH on



growth, aggregation, and biofilm formation of Xylella fastidiosa”, Current

Microbiology, 57 (2), pp. 127-132.

66. Yangin C., Yilmaz S., Altinbas M., and Ozturk I. (2002), “A new process for

the combined treatment of municipal wastewaters and landfill leachates in

coastal areas”, Water science and technology : a journal of the International

Association on Water Pollution Research, 46 (8), pp. 111-118.

67. Zhang J., Wu P., Hao B., and Yu Z. (2011), “Heterotrophic nitrification and

aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001”,

Bioresource Technology, 102 (21), pp. 9866-9869.

68. Zhang Q.-L., Liu Y., Ai G.-M., Miao L.-L., Zheng H.-Y., and Liu Z.-P.

(2012), “The characteristics of a novel heterotrophic nitrification–aerobic

denitrification bacterium, Bacillus methylotrophicus strain L7”, Bioresource

Technology, 108 (0), pp. 35-44.

Website

69. http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen_cycle

70. http://www.visionlearning.com/library/module_viewer.php?mid=98

71. http://www.thewaterplanetcompany.com/docs/WPC_Nitrification and

Denitrification.pdf


Ngô Thị Kim Toán K19 – Sinh học thực nghiệm

PHỤ LỤC

1. Trình tự gen mã hóa 16S rARN của vi khuẩn B11.11 được đọc trên máy

đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) .

GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTA

GGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGA

CTGGGATAACTCCGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACC

GCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGA

CCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG

ATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACA

CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGG

ACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT

CGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGG

CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCA

GCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA

AAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCA

ACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAG

AGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAAC

ACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGA

AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA

AACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGC

AAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACT

CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAA

TTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAAC

CCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATG

GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAG

CGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTG

ACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCA

TGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAG



GGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTT

CGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAAT

CGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACC

GCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC

TTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGA

2. Trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng B21.10 được đọc trên máy đọc

trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ).

AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAG

ATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG

GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA

CCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGG

CTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA

CGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC

CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA

GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA

GTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG

TGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCAC

GGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTG

TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGA

TGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAA

CTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATG

CGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGT

AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATAC

CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTC

CGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA

CGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC

GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT

CTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA

GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG



GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTC

AGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGG

GGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGC

TACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATC

CCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTG

AAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGT

TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACAC

CCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGA

CAGA

3. Trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng B23.2 được đọc trên máy đọc


AGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGA

AGGGAGCTTGCTCCTGGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGG

AATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCCGAAAGGAACGCTAATACCG

CGTACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCA

GATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAG

GCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTG

AGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC

AATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTT

CGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTACGTTAATACC

GTGCAATTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCC

AGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGG

GCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGTAAGTTGGAAGTGAAATCCCCGG

GCTCAACCTGGGAACTGCTTTCAAAACTGCTGAGCTAGAGTACGGTAGA

GGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGG

AACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGT

GCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC

CGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGC

AGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA



ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT

AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAAC

TTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCA

TGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACG

AGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAG

GAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCA

TCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACA

AAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGT

AGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAG

TAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA

CACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCT

AACCTTCGGGGGGACGGTACCACGGAG

4. Trình tự gen mã hóa 16S rARN của chủng A4.2 được đọc trên máy đọc


CTCTGCTCAGGACGAACGCCGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAG

CGGACCGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTA

ACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGATTGGGATAACTCCGGGAAACCGGG

GCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTG

GCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGG

TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG

TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG

CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG

CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGA

AGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG

AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG

CAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCT

TAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAA

CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCG

GTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCT



CTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG

ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA

GAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCC

TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCC

CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAC

CTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCT

TCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGT

GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTG

CCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAG

GAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC

ACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTA

AGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCG

ACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGT

GAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTT

TGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGT

GGACAGAATGACTCA

ĐẠi hỌc quỐc gia hÀ nỘi - hus.vnu.edu.vn (201).pdf · lêi c¶m ¬n lêi ®Çu tiªn, em...

Documents