hormonas del estrés en lobos italianos (canis lupus
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Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Ciencias Biológicas
Hormonas del estrés en lobos Italianos (Canis lupus)
Lorena Valeria Moro Jiménez
Tesis de grado presentada como último requisito para optar al
título de Biología
Director
Duccio Berzi
Codirector
Carlos Jaramillo
Bogotá D. C., febrero 2004
2
AGRADECIMIENTOS
A Duccio Berzi y Carlos Jaramillo por ser el Director y el Codirector de este
trabajo.
A mi papá y a mi mamá quienes me apoyaron desde el principio e hicieron
posible la realización de este proyecto.
A la familia Tombarelli y Monika, que me acogieron y me brindaron su apoyo
y compañía durante mi estadía en la Abadía de Moscheta.
A mi familia de aquí y de allá por su preocupación, ayuda y soporte.
A Federico Botero por su comprensión, soporte y espera.
A Carlos Arias y Camilo Salazar por su ayuda.
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TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN 4
OBJETIVOS 5
INTRODUCCION 6
MARCO TEORICO 8
SITUACION DEL LOBO EN ITALIA 8
EL ESTRÉS 10
LA RESPUESTA AL ESTRÉS:
LOS GLUCOCORTICOIDES 11
MATERIALES Y METODOS 14
AREA DE ESTUDIO 14
RECOLECCION DE LAS MUESTRAS 14
ANALISIS DE LAS MUESTRAS 18
EXTRACCION 19
RADIOINMUNOENSAYO 19
ANALISIS ESTADISTICO 21
RESULTADOS 22
DISCUSION 24
BIBLIOGRAFIA 26
4
RESUMEN
Los lobos se ven constantemente expuestos a diferentes estímulos que
pueden llegar a crear momentos de gran tensión. La respuesta fisiológica al
estrés se traduce en la activación del sistema hormonal, causando la
liberación de glucocorticoides en el organismo. La medición del nivel de estas
hormonas puede ser un buen método para monitorear el estado de los
animales frente a diversos disturbios.
En este trabajo se intentó determinar si el aumento del turismo y de la
actividad humana tenía relación alguna con el nivel de glucocorticoides en los
lobos italianos. Diferentes muestras de heces fueron recogidas usando un
método no invasivo durante tres meses y fueron analizadas mediante un
radioinmunoensayo sobre microplaca.
Se encontró que no existen diferencias significativas entre los tres meses de
muestreo. Sin embargo, junto con el comienzo de la actividad humana en la
zona, se pudo observar un incremento en los niveles de hormonas del estrés
en los lobos. Por lo que podemos decir que probablemente esto si está
teniendo un efecto sobre los individuos.
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OBJETIVOS
• Dar una primera aproximación en la cuantificación indirecta del nivel
de glucocorticoides en lobos italianos.
• Aplicar el método de radioinmunoensayo sobre microplaca para
analizar muestras de heces.
• Determinar el nivel de Cortisol a partir de las muestras.
• Determinar si existe relación entre la actividad humana y el nivel de
glucocorticoides fecales.
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INTRODUCCIÓN
El lobo italiano (Canis lupus) es uno de los animales menos estudiados. Su
estado taxonómico no es del todo claro ya que estudios morfológicos lo
ubican como una subespecie distinta a otras poblaciones de lobos. Sin
embargo, distintos estudios genéticos contradicen esta afirmación. Análisis
alozímicos y estimativos de la divergencia nucleotídica entre haplotipos de
ADN mitocondrial indican una baja diferenciación genética entre las distintas
poblaciones (Randi et al. 1993; Randi et al. 1998). Estudios de la ecología,
comportamiento y fisiología han mostrado ser de gran importancia dentro de
este grupo de organismos no solo para entender la dinámica de sus
poblaciones sino también para establecer cómo la acción del hombre puede
afectar su supervivencia.
Hacia 1970 la caza extensiva y la fragmentación del hábitat estaban llevando
a esta especie a su extinción (Ciucci y Boitani 1998). Sin embargo gracias a
la protección que se consiguió tanto para la especie como para sus presas, el
lobo italiano sobrevivió y actualmente extiende sus territorios a lo largo del
país. Pero a pesar de esto, el hombre sigue influenciando la estabilidad de las
poblaciones de lobos. Una manera novedosa de observar dicho efecto es
medir las variaciones de los ciclos hormonales. Distintos estudios han
mostrado que los glucocorticoides son hormonas estrechamente relacionadas
con el estrés. La concentración de cortisol presenta una relación directa con
la depresión del sistema inmune lo que puede causar una reducción en la
tasa de apareamiento.
Este trabajo pretende hacer una primera aproximación en la cuantificación
indirecta del nivel de estrés de algunos de estos animales, midiendo los
niveles de glucocorticoides fecales (cortisol), como respuesta a la presencia
7
de diferente número de visitantes y a la actividad humana en una zona del
complejo Demanial Giogo-Casaglia (Florencia, Italia).
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MARCO TEORICO.
Situación del lobo en Italia.
Históricamente el lobo ocupaba todo el hemisferio norte. Sin embargo
actualmente, las poblaciones de esta especie disminuyeron
considerablemente y solo se les encuentra en América del norte, en los
países de la ex Unión Soviética y en Europa centro oriental (Berzi et al,
1999). En Italia se encuentran poblaciones menos significativas, las cuales
han estado aisladas de las demás por casi un siglo. A comienzos de 1900, el
lobo italiano fue considerado como una subespecie del lobo europeo, Canis
lupus italicus (Altobello, 1921). Sin embargo, actualmente esto ya no se
considera así puesto que gracias a las recientes investigaciones que se
llevan a cabo a nivel de microsatélites y secuenciación de ADN mitocondrial
(Randi, E.), se ha concluido que no existen razones suficientes para justificar
la subespecie. Es por esto que viene siendo actualmente considerado como
un ecotipo de este (C. lupus lupus) (Berzi et al, 1999).
A comienzos del siglo pasado y casi hasta los años 70, la situación del lobo
en Italia era altamente alarmante, pues las poblaciones disminuían cada vez
más a causa de la caza, legal en esas épocas, y sobre todo por la
persecución excesiva por parte de los granjeros quienes veían en el lobo un
cazador potencial de sus ganados (Tabla 1). Fue así que los lobos fueron
extinguidos en los Alpes y en la isla de Sicilia. Se presumía que quedaban
entre unos 80 a 100 individuos en ese entonces, distribuidos en grupos
aislados en el Apenino central y meridional. Había gran incertidumbre si la
pequeña población que sobrevivía podría salir del “cuello de botella” en el que
había caído (Berzi y Valdrè, 2002).
9
Tabla 1. Población de lobos en Italia en diferentes años (Berzi y Valdrè, 2002).
Fecha Estimación de la población
viviente Fuentes Hasta 60´s 200 Tassi 1971 1972 100 Zimen y Boitani 1975 1977 200 Boscagli 1985 1980 100 Boitani 1981 1982 150 Boitani 1983 1983 200 Boitani y Fabbri 1983 1984 220 Boitani 1984 1985 240 Boitani 1986 1987 200 Boscagli 1997 1988 300 Boitani et al. 1989 1990 300 Ciucci y Boitani 1991 1991 400 Boscagli y Gandolfi 1992 1994 450 Boitani 1994 1998 Más de 500 Ciucci y Boitani 1998
Afortunadamente la población se restableció, su número aumentó y se han
ido extendiendo por el territorio italiano. Actualmente se cuentan más de 500
individuos y su distribución va desde los Alpes Marítimos, regiones de
Piamonte y Liguria (pasando por Francia) hasta la región de Calabria al sur
(Figura 1).
Fig. 1. Distribución del lobo en Italia: la línea negra representa la distribución en 1973 (Zimen y Boitani 1975); en gris la de 1998 (Corsi et al. 1998) (Ciucci, Boitani, 1998). La franja verde muestra la expansión en los últimos años.
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El estrés “natural” no es tan perjudicial ni nocivo para los animales ya que no
son estímulos que duren mucho tiempo, por lo que la respuesta fisiológica no
es constante y permanece en un nivel bajo. Además, cierto nivel de estrés es
necesario para que el organismo del individuo funcione correctamente (ver
adelante).
El siguiente grupo de estrés, el provocado, no es tan inofensivo como el
anterior. Por el contrario puede llegar a ser letal incluso para una especie.
Este tipo de estrés es el causado por el hombre, debido al aumento y
desplazamiento de las poblaciones humanas hacia los territorios del lobo.
Esto ha generado una exclusión competitiva entre estas dos especies. La
competición con el hombre no solo ha logrado una reducción en número de
individuos por muerte directa, sino que las técnicas utilizadas para erradicar
las poblaciones de lobos de estas zonas generan estrés por persecución
(Mech, 1970). Además crea tensión por la disminución del hábitat lo que va
haciendo que tengan menos espacio para delimitar sus territorios.
Adicionalmente, la intromisión del turismo en los pocos territorios que les
queda se convierte en un factor más de estrés que poco a poco amenaza el
futuro de la especie.
La respuesta al estrés: los glucocorticoides.
La respuesta fisiológica a los diferentes estímulos externos que provocan
estrés se ve reflejada en la activación del eje hipotálamico-pituitario-adrenal
cuya consecuencia es la liberación en el organismo de glucocorticoides
(GCs). Los GCs son hormonas esteroideas con influencias muy diversas
sobre las funciones del cuerpo. Dichas influencias consisten en ayudar al
cuerpo a combatir condiciones adversas duraderas en el medio (Romer,
1981). Estas hormonas son sintetizadas en la corteza adrenal y el cortisol (o
hidrocortisona) es la principal hormona glucocorticoide ya que es
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responsable de cerca el 95% de toda la actividad glucocorticoide suprarrenal
(Guyton, 1995).
El control de la secreción de los GCs esta regulado por la hormona
adrenocorticotrópica o más comúnmente corticotropina (ACTH) la cual es
secretada por la hipófisis anterior. Esta a su vez es controlada por el
hipotálamo gracias a la secreción de la hormona liberadora de la
corticotropina (CRH) (Figura 2).
Fig. 2. Mecanismo de regulación de la secreción de los glucocorticoides (Guyton, 1995)
Los efectos de los GCs se ejercen sobre el metabolismo de los
carbohidratos, de las proteínas y de los ácidos grasos. Las elevaciones de
los niveles de GCs redirigen las reservas para movilizar energía que puede
ser utilizada para resolver la situación estresante, (Sapolsky en Creel, 2001),
pero también resulta muy útil para el mejoramiento de la aptitud de los
individuos.
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Si el estímulo estresante es duradero, es decir, si los niveles de GCs son
demasiado elevados y esto persiste por un largo periodo de tiempo, las
consecuencias patológicas pueden llegar a ser letales. El suministro de
fuertes dosis de cortisol determina una relevante atrofia de todo el tejido
linfoide del organismo, lo que, a su vez, hace disminuir la formación de
linfocitos T y de anticuerpos por parte del mismo (Guyton, 1995). Así, el
sistema inmunitario del individuo sufre una baja considerable, sus músculos
se ven desgastados e incluso se presenta una supresión en la reproducción,
por lo que la aptitud decae. Es por esto que, a causa de estos efectos
potenciales en el estatus fisiológico, la medición de los glucocorticoides
puede ser valiosa en estudios de ecología evolutiva, biología de
conservación y en el bienestar animal (Goymann, 1999).
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MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio.
El área donde se realizó la recolección de muestras forma parte de un gran
complejo natural conocido como COMPLESSO DEMANIALE GIOGO-
CASAGLIA. La zona de Moscheta está ubicada a aproximadamente 50 Km.
de Florencia sobre la cadena Apenínica, entre las regiones Toscana y Emilia
Romagna (Apenino Tosco-Romagnolo).
El área cuenta con una extensión de aproximadamente unos 300 km2 y
elevaciones que oscilan entre los 500 y los 1200 metros sobre el nivel del
mar.
Es probablemente uno de los mejores ambientes para el lobo pues posee
montañas poco elevadas, bosques extensos y alimento abundante.
Recolección de las muestras.
La recolección de muestras se basó principalmente en la recuperación de
heces debido a que la toma de estas en sangre implica la presencia humana
y el proceso de captura del individuo generaría un factor de estrés el cual
podría interferir en los resultados finales. Se utilizó el método de Snow
tracking el cual consiste en el seguimiento de los individuos a partir de las
huellas dejadas sobre la nieve (Berzi y Valdrè, 2002). Esto sugiere tanto un
buen conocimiento del área en la cual se está trabajando como de las rutas o
lugares más frecuentados por los lobos. Para determinar si las huellas
encontradas en el barro o nieve pertenecen a un lobo o a un perro debido a
su gran similitud, se utilizó la variación en el tamaño y la disposición de las
mismas sobre su andar. En general las huellas del lobo miden alrededor de
10 a 11 cm. de largo y de 9 a 10 cm. de ancho (Figura 3). Además las
huellas de lobo están dispuestas a lo largo de una línea recta y siguen
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recorridos mucho más rectilíneos que las de los perros (Berzi, Valdré. 2002)
(Figura 4).
Fig. 3. Foto de huella de lobo sobre nieve y esquema para mostrar su tamaño. (Berzi y Valdrè, 2002)
Fig. 4. Las diferentes formas de andar del lobo: galope ligero, galope veloz, trote lento.
(Boscagli, 1985)
Galope ligero
Galopeveloz
Trote lento
16
Por otro lado, las heces de los lobos son bastante características (Foto 1):
tienen una forma cilíndrica, son gruesas (más o menos 3 cm. de diámetro) y
contienen por lo general fragmentos de huesos y pelos de sus presas
además de poseer un olor fuerte y penetrante
Foto 1. Heces de lobo. Foto tomada en el punto 1 del sendero 00 (Fig. 5) el 19 de marzo de 2003 por Lorena Moro.
Los excrementos fueron encontrados por lo general en lugares como cruces,
pasos, ensanchamientos de las carreteras y su posición era bien visible.
La recolección se llevó a cabo en los meses de invierno, ya que la nieve hace
más fácil seguir sus huellas y las bajas temperaturas ayudan a preservar las
muestras. En total se realizaron 16 salidas a campo (Tabla 2), los recorridos
fueron a pie utilizando los senderos y caminos forestales (Figura 5), los
17
cuales son también muy usados por los lobos ya que estos les facilita el
desplazamiento a través de los bosques y además sirven de limites para
demarcar sus territorios.
Tabla 2. Tabla de salidas y recolección de muestras.
Sendero Fecha Punto de
recolección Total de muestras
recogidas Moscheta - Serra 18/02/2003
Moscheta-Giogarello- Serra 22/02/2003
Moscheta-Lame-Serra 23/02/2003 Punto 6 1 Moscheta-Giogarello-
Serra 08/03/2003
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Fig. 5. Mapa de los senderos recorridos para la recolección de las muestras. En negro son representadas las carreteras principales asfaltadas, en gris las secundarias y en rojo los caminos forestales. El marcado como 00 es el sendero de recorrido principal y los puntos numerados son los lugares de recolección.
Análisis de las muestras.
El análisis de las muestras fue llevado a cabo por la Doctora Claudia
Simontacchi y su equipo de colaboradores del laboratorio del departamento
de ciencias experimentales veterinarias de la Universidad de Padua, Italia.
El análisis de las muestras se realizó principalmente en 2 fases: extracción e
inmunoensayo.
Florencia
Bolonia Moscheta
Serra Lame
Giogarello
Giogo
19
Extracción.
Al momento de la recolección las muestras fueron congeladas y conservadas
de esta forma hasta su utilización. Se procedió entonces a realizar la
extracción de los esteroides de la muestra fecal, en este caso el cortisol. Esta
es la primera fase de trabajo de 7 que implica llevar a cabo el análisis radio
inmunológico. Para este procedimiento las muestras fueron descongeladas a
temperatura ambiente, se mezclaron para homogeneizarlas y se tomó un
gramo de cada una, el cual fue congelado en nitrógeno líquido para luego ser
macerado hasta obtener una muestra en polvo. A 100 mg de esta muestra se
le adicionó 0,5 ml de tampón RIA (Tampón fosfato, pH 7,2) y el total fue
extraído con éter di etílico, agitando por 10 minutos a temperatura ambiente
en un agitador rotatorio y centrifugando a 1500 g por 5 minutos a 5°C.
Después del congelamiento de la fase acuosa a -20°C, el sobrenadante fue
decantado en probetas cónicas de vidrio y fue secado bajo corriente de aire.
El residuo seco fue rehidratado con 500 µl de tampón RIA y agitado por 15
minutos sobre un agitador horizontal. Para el RIA fueron utilizadas alícuotas
de 20 µl.
Radioinmunoensayo.
El nivel de cortisol fecal fue medido utilizando un análisis radio inmunológico
(RIA) sobre microplaca, que es una variante en fase sólida de los métodos
tradicionales radioinmunológicos en fase líquida. Esto implica el uso de
microplacas en vez de probetas, con lo cual se economiza reactivo (líquido
centelleante) y se simplifica la metodología de separación libre/ligado. Este
método se caracteriza por su sensibilidad y especificidad.
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Se llevaron a cabo 6 pasos de trabajo para poder realizar con éxito el RIA.
El primer paso consistió en la adsorción del anticuerpo anti-IgG de conejo.
Para esto 200 µl de anticuerpo (producido en una cabra) fueron diluidos al
1:1000 con acetato de sodio (0,15 mM pH9) y se distribuyeron en los 96
pozos de la microplaca. Se dejó incubar por una noche a 4°C con el fin de
que se realizara la adsorción del anticuerpo sobre las paredes del pozo. Una
vez desocupada la microplaca, a cada pozo se le agregó 200 µl de tampón
RIA conteniendo albúmina bovina (BSA). Después de una segunda
incubación (1H, 4°C), la microplaca fue desocupada y conservada a -20°C
(no más de 4 semanas) hasta el momento de la utilización.
El siguiente paso fue la incubación con el anticuerpo específico anti-cortisol.
Para esto a cada pozo se le agregaron 200 µl de antisuero anti-cortisol diluido
al 1:8000, se dejó incubar por una noche a 4°C, para luego desocupar y lavar
la microplaca con tampón RIA.
Para la incubación con la muestra extraída de las heces, fueron añadidos a
cada pozo 20 µl de muestra, 10 µl de cortisol 3H (trazador marcado) y 180 µl
de tampón RIA y se dejó incubar por una noche a 4°C.
A este punto se obtuvo la fase de separación del antígeno marcado libre del
antígeno marcado ligado al anticuerpo, la cual se efectuó por enjuague de los
pozos: la microplaca fue desocupada y lavada 4 veces con tampón RIA (200
µl por pozo) así las moléculas de antígeno marcado que fueron ligadas al
anticuerpo permanecieron adheridas a las paredes del pozo mientras que el
antígeno libre fue lavado.
Finalmente se preparó la microplaca para la lectura de la radioactividad: 200
µl de líquido centelleante (Microscint 20 – Packard) fueron distribuidos en
21
cada pozo. Luego, la microplaca sellada a calor con su respectiva película,
fue puesta en el contador de centelleos (Topcount-Packard).
Para cada microplaca se preparó una curva de calibración del siguiente
modo: 50 µl de cantidades crecientes de Ag no marcado (3.125, 6.25, 12.5,
25, 100, 200 pg), 10 µl de cortisol marcado y 150 µl de tampón RIA.
Análisis estadístico.
Los análisis estadísticos y gráficos fueron realizados con el programa
STATISTIX 7 para windows (Analitycal software 2000). La tendencias de los
datos fueron mostradas por medio de un gráfico de cajas (box y Whisker plot)
(Gráfico 1).
Para observar si existían diferencias entre los tratamientos, se realizó en
primera instancia la prueba de normalidad Shapiro Wilk para ver si los datos
eran normales. Al ser estos datos no normales se utilizó la prueba no
paramétrica de Kruskal Wallis y se determinó si existían diferencias
significativas entre los meses de muestreo.
22
RESULTADOS A partir de la recolección hecha en la zona de Moscheta durante los meses
de muestreo se obtuvieron 9 muestras de heces de lobo italiano. Dichas
muestras se encontraron en su mayoría, por senderos de gran tamaño y en
un estado bien conservado. Al realizar la extracción del cortisol de estas
muestras se encontraron concentraciones de este glucocorticoide en un
rango entre 0.9 y 40 ng/g de heces secas (Tabla 3). Con estas
concentraciones, se realizó una prueba de normalidad (Shapiro Wilk), donde
se rechazó la hipótesis nula de distribución normal de los datos (W = 0.7159,
P = 0.0022), razón por la cual se realizó la prueba para datos no
paramétricos de Kruskal Wallis.
Tabla 3. Resultados de la medición de los niveles de cortisol en las heces de lobos. Muestra Fecha de
recolección Características Peso de la
muestra en gCortisol
ng/g de heces fecales secas
1 23-02-03 PELO, HUESOS 5,1 7,1 2 19-03-03 PELO 5,4 5 3 19-03-03 PELO 7,9 4 4 19-03-03 PELO 6,1 15,3 5 28-03-03 HECES 6,7 0,9 6 29-03-03 PELO, HUESOS 16,8 5,7 7 9-04-03 PELO, HUESOS 7,7 7,4 8 16-04-03 HECES 35,9 11,3 9 16-04-03 PELO, HUESOS 13,7 40
Los resultados encontrados no mostraron diferencias significativas entre los
distintos meses de muestreo (K. W. 3.48, P = 0.1751). Sin embargo si
observamos los promedios, los máximos y los mínimos graficados en un
diagrama de cajas (box y whisker plot; Fig. 6) vemos que la variación en el
promedio entre los meses de febrero y marzo no fue tan grande, pero al
23
observar los promedios entre los meses de marzo y abril se encuentra una
ligera tendencia a un aumento de la concentración de cortisol en las
muestras de heces.
Gráfico 6. Concentración de glucocorticoides en lobos entre febrero y abril.
24
DISCUSION
Aunque ya hacia el mes de marzo las condiciones ambientales comienzan a
mejorar (los días se alargan, la temperatura ambiente aumenta y la
vegetación comienza a crecer) no es sino hasta comienzos de abril que
empieza a verse la actividad humana. El turismo hacia la zona crece y se da
inicio a las actividades pastorales.
Estadísticamente los resultaron mostraron que no hay razones suficientes
para determinar que hubo diferencias significativas en los niveles de
glucocorticoides entre los 3 meses. Sin embargo en el mes de abril, junto con
la actividad humana, se observó un incremento en el nivel de cortisol. Este
aumento pudo ser causado por el acrecentamiento de turistas en la zona y
por el tránsito de estos y de automóviles por los senderos forestales que los
lobos también usan. Esto puede explicar además la dificultad de obtención de
muestras a medida que pasaba el tiempo. Los animales al sentirse invadidos
muy probablemente se alejaron de la zona trasladándose hacia la parte alta
de las montañas o simplemente ocupando otros territorios, evadiendo así los
caminos y los lugares frecuentados por los humanos.
Por otro lado, estudios llevados a cabo en lobos de Estados Unidos
mostraron que si existía una correlación entre el aumento de las hormonas
del estrés y la actividad y el uso de vehículos de nieve de los humanos (Creel,
2002).
Sin embargo, con este tipo de estudios no se puede concluir si los lobos
sufren de alguna de las patologías provocadas por un estrés prolongado o
repetitivo, o si la aptitud de los individuos está decayendo. Aunque los
métodos para medir el nivel de glucocorticoides fecales son simples y
efectivos y se sugieren para monitorear los efectos humanos en las
poblaciones animales, inclusive los efectos incipientes (Creel, 2002), no nos
dan una aproximación sobre el estado patológico del organismo.
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Además hay que tener precaución y realizar estudios bien planificados para
observar que tanto el estrés influye negativamente en los animales. Por
ejemplo se podría observar si las elevaciones de GCs están teniendo efectos
negativos en la dinámica de población o en la demografía (Creel, 2002). Para
esto, junto con los estudios de GCs se debería llevar a cabo un estudio de la
población de la especie en cuestión.
Por otro lado, hay que mirar hasta que punto el estrés provocado por los
humanos puede ser nocivo, ya que por el contrario las situaciones podrían
llegar a ser beneficiosas para los lobos, como lo muestra Creel en su estudio
sobre el efecto de los vehículos para nieve en los lobos: los animales
sacaban de los trayectos realizados por los vehículos, ya que aplanaban y
compactaban la nieve lo que los ayudaba en su desplazamiento.
Las situaciones que creemos estresantes deben ser evaluadas y estudiadas,
para discernir si son positivas o potencialmente negativas, y de este modo
saber si los animales sufren o pueden sacar beneficios de nuestras acciones.
Existen todavía muchos aspectos desconocidos de las especies animales y
esto genera muchos campos de investigación. La medición de
glucocorticoides se puede aplicar a cualquier animal de cualquier especie,
esté libre o en cautiverio. Es un estudio importante ya que puede llegar a ser
una herramienta muy valiosa en estudios de conservación, evolución y
protección de la vida animal.
26
BIBLIOGRAFIA
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