hiv-1 szubtÍpusokra optimalizÁlt, szemÉlyre szabott...

1

ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Erdei Anna, DSc

Klasszikus és molekuláris genetika program Programvezető: Prof. Dr. Orosz László, DSc

HIV-1 SZUBTÍPUSOKRA OPTIMALIZÁLT, SZEMÉLYRE SZABOTT IMMUNTERÁPIA

Doktori értekezés

Somogyi Eszter

Témavezető: Dr. Lisziewicz Julianna, PhD Genetic Immunity Kft., Budapest

Budapest 2012

2

Tartalomjegyzék 1. Rövidítések ................................................................................................................... 4

2. Bevezetés ...................................................................................................................... 6

3. Irodalmi áttekintés és a téma háttere ............................................................................ 8

3.1 A HIV felépítése és életciklusa .................................................................................. 10

3.2 A HIV fertőzés immunológiája .................................................................................. 13

3.3 HIV diverzitás és epidemiológia ................................................................................ 17

3.4 A DermaVir kifejlesztése ........................................................................................... 19

3.4.1 A DermaVir pDNS alapú antigénje ........................................................................... 21

3.4.2 Az antigén DC-be juttatása patogén-szerű szintetikus nanorészecskével ................. 21

3.4.3 DermaPrep orvosi eszköz a nanomedicina bőrön át történő bejuttatására .............. 22

3.4.4 Preklinikai és klinikai eredmények ........................................................................... 23

4. Célkitűzések ............................................................................................................... 26

5. Anyagok és módszerek .............................................................................................. 27

5.1. Nanomedicina készítés ............................................................................................... 27

5.2. Western blot ............................................................................................................... 27

5.3. Immunprecipitáció ..................................................................................................... 27

5.4. Intracelluláris festés ................................................................................................... 28

5.5. VLP+ termelés és tisztítás ........................................................................................... 28

5.6. Transzmissziós elektronmikroszkópia ....................................................................... 28

5.7. Biológiai aktivitás mérés ............................................................................................ 28

5.8. Statisztikai analízis ..................................................................................................... 29

5.9. In silico T sejt epitóp repertoár analízis ..................................................................... 29

5.10. Filogenetikai analízis ................................................................................................. 29

5.11. pDNS konstrukciók készítése .................................................................................... 30

5.11.1. Szekvenciák................................................................................................................. 30

5.11.2. RNS kivonás ............................................................................................................... 30

5.11.3. Oligonukleotidok tervezése és szintézise .................................................................... 30

5.11.4. RT-PCR ...................................................................................................................... 30

5.11.5. Agaróz gélelektroforézis ............................................................................................ 31

5.11.6. DNS tisztítás gélből .................................................................................................... 31

5.11.7. Inzert és pDNS vektor előkészítése irányított ligáláshoz ........................................... 31

5.11.8. Hőkompetens E. coli kompetens sejt készítés ............................................................. 32

5.11.9. Ligálás és transzformálás .......................................................................................... 32

5.11.10. pDNS termelés ............................................................................................................ 32

5.11.11. Az új pDNS-esek azonosságának ellenőrzése ............................................................ 32

6. Eredmények ................................................................................................................ 33

6.1. A DermaVir in vitro jellemzése ................................................................................. 34

6.1.1. A pLWXu1 pDNS által expresszált fehérje repertoár ................................................ 34

3

6.1.2. VLP+ termelés ............................................................................................................ 36

6.1.3. Biológiai aktivitás ...................................................................................................... 37

6.2. A nanomedicina immunológiai potenciáljának in silico modellezése ....................... 40

6.2.1. T sejt epitóp repertoár analízis kidolgozása .............................................................. 40

6.2.2. Abszolút immunológiai potenciál (AIP) ..................................................................... 42

6.2.3. A DermaVir (pLWXu1) immunológiai potenciálja egy személyben modellezve ....... 43

6.2.4. Relatív immunológiai potenciál (RIP) ....................................................................... 44

6.2.5. Nem-B szubtípusú fertőzés esetén a B-szubtípus alapú terápia hatékonyságának in

silico modellezése ....................................................................................................... 46

6.3. Szubtípus-optimalzált pDNS konstrukciók tervezése és klónozása .......................... 49

6.3.1. A vakcinatervezést segítő új alkalmazás: az “immunológiai fa” .............................. 49

6.3.2. Szubtípus-optimalizált termékjelöltek immunológiai szempontú tervezése ............... 52

6.3.3. Az új pDNS-ek elkészítése és a termékjelöltek in silico jellemzése ............................ 53

6.3.4. Az új szubtípus-optimalizált termékjelöltek in vitro tesztelése .................................. 56

6.3.4.1. VLP+ termelés az új termékjelöltek által.................................................................... 56

6.3.4.2. Az új termékjelöltek biológiai aktivitása .................................................................... 59

6.3.5. A nanomedicina termékcsalád in vitro eredményeinek összefoglalása ..................... 59

7. Eredmények megvitatása ........................................................................................... 61

8. Összefoglalás .............................................................................................................. 69

9. Summary .................................................................................................................... 71

10. Publikációk ................................................................................................................. 72

11. Köszönetnyilvánítás ................................................................................................... 73

12. Irodalomjegyzék…………………………………………..…..…………………....74

4

1. Rövidítések

AIDS Szerzett immunhiányos tünetegyüttes (Acquired Immune Deficiency

Syndrome)

AIP Abszolút immunológiai potenciál

ANN Mesterséges neurális hálózat (Artificial Neural Network)

APC Antigén prezentáló sejt (Antigen presenting cell)

ARB Általános relatív kötés (Average Relative Binding)

ART Antiretrovirális terápia

as aminosav

bp bázispár

CA Kapszid

cART kombinált antiretrovirális terápia

CTL Citotoxikus T limfocita (Cytotoxic T lymphocyte)

DC Dendritikus sejt (Dendritic cell)

EMA Európai Gyógyszerengedélyezési Hivatal (European Medicines Agency)

Env Burokfehérje (Envelope)

FDA Amerikai Élelmiszer- és Gyógyszerengedélyezési Hivatal (Food and Drug

Administration)

HIV Emberi immunhiány vírusa (Human Immunodeficiency Virus)

HLA Humán leukocita antigén (Human leukocyte antigen)

IEDB Immunológiai Epitóp Adatbázis (Immune Epitope Database)

IN Integráz

Kbp kilobázispár

LC Langerhans sejt (Langerhans cell)

MA Mátrix

MHC Fő hisztokompatibilitási antigén (Major histocompatibility complex)

NC Nukleokapszid

Nef Negatív faktor

PCR Polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction)

pDNS plazmid DNS

Pol Polimeráz

PEIm Polietilénimin-mannóz

Rev Virion expressziós szabályozó (Regulator of virion expression)

5

RIP Relatív immunológiai potenciál

RT Reverz transzkriptáz fehérje

SIV Majom immunhiány vírusa (Simian Immunodeficiency Virus)

SMM Stabilizált mátrix módszer (Stabilized Matrix Method)

SU Felszíni fehérje (surface protein)

Tat transzaktiváló szabályozó fehérje (Transactivating regulatory protein)

TM Transzmembrán fehérje

Vif Virion fertőzési faktor (Virion infectivity factor)

VLP Vírusszerű részecske (Virus-like particle)

VLP+ Komplex vírusszerű részecske

Vpr R-vírusfehérje (Viral protein R)

Vpu U-vírusfehérje (Viral protein U)

6

2. Bevezetés

Ez a doktori munka a Genetic Immunity Kft. termékfejlesztési laboratóriumában

készült.

A HIV (Human Immunodeficiency Virus) fertőzés és a következtében kialakuló AIDS

(Acquired Immunodeficiency Syndrome) világszerte 34 millió fertőzöttet számláló

halálos betegség [1]. Egyelőre nem létezik ellene sem megelőző oltás, sem terápiás

vakcina, noha a vakcina fejlesztés egyik kiemelkedő fontosságú célterülete ez. Az

antiretrovirális gyógyszeres terápia számos mellékhatása, és a gyógyszer rezisztens

vírustörzsek kialakulása miatt sürgető feladat egy működő, és a szervezetre kevésbé

káros vakcina kifejlesztése.

A Genetic Immunity Kft. terápiás nanomedicina kifejlesztését tűzte ki célul a

HIV/AIDS kezelésére. (A nanomedicina a nanotechnológia orvosi alkalmazásának

összefoglaló megnevezése, és ez a kutatási terület többek között betegségek

megelőzésére, kezelésére, és diagnózisára keres megoldásokat [2].) A Genetic

Immunity első termékjelöltje, a DermaVir HIV Tapasz már a klinikai fejlesztés

második fázisában jár. A nanomedicina terápiás alkalmazásának célja de novo T sejtes

immunválasz kiváltása a kezelt beteg szervezetében, mely a HIV-vel fertőzött sejtek

pusztításával csökkenti a vírusterheltséget, ugyanakkor javítja az immunrendszer –ezzel

a fertőzött személy– általános állapotát.

A nanomedicina hatóanyaga egy patogén-szerű nanorészecske, ami HIV fehérjéket

kódoló plazmid DNS-ből (pDNS) és kationos szintetikus polimerből (polietilénimin-

mannóz, PEIm) áll, folyadék formulációban. A nanorészecske oldat célzott, bőrön át

történő “beadását”-, ezzel együtt az epidermiszben lévő antigén bemutató sejtekhez

(Langerhans sejtek, LC) irányítását a szintén saját fejlesztésű DermaPrep orvosi eszköz

teszi lehetővé. Az immunválasz kiváltásában kulcsfontosságú hatóanyag a pDNS, ami

számos HIV fehérjét (antigént) expresszál, az első termékjelölt esetében B szubtípusra

specifikusakat.

A HIV azonban rövid története ellenére az RNS vírusok gyors evolúciója miatt nagy

természetes diverzitással rendelkezik. Kilenc térbeli és időbeli elkülönülést mutató

szubtípusba (és számos rekombináns alcsoportba) sorolható, melyek között 10-35%

genetikai távolság állapítható meg [3].

7

Kérdésként merül fel, hogy az ilyen nagy divergenciát mutató szubtípusokkal fertőzött

betegek esetében mennyire lehet hatékony a B szubtípusra specifikus nanomedicina?

Ezért a doktori munka egyik célkitűzése a B szubtípusra specifikus termékjelölttel

kiváltható immunválasz in silico modellezésének kidolgozása, majd ezzel a

nanomedicina kereszt-reaktivitásának modellezése volt nem-B szubtípusú fertőzések

esetén. A kapott eredmények alapján döntöttünk egy szubtípus-optimalizált

termékcsalád kifejlesztése mellett. A feladat megvalósításához egy immunológiai

szempontú tervezést segítő eszközt is kifejlesztettünk. Ezenkívül fontos célunk volt a

klinikai tesztelés alatt álló DermaVir termékjelölt in vitro jellemzése, ehhez módszerek

fejlesztése, majd végül az új nanomedicina jelöltek klinikai vizsgálatokra alkalmas

minőségének in vitro igazolása.

8

3. Irodalmi áttekintés és a téma háttere

Létezik-e olyan antigén, ami a HIV fertőzés ellen véd? Ez a kérdés kutatók ezreit és

emberek (tíz)millióit foglalkoztatja 25 éve. Eddig senki nem adott egyértelmű választ a

kérdésre. Nincs megelőző védőoltás, mert a HIV számos védőmechanizmusa, valamint

genetikai változatossága miatt az eddigi összes antigén jelölt hatástalannak bizonyult. A

kutatás tovább folyik, de a sikertelenség miatt időközben előtérbe került a terápiás

vakcinák fejlesztése, hogy a világméretű járvány fertőzöttjeinek jobb életkilátásokat és

jobb életminőséget nyújtsanak. Amíg célt nem ér valaki, addig marad az antiretrovirális

terápia (ART), a vírus életciklusának különböző szakaszait gátló közel harmincféle

piacon lévő gyógyszerrel [4]. Az ART legnagyobb hátránya, hogy a vírus RNS

örökítőanyagának rendkívül gyors mutációs képessége miatt hamar kialakulnak a

gyógyszerrezisztens mutánsok. Épp ezért a gyógyszereket hármas kombinációban adják

(cART), és amikor az adott betegben hatástalanná válik, lecserélik egy újabb

gyógyszerkombinációra. Sajnos sok HIV fertőzött eljut odáig, hogy már nincs mire

lecserélni a gyógyszereit.

A terápiás HIV vakcina tervezés esetén is az egyik legnagyobb kihívás a megfelelő

antigén készlet kiválasztása, amely hatékonyan képes HIV-specifikus T sejteket

indukálni, hogy azok sikeresen elpusztíthassák a vírussal fertőzött sejteket a beteg

szervezetében, ezzel fékezve a betegség előrehaladását. Minél szélesebb az antigén

repertoár, annál többféle antigén-specifikus T sejt termelődése indukálható, és annál

hatékonyabb lehet a vakcina [5]. A gyengített vírust tartalmazó vakcinák ezért sikeresek

sok kórokozó elleni védelemben (pl. mumpsz, kanyaró, rubeola). Sőt, már a SIV

(majom immundeficiencia vírus) esetében is kifejlesztettek hosszú távú védettséget

biztosító, gyengített kórokozót tartalmazó oltóanyagot [6]. Ez bíztató eredmény arra

nézve, hogy esetleg emberben is indukálható tartós, a vírus replikációt kordában tartó

immunválasz a HIV ellen. Azonban a gyengített HIV vírus vakcinaként történő

alkalmazása túl sok biztonsági kockázatot rejt [7].

Az elterjedten használt alegység vakcinák ezzel szemben csak egy vagy néhány

antigént tartalmaznak. Ezek újabb alternatívája a VLP (vírusszerű részecske) vakcina,

ami spontán összeszerelődő kapszidfehérjékből, valamint esetenként burokfehérjékből

áll, és nagy előnye, hogy az alkotó fehérjéket természetes konformációban tartalmazza

a leghatékonyabb immunválasz kiváltása érdekében. Már kereskedelmi forgalomban is

9

kaphatók ilyen VLP vakcinák, pl. a magas kockázatú humán papillomavírus törzsek

elleni megelőző vakcinák (Gardasil® és Cervarix™) [8,9]. Eddig azonban a VLP

vakcinák terápiás felhasználása nem volt sikeres (vagy fel sem merült), mivel nem

váltanak ki a terápiás vakcinák hatékonyságához szükséges T sejtes immunválaszt [10].

Néhány kivételes esetben megfigyeltek már mind a fertőzéstől megvéd, mind terápiás

szempontból hatékony immunválaszt HIV-fertőzött betegekben [11,12,13,14]. Ezen

esetek jelzik, hogy a HIV virion jó antigén, ami ellen létezhet hatékony természetes

immunválasz. Épp ezért a széles antigén repertoár és a virion felszíni

struktúrfehérjéinek együttes bevetése immunogénként működő vakcinát

eredményezhet, amit már többféle vakcinafejlesztési elképzelésben is felhasználtak.

Többen is készítettek kémiailag módosított-, vagy replikációs mutáns HIV

vírustörzseket, de a klinikai vizsgálatokra vonatkozó kérelmeiket nem fogadták el a

gyógyszerengedélyezési hatóságok, mert a vakcina-jelöltek nem bizonyultak eléggé

biztonságosnak [15, 16].

Az egyéb vírus-vektor alapú vakcinák fő hátránya, hogy a vektorral szembeni korábbi

védettség miatt nem alkalmazhatók mindenkinél, és terápiás célú (többszöri)

alkalmazásuk is korlátozott a vektor antigének ellen kialakuló immunválasz miatt, amik

közömbösíthetik a vakcina hatását. A Merck STEP klinikai kísérletében például

Adenovírus 5 vírus-vektor alapú megelőző vakcinát használtak magas fertőzési

kockázatú HIV negatív egyének bevonásával. Sajnos azonban a kezelt csoportban

magasabb volt a HIV-fertőzések száma a korábban Adenovírus fertőzésen átesett

személyek vírusvektorral szembeni immunitása miatt, mint a kontroll csoportban [17].

A nem vírus-vektor alapú DNS vakcinákat is azzal a céllal fejlesztik, hogy számos

antigén ellen váltsanak ki velük immunválaszt. Előnyük, hogy egy DNS konstrukció

sok antigént expresszálhat, ezáltal széles repertoárú patogén-specifikus immunválaszt

válthat ki, emellett a körültekintő és többszörös biztonsági módosítások könnyen

bevihetők a DNS-be. Így megszüntethetők az eredeti kórokozó integrációs-, és onkogén

tulajdonságai, valamint megakadályozható, hogy a vakcinaként felhasznált módosított

örökítőanyag replikálódjon, ill. rekombinálódjon vad vírustörzsekkel.

A Genetic Immunity laboratóriumában olyan terápiás HIV vakcina kifejlesztését tűztük

ki célul, ami HIV specifikus T sejtek széles repertoárjának képződését képes kiváltani,

ezáltal a HIV fertőzés ill. az AIDS lefolyását lassítani. A DermaVir terápiás vakcina

pDNS hatóanyaga a tizenöt HIV fehérje közül tizenhármat teljes hosszúságában-, kettőt

10

pedig részlegesen kódol és expresszál a célzott antigén bemutató sejtekben (APC). A

pDNS célba juttatását lehetővé tevő nanorészecske formuláció-, valamint a bőrben lévő

APC-k elérését szolgáló “DermaPrep” bőr előkészítő és kezelési eljárás fontos részét

képezik az alább kifejtett hatásmechanizmus kiváltásának. Előbb azonban tekintsük át

röviden a HIV életciklusát, immunológiáját és epidemiológiáját!

3.1 A HIV felépítése és életciklusa

A HIV (Human Immunodeficiency Virus) a Retroviridae család Lentivirus genusába

tartozik, többek között a majom immunhiány vírusával (SIV) együtt. A 120 nm

átmérőjű burkos RNS vírus lassú lefolyású halálos fertőzést okoz. A HIV genomját két

azonos, egyszálú pozitív irányultságú, 9,5 kilobázis méretű RNS alkotja, ami a

következő vírusalkotó fehérjéket expresszálja (1. ábra) [18]: Gag poliprotein (mely a

vírus érése során tovább hasítódik mátrix-MA, kapszid-CA és nukleokapszid-NC

fehérjékké), Pol poliprotein (melyet saját enzimaktivitása hasít proteáz-PR, reverz

transzkriptáz-RT és integráz-IN fehérjékre), valamint az Env 160 kDa méretű

poliprotein (amit a gazdasejt proteázai gp120 felszíni fehérje alegységre-SU és a pg41

transzmembrán fehérje alegységre-TM hasítanak, és ezek trimerei alkotják a vírus

felszíni gligoproteinjét). A szerkezeti fehérjéken kívül szabályozó fehérjéket is kódol a

genom: Tat és Rev, valamint a Nef, Vif, Vpr és Vpu járulékos fehérjéket [19].

1. ábra. A HIV virion felépítésének sematikus ábrája.

Integráz (Pol-IN)

vírus genom

Kapszid (Gag-CA)Nukleokapszid

(Gag-NC)

Proteáz (Pol-PR)

Transzmembrán

burokfehérje (Env-TM)

Felszíni burokfehérje

(Env-SU)

Reverz transzkriptáz

(Pol-RT)

Vpr

kettős lipidréteg

Mátrix (Gag-MA)

11

A vírus szexuális úton a nyálkahártya mikrosérülésein át, vagy vérrel, ill. vertikálisan

anyáról magzatra, illetve újszülöttre (anyatejjel) terjed [20]. Sikeres fertőzés az után

jöhet létre, hogy a szervezetbe került virionok bejutnak a szaporodásuk helyszínéül

szolgáló immunsejtekbe: elsősorban a CD4 receptorral rendelkező T limfocitákba,

esetleg dendritikus sejtekbe (DC) ill. makrofágokba. Először általában nyugvó CD4+ T

sejteket fertőz a vírus, majd ezekben intenzív reprodukciós ciklussal megsokszorozza a

vírusmennyiséget (ez a fertőzés akut fázisa, amit enyhe mononukleózis-szerű tünetek

kísérhetnek). A T sejt CD4+ receptorán és koreceptorán (CCR5 vagy CXCR4) az Env-

SU felszíni glikoproteinjének segítségével rögzül a virion. Majd konformáció változás

után az Env-TM fehérje utat nyit a sejtbe: a vírus burka a gazdasejt membránjába olvad,

a kapszid pedig bejut a citoplazmába (2.ábra) [21]. Ezután a kapszid is lebomlik, és

szabaddá válik a vírusgenom, megkezdődik a replikáció. Az RT fehérje révén az RNS-

ről RNS-DNS hibrid, majd kettős szálú DNS másolat készül, mely gyűrű

konformációjú preintegrációs komplexként az IN fehérje segítségével a gazdasejt

genomjába integrálódik [22]. A vírus ezen integrálódott formája a provírus, és

amennyiben a fertőzött T sejtből memória T sejt alakul ki, ez a látens fertőzés hosszú

ideig fennmaradhat, a vírus rezervoárját (ill. annak egy részét) alkotva [23,24]. Ha a

gazdasejt aktiválódik ― vagyis mitózis történik, RNS polimeráza kis mennyiségben

mRNS-eket szintetizál az integrálódott HIV DNS-ről, és ezekről korai szabályozó

fehérjék expresszálódnak [25]. Előbbi (“transzaktivátor fehérje”, a transzkripció fő

virális szabályozó fehérjéje) a genom LTR promóterérnek TAR (“Transactivating

Responsive Region”) szabályozó régiójának transzkriptumához kötődve transzkripciós

iniciátorként és elongációs faktorként fokozza az mRNS-ek képződését (3. ábra)

[25,25,26]. A Rev az RRE (“Rev Responsive Element”) szabályozó régióhoz kötődve a

képződött teljes hosszúságú és a részlegesen hasított mRNS-ek sejtplazmába történő

exportját-, ezzel a HIV fehérjék transzlációját segíti elő [27]. A termelődő vírus

fehérjék a teljes hosszúságú mRNS két kópiáját is becsomagolva éretlen HIV

részecskékké szerelődnek össze a sejthártyát is integrálva annak belső oldalán, majd a

folyamat a sejthártya lefűződésével és ezzel a termelődött HIV vírusok sejtből való

kijutásával zárul. Utolsó lépésként transzlációt követő fehérje hasítással a Gag

poliproteinből származó fehérjék is előállítódnak, felveszik végleges térszerkezetüket és

a Gag-CA fehérjékből kialakul a kapszid, ami az érett virion morfológiájának ismérve

[28].

2

3: transzkripció, 4: a virális DNS integrációja a gazdasejt genomjába, 5: fehérjeszintézis és új

vírusok összesz

3

starthelyt

ábra bal alsó rész

TAR

2. ábra.


vírusok összesz

3. ábra.

starthelyt


TAR

. ábra.


vírusok összesz

. ábra.

starthelyt


TAR RNS szürk

. ábra. A HIV életciklusának áttekintése


vírusok összesz

. ábra.

starthelytő


RNS szürk

A HIV életciklusának áttekintése


vírusok összesz

. ábra. A HIV

starthelytől közvetlenül


RNS szürk



vírusok összeszerel

A HIV

ől közvetlenül


RNS szürk

CD4+ T sejt



erelő

A HIV

l közvetlenül

ábra bal alsó részén látható

RNS szürkével jelölt régiójához köt

CD4+ T sejt



erelődése, 6: új vírusok lef

A HIV genom és promóter

l közvetlenül

én látható

ével jelölt régiójához köt

CD4+ T sejt



ődése, 6: új vírusok lef

genom és promóter

l közvetlenül downstream irányban helyezkedik el a TAR szabályozó régió, ami az

én látható


HIV

CD4+ T sejt



dése, 6: új vírusok lef

genom és promóter

downstream irányban helyezkedik el a TAR szabályozó régió, ami az

én látható „


HIV virion

CD4+ T sejt

RNS/DNS

Virális

dsDNS




genom és promóter


„stem


virion

1

RNS/DNS

Virális

dsDNS




genom és promóter


stem-loop


virion

RNS/DNS

Virális

dsDNS




genom és promóter


loop


2

RT



dése, 6: új vírusok lefű

genom és promóter


loop” struktúrájú RNS

ével jelölt régiójához kötődik.

Vírus

RT

A HIV életciklusának áttekintése. 1: Vírus köt


dése, 6: új vírusok lefűződése.

vázlatos


struktúrájú RNS

ével jelölt régiójához kötődik.

Vírus

1: Vírus köt


űződése.

vázlatos


struktúrájú RNS

ődik.

3

4

Vírus ssRNS

1: Vírus köt


ődése.

vázlatos


struktúrájú RNS

4

ssRNS

m

1: Vírus kötő


vázlatos térképe


struktúrájú RNS

mRNS

1: Vírus kötődés és sejtbe jutás, 2: kicsomagolódás,


térképe


struktúrájú RNS-

Sejtmag

Provírus

RNS

ődés és sejtbe jutás, 2: kicsomagolódás,


térképe. A promóter


-t kódolja.

Sejtmag

Provírus

dés és sejtbe jutás, 2: kicsomagolódás,


. A promóter


t kódolja.

Sejtmag

Provírus



. A promóter


t kódolja.

5



. A promóter


t kódolja. A Tat szabályozó fehérje a

Új HIV

6



. A promóterben a


A Tat szabályozó fehérje a

Új HIV



ben a



Új HIV



ben a





transzkripciós





transzkripciós





transzkripciós



12



transzkripciós



12



transzkripciós



13

3.2 A HIV fertőzés immunológiája

A HIV fertőzés immunológiai alapjainak áttekintéséhez a klinikusok számára készített

UpToDate online tudásbázist használom vezérfonalként [29]. A HIV leggyakrabban az

anogenitális nyálkahártyán át fertőz, és az előző bekezdésben leírt módon jut be a CD4

receptorral rendelkező immunsejtekbe. A célsejtbe jutáshoz a gp120 vírusfehérje és a

célsejt CD4 receptorának kapcsolódásán kívül a CCR5 vagy a CXCR4 koreceptor

keresztkötése is szükséges. A vírus koreceptor használata meghatározza a célsejtek

fajtáját: a CCR5 koreceptor segítségével bejutó HIV törzsek makrofág-, ill. DC

tropikusak, a CXCR4 koreceptor pedig a T sejt tropikus HIV bejutásában játszik

szerepet, de vannak olyan vírusok is, amik mindkét koreceptorral képesek kapcsolódni

[30]. Friss (ún. elsődleges) fertőzést általában makrofág/DC tropikus vírus hoz létre. A

leggyakoribb a DC antigénbemutató sejt fertőzése, produktív vagy nem produktív

módon. A nem produktív fertőzés eredményeképp a vírus a DC-SIGN receptorhoz

kapcsolódva bejut a sejtbe, de nem replikálódik, hanem a DC segítségével a

nyirokcsomóba jut és ott CD4+ T sejteket fertőz [31,32]. A vírus két nap múlva már

kimutatható a közeli nyirokcsomókban, további három nap múlva pedig a vérben is

[33]. Ezután a fertőzés szétterjed az egész szervezetben.

A következő, akut fertőzési szakasz néhány hetében többnyire mononukleózis-szerű

tünetekkel kísérve (láz, nyirokcsomó-duzzanat), esetleg tünetmentesen a vírus gyorsan

replikálódik (4. ábra) [34]. Ezzel egy időben a CD4+ T sejt szám csökken, a CD8+ T

sejt szám pedig emelkedik, de mindkettő hamar visszaáll az eredetihez közeli szintre. A

CD4+ T sejt szám csökkenés, valamint a Th17 (szabályozó) T sejt szám csökkenés az

emésztőrendszer mentén lévő nyirokcsomókban lokális immunhiányt okoz, ennek

következtében a bélfal nyálkahártyáján át baktériumok kerülnek a szervezetbe, ami

krónikus immun-aktivációt eredményez [35,36]. Az immun-aktivációban természetesen

szerepet játszik az intenzív HIV replikáció is.

14

4. ábra. A HIV fertőzés tipikus időbeli lefolyása a CD4+ T sejt szám és a vérplazmában

mérhető HIV RNS mennyiségének függvényében.

Az akut HIV fertőzési szakaszban a természetes ölősejtek (NK) közvetlen lízissel, és

ellenanyag-függő citotoxikus mechanizmussal (ADCC) pusztítják a fertőzött sejteket.

Az NK sejtek átmenetet képeznek a veleszületett- és az adaptív immunválasz között,

mivel elősegítik a DC-k érését [37]. A DC professzionális antigénbemutató sejtek

(APC) szerepe kulcsfontosságú a HIV specifikus immunválasz kiváltásában.

(Ugyanakkor ezek a sejtek fertőződnek meg elsőként, amikor a HIV a nyálkahártyán át

bejut a szervezetbe.) Az éretlen DC-k endocitózissal veszik fel a virionokat a

szervezetbe jutásuk helyén, és a közeli nyirokcsomóba vándorolnak, miközben érett

DC-vé differenciálódnak az antigén feldolgozása során. A DC-k antigén bemutató

funkcióját az MHCI (fő hisztokompatibilitási komplex I) és MHCII (fő

hisztokompatibilitási komplex II) molekulákhoz kapcsolt immunogén peptidekkel, azaz

epitópokkal hajtja végre. A 9-11 aminosav (as) hosszúságú epitópot kötő MHCI

molekula CD8+ T sejtek érését (ún. priming-ot) segíti elő, míg az MHCII molekulához

kapcsolt 13-25 as méretű epitópok a CD4+ helper T sejtek érését stimulálják. A HIV

virionok endocitózisa után az exogén (sejten kívülről származó) vírusfehérjék

proteolitikus lízissel peptidekre esnek, és ezek egy része az endocitotikus úton MHCII

molekulákra kötődik, amit a DC-k CD4+ helper T sejteknek mutatnak be (5.ábra) [38].

A sejten belül képződő vírusfehérjék, és kereszt-prezentációval akár a sejten kívülről

15

felvett antigének is képesek az MHCI útvonalon CD8+ citotoxikus T sejtek (CTL)

primingjára [39,40]. (A HIV vírus Nef fehérjéje az antigén bemutatás hatékonyságát

csökkenti, mert az MHCI és MHCII molekulák downregulációjával akadályozza HIV

epitópok megjelenését a sejtfelszínen [41,42].) Az MHCI útvonalon a HIV antigének

proteasomákban történő részleges lebontás után peptidek formájában haladnak át a TAP

transzportfehérjéken (Transporter associated with Antigen Processing) az

endoplazmatikus retikulumba. A TAP molekulán azonban átlagosan csak minden 7.

peptid képes átjutni, és az epitópok száma még ennél is kisebb, mert csak minden 200.

peptid illik bele az MHCI molekula kötőzsebébe, hogy aztán megfelelő erősséggel

kötődjön [43,44].

5. ábra. Az antigén bemutatás útvonalai DC-kben. A HIV fehérjéket a DC-k mindkét útvonalon

képesek feldolgozni: a sejten kívülről származó antigénekből proteolitikus bontással nyert

peptideket MHCII molekulákon mutatják be, ezzel CD4+ T sejtek érését elősegítve. A sejtben

képződő vírusfehérjék, ill. kereszt-prezentációval az endocitózissal felvett antigénekből

származó peptidek pedig MHCI molekulákhoz kapcsolódva CD8+ T sejtek érését segítik elő.

Az MHCI-hez a TAP transzportfehérjén átjutott peptidek egy része tud kapcsolódni.

A DC-k tehát elősegítik a differenciálódó CD4+ helper- és CD8+ T sejtek HIV

specifikus effektor sejtté- ill. memória sejtté érését. Az antigén bemutatás során a

nyirokcsomóban a vírus specifikus MHC-peptid komplexhez kapcsolódni képes T sejt

16

receptorú (TCR) T sejtek aktiválódnak, és gyorsan proliferálódnak, aminek

köszönhetően több nagyságrenddel megnő a mennyiségük. A CD8+ T sejtek emellett

differenciálódnak is (effektor/memória sejtté). Az effektor sejtek antivirális citokineket

termelnek (pl. IFN-γ, β-kemokin, MIP-1α, MIP-1β és RANTES), ill. citolitikus sejtté

differenciálódnak granzim és perforin enzimek termelésével (ez a sejtpopuláció képes a

nyirokszerveket, ill. nyirokkeringést is elhagyni). A citolitikus sejtek azután közvetlen

lízissel képesek elpusztítani a specifitásuknak megfelelő fertőzött sejteket. Az effektor

sejtek kis része további differenciálódás után nyugvó memóriasejtekké alakul, amik

antigén hiányában is hosszú ideig képesek fennmaradni, és újabb antigén stimulusra

azonnali effektor funkciókkal válaszolni. A CD4+ helper T sejtek termelődése az

immunválasz során két szempontból meghatározó: a HIV fertőzés miatt pusztuló CD4+

T sejt állományt pótolják, és a CD8+ T sejtek működését segítik. Utóbbi segítő funkció

több szinten is megnyilvánul, pl. a CD8+ T sejtek megfelelő primingjában az akut

fertőzés során, és a memória CD8+ T sejt populáció kialakulásában. A CD4+ T sejtek

közreműködésével kialakult CD8+ memória T sejtek pedig hatékonyabb másodlagos

effektor populációt képesek termelni [45,46,47]. Noha a vírusfertőzések során az

ellenanyag termelés kulcsfontosságú a fertőzés megakadályozására, HIV esetében ez

nem igaz. A neutralizáló ellenanyagok definíció szerint a kórokozó felszíni fehérjéihez

specifikusan kapcsolódva megakadályozzák, hogy a fertőzés létrejöjjön. A neutralizáló

(és a nem-neutralizáló) HIV specifikus ellenanyagok azonban nem tudnak megfelelő

hatást kifejteni a fertőzés megelőzésére, de még a vírus replikáció fékezésére sem a

krónikus fertőzési szakaszban. Ennek oka, hogy a vírus gyors mutációs rátájának és az

immunszelekciónak köszönhetően hamar megjelennek olyan mutáns vírustörzsek, amik

az ellenanyag kötőhelyeken változva kivédik az ellenanyag kötődését. [48,49].

A fent részletezett specifikus (adaptív) immunválasz megfékezi és visszaszorítja a HIV

további szaporodását: a HIV-specifikus T limfociták hatékonyan csökkentik a szervezet

vírus-terheltségét. A humorális immunválasz eredményeként pedig jelentős ellenanyag

termelés mutatható ki, vagyis megtörténik a szerokonverzió is. A fertőzés akut

szakaszában a legtöbb HIV virion éppen a frissen fertőzött proliferálódó CD4+ T

sejtekben termelődik. Noha az immunrendszer hatékonyan pusztítja ezeket a fertőzött T

sejteket, egy kis részük elég hosszú ideig életben marad ahhoz, hogy visszaalakuljon

nyugvó memória sejtté, és az integrálódott HIV-et (provírus) hordozva a vírus

rezervoárját képezze.

17

A lecsökkent vírusszám, és replikációs aktivitás mellett az immunrendszer hosszú

évekig képes kontrollálni a fertőzést (akár 15 évig), ez a klinikailag tünetmentes látens

fertőzési szakasz. Ezalatt a CD4+ T sejt szám és a DC-k száma is lassan csökken, sőt

egyes nagyon alacsony vírusszámú fertőzöttekben sosem éri el az AIDS tünetegyüttes

kialakulásához vezető mennyiséget. A csökkenés oka elsősorban az, hogy a vírus a

CD4+ T sejteket fertőzi, továbbá a vírusra ható immunszelekció (escape mutánsok

megjelenése), és az aktivált T sejtek apoptózisra való “hajlama” is közrejátszik a

folyamatban.

Amikor a CD4+ sejtek száma a kritikus mennyiséget közelíti (200/ml), a

vírusmennyiség drasztikusan nőni kezd, és járulékos fertőzések tünetei jelennek meg a

betegben, pl. TBC, toxoplazma, gombás fertőzések, és tumoros betegségek. Az AIDS, a

szerzett immunhiányos tünetegyüttes a HIV fertőzés utolsó fázisa, ami néhány éven

belül halállal végződik.

Fontos megjegyezni, hogy az immunválasz minőségét, ezáltal a betegség lefolyásának

sebességét nagyban befolyásolhatja a fertőzött egyén MHC genotípusa. Egyes MHC

allélek (más néven HLA-humán leukocita antigén) nagyon hatékony immunválasszal

egészen alacsonyra csökkentik az akut fázisban a vírusszámot, ezzel lassú betegség

lefolyást tesznek lehetővé. Ezek a protektív allélek, pl. HLA-B57 [50]. Sajnos azonban

léteznek nem-protektív allélek is, pl. HLA-B35, és az ilyen allélekkel rendelkező

betegekben az átlagosnál gyorsabb a betegség lefolyása. HLA [51].

3.3 HIV diverzitás és epidemiológia

A HIV-1 vírus őse valószínűleg a SIV majom immundeficiencia vírus volt, amit

Kamerunban csimpánz vadászok kaphattak el elsőként [52,53,54]. A majom vírusok

filogenetikai vizsgálatai alapján úgy tűnik több független fertőzési esemény is történt,

az első valamikor az 1930-as évek környékén [55]. Ezekből jöhetett létre a HIV-1

három járványcsoportja: a mára globális járványokozó M (main) csoport, az O (outlier)

csoport és az N (non-outlier) csoport [3]. Egy átfogó filogenetikai tanulmány szerint

viszont az O csoport tagjaihoz filogenetikailag legközelebb álló majom vírustörzsek

gorillából származnak [56]. Az N és O csoport tagjai csak az eredetük helyén, Nyugat-

Afrikában terjedtek el, míg az M csoport alább részletezett szubtípusai és rekombináns

csoportjai tehetők felelőssé a globális járványokért (6. ábra. HIV szubtípusok és

rekombináns formák földrajzi elterjedése.) [54].

18

A HIV-2 kórokozó őse szintén majom SIV, a Cercocebus atys fajt fertőző vírus, de a

HIV-2 járványtani jelentősége a HIV-1 N és O csoportjához hasonlóan kis területekre

korlátozódik [57]. Ezért a továbbiakban a HIV rövidítés alatt jellemzően a HIV-1 M

csoportját értem.

Rövid múltja ellenére a HIV nagy természetes diverzitással rendelkezik, és számos,

térbeli és időbeli elkülönülést mutató kisebb genetikai csoportba, szubtípusba sorolható.

Gyors evolúciójának legfőbb oka, hogy a HIV reverz transzkriptáz enzimének nincs

proofreading hibajavító aktivitása, így a magas, kb. 3,4x10-5

mutáció/bázispár/replikációs ciklus mutációs ráta eredményeként milliós nagyságrendű

új vírusvariáns képződik naponta(!) minden fertőzött személyben [58]. Ilyen ütemű

evolúció mellett mára a szubtípusok genetikai diverzitása 10-35% [3]. Jelenleg 9

szubtípusba sorolhatók az M csoportba tartozó izolátumok, melyeket A-K betűkkel

jelölnek, ill. vannak még kisebb genetikailag elkülönülő csoportok: szub-szubtípusok,

valamint rekombináns alcsoportok, amik kialakulásához különböző szubtípusokkal való

egyidejű fertőzés, rekombináció, és a rekombináns sikeres terjedése szükséges (6. ábra)

[54]. A HIV-1 nevezéktani ajánlás definíciója szerint ilyen rekombinánsok (circulating

recombinant form, CRF) akkor jegyezhetők be, ha legalább három személyből,

járványtani kapcsolatot nem mutató esetekben izolálják a stabilizálódott rekombináns

vírust [59].

6. ábra. HIV szubtípusok és rekombináns formák földrajzi elterjedése.

B és CRF01_AE

CRF02_AG és más rekombináns formák

A, B és AB rekombináns forma

B és BF rekombináns forma

B, C és BC rekombináns forma

F, G, H, J, K, CRF_01 és más rekombináns formák

Nincs elegendő adat

A

B

C

D

19

3.4 A DermaVir kifejlesztése

A DermaVir nanomedicina kifejlesztésének ötletét egy HIV-fertőzött beteg különleges

kórtörténete adta 1999-ben [14,60]. A betegnél korai diagnózist követően kezdték meg

az antiretrovirális terápiát, amit a szokásos módon szakítottak meg ún. kezelési

szünetekkel (a kezelési szünetekben az immunrendszer ugyanis új erőre kap). Két ilyen

kezelési szünet után az ilyenkor szintén szokásos mérsékelt vírusszint emelkedés volt

megfigyelhető. Aztán a beteg egy időre abbahagyta a terápiát, és a következő klinikai

ellenőrzés során kiderült, hogy vírusszintje nem emelkedett. Vagyis a beteg szervezete

olyan hatékony immunválaszt produkált, ami kordában tudta tartani a fertőzést. A

vírusszint ezután még évekig alacsony maradt antiretrovirális kezelés nélkül, és csak

azután emelkedett újból mérhető szintre! Ez volt az első klinikai megfigyelés, ami azt

mutatta, hogy létezhet hatékony immunválasz a HIV ellen. Az eset rámutatott, hogy a

fertőzés korai szakaszában a T sejtes immunválasz megfelelően erős ahhoz, hogy a

vírusszámot a mérési határ alá szorítsa. A megfigyelést egy majomkísérlettel is sikerült

igazolni: primer fertőzést követően beiktatott kezelési szünet után a T sejtes

immunválasz sikeresen megfékezte, és visszaszorította a SIV vírus szaporodását [61]. A

fertőzés hosszú távú természetes kontrollját azóta sokan leírták az “elit kontroller” HIV

fertőzöttek esetében, akiknél a szabad vírusszám tartósan nagyon alacsony (50 kópia/ml

alatti) [62].

A termékfejlesztés irányát az ekkor megfogalmazott kérdés határozta meg: hogyan

lehetne olyan HIV-specifikus T sejtes immunválaszt generálni, ami hatékonyan

pusztítja a HIV-vel fertőzött sejteket, és ezzel a tünetmentes fázisban megfékezi a

betegség előrehaladását? Mivel a T sejtek kórokozó-specifikussá érését

antigénbemutató sejtek irányítják, ezért HIV antigének DC-kbe juttatásával lehetne

megoldani a feladatot. A kifejlesztett DermaVir termék lényegében a természetes

immunválasz biztonságos utánzása, az alábbi módon. A hatóanyag pDNS, ami a

biztonsági módosítások mellett a lehető legtöbb HIV antigént kódolja, hogy minél

hatékonyabb (széles specifitású) T sejt választ tudjon kiváltani. A pDNS DC-k általi

felvételét és az antigén expressziót egy szintetikus patogén-szerű nanorészecske

formuláció segíti [63]. A nanorészecskék DC-khez irányítása pedig egy szintén saját

fejlesztésű technológiával történik: a DermaPrep kezelési eljárással a nanorészecske

oldat a bőrben lévő DC populációhoz, az LC-khez juttatható. A DermaVir kezelés

hatásmechanizmusát a 7. ábrán mutatom be röviden.

20

7. ábra. A DermaVir kezelés hatásmechanizmusának áttekintése. A bőr előkészítése a során a

nanomedicina penetrációját akadályozó felső elhalt sejtrétegeket (stratum corneum) kell

eltávolítani dörzsöléssel. Ugyanez a lépés aktiválja, és a kezelt területre vonzza az LC-ket

enyhe bőrpír kíséretében. Ezután zsebet formáló, szélein leragasztható 80 cm2-es tapasz(oka)t

helyezünk a bőrre, és az így képződő “tartályba” juttatjuk a nanorészecskéket tartalmazó

oldatot. Az odasereglő aktivált LC-k felveszik a mannozilált felszínű, patogént imitáló

nanorészecskéket és a nyirokcsomóba vándorolnak, ahol az időközben a pDNS-ről termelődő

fehérje antigéneket feldolgozzák. A feldolgozott antigénekből származó epitópokat ezután

éretlen T sejteknek mutatják be (priming), amit az immár HIV specifikus CD4+ és CD8+ T

sejtek proliferációja-, és a szervezetben való szétterjedése és követ. A kezelés hatására

termelődött T sejtek (effektorok és nagy proliferációs kapacitású memória sejtek) a HIV-vel

fertőzött sejteket pusztítják.

A DermaVir kezelés fő lépései megegyeznek a kórokozók elleni T sejtes immunválasz

természetes lefolyásával: a kezelést végző személy a bőr felső elszarusodott rétegét

dörzsöléssel távolítja el. Ezzel megszünteti a fizikai akadályt, ami a nanomedicina vizes

oldatának felszívódását akadályozná, valamint ez a “veszély-jelzés” odavonzza és

aktiválja az epidermisz antigénbemutató sejtjeit. A felületre ezután egy 80 cm2-es,

szélein leragasztható tapasz kerül, ami a bőrfelületen tartja az ezután egy tű nélküli

fecskendővel a tapasz alá juttatott nanomedicinát. A felszívódás során az LC-k

találkoznak a mannozilált felszínű szintetikus nanorészecskékkel, és endocitózissal

felveszik azokat, mintha kórokozók volnának. A nanorészecske “belsejében” lévő

NYIROKCSOMÓ

21

pDNS-t a szintetikus burok megvédi az enzimatikus bontástól, így a pDNS-ről

expresszálódhat a kódolt 15 antigén, majd megtörténhet az antigén bemutatás. (Az

antigén bemutatás lehetséges útvonalait a disszertáció új eredményei alapján az

“Eredmények megvitatása” c. fejezetben fejtem ki.) Eközben az LC-k a közeli

nyirokcsomókba vándorolnak, ahol CD4+ T sejtek-, és CD8+ T sejtek érését

stimulálják a pDNS-ről származó HIV-specifikus epitópok bemutatásával.

Végeredményül HIV-specifikus effektor sejtek és memória T sejtek termelődnek, amik

képesek a HIV-vel fertőzött sejtek elpusztítására [64].

3.5 A DermaVir pDNS alapú antigénje

A DermaVir hatóanyaga, a pLWXu1 pDNS a széles specifitású T sejtes immunválasz

kiváltása érdekében úgy lett tervezve, hogy a tizenöt HIV fehérje közül tizenhármat

módosítás nélkül expresszáljon, valamint az IN és Nef fehérjék működésképtelen N-

terminális részét is kódolja. Több biztonsági módosítás gátolja meg az integrációt,

reverz transzkripciót és replikációt. A tizenhárom fehérje módosítás nélküli kódolása

elméletileg azt is lehetővé teszi, hogy belőlük komplex vírusszerű részecskék (VLP+)

képződjenek. Az eredeti HIV promóter (5’ LTR) biztosítja a pDNS által kódolt fehérjék

expresszióját antigénbemutató sejtekben (lásd 3. ábra) [25]. A Nef fehérje működésének

kiiktatása az immunogenitás növelésének előnyével is jár, mert a Nef az MHCI és

MHCII molekulák downregulációjával akadályozza HIV epitópok megjelenését a

sejtfelszínen a természetes fertőzés során, amivel meggátolja, hogy az immunrendszer

megtalálja a fertőzött sejteket [41,42,65].

3.6 Az antigén DC-be juttatása patogén-szerű szintetikus nanorészecskével

Annak érdekében, hogy a pDNS hatékonyan jusson be a DC-kbe, és ott a kódolt

antigéneket expresszálja, egy szintetikus nanorészecske formulációt fejlesztettünk ki. A

polietilénimin-mannóz (PEIm) a pDNS-sel a vírusok mérettartományába eső 70-300 nm

átmérőjű gömbszerű nanorészecskéket alkot, amit a DC-k a kórokozókhoz hasonlóan

felvesznek és aktiválódnak [63,66,67]. Ebben belül helyezkedik el a pDNS, amit

beburkol a mannozilált, pozitív töltésű polimer (8. ábra). A nanorészecske endocitózisa

után a pDNS-t a polimer burok megvédi az enzimatikus bontástól, és lehetővé teszi,

hogy a pDNS eljusson a sejtmagba és megtörténjen az antigének expressziója. A pDNS

védelmének “finomhangolását” a nanorészecskét stabilizáló kötések száma határozza

22

meg a pDNS foszfátcsoport oxigénje és a PEIm másodlagos amin nitrogénje közt. A

nanorészecske stabilitása tehát szorosan összefügg a pDNS antigén-expressziós

hatékonyságával (biológiai aktivitásával), mert az endoszómában védenie kell a pDNS-

t, majd a sejtmag közelébe jutva “szétesnie” [66,68].

A szintetikus nanorészecskék használatának előnye tehát, hogy segíti a pDNS-be kódolt

antigének DC-kbe jutását, expresszióját, és azután az endogén antigének bemutatási

útvonalán haladhat az antigének feldolgozása. Továbbá a nanorészecskék terápiás

alkalmazásával kiküszöbölhetjük az általánosan használt vírusvektorokkal szemben a

többszöri alkalmazás miatt kialakuló rezisztenciát.

8. ábra. A DermaVir szintetikus nanorészecske egyszerűsített modellje (keresztmetszet).

pDNS: plazmid DNS, PEIm: polietilénimin-mannóz.

3.7 DermaPrep orvosi eszköz a nanomedicina bőrön át történő bejuttatására

Az antigéneket pDNS-ben kódoljuk, a nanorészecske formuláció segít a pDNS DC

célsejtekbe juttatásában és az antigének expressziójában ill. bemutatásában, végső soron

a HIV-specifikus T sejtek termelésében. De hogyan kerül a DC-k közelébe a

nanorészecske oldat? Ennek a lépésnek a megoldása a szintén saját fejlesztésű

DermaPrep orvosi eszközzel lehetséges. Az eszköz alkalmazása magában foglal egy bőr

előkészítő eljárást: egy durva szivaccsal eltávolításra kerül a bőr külső-, fizikai

védelmet biztosító stratum corneum rétege, és ez veszély-jelzésként odavonzza és

aktiválja az LC (DC) sejteket (7. ábra) [69,70]. A bőrre ragasztott féligáteresztő

anyagból készült tapasz alá juttatott nanomedicina immár könnyen felszívódik, és az

LC-k kórokozók után kutatva hatékonyan fel is veszik a patogén-szerű

nanorészecskéket. A DermaPrep kezelés lényegében a természetes immunválasz

folyamatait segíti elő, ugyanis az aktivált LC-k a veszély-jelzés hatására egy 900-1800

sejt/mm2 hálózatot hoznak létre közvetlenül a bőrfelszín alatt [71]. Vagyis körülbelül 8

pDNS

PEIm

23

millió LC-t állít szolgálatba a 80 cm2 felületen végzett kezelés. Miután pedig az LC-k

felvették a DermaVir nanorészecskéit, a nyirokcsomóba vándorolnak, hogy a pDNS-

ben kódolt antigénekre specifikus T sejtek termelését irányítsák. A DermaPrep eszköz

tehát végső soron a nanomedicinát a bőrön át a nyirokcsomóba juttatja. A DermaPrep

orvosi eszköz európai forgalmazási engedélyét (CE jelzés) 2009-ben szereztük meg.

3.8 Preklinikai és klinikai eredmények

A DermaVir hatásmechanizmusának kísérletes igazolása a humán klinikai kísérletek

előtt ex vivo kísérletekkel, majd előrehaladott állapotú SIV fertőzött rhesusmajmokban

történt a fent ismertetett pDNS konstrukció SIV (és HIV) fehérjéket kódoló változatával

[64,72]. Sikerült igazolni, hogy az ex vivo úton DC-kbe juttatott DermaVir-rel kezelt

sejtek szubkután injektálását követően a pDNS-ben kódolt antigének expresszálódnak a

nyirokcsomóban lévő DC-kben, és, hogy ezek a DC-k HIV-specifikus CD4+ Helper T

sejtek, valamint CD8+ citotoxikus T sejtek termelődését indukálják [67]. Ezután a

mérések in vivo ismétlése következett egér-, és majom modellben, a DermaVir-t

DermaPrep-pel bőrön át bejuttatva. Az in vivo eredmények megerősítették az ex vivo

mérések eredményét, ezzel alátámasztva a DermaPrep kezelési eljárás hatékonyságát

[64]. A következő lépés a humán fázis I kísérletek előtt a tervezett humán kísérlethez

hasonló méréssorozatok elvégzése volt krónikus SIV251 fertőzött rhesusmajmokban. Az

antiretrovirális kezeléssel kombinált (cART) DermaVir kezelések növelték a SIV-

specifikus T sejtek mennyiségét (még a késői stádiumú, AIDS-es majmokban is),

lecsökkentették a vírusszámot, és jelentősen megfékezték a vírus replikációt a kezelés

utáni időszakban is. Ennek eredményeképpen a kezelt állatok életideje 18 hétről 38

hétre növekedett a nem kezelt kontroll csoportéhoz képest [72].

Az első, embereken végzett klinikai kísérlet a budapesti Szent László Kórházban, 2005-

2006 között zajlott [73,74]. Célja a DermaVir kezelés biztonságosságának, és

immunogenitásának vizsgálata volt. Kilenc cART kezelés alatt álló HIV fertőzött

beteget kezeltek DermaVirrel, egy alkalommal, három különböző dózissal: három-

három beteg kapott 0,1 mg DNS-t tartalmazó DermaVir-t két DermaVir tapasszal

bejuttatva, 0,4 mg pDNS-t tartalmazó DermaVir-t négy tapasszal, ill. 0,8 mg pDNS-t

tartalmazó DermaVir-t nyolc tapasszal. Nemcsak a hatóanyag mennyisége különbözött

tehát, hanem a célzott nyirokcsomók (ill. LC-k) száma is. A kezelés után 28 napon át

figyelték az esetleges mellékhatások megjelenését, majd hosszú távon is ellenőrizték:

24

12, 24, 36 és 48 héttel a kezelést követően. A vizsgálat során egyetlen esetben sem

tapasztaltak súlyosabb mellékhatást, a leggyakoribb (négy betegnél) enyhe bőrreakció

volt, dózistól függetlenül. A hatásosság vizsgálata a következő eredményeket hozta: a

cART terápiának köszönhető 50 kópia/ml alatti vírusszint változatlanul alacsony maradt

a DermaVir adását követő 28 napban. A Gag, Tat és Rev antigénekre specifikus (IFNγ-

át és IL2-t termelő) CD4+ és CD8+ effektor T sejtek száma megemelkedett, az alacsony

dózisú csoportban 3-ból 2 kezeltben, és a középső dózisú csoport mindhárom tagjában.

Ezenkívül a magas proliferációs kapacitású HIV-specifikus memória T sejtek száma is

szignifikánsan emelkedett, és még egy évvel később is esetenként detektálható volt

[73,74,75]. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a DermaVir biztonságos, és a

középső dózisban már egyetlen DermaVir immunizálás is kiváltja az elvárt széles

specifitású T sejtes immunválaszt. De a tartós hatás érdekében szükségesnek tűnik a

DermaVir kezelés bizonyos időközönkénti ismétlése.

Az USÁ-ban végzett fázis I/II klinikai kísérletben ezért már többszöri DermaVir

kezelés hatását vizsgálták 24 cART kezelés alatt álló HIV fertőzött betegben [76]. A

betegek egyik csoportja 0,2 mg, ill. 0,4 mg pDNS dózisú DermaVir-t kapott három

alkalommal, a másik csoport 0,4 mg pDNS dózisú DermaVir-t hat alkalommal, a

harmadik csoport pedig placebo-t. A kezelések nem okoztak súlyos mellékhatásokat, és

ismét megemelkedett a HIV-specifikus effektor-, és memória T sejtek száma, a

legjobban a 0,4 mg-mos dózissal kezelt csoportban.

A következő, fázis II klinikai vizsgálat célja a DermaVir biztonságosságának mérése,

valamint az immunogenitásának és antivirális hatásának mérése volt, ezúttal cART

kezelést nem kapó betegekben [77]. 36 HIV-fertőzött egyént kezeltek a háromféle

DermaVir dózis valamelyikével (0,2 mg, 0,4 mg vagy 0,8 mg pDNS/DermaVir), ill.

placebo-val hat-hetenként, összesen négy alkalommal. A kezelt csoportokban

előforduló mellékhatások nem különböztek a placebo csoportétól, csak egy betegnél

fordult elő közepesen súlyos mellékhatás (a háromfokozatú skálán 2-es), de az ő

kezelését sem kellett emiatt felfüggeszteni. A 0,4 mg-mos dózisú csoport megint jobb

immunválaszt mutatott a többinél, és szintén ebben a csoportban a szabad

vírusmennyiség 70%-kal csökkent a placebóhoz képest.

Az eddigi klinikai vizsgálatok eredményei alapján tehát a DermaVir kezelés ismételt

alkalmazása megfelelően biztonságos, és HIV specifikus T sejtes immunválaszt

generál, valamint fékezi a HIV szaporodását.

25

A pLWXu1 pDNS-t tartalmazó DermaVir termékjelölt klinikai vizsgálatai tovább

folytatódnak, és reményeink szerint a termék forgalomba hozatali engedélyével zárul a

fejlesztés. Ezzel párhuzamosan a DermaVir hatásmechanizmusának további,

részletekbe menő jellemzésén is dolgozunk. A munka folyamatosan újabb kutatási

kérdéseket vet fel, amik megválaszolása új fejlesztési irányt is kijelölhet. Így történt ez

doktori munkám esetében is, aminek egy személyre szabható DermaVir terápia, és

hozzá egy szubtípus optimalizált termékcsalád első termékjelöltjeinek elkészítése lett az

eredménye. Lássuk, hogyan!

26

4. Célkitűzések

A DermaVir HIV terápiás nanomedicina in vitro kísérletes jellemzését, és az antigén

repertoár in silico jellemzését, valamint ezekhez vizsgálati módszerek fejlesztését

tűztem ki célul. A DermaVir immunválasz kiváltó képességének in silico modellezési

eredményei alapján ezután indokoltnak láttuk egy HIV szubtípus-optimalizált

DermaVir termékcsalád kifejlesztését, és a termékcsaládon alapuló személyre szabott

HIV immunterápia prototípusának kidolgozását.

Fenti célok eléréséhez az alábbi részfeladatokat állapítottuk meg:

I. A klinikai tesztelés alatt álló DermaVir HIV terápiás nanomedicina kísérletes

jellemzése a hatásmechanizmus egyes részleteinek megismerésére, ill.

alátámasztására. (Eredmények a 6.1. alfejezetben.)

II. Az előbbi célkitűzéshez in vitro vizsgálati módszerek fejlesztése, ill.

optimalizálása és validálása a DermaVir komplex VLP+ termelésének-

valamint biológiai aktivitásának (antigén expressziós potenciáljának)

mérésére. (Eredmények a 6.1.2. és 6.1.3. alfejezetekben.)

III. A DermaVir terápiás nanomedicina pDNS hatóanyaga által expresszált

majdnem teljes proteom immunválasz kiváltó képességének (immunológiai

potenciáljának) in silico modellezésére T sejt epitóp predikción alapuló

módszer kidolgozása. (Eredmények a 6.2.1. alfejezetben.)

IV. A szubtípus-B specifikus HIV szekvenciát tartalmazó DermaVir

immunológiai potenciáljának in silico modellezése, és a nanomedicina

hatásosságának in silico modellezése nem-B szubtípusú HIV-vel

fertőzöttekben. (Eredmények a 6.2.2.-6.2.5. alfejezetekben.)

V. HIV-1 szubtípusokra immunológiailag optimalizált pDNS-ek tervezése, és

ehhez a tervezést segítő eszköz elkészítése, ami a személyre szabható

immunterápia megvalósítását is támogatja. (Eredmények a 6.3.1. és 6.3.2.

alfejezetekben.)

VI. A megtervezett pDNS-ek elkészítése, valamint az elkészített termékjelöltek in

silico jellemzése. (Eredmények a 6.3.3. alfejezetben.)

VII. Az új termékjelöltek in vitro jellemzése. (Eredmények a 6.3.4. alfejezetben.)

27

5. Anyagok és módszerek

5.1. Nanomedicina készítés

1 mg/ml koncentrációjú pDNS-t 6 térfogat egység 10%-os glükóz oldattal higítottunk,

majd 13,6 mM koncentrációjú polietilénimin-mannóz (PEIm) oldatot adtunk az

elegyhez. A nanorészecske képződés 20 perces, szobahőn (23 ± 2ºC) történő inkubálás

alatt történt.

5.2. Western blot

DMEM tápfolyadékban tartott 293T humán sejteket transzfektáltunk 10 µg pDNS-t

tartalmazó DermaVirrel, nem transzfektált sejteket használva negatív kontrollként. A

sejteket 24 órás, 37 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett történő inkubálás után lizáltuk, és

szétosztott adagokban felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A lizált mintákat, vagy

tisztított VLP+-t (lásd az 5.5. pontban) előre öntött 4-20% gradiens gélben (Bio-Rad)

futtattuk, majd PVDF membránra (Bio-Rad) blottoltuk 1 órán át 300 mA-rel

(omniPAGE Electroblotting System, Cleaver Scientific). A membránt 5% BSA-val

blokkoltuk, és többszöri PBS mosást követően HIV+ humán szérumban (Boston

Biomedica) inkubáltuk 1 órán át. Tween-20-at tartalmazó PBS mosási lépések után a

membránt peroxidázzal konjugált anti-humán IgG-vel (Sigma-Aldrich) inkubáltuk,

majd mostuk, végül az eredményt kolorimetriás eljárással (Amplified Opti-4CN kit,

Bio-Rad) tettük láthatóvá.

5.3. Immunprecipitáció

DMEM tápfolyadékban tartott 293T sejteket transzfektáltunk pLWXu1-gyel, és 24 órán

át 37 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett inkubáltuk, majd radioaktívan jelöltük 400

microCi 35S-sel (Perkin Elmer NEG009H) és egy éjszakán át inkubáltuk. Pozitív

kontrollként a pLW fertőzőképes vírust tartalmazó szülői pDNS-t, negatív kontrollként

nem-transzfektált sejteket használtunk. A következő napon a sejteket lizáltuk és

szétosztott adagokban felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A lizált minták precipitációját

inaktivált HIV+ humán szérum (Advanced BioScience Laboratories), vagy

monoklonális Nef ellenanyag (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)

hozzáadásával végeztük. Mosást követően a mintákat 12% SDS-PAGE gélben futtattuk.

28

5.4. Intracelluláris festés

293T sejteket transzfektáltunk 10 µg pLWXu1-gyel vagy a pozitív kontroll pLW

pDNS-sel, és 48 órás inkubálás után monoklonális egér ellenanyagokkal (NIH AIDS

Research and Reference Reagent Program ill. Affinity BioReagents) jelöltük, majd

EPICS XL-MCL áramlási citofluoriméterrel vizsgáltuk (Coulter). Minden mérést 50000

adatponttal végeztünk.

5.5. VLP+ termelés és tisztítás

293T sejteket transzfektáltunk DermaVirrel, majd 24 órával a transzfekció után

leszívtuk a VLP+-t tartalmazó felülúszót. A felülúszót 10 ml 20%-os szukróz oldatra

pipettáztuk és a VLP+-ket centrifugálással szűrtük át a szukróz oldaton (50000 g, 3 órás

centrifugálás). A pelletet 1/20 térfogatarányú PBS (pH 7,4) oldatban szuszpendáltuk, és

a tisztított VLP+-ket felhasználásig -80 °C-on tároltuk.

5.6. Transzmissziós elektronmikroszkópia

293T sejteket transzfektáltunk DermaVirrel, és 24 órával a transzfekció után a leszívtuk

a felülúszót, a sejteket PBS-sel mostuk, majd 5% glutaraldehidet tartalmazó, 0.1 M

cacodylate pufferben fixáltuk. A fixált sejteket Dr. Kovács Attila Lajos segítségével az

ELTE Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszékén beágyaztuk, metszettük, és

elektronmikroszkóppal (JEM100CX II) vizsgáltuk, az alábbiak szerint: a rögzített

sejteket 0.1 M cacodylate pufferrel mostuk, majd 50 °C-os 1,5%-os agarra rétegeztük.

A mintákat cacodylate OsO4 oldattal utó-fixáltuk, “en-block” festettük nem pufferelt

1% uranil-acetát oldattal, végül etanollal és propilén-oxiddal dehidratáltuk. A

beágyazáshoz DPM-30-at tartalmazó TAAB kitet használtunk (TAAB Laboratories

Equipment). Az ultravékony metszeteket lead-citráttal festettük.

5.7. Biológiai aktivitás mérés

DMEM tápfolyadékban tartott 293T humán sejteket transzfektáltunk DermaVirrel. 24

órás, 37 °C-on, 5% CO2 tartalom mellett történő inkubálás után a felülúszót leszívtuk,

és HIV p24 antigén ELISÁ-val (Zeptometrix, Retrotek), a gyártó előírása szerint

meghatároztuk a plazmid DNS által expresszált p24 koncentrációt. A biológiai

aktivitást mérő módszerünket az európai gyógyszerengedélyezési hatóság (International

29

Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of

Pharmaceuticals for Human use) ICHQ2(R1) ajánlása alapján végeztük [78]. A

validálás célja az volt, hogy az ajánlásban javasolt paraméterek meghatározásával

igazoljuk, módszerünk alkalmas a DermaVir biológiai aktivitásának (azaz antigén

expressziós képességének) mennyiségi meghatározására. A validált biológiai aktivitást

mérő módszer használatát az európai és amerikai gyógyszerengedélyezési hatóságok

(EMA, FDA) írják elő. Minden esetben öt párhuzamossal végeztük a méréseket

adatpontonként, valamint legalább két alkalommal ismételtük a mérést.

5.8. Statisztikai analízis

Az eredmények szignifikanciájának meghatározása Student’s t-teszttel történt, és

minden esetben megadtuk a P-értéket.

5.9. In silico T sejt epitóp repertoár analízis

Az MHCI és MHCII T sejt epitóp predikciókat az “Immune Epitope Database” (IEDB)

epitóp adatbázis felhasználásával végeztük [79]. Az MHCI epitóp predikciókhoz

mesterséges neurális hálózaton (Artificial Neural Network, ANN) alapuló predikciós

módszert-, míg MHCII epitóp predikciókhoz az úgynevezett Konszenzus módszert

használtuk [80,81,82]. Csak a nagy affinitású MHCI epitópokat vizsgáltuk, melyek 50

nM-nál kisebb koncentrációjú fél-maximális gátlási koncentrációval jellemezhetők [83].

Az MHCI epitóp predikciós paraméterek az alábbiak voltak: humán MHCI forrás faj;

összes, ill. kiválasztott MHCI allélek; peptid hossz: 9 aminosav; eredményhalmaz

szűkítése: csak az IC50=50 nM alatti epitópok; ANN predikciós módszer. Az MHCII

epitóp predikciókat a következő paraméterekkel végeztük: konszenzus predikciós

módszer; összes, ill. kiválasztott MHCII allélek, eredményhalmaz szűkítése: 90 vagy 50

konszenzus százalékos rangsor (Consensus Percentile Rank) ill. magasabb értékkel

rendelkező epitópok.

5.10. Filogenetikai analízis

A Los Alamos HIV Database-ből származó szekvenciák Clustal-W illesztését követően

(BioEdit 7.0.9.0) Neighbor-joining módszerrel Kimura két paraméteres korrekciós

modelljét használva filogenetikai fákat generáltunk (MEGA 4.1) [84,85]. A fák

topológiájának megbízhatóságát 1000 Bootstrap ismétléssel ellenőriztük [86].

30

5.11. pDNS konstrukciók készítése

5.11.1. Szekvenciák

A következő, szubtípus-optimalizált pDNS konstrukciókat készítettük el: pLWXu-AB,

pLWXu-BC, pLWXu-C, pLWXu-BF. A felhasznált szekvenciák kétféle forrásból

származtak: vírus RNS izolálást követő RT-PCR-rel HIV+ vérplazma mintákból

amplifikáltuk (pLWXu-BC, pLWXu-C, pLWXu-BF pDNS-ek esetében), ill. a “Los

Alamos HIV Database”-ben található HIV szekvenciák alapján tervezett gént

szintetizáltattunk (CRF AB gag gén, génbanki szám: AF414006).

5.11.2. RNS kivonás

Az RNS kivonást “QIAamp viral RNA Mini Kit”-tel (Qiagen) végeztük mintánként 140

µl vérplazmából, a gyártó előírása szerint.

5.11.3. Oligonukleotidok tervezése és szintézise

Az oligonukleotidokat génbanki, szubtípus-azonos HIV izolátumok megfelelő

génszakaszainak szekvenciái alapján terveztük OLIGO 4.0 szoftver segítségével. Az

oligonukleotidokat az Invitrogen (RT-PCR primerek) ill. az Eurofins MWG Operon

(szekvenáló primerek) állította elő.

5.11.4. RT-PCR

A szubtípus optimalizáláshoz két HIV genomi szakaszt amplifikáltunk, melyek a (1.)

gag és részleges pol ill. (2.) env-tat-rev-vpu géneket fedik le. A felhasznált primereket

az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az egy lépéses RT-PCR reakciókat a SuperScript III

One-step RT-PCR System kittel (Invitrogen) végeztük, 50 µl reakcióelegyben, ami 25

µl 2x “reakció mix” puffert, 10 µl tisztított HIV RNS-t, mindkét oligonukleotidból 10

µM-t, 1U SuperScript III/Taq enzimet, 40U RNase-out enzimet, és nukleáz-mentes

vizet tartalmazott. A PCR reakció paraméterei az alábbiak voltak: 60 °C 30 min, 30x(94

°C 15 s, 55-58 °C 30 s, 68 °C 3 min), 68 °C 5 min.

31

1. táblázat. A HIV RT-PCR reakciókhoz felhasznált primerek.

5.11.5. Agaróz gélelektroforézis

0,8%-os, 0,5 µg/ml etídium-bromiot tartalmazó agaróz gélt és 1xTAE puffert

(Invitrogen) használtunk. Futtatási paraméterek: 100V, 45 perc ill. PCR termék

tisztítása esetén 60V, 2 óra. A gélek értékeléséhez az ImageJ (NIH) szoftvert

használtuk.

5.11.6. DNS tisztítás gélből

A kívánt 2,3 kbp (gag gén) ill. 3 kbp (env-tat-rev-vpu gének) méretű RT-PCR

terméknek megfelelő sávot, ill. az emésztett pDNS vektort (10, ill. 9,3 kbp) 0,8%

agaróz gélben való futtatás után kivágtuk, majd “Genelute Gel Extraction Kit”-tel

(Omega) tisztítottuk, a gyártó előírása szerint. A termékeket precipitáltuk 2,5x térfogat

abszolút etanol és 1/10 térfogat 3M nátrium-acetát hozzáadásával. 1 órás -80 °C-os

inkubálás után 70%-os jéghideg etanollal mostuk, majd szárítás után a pelletet 20 µl

DNáz-mentes vízben visszaoldottuk.

5.11.7. Inzert és pDNS vektor előkészítése irányított ligáláshoz

A tisztított RT-PCR termékeket (inzert) és a pLWXu1 plazmidot (vektor) restrikciós

enzimes emésztéssel készítettük elő a ligáláshoz. A Gag poliprotein klónozásához a

pLWXu1 pDNS-t és a megfelelő gag gént tartalmazó inzertet NarI és BstZ17I

restrikciós enzimekkel (New England BioLabs) emésztettük a gyártó által biztosított 1x

NEBuffer4 pufferben, egész éjszakán át 37 °C-on inkubálva. Az env-tat-rev-vpu gének

klónozásához a pLWXu1 pDNS-t és a megfelelő inzertet NcoI és BlpI restrikciós

enzimekkel (New England BioLabs) emésztettük a gyártó által biztosított NEBuffer4

pufferben egész éjszakán át 37 °C-on inkubálva. Az emésztett pLWXu1 pDNS vektort

az előző bekezdésben leírt módon gélből kivágtuk és tisztítottuk. Az emésztett inzertet

is precipitáltuk a fentiek szerint, és 20 µl DNáz-mentes vízben visszaoldottuk.

Primer azonosító Szekvencia Termék

cDNA1 AGA GAC CCA GTA CAA GC cDNS

Gag-F CTG GTA ACT AGA GAT CCC TCA GA1. PCR termék

Gag-R TTG TTT ATA CTA GGT ATG GTG

Env-F TGG CTC CAT GGC TTA GGA CAA TAT ATC TAT G2. PCR termék

Env-R CTA CTC CCT CTG CTG CTG GCT CAG CT

32

5.11.8. Hőkompetens E. coli kompetens sejt készítés

E.coli Max efficiency Stbl2 kompetens sejt (Invitrogen) felhasználásával saját

kompetenssejt- bankot (WCB) készítettünk az E. coli rázott lombikos fermentálását

követő kétszeri CaCl2-os kezeléssel 0 °C-on (víz-jég elegyben). A kompetens sejtet

felhasználásig (legfeljebb egy hétig) 0 °C-on tároltuk.

5.11.9. Ligálás és transzformálás

A pDNS vektort és az inzertet 1:5 mólarányban adtuk a ligálási reakció elegyhez, 4 U

T4 DNS ligáz (Invitrogen) és 5x ligáz puffer mellett 20 µl-es végtérfogatban, majd

egész éjszakán át szobahőn inkubáltuk. 50 µl E. coli kompetens sejthez 5 µl-t ligálási

elegyet adtunk, majd 30 perces jégen inkubálás, 45mp 42 °C-os vízfürdőben történő

hősokkolás, és újabb 1 perces jégen történő inkubálás után 250 µl LB tápfolyadékot

(Gibco) mértünk a sejtekhez. 90 percen át inkubáltuk 37 °C-on, 250 fordulat/min

keverés mellett, ezután LB-agar-Kanamicin (50 µg/ml) táptalajra szélesztettük, és 30

°C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A transzformáns baktérium telepeket 4 °C-on

tároltuk.

5.11.10. pDNS termelés

A baktérium telepeket LB-Kanamicin (50 µg/ml) tápfolyadékba oltottuk, és 16 órán át

30 °C-on, 250 fordulat/min keverés mellett szelektíven növesztettük, majd izoláltuk az

így felszaporított pDNS-t. A pDNS izolálást E.Z.N.A. Miniprep Kittel (BioBasics)

végeztük a gyártó előírása (Plasmid Miniprep Protocol II) szerint, 1.5 ml baktérium

szuszpenzió feldolgozásával, átlagosan 50 µg hozammal. A nagyobb mennyiségű pDNS

termelést Qiagen Plasmid Maxi Kittel (QIAGEN) végeztük, a gyártó előírása szerint,

500 ml baktérium szuszpenzió feldolgozásával és átlagosan 500 µg hozammal. A pDNS

oldat koncentrációját az oldat 260 nm-en mért abszorbanciájának spektrofotometriás

meghatározása után a DNS koncentráció= A260× 50×(hígítási faktor) képlettel

számoltuk ki, és a pDNS oldat koncentrációját 1 mg/ml-re hígítottuk.

5.11.11. Az új pDNS-esek azonosságának ellenőrzése

A tisztított pDNS-eket a ligáláshoz használt enzimpárral (NarI-BstZ17I ill. NcoI-BlpI)

emésztettük. A reakcióelegy 1 µg pDNS-t, 1x NEBuffer4 puffert, 1-1 U restrikciós

enzimet és nukleáz-mentes vizet tartalmazott 20 µl végtérfogatban. 37 ºC-on 2 órás

inkubáció után a mintákat 0,8%-os agaróz gélben futtattuk. A megfelelő méretű DNS

fragmentumokat tartalmazó mintákat szekvenáltattuk (Eurofins MWG Operon).

33

6. Eredmények

A DermaVir hatóanyagát egy fertőzőképes, B szubtípusú HIV izolátumból kiindulva

fejlesztette ki korábban munkacsoportunk. [87,88,89]. A laboratóriumi dolgozóból

izolált vírus klónozása után (pLW) többszörös mutációkkal módosították a szekvenciát,

hogy a replikációt, ezen belül a reverz transzkripciót és az integrációt gátolják (9. ábra).

A reverz transzkripció a 3’LTR deléciójával blokkolható, és ezzel megakadályozható a

módosított DNS vad vírusból származó DNS-sel vagy retrotranszpozonokkal történő

rekombinációja ill. komplementációja is. Továbbá a HIV IN fehérjéje a 3’LTR régióhoz

kötődve irányítja a virális DNS integrációját. A deléció tehát egyszerre több folyamatot

is akadályoz. Az IN fehérje génjének többszörös mutációja (stop kodonok és 7 bp

deléció) további biztosíték az integráció gátlására [90]. Ezek a biztonsági módosítások

két fehérjét tesznek működésképtelenné: Pol-RT és Nef. Mindemellett a többi fehérje

módosítás nélküli kódolása lehetővé teszi, hogy a tizenöt HIV fehérje közül 13

természetes konformációban termelődjön, valamint ezek a fehérjék komplex vírusszerű

részecskékké (VLP+) álljanak össze. A Nef mutációját a fehérje kódoló régiójával

átfedésben lévő 3’ LTR deléciója okozza. De a Nef fehérje működésének kiiktatása az

immunogenitás növelésének előnyével is járhat, mert a Nef az MHCI és MHCI

downregulációjával akadályozza HIV epitópok megjelenését a sejtfelszínen a

természetes fertőzés során, amivel meggátolja, hogy az immunrendszer megtalálja a

fertőzött sejteket [41,42]. Az eredeti HIV promóter (5’ LTR) biztosítja a pDNS által

kódolt fehérjék expresszióját antigénbemutató sejtekben (lásd 3. ábra) [24,25]. A HIV

promóter használata új megközelítés a vakcinatervezésben, pedig a Tat jelenlétében

erősebb transzkripciós aktivitása van, mint az adenovírus promóternek, vagy a CMV

promóternek [25]. Ezenkívül talán az is előnyös lehet az immunválasz kiváltása

szempontjából, hogy az eredeti promóterről a természetes vírusfehérje termeléshez

hasonló mennyiségben, ill. sorrendben történik az átírás [91].

34

9. ábra. A DermaVir nanomedicina aktív hatóanyagának, a pLWXu1 pDNS-nek a (linearizált)

térképe. Biztonsági módosítások a pDNS HIV-specifikus részében: az integráz géntermék

inaktiválására két stop kodon, valamint egy 7 bp hosszúságú deléció, mely további alternatív

stop kodonokat eredményez a deléciótól downstream irányban az int génben. Hosszú deléció a

nef gén 3’ végén, mely csonka Nef átírását eredményezi. 3’ LTR teljes deléció, ami

megakadályozza a reverz transzkripciót. ■: biztonsági módosítások helye a pDNS-ben.

A pLWXu1 pDNS-ben kódolt fehérje repertoár jelenti a nanomedicina antigén

készletét. A fehérjetermelés kísérletes jellemzése ezért a nanomedicina hatásának

igazolása szempontjából, valamint biztonságossága szempontjából is nagyon fontos. Az

alábbiakban az erre irányuló in vitro kísérletek eredményét mutatom be. Azután pedig

az antigén-készlet immunválasz-kiváltó képességének (immunológiai potenciáljának) in

silico modellezése következik.

6.1. A DermaVir in vitro jellemzése

6.1.1. A pLWXu1 pDNS által expresszált fehérje repertoár

A pLWXu1 által expresszált fehérje (antigén) repertoár termelését Western blottal

igazolta munkacsoportunk (10. ábra). A legnagyobb mennyiségben a gag gén termékei

(p17-MA, p24-CA, p55-Gag poliprotein, amely tartalmazza a p7-NC fehérjét is), Env-

SU (gp120) és az Env-TM (gp41) expresszálódtak. A Pol fehérjéket: p66-RT plusz

76007541

CAGGAA TTT GGA ATT CCC TAG CGG TAA CCA-------GAGTAGTAGAATCTATGAATAA-AGAATTAAQ E F G I P stopstop stop stop stop stop stopdeletion

Inaktivált integráz gén Csonka nef génDel 12141-12309

Nef

11689 12309

12141

Inaktivált reverz transzkripcióDel 12141-12611

NF-κBNF-ATc

11978 12611

R U5

TATASP1

12141

Gag5’ LTR

NefEnv

TatRev

Prot RT RNáz IN

Pol

3’ LTR12252

1

35

RNáz, ill. RT (p51) kisebb koncentrációban detektáltuk. A teljes hosszúságú IN és Nef

fehérjék hiányát egyrészt szekvenálással, másrészt immunprecipitációval igazoltuk,

amihez a pLW fertőzőképes HIV-et expresszáló pDNS-t használtuk pozitív kontrollként

(ez a pDNS volt a pLWXu1 elkészítésének kiindulási alapja is; 10.B és C ábra) [92].

10. ábra. A pLWXu pDNS által expresszált fehérjék. A: western blot, HIV+ humán szérum

használatával elsődleges ellenanyagként. M: fehérje marker, Neg: negatív kontroll, nem

transzfektált sejtek; a-gp120 (Env-SU), b-p66 (RT plusz RNase), c-p55 (Gag poliprotein, benne

p17, p24 és p7), d-p51 (Pol-RT), e-gp41 (Env-TM), f-p24 (Gag-CA), g-p17 (Gag-MA). B: A

teljes hosszúságú Integráz termelődésének hiányát igazoló immunprecipitáció (csillaggal

jelölve). Az extra csíkok a HIV+ szérum használata miatt megjelenő többi HIV specifikus

fehérjének felelnek meg. C: A teljes hosszúságú Nef termelődésének hiányát igazoló

immunprecipitáció (csillaggal jelölve). D: pLWXu1-gyel transzfektált 293T sejtek

intracelluláris festése FITC-cel jelölt p24, p55, gp41, gp120, Rev és Tat ellenanyagok

használatával, áramlási citofluorimetriával mérve.

Mivel a többi szabályozó fehérjét sem western blottal, sem immunprecipitációval nem

sikerült kimutatni, egy társ-munkacsoport intracelluláris festéssel igazolta azok

termelődését. Ezzel sikerült bizonyítani a Rev (0,7% pLWXu1 esetében, ill. 1,3% a

kontroll pLW esetében) ill. Tat (0,2% pLWXu1 esetében, ill. 0,5% a kontroll pLW

esetében) fehérjék expresszióját (16.D ábra). Továbbá a p24, p55, gp41 és gp120

36

struktúrfehérjék termelődését a pLWXu1-ről ez a módszer is megerősítette. A Vif, Vpr

és Vpu fehérjék létét közvetett módon, szekvenálással igazoltuk. Eredményeink a

szekvenálási adatokkal együtt alátámasztják a pDNS-ben kódolt tizenhárom intakt

fehérje termelődését, valamint a két módosított génről a natív fehérje termelődésének

hiányát.

6.1.2. VLP+ termelés

Mivel a pLWXu1 tizenhárom teljes hosszúságú HIV fehérjét expresszál, feltételeztük,

hogy ezek komplex vírusszerű részecskévé (VLP+) képesek összeállni. A “+” index a

komplex VLP megkülönböztetésére szolgál a hagyományos, általában egy ill. kétfajta

struktúrfehérjéből spontán összeszerelődő VLP-ktől [93]. A pLWXu1 VLP+

termelésének igazolására humán 293T sejteket transzfektáltunk pLWXu1 pDNS-t

tartalmazó nanomedicinával, és egy napos inkubálást követően transzmissziós

elektronmikroszkóppal vizsgáltuk a mintákat (11.A ábra). A felvételeken jól láthatók a

vad típusú HIV-re jellemző fenotípusú VLP+ részecskék, melyek az érett virionhoz

hasonló mag (core) és burok (envelop) struktúrákat tartalmaznak. Megfigyeltük

továbbá, hogy a VLP+ részecskék a sejten kívüli térbe, vagy intracitoplazmatikus

vakuolumokba fűződnek le, és a virion érési fázisaihoz hasonló stádiumok különíthetők

el [92]. A VLP+ összetett felépítését tisztított VLP+ felhasználásával végzett western

blot is igazolta (11.B ábra).

11

órával a transzfekciót követ

Attila Lajos készítette. Ezeken jól megfigyelhet

(budding), 2:

szer

B

els

pDNS. a

benne p17, p24 és p7), d

CA), i

A pLWXu1 pDNS alapú immunogén részletes jellemzését a

hatóságok el

11. ábra



(budding), 2:

szerű

B: Western blot pLWXu1

első

pDNS. a


CA), i


hatóságok el

. ábra



(budding), 2:

szerű (intracitoplazmatikus vakuolumban). A méretskála minden esetben 100 nm

: Western blot pLWXu1

elsődleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLW vad típusú HIV

pDNS. a


CA), i-


hatóságok el

. ábra.



(budding), 2:

ű (intracitoplazmatikus vakuolumban). A méretskála minden esetben 100 nm


ődleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLW vad típusú HIV

pDNS. a-gp120 (Env


-p17 (Gag

6.1.3.


hatóságok el

A pLWXu1



(budding), 2:

(intracitoplazmatikus vakuolumban). A méretskála minden esetben 100 nm


dleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLW vad típusú HIV

gp120 (Env


p17 (Gag

6.1.3.


hatóságok el

A pLWXu1



(budding), 2: éretlen virion




gp120 (Env


p17 (Gag

6.1.3. Biológiai aktivitás


hatóságok előírása alapján végeztük el. Biológiai termékek esetén az egyik

A pLWXu1



éretlen virion




gp120 (Env


p17 (Gag-MA), j

Biológiai aktivitás


hatóságok előírása alapján végeztük el. Biológiai termékek esetén az egyik

A pLWXu1



éretlen virion




gp120 (Env-SU), b


MA), j



őírása alapján végeztük el. Biológiai termékek esetén az egyik

A pLWXu1-ről e



éretlen virion




SU), b

benne p17, p24 és p7), d-p51 (Pol

MA), j-p7 (Gag



írása alapján végeztük el. Biológiai termékek esetén az egyik

ről expresszált fehérjékb

órával a transzfekciót követő


éretlen virion-szer


: Western blot pLWXu1-gyel transzfektált 293T sejtek felülúszójából, két HIV


SU), b-

p51 (Pol

p7 (Gag




xpresszált fehérjékb

órával a transzfekciót követően fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács


szerű


gyel transzfektált 293T sejtek felülúszójából, két HIV


-p66 (reverz transzkriptáz plusz RNase), c

p51 (Pol

p7 (Gag





ően fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács


szerű, 3: érett virion




p66 (reverz transzkriptáz plusz RNase), c

p51 (Pol-RT), e

p7 (Gag-NC).





en fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács


ű, 3: érett virion





RT), e

NC).







, 3: érett virion





RT), e-gp41 (Env






, 3: érett virion





gp41 (Env



xpresszált fehérjékbő



, 3: érett virion





gp41 (Env



xpresszált fehérjékből képz


Attila Lajos készítette. Ezeken jól megfigyelhetők a VLP

, 3: érett virion-szer





gp41 (Env



ől képz


Attila Lajos készítette. Ezeken jól megfigyelhetők a VLP

szerű





gp41 (Env-TM), f



l képződő


ők a VLP

szerű (extracelluláris térben), 4: érett virion





TM), f



ődő komplex VLP


k a VLP+

ű (extracelluláris térben), 4: érett virion





TM), f-p31 (I



ő komplex VLP

en fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács + “érésének” fázisai: 1: lef

(extracelluláris térben), 4: érett virion





p31 (I



komplex VLP


“érésének” fázisai: 1: lef






p31 (IN), g



komplex VLP








N), g

A pLWXu1 pDNS alapú immunogén részletes jellemzését a gyógyszerengedélyezési


komplex VLP







p66 (reverz transzkriptáz plusz RNase), c-p55 (Gag polyprotein,

N), g-p27 (Nef), h

gyógyszerengedélyezési


komplex VLP+ részecskék.







p55 (Gag polyprotein,

p27 (Nef), h



részecskék.




(intracitoplazmatikus vakuolumban). A méretskála minden esetben 100 nm-




p27 (Nef), h



részecskék.




-nek felel meg.




p27 (Nef), h



részecskék.




nek felel meg.

gyel transzfektált 293T sejtek felülúszójából, két HIV+ szérum

dleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLW vad típusú HIV-et kódoló


p27 (Nef), h-p24 (Gag



részecskék. A


“érésének” fázisai: 1: lefűző


nek felel meg.

+ szérum

et kódoló


p24 (Gag



37

A: 24


“érésének” fázisai: 1: lefűződés


nek felel meg.

+ szérum

et kódoló


p24 (Gag



37

: 24


ű ődés

(extracelluláris térben), 4: érett virion-

nek felel meg.

+ szérum

et kódoló


p24 (Gag-



38

kulcsfontosságú paraméter a biológiai aktivitás, azaz esetünkben az antigén expressziós

hatékonyság meghatározása. A biológiai aktivitás in vitro meghatározására egy olyan

módszert optimalizáltunk és validáltunk, mely humán sejtvonal transzfekcióját

követően a felülúszóba szekretált HIV specifikus fehérje, a p24 (Gag-CA) mennyiségi

mérésével történik.

A p24 fehérje a pLWXu1-ről a HIV virionhoz hasonló módon, csak a transzkripció

késői szakaszában termelődik, és expressziójához a transzkripció korai szakaszában már

átíródó szabályozó fehérjék szükségesek. Azt találtuk, hogy a transzfektált 293T sejtek

felülúszójában található p24 mennyiségének 92.1%-a VLP+ részecskék alkotóelemeként

van jelen (12. ábra). Ezért a p24 mennyiségi kimutatásával mérhető a pDNS

konstrukcióban kódolt fehérjekészlet-, valamint a VLP+ expressziója is, azaz a pDNS

biológiai aktivitása [92].

12. ábra. A pLWXu1 biológiai aktivitása. A nanomedicinával transzfektált 293T sejtek által

termelt összes p24 92,1%-a (62,7 ng/ml) VLP+ alkotóelemként van jelen a transzfektált sejtek

felülúszójában (*P<0,001).

Az optimalizált (sztenderdizált) módszert az európai ICH Q2(R1) analitikai módszerek

validálására vonatkozó irányelvek alapján validáltuk [78]. A validálás lényege, hogy

igazoljuk a mérési módszer alkalmasságát a tervezett célra: a DermaVir vizsgálati

anyag biológiai aktivitásának in vitro meghatározására a pDNS hatóanyag által

expresszált p24 antigén mennyiségi mérésével. Ehhez a módszer következő

paramétereit kell meghatározni: pontosság (accuracy), ismételhetőség (precision)

(napok közti variabilitás: különböző napokon ugyanaz a személy végzi el a mérést;

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Összes p24 Nem-VLP+ alkotó p24

Bio

lóg

iai a

ktiv

itás

(p2

4 n

g/m

l)

*

39

minták közti variabilitás: két személy ugyanazon vizsgálati anyagból származó

mintákkal végzi el a mérést; mintán belüli variabilitás: egy személy a vizsgálati anyag

5 különböző adagjából vett 3-3 mintával végzi el a mérést; mérést végző személyek közti

variabilitás: azonos napon többen is elvégzik a mérést), specifikusság (a módszer

specifikus a kívánt paraméter meghatározására, ebben az esetben a DermaVir

formuláció p24 fehérje expresszióját képes mérni), mérési tartomány, kimutatási határ

és a mennyiségi meghatározásra alkalmas alsó méréshatár, linearitás (koncentráció

függés, vagyis annak igazolása, hogy a módszer a mérési tartományban kvantitatív).

Minden mérés során 5 párhuzamossal dolgoztunk. A kívánt paramétereket

meghatároztunk a pontosság kivételével, amelyben egy minősített sztenderd anyaghoz

kell hasonlítani a mintánkat, csakhogy a DermaVir esetében nincs ilyen összehasonlító

anyag. Eredményeink összefoglaló számadatai a következők: ismételhetőség (precision,

n=49): [p24] = 45,19 ng/ml; CV% (variációs együttható, az adatcsoport átlagtól való

eltérése osztva az átlaggal, százalékban kifejezve) = 14,12 %. Specifikusság:

DermaVir[p24] = 43,80 ng/ml, CV (%) = 4,4 %. A formuláció nélküli csupasz pDNS

esetében a kimutatási határ alatti eredményeket kaptunk. Szintén a méréshatár alatti

eredményt kaptunk a p24 fehérjét expresszálni nem képes, aspecifikus pDNS-t

tartalmazó nanorészecske formuláció esetében is. Ezzel igazoltuk, hogy módszerünk a

DermaVir formuláció biológiai aktivitásának mérésére specifikus. Mérési tartomány:

0,5-0,8 µg pDNS-t tartalmazó DermaVir. Linearitás: a mérési tartományon belül 7

adatpontra határoztuk meg, ahol a 0,7 µg pDNS/DermaVir az alapértelmezett vizsgálati

mennyiség, és ennek 70-120%-át jelenti a többi vizsgálati pont. A linearitás mérés

adataira illesztett egyenes egyenlete: y=0,472x-22,636, korrelációs együtthatója

R2=0,83, ez megfelel az R2>0,8 elfogadási kritériumnak. A kimutatási határ a vizsgálati

anyag kalibrációs egyeneséből (linearitás adatok) és a negatív kontroll mintákra kapott

p24 adatok átlagtól való eltérése alapján (SD%=0,78) 16,60 pg/ml-nek adódott.

A validálás során minden előírt paramétert meghatároztunk, valamint igazoltuk a

módszer alkalmasságát a DermaVir biológiai aktivitásának pontos, specifikus és

reprodukálható mennyiségi meghatározására.

40

6.2. A nanomedicina immunológiai potenciáljának in silico modellezése

6.2.1. T sejt epitóp repertoár analízis kidolgozása

Jelen fejezetben az in silico immunológiai potenciál modellezésének kidolgozásáról

lesz szó: hogyan választottuk ki a T sejt epitóp predikciós módszereket és a felhasznált

HIV szekvencia adatbázist. Ezt követően a kiválasztott módszerek megbízhatóságának

tesztelését, és az általunk bevezetett kvantitatív és kvalitatív mérőszámok: az abszolút

immunológiai potenciál (AIP) és a relatív immunológiai potenciál (RIP) definícióját és

alkalmazását mutatom be a DermaVir nanomedicina pDNS hatóanyagának (pLWXu1)

példáján. Ezután pedig a nanomedicina keresztvédő képességének modellezését

különböző szubtípusú fertőzésekre. A személyre szabott immunterápia tervezése is

ugyanezen T sejt predikciós módszeren alapul, ami alapján kifejlesztettünk egy

immunológiai hasonlósági csoportokat megjelenítő új vakcinatervező “eszközt”, az

immunológiai fá-t. Utóbbi lényegét és alkalmazását a 6.3. fejezetben részletezem.

Mivel lényegében a T sejt epitópok határozzák meg egy T sejtes immunválaszt kiváltó

terápiás vakcina immunológiai karakterét, célul tűztük ki a pLWXu1-ről termelődő

fehérje antigének elméleti T sejt epitóp repertoárjának mennyiségi és minőségi

vizsgálatát bioinformatikai eszközökkel. Az analízishez a legmegbízhatóbb módszerek

és adatbázis kiválasztására törekedtünk. A legnagyobb és leghomogénebb adatokat

tartalmazó T sejt epitóp adatbázist, az “Immune Epitope Database”-t (IEDB)

használtuk. A legmegbízhatóbb in silico epitóp predikciós módszer kiválasztásához

összehasonlítottuk a stabilizált mátrix módszer (Stabilized Matrix Method, SMM), az

átlagos relatív kötésen alapuló módszer (Average Relative Binding, ARB) és a

mesterséges neurális hálózat alapú módszer (Artificial Neural Network, ANN)

megbízhatóságát. Ehhez a HXB2 HIV-1 referencia törzs struktúrfehérjéit választottuk

(GenBank azonosító: NC_001802), és az IEDB adatbázis segítségével, mindhárom

módszerrel prediktáltuk a nagy affinitású MHCI epitópokat, majd összehasonlítottuk

azokat a “HIV Molecular Immunology” című kiadványban publikált, kísérletesen

igazolt epitópokkal [83]. (A nagy affinitású epitópok definíció szerint 50 nM-nál kisebb

fél-maximális gátlási koncentrációval – IC50 értékkel – jellemezhetők.)

A megbízhatóságot a kísérletes adatokkal korrekt egyezést mutató (teljesen egyező-,

plusz az egy as eltérést tartalmazó) epitópok százalékban kifejezett arányaként adtuk

meg. Az ANN predikciós módszer bizonyult a legmegbízhatóbbnak, az Env-TM (gp41)

41

fehérje esetén például a prediktált epitópok 74,5%-a mutatott korrekt egyezést a

kísérletesen igazolt, valós epitópokkal, míg az SMM 66,4%-os, az ARB módszer pedig

57,6%-os predikciós megbízhatóságot eredményezett.

Ezután meghatároztuk az ANN MHCI predikciós módszer megbízhatóságát a HXB2

összes struktúrfehérjéjének felhasználásával, ugyanarra az allélre. A legalacsonyabb,

70,5%-os megbízhatósági értéket a gp120 eredményezte. Az MHCII epitóp predikciós

“Konszenzus módszert” publikált validálási eredmények alapján választottuk [81]. A

továbbiakban tehát az ANN predikciós módszerrel, valamint a Konszenzus módszerrel

prediktáltuk az MHCI és MHCII epitópokat mind a tizenöt pLWXu1 által kódolt teljes

vagy csonka fehérjére [92]. Ezen predikciók, és a szintén ebben a fejezetben részletezett

keresztvédettség elemzések elvégzése után az addig általunk prediktált összes epitóp

felhasználásával ismét elvégeztük az ANN ill. Konszenzus predikciós módszerek

megbízhatóságának vizsgálatát, most már az összes prediktálható allélre (57 MHCI és

63 MHCII allélre). Eredményül 97,7%-os megbízhatóságot kaptunk az MHCI

predikciós módszerre, és 95,1%-os megbízhatóságot az MHCII predikciós módszerre

(2. Táblázat). Ez azt jelenti, hogy a kísérletesen igazolt 1480 CD8+ T sejt specifikus

MHCI epitóp 97,7%-át prediktáltuk pontos-, vagy korrekt egyezéssel. Az MHCII

esetében pedig a 615 kísérletesen igazolt CD4+ T sejt specifikus MHCII epitóp 95,1%-

át sikerült pontos-, ill. korrekt egyezéssel prediktálnunk.

2. táblázat. Az MHCI és MHCII epitóp predikciós módszerek megbízhatóságának vizsgálata

kísérletesen igazolt epitópok segítségével.

Predikcióink alapján a pLWXu1 által expresszált fehérjék összesen 933 nagy affinitású

(CD8+ T sejtek érését indukáló) MHCI epitópot, és 2330 nagy affinitású (CD4+ T

sejtes választ eredményező) MHCII epitópot tartalmaznak az IEDB adatbázisban

elérhető összes gyakori humán MHCI allélre (n=57) valamint MHCII allélre (n=63).

MHCI MHCII

Megengedett eltérések száma az epitópban 1 1

Adathalmaz szűkítése (erős epitópok <50 nM <50

Kísérletesen igazolt epitópok száma* 1480 615

Predikcióval „megtalált„ epitópok száma 1436 585

A predikció megbízhatósága 97,7% 95,1%

*HIV Molecular Immunology 2008

42

Fontos megjegyezni, hogy ez az epitóp repertoár nem egy adott egyénben kifejeződő

epitópokat jelenti, hanem a teljes humán populációban elméletileg képződő HIV epitóp

repertoárt. Vagyis ez az összegzett érték a pLWXu1 által expresszált fehérje készlet

elméleti epitóp mennyiségét adja meg, amely T sejtes immunválasz kiváltását

indukálhatja a humán populációban.

6.2.2. Abszolút immunológiai potenciál (AIP)

Az immunológiai potenciál részletesebb jellemzéséhez bevezettük az abszolút

immunológiai potenciál (AIP) fogalmát, ami megmutatja, hogyan oszlik meg az egyes

fehérjékre specifikus epitópok mennyisége a teljes proteom immunológiai potenciálján

belül. Az AIP tehát minden fehérjének megadja az antigén-specifikus T sejtes

immunválaszban képviselt elméleti részarányát. Az AIP-t az összes gyakori IEDB

adatbázisban található MHCI és MHCII allélre prediktáltuk.

Az alább részletezett eredményeink rámutattak a strukturális és szabályozó fehérjék

egyidejű kódolásának fontosságára a széles spektrumú immunválasz kiváltására

tervezett HIV vakcinánkban. A pLWXu1 által expresszált fehérjék a következő MHCI-

AIP sorrendet eredményezték: Env-TM (22,9%), Pol-RT (15,0%) és Env-SU (13,7%),

valamint Gag-CA (7,6%), Rev (6,6%), Vif (6,5%), Nef (5,6%), Vpu (4,2%), Gag-MA

(3,8%), Pol-RNáz (3,8%), Pol-IN (3,4%), Vpr (3,0%), Pol-Proteáz (2,0%), Tat (1,3%)

és Gag-NC (0,5%) (13. ábra). Az MHCII specifikus AIP pedig ezt a sorrendet mutatta:

Env-SU > Tat > Pol-RT > Gag-NC > Vif > Gag-CA > Gag-MA > Env-TM > Rev >

Nef > Vpr > Pol-IN > Pol-RNáz > Vpu > Pol-Proteáz. 17,3%-tól 2,0%-ig terjedő

értékekkel. Eredményeink megmutatták, milyen jelentős különbségek vannak az egyes

HIV fehérjék CD4+ ill. CD8+ T sejt indukáló képességében: az MHCI-AIP megoszlása

a struktúrfehérjék és szabályozófehérjék között 72,8% ill. 27,2%, az MHCII-AIP

esetében pedig 63,6% ill. 36,4%. A legmagasabb AIP részarányt a Gag-CA, Pol-RT,

Vif, Rev, Env-SU és Env-TM fehérjék képviselik a pLWXu1 expresszált fehérjéi közül.

A legnagyobb MHCI-AIP és MHCII-AIP értékek közti különbséget a Tat és Gag-NC

fehérhéknél találtuk. Ezek nagyon kis aktivitást mutatnak a CD8+ T sejtek

indukálására, viszont nagyon immunogénnek adódnak a CD4+ helper T sejtek

indukálására nézve. (Az Env-SU ötször hosszabb fehérje, mégis a Tat szinte

ugyanakkora részt tesz ki az MHCII-AIP-ből (15,0 %-ot), mint az Env-SU (17,3%).)

43

13. ábra. A pLWXu1 pDNS gyógyszerhatóanyag által expresszált antigén készlet abszolút

immunológiai potenciálja (AIP) MHCI és MHCII T sejt epitópok predikciója alapján. A

pLWXu1 által expresszált proteom AIP értékének az egyes fehérjék közti megoszlása

százalékban kifejezve: az MHCI molekulákon bemutatott epitópok által indukálható CD8+

specifikus T sejtek mennyisége (fekete oszlop), ill. az MHCII molekulákon bemutatott

epitópokkal indukálható CD4+ T sejtek mennyisége (szürke oszlop). A csillaggal jelölt fehérjék

nem teljes hosszúságúak; a fehérjék hossza (as) a fehérjék rövidítése mellett zárójelben

szerepel.

6.2.3. A DermaVir (pLWXu1) immunológiai potenciálja egy személyben

modellezve

A teljes populációra vonatkoztatható eredmények után lássuk, milyen egy hipotetikus

genetikai HLA háttérrel rendelkező személy AIP-je. A legáltalánosabb HLA alléleket is

hordozó hipotetikus személy genotípusa legyen a következő: HLA A*0250, 3001; HLA

B*0702, 0801 MHCI specifikus allélek, valamint DP A1*0103, 0201; DP B1*0201,

0501; DQ A1*0101, 0301; DQ B1*0501, 0302; DR A1*0101, 0101; DR B1*0101,

0102 MHCII specifikus allélek. (HLA C alléleket még nem tartalmazott az IEDB

adatbázis a vizsgálat idején, ezért nem szerepelnek a hipotetikus genotípusban sem.)

Az MHCI-AIP eredmények hasonló trendet mutattak egy személy esetén, mint a

minden fenti, populáció szintű predikció esetében. Csak három fehérje: Pol-RNase, Vpu

és a Pol-IN sorrendje módosult minimálisan (± 1 hellyel). Ezzel szemben az MHCII-

AIP nagyobb eltéréseket eredményezett a modell személy esetében: az Env-TM > Tat >

5.6

22.9

13.7

4.2

6.6

1.3

3.0

6.5

3.4

3.8

15.0

2.0

0.5

7.6

3.8

4.4

5.9

17.3

2.3

4.8

15.0

3.0

7.0

3.0

2.7

11.0

1.7

8.8

6.9

6.4

-30 -20 -10 0 10 20 30

Nef* (150)

TM (345)

SU (508)

Vpu (81)

Rev (115)

Tat (101)

Vpr (96)

Vif (192)

IN* (142)

RNase (120)

RT (440)

Prot. (99)

NC (55)

CA (231)

MA (132)

Env

Pol

Gag

pLW

Xu

1 á

ltal

exp

ress

zált

feh

érj

ék

Abszolút immunológiai potenciál (%)

30 20 10

MHCI MHCII

44

Pol-RT > Gag-NC > Env-TM > Gag-CA > Vif > Rev > Gag-MA > Vpr > Nef > Pol-IN

> Vpu > Pol-Proteáz > Pol-RNáz antigén sorrendet kaptuk [92]. Fontos megjegyezni,

hogy az egyes MHC allélek hozzájárulása immunológiai potenciálhoz nagyon eltérő, pl.

az MHCI epitópok mennyisége a különböző alléleken a következőképpen alakult:

A*0250-re 78 epitóp, A*3001-re 43 epitóp, A*0702-re 9 epitóp míg az A*0801 allélre

mindössze 1 nagy affinitású epitóp volt prediktálható. Tehát az immunválasz minősége

függ az egyén genetikai MHC hátterétől.

Ezek az eredmények jelzik, hogy módszerünk alkalmas lehet a DermaVirre (vagy más

antigénre) specifikus T sejtes immunválasz modellezésére minden személyben,

amennyiben a HLA genotípusa ismert. Ezért úgy gondoljuk a módszer segítséget

nyújthat a klinikai kísérletek immunogenitási eredményeinek értelmezése során is,

mivel prediktálhatjuk az immunogén immunválaszban mérhető hatását.

6.2.4. Relatív immunológiai potenciál (RIP)

Az egyes fehérjék T sejtes választ kiváltó potenciáljának további jellemzése céljából

definiáltuk a relatív immunológiai potenciált (RIP), amely az adott fehérjére specifikus

adat. A RIP megmutatja, hogy egy fehérjében mennyi nagy affinitású epitóp található

az elméletileg lehetséges epitópmennyiséghez képest, vagyis MHCI esetén a modell

szerinti 9 as hosszúságú, MHCII esetén 15 as hosszúságú peptidek maximális számához

képest. Mivel az MHCI epitópok hossza 9 as a predikcióinkban, az MHCII epitópok

hossza pedig 15 as, ezért az elméleti epitóp szám MHCI esetén a fehérje hossza mínusz

8, MHCII esetén a fehérje hossza mínusz 14. A RIP értékét a prediktált nagy affinitású

epitópok számának, valamint az elméleti epitópok számának hányadosa adja,

százalékban kifejezve. A RIP tehát a fehérje epitópsűrűségének mérőszáma.

Az MHCI-RIP az Env-TM struktúrfehérje (214/337; 63,5%) és a Rev szabályozó

fehérje (62/107; 57,9%) esetében volt a legmagasabb, de a Gag-CA (71/124; 57,3%), és

a Vpu is magas relatív immunológiai potenciált eredményezett (39/73; 53,4%) (14.

ábra). A legalacsonyabb értékek a Tat (12/93; 12,9%) és Gag-NC fehérjékre (5/47;

10,6%) adódtak.

A legnagyobb MHCII-RIP értékeket a Gag-NC (204/41; 497,6%) és Tat (349/87;

401,1%) fehérjékre számoltuk, ami összecseng ezen fehérjék magas MHCII-AIP

részarányával. 100%-nál magasabb RIP értéket akkor kaphatunk, ha a vizsgált fehérje

bizonyos mértékben “MHC-független” erős epitópokat is tartalmaz, vagyis ha egy

45

epitóp több MHCII allélre is prediktálható (ekkor az ismétlések is beleszámítandók az

összes prediktált epitóp mennyiségbe). A Gag-CA szintén magas RIP-pel jellemezhető

(160/118; 135,6%), ezután pedig a Rev > Vif > Vpr > Env-SU > Vpu > Nef > Gag-MA

> Pol-RT > Pol-RNáz > Pol-IN > Pol-Proteáz > Env-TM fehérjék következnek a sorban

[92].

Az MHCI-RIP és MHCII-RIP értékek tehát nagyban különböznek, ami szintén jelzi a

sokféle fehérje antigént tartalmazó pLWXu1 pDNS alapú vakcina immunológiai

potenciálját széles specifitású CD4+ és CD8+ T sejtes immunválasz kiváltására.

14. ábra. A pLWXu1 pDNS gyógyszerhatóanyag által expresszált antigén készlet relatív

immunológiai potenciálja (RIP) MHCI és MHCII T sejt epitópok predikciója alapján. A

pLWXu1 expresszált antigén készletének RIP értéke, vagyis az egyes fehérjéken belüli epitóp

sűrűség ábrázolása: az MHCI specifikus epitópok (fekete oszlop) aránya az adott fehérjében

elméletileg lehetséges 9 as hosszú epitópok mennyiséghez képest (fehér oszlop), ill. az MHCII

specifikus epitópok aránya az adott fehérjében elméletileg lehetséges 15 as hosszú epitópok

mennyiséghez képest (fehér oszlop). A csillaggal jelölt fehérjék nem teljes hosszúságúak; a

fehérjék hossza (as) a fehérjék rövidítése mellett zárójelben szerepel.

-600 -400 -200 0 200 400 600

Nef* (150)

TM (345)

SU (508)

Vpu (81)

Rev (115)

Tat (101)

Vpr (96)

Vif (192)

IN* (142)

RNase (120)

RT (440)

Prot. (99)

NC (55)

CA (132)

MA (231)

Env

Pol

Gag

pL

WX

u1

de

rive

dp

rote

ins

600 400 200

Number of theoretical and predicted epitopes

-600 -400 -200 0 200 400 600

Nef* (150)

TM (345)

SU (508)

Vpu (81)

Rev (115)

Tat (101)

Vpr (96)

Vif (192)

IN* (142)

RNase (120)

RT (440)

Prot. (99)

NC (55)

CA (231)

MA (132)

Env

Pol

Gag

pL

WX

u1

álta

l e

xpre

sszá

ltfe

hé

rjé

k

Elméleti- és prediktált epitópok száma

600 400 200

MHCI MHCII

46

6.2.5. Nem-B szubtípusú fertőzés esetén a B-szubtípus alapú terápia

hatékonyságának in silico modellezése

A fent ismertetett in silico T sejt epitóp predikciós módszer segítségével modelleztük,

hogy a B szubtípusra specifikus T sejtes immunválasz mennyire lehet hatékony nem B-

szubtípusú HIV fertőzés esetén.

Mivel az Afrikában (Szaharától délre) domináló C szubtípusú HIV a legjelentősebb

járványokozó bolygónkon, részletes összehasonlításukat ezzel a szubtípussal mutatom

be. Először egyetlen gyakori MHCI specifikus HLA allélre, részletesen vizsgáljuk meg

a keresztvédettséget a közös epitópok számba vételével! A HLA A*0250 allélre

vonatkozó eredményeinket a 3. táblázatban foglaltam össze. A nanomedicina által

expresszált fehérjekészlet 104 nagy affinitású epitópja közül B szubtípusú (vagyis

szubtípus-azonos) fertőzés esetén 93 teljesen megegyezik, vagyis a prediktált pLWXu1

epitópok 89%-a hatékony CD8+ T sejtes válasz indukálására lehet képes, amennyiben a

kezelt beteg az elemzett B szubtípusú HIV-vel fertőzött (3.A táblázat).

C szubtípusú fertőzés esetén azonban sokkal alacsonyabb a nanomedicinából származó

epitópok, és a fertőzést okozó HIV-ből származó epitópok közti egyezés mértéke:

mindössze 13 egyező epitópot találtunk, amik a Gag, Pol és Env poliproteinekre

korlátozódtak (3.B táblázat). Ez mérsékelt keresztvédettségre utal, más szóval a B

szubtípusú fehérjéket expresszáló vakcina alacsony hatékonyságát jelzi C szubtípusú

HIV-vel fertőzött betegben.

3. táblázat. A B szubtípus specifikus pLWXu1 nanomedicina hatékonyságának modellezése C

szubtípusú HIV-vel fertőzött betegben, T sejt epitóp predikcióval az MHCI specifikus HLA

A*0250 allélre. A: Összefoglaló táblázat a nanomedicina hatékonyságára egy szubtípus-azonos

(génbanki azonosító: NC_001802), valamint C szubtípusú (AB254141) fertőzés esetén. *A

teljesen megegyező epitópok alapján számoltuk ki a keresztvédettség mértékét, melyet a

pLWXu1 összes epitópjának százalékában adtuk meg. B: A megegyező epitópok eloszlása a

proteomban. (Az epitóp szekvenciákat követő számok az epitóp fehérjén belüli pozícióját

jelölik. Az egyező epitópokat +, az eltérőeket – szimbólum jelöli.)

A

A fertőzés szubtípusa pLWXu1 epitópok száma B C

A*0250 MHCI allélre egyező/Σ epitóp egyező/Σ epitóp 104 93/107 13/92

Keresztvédettség* (%) 89 13

47

B

Fehérje pLWXu1 B szubtípus C szubtípus Fehérje pLWXu1 B szubtípus

16 15 / 16 5 / 20 9 8 / 9

GLLETSEGC + + FLYQSTHLP 21-29 -

ILGQLQPSL + - RLVNGSLAL 54-62 +

SLYNTVATL + + LIWDDLRSL 62-70 +

TLYCVHQRI + - RLRDLLLIV 77-85 +

TLNAWVKVV 151-159 + - LLLIVTRIV 81-89 +

ALSEGATPQ 174-182 + + LIVTRIVEL 83-91 +

DLNTMLNTV 183-191 + + LLGRRGWEA 91-99 +

AMQMLKETI 197-205 + - ALKYWWNLL 99-107 +

AEWDRVHPV 210-218 + - LLQYWSQEL 106-114 +

IILGLNKIV 266-274 + + 4 3 / 4

RMYSPTSIL 275-283 + - ALVVAIIIA +

WMTETLLVQ 316-324 + - VVAIIIAIV +

EMMTACQGV 345-353 + - IIAIVVWSI +

VLAEAMSQV 362-370 + - ALAEMGVEM -

AMSQVTNSA 366-374 + - 37 32 / 37

SLFGNDPSS 491-499 - - MLLGMLMIC 20-28 +

24 23 / 27 4 / 18 QMHEDIISL 103-111 +

ITLWQRPLV 59-67 + + KLTPLCVSL 121-129 +

LLTQIGCTL 145-153 + - TLTSCNTSV 192-200 +

ALVEICTEM 188-196 + - VITQACPKV 200-208 +

DVGDAYFSV 265-273 + + SLAEEEVVI 264-272 +

YQYMDDLYV 336-344 + + NLTDNVKTI 276-284 -

YMDDLYVGS 338-346 + + IIVQLNQSV 284-292 -

HLLRWGLTT 363-371 + - TLKQIASKL 341-349 +

ELHPDKWTV 388-396 + - QIINMWQEV 422-430 -

TVNDIQKLV 408-416 + - ALFLGFLGA 517-525 +

KLVGKLNWA 414-422 + - FLGAAGSTM 522-530 +

KLLRGTKAL 436-444 + - TMGAASMTL 529-537 +

LLRGTKALT 437-445 + - QLLSGIVQQ 543-551 +

ALTEVIPLT 443-451 + - LLSGIVQQQ 544-552 +

ELAENREIL 457-465 + - AIEAQQHLL 558-566 +

ILKEPVHGV 464-472 + - LLQLTVWGI 565-573 +

QLTEAVQKI 522-530 + - QLQARILAV 575-583 +

YQLEKEPIV 582-590 + - SLWNWFNIT 668-676 +

IVGAETFYV 589-597 + - NITNWLWYI 674-682 +

YLALQDSGL 638-646 + - WLWYIKIFI 678-686 -

ALQDSGLEV 640-648 + - YIKIFIMIV 681-689 -

IVTDSQYAL 650-658 + - FIMIVGGLV 685-693 +

LVNQIIEQL 672-680 + - MIVGGLVGL 687-695 +

YLAWVPAHK 687-695 + - GLRIVFAVL 694-702 +

HLEGKVILV 782-790 + - IVFAVLSIV 697-705 +

6 6 / 6 0 / 5 AVLSIVNRV 700-708 +

WQVMIVWQV 5-13 + - RLVNGSLAL 747-755 +

RIRTWKSLV 17-25 + - LIWDDLRSL 755-763 +

SLVKHHMYV 23-31 + - RLRDLLLIV 770-778 +

LVITTYWGL 64-72 + - LLLIVTRIV 774-782 +

ELADQLIHL 101-109 + - LIVTRIVEL 776-784 +

KIKPPLPSV 158-166 + - LLGRRGWEA 784-792 +

5 4 / 5 0 / 5 ALKYWWNLL 792-800 +

LLEELKNEA 22-30 + - LLQYWSQEL 799-807 +

WLHGLGQHI 38-46 + - SLLNATAIA 813-821 +

GLGQHIYET 41-49 + - AVAEGTDRV 821-829 +

AIIRILQQL 59-67 + - 3 2 / 3

QLLFTHFRI 66-74 - - LLRPMTYKA 75-83 -

GLEGLIHSQ 96-104 +

ILDLWIYHT 109-117 +

Nef

Vp

r

En

v (p

oli

pro

tein

)V

pu

Rev

Gag

(p

oli

pro

tein

)P

ol

(po

lip

rote

in)

Vif

Tat 0 0 0

48

A pLWXu1 pDNS alapú nanomedicina hatékonyságának elemzését nem B-szubtípusú

fertőzöttben ezután kiterjesztettük az összes prediktálható gyakori MHCI allélre (n=57),

valamint MHCII allélre is (n=63). A CD8+ T sejtes immunválasz elméleti hatékonysága

58%-osnak adódott szubtípus-azonos pácienst feltételezve, míg a C szubtípusú

fertőzöttben mindössze 26% volt a megegyező epitópok aránya a nanomedicinából

származó epitópokkal (4. táblázat). Modellünkbe bevettünk egy harmadik elterjedt

szubtípust is, az A szubtípust. Ennél szintén alacsony, 24%-os epitóp-egyezést találtunk

a nanomedicinából származó MHCI epitópokkal. A CD4+ T sejtes immunválasz

esetében szintén korlátozott mennyiségben találtunk egyező epitópokat: 47%-ot az

egyező szubtípusú fertőzés esetén, 15%-ot a C szubtípusú fertőzés esetén, ill. 14%-ot A

szubtípusú fertőzés esetén. Noha modellünkben csak egy-egy szubtípus-specifikus

szekvenciát elemeztünk, eredményeink megerősítik a fenti, egyetlen allél vizsgálatával

tett megállapításunkat, azaz a nanomedicina eltérő szubtípusú fertőzés esetén

lényegesen kisebb hatékonyságú lehet. A természetes felülfertőződéshez hasonlít ez a

megfigyelés, aminek során a HIV fertőzött beteg egy újabb HIV vírussal is fertőződik.

A felülfertőzés vírusszint emelkedést okoz, mert az alacsony kereszt-reaktivitás miatt az

addig hatékony immunválasz nem működik az új vírussal szemben [94,95].

4. táblázat. A B-szubtípus specifikus pLWXu1 nanomedicina hatékonyságának modellezése

szubtípus-azonos (génbanki azonosító: NC_001802), C szubtípusú (AB254141) és A szubtípusú

(AB253428) HIV-vel fertőzés esetén, T sejt epitóp predikcióval az összes prediktálható gyakori

MHCI és MHCII allélre. A keresztvédettséget a pLWXu1 összes epitópjának százalékában

adtuk meg.

A fertőzés szubtípusa

pLWXu1 B C A epitópok száma

57 MHCI allélre egyező/Σ epitóp egyező/Σ epitóp egyező/Σ epitóp

991 578/1164 257/1051 242/964

Keresztvédettség (%) 58 26 24

epitópok száma 63 MHCII allélre

egyező/Σ epitóp egyező/Σ epitóp egyező/Σ epitóp

2046 966/1636 297/2102 280/2261

Keresztvédettség (%) 47 15 14

Eredményeink azt sugallják, hogy a teljes HIV-fertőzött humán populáció számára

akkor tudunk hatékony terápiás vakcinát (nanomedicinát) nyújtani, ha a vírus genetikai

változatosságát, pontosabban a genetikai változatosságból származtatható immunválaszt

49

befolyásoló különbségeket is figyelembe véve szubtípus-optimalizált termékeket

fejlesztünk.

6.3. Szubtípus-optimalzált pDNS konstrukciók tervezése és klónozása

6.3.1. A vakcinatervezést segítő új alkalmazás: az “immunológiai fa”

Mivel a HIV genetikai változatossága (szubtípusok) a megfertőzött személy antigén-

feldolgozásért felelős genetikai változatosságával (MHC vagy HLA genotípus) együtt

határozza meg a kialakuló immunválasz minőségét, indokolt mindkét paramétert

figyelembe venni az immunogén tervezés során. Ezért a hagyományos HIV diverzitás

genetikai rokonsági viszonyainak vizsgálata helyett kidolgoztunk egy immunológiai

hasonlóságokon alapuló vírus csoportosítást. Módszerünk fehérje aminosav sorrend

helyett immunológiailag releváns T sejt epitópok alapján illeszti a szekvenciákat, és a

Neighbor joining filogenetikai fa készítő algoritmussal analóg módon kapcsolja össze

az epitópok alapján leghasonlóbb szekvenciákat, ill. szekvencia csoportokat [84].

Eredményül a hasonló immunválaszt kiváltani képes HIV szekvenciák csoportjait

kapjuk. Lássunk egy példát a genetikai hasonlóság-alapú fa és az immunológiai fa

információtartalma közti különbség bemutatására! Az elemzéshez egy jól izolált

epidémia, az ausztrál járvány génbankban található összes teljes HIV szekvenciáját

használtuk fel. A 15. ábrán a legkonzervatívabb HIV fehérje, a Pol poliprotein

aminosav alapú illesztése után készített filogenetikai fa, és a gyakori MHCI allélekre

prediktált CD4+ T sejt epitópok illesztése után készített immunológiai fa látható.

Külcsoportnak három, főként a Távol-Keleten elterjedt CRF_AG izolátumot

választottunk. A filogenetikai fán az elágazási pontokon a bootstrap értékek a

megbízhatóságot jelző mérőszámok (1000 ismétléssel generált fa hány százalékában

szerepel az adott elágazás). Az immunológiai fa elágazási pontjain a számok két

izolátum, ill. izolátum-csoport közötti korrekt egyezést mutató epitópok (megegyező

plusz egyetlen aminosavban különböző) számát adják meg. Tehát minél több a korrekt

egyezést mutató epitóp, annál nagyobb az immunológiai, pontosabban immunválaszbeli

hasonlóság két szekvencia között. Éppen ezért a közös ágon lévő szekvenciák jobb

immunológiai keresztreakciót adhatnak egymással, mint a csoporton kívüli

szekvenciákkal.

50

15. ábra. Példa a filogenetikai fa és az immunológiai fa információtartalmának különbségére, ausztrál HIV izolátumok Pol poliproteinjének vizsgálatával.

Filogenetikai fa: Clustal-W illesztés, Neighbor-Joining algoritmus, 1000 Bootstrap ismétlés. Immunológiai fa: prediktált MHCI epitópok sorozatának

(epitom) illesztése; a számok a vonatkozó két taxon közti korrekt egyezést mutató (megegyező plusz egy as-ban eltérő) epitópok mennyiségét jelentik.

Filogenetikai fa Immunológiai fa

51

A CRF_AG külcsoport filogenetikailag jól elkülönül a szubtípus-B csoporttól, és az

immunológiai fán is egy klasztert alkot, noha két B szubtípusú szekvencia

immunológiailag kilóg a csoportból. Közülük az egyik éppen a pLWXu1 által

expresszált Pol poliprotein, de ennek a nagyobb immunológiai távolságát az

magyarázhatja, hogy a biztonsági módosítások miatt rövidebb fehérjét hasonlítottunk a

többi teljes hosszúságú poliproteinhez. A fák topológiájában azonban több különbség is

látható, például a filogenetikai fán bekeretezett három szekvencia filogenetikai

távolsága lényegében elhanyagolható, míg az immunológiai fán a DQ676879

azonosítójú szekvencia távolabb helyezkedik el a filogenetikailag közelebbi DQ676877

és DQ676878-as szekvenciáktól, és több közös epitópot tartalmaz a DQ676880-as

szekvenciával, mint az előbbiekkel. Ehhez hasonló különbségeket a két fa között több

helyen is megfigyelhetünk még.

Noha az eltérések viszonylag kismértékűek, mégis rávilágítanak arra, hogy a

filogenetikai csoportok nem feltétlenül egyeznek a szekvenciák immunológiai

csoportosítással előálló klasztereivel. Ugyanis az immunológiai fa az immunválaszt

meghatározó epitópok szempontjából súlyozza a szekvenciák közti távolságokat,

minőségileg más eredményt adva. Az immunológiai-, ill. filogenetikai fák

összehasonlítását a többi HIV fehérjére is elvégeztük, és minden esetben az előző

példához hasonló szintű minőségi különbségeket találtunk köztük. Az immunológiai

fákat elkészítettük MHCI és MHCII allélekre is, amelyek minden fehérje esetén

kongruensek voltak: a módszer azonos immunológiai hasonlósági viszonyokat

eredményezett mind a CD8+ T sejtes immunválasz, mind a CD4+ T sejtes immunválasz

szempontjából.

Vizsgálataink alapján úgy véljük, hogy az immunológiai fa hatékony eszköz lehet az új

vakcinajelöltek (immunogének) fejlesztéséhez.

A továbbiakban az immunológiai fa alapján történő pDNS immunogén tervezést

mutatom be a szubtípus-optimalizált új nanomedicina hatóanyagok példáján.

52

6.3.2. Szubtípus-optimalizált termékjelöltek immunológiai szempontú tervezése

Az új nanomedicina termékjelöltek tervezése előtt kiválasztottuk a célzott járványokat.

A leendő termékcsalád első tagjai az alábbi szubtípusokba ill. cirkuláló rekombináns

formákhoz tartoznak: a legnagyobb járványokat okozó C szubtípus, a Kínában és a

Távol-Keleten gyakori BC rekombináns forma (CRF_07 ill. CRF_08), a Dél-

Amerikában jellemző BF rekombináns típusok (CRF_39 ill. CRF_40), és a Kelet-

Európában, főként Ukrajnában az utóbbi évtizedben gyorsan terjedő AB rekombináns

szubtípus (5. táblázat) [96].

5. táblázat. HIV-1 szubtípus-optimalizált pDNS konstrukciók, és a célzott járványok helye

valamint mérete.

Szubtípus / CRF Elterjedési terület Fertőzöttek száma* pDNS név C szubtípus Afrika (Szaharától délre) 22,5 millió pLWXu-C

CRF_BC (07 és 08) Kína 3,3 millió pLWXu-BC CRF_BF (12 és 39) D-Amerika 1,6 millió pLWXu-BF

CRF_AB (03) K-Európa 10 000 pLWXu-AB * A régió összes HIV fertőzöttjének száma, amin belül a megadott szubtípus, ill. CRF-ek dominálnak.

Ezt követően T sejtes immunválasz alapú immunológiai hasonlósági fákat készítettünk

teljes HIV proteomokra a kiválasztott járványok izolátumainak felhasználásával.

Célunk az volt, hogy az immunológiai fa csoportjaiba sorolható konstrukciókat

tervezzünk. Ugyanakkor kulcsfontosságú feladat volt a konstrukciók biztonsági

módosítása, a klinikai tesztelésre hatóságilag engedélyezett (pLWXu1) pDNS

biztonsági profiljának megőrzésével. Ezért a pLWXu1 pDNS Pol poliprotein génjét

(melynek 3’ végéhez közeli IN tartalmaz többszörös biztonsági módosításokat),

valamint a Nef gén 3’ végén csonkított kódoló darabját változtatás nélkül megőriztük a

szubtípus-optimalizált konstrukciókban. Vagyis az immunológiai optimalizálást a fent

említett HIV-specifikus szekvenciákon kívül eső régiókra kellett korlátoznunk. A

biztonsági és immunológiai optimalizálási szempontoknak megfelelő új pDNS

szekvenciákat a 16. ábrán látható térképek szerint terveztük meg. A CRF-ek esetében

természetesen az eredeti szubtípusok rekombinációs mintázatát is figyelembe vettük

[97].

53

16. ábra. A négy új pDNS HIV-specifikus részének térképe. A szubtípus-B eredetű

szekvenciák és a biztonsági módosítások a pLWXu1 pDNS-ből származnak.

Az immunológiai szekvencia optimalizálást a következőképpen valósítottuk meg: a

pLWXu-AB termékjelölt esetében az immunológiai fa CRF_03 AB klaszteréből

kiválasztott izolátum alapján terveztük a pDNS szekvenciát (16. ábra). Azon

konstrukcióknál, amelyeket frissen izolált HIV törzsek klónozásával készítettünk

(pLWXu-BC, pLWXu-BF és pLWXu-C), az immunológiai fát használtuk fel a

megfelelő epidemiológiai egységek meghatározásához, majd a pDNS-ek készítéséhez.

6.3.3. Az új pDNS-ek elkészítése és a termékjelöltek in silico jellemzése

Ezután elkészítettük az új pDNS termékjelölteket. A HIV-fertőzött betegek

vérszérumából RNS izolálás után RT-PCR-rel amplifikáltuk a vírus örökítőanyagát. A

pLWXu-AB konstrukcióhoz az AB rekombinánsra optimalizált DNS-t

szintetizáltattunk. A pLWXu1 “szülői” pDNS biztonsági módosításokat is tartalmazó

részeit változtatás nélkül megtartottuk, míg a szubtípus-specifikus DNS szakaszokat a

pLWXu1 DNS megfelelő szakaszai helyére illesztettük irányított klónozással. A

restrikciós enzimes gyors ellenőrzést követően az új pDNS-eket megszekvenáltattuk.

Az elkészített pDNS konstrukciók szekvenciáit felhasználva azt is ellenőriztük, hogy

tényleg az immunológiai fa megfelelő csoportjába tartoznak-e. A 17. ábrán az

pLWXu-C

pLWXu-BF

pLWXu-AB

LTR LTR

NefGag

LTR

Env

Tat

Rev

RT RNáz IN

Pol

Prot

LTR LTR

Nef

LTR

Env

Tat

Rev

GagRT RNáz IN

Pol

Prot

Env

Tat

Rev

Gag

LTR LTR

Nef

LTR

Prot RT RNáz IN

Pol

Szubtípus- B: ; C: ; F: ; AB: ; biztonsági módosítások:

pLWXu-BCLTR LTR

NefGag

LTR

Env

Tat

Rev

RT RNáz IN

Pol

Prot

54

immunológiai szekvencia-optimalizálás célfehérjéi közül a két legjelentősebb

poliprotein, a Gag és Env immunológiai fáit mutatjuk be, melyek a szubtípusok és

CRF-ek csoportspecifikus referencia szekvenciákat is tartalmazó válogatásai. A

szubtípus-optimalizált szekvenciák minden esetben a megfelelő (tervezett)

immunológiai klaszterbe sorolódtak.

17. ábra. Az immunológiai szekvencia-optimalizálás eredménye: az új pDNS immunogén

jelöltek a tervezett immunológiai klaszterekbe tartoznak mind a Gag poliprotein-, mind pedig az

Env poliprotein immunológiai fáján. (A termékjelölteket aláhúzással emeltük ki a fákon.)

A munkát az új termékjelöltek in silico jellemzésével folytattuk: a pDNS-ek által kódolt

fehérjék immunológiai potenciálját modelleztük különböző szubtípusú és CRF-ű

fertőzések esetén. Annak érdekében, hogy a modell reprezentatív legyen, minden

gyakori HLA allélre elvégeztük a T sejt epitóp predikciót, amit az IEDB adatbázis

tartalmaz (57 MHC I allél, 63 MHC II allél, 2010-es allélkészlet alapján). Ezáltal

populációs szintű immunválaszokat kaptunk, amik sosem egyetlen egyénre

Env poliprotein

A

B

C

pLWXu-BF

pLWXu-ABpLWXu1 (B)

pLWXu-C

BF

A

B

C

AB

pLWXu-C

pLWXu-AB

pLWXu1 (B)

BF pLWXu-BF

pLWXu-BC

pLWXu-BC

Gag poliprotein

55

specifikusak, viszont általánosan jellemezhetik a nanomedicina-jelöltek

használhatóságát különböző szubtípusokba tartozó járványokban.

Eredményeinket a 6. táblázatban rendszereztük. Vizsgálatunkat a következő

szempontok szerint végeztük: Az A, B, C és F szubtípusok esetén a Los Alamos HIV

Database teljes genom szekvenciáiból készítettünk egy-egy reprezentatív szekvencia

gyűjteményt, 1 szekvencia / év / izolálás országa / szubtípus kiválasztással. Ez

átlagosan 50 szekvenciát jelent szubtípusonként. A CRF-ek esetében minden teljes

genom szekvenciát felhasználtunk az elemzéshez. A csoportokon belül a Los Alamos

Database szerinti referencia szekvenciát választottuk ki összehasonlító szekvenciának

(génbanki azonosítók: AB253428, NC_001802, AF286224, AF077336, AF193277,

AY008716, EU735534). Ezután a megfelelő referencia szekvencia proteomja alapján

prediktált T sejt epitóp készlettel hasonlítottuk össze a csoporton belüli összes proteom

epitóp készletét, valamint az összes szubtípus-optimalizált pDNS által termelt fehérje

repertoár epitóp-készletét. A referencia szekvencia összes prediktált MHC I ill. MHC II

epitópjának számát adtuk meg 100%-nak. (Mivel ez a szám szekvenciánként eltérő

lehet, a táblázat utolsó sorában megadtuk, hogy az adott összehasonlító szekvencia

esetén 1% mennyi epitópot jelent.) Majd kiszámoltuk a csoportátlagokat (szubtípus ill.

CRF csoportátlag), amely az egyező epitópok átlagos mennyisége egy csoporton belül.

Ez az érték adja meg a szigorúan vett keresztvédettséget csoporton belül, noha a

kizárólag nagy, ill. közepes affinitású epitópok vizsgálata miatt ezek a számok

valószínűleg kissé alábecsült értékek. Ezenkívül a csoportátlag egy elvi maximumot, ill.

viszonyítási értéket is kijelöl, hiszen a HIV szekvenciákkal a legerősebb kereszt-

reaktivitást mutató új termékjelölteknél sem várunk a csoportátlagnál nagyobb

számokat. Az 6. táblázatból kiolvashatjuk tehát, hogy a vizsgált szubtípusú ill. CRF-ű

csoportba eső fertőzések esetén mely szubtípus-optimalizált pDNS konstrukciók

nyújtanák a legjobb védelmet. Egy kivétellel a konstrukciók az azonos szubtípusú/CRF-

ű fertőzéssel szemben adták a legmagasabb prediktált keresztvédettséget. A

csoportspecifikus átlaggal összemérhető eredményeket kaptunk, vagyis a legjobb

immunválaszt adó termékjelölt megközelíti a csoporton belüli átlagos

keresztvédettséget. A CRF_BC fertőzési modellünkben a vizsgált HIV törzs nem az

azonos CRF-ű termékjelölttel adta a legjobb immunválaszt, hanem a pLWXu1-gyel.

Vagyis immunológiailag a pLWXu1 hatóanyagú nanomedicina közelebb áll a CRF_BC

referencia izolátumhoz, mint a pLWXu_BC. Ez az eredmény megerősíti a szubtípus-

56

optimalizált termékekből álló termékcsalád hasznosságát, kiegészítve azzal a

megállapítással, hogy a jövőben a leghatékonyabb nanomedicina kiválasztásához a

fertőzést okozó vírustörzs szekvenciáját érdemes analizálni és megnézni, hogy

ténylegesen melyik termékjelölttel adja a legjobb keresztvédettséget. Tehát a páciens

fertőzést okozó HIV vírusának-, és a T sejt epitópjait meghatározó HLA genotípusának

ismeretében személyre szabott in silico analízist végezhetünk, és személyre szabott

ajánlást tehetünk a betegben legjobb hatékonyságot mutató immunogénre ill.

immunterápiára.

6. táblázat. Az új nanomedicina termékjelöltek immunológiai hatásosságának modellezése

különböző HIV fertőzések esetén. Az immunológiailag legközelebbi, vagyis a fertőzést okozó

HIV törzzsel legtöbb közös epitópot tartalmazó termékjelölteket szürkével emeltük ki.

DermaVir

szubtípus (fertőzésé) CRF (fertőzésé) A B C F AB BC BF Szubtípus/CRF összehasonlító szekvenciával

egyező MHC I/MHC II epitópok (%) pLWXu1 (B) 25/12 80/59 26/16 23/10 37/20 27/20 22/14 pLWXu-AB 28/14 69/46 27/12 24/12 43/30 23/15 22/11 pLWXu-BC 28/13 37/47 30/17 22/12 29/13 27/15 24/13 pLWXu-C 26/12 26/18 31/17 24/10 28/12 27/15 25/10

pLWXu-BF 26/11 48/35 28/16 29/16 33/14 29/14 30/18 Szubtípus ill. CRF csoportátlag 30/15 37/16 37/18 36/23 70/62 38/38 30/16

1% epitóp egyezés mennyi epitópot jelent (MHC I/MHC II)

10/22 7/16 10/21 10/21 9/21 10/21 10/22

6.3.4. Az új szubtípus-optimalizált termékjelöltek in vitro tesztelése

Az új termékjelöltek minőségének ellenőrzése során a klinikai DermaVirt használtuk

referencia anyagként. Az új pDNS konstrukciók mindegyike a pLWXu1 pDNS HIV-

specifikus részeinek cseréjével készült, az összes biztonsági módosítást változtatás

nélkül megőrizve. Ezt szekvenálással ellenőriztük minden esetben. Ezért az új

nanomedicina jelöltek esetén elegendő volt az antigén expressziót jellemezni a VLP+

termelés és a biológiai aktivitás in vitro mérésével.

6.3.4.1. VLP+ termelés az új termékjelöltek által

Az új termékjelöltek VLP+ termelésének igazolására a pLWXu1-nél ismertetett módon

a pDNS-ekkel transzfektált 293T sejteket transzmissziós elektronmikroszkóppal

vizsgáltunk (18.A ábra). Minden új termékjelölt esetében jól láthatók a vad típusú HIV-

re jellemző fenotípusú VLP+ részecskék, melyek az érett virionhoz hasonló mag (core)

57

és burok (envelop) struktúrákat tartalmaznak, és a sejten kívüli térbe, valamint sejten

belüli vakuolumokba fűződnek le.

A VLP+ összetett felépítését tisztított VLP+ felhasználásával végzett western blottal is

megerősítettük (18.B ábra). Ugyanezen módszerrel igazoltuk a pDNS-ekben kódolt

fehérje repertoár VLP+-alkotó részének expresszióját. A pLWXu-BF és pLWXu-BC

esetén a p17-nek megfelelő sáv nem látható, amit a felhasznált VLP+ minta alacsonyabb

koncentrációja okozhat. (A p17 expresszióját egyértelműen igazolja a VLP+

termelődése, hiszen a VLP+ core részét a p17 fehérjék határolják, lásd 18.A ábra.)

58

18. ábra. Az új pDNS-ekről expresszált fehérjékből képződő komplex VLP+ részecskék. A: a

VLP+ “érésének” különböző fázisai az új pDNS-ek esetében (intracelluláris- és extracelluláris

lefűződés, éretlen virion-szerű fázis, érett virion-szerű fázis). A méretskála minden esetben 100

nm-nek felel meg. A fixált minták elektronmikroszkópos felvételeit Dr. Kovács Attila Lajos

készítette. B: Western blot pLWXu1-gyel transzfektált 293T sejtek felülúszójából, HIV+

szérum-keverék elsődleges ellenanyagként való használatával. Pozitív kontroll: pLWXu1

“szülői” pDNS. a-gp120 (Env-SU), b-p66 (reverz transzkriptáz plusz RNáz), c-p55 (Gag

poliprotein, benne p17, p24 és p7), d-p51 (Pol-RT), e-gp41 (Env-TM), f-p24 (Gag-CA), g-p17

(Gag-MA), h-p7 (Gag-NC).

A

B

pLWXu-C

pLWXu-BF

pLWXu-AB pLWXu-BC

59

6.3.4.2. Az új termékjelöltek biológiai aktivitása

Az új termékjelöltek biológiai aktivitásának meghatározását a fentiekben ismertetett

validált módszerrel végeztük el. Az új termékjelöltek biológiai aktivitását a pLWXu1

pDNS-t tartalmazó referencia anyag biológiai aktivitásának százalékában adtuk meg

(19. ábra). Minden új termékjelölt legalább 80%-os biológiai aktivitást mutatott, ezzel

megfelelt annak a minimum 70%-os elfogadási kritériumnak, aminek a klinikai termék

stabilitás vizsgálatai során is teljesülni kell.

19. ábra. Az új pDNS-ek biológiai aktivitása, a pLWXu1 biológiai aktivitásának %-ában

megadva. (pLWXu-BF: 82,0±8,5%; pLWXu-AB: 98,5±9,5%; pLWXu-BC: 103,0±10,0%;

pLWXu-C: 93,1±2,2%; P>0,05).

6.3.5. A nanomedicina termékcsalád in vitro eredményeinek összefoglalása

A DermaVir termékcsalád eddig elkészült termékjelöltjeinek in vitro kísérletes

jellemzési eredményeit a 7. táblázatban foglaltuk össze. A pDNS-ek szekvenciája a

tervekkel egyező volt. A szubtípus-optimalizált pDNS-ek esetében távolság-mátrix

alapú vizsgálattal ellenőriztük a szubtípus-specifikus szakaszok genetikai távolságát. A

vizsgált Gag ill. Env poliproteinek esetében a B szubtípusú pLWXu1 fehérjéitől való

szekvencia eltérés megegyezett az szubtípusok közötti divergencia általános mértékével

[3]. A pLWXu1 pDNS hatóanyagú DermaVir a kódolt fehérjéket expresszálta, valamint

VLP+-t termelt, ahogyan a szubtípus-optimalizált új termékjelöltek is. Az új

termékjelöltek biológiai aktivitása pedig összemérhető volt a referencia anyagként

használt pLWXu1-ével. A pLWXu1 esetében a biztonsági módosítások miatt a teljes

hosszúságú IN és Nef fehérjék termelődésének hiányát is igazolta munkacsoportunk.

40

60

80

100

120

pLWXu1 pLWXu-BF pLWXu-AB pLWXu-BC pLWXu-C

Rel

atív

bio

lógi

ai a

ktiv

itás

(%) *

60

7. táblázat. A nanomedicina termékcsalád kísérletes (in vitro) jellemzésének összefoglalása.

Jellemzett tulajdonság

(vizsgálati módszer)pLWXu1 (B) pLWXu-AB pLWXu-BC pLWXu-C pLWXu-BF

Azonosság meghatározás és szekvencia alapú fehérje

különbségek(Szekvenálás, távolság mtx.)

pDNS tervvel egyezőpDNS tervvel

egyezőGag: 15%

pDNS tervvel egyező

Env: 31%

pDNS tervvel egyező

Gag: 20 %Env: 31%

DNS tervvel egyező

Env: 26%

VLP+ termelés

(TEM)VLP+ kimutatható VLP+ kimutatható VLP+ kimutatható VLP+ kimutatható VLP+ kimutatható

Antigén termelés (Western Blot)

gp120 (Env-SU), p66 (RT+RNáz), p55 (Gag poliprot.), p51

(Pol-RT), gp41 (Env-TM), p24 (Gag-CA), p17 (Gag-MA)

kimutatható

A várt fehérjék kimutathatók

A várt fehérjék kimutathatók, p17

csak Gagpoliproteinalkotóként

A várt fehérjék kimutathatók

A várt fehérjék kimutathatók, p17

csak Gagpoliproteinalkotóként

Relatív biológiai aktivitás

(transzfekció, p24 ELISA)100% 99% 103% 93% 82%

Antigén termelés(Intracelluláris festés, FACS)

p24, p55, gp41, gp120, Rev, Tat

kimutathatóNem mértük Nem mértük Nem mértük Nem mértük

Biztonsági módosítások(Immunprecipitáció)

IN, Nef módosított fehérjék nem mutathatók ki

Nem mértük Nem mértük Nem mértük Nem mértük

61

7. Eredmények megvitatása

Az immunológiai szempontból szubtípus-optimalizált HIV immunterápia egy új

lehetőség a HIV fertőzöttek kezelésére úgy, hogy a kezelt beteg vírusának és az

immunválasz minőségét befolyásoló HLA típusának figyelembe vételével a neki

leginkább megfelelő termék választható ki a szubtípus-optimalizált termékcsaládból. A

termékcsalád első tagjait a DermaVir HIV Tapasz fázis II klinikai kísérleti fejlesztési

fázisban járó nanomedicina alapján terveztük és készítettük. Ehhez felhasználtuk az

eddig kifejlesztett technológiákat, hiszen az új termékjelöltekben csak az antigéneket

kódoló pDNS-ek különböznek. A termékcsalád kifejlesztésének szükségességét

támogató in silico immunológiai potenciál predikciók és kereszt-védettségi

modellezések, valamint az immunogén tervezésére kifejlesztett módszereink egészítik

ki az eddigi technológiákat. Miért, és hogyan érhetünk el eredményt ezzel a

termékcsaláddal? A klinikai DermaVir termékjelölt in vitro jellemzésének új

eredményei, a nanomedicina termékcsalád in silico és in vitro tesztelésének eddigi

adatai, valamint a HIV/AIDS elleni vakcinafejlesztés tanulságai alapján tekintsük át a

lehetséges válaszokat!

A kutatók a természetes immunológiai kontrollal rendelkező HIV fertőzöttek (“elit

kontrollerek”) tanulmányozásával próbálják megtalálni a legjobb antigént, egyelőre

sikertelenül [98,99,100]. A HIV fertőzöttek szervezetében termelődnek ugyan vírus

neutralizáló ellenanyagok, de ezeket eddig nem sikerült eredményesen felhasználni

vakcina hatóanyagként. A legújabb vizsgálatok mutatnak rá az eredménytelenség

okaira. A neutralizáló ellenanyag molekulák a HIV felszínén lévő Env glikoproteinek

trimereihez kapcsolódnak. Úgy tűnik, hogy a hatékony neutralizálás feltétele a HIV

esetében is a pl. influenza vírusnál sikeres antigén keresztkötés az ellenanyag által.

Csakhogy a HIV felszínén kevés keresztköthető fehérje trimer található, egymástól

távol. Ezért itt az ún. polireaktív ellenanyagok lehetnek hatékonyak, amik a trimeren

belüli keresztkötést teszik lehetővé, ezzel stabilizálva az ellenanyag-antigén kötést

[101]. Sajnos azonban még az ilyen polireaktív ellenanyagok is csak korlátosan

működnek [102]. A HIV diverzitás, a vírusra ható immunszelekció és a vírus többféle

védőmechanizmusa gördít leküzdhetetlennek tűnő akadályokat a megelőző vakcina

kifejlesztése elé. A terápiás vakcinafejlesztés esetében is több antigén használata, és

ezzel a minél szélesebb skálájú immunválasz kiváltása látszik célravezetőnek az egyedi

antigének használata helyett [103].

62

A HIV vakcinafejlesztés tehát a sok antigénes hatóanyagok fejlesztése irányába halad

[104]. Ennek a feladatnak a megoldásában egyre inkább előtérbe kerül a

bioinformatikai modellezés, mint a tervezés idő- és költséghatékonyságát növelő

eszköz.

Az in silico T sejt epitóp predikciót mi is felhasználtuk a doktori munka több lépéséhez:

(1) a B-szubtípusú DermaVir pDNS-e (pLWXu1) által expresszált antigének

immunológiai potenciáljának modellezéséhez; (2) a DermaVir hatékonyságának

modellezéséhez nem-B szubtípusú fertőzöttek esetében a keresztvédettség

vizsgálatával; (3) szubtípus-optimalizált DermaVir termékcsalád pDNS-einek

immunológiai alapú tervezéséhez; (4) az új termékjelöltek immunológiai potenciáljának

(kereszt-reaktivitásának) modellezéséhez szubtípus-azonos ill. eltérő szubtípusú

fertőzések esetén.

A bioinformatikai modellezési munkához először kiválasztottunk egy in silico T sejt

epitóp predikciós módszert mind a CD8+ T sejtekre specifikus MHCI-, mind pedig a

CD8+ T sejtekre specifikus epitópok prediktálására. A módszerek megbízhatóságát

kísérletesen igazolt epitópok adatbázisának segítségével határoztuk meg: a nagy ill.

közepes affinitású T sejt epitópok prediktálásának megbízhatósága 97,1%-ot

eredményezett MHCI epitópok esetén, míg 97,7%-ot MHCII epitópok predikciója

esetén, vagyis a kísérletesen igazolt epitópok 97,1%-át, ill. 97,7%-át teljes- ill. korrekt

egyezéssel (1 as eltérést megengedve) tudtuk prediktálni (2.táblázat). Ezzel az eljárással

modelleztük azután a pLWXu1 pDNS-ben kódolt antigén készlet, vagyis a

nanomedicina várható immunológiai hatását. Több, mint 100 eltérő HLA allélre

prediktáltuk a nagy-, és közepes affinitású T sejt epitópokat. Eredményeink alapján a

nanomedicina jelölt által expresszált 15 fehérjéből álló antigén repertoárja széles

spektrumú CD4+ és CD8+ specifikus immunválasz kiváltására képes. Ez az

irodalomban eddig közölt HIV vakcinajelöltek közül a legszélesebb HIV epitóp

repertoárt jelenti [105,106].

Az abszolút immunológiai potenciál (AIP) és relatív immunológiai potenciál (RIP)

analízisünk megerősítette mind a struktúrfehérjék, mind pedig a szabályozó fehérjék

kódolásának fontosságát a T sejtes immunválaszt célzó nanomedicina pDNS-ében. A

pLWXu1 pDNS által kódolt fehérje repertoár AIP értéke mennyiségileg prediktálja a

hatóanyag által indukálható CD4+ és CD8+ specifikus immunválaszt. Ez alapján

minden HIV fehérje szerepet játszik a CD4+ ill. CD8+ T sejtek különböző mértékű

63

aktiválásában, de csak az Env-SU, Pol-RT, Gag-CA Vif és Rev fehérjék aktiválják

hatékonyan mindkettőt. A Tat és Gag-NC a CD4+ T sejt válasz kiváltására nagyon

magas, míg a CD8+ T sejtes válasz kiváltására szerény potenciált mutatott. Klinikai

kutatások eredményei is megerősítették, hogy a széles HIV epitóp repertoár felismerése

fordítottan korrelál a vírus terheltséggel, noha a szerepet játszó fehérjék immunválasz

szempontú sorrendje természetesen függ az egyén HLA hátterétől és érdekes módon a

betegség stádiumától is [107,108]. A széles epitóp repertoárnak köszönhetően a T sejtek

képesek felismerni és elpusztítani a HIV-vel fertőzött sejteket (a látensen fertőzöttek

kivételével), de lehet, hogy a korai fehérjékre specifikus T sejtek (pl. Vif és Rev)

szerepe is meghatározó a HIV replikáció visszaszorításában.

A RIP mérőszámmal a fehérjén belüli nagy epitópok relatív sűrűségét adhatjuk meg, a

fehérje elméleti (9, ill. 15 as hosszú) epitóp mennyiséghez képest. (Az elméleti epitóp

mennyiség a protein hossz mínusz 8 az MHCI RIP predikció esetén, ill. protein hossz

mínusz 14 az MHCII RIP esetén.) A RIP hasonlít egy már korábban bevezetett

mérőszámhoz: a SIR (“size of immune repertoire”, immunológiai repertoár mérete) a

fehérjében prediktált epitóp mennyiséget hasonlítja egy ugyanolyan mennyiségű

elméleti nonamert tartalmazó, és hasonló aminosav eloszlású fehérjében várt epitóp

mennyiséghez [109]. RIP analízisünk alapján a Gag és Env proteinek méltán

szerepelnek sok fejlesztés alatt álló HIV vakcina antigénjeként, hiszen magas MHCI-,

és MHCII RIP értékkel rendelkeznek. Szintén magas MHCI-RIP-et kaptunk a Rev és

Vpu fehérjék esetében, és a Tat fehérje MHCII-RIP értéke is kiemelkedő volt, jelezvén

a korai szabályozó fehérjék magas immunológiai potenciálját, ill. támogatva ezek HIV

vakcina antigénként való felhasználását.

Immunogén-tervezési koncepciónk némiképp hasonlít a mozaik vakcinatervezési

módszerhez, melynek lényege, hogy az antigént mesterségesen dúsítják fel epitóp-

gazdag szakaszokkal, in silico evolúciót modellezve [110]. A felhasznált valódi

kórokozó szekvenciák egy csoportját in silico “rekombináltatják”, majd minden ciklus

után meghatározott paraméterek figyelembevételével kiválogatják a legtöbb epitópot

tartalmazó (átfedő epitópokat is tartalmazó) szekvenciákat, és az eredeti szekvencia

csoport epitóp-szegény szekvenciáit ezekre cserélik. Bizonyos számú ciklus után

végeredményül egy, a valóságban nem létező mozaik szekvenciát kapnak, amit aztán

vakcina antigénként tesztelnek.

64

A DermaVir nanomedicinában az epitóp repertoár kiterjesztésének a sok fehérje

kódolásán kívül egy másik módja is van: az egyszerű antigén expresszión kívül

komplex vírus-szerű részecskék (VLP+) is termelődnek. A DermaVir kísérletes

jellemzése során igazoltuk, hogy a pDNS-ben kódolt közel teljes proteomból komplex

VLP+ részecskék is képződnek. Tehát természetes konformációban expresszálja a HIV

antigéneket, ami a természetes HIV fertőzéssel egyező antigén feldolgozást és

immunválasz kiváltását eredményezheti. Megjegyzendő, hogy a gyógyszerjelölt ezen

potenciálját akár megelőző vakcina kifejlesztéséhez is fel lehetne használni, hiszen a

natív térszerkezetű felszíni fehérjék nagy hatékonyságú, polireaktív neutralizáló

ellenanyagok termelését is kiválthatnák [101]. Másrészt a VLP+ termelés a CD4+ helper

T sejtek indukcióját is elősegíti, ami pedig a CD8+ T sejtek érését (priming-ot),

valamint a hatékony immunválaszban kulcsszerepű memóriasejtek termelődését

támogatja [45,46,47].

Kísérletesen kimutattuk a DermaVir által expresszált antigén készlet termelődését,

valamint igazoltuk, hogy ezek a HIV fehérjék a vad típusú HIV-hez hasonló struktúrájú

komplex VLP+ részecskékké állnak össze. A vírus érési fázisainak megfelelő

struktúrájú VLP+-k kimutathatók, azonban ezek biztonságosak, és nem fertőzőképesek

(utóbbi eredmény nem része a dolgozatnak [92]). A VLP+ intracelluláris-, és

extracelluláris térbe egyaránt ürül, akárcsak a vad HIV virionja [111].

A DermaVir pDNS-éről termelődő antigének (fehérjék és VLP+) az antigénbemutató

sejt általi feldolgozását követően kerülhetnek MHCI és MHCII molekulákra. A 20.

ábrán foglaltuk össze a nanomedicina pDNS immunogénjének lehetséges antigén

expressziós és antigén prezentációs útvonalait [92]. A pLWXu1 pDNS-ről

expresszálódó antigén készlet mindkét antigén feldolgozási útvonalon képes

immunválaszt kiváltani: az endogén antigén-bemutatási út a pDNS-ről az

antigénbemutató sejtben termelődő fehérjék feldolgozásával történik (20. ábra, “a”

útvonal). Az expresszált fehérjékből spontán összeszerelődő VLP+ részecskék sejten

belüli vezikulumokba és a sejten kívüli térbe is juthatnak. Mindkét esetben az exogén

antigének feldolgozási útvonalán halad a folyamat, ami a VLP+-ből származó MHCII

epitópok bemutatásával HIV-specifikus CD4+ helper T sejtes immunválasz kiváltását

eredményezi (20. ábra “b” és “c”).

65

20. ábra. HIV-specifikus T sejtes immunválasz kiváltásának lehetséges útvonalai a DermaVir

pDNS hatóanyagáról termelődő antigénekkel. A nanomedicinát felvevő antigénbemutató

sejtben a pDNS-ről HIV fehérjék termelődnek: a) az intracelluláris fehérjék feldolgozásának

útvonalán halad tovább a folyamat, ami MHC I molekulákon való epitópok bemutatását, ezzel

HIV-specifikus CD8+ T sejtek indukcióját eredményezi. b) Az expresszált fehérjékből VLP+

részecskék képződnek, melyek sejten belüli vezikulumokba szekretálódnak, és az antigén

feldolgozás során képződő epitópok MHC II molekulákon bemutatva HIV-specifikus CD4+ T

sejtek képződését indukálják. c) VLP+ részecskék a sejten kívüli térbe is szekretálódhatnak,

amik kis eséllyel egy újabb antigénbemutató sejtben az antigén bemutatás CD4+ T sejt választ

eredményező útján haladhatnak. Mivel a VLP+ nem képes replikálódni, a folyamat az antigén

feldolgozással véget ér.

Az összetett VLP-t expresszáló HIV vakcina ötlete egyébként nem egyedülálló, bár a

szintén klinikai tesztelés alatt álló másik immunogén DNS csak a HIV fehérjék kb.

50%-át expresszálja, és az éretlen vírushoz hasonló morfológiájú VLP-t, valamint

fehérje aggregátumokat termel [106,112].

A vakcina hatékonyságnak van még egy fontos paramétere a sokféle antigénen kívül: a

DermaVir-ből származó epitópoknak a kezelt beteg HIV epitópjaival való egyezés

mértéke, vagyis a kereszt-reaktivitás. Hiába generál ugyanis a DermaVir számos HIV

epitópra specifikus CD4+ és CD8+ T sejteket, ha azok nem egyeznek a fertőzött

személy vírusának epitópjaival. Mert nyilvánvalóan csak azok a T sejtek tudják

elpusztítani a HIV-vel fertőzött sejteket, amik felismerik őket. Hogy képet kapjunk az

epitóp egyezések mértékéről, in silico modelleztük a B-szubtípusú HIV fehérjéket

pDNS

12

3

(…)

CD8+ T sejt válasz

Nem reprodukálódik:•Reverz transzkripció gátolt•Replikáció gátolt•Integráció gátolt

a

c

CD4+ T sejt válasz

b

MHCIMHCII

MHCII

T

66

kódoló DermaVir epitópjainak kereszt-reakcióját egy szubtípus-azonos, egy C

szubtípusú, és egy A szubtípusú izolátum esetén. A szubtípus-azonos izolátum esetén a

CD8+ T sejt specifikus epitópok 58%-a és a CD4+ T sejt specifikus epitópok 47%-a

egyezett meg teljesen a DermaVir epitópjaival. (Ez persze a legszigorúbb egyezés

mellett adódó érték, a kereszt-reaktivitás megenged néhány aminosav eltérést, ezért a

valódi keresztvédettséget valamivel erősebbnek várhatjuk.) Ehhez képest viszont a C-,

ill. A szubtípusú fertőzés esetén csak az MHCI epitópok 26%-a ill. 24%-a, míg az

MHCII epitópok 15%-a ill. 14%-a egyezett a DermaVir epitópjaival. A kereszt-

reaktivitást megvizsgáltuk a többi szubtípusra is, valamint az egyes szubtípusok több

izolátumára (az adatokat nem mutatjuk), és hasonló eredményt kaptunk: a nem-B

szubtípusba tartozó izolátumokkal kevesebb keresztvédettséget biztosító egyező epitóp

mutatható ki, mint a szubtípus-azonos izolátumokkal. Ezért indokoltnak láttuk a

szubtípus-optimalizált termékcsalád kifejlesztését, hogy egyszer majd minden beteg

optimális immunválaszt kiváltó DermaVir-t kaphasson.

Az immunválasz szempontú termék optimalizáláshoz egy, a filogenetikai rokonsági

viszonyokat tükröző fával analóg eszközt fejlesztettünk ki: az immunológiai fát, ami a

hasonló epitóp-összetételű szekvenciákat jeleníti meg közös ágon. Információtartalma

minőségileg tér el a filogenetikai fáétól, mert az immunválasz szempontjából legjobban

hasonlító szekvenciákat helyezi egymáshoz legközelebb, ami nem feltétlenül egyezik a

szekvencia alapú távolsággal. Gondoljunk csak az MHCI epitópok képződésének

korábban említett statisztikájára: az antigén feldolgozás során csak minden 7. peptid tud

a TAP molekulán bejutni az endoplazmatikus retikulumba, ahol az MHCI molekulák

csak minden 200. epitópot kötnek meg [43,44]. Két szekvencia közti különbségek tehát

nem jelennek meg az immunológiai fán, ha olyan szakaszon vannak, amikre nem

prediktálható epitóp. Ugyanakkor többszörös súllyal számíthat akár egyetlen bázispár

eltérés, amennyiben az érintett szakaszra több, átfedő epitóp prediktálható.

Az immunológiai fa csoportjai alapján kiválasztottunk négy szubtípust, ill. rekombináns

formát, majd ezekre optimalizált pDNS konstrukciókat terveztünk. Tulajdonképpen

nem is szubtípust/rekombinánst választottunk, hanem “immunológiai

szubtípust/rekombinánst”, de megfelelő elnevezés híján egyelőre a szekvencia-alapú

csoportosítás nevezéktanát használjuk, némi képzavart kockáztatva ezzel. A pDNS-eket

elkészítettük, és az új nanomedicina termékjelölteket in silico és in vitro teszteknek

vetettük alá. Az in silico keresztvédettségi vizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy

67

az új termékjelöltek a szubtípusuknak/rekombináns csoportjuknak megfelelő

izolátumok esetében eredményezték a legjobb keresztvédettséget, kivéve egy esetet.

Ebben az immunológiai távolságok eltértek a szubtípus-alapú csoportosítástól, mert a

CRF-BC rekombinánssal való fertőzés modelljében nem a pLWXu-BC termékjelölttel

adódott a legnagyobb keresztvédettség, hanem MHCI esetén a pLWXu-BF

termékjelölttel, MHCII esetén pedig a B szubtípus-specifikus pLWXu1-gyel. Ez a példa

is megerősíti az immunológiai alapú szekvencia csoportosítás létjogosultságát.

A kereszt-reaktivitás vizsgálatát akár személyre szabottan is megtehetjük

módszerünkkel: a páciens HIV szekvenciája és HLA genotípusa ismeretében a

termékjelöltek közül kiválasztható az adott páciensnél legmagasabb keresztvédettséget

biztosító nanomedicina. Ugyanígy prediktálhatjuk egy klinikai kísérletben résztvevő

páciensek HLA genotípusa és vírus szekvenciája ismeretében a várható T sejtes

immunválaszt, segítséget nyújtva az immunogenitási eredmények kiértékeléséhez, ill.

értelmezéséhez.

Az immunológiailag optimalizált szubtípus-specifikus termék-skála tovább bővíthető,

elméletben akár a személyre szabott konstrukciókig. Valószínű azonban, hogy az új

termékcsalád hatékonyságát vizsgáló majdani klinikai mérések alapján nagyobb

immunológiai csoportokat lehet megállapítani, és elég lesz ezekre a csoportokra egy-

egy termékjelöltet készíteni.

A HIV diverzitása miatti kereszt-reaktivitás más vakcinajelöltek esetén is elvárt

tulajdonság, amit többféle megközelítéssel terveznek elérni a fejlesztők, például több

szubtípusra specifikus konszenzus antigének alkalmazásával [113]. A mozaik vakcinák

fejlesztésekor pedig konzervatív, ezáltal kereszt-reaktív epitópok kiválasztására

törekszenek. Tegyük fel, hogy több mozaik fehérjét egyszerre használunk

immunizálásra, pl. a Barouch és munkatársai által in vivo állatmodellben sikeresen

tesztelt Gag, Pol és Env mozaik antigéneket [114]. Egy B szubtípusú fertőzési

modellben (szekvencia génbanki azonosítója DQ487189, a beteg meghatározott HLA

allélje, amit mi is vizsgáltunk: A*0201) 114 MHCI epitóp volt prediktálható a teljes

HIV proteomra. Ha az előbbi mozaik antigéneket használnánk terápiás vakcinaként,

mindössze 5 azonos (kereszt-reaktív) epitóp (4%) adódna. Ehhez képest a DermaVir

(B) esetében 47 egyező epitóp (41%) indukálhatná a beteg HIV vírusát felismerő CD8+

T sejtek termelődését. Egy másik példában valamivel jobb arányt találtunk (szekvencia

génbanki azonosítója DQ487189, a beteg HLA allélje: B*35:01): a beteg 84 epitópjából

68

25-öt fedett le a mozaik antigén készlet (30%), míg 40-et a DermaVir antigén készlete

(48%). Ehhez képest egy C szubtípusú fertőzési modellben (szekvencia génbanki

azonosítója AY463231, a beteg HLA allélje: A*68:02) a beteg 95 epitópjával a mozaik

antigének kereszt-reaktivitása 26% volt (25 egyező epitóp), míg a DermaVir antigén

készletével 37% (35 egyező epitóp). Ha a még jobb összehasonlíthatóság érdekében pl.

csak a Gag antigént vizsgáljuk mindkét vakcinából, akkor a B szubtípusú fertőzési

modellekben a vírus Gag fehérjéjére prediktált 15 epitópból csak egy egyezik meg a

mozaik Gag epitópjaival, és 8 a DermaVir-ével, valamint a 16 vírus epitópból 6 a

mozaik Gag epitópjaival és 10 a DermaVir-ével. A C szubtípusú vírus 12 Gag epitópja

közül egyaránt 7-7 egyező epitópot eredményezett a mozaik-Gag és a DermaVir-Gag.

Ez persze messze nem reprezentatív vizsgálat, de ezekben a véletlenszerűen kiválasztott

példákban nem látszott hatékonyabbnak a szubtípustól függetlenül kereszt-reaktívnak

tervezett mozaik antigén, mint a B szubtípusra specifikus DermaVir. A fertőzés

vírusával azonos szubtípusú DermaVir viszont jobbnak adódott, mint a kereszt-reaktív

mozaik antigének, megerősítve a szubtípus-optimalizált termékcsaládtól várt

optimálisabb hatékonyságot.

Az elkészített új nanomedicina termékjelöltek in vitro jellemzését is elvégeztük, és

minőségüket a klinikai DermaVir-éhez hasonlítottuk. Azt találtuk, hogy a

termékjelöltek képesek a kódolt antigén repertoár expressziójára, valamint komplex

VLP+ részecskék expressziójára is, és biológiai aktivitásuk hasonlóan erős, mint a

referencia anyagként használt klinikai tesztelés alatt álló DermaVir-é. Az új

termékjelöltek biztonsági módosításait a szülői pDNS-ként használt pLWXu1-ből

vettük át változtatás nélkül, ezért az új nanomedicina jelölteknél ezen változtatások

eredményét már nem kellett ellenőrizni.

A szubtípus-optimalizált HIV terápiás nanomedicina termékcsalád első tagjai a pDNS

hatóanyagok megfelelő mennyiségben és minőségben történő előállítása után

lényegében készen állnak a klinikai tesztelésre. A termékcsalád hatékonyságára

vonatkozó legfontosabb eredményeket a klinikai mérések szolgáltatják majd.

69

8. Összefoglalás

Kísérletesen és in silico módszerekkel jellemeztük a jelenleg klinikai kísérleti fázisban

lévő HIV-1 B-szubtípus specifikus DermaVir terápiás nanomedicina termékjelölt pDNS

alapú immunogénjét. Továbbá új HIV-1 szubtípus-optimalizált immunterápiás

nanomedicina termékjelölteket terveztünk a vírus diverzitás és a betegek HLA

hátterének figyelembe vételével. A termékjelölteket elkészítettünk és teszteltünk.

Munkánk során bioinformatikai-, molekuláris- és sejtbiológiai módszereket

használtunk, ill. fejlesztettünk.

Kimutattuk, hogy a DermaVir képes a kódolt HIV antigének (tizenhárom teljes és két

részleges antigén) expressziójára humán sejtekben, valamint igazoltuk, hogy ezek az

antigének a vad típusú HIV-vel immunológiai szempontból megegyező komplex vírus-

szerű részecskékké (VLP+) állnak össze. A DermaVir immunogénje emellett

biztonságos, mert nem képes integrálódni, replikálódni, ill. fertőző virionokat termelni.

Az antigén expresszió és a VLP+ termelés kimutatására vizsgálati módszereket

fejlesztettünk. Az európai és amerikai gyógyszerengedélyezési hatóságok

követelményeinek megfelelő validált biológiai aktivitást mérő módszert fejlesztettünk a

termékjelölt antigén termelési potenciáljának mérésére. Eredményeink segítettek

felvázolni a DermaVir hatásmechanizmusának részleteit a DermaVir-ből származó

antigének MHCI és MHCII molekulákon történő antigénbemutatási folyamatában.

A B szubtípusra specifikus DermaVir in silico vizsgálati eredményei, ill. a klinikai

mérési eredmények alapján indokoltnak láttuk szubtípus-optimalizált terápiás vakcina

termékjelöltek kifejlesztését. Prediktáltuk a DermaVir-B T sejt specifikus immunológiai

potenciálját, és modelleztük a keresztvédő képességét nem-B szubtípusú fertőzések

esetén. Azt találtuk, hogy a szubtípusok között csak mérsékelt keresztvédettség

prediktálható a T sejtes immunválaszban, ami a nanomedicina terápiás

hatékonyságának csökkenését vonhatja maga után bizonyos betegpopulációkban. Ezen

eredmények alapján kifejlesztettünk egy in silico immunogén tervezési eszközt. Az

“immunológiai fa” a hasonló epitóp összetételű vírus szekvenciák csoportjaiból épül

fel, amik minőségileg hasonló immunválaszt képesek kiváltani az adott kórokozó(k)

ellen. Ezt az immunológiai szempontú szekvencia csoportosítást használtuk fel négy új

pDNS alapú immunogén tervezésére, amik elsősorban a szubtípus-C, CRF-BC

(rekombináns forma), CRF-BF és CRF-AB-vel fertőzött betegek kezelésére nyújthatnak

70

immunológiailag optimalizált megoldást. Ezután elkészítettük a pDNS konstrukciókat

és belőlük a nanomedicina termékjelölteket, majd a szubtípus-B DermaVir vizsgálatára

kifejlesztett módszereinkkel jellemeztük azokat. Minden nanomedicina termékjelölt

antigén termelő képességét (fehérje repertoár, VLP+, biológiai aktivitás) igazoltuk, és a

termékjelöltek minőségét a klinikai vizsgálati DermaVir-hez hasonlónak találtuk.

Emellett in silico modelleztük az új termékjelöltek immunológiai potenciálját és

keresztvédő képességét, ami a megegyező szubtípusú/CRF-ű fertőzések esetében volt a

legjobb. Az új immunológiai fa használatát javasoljuk a legjobb kersztvédő képességű

termékjelölt ill. (személyre szabott) immunterápia kiválasztására is minden beteg

számára.

71

9. Summary

We characterized both in vitro and in silico, the HIV-1 subtype-B specific immunogen

(pDNA) of DermaVir therapeutic nanomedicine presently tested in Phase II clinical

trials in HIV-infected individuals. We have further designed and characterized a HIV-1

subtype-optimized nanomedicine product portfolio taking in consideration of the

genetic sequence variability of the patient’s HLA and HIV. During this work we

employed and developed both bioinformatics, molecular- and cell-biological methods.

We confirmed that DermaVir express fifteen HIV antigens in human cells that assemble

to a complex VLP (VLP+), immunological authentic to the wild-type HIV. However, it

is safe because it cannot integrate or reverse-transcribe new infectious virions. To

characterize the antigen expression and VLP+ release we have developed analytical

methods. To meet the FDA and EMA requirements we have developed a validated

potency assay for DermaVir vaccine that characterized the biological activity of the

product candidate. Our results provided explanation to the mechanism of action for

DermaVir-derived antigen presentation on the MHCI and MHCII molecules.

During the in silico and clinical analysis of DermaVir (subtype-B) we found the

rationale for the development of subtype-optimized vaccine product candidates. We

predicted its T cell specific immunological potential and modeled its cross-protection

capacity in non-B subtype specific infections. We found only modest cross-protection

of DermaVir with other subtype-specific infections of individual patients. This suggests

a decreased immunogenicity of subtype-B specific DermaVir vaccine in non-B subtype

of infections. Based on these results we developed an in silico tool for the rational

design of immunogens. The “immunological tree” clusters sequences containing similar

epitopes that determine the quality of immune responses against the certain antigen(s).

This immunological aspect of sequence grouping were used for the design of four new

pDNA immunogens targeting epidemics caused by subtype-C, CRF-BC (circulating

recombinant form), CRF-BF and CRF-AB. We have cloned these pDNA constructs,

prepared the nanomedicine product and characterized with our molecular- and cell-

biological methods developed for DermaVir subtype B vaccine. Expression of the

antigen repertoire and VLP+ were confirmed for all nanomedicines and quality of the

new product candidates was similar as for the clinically tested DermaVir. Additionally,

we modeled in silico the immunological potency and cross-protection capacity of the

new DermaVir products and showed the highest cross-reactivity with the matching

subtypes. We suggest the application of the novel “immunological tree” as a selection

tool for the best matching product and personalized immunotherapy for each patient.

72

10. Publikációk

Az értekezés alapját képező közlemények

Somogyi E, Xu J, Gudics Á, Tóth J, Kovács AL, Lori F, Lisziewicz J. A plasmid DNA

immunogen expressing fifteen protein antigens and complex virus-like particles (VLP+)

mimicking naturally occurring HIV. Vaccine 2011;29(4):744–753. (IF: 3,572)

Tőke ER, Lőrincz O, Somogyi E, Lisziewicz J. Rational development of a stable liquid

formulation for nanomedicine products. International Journal of Pharmaceutics

2010;392(1-2):261-7. (IF: 3,607)

Referált folyóiratban megjelent konferencia összefoglaló:

Somogyi E, Gudics Á, Forni DD, Molnár L, Lori F, Lisziewicz J. Subtype-optimized

DermaVir for personalized immunotherapy. Abstracts from AIDS Vaccine 2010. AIDS

Research and human retroviruses 2010, 26(10): A-1-A-184. (IF: 2,082)

A témában megjelent egyéb közlemények

Lőrincz O, Tőke ER, Somogyi E, Horkay F, Chandran P, Douglas JF, Szebeni J,

Lisziewicz J. Structure and biological activity of pathogen-like synthetic

nanomedicines. Nanomedicine: NMB 2011. Nyomtatás alatt. (IF: 4,882)

Szabadalom:

Csörgő SBZ, Garaczi E, Gruber L, Hamar P, Kemény L, Kökény G, Lisziewicz J,

Lőrincz O, Molnár M, Mózes M, Ötvös L, Pandur J, Pintér I, Somogyi E, Szabó KÁ,

Szollár L, Tőke ER. Immunogenic nanomedicine composition and preparation and uses

thereof. Pub. No.: WO/2010/125544, International Application No.:

PCT/IB2010/051909, Publication Date: 04.11.2010, International Filing Date:

30.04.2010

73

11. Köszönetnyilvánítás

Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Lisziewicz Juliannának, a Genetic Immunity Kft.

vezérigazgatójának, hogy doktori munkám az ő irányítása alatt végezhettem. A

szaktudáson kívül céltudatosságot, kitartást és problémamegoldó gondolkodást tanultam

tőle.

Hálás vagyok kollégáimnak a közös-, és előremutató munkáért. Köszönöm a

bioinformatikus csoportnak: Molnár Leventének és Tóth Józsefnek a “rám szabott”

szoftvereket, amik nélkül sok in silico eredményem csak hipotézis lehetne. A vegyész

laborral mindig öröm volt a sok munka is, hálás vagyok nekik: Dr. Tőke Enikő, Lőrincz

Orsolya, Lakatos Mónika. Köszönöm Szűcsné Pulinka Ildikónak és Földiné Horváth

Erika technikusoknak a precíz és lelkiismeretes munkát, Gudics Ágnesnek a

felejthetetlen MBT éveket, és a csapatmunkát. Hálával tartozom Dr. Davide de

Forninak a klónozási feladatokban való részvételéért és szakmai segítségért, valamint

Dr. Franco Lorinak a mindig hasznos szakmai kritikáiért. Köszönöm Dr. Kovács Attila

Lajosnak az értékes elektronmikroszkópos felvételeket, Dr. Lisziewicz Zsoltnak pedig a

jó hangulatú brainstorming-eket.

A doktori munka elvégzéséhez az NKTH HIKC05 és DVCLIN01 pályázatok, valamint

a Research Institute for Genetic and Human Therapy (RIGHT) nyújtott anyagi

támogatást.

Hálával gondolok családom minden tagjára, mert szerető támogatásuk nélkül most nem

kerülhetne pont a disszertációm végére.

74

12. Irodalomjegyzék

[1]UNAIDS World AIDS Day Report 2011, www.unaids.org

[2]Webster TJ. Nanomedicine: what’s in a definition? International Journal of Nanomedicine 2006;1(2) 115–116.

[3]Hemelaar J, Gouws E, Ghys PD, Osmanov S. Global and regional distribution of HIV-1 genetic subtypes and recombinants in 2004. AIDS. 2006 Oct 24;20(16):W13-23.

[4]World Health Organization. Antiretroviral therapy of HIV infection in infants and children. Recommendations for a public health approach. 2006, Geneva.

[5]Pantaleo G, Demarest JF, Schacker T, Vaccarezza M, Cohen OJ, Daucher M, Graziosi C, Schnittman SS, Quinn TC, Shaw GM, Perrin L, Tambussi G, Lazzarin A, Sekaly RP, Soudeyns H, Corey L, Fauci AS. The qualitative nature of the primary immune response to HIV infection is a prognosticator of disease progression independent of the initial level of plasma viremia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997;94(1):254-8.

[6]Wyand MS, Manson K, Montefiori DC, Lifson JD, Johnson RP, Desrosiers RC. Protection by live, attenuated simian immunodeficiency virus against heterologous challenge. Journal of Virology 1999;73(10):8356-63.

[7]Gundlach BR, Lewis MG, Sopper S, Schnell T, Sodroski J, Stahl-Hennig C, Uberla K. Evidence for recombination of live, attenuated immunodeficiency virus vaccine with challenge virus to a more virulent strain. Journal of Virology 2000;74(8):3537-42.

[8]Paovonen J, Naud P, Salmeron J, Wheeler CM, Chow SN, Apter D, Kitchener H, Teixeira JC, Skinner SR, Jaisamrarn U, Limson G, Romanowski B, Aoki FY, Schwarz TF, Poppe WA, Bosch FX, Harper DM, Huh W, Hardt K, Zahaf T, Descamps D, Struyf F, Dubin G, Lehtinen M; HPV PATRICIA Study Group. Efficacy of human papillomavirus (HPV)-16/18 AS04-adjuvanted vaccine against cervical infection and precancer caused by oncogenic HPV types (PATRICIA): final analysis of a double-blind, randomised study in young women. Lancet 2009;374(9686):301-14.

[9]Villa LL, Perez G, Kjaer SK, Paavonen J, Lehtinen M, Munoz N, et al. Quadrivalent vaccine against human papillomavirus to prevent high-grade cervical lesions. New England Journal of Medicine 2007;356(19):1915-27.

[10]Hildesheim A, Herrero R, Wacholder S, Rodriguez AC, Solomon D, Bratti MC, Schiller JT, Gonzalez P, Dubin G, Porras C, Jimenez SE, Lowy DR; Costa Rican HPV Vaccine Trial Group. Effect of human papillomavirus 16/18 L1 viruslike particle vaccine among young women with preexisting infection - A randomized trial. Jama-Journal of the American Medical Association 2007;298(7):743-53.

[11]Broliden K, Hinkula J, Devito C, Kiama P, Kimani J, Trabbatoni D, Bwayo JJ, Clerici M, Plummer F, Kaul R.Functional HIV-1 specific IgA antibodies in HIV-1 exposed, persistently IgG seronegative female sex workers. Immunology Letters 2001;79(1-2):29-36.

75

[12]Rowland-Jones S, Sutton J, Ariyoshi K, Dong T, Gotch F, McAdam S, et al. HIV-specific cytoptoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nature Medicine 1995;1(1):59-64.

[13]Rosenberg ES, LaRosa L, Flynn T, Robbins G, Walker BD. Characterization of HIV-1-specific T-helper cells in acute and chronic infection. Immunology Letters 1999;66(1-3):89-93.

[14]Lisziewicz J, Rosenberg E, Lieberman J, Jessen H, Lopalco L, Siliciano R, Walker B, Lori F. Control of HIV despite the discontinuation of antiretroviral therapy. New England Journal of Medicine 1999;340(21):1683-4.

[15]Johnson RP, Glickman RL, Yang JQ, Kaur A, Dion JT, Mulligan MJ, Desrosiers RC. Induction of vigorous cytotoxic T-lymphocyte responses by live attenuated simian immunodeficiency virus. Journal of Virology 1997;71(10):7711-8.

[16]Busch M, Abel K, Li J, Piatak M, Lifson JD, Miller CJ. Efficacy of a SHIV 89.6 proviral DNA vaccine against mucosal SIVmac239 challenge. Vaccine 2005;23(31):4036-47.

[17]McElrath MJ, De Rosa SC, Moodie Z, Dubey S, Kierstead L, Janes H, Defawe OD, Carter DK, Hural J, Akondy R, Buchbinder SP, Robertson MN, Mehrotra DV, Self SG, Corey L, Shiver JW, Casimiro DR; Step Study Protocol Team. HIV-1 vaccine-induced immunity in the test-of-concept Step Study: a case-cohort analysis. Lancet 2008;372(9653):1894-905.

[18]Weboldal: http://idshowcase.lshtm.ac.uk/

[19]Gelderblom HR, Ozel M, Pauli G. Morphogenesis and morphology of HIV. Structure-function relations. Arch Virol 1989;106:1-13.

[20]Sagar M. J Infect Dis. 2010 Oct 15;202 Suppl 2:S289-96.

[21]Fanales-Belasio E, Raimondo M, Suligoi B, Buttò S. Ann Ist Super Sanita. 2010;46(1):5-14.

[22]Bera S, Pandey KK, Vora AC, Grandgenett DP. Molecular interactions between HIV-1 integrase and the two viral DNA ends within the synaptic complex that mediates concerted integration. Journal of Molecular Biology 2009;389(1):183–98.

[23]McDougal JS, Mawle A, Cort SP, Nicholson JK, Cross GD, Scheppler-Campbell JA, Hicks D, Sligh J. Cellular tropism of the human retrovirus HTLV-III/LAV. I. Role of T cell activation and expression of the T4 antigen. J Immunol. 1985 Nov;135(5):3151-62.

[24]Siliciano RF, Greene WC. HIV Latency. Cold Spring Harb Perspect Med. 2011 Sep;1(1):a007096.

[25]Karn, J. Tackling Tat. J. Mol. Biol. 1999;293, 235-254.

[26]Feinberg MB, Baltimore D, Frankel AD.The role of Tat in the human immunodeficiency virus life cycle indicates a primary effect on transcriptional elongation. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88: 4045-4049.

[27]Hope TJ. The ins and outs of HIV Rev. Arch Biochem Biophys. 1999;15;365(2):186-91.

[28]Ganser-Pornillos BK, Yeager M, Sundquist WI. The structural biology of HIV assembly. Curr Opin Struct Biol. 2008 Apr;18(2):203-17.

[29]Weboldal: http://www.uptodate.com/contents/immunology-of-hiv-1-infection

76

[30]Moore JP. Coreceptors: implications for HIV pathogenesis and therapy. Science. 1997;276(5309):51.

[31]Grouard G, Clark EA. Role of dendritic and follicular dendritic cells in HIV infection and pathogenesis. Curr Opin Immunol. 1997;9(4):563.

[32]Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Middel J, Cornelissen IL, Nottet HS, KewalRamani VN, Littman DR, Figdor CG, van Kooyk Y.DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 2000 Mar 3;100(5):587-97.

[33]Kahn JO, Walker BD. Acute human immunodeficiency virus type 1 infection. N Engl J Med. 1998;339(1):33.

[34]Pantaleo G, Fauci AS.Immunopathogenesis of HIV infection. Annu Rev Microbiol. 1996;50:825-54.

[35]Brenchley JM, Price DA, Schacker TW, Asher TE, Silvestri G, Rao S, Kazzaz Z, Bornstein E, Lambotte O, Altmann D, Blazar BR, Rodriguez B, Teixeira-Johnson L, Landay A, Martin JN, Hecht FM, Picker LJ, Lederman MM, Deeks SG, Douek DC. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 2006;12(12):1365.

[36]Hunt PW. Th17, gut, and HIV: therapeutic implications. Curr Opin HIV AIDS. 2010;5(2):189.

[37]Cooper MA, Fehniger TA, Fuchs A, Colonna M, Caligiuri MA. NK cell and DC interactions. Trends Immunol. 2004 Jan;25(1):47-52.

[38]Villadangos JA, Schnorrer P. Intrinsic and cooperative antigen-presenting functions of dendritic-cell subsets in vivo. Nat Rev Immunol. 2007 Jul;7(7):543-55.

[39]Bachmann MF, Lutz MB, Layton GT, Harris SJ, Fehr T, Rescigno M, Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cells process exogenous viral proteins and virus-like particles for class I presentation to CD8+ cytotoxic T lymphocytes. Eur J Immunol. 1996;26(11):2595.

[40]Sabado RL, Babcock E, Kavanagh DG, Tjomsland V, Walker BD, Lifson JD, Bhardwaj N, Larsson M. Pathways utilized by dendritic cells for binding, uptake, processing and presentation of antigens derived from HIV-1. Eur J Immunol. 2007 Jul;37(7):1752-63.

[41]Schwartz O, Marechal V, LeGall S, Lemonnier F, Heard JM. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. Nature Medicine 1996;2(3):338–42.

[42]Stumptner-Cuvelette P, Morchoisne S, Dugast M, Le Gall S, Raposo G, Schwartz O, Benaroch P. HIV-1 Nef impairs MHCclass II antigen presentation and surface expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001;98(21):12144–9.

[43]Uebel S, Kraas W, Kienle S, Wiesmuller KH, Jung G, Tampe R. Recognition principle of the TAP transporter disclosed by combinatorial peptide libraries. Proc Natl Acad Sci U S A 1997 94:8976–81.

[44]Yewdell JW, Bennink JR. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annu Rev Immunol. 1999;17:51–88.

77

[45]Janssen EM, Lemmens EE, Wolfe T, Christen U, von Herrath MG, Schoenberger SP. CD4(+) T cells are required for secondary expansion and memory in CD8(+) T lymphocytes. Nature 2003;421(6925):852-6.

[46]Letvin NL, Walker BD. Immunopathogenesis and immunotherapy in AIDS virus infections. Nat Med. 2003 Jul;9(7):861-6.

[47]Wherry EJ, Ahmed R. Memory CD8 T-cell differentiation during viral infection. J Virol. 2004 Jun;78(11):5535-45.

[48]Poignard P, Sabbe R, Picchio GR, Wang M, Gulizia RJ, Katinger H, Parren PW, Mosier DE, Burton DR. Neutralizing antibodies have limited effects on the control of established HIV-1 infection in vivo. Immunity. 1999 Apr;10(4):431-8.

[49]Richman DD, Wrin T, Little SJ, Petropoulos CJ. Rapid evolution of the neutralizing antibody response to HIV type 1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 1;100(7):4144-9.

[50]Pelak K, Goldstein DB, Walley NM, Fellay J, Ge D, Shianna KV, Gumbs C, Gao X, Maia JM, Cronin KD, Hussain SK, Carrington M, Michael NL, Weintrob AC, Infectious Disease Clinical Research Program HIV Working Group, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Center for HIV/AIDS Vaccine Immunology (CHAVI). Host determinants of HIV-1 control in African Americans. J Infect Dis. 2010;201(8):1141.

[51]Scorza Smeraldi R, Fabio G, Lazzarin A, Eisera N, Uberti Foppa C, Moroni M, Zanussi C. HLA-associated susceptibility to AIDS: HLA B35 is a major risk factor for Italian HIV-infected intravenous drug addicts. Hum Immunol. 1988;22(2):73

[52]De Leys R, Vanderborght B, Van den Haesevelde M, Heyndrickx L, Van Geel A, Wauters C, Bernaerts R, Saman E, Nijs P, Willems B. Isolation and partial characterization of an unusual human immunodeficiency retrovirus from two persons of west-central African origin. J Virol 1990;64(3):1207-16.

[53]Keele BF, Van Heuverswyn F, Li Y, Bailes E, Takehisa J, Santiago ML, Bibollet-Ruche F, Chen Y, Wain LV, Liegeois F, Loul S, Ngole EM, Bienvenue Y, Delaporte E, Brookfield JF, Sharp PM, Shaw GM, Peeters M, Hahn BH. Chimpanzee reservoirs of pandemic and nonpandemic HIV-1. Science. 2006 Jul 28;313(5786):523-6.

[54]Taylor BS, Sobieszczyk ME, McCutchan FE, Hammer SM. The Challenge of HIV-1 Subtype Diversity. N Engl J Med 2008; 358:1590-1602.

[55]Korber B, Muldoon M, Theiler J, Gao F, Gupta R, Lapedes A, Hahn BH, Wolinsky S, Bhattacharya, T. Timing the Ancestor of the HIV-1 Pandemic Strains. Science. 2000 Jun 9;288(5472):1789-96.

[56]Van Heuverswyn F, Li Y, Neel C, Bailes E, Keele BF, Liu W, Loul S, Butel C, Liegeois F, Bienvenue Y, Ngolle EM, Sharp PM, Shaw GM, Delaporte E, Hahn BH,Peeters M.. Human immunodeficiency viruses: SIV infection in wild gorillas. Nature 2006;444:164.

[57]Rambaut A, Posada D, Crandall KA, Holmes EC. The causes and consequences of HIV evolution. Nat Rev Genet. 2004 Jan;5(1):52-61.

[58]Perelson AS, Neumann AU, Markowitz M, Leonard JM, Ho DD. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science 1996;271:1582-6.

78

[59]Robertson DL, Anderson JP, Bradac JA, Carr JK, Foley B, Funkhouser RK, Gao F, Hahn BH, Kalish ML, Kuiken C, Learn GH, Leitner T, McCutchan F, Osmanov S, Peeters M,Pieniazek D, Salminen M, Sharp PM, Wolinsky S, Korber B. HIV-1 nomenclature proposal. Science. 2000 Apr 7;288(5463):55-6.

[60]Natz E, Lisziewicz J. Rational design of formulated DNA vaccines: the DermaVir approach. Gene Vaccines 2012, 127-143

[61]Lori F, Lewis MG, Xu J, Varga G, Zinn DE Jr, Crabbs C, Wagner W, Greenhouse J, Silvera P, Yalley-Ogunro J, Tinelli C, Lisziewicz J (2000) Control of SIV rebound through structured treatment interruptions during early infection. Science 290(5496):1591–1593.

[62]Walker BD. Elite control of HIV Infection: implications for vaccines and treatment. Top HIV Med. 2007 Aug-Sep;15(4):134-6.

[63]Toke ER, Lorincz O, Somogyi E, Lisziewicz J. Rational development of a stable liquid formulation for nanomedicine products. Int J Pharm 2010; 392(1-2):261-267.

[64]Lisziewicz J, Trocio J, Whitman L, Varga G, Xu J, Bakare N, Erbacher P, Fox C, Woodward R, Markham P, Arya S, Behr JP, Lori F. DermaVir: a novel topical vaccine for HIV/AIDS. J Invest Dermatol 2005;124(1):160–169.

[65]Collins KL, Chen BK, Kalams SA, Walker BD, Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. Nature. 1998 Jan 22;391(6665):397-401.

[66]Lőrincz O, Tőke ER, Somogyi E, Horkay F, Chandran P, Douglas JF, Szebeni J, Lisziewicz J. Structure and biological activity of pathogen-like synthetic nanomedicines. Nanomedicine: NMB 2011. In press.

[67]Lisziewicz J, Gabrilovich DI, Varga G, Xu JQ, Greenberg PD, Arya SK, Bosch M, Behr JP, Lori F. Induction of potent human immunodeficiency virus type 1-specific T-cell-restricted immunity by genetically modified dendritic cells. Journal of Virology 2001;75(16):7621-8.

[68]Boussif O, Lezoualc’h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JP. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(16):7297–7301.

[69]Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self. Science 2002; 296(5566): 301-305.

[70]Nicolas JF and Guy B Intradermal, epidermal and transcutaneous vaccination: from immunology to clinical practice. Expert. Rev. Vaccines 2008; 7(8): 1201-1214.

[71]Bauer J, Bahmer FA, Worl J, Neuhuber W, Schuler G et al A strikingly constant ratio exists between Langerhans cells and other epidermal cells in human skin. A stereologic study using the optical disector method and the confocal laser scanning microscope. J. Invest. Dermatol. 2001;116(2):313-318.

[72]Lisziewicz J, Trocio J, Xu J, Whitman L, Ryder A, Bakare N, Lewis MG, Wagner W, Pistorio A, Arya S, Lori F. Control of viral rebound through therapeutic immunization with DermaVir. AIDS 2005;19(1):35–43.

79

[73]Lisziewicz J, Calarota SA, Banhegyi D, Lisziewicz Z, Ujhelyi E, Lori F. Single DermaVir patch treatment of HIV+ individuals induces long-lasting, high-magnitude, and broad HIV-specific T cell responses. Poster presentation. 15th conference on retroviruses and opportunistic infections, Boston, MA, 3–6 Feb 2008.

[74]Lisziewicz J, Bakare N, Calarota SA, Bánhegyi D, Szlávik J, Újhelyi E, Tőke ER, Molnár L, Lisziewicz Z, Autran B, Lori F. Single DermaVir Immunization: Dose-dependent Expansion of Precursor/Memory T Cells Against All HIV Antigens in HIV-1 Infected Individuals. Plos One 2012. In press.

[75]Calarota SA, Foli A, Maserati R, Baldanti F, Paolucci S Young MA, Tsoukas CM, Lisziewicz J, Lori F. HIV-1-Specific T Cell Precursors with High Proliferative Capacity Correlate with Low Viremia and High CD4 Counts in Untreated Individuals. J. Immunol. 2008; 180(9): 5907-5915.

[76]Rodriguez B, Asmuth D, Matining R, Spritzler J, Li X, Jacobson J, Read S, Lisziewicz J, Lori F, Pollard R, Team AS. Repeated-dose transdermal administration of DermaVir, a candidate plasmid DNA-based therapeutic HIV vaccine, is safe and well-tolerated: a 61-week analysis of ACTG Study 5176. Presented at the XVIIIth International AIDS Conference, 2010, Vienna, Austria

[77]van Lunzen J, Pollard R, Stellbrink HJ, Plettenberg A, Natz E, Lisziewicz Z, Freese R, Molnar L, Calarota SA, Lori F, Lisziewicz J. DermaVir for initial treatment of HIV-infected subjects demonstrates preliminary safety, immunogenicity and HIV-RNA reduction versus placebo immunization. Presented at the XVIII international AIDS conference, 2010, Vienna, Austria

[78]ICH Q2(R1) guideline: Validation of analytical procedures: Text and Methodology

[79]Weboldal: http://tools.immuneepitope.org/

[80]Peters B, Bui HH, Frankild S, Nielsen M, Lundegaard C, Kostem E, Basch D, Lamberth K, Harndahl M, Fleri W, Wilson SS, Sidney J, Lund O, Buus S, Sette A. A community resource benchmarking predictions of peptide binding to MHC-I molecules. PLoS Computational Biology 2006;2(6):574–84.

[81]Wang P, Sidney J, Dow C, Mothe B, Sette A, Peters B. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Computational Biology 2008;4(4).

[82]Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Science 2003;12(5):1007–17.

[83]Korber TMB, Brander C, Haynes BF, Koup R, Moore JP, Walker BD, et al., editors. HIV Molecular Immunology 2008. Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory, Theoretical Biology and Biophysics, 2008.

[84]Saitou, N., Nei, M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987; 4;406-625.

[85]Kimura, M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980;16;111-120.

[86]Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985;39;783-791.

80

[87]Lori F, Veronese FD, Devico AL, Lusso P, Reitz MS, Gallo RC. Viral-DNA carried by human-immunodeficiency-virus type-1 virions. Journal of Virology 1992;66(8):5067-74.

[88]Malykh A, Reitz MS, Louie A, Hall L, Lori F. Multiple determinants for growth of human-immunodeficiency-virus type-1 in monocyte-macrophages. Virology 1995;206(1):646-50.

[89]Piccinini G, Foli A, Comolli G, Lisziewicz J, Lori F. Complementary antiviral efficacy of hydroxyurea and protease inhibitors in human immunodeficiency virus-infected dendritic cells and lymphocytes. Journal of Virology 2002;76(5):2274-8.

[90]Cara A, Guarnaccia F, Reitz MS, Gallo RC, Lori F. Self-limiting, cell typedependent replication of an integrase defective human-immunodeficiencyvirus type-1 in human primary macrophages but not T-lymphocytes. Virology 1995;208(1):242–8.

[91]Gruters RA, van Baalen CA, Osterhaus A. The advantage of early recognition of HIV-infected cells by cytotoxic T-lymphocytes. Vaccine 2002;20(15):2011–5.

[92]Somogyi E, Xu J, Gudics Á, Tóth J, Kovács AL, Lori F, Lisziewicz J. A plasmid DNA immunogen expressing fifteen protein antigens and complex virus-like particles (VLP+) mimicking naturally occurring HIV. Vaccine 2011;29(4):744–753.

[93]Quan FS, Steinhauer D, Huang CZ, Ross TM, Compans RW, Kang SM. A bivalent influenza VLP vaccine confers complete inhibition of virus replication in lungs. Vaccine 2008;26(26):3352-61.

[94]Altfeld M, Allen TM, Yu XG, Johnston MN, Agrawal D, Korber BT, Montefiori DC, O'Connor DH, Davis BT, Lee PK, Maier EL, Harlow J, Goulder PJ, Brander C,Rosenberg ES, Walker BD. HIV-1 superinfection despite broad CD8+ T-cell responses containing replication of the primary virus. Nature. 2002 Nov 28;420(6914):434-9.

[95]Streeck H, Li B, Poon AF, Schneidewind A, Gladden AD, Power KA, Daskalakis D, Bazner S, Zuniga R, Brander C, Rosenberg ES, Frost SD, Altfeld M, Allen TM. Immune-driven recombination and loss of control after HIV superinfection. J Exp Med. 2008 Aug 4;205(8):1789-96.

[96]Somogyi E, Gudics Á, Forni DD, Molnár L, Lori F, Lisziewicz J. Subtype optimized DermaVir for personalized immunotherapy. Abstracts from AIDS Vaccine 2010. AIDS Research and human retroviruses 2010, 26(10): A-1-A-184.

[97]Weboldal: http://www.hiv.lanl.gov/

[98]Pantaleo G, Koup RA. Correlates of immune protection in HIV-1 infection: what we know, what we don't know, what we should know. Nat Med. 2004 Aug;10(8):806-10.

[99]Mascola JR, Montefiori DC. The Role of Antibodies in HIV Vaccines. Annu. Rev. Immunol. 2010. 28:413–44.

[100]Koup RA, Graham BS, Douek DC. The quest for a T cell-based immune correlate of protection against HIV: a story of trials and errors. Nat Rev Immunol. 2011 Jan;11(1):65-70.

81

[101]Mouquet H, Scheid JF, Zoller MJ, Krogsgaard M, Ott RG, Shukair S, Artyomov MN, Pietzsch J, Connors M, Pereyra F, Walker BD, Ho DD, Wilson PC, Seaman MS, Eisen HN, Chakraborty AK, Hope TJ, Ravetch JV, Wardemann H, Nussenzweig MC. Polyreactivity increases the apparent affinity of anti-HIV antibodies by heteroligation. Nature 2010;467(7315):591-595.

[102]Mouquet H, Warncke M, Scheid JF, Seaman MS, Nussenzweig MC. Proc Natl Acad Sci U S A. Enhanced HIV-1 neutralization by antibody heteroligation. 2012 Jan 17;109(3):875-80.

[103]Betts MR, Casazza JP, Koup RA. Monitoring HIV specific CD8+ T cell responses by intracellular cytokine production. Immunol Lett. 2001 Nov 1;79(1-2):117-25.

[104]Abbott A. Therapeutic HIV vaccines show promise. Nature 2010;466,539, published online. http://www.nature.com/news/2010/100727/full/466539a.html

[105]Sandstrom E, Nilsson C, Hejdeman B, Brave A, Bratt G, Robb M, Cox J, Vancott T, Marovich M, Stout R, Aboud S, Bakari M, Pallangyo K, Ljungberg K, Moss B,Earl P, Michael N, Birx D, Mhalu F, Wahren B, Biberfeld G; HIV Immunogenicity Study 01/02 Team. Broad Immunogenicity of a Multigene, Multiclade HIV-1 DNA Vaccine Boosted with Heterologous HIV-1 Recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara. Journal of Infectious Diseases 2008;198(10):1482-90.

[106]Ellenberger D, Wyatt L, Li B, Buge S, Lanier N, Rodriguez IV, Sariol CA, Martinez M, Monsour M, Vogt J, Smith J, Otten R, Montefiori D, Kraiselburd E, Moss B,Robinson H, McNicholl J, Butera S. Comparative immunogenicity in rhesus monkeys of multi-protein HIV-1 (CRF02_AG) DNA/MVA vaccines expressing mature and immxature VLPs. Virology 2005;340(1):21-32.

[107]Masemola A, Mashishi T, Khoury G, Mohube P, Mokgotho P, Vardas E, Colvin M, Zijenah L, Katzenstein D, Musonda R, Allen S, Kumwenda N, Taha T, Gray G,McIntyre J, Karim SA, Sheppard HW, Gray CM; HIVNET 028 Study Team. Hierarchical Targeting of Subtype C Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proteins by CD8+ T Cells: Correlation with Viral Load. Journal of Virology 2004; 78(7):3233–3243.

[108]Kiepiela P, Ngumbela K, Thobakgale C, Ramduth D, Honeyborne I, Moodley E, Reddy S, de Pierres C, Mncube Z, Mkhwanazi N, Bishop K, van der Stok M, Nair K, Khan N, Crawford H, Payne R, Leslie A, Prado J, Prendergast A, Frater J, Brander C, Learn GH, Nickle D, Rousseau C, Coovadia H, Mullins JI, Heckerman D, Walker BD, Goulder P. CD8+ Tcell responses to different HIV proteins have discordant associations with viral load. Nat Med. 2007 Jan;13(1):46-53.

[109]Vider-Shalit T, Fishbain V, Raffaeli S, Louzoun Y. Phase-dependent immune evasion of herpesviruses. Journal of Virology 2007;81(17):9536-45.

[110]Fischer W, Perkins S, Theiler J, Bhattacharya T, Yusim K, Funkhouser R, Kuiken C, Haynes B, Letvin NL, Walker BD, Hahn BH, Korber BT. Polyvalent vaccines for optimal coverage of potential T-cell epitopes in global HIV-1 variants. Nat Med 2007;13(1)100-6.

[111]Blauvelt A, Asada H, Saville MW, KlausKovtun V, Altman DJ, Yarchoan R, Katz SI. Productive infection of dendritic cells by HIV-1 and their ability to capture virus are mediated through separate pathways. Journal of Clinical Investigation 1997;100(8):2043-53.

82

[112]Ellenberger D, Li B, Smith J, Yi H, Folks T, Robinson H, Butera S. Optimization of a multi-gene HIV-1 recombinant subtype CRF02_AG DNA vaccine for expression of multiple immunogenic forms. Virology 2004;319(1):118-30.

[113]Weaver EA, Lu Z, Camacho ZT, Moukdar F, Liao HX, Ma BJ, Muldoon M, Theiler J, Nabel GJ, Letvin NL, Korber BT, Hahn BH, Haynes BF, Gao F. Cross-subtype T-cell immune responses induced by a human immunodeficiency virus type 1 group M consensus env immunogen. J Virol 2006;80:6745-56.

[114]Barouch DH, O'Brien KL, Simmons NL, King SL, Abbink P, Maxfield LF, Sun YH, La Porte A, Riggs AM, Lynch DM, Clark SL, Backus K, Perry JR, Seaman MS,Carville A, Mansfield KG, Szinger JJ, Fischer W, Muldoon M, Korber B. Mosaic HIV1 vaccines expand the breadth and depth of cellular immune responses in rhesusmonkeys. Nat Med. 2010 Mar;16(3):319-23.

hiv-1 szubtÍpusokra optimalizÁlt, szemÉlyre szabott...

Documents