hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v …

Magistrsko delo

HIDROLIZA GLIKOZIDNO VEZANIH

ANTIOKSIDANTOV V ČEBULNEM

EKSTRAKTU S SUBRKRITIČNO VODO

Julij, 2016 Jožica Ulčnik

Jožica Ulčnik

Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v

čebulnem ekstraktu s subkritčno vodo

Magistrsko delo

Maribor, 2016

Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v

čebulnem ekstraktu s subkritično vodo

Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje

Študentka: Jožica Ulčnik

Študijski program: magistrski študijski program II. stopnje Kemijska

tehnika

Predvideni strokovni naslov: magistrica inženirka kemijske tehnike

Mentor: red. prof. dr. Mojca Škerget

Somentor: red. prof. dr. Željko Knez

Maribor, 2016

Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo

1

Kazalo

Kazalo ....................................................................................................................................... 1

Izjava......................................................................................................................................... 4

Zahvala ..................................................................................................................................... 6

Abstract ..................................................................................................................................... 8

Seznam tabel ............................................................................................................................. 9

Seznam slik ............................................................................................................................. 10

Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ 12

Uporabljene kratice ................................................................................................................. 13

1 Uvod ................................................................................................................................ 14

1.1 Opredelitev problema in pregled literature .............................................................. 14

1.2 Namen, hipoteze in cilji ........................................................................................... 15

2 Teoretični del ................................................................................................................... 17

2.1 Ptujska čebula .......................................................................................................... 17

2.1.1 Kemijska sestava čebule ................................................................................... 18

2.2 Fenolne spojine in njihovo antioksidativno delovanje ............................................. 19

2.2.1 Flavonoidi ......................................................................................................... 20

2.2.2 Antioksidativna aktivnost ................................................................................. 21

2.2.3 Kvercetin........................................................................................................... 22

2.3 Lastnosti subkritične vode ....................................................................................... 25

2.3.1 Dielektrična konstanta ...................................................................................... 27

2.3.2 Ionski produkt ................................................................................................... 27

2.4 Hidroliza in hidrotermični procesi ........................................................................... 28

2.4.1 Hidroliza ........................................................................................................... 28

2.4.2 Hidrotermični procesi ....................................................................................... 29

2.4.3 Razpadni produkti hidrotermične degradacije kvercetina ................................ 30

2.5 Konvencionalna ekstrakcija ..................................................................................... 31

2.6 Šaržni in kontinuirni procesi .................................................................................... 33

3 Eksperimentalni del in metode dela ................................................................................ 36

3.1 Kemikalije, pribor, aparature ................................................................................... 36

3.2 Priprava materiala .................................................................................................... 37


2

3.3 Ekstrakcija materiala ................................................................................................ 38

3.4 Določitev totalnih fenolov ........................................................................................ 39

3.4.1 Umeritvena krivulja z galno kislino .................................................................. 39

3.4.2 Vsebnost totalnih fenolov v vzorcu .................................................................. 40

3.5 Kislinska hidroliza čebulnega ekstrakta ................................................................... 41

3.6 HPLC analiza kvercetina .......................................................................................... 41

3.7 Šaržna hidroliza vzorca s subkritično vodo .............................................................. 42

3.8 Kontinuirna hidroliza vzorca s subrkritično vodo .................................................... 44

3.9 Pridobivanje končnega hidroliziranega produkta ..................................................... 47

4 Rezultati in diskusija........................................................................................................ 48

4.1 Vplivi parametrov na izkoristek in vsebnost fenolnih spojin v ekstraktu ptujske

rdeče čebule ......................................................................................................................... 48

4.1.1 Vpliv uporabljenega čebulnega materiala ......................................................... 50

4.1.2 Vpliv temperature ............................................................................................. 50

4.1.3 Vpliv dodatka etanola k topilu .......................................................................... 51

4.1.4 Izbira ekstrakta za hidrolizo in določitev vsebnosti kvercetina ........................ 51

4.2 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta s subkritično vodo

v šaržnem reaktorju ............................................................................................................. 52


4.2.2 Vpliv kontaktnega časa ..................................................................................... 53

4.2.3 Vpliv uporabe CO2 ............................................................................................ 54

4.2.4 Vpliv koncentracije ........................................................................................... 55

4.3 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta v kontinuirnem

sistemu ................................................................................................................................. 56

4.3.1 Vpliv pretoka in kontaktnega časa .................................................................... 57


4.3.3 Vpliv koncentracije ........................................................................................... 59

4.4 Primerjava šaržnega in kontinuirnega procesa ......................................................... 60

4.5 Produkti hidrotermične degradacije ......................................................................... 61

4.5.1 Stranski produkti pri šaržnem postopku hidrolize ............................................ 61

4.5.2 Stranski produkti pri kontinuirnem procesu hidrolize ...................................... 63

4.6 Končni hidroliziran produkt ..................................................................................... 65

5 Zaključek ......................................................................................................................... 66


3

6 Literatura ......................................................................................................................... 68

7 Priloge ............................................................................................................................. 70

7.1 Umeritvena krivulja z GA ........................................................................................ 70

7.2 HPLC kromatogrami ................................................................................................ 70

7.3 Trendi nihanja % hidrolize med obratovanjem kontinuirnega sistema.................... 74

8 Življenjepis ...................................................................................................................... 76


4

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledala sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih:

Vir: ScienceDirect (http://www.sciencedirect.com/)

Gesla: Število referenc

Phenolic compounds in onion 3 459

Properties of subcritical water 18 149

Quercetin 26 009

Flavonoids in dry materials 30 255

Conventional extraction of onion peels 502

Batch and continuos hydrolysis 65

5-hydroxymethylfurfural 7 268

Vir: Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)


Phenolic compounds in onion 59

Properties of subcritical water 53

Quercetin 12 828

Flavonoids in dry materials 57

Conventional extraction 7 347

5-hydroxymethylfurfural 217

Vir: American Chemical Society - ACS (http://www.acs.org)


Phenolic compounds 75

Properties of subcritical water 5

Quercetin 17

Flavonoids in dry materials 9

Conventional extraction 96

Batch hydrolysis 22



5

Vir: Google Scholar, Google Books (http://scholar.google.si/,http://books.google.com/)


Phenolic compounds in onion 29 500

Properties of subcritical water 70 300

Quercetin 107 000

Flavonoids in dry materials 128 000

Conventional extraction of onion 36 100

Batch hydrolysis 32 800


Skupno število pregledanih člankov: 48

Skupno število pregledanih knjig: 5

Maribor, julij 2016 Jožica Ulčnik

_____________


6

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici, red. prof. dr. Mojci Škerget, za

vodenje, strokovno pomoč in nasvete pri opravljanju

magistrskega dela. Zahvaljujem se tudi somentorju red. prof. dr.

Željku Knezu.

Veliko zahvalo namenjam dipl. ing. kem. teh. Mateju Ravberju

za vso pomoč pri delu v laboratoriju, nasvete in posvečen čas

pri pisanju in oblikovanju moje magistrske naloge. Zahvaljujem

se tudi celotnemu kolektivu Laboratorija za spearacijske

procese in produktno tehniko.

Posebna zahvala gre tudi moji družini, ki mi je v času študija

vedno stala ob strani v vseh dobrih in slabih trenutkih, me

spodbujala in verjela vame.


7

Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s

subkritično vodo

Povzetek

Magistrsko delo prikazuje študijo možnosti uporabe subkritične vode kot hidroliznega

medija za selektivno razgradnjo glikozidno vezanih antioksidantov v ekstraktu rdeče ptujske

čebule. Iz neizkoriščenih čebulnih olupkov smo želeli pridobiti kvercetin, kot produkt z

visoko dodano vrednostjo.

S pomočjo konvencionalne ekstrakcije čebulnih olupkov smo pridobili čebulni ekstrakt, le-

temu smo določili vsebnost totalnih fenolov v ekstraktu s Folin-Ciocalteu metodo. Ekstrakt

smo hidrolizirali po postopku kislinske hidrolize s HCl in s tem določili vsebnost totalnega

kvercetina v ekstraktu. Preučevali smo vpliv parametrov (temperatura, tlak in uporabljena

vrsta plina v avtoklavu, kontaktni čas in koncentracija raztopine ekstrakta) na izkoristek

hidrolize s subkritično vodo v šaržnem reaktorju. Na podlagi optimalnih pogojev v šaržnem

reaktorju smo izvedli kontinuirno hidrolizo ekstrakta s subkritično vodo. Kvalitativno in

kvantitativno vsebnost kvercetina v hidroliziranih vzorcih smo določili s HPLC analizo.

Rezultati kažejo, da smo najvišji izkoristek ekstrakcije dosegli pri ekstrakciji zmlete

mešanice olupka in jedilnega dela čebule z vodo pri temperaturi 95 °C. Najvišjo vsebnost

totalnih fenolov smo določili v ekstraktu čebulnega olupka, pridobljenega s 35 % raztopino

etanola pri 80 °C. Najvišji odstotek hidrolize smo s šaržnim procesom dosegli pri 195 °C,

kontaktnem času 12,5 min, uporabi CO2 pri tlaku 215 bar in koncentraciji raztopine ekstrakta

0,1 mg/ml. Na podlagi rezultatov HPLC meritev sklepamo, da pri šaržnem procesu, z

naraščajočo koncentracijo vodne raztopine čebulnega ekstrakta odstotek hidrolize pada.

Najvišji odstotek hidrolize pri kontinuirnem procesu smo dosegli pri temperaturi 200 °C,

tlaku 102 bar, kontaktnem času 12,9 min in koncentraciji raztopine ekstrakta 0,5 mg/ml.

HPLC analiza je pokazala, da kot stranska produkta med potekom hidrolizne reakcije poleg

ostalih komponent nastajata 3,4-dihidroksi benzojska kislina in 5-hidroksi metil furfural, ki

ga lahko zaradi razlik v topnosti v vodi separiramo od kvercetina.

Ključne besede: olupki rdeče čebule, glikozidi, hidroliza, subkritična voda, kvercetin

UDK: 66.094.941:635.25(043.2)


8

Hydrolysis of glycoside bounded antioxidants in onion extract with

subcritical water

Abstract

This master thesis describes the possible usage of subcritical water as hydrolysis medium for

selective decomposition of glycoside bounded antioxidants in red onion peel extract. The

main intention was to obtain quercetin from unused red onion peels as a material with added

value.

Convencional extraction of onion peels enabled us to obtain the onion peel extract. The

content of total phenols in the extract was determinated with the Folin-Ciocalteu reagent.

The extract was hydrolyzed according to the procedure of acid hydrolysis with HCl and the

total amount of quercetin in the extract was determined. We studied the effect of reaction

parameters (temperature, pressure and type of gas in autoclave, contact time and

concentration of extract solution) on efficiency of hydrolysis with subcritical water in batch

reactor. Using optimal conditions in the batch reactor, continuous hydrolysis of extract with

subcritical water was performed. Qualitative and quantitative content of quercetin in

hydrolysed samples was determined with HPLC analysis.

Results show that the highest amount of extract was acquired when the grinded mixture of

peels and eadible part of onion was extracted by water at a temperature of 95 °C. The highest

content of total phenols was determined in extract of onion peels that was obtained with a 35

% ethanol solution at 80 °C. The highest percentage of hydrolysis performed in batch

process was achieved at 195 °C, at a contact time of 12.5 minutes, using CO2 at a pressure of

215 bar and a concentration of extract solution of 0.1 mg/ml. Based on results of HPLC

measurements we can conclude that the percentage of hydrolysis in batch process is

decreasing by increasing concentration of water solution of onion extract. The highest

percentage of hydrolysis performed in continuous mode was achieved at a temperature of

200 °C, pressure of 102 bar, treatment time of 12.5 min and 0.5 mg/ml concentration of

extract solution.

HPLC analysis indicated that during the hydrolysis reaction, 5-hydroxymethylfurfural and

3,4-dihydroxybenzoic acid are produced as side products, however 5-HMF could be

separated from quercetin, due to differences in solubility in water.

Key words: red onion peel, glycosides, hydrolysis, subcritical water, quercetin

UDK: 66.094.941:635.25(043.2)


9

Seznam tabel

Tabela 2-1: Sestava jedilnega dela čebule. ............................................................................. 18

Tabela 2-2: Razredi fenolnih spojin. ...................................................................................... 19

Tabela 2-3: Nekatere fizikalne in kemijske lastnosti vode in pare pri različnih temperaturah

in tlakih. .................................................................................................................................. 26

Tabela 2-4: Lastnosti šaržnega in kontinuirnega procesa. [26] .............................................. 34

Tabela 3-1: Gradient mobilne faze B v %. ............................................................................. 42

Tabela 4-1: Vsebnost stranskih produktov pri šaržnem procesu. .......................................... 62

Tabela 4-2: Vsebnost stranskih produktov pri kont. procesu. ................................................ 63


10

Seznam slik

Slika 2-1: a) Zaščitena geografska označba; b) venec ptujske čebule. ................................... 17

Slika 2-2: Fenol z odprtim ogljikovim mostom. ..................................................................... 20

Slika 2-3: Ogljikov most vključen v obroč C. ........................................................................ 20

Slika 2-4: Shema delovanja antioksidanta. ............................................................................. 22

Slika 2-5: Molekula kvercetina. .............................................................................................. 23

Slika 2-6: Glukozidi kvercetina: a) kvercetin-3-Q-β-glikozid, b) kvercetin-4-Q-glikozid, c)

kvercetin 7-O-β-D-glikozid, d) kvercetin-3,4'-diglikozid. ...................................................... 24

Slika 2-7: Fazni diagram vode. ............................................................................................... 25

Slika 2-8: Dielektrična konstanta vode v odvisnosti od temperature. [14] ............................. 27

Slika 2-9: Gostota in Kw v odvisnosti od temperature [16]. .................................................... 28

Slika 2-10: Primer razpadnih produktov pri hidrolizi kvercetin glikozida [17]. .................... 30

Slika 2-11: Molekula 5- hidroksi metil furfurala. [24] ........................................................... 31

Slika 3-1: Zmlet čebulni material............................................................................................ 38

Slika 3-2: Čebulni ekstrakt. ..................................................................................................... 39

Slika 3-3: Visokotemperaturni visokotlačni šaržni avtoklav. ................................................. 43

Slika 3-4: Shema aparature za šaržno hidrolizo. ..................................................................... 44

Slika 3-5: Sistem za kontinuirno hidrolizo ekstrakta. ............................................................. 45

Slika 3-6: Shema aparature za kontinuirno hidrolizo. ............................................................. 46

Slika 4-1: Izkoristki ekstrakcij pri različnih ekstrakcijskih pogojih. ...................................... 48

Slika 4-2: Vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih, pridobljenih pri različnih ekstrakcijskih

pogojih. ................................................................................................................................... 49

Slika 4-3: Vpliv temperature na wkvercetina (%). ........................................................................ 53

Slika 4-4: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%). ............................................................... 53

Slika 4-5: Vpliv uporabe CO2 na wkvercetina (%). ...................................................................... 54

Slika 4-6: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%). ..................................................................... 55

Slika 4-7: Trend nihanja wkvercetina (%) s časom obratovanja kontinuirnega sistema glede na

koncentracijo raztopine ekstrakta............................................................................................ 57

Slika 4-8: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%) pri kontinuirnem procesu. ...................... 58


11

Slika 4-9: Vpliv temperature na wkvercetina (%) pri kont. procesu. ........................................... 59

Slika 4-10: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%) pri kont. procesu. ....................................... 60

Slika 4-11: a) Raztopina hidroliziranega vzorca pred in po uparjanju, b) precipitirani delci

kvercetina ob steni bučke........................................................................................................ 65

Slika 7-1: Umeritvena krivulja z GA za določitev totalnih fenolov. ...................................... 70

Slika 7-2: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 15 min, N2. ... 70

Slika 7-3: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, N2. 71

Slika 7-4: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, CO2.

................................................................................................................................................ 71

Slika 7-5: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 0,1 mg/ml, 195 °C, 12,5 min,

CO2. ........................................................................................................................................ 72

Slika 7-6: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,25 mg/ml, 200 °C, 12,9

min, 96 bar. ............................................................................................................................. 72


min, 97 bar. ............................................................................................................................. 73


min, 98 bar. ............................................................................................................................. 73

Slika 7-9: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 0,1 mg/ml. .................................... 74

Slika 7-10: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 0,25 mg/ml. ................................ 74

Slika 7-11: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 0,5 mg/ml. .................................. 75

Slika 7-12: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 1 mg/ml. ..................................... 75


12

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli

a naklon premice umeritvene krivulje GA

Abs absorbanca raztopine vzorca

b odsek premice umeritvene krivulje GA

cp toplotna kapaciteta (kJ/ kg °C)

D premer cevi (mm)

Fv0 volumski pretok (mm3/min)

γ(QU) koncentracija kvercetina v posamezni fazi določena na HPLC (ng/μl),

ε dielektrična konstanta

η izkoristek ekstrakcije (%)

γGA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/ml)

γekstrakt koncentracija ekstrakta v raztopini vzorca (mg/ml)

Kw ionski produkt vode (mol2/dm

6)

L dolžina cevi (mm)

mekstrakt masa ekstrakta (g)

mmateriala masa vhodnega materiala (g)

msuh. pre. masa suhega preostanka v posamezni fazi (mg)

P tlak (bar)

Pcr kritični tlak (bar)

q volumski pretok (ml/min)

ρ gostota (kg/m3)

ρ0 gostota vode pri normalnih pogojih (g/ml)

ρn gostota vode pri temp. eksperimenta (g/ml)

T temperatura (°C)

Tcr kritična temperatura (°C)

t čas (min)

tk kontaktni čas (min)

λ toplotna prevodnost (mW/mK)

υ dinamična viskoznost (mPa·s)


13

Uporabljene kratice

3,4-DHBA 3,4- dihidroksi benzojska kislina

FC reagent Folin-Ciocalteu reagent

FOS fruktooligosaharidi z nizko molekulsko maso

GA galna kislina

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

5-HMF 5-hidroksi metil furfural

KE konvencionalna ekstrakcija

SCW superkritična voda

SubCW subkritična voda

UV ultravijolično

QU kvercetin


14

1 Uvod

Čebula je ena izmed glavnih in dnevno uporabljenih vrst zelenjave v Evropi. Uporabljamo jo

bodisi surovo ali predelujemo na različne načine. Znano je, da uživanje čebule deluje

stimulativno na srce, kot diuretik, pomaga pri izkašljevanju, ima antibakterijske lastnosti,

spodbujaja prebavo, spodbuja proizvodnjo žolča in zmanjšuje raven sladkorja in lipidov v

krvi. V Sloveniji se izmed vseh vrst čebule vse pogosteje uporablja ptujska rdeča čebula.[1]

1.1 Opredelitev problema in pregled literature

Čebulno predelovalna industrija letno proizvede več kot 450.000 ton čebulnih odpadkov

znotraj Evropske unije. Mednje uvrščamo olupke, zunanje mesnate liste, rastne liste in

spodnje koreninske dele. Ti odpadki zaradi močne arome čebulnih ostankov niso primerni za

uporabo kot krma za živali, niti se ne morejo uporabiti kot organsko gnojilo, zaradi hitrega

razvoja fitopatogenih agentov. Prav tako zaradi visoke vsebnosti vlage, njihova odstranitev s

sežigom postane precej draga. Zaradi navedenih vzrokov, so proizvajalci čebule in

prehrambena industrija začeli iskati načine za pretvorbo čebulnih odpadkov v uporabne

sestavine živil, kot so npr.: fenolne spojine za ojačitev okusa, dodatna prehranska vlakna,

pigmenti, želirni pektini ali naravni antioksidanti. [1]

Glede na znane podatke o vsebnosti fenolnih in drugih spojin v odpadnem čebulnem

materialu, ki ga uvrščamo med biološke odpadke, želijo pridobiti izdelke z dodano

vrednostjo, povečati prihodek procesa in nenazadnje na ta način zmanjšati količino

odpadkov. [1]

Z namenom pridobivanja bioproduktov in energije iz naravnih in odpadnih materialov se

vedno več uporablja voda, ki jo glede na kemijske in fizikalne lastnostni uvrščamo med tako

imenovana zelena oz. okolju prijazna topila. Zaradi svoje polarnosti in sposobnost, da tvori

vodikove vezi, je odlično ekstrakcijsko oz. reakcijsko topilo. V njej se raztaplja veliko

različnih vrst molekul. [2]

Pri standardnih pogojih (temperaturi - T = 25 °C, tlaku - P = 1 bar ) je voda slabo mešljiva z

nepolarnimi ogljikovodiki in plini. Zaradi svoje visoke dielektrične konstante (78,5) in

visoke gostote (997 kg/m3) je dobro topilo za soli in druge močno polarne komponente. Pri

pogojih pod kritično temperaturo in tlakom (Tcr = 374 °C in Pcr = 220,6 bar) je voda v


15

subkritičnem stanju (SubCW), ko pa doseže pogoje nad kritičnimi pogoji, preide v

superkritično stanje (SCW). [3]

Znano je, da so v sub- in superkritičnem stanju, reakcijske lastnosti vode precej drugačne od

lastnosti pri atmosferskih pogojih. Zaradi možnosti spreminjanja temperature, tlaka in

posledično gostote, je pri uporabi vode kot reakcijskega agenta, možno manipulirati

selektivnost oz. vrste reakcij in jih uporabiti za pretvorbo odpadkov in pridobitev

raznovrstnih kemikalij. [3]

V primerjavi s klasičnimi postopki za pridobivanje izdelkov z dodano vrednostjo, kot sta

ekstrakcija z organskimi topili in hidroliza v močno kislem mediju, ima obdelava materiala s

subkritično vodo pomembno prednost, saj ni potrebnega predhodnega procesa sušenja

vhodnega materiala in lahko vrsta reakcij (hidroliza, dehidracija, aromatizacija…) poteka pri

višji vsebnosti vlage, ki je tipična za biomaso. Pri uporabi vode kot reakcijskega topila gre

nenazadnje za tako imenovano ''zeleno'' in trajnostno tehnologijo obdelave odpadnega

materiala, ki nadomešča uporabo dragih in okolju škodljivih organskih topil. [4]

Glede na to, da ima pri subkritičnih pogojih voda edinstvene lastnosti, saj ostane v tekočem

stanju in lahko deluje kot topilo, reaktant ali katalizator, jo lahko uporabimo kot hidrolizni

medij za procesiranje čebulnih glikozidov, pri čemer nastane aglikon kvercetina.

1.2 Namen, hipoteze in cilji

Namen magistrske naloge je bil raziskati možnost uporabe subkritične vode kot hidroliznega

medija za selektivno razgradnjo glikozidno vezanih antioksidantov v ekstraktu ptujske

čebule. Naše raziskave so se osredotočale na pridobitev prostega aglikona kvercetina,

produkta z visoko dodano vrednostjo v najvišjem možnem izkoristku, brez uporabe močnih

kislin ali baz.

V ta namen smo najprej izvedli konvencionalno ekstrakcijo lupine ptujske čebule z

namenom, da smo pridobili vhodni material – čebulni ekstrakt. Dobljenem produktu smo

določili vsebnost totalnih fenolih spojin in totalnega kvercetina. Totalne fenolne spojine smo

določili s kolorimetrično Folin-Ciocalteu metodo. Vsebnost totalnega kvercetina smo

določili na takšen način, da smo ekstrakt naprej hidrolizirali v močno kislem mediju in

hidroliziran produkt nato analizirali na tekočinskem kromatografu za prosti kvercetin. Tako

dobljena koncentracija kvercetina v ekstraktu se je smatrala kot popolnoma hidroliziran


16

produkt in ta vrednost se je uporabila pri izračunu odstotka hidrolize izvedene s subkritično

vodo.

V naslednjem koraku smo z dobljenimi podatki preučevali vpliv parametrov (temperatura,

kontaktni čas, uporaba plina za vzpostavitev tlaka v reaktorju in koncentracija ekstrakta) na

izkoristek hidrolize v šaržnem reaktorju, kjer smo uporabili subkritično vodo kot hidrolizni

medij. Na podlagi določitve optimalnih pogojev hidrolize v šaržnem reaktorju smo izvedli

tudi kontinuirno hidrolizo ekstrakta s subkritično vodo. Na koncu smo hidroliziran medij

precipitirali in s tem pridobili produkt z visoko vsebnostjo aglikona kvercetina.


17

2 Teoretični del

2.1 Ptujska čebula

Ptujski čebula (Ptujski lük) je staro ime za čebulo značilne rdečo-rjave barve suholistov, bele

in vijolično-rdeče barve mesa, srčasto-ploščate oblike in izrazitega okusa. Spada v družino

Liliaceae, njeno latinsko ime je Allium cepa var. cepa. Izhaja iz Azije, od koder se je preko

Italije razširila v srednjo Evropo. Cenjena je kot zelenjadnica in zdravilna rastlina, ki jo v

Sloveniji pridelujejo že več kot 200 let. Območje pridelovanja je zgodovinsko pogojeno in

obsega ravninski del Ptujskega polja, ki se razteza med reko Dravo, reko Pesnico, mestoma

Ptuj in Ormož ter obronki Slovenskih goric. [5]

Leta 2011 je pridobila oznako: Zaščitena geografska označba (slika 2-1a). V slovenski sorti

list je vpisana kot sorta Ptujska rdeča. Navedena je tudi v katalogu sort Evropske unije in v

opisu priporočenih sort poljščin in vrtnin, ki ga je izdal Kmetijski inštitut Slovenije. [6]

Navadno se shranjuje v obliki tradicionalnega venca prikazanega na sliki 2-1b, ali manjših

pakiranjih. Zaradi pletenja v kite ima ptujska čebula več zelenega listja, ki je žilavo in se ne

lomi ob puljenju. Slednje je zelo pomembno, saj kmetje čebulo že od nekdaj spravljajo

izključno ročno. Suho podnebje ob dozorevanju ter plitva, peščena in s hranili slabše

založena tla, so razlog, da je sorta razvila izrazit in ostrejši okus. [7]

Slika 2-1: a) Zaščitena geografska označba; b) venec ptujske čebule.


18

2.1.1 Kemijska sestava čebule

Dejstvo je, da je kemijska sestava čebule zelo zapletena. Študije kažejo, da suha čebulna

lupina vsebuje do 80 masnih % ogljikovih hidratov med katere uvrščamo glukozo, fruktozo,

saharozo, fruktooligosaharide z nizko molekulsko maso (FOS) in različne razvejane

polisahraide, ki so prisotni v večini rastlin. Različni avtorji poročajo, da prav zaradi velikega

zanimanja potrošnikov o dietni prehrani, vse več podjetij poskuša pridobiti dovoljenje za

uporabo in trženje FOS kot naravne sestavine živil v ZDA in Evropi. [8]

Tabela 2-1: Sestava jedilnega dela čebule.

100 g jedilnega dela čebule vsebuje: (g)

Voda 89,11

ogljikovi hidrati 9,34

Maščobe 0,10

Proteini 1,10

Vitamini: (mg)

tiamin (B1) 0,046

riboflavin (B2) 0,027

niacin (B3) 0,116

pantotenska kislina (B5) 0,123

vitamin B6 0,120

folna kislina (B9) 0,019

vitamin C 7,400

Minerali: (mg)

Kalcij 23

Železo 0,21

Magnezij 10

Fosfor 29

Žveplo 146

Cink 0,17

Od vseh zdravilnih snovi prisotnih v čebuli, izstopajo predvsem spojine žvepla in kvercetin,

ki delujejo kot močni antioksidanti in pomagajo nevtralizirati proste radikale v telesu ter

ščitijo membrane telesnih celic pred poškodbami. Poleg kvercetina, čebula dokazano vsebuje

tudi izorhamnetin in kaempferol glikozide, ki jih prav tako uvrščamo med flavonoide. [8]

Znanstveniki so dokazali, da čebula vsebuje tudi znatne količine natrija, kalcija, železa in

folne kisline (tabela 2-1). Pri rednem uživanju čebula zagotavlja priporočljiv vnos


19

prehranskih vlaknin, vitamina C, vitamina B6, kalija in ključnih fitokemikalij v obliki

disulfidov, trisulfidov in drugih sulfidnih spojin, ki so aromatskega izvora. [8]

2.2 Fenolne spojine in njihovo antioksidativno delovanje

Strukturno fenolne spojine obsegajo aromatski obroč, ki nosi enega ali več hidroksilnih

substituentov. V skupino fenolnih spojin uvrščamo številne enostavne fenolne spojine z

nizko molsko maso, kot tudi strukturno zapletene molekule z visoko molsko maso. Kljub

strukturni raznolikosti, se ta skupina spojin pogosto označuje kot "polifenoli". [9]

V naravi prisotne fenolne spojine najdemo v obliki konjugatov mono- in polisaharidov, ki so

povezani z eno ali več fenolnimi skupinami in se lahko pojavijo tudi kot funkcionalni

derivati v obliki estrov in metil estrov. Imajo pomembno vlogo pri rasti in razmnoževanju

rastlin, saj zagotavljajo zaščito pred patogeni in plenilci, poleg tega prispevajo tudi k barvi in

senzoričnim lastnostim sadja in zelenjave. [9]

V grobem jih razdelimo v več razredov, kot je prikazano v tabeli 2-2. Izmed spodaj

navedenih imajo fenolne kisline, flavonoidi in tanini vodilno vlogo glavnih prehranskih

fenolnih spojin. [9]

Tabela 2-2: Razredi fenolnih spojin.

Razred Struktura

enostavni fenoli, benzokinoni C6

hidroksibenzojske kisline C6–C1

acetofenoli, fenolocetne kisline C6–C2

hidroksicinamične kisline, fenilpropanoidi

(kumarini, izokumarini, kromini, kromeni)

C6–C3

naftokinoni C6–C4

ksantoni C6–C1–C6

stilbeni, antrakinoni C6–C2–C6

flavonoidi, izoflavonoidi C6–C3–C6

lignani, neolignani (C6–C3)2

biflavonoidi (C6–C3–C6)2

lignini (C6–C3)n

kondenzirani tanini (proantocianidini) (C6–C3–C6)n


20

2.2.1 Flavonoidi

Flavonoidi predstavljajo največjo skupino rastlinskih fenolov in predstavljajo več kot

polovico od vseh osem tisoč v naravi prisotnih fenolnih spojin. So spojine, molekulsko

sestavljene iz petnajstih ogljikovih atomov, ki so razvrščeni v konfiguraciji C6-C3-C6.

Osnovna struktura flavonoidov je sestavljena iz dveh fenilnih skupin, ki sta povezani z

mostom, sestavljenim iz treh atomov ogljika. Delimo jih v dva glavna razreda. V prvi razred

sodijo spojine, v katerih je ogljikov most "odprt" (slika 2-2), v drugi razred sodijo tiste, pri

katerih je ogljikov most vključen v heterociklični obroč C (slika 2-3). [10]

Slika 2-2: Fenol z odprtim ogljikovim mostom.

Variacije v obroču C in različni vzorci substitucije, ki so na voljo za obroča A in B

omogočajo različne strukture flavonoidov. [10]

Slika 2-3: Ogljikov most vključen v obroč C.

Podrazrede flavonoidov razlikujemo glede na funkcionalne skupine, vezane na obroču C

(slika 2-3). Flavanoli in antocianidini sta le dva podrazreda, kjer ni skupne 4-okso skupine,


21

vendar pa imajo molekule na tretjem ogljikovem atomu v obroču C vezano hidroksilno

skupino (-OH). Flavone, izoflavone in flavonole prepoznamo po dvojni vezi med

ogljikovima atomoma na drugem in tretjem mestu C obroča. Antocianidini imajo dve dvojni

vezi znotraj C obroča. Različna mesta dvojnih vezi in skupine vezane na različnih mestih

določajo podrazrede in vplivajo tudi na njihovo absorpcijo in njihovo sposobnost, da

delujejo kot antioksidanti. [10]

2.2.2 Antioksidativna aktivnost

Snovi, sposobne zavirati širjenje oksidativnih verižnih reakcij, ki jih povzročajo prosti

radikali, imenujemo antioksidanti. Oksidativne poškodbe s prostimi radikali povzročajo

oksidativni stres, ki je povezan z več degenerativnimi boleznimi. [11]

Prosti radikali so reaktivne molekulske vrste npr.: superoksid itd., ki nastajajo v celicah ali

jih telo absorbira iz okolja. Imajo neparno število elektronov, ki oksidirajo druge molekule z

namenom, da bi pridobili elektrone in sami stabilizirali svojo strukutro (slika 2-4).

Oksidirajo lahko makromolekule, kot so DNK, beljakovine, ogljikovi hidrati in maščobe.

[11]

Poznamo različne metode zaustavljanja delovanja prostih radikalov. Ena izmed njih je

uporaba aromatskih spojin, ki imajo strukturo polifenolov. Ta je sestavljena iz številnih

dvojnih vezi in hidroksilnih skupin, ki lahko darujejo elektrone za stabilizacijo prostih

radikalov. Prav antioksidativne lastnosti, povezane s strukturo flavonoidov, branijo celice

pred oksidativnim stresom. [11]


22

Slika 2-4: Shema delovanja antioksidanta.

V splošnem obstajata dve osnovni skupini antioksidantov. Ločimo jih na naravne in

sintetične. Raziskave v zadnjem obdobju kažejo, da se je znatno povečalo zanimanje po

iskanju antioksidantov iz naravnih virov, ki se uporabljajo kot dodatek za izboljšano

obstojnost živil v prehrambeni industriji in zdravil v farmacevtski industriji. Na ta način

želijo izpodriniti uporabo sintetičnih antioksidantov, za katere je dokazano, da so zdravju

škodljivi. Zaradi dokazane zmožnosti zaviranja verižnih oksidativnih reakciji med naravne

antioksidante uvršamo tudi molekulo kvercetina. [10]

2.2.3 Kvercetin

Kvercetin (C15H10O7) uvrščmo med flavonole in je eden izmed najbolj izraženih flavonoidov

v rastlinah. Njegovo kemijsko ime je 3,3',4',5,7 – penta hidroksi flavon (slika 2-5). Je široko

dostopen, saj se večinoma pridobiva z ekstrakcijo naravnih materialov v obliki rumenega

prahu. Spekter njegove uporabe je širok. Najpogosteje se dodaja kot antioksidant ali naraven

prehranski dodatek k živilskim, kozmetičnim in farmacevtskim proizvodom. [12]

Njegov vpliv na zdravje posameznika se kaže predvsem v sodelovanju pri vzpostavitvi

normalnega zdravja dihal, srca in ožilja, spodbujanju uravnovešenega krvnega tlaka in

zaščiti proti stresu, saj je močan antioksidant. Dokazano deluje protivnetno, saj inhibira

začetne vnetne procese, nastajanje in izločanje histamina ter drugih vnetnih mediatorjev.

Zanj je bilo ugotovljeno tudi protitumorno delovanje. Je antitrombotik, saj preprečuje

nastajanje krvnih strdkov. Sodeluje pri preprečevanju oksidacije maščob in preprečevanju


23

poškodb arterij ter tako skrbi za čistost in pretočnost ožilja (tudi v očeh). Učinkuje na več

načinov in je eden izmed najmočnejših protirakavih snovi, kar jih poznamo. Deaktivira več

karcinogenov, preprečuje poškodbe DNK in zavira encime, ki pospešujejo rast tumornih

celic. Zaradi vsebnosti kvercetina ima čebula, ki vsebuje celo do 10 odstotkov kvercetina na

suho maso materiala, sloves zdravila proti astmi in alergijam. [12]

Slika 2-5: Molekula kvercetina.

Različne študije poročajo o prisotnosti kvercetina v čebuli, jabolkah, zelenem čaju,

brokoliju, špinači, ajdi, citrusih, rdečem vinu itd. Njegova vsebnost v živilih je odvisna tudi

od učinkov shranjevanja. V prvih dvanajstih dneh neustreznega skladiščenja lahko čebula

izgubi od 25 % do 33 % vsebnosti kvercetina. Pri skladiščenju za tem lahko pride le še do

minimalnih izgub. Znano je tudi, da lahko čebulni olupek vsebuje celo 77-krat več

kvercetina, kot se le tega nahaja v jedilnem delu. [13]

Kvercetin in njegove s sladkorji vezane oblike, ki jih imenujemo glikozidi, predstavljajo od

60 % do 75 % prisotnih flavonoidov v ekstraktu čebulnega olupka. Eden izmed običajnih

načinov za hidrolizo kvercetin glukozidov iz čebule je uporaba kislinske hidrolize s HCl, ki

poenostavi kvalitativno in kvantitativno analizo prisotnosti kvercetina v materialu. Pri tem

postopku se prekine glikozidna vez in na ta način se poveča vsebnost kvercetin aglikona v

materialu. Poleg tega nastanejo tudi razpadni produkti kvercetina, ki so večinoma neznane

spojine. Najpogosteje zastopani glikozidni obliki v čebuli sta predvsem kvercetin-4-glukozid

in kvercetin-3,4-diglukozid. [13]


24

2.2.3.1 Glikozidi kvercetina

Številni flavonoidi so vezani na sladkorje v naravnem stanju. Imenujemo jih glikozidi.

Pojavi se glikozilacija na katerikoli hidroksilni skupini, kamor se veže sladkor. Tako kot pri

večini bioaktivnih komponent je tudi v primeru kvercetina prosta oz. aglikonska oblika

molekule v naravi manj pogosta. Najpogosteje ima kvercetin vezano skupino sladkorja na

tretjem mestu C obroča, 4. mestu obroča B in 7. mestu obroča A. [11]

Primeri so: kvercetin-3-Q-β-glikozid (slika 2-6 a), kvercetin-4-Q-glikozid (slika 2-6 b) in

kvercetin-7-O-β-D- glikozid (slika 2-6 c). Na molekulo kvercetina je lahko vezanih tudi več

skupin sladkorja v različnih kombinacijah. Primer takšne molekule je kvercetin-3,4'-

diglikozid (slika 2-6 d). [11]

Slika 2-6: Glukozidi kvercetina: a) kvercetin-3-Q-β-glikozid, b) kvercetin-4-Q-glikozid, c)

kvercetin 7-O-β-D-glikozid, d) kvercetin-3,4'-diglikozid.


25

2.3 Lastnosti subkritične vode

Vodo poznamo kot univerzalno polarno topilo, saj lahko v njej raztopimo več snovi, kot v

kateri koli drugi vrsti topila. Kaže zanimive lastnosti kot reakcijsko topilo pri subkritičnih ali

superkritičnih pogojih. Tehnologija s subkritično vodo (SubCW) je trenutno v svetu hitro

razvijujoča se metodologija, ki uveljavlja SubCW kot reakcijski medij pri temperaturah (T)

med 100 °C in 374 °C in pri tlaku (P), ki je dovolj visok, da ostane le-ta v tekočem stanju.

Kadar se reakcijska temperatura in/ali tlak dvigne nad kritično temperaturo (Tcr) in/ali tlak

(Pcr), se stanje vode pretvori iz subkritičnega v superkritično (SCW). Ti pogoji omogočajo,

da so lastnosti vode precej drugačne od običajne tekoče vode ali pare pri atmosferskem

tlaku. Slika 2-7 prikazuje trojno točko, kritično točko vode in območji SubCW in SCW. [4]

Slika 2-7: Fazni diagram vode.

V skladu s spremembami ionskega produkta ima SubCW pomembno vlogo pri kislinsko- in

bazično-kataliziranih reakcijah, ki se večinoma uporabljajo za hidrolizo biomase. Edinstveno

obnašanje SubCW in SCW izhaja tudi iz transportnih lastnosti, saj ima pri teh pogojih voda

visok difuzijski koeficient in toplotno prevodnost (maksimalna v kritičnem stanju) in nizko

viskoznost, zaradi česar je po svojih lastnostih bolj podobna plinom, kot tekočinam. Zaradi


26

odlične možnosti spreminjanja nekaterih lastnosti vode, kot sta temperatura in gostota, je

možno manipulirati selektivnost vrste reakcij in jih uporabiti za pretvorbo odpadkov s

SubCW in SCW vodo, ki ju uvrščamo med najbolj obetavne poti za pridobitev raznovrstnih

kemikalij. Tako za pridobitev manjših količin kemikalij z visoko dodano vrednostjo kot tudi

večjih količin cenejših kemikalij. [14]

Lastnosti vode, kot sta gostota (ρ) in dielektrična konstanta (ε), lahko neprekinjeno

nadzorujemo s spreminjanjem temperature (T) in tlaka (P). Njena dielektrična konstanta pri

sobni temperaturi in normalnem tlaku znaša 78,5. Pri normalnih pogojih ima konstanten

ionski produkt Kw = 10-14

mol2/dm

6 in ρ= 997 kg/m

3, toda ko je segreta pri visoki temperaturi,

se število vodikovih vezi med molekulami vode zniža, kar povzroči padec dielektrične

konstante ter drugih njenih tipičnih fizikalno-kemijskih lastnosti, z izjemo Kw, ki pri 300 °C

doseže maksimalno vrednost in nato strmo pade. [14]

Pri temperaturah pod 300 ° C je voda precej nestisljiva, kar pomeni, da povišan tlak nima

izrazitega vpliva na njene fizikalne lastnosti, omogoča pa, da voda ostaja v tekočem stanju.

Vrednost tlaka, ki zagotavlja, da je pri izbrani temperauri voda v tekočem stanju, razberemo

iz parnih tabel kot vrednost nasičenega parnega tlaka. Npr.: nasičen parni tlak pri 121 °C

znaša 1 bar, pri 150 °C 4,7 bar, pri 200 °C 15,5 bar in v kritični točki 374 °C 220,6 bar. V

območju med 300 °C in 374 °C, ko se voda približuje kritični točki, se njene fizikalne

lastnosti s povišanjem tlaka bistveno spremenijo. Tabela 2-3 prikazuje številne variacije

fizikalno-kemijskih lastnosti vode pridobljenih s tlačnimi in temperaturnimi spremembami.

[14]

Tabela 2-3: Nekatere fizikalne in kemijske lastnosti vode in pare pri različnih temperaturah

in tlakih.

Voda SubCW SCW Para

T (°C) 25 250 400 400 400

P (bar) 1 50 250 500 1

ρ (kg/m3) 997 800 170 580 0,3

ε 78,5 27,1 5,9 10,5 1,0

pKw 13,6 11,2 19,4 11,9 /

Cp (kJ/kgK) 4,22 4,86 13,0 6,8 2,1

υ (mPa·s) 0,89 0,11 0,03 0,07 0,02

λ (mW/mK) 608 620 160 438 55


27

2.3.1 Dielektrična konstanta

Dielektrična konstanta (ε) je brezdimenzijska konstanta ki kaže, kako enostavno se material

lahko polarizira z uvedbo električnega polja in prikazuje afiniteto vode, ki se uporablja kot

industrijski reakcijski medij. Ko vodo segrejemo nad 100 °C se ε zmanjšuje (slika 2-8). Pri

200 °C in tlaku 16 bar je dielektrična konstanta vode, enaka dielektrični konstanti metanola

(32,5) pri sobnih pogojih. Pri 250 °C je ε vode, ki jo ohranjamo v tekočem stanju, enaka

dielektrični konstanti etanola (27,1) pri sobnih pogojih. Pri temperaturi 297 °C postane celo

benzen popolnoma mešljiv z vodo. Voda v subkritičnem stanju tako postane mnogo boljše

topilo za hidrofobne organske snovi, kot voda pri sobni temperaturi. Deluje lahko kot

katalizator pri reakcijah, ki normalno zahtevajo dodatek katalizatorja. [4]

Slika 2-8: Dielektrična konstanta vode v odvisnosti od temperature. [14]

2.3.2 Ionski produkt

Ionski produkt (Kw) je definiran kot produkt koncentracije vodikovih in hidroksidnih ionov

in ponazarja stopnjo disociacije vode:

Kw = [H+]·[OH

-];


28

pKw= -log10Kw. [15] (2.1)

Slika 2-9: Gostota in Kw v odvisnosti od temperature [16].

Slika 2-9 prikazuje Kw in ρ v odvisnosti od temperature. Ionski produkt s povišano

reakcijsko temperaturo narašča. Po velikosti je pri subkritičnih pogojih približno trikrat višji

kot pri sobnih pogojih, kar omogoča SubCW, da sočasno deluje kot kislina in baza. Pri

temperaturi 250 °C in tlaku 50 bar znaša pKw = 11,2. Pri okoli 300 °C doseže maksimum ter

se postopoma zmanjšuje s povišano temperaturo do vrednosti 19,4, pri temperaturi 400 °C in

250 bar. Pri navedenih pogojih pride do zmanjšanja solvatacije ionov, kar je posledica

zmanjšanja gostote vode pri višjih temperaturah. Iz teh razlogov ima subkritična voda

pomembno vlogo v kislinsko in bazno kataliziranih reakcijah. Posebej je to vidno pri

pospešenih hidrolizah biomasnih komponent brez dodatka katalizatorja. [15]

2.4 Hidroliza in hidrotermični procesi

2.4.1 Hidroliza

Hidroliza je proces pri katerem v stiku z vodo pride do prekinitve vezi znotraj molekule.

Reakcija v glavnem poteče med vodno molekulo in ionom pri spremenjeni pH vrednosti


29

raztopine. Poznamo tri glavne vrste hidrolize: hidroliza soli, kislinska hidroliza in bazna

hidroliza. [16]

V primeru hidrotermične degradacije (hidrolize) glikozidno vezanih biopolimerov lahko

molekula vode, ki v subkritičnem stanju deluje kot močna kislina ali baza, prekine

glikozidno vez s katero je na molekulo vezan sladkor. [17]

2.4.2 Hidrotermični procesi

Postopek v vodi pri povišani temperaturi in tlaku se imenuje hidrotermični proces.

Hidrotermične reakcije za predelavo kompleksov kmetijskih in živilskih odpadnih

proizvodov zajemajo širok spekter fizikalnih in kemijskih reakcij. Koncept izhaja prvotno iz

geologije. Čim višja je potrebna temperatura za določen proces, višji tlak moramo zagotoviti

z namenom, da se izognemo uparevanju vode in jo s tem ohranimo v tekočem stanju. [9]

Splošno med hidrotermične reakcije uvršamo sintezne reakcije kot so: hidrolizne reakcije,

oksidacijske reakcije, kondenzacijske reakcije, reakcije hidrogeniranja in dehidrogeniranja,

reakcije izomerizacije, reakcije aromatizacije, reakcije alkiliranja, reakcije spajanja,

ciklizacijske reakcije, reakcije dekarboksilacije, Diels-Alderjeve reakcije,

dispropocionacijske reakcije, reakcije izločanja, organokovinske reakcije in reakcije

transformacije molekul, pri katerih se SubCW in SCW, zaradi selektivnih lastnosti

uporabljata kot reakcijsko topilo z nizko viskoznostjo in visoko sposobnostjo raztapljanja

substrata. Poleg tega se uporabljata kot reakcijski medij pri sintezi različnih materialov,

razgradnji odpadkov, recikliranju plastičnih materialov in obdelavi biomase. [18]

Med glavne procesne parametre, ki vplivajo na učinkovitosti hidrotermičnih reakcij

uvrščamo: reakcijsko temperaturo (T), tlak (P), hitrost pretoka (q) (v primeru kontinuirnih

procesov), kontaktni čas (tk), razmerje med materialom in topilom ter dodatek katalizatorja.

[19]

Reakcijska temperatura je eden izmed najpomembnejših dejavnikov, ki vplivajo na

učinkovitost poteka rekcij v SubCW, saj temperatura bistveno vpliva na fizikalno-kemijske

lastnosti vode. Raziskovalci so dokazali, da povišanje temperature povzroči izredno

povečanje hitrosti masnega prenosa snovi in izboljša topnost bioaktivnih spojin v vodi. Z

naraščanjem temperature se viskoznost in površinska napetost vode kot ekstrakcijskega

topila zmanjšata. Iz tega razloga je reakcije v SubCW najučinkovitejše izvajati pri najvišji


30

dovoljeni temperaturi, ki še ne povzroči degradacije želenih komponent v izbranem

materialu. Vpliv temperature se spreminja glede na različne naravne materiale, in je povezan

tudi s koncentracijo bioaktivne spojine v materialu. [16]

Pomemben dejavnik, ki poleg temperature in vrste vzorca, vpliva na potek reakcije s SubCW

je kontaktni čas v katerem je material, ki ga želimo hidrolizirati v stiku s SubCW. Znano je,

da je kontaktni čas močno odvisen od lastnosti in občutljivosti uporabljenega materiala, kot

tudi od občutljivosti komponente, ki jo želimo pridobiti. [16]

Na uspešnost hidrolize s subkritično vodo vpliva tudi vrsta glikozidne vezi. Znano je, da je

beta glikozidna vez stabilnejša kot alfa vez. Na potek hidrolize vplivata tudi lokacija

glikozidne vezi v polisaharidni verigi in njena dolžina. Reakcija je učinkovitejša pri

prekinitvi vezi na koncu molekule polisaharida. [16]

2.4.3 Razpadni produkti hidrotermične degradacije kvercetina

Subkritična voda je zaradi svojih lastnosti sposobna degradirati oz. hidrolizirati mnogo

organskih spojin, kot so biopolimeri (ogljikovi hidrati in proteini) na njihove enostavnejše

molekule kot so sladkorji, aminokisline, itd. Hkrati pa povzroči tudi nastanek stranskih

produktov. [17]

Slika 2-10: Primer razpadnih produktov pri hidrolizi kvercetin glikozida [17].


31

Slika 2-10 prikazuje primer razpadnih produktov kvercetin glikozida, kjer nastanejo poleg

proste molekule kvercetina, 3,4-dihidroksibenzojska kislina in druge komponente, tudi

sladkorji, ki so znani po tem da razpadejo v furfurale (5-HMF, itd.), aldehide (glicerol

aldehid, glikol aldehid, itd.), ketone (1,3-dihidroksi aceton), organske kisline (levulinsko

kislino, itd.), katehol, itd. [17]

Furfurali so najpogosteje zastopani enostavni furani v naravi in jih pridobivamo iz naravnih

materialov, ki vsebujejo lignocelulozo. Pri tem pride do hidroliznega procesa in nastanka

hemiceluloze. Molekule pentoze dehidrirajo v furfural in molekule heksoze dehidrirajo v 5-

hidroksi metil furfural (5-HMF), ki je sestavljen iz furan prstana in vsebuje funkcionalne

skupine aldehida in alkohola (slika 2-11). Ena izmed njegovih lastnosti je, da je zelo dobro

topen v vodi. Njegova prisotnost ni zaželjena ker je znak kvarjenja živil, označuje razpad

sladkorjev in je strupen. [20, 21, 22]

Slika 2-11: Molekula 5- hidroksi metil furfurala. [24]

2.5 Konvencionalna ekstrakcija

Pridobivanje bioaktivnih spojin iz rastlinskih snovi je prvi korak pri izkoriščanju naravnih

fitokemikalij, pri pripravi prehranskih dopolnil ali farmacevtskih dodatkov, sestavin živil in

proizvodnji farmacevtskih ter kozmetičnih izdelkov. Ekstrahiramo lahko sveže, zamrznjene

ali posušene rastlinske materiale. Ponavadi večje dele materiala pred ekstrakcijo zrežemo,

zmeljemo in homogeniziramo tako, da dobimo delce podobne velikosti. Če materiali

vsebujejo večjo količino vlage lahko izvedemo sušenje na zraku ali sušenje s postopkom

liofilizacije. [23]

Raziskave na tem področju so pokazale, da liofiliziran material, kot so npr. jagode in koruza,

vsebuje višjo vsebnost fenolnih spojin v primerjavi s tistim, ki ga posušimo na zraku. Vendar

sušenje, vključno z liofilizacijo, lahko povzroči neželene učinke na sestavnih profilih

vzorcev rastlin, zato je potrebna pazljivost pri načrtovanju sušenja. [23]


32

Pogosto se uporablja širok spekter ekstrakcijskih tehnik trdno-tekoče tudi za zgodnje

čiščenje naravnih izdelkov pridobljenih iz rastlinskega materiala ali mikroorganizmov.

Klasično lahko ekstrakcijske metode razdelimo na tradicionalne in novejše. K tradicionalnim

metodam vključujemo konvencionalno ekstrakcijo, Soxhletovo ekstrakcijo, maceracijo,

perkolacijo, turbo-ekstrakcijo z visokimi hitrostmi mešanja in ultrazvočno ekstrakcijo. Te

tehnike se večinoma uporabljajo v zadnjih nekaj desetletjih. [23]

Konvencionalna ekstrakcija (KE) je najpogosteje uporabljeni postopek za pripravo

ekstraktov iz rastlinskih materialov prav zaradi enostavnosti, učinkovitosti in široke

uporabnosti. Splošno znano je, da je izkoristek ekstrakcije odvisen od vrste in lastnosti

uporabljenega topila, njegove polarnosti, časa ekstrakcije, temperature, uporabljenega

razmerja med trdnim materialom in topilom kot tudi od kemijske sestave in fizikalnih

lastnosti materiala. Rastlinski materiali vsebujejo različne fenolne spojine od preprostih

fenolnih kislin, antocianov, do visoko polimeriziranih snovi kot so tanini. Iz teh razlogov

univerzalen postopek ekstrakcije, ki bi bil najprimernejši za pridobivanje rastlinskih fenolov,

ne obstaja. [23]

Naravni materiali vsebujejo tudi ne-fenolne snovi, kot so sladkorji in druge oblike ogljikovih

hidratov, organske kisline, proteine in maščobe, zaradi česar so lahko pri pridobivanju

ekstrakta potrebni tudi dodatni koraki za odstranitev teh komponent. [23]

Kot ekstrakcijska topila za pridobivanje fenolov so največkrat uporabljena naslednja

organska topila: metanol, etanol, aceton, etilacetat, in njihove kombinacije z različnimi

deleži vode. Prav izbira topila ključno vpliva na količino ekstrahiranih polifenolov v

ekstraktu. Znano je, da uporaba metanola poveča učinkovitost ekstrakcije fenolnih spojin z

nižjo molekulsko maso, med tem ko z uporabo acetona učinkoviteje ekstrahiramo flavanole

z višjo molekulsko maso. Zaradi svojih kemijskih lastnosti je v uporabi tudi etanol, saj je

varen za prehrano ljudi. [23]

V skladu z direktivo Evropske skupnosti (88/344/EEC) se lahko v ekstrakcijskih procesih

brez omejitev uporabljajo neslednja topila: voda, propan, butan, butilacetat, etilacetat, etanol,

ogljikov dioksid, aceton in N2O. Vsa druga topila so prepovedana ali imajo zelo natančno

določena področja uporabe (ne za prehrambeno, kozmetično in farmacevtsko industrijo).

[24]

Na izkoristek ekstrakcije fenolnih spojin iz rastlinskih materialov poleg časa vpliva tudi

temperatura, ki odraža nasprotja med topnostjo in degradacijo komponent pri procesu

oksidacije. Povišanje ekstrakcijske temperature po navadi spodbuja višjo topnost


33

komponente v topilu, saj se poveča hitrost prenosa snovi. Poleg tega se pri višji temperaturi

zmanjšata viskoznost in površinska napetost topila, kar pomaga izboljšati izkoristek

ekstrakcije. Vendar so mnoge fenolne spojine občutljive na visoko temperaturo, kar poveča

možnost oksidacije fenolov in posledično zmanjša izkoristek fenolnih spojin v ekstraktih.

Zato je ključnega pomena, da izberemo učinkovito metodo ekstrakcije z namenom, da

ohranimo stabilnost fenolnih spojin. [25]

Slabost konvencionalnih metod ekstrakcije kot sta npr. maceracija in Soxhlet ekstrakcija se

kažejo predvsem v večinoma nizki učinkovitosti, potencialnem onesnaževanju okolja zaradi

uporabljenih večjih količin organskih topil in daljšega ekstrakcijskega časa. V zadnjih letih

so se razvile številne novejše ekstrakcijske metode kot so ekstrakcija z mikrovalovi,

ekstrakcijo s subkritično vodo in ekstrakcija s superkritično vodo. [25]

2.6 Šaržni in kontinuirni procesi

Proizvodne procese v kemijski industriji lahko izvedemo na več načinov: šaržno, kontinuirno

ali semikontinuirno. [20]

Šaržni proces je eno- ali večstopenjski proces, pri katerem se določena količina surovin,

pomožnih materialov, energije, itd., predhodno dovede v kemijsko reakcijsko enoto pod

pogoji, ki so primerni za potek željene reakcije. Za takšne procese je značilno, da se

posamezne naloge oz. operacije izvajajo prekinjeno in po določenem receptu

(diskontinuirno). Zato se obratovalni parametri, npr. masa, koncentracija, temperatura in

tlak, spreminjajo s časom. Znotraj reaktorja v danem času pride do padca koncentracije

reaktantov in nastanka produktov. Ob zaključku postopka zmes odstranimo iz reaktorja in

nato opravimo ustrezne stopnje ločevanja in predelave (bodisi fizične ali kemične), da

pridobimo zahtevano raven čistote končnega produkta. To običajno narekujejo kupci, za

katere se posamezen izdelek proizvaja. Reaktanti, ki ne reagirajo in so ločeni od reakcijske

zmesi se lahko ponovno uporabijo za nadaljnjo reakcijo (običajno potem, ko so bili obdelani

ali očiščeni). [26]

Pri kontinuirnem procesu se vhodne surovine dovaja v sistem s konstantno hitrostjo, v

želenih razmerjih (surovin, pomožnih materialov, energije, itd.) in hkrati poteka konstantno

pridobivanje produktov, izdelkov, energije, itd. Za normalno obratovanje postopka je

potrebno doseči stacionarno stanje, v katerem je koncentracija tako reaktantov kot tudi


34

produktov v izbranem časovnem intervalu v vsaki točki reaktorskega sistema enaka. Nadzor

postopka poteka s konstantnim in enakomernim dotokom surovin in doseganjem konstantnih

pogojev (temperature, tlaka…). [26]

Kontinuirni procesi so značilni za proizvodnjo večjih količin osnovnih kemikalij. Za

proizvodnjo specialnih kemikalij in zdravil so primernejši šaržni procesi. V praksi je pogosta

tudi kombinacija obeh primerov tj. semikontinuirno obratovanje, kar pomeni, da proces v

določenem časovnem intervalu obratuje kontinuirno, vendar se periodično zaustavlja in

ponovno zaganja. Lastnosti posameznega procesa so prikazene v tabeli 2-4. [27]

Tabela 2-4: Lastnosti šaržnega in kontinuirnega procesa. [26]

Šaržni proces Kontinuirni proces

Material Lahko se uporablja za vse vrste

materialov (za materiale v trdnem

stanju je lažja uporaba šaržnega

procesa).

Lažja uporaba materialov v

tekoči obliki (danes, se lahko

skoraj vsak produkt proizvaja

z neprekinjenim procesom;

strošek investicije je odločilen

dejavnik).

Velikost naprav Relativno velike naprave. Visoke

naložbe pri nakupu zemljišča in

naprav.

Relativno majhne naprave.

Pomembni prihranki pri

nakupu zemljišča in naprav.

Reaktorji Pride do sprememb pri

koncentracijah snovi znotraj sistema

v daljšem časovnem obdobju.

Na vseh točkah sistema so po

določenem času zagona

doseženi konstantni pogoji

(stacionarno stanje).

Vtok surovin Sistem napolnimo s surovinami

pred začetkom reakcijskega

procesa.

Konstanten vtok surovin med

celotnim reakcijskem

procesom.

Kontrola

obratovalnih

pogojev

Enostavna kontrola. Lažje je

nadzorovati pogoje reakcije (pH ,

tlak, temperatura). Možno je tudi

ročno upravljanje.

Zahtevnejša kontrola

reakcijskih pogojev.

Zagotoviti je potrebno

avtomatično kontrolo.

Kontrolirati je potrebno tudi

pretok surovin.

Produkti Pridobivanje produktov šele na

koncu, ko so vsi deli reakcije

končani.

Stalno pridobivanje

produktov, ves čas reakcije.

Odpravljanje težav Napake, ki zahtevajo popravilo pri

določenem delu serije ne

povzročajo težav v drugih fazah.

Ustrezni preizkusi, se izvajajo

redno, po vsaki fazi.

Naprave so med seboj

povezane, tako da napaka v

enem delu procesa povzroča

zastoje v vseh drugih delih.

Dela, ki je bil poškodovan, ni

mogoče popraviti pod enakimi

delovnimi pogoji. Postopek je

potrebno zaustaviti.


35

Proizvedene količine

produkta

Uporabni proces za proizvodnjo

manjših količin produkta.

Uporabni proces za

proizvodnjo večjih količin

produkta.

Raznolikost

produktov v obratu

Pri uporabi istega reaktorja, lahko

vsako naslednjio šaržo prilagodimo

na nove pogoje obratovanja, ki

dajejo nov produkt.

Zaželjeno, da se pri

vzpostavljenih pogojih trajno

prizvaja en produkt.

Faza razvoja

produkta

Bolje na začetku, ko je postopek

relativno nov in še ne poznan. V

tem primeru sta začetna investicija v

manjši šaržni reaktor in s tem tudi

gospodarsko tveganje manjša.

Bolje po opravljenih vseh

fazah načrtovanja širjenja

procesa in testov gospodarske

izvedljivosti.


36

3 Eksperimentalni del in metode dela

Z namenom, da bi pridobili vhodni material – čebulni ekstrakt smo naprej izvedli

konvencionalno ekstrakcijo lupine ptujske čebule. Dobljenem produktu smo določili

vsebnost totalnih fenolih spojin in totalnega kvercetina. Totalne fenolne spojine smo določili

s kolorimetrično Folin-Ciocalteu metodo. Vsebnost totalnega kvercetina smo določili na

takšen način, da smo ekstrakt naprej hidrolizirali v močno kislem mediju (HCl) in

hidroliziran produkt nato analizirali na tekočinskem kromatografu za prosti kvercetin.

3.1 Kemikalije, pribor, aparature

Kemikalije:

Metanol (99 %)

Etanol (99 %)

Milli-Q voda

Galna kislina (standard, 98 %)

Kvercetin dihidrat (standard, 98 %)

5 - hidroksi metil furfural (standard, 99 %)

3,4 - dihidroksi benzojska kislina (standard, 99 %)

Folin - Ciocalteau (FC) reagent

Na2CO3

Pribor:

Steklena bučka z okroglim dnom (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml)

Steklena bučka z ravnim dnom (50 ml, 100 ml, 250 ml)

Steklen merilni valj (50 ml, 100 ml, 250 ml)

Steklene viale z zamaškom (10 ml)

Steklena čaša (250 ml, 500 ml, 1000 ml)

Steklena kristalizirka (500 ml)

Steklene viale z zamaški za HPLC


37

Vodni hladilnik

Stojalo in prižeme za bučke

Nuča

Prisesalka za nučiranje

Filter papir

Avtomatska pipeta (1 ml, 2 ml, 5 ml, 100 μl)

Plastični nastavki za pipeto (1 ml, 2 ml, 5 ml, 100 μl)

Plastične centrifugirke

Plastične inekcije

Teflonski membranski filter 0,25 μl

Aparature:

Liofilizator (Kambič, Slovenija)

Električni mlinček (Bosch)

Magnetni mešalnik z grelno ploščo

Ultrazvočna kopel (Kambič, Slovenija)

Analitska tehtnica (Mettler Toledo, Švica)

Termogravimetrična tehnica za določitev vlage v materialu (Mettler Toledo, Švica)

Rotacijski vakuumski uparjalnik (Büchi, Nemčija)

UV spektrofotometer Varian, Cary 50 (Varian, ZDA)

HPLC sistem Agilent 1100 (Agilent, ZDA)

3.2 Priprava materiala

Ptujsko čebulo smo najprej olupili in tako nejedilni del kot prvi jedilni sloj le-te posušili v

liofilizatorju. Suhi material smo zmleli z električnim mlinčkom. Zmletemu materialu,

prikazanem na sliki 3-1, smo določili vlažnost s termogravimetrično tehtnico. Vlažnost je

znašala 8,9 % ± 0,3 %.


38

ekstrakt

ekstrakcije

material

100 %m

m

Slika 3-1: Zmlet čebulni material.

3.3 Ekstrakcija materiala

Zmlet material smo zatehtali v bučko in v masnem razmerju 1/20 (g/ml) dodali vodo ali

mešanico etanol/voda (20 vol % EtOH, 35 vol % EtOH, 65 vol % EtOH) kot ekstrakcijski

medij ter magnetni mešalček. Bučko smo termostatirali na vodni kopeli pri različnih

temperaturah (45 °C, 60 °C, 80 °C in 95 °C) namestili povratni vodni hladilnik ter vklopili

mešanje. Ekstrakcijo smo vzdrževali 2 uri pri danih pogojih. Ekstrakcijsko zmes smo

ohladili ter prefiltrirali na nuči s filter papirjem s pomočjo podtlaka. Raztopino ekstrakta smo

prelili v stehtano bučko z okroglim dnom, jo namestili na rotacijski uparjalnik (rotavapor) in

uparili vodo do ostanka suhega ekstrakta. Bučko s suhim ekstraktom smo stehtali, določili

maso ekstrakta in izračunali izkoristek ekstrakcije. Tako pripravljen suhi ekstrakt, prikazan

na sliki 3-2, smo postrgali iz bučke in ga uporabili za nadalnje delo. [28]

Izkoristek ekstrakcije (ηekstrakcije, v mas. %) izračunamo po enačbi:

(3.1)

kjer je:

mekstrakt – masa pridobljenega ekstrakta (g) in

mmaterial – masa zatehtanega materiala (g). [28]


39

Slika 3-2: Čebulni ekstrakt.

3.4 Določitev totalnih fenolov

Kolorimetrične reakcije se pogosto uporabljajo pri UV/VIS spektrofotometričnih metodah,

saj so hitre in enostavne za izvedbo. Za kolorimetrični test je potrebno uporabiti referenčno

snov, šele nato je ta metoda primerna za določanje koncentracije skupnih fenolnih spojin v

rastlinskih ekstraktih. Polifenoli v rastlinskih izvlečkih reagirajo z določenimi redoks

reagenti, kot je npr. Folin-Ciocalteu reagent. Pri tem se tvori modri kompleks, ki ga je

mogoče določiti spektrofotometrično pri valovni dolžini 760 nm. Metoda temelji na

kompleksu fosfovolframove kisline v alkalni raztopini. Absorbanca nastalega kompleksa je

sorazmerna s številom aromatskih fenolnih skupin v vzorcu in se izraža z ekvivalentom

galne kisline. [29]

3.4.1 Umeritvena krivulja z galno kislino

Galna kislina se uporablja kot standard pri določevanju vsebnosti totalnih fenolov v vzorcu.

Vsebnost totalnih fenolov v materialu podamo kot ekvivalent v mg/g materiala. V ta namen

smo pripravili umeritveno krivuljo galne kisline. Enačbo premice umeritvene krivulje smo

uporabili pri izračunu vsebnosti totalnih fenolov v vzorcih.


40

3.4.1.1 Postopek priprave umeritvene krivulje

V 10 ml merilne bučke smo odpipetirali: 1,75 ml; 1,5 ml; 1,25 ml; 1 ml; 0,5 ml; 0,25 ml in

0,1 ml osnovne raztopine GA s koncentracijo 0,4 mg/ml ter razredčili z vodo do oznake.

Nato smo v stekleničke odpipetirali 0,5 ml razredčene raztopine GA, dodali 2,5 ml raztopine

Folin-Ciocalteu reagenta ter 2 ml raztopine Na2CO3 s koncentracijo 75 g/l, dobro premešali

in termostatirali na vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 °C. Čas za pripravo vzorca ni smel

presegati 2 min. Raztopine smo ohladili in izmerili absorbanco na UV spektofotometru pri

valovni dolžini 760 nm. Hkrati smo pripravili slepi vzorec, kjer smo namesto raztopine GA

uporabili destilirano vodo. [28]

3.4.2 Vsebnost totalnih fenolov v vzorcu

Vsebnost totalnih fenolov v čebulnem ekstraktu smo določili po podobnem postopku, kot

smo ga uporabili pri pripravi umeritvene krivulje z GA. V 10 ml merilne bučke smo zatehtali

20 mg ekstrakta in dopolnili do oznake z destilirano vodo. 0,5 ml raztopine ekstrakta smo

odpipetirali v stekleničke, dodali 2,5 ml raztopine Folin-Ciocalteu reagenta razredčenega z

vodo v razmerju 1:10 ter 2 ml Na2CO3 s koncentracijo 75 g/l. Čas za pripravo vzorca ni smel

presegati 2 min. Vzorce smo termostatirali na vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 °C, jih

ohladili na sobno temperaturo in izmerili absorbanco pri 760 nm. Za pripravo kontrolnega

vzorca smo namesto raztopine ekstrakta uporabili destilirano vodo. [28]

Koncentracijo totalnih fenolov v ekstraktu smo izračunali na podlagi umeritvene krivulje z

GA po naslednji enačbi:

Abs = a·γGA + b (3.2)

pri čemer je:

Abs – absorbanca raztopine vzorca izmerjena pri 760 nm (/),

a – naklon premice umeritvene krivulje GA (/),

b – odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance (/) in

γGA – koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/ml). [28]


41

Vsebnost totalnih fenolov smo izrazili v mg GA na g ekstrakta (wGA ekstrakt) oz. na g materiala

(wGA material) po naslednjh enačbah:

GA

GA, ekstrakt

ekstrakt

1000w

(3.3)

ekstrakcije

GA material GAekstrakt 100

w w

(3.4)

kjer je:

γekstrakt – koncentracija ekstrakta v raztopini vzorca (mg/ml),

ηekstrakcije – izkoristek ekstrakcije (%). [28]

3.5 Kislinska hidroliza čebulnega ekstrakta

Totalno vsebnost kvercetina v čebulnem ekstraktu smo določili s pomočjo kislinske hidrolize

s HCl. Smatrali smo, da je pri tem postopku proces hidrolize potekel 100 %.

V 20 ml merilno bučko smo zatehtali 50 mg ekstrakta in z destilirano vodo dopolnili do

oznake. Bučko z vodno raztopino ekstrakta smo za 10 min postavili v ultrazvočno kopel, kar

je omogočilo učinkovitejše raztapljanje ekstrakta. V 100 ml bučko z okroglim dnom smo

odmerili 16 ml pripravljene raztopine ekstrakta, dodali 5 ml 6 M HCl in 24 ml čistega

etanola, namestili povratni vodni hladilnik in bučko termostatirali na vodni kopeli pri 90 °C.

Po 2 urah smo vsebino bučke ohladili, dodali 5 ml destilirane vode in dobro premešali na

ultrazvočni kopeli. Tako pripravljen hidroliziran vzorec smo analizirali glede na vsebnost

kvercetina na HPLC. [30]

3.6 HPLC analiza kvercetina

Prisotnost in količino kvercetin aglikona v hidroliziranem vzorcu smo določili s pomočjo

Agilentov-ega HPLC serije 1100, sestavljenega iz binarne črpalke, avtomatskega

vzorčevalnika, grelnika kolone in detektorja s spremenljivo valovno dolžino (VWD).

Uporabili smo kromatografsko kolono Agilent Zorbax SB-C18 z dolžino 150 mm, notranjim

premerom 4,6 mm in velikostjo delcev 1,8 μm. Temperatura kolone je bila nastavljena na 35


42

°C in pretok mobilne faze na 0,55 ml/min. Volumen injiciranja vzorca je znašal 10 μl.

Mobilna faza je bila sestavljena iz dveh delov. Mobilna faza A je bila 2 % metanolna

raztopina ocetne kisline in mobilna faza B 2 % vodna raztopina ocetne kisline. [17]

Gradient mobilne faze v določenem času meritve vzorca je prikazan v tabeli 3-1.

Tabela 3-1: Gradient mobilne faze B v %.

Čas (min) % mobilne faze B

0 95

5 80

15 15

18 95

20 95

Na začetku metode je bila valovna dolžina nastavljena na 280 nm, in po 14,5 min

spremenjena na 365 nm vse do konca metode. Kvantitativna opredelitev vsebnosti kvercetina

in drugih produktov je bila opravljena na podlagi umeritvenih krivulj, pridobljenih s

standardi. [17]

3.7 Šaržna hidroliza vzorca s subkritično vodo

Hidrolizo vzorca s subkritično vodo smo izvedli v 75 ml visokotemperaturem in

visokotlačnem šaržnem avtoklavu iz nerjavečega jekla serije 4740 (Parr instruments, Moline,

ZDA). Delovno območje avtoklava je tovarniško določeno na maksimalno temperaturo 350

°C in tlak 586 bar. Prikazan je na sliki 3-3. Sestavljajo ga: 1- dovod plina, 2- manometer, 3-

tipalo digitalnega termometra, 4- avtoklav ovit z grelnim kablom in izolacijskim trakom, 5-

digitalni termometer, 6- magnetni mešalnik z grelno ploščo, 7- ventil za izpust plina iz

sistema.


43

Slika 3-3: Visokotemperaturni visokotlačni šaržni avtoklav.

Za posamezni poskus smo avtoklav napolnili s 20 ml sveže pripravljene vodne suspenzije

čebulnega ekstrakta z znano koncentracijo (2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25

mg/ml ali 0,1 mg/ml) in dodali magnetno mešalo. Avtoklav smo ovili z električnim grelnim

kablom in izolacijskim trakom, s katerim smo zmanjšali toplotne izgube pri segrevanju.

Mešanje suspenzije znotraj avtoklava med potekom reakcije smo zagotovili z magnetnim

mešalom. Pred segrevanjem na želeno temperaturo, smo avtoklav prepihali z inertnim

dušikom ali CO2 in na ta način odpravili prisotnost kisika, ki bi lahko povzročil oksidacijo

komponent v vzorcu in potek neželenih stranskih reakcij. Sledilo je segrevanje na določeno

temperaturo (180 °C, 190 °C, 195 °C, 200 °C ali 210 °C) in vzpostavitev tlaka uporabljenega

plina (N2 ali CO2) v sistemu (slika 3-4) na želeno vrednost (50 bar, 90 bar, 150 bar, 215 bar,

380 bar ali 545 bar). Po obratovanju pri zgoraj navedenih pogojih in določenem kontaktnem

času (7,5 min, 10 min, 12,5 min, 15 min ali 17,5 min) smo avtoklav hitro ohladili v hladni

vodni kopeli in iz sistema spustili preostali plin. Nato smo iz avtoklava odvzeli hidroliziran

vzorec in ga primerno redčili z metanolom. Posamezni eksperiment pri izbranih parametrih

smo ponovili dvakrat. Pripravljeno raztopino vzorca smo filtrirali skozi teflonski

membranski filter 0,2 μm in jo v treh zaporednih meritvah analizirali na napravi HPLC.


44

Odstopanje meritev od povprečne vrednosti % hidrolize posameznega vzorca je

predstavljeno s standardno deviacijo.

Slika 3-4: Shema aparature za šaržno hidrolizo.

3.8 Kontinuirna hidroliza vzorca s subrkritično vodo

Kontinuirno hidrolizo vzorca smo izvedli s pomočjo sistema, ki je prikazan na sliki 3-4.

Sistem sestavljajo: 1- rezervoar za Milli-Q vodo, 2- rezervoar za suspenzijo ekstrakta, 3-

visokotlačna črpalka Gilson 305, 4- visokotlačna črpalka Shimadzu LC-10AS, 5- navitje

električnega grelca, 6- manometer, 7- digitalni termometer, 8- reaktorska cev ovita z grelnim

kablom in izolirnim trakom, 9- ekspanzijski ventil, 10- kriostat, 11- zbirna posoda za

iztekajoči vzorec, 12- grelnik za reaktorsko cev.


45

Slika 3-5: Sistem za kontinuirno hidrolizo ekstrakta.

S peristaltično črpalko Gilson 305 pump smo v sistem črpali Milli-Q vodo in s črpalko-

Shimadzu LC-10AS suspenzijo ekstrakta. Skupni volumski pretok obeh črpalk je znašal 1,5

ml/min. Glede na željeno koncentracijo ekstrakta (0,1 mg/mL, 0,25 mg/ mL, 0,5 mg/mL, 1

mg/ mL) v reakcijski mešanici smo nastavili pretok črpalke ekstrakta na 0,1 mL/min, 0,2

mL/min, 0,4 mL/min in pretok vode ustrezno na 1,4 mL/min, 1,3 mL/min in 1,1 mL/min.

Z elektičnim grelcem znamke Parr, smo segrevali vodo na želeno temperaturo tako, da smo

jo vodili skozi ogrevano navitje grelca. Voda in suspenzija ekstrakta sta bili v stiku v

reaktorski cevi dolžine (L) 700 mm in premera (D) 6,35 mm. Cev smo dodatno segrevali

tako, da smo jo ovili z grelno kačo in izolacijskim trakom, s katerim smo zmanjšali možnost

toplotnih izgub. Ker so reakcije potekale pod vplivom tlaka (okoli 100 bar), smo za

regulacijo tlaka v sistemu potrebovali tudi tlačni ventil. Tlak v sistemu je prikazoval digitalni

barometer. Hidroliziran vzorec, ki je iz sistema pritekal segret na temperaturo sistema smo

vodili v kriostat (vodni hladilnik), kjer se je ohladil na sobno temperaturo (slika 3-6).

Ohlajen vzorec smo zbirali v merilni valj.


46

Pri opazovanju vpliva pretoka, kontaktnega časa in temperature, smo vzorec za analizo

vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirnega merilnega valja po 1 h obratovanja

posameznega eksperimenta. Pri opazovanju vpliva koncentracije na % hidrolze pa smo

vzorec odvzeli na vsakih 15 min v 240 minutah obratovanja, ga filtrirali skozi teflonski

membranski filter (0,25 μm), redčili z metanolom v ustreznem razmerju in analizirali na

HPLC. Odstopanje meritev od povprečne vrednosti % hidrolize posameznega vzorca je

predstavljeno s standardno deviacijo.

Slika 3-6: Shema aparature za kontinuirno hidrolizo.

Kontaktni čas (tk) v reaktorju smo določili s pomočjo enačbe :

2

04

n

vo

DL

k Ft

(3.5)

pri čemer je:

D - premer cevi (mm),

L - dolžina cevi (mm),

ρn – gostota vode pri normalnih pogojih (g/ml),

ρ0 – gostota vode pri eksperimentalinih pogojih (g/ml),

Fv0 – skupni volumski pretok pri izbranih koncentracijah ekstrakta (mm3/min).


47

( )

( . .)

100%kvercetina

QU

suh pre

wm

Pri izvedbi kontinuirnih eksperimentov smo študirali vpliv kontaktnega časa, temperature in

koncentracije uporabljene raztopine ekstrakta na % hidrolize. Eksperimente smo izvedli pri

kontaktnem času 11,4 min, 12,9 min, 14,9 min in 17,5 min, temperaturah 180 °C, 190 °C,

200 °C in 210 °C in koncentracijah raztopine ekstrakta 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml in

0,1 mg/ml.

3.9 Pridobivanje končnega hidroliziranega produkta

Z namenom, da bi pridobili kvercetin kot želen končni produkt, smo zbrali celoten

hidrolizirani vzorec pridobljen s kontinuirnim postopkom pri optimalnih pogojih. Vodo, ki jo

je vsebovala vodna raztopina vzorca smo uparili na rotavaporju do stopnje, pri kateri so delci

vidno precipitirali v raztopini.

S pomočjo centrifuge smo ločili precipitirane delce in vodno fazo. Precipitirane delce smo

raztopili v znani količini metanola in tako pripravili metanolno (s kvercetinom bogato) fazo.

Določili smo tudi volumen vodne (s kvercetinom revne) faze. V obeh fazah (metanolni in

vodni fazi) smo določili vsebnost kvercetina in 5-hidroksi metil furfurala na HPLC.

Maso suhega preostanka v posamezni fazi smo določili gravimetrično. Na dve manjši

petrijevki smo ločeno odpipetirali 1 ml vodne in 1 ml metanolne faze in določili maso pred

sušenjem. Nato smo izvedli sušenje pri temperauri 120 °C. Razlika v masi pred in po 6

urnem sušenju pri temperaturi 120 °C je predstavljala maso suhega preostanka v posamezni

fazi. % kvercetina v vsaki izmed fazi smo določili po spodnji enačbi:

(3.6)

pri tem je:

γ(QU) - koncentracija kvercetina v posamezni fazi določena na HPLC (ng/μl),

m(suh pre.) - masa suhega preostanka v posamezni fazi (mg).


48

4 Rezultati in diskusija

4.1 Vplivi parametrov na izkoristek in vsebnost fenolnih spojin v

ekstraktu ptujske rdeče čebule

Izkoristek ekstrakcije smo določili kot razmerje med maso suhega ekstrakta in maso suhega

vhodnega materiala na začetku ekstrakcije po enačbi (3.1). Slika 4-1 prikazuje izkoristke

izvedenih ekstrakcij pri različnih pogojih.

Slika 4-1: Izkoristki ekstrakcij pri različnih ekstrakcijskih pogojih.

Na sliki 4-1 vidimo, da smo najvišji izkoristek pridobljenega ekstrakta, ki znaša 53,9 %,

dosegli pri ekstrakciji mlete mešanice olupka in jedilnega dela čebule z vodo pri temperaturi

95 °C. Najnižji izkoristek ekstrakcije smo določili pri ekstrakciji čebulnega olupka z 20 %

raztopino etanola, kot ekstrakcijskim medijem. Ta je pri temperaturi 80 °C znašal 9,9 %.

0

10

20

30

40

50

60

Izko

rist

ek e

kst

rakci

je (

mas

. %

)


49

Izkaže se, da uporaba samega olupka zniža izkoristek ekstrakcije. Na podlagi tega sklepamo,

da pri ekstrakciji mešanice olupka in jedilnega dela ptujske čebule z vodo eksrahiramo več

sladkorjev in ostalih komponet iz jedilnega dela čebule.

Slika 4-2 prikazuje, da smo najvišjo vsebnost totalnih fenolov (slika 4-2), ki znaša 57,7 mg/g

materiala, določili v ekstraktu čebulnega olupka pridobljenega s 35 % raztopino etanola pri

80 °C. Najmanj totalnih fenolov (6,1 mg/g materiala) vsebuje vodni ekstrakt olupka,

pridobljen pri temperaturi 60 °C.

Slika 4-2: Vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih, pridobljenih pri različnih ekstrakcijskih

pogojih.

0

10

20

30

40

50

60

mg e

kviv

alen

ta G

A/g

mat

eria

la


50

4.1.1 Vpliv uporabljenega čebulnega materiala

Iz slik 4-1 in 4-2 je razviden vpliv na izkoristek ekstrakcije in vsebnost totalnih fenolov

glede na uporabljeno mešanico zmletega olupka in jedilnega dela čebule ali samo zmletega

čebulnega olupka.

Vidimo, da pri uporabi mešanice olupka in jedilnega dela dosežemo višje izkoristke

ekstrakcije, kot pri uporabi samega olupka. Sklepamo lahko, da je to posledica visoke

vsebnosti sladkorjev v jedilnem delu čebule, ki jih voda kot polarno topilo s svojimi

specifičnimi lastnostmi lažje ekstrahira.

Ravno obratno velja za vsebnost fenolnih spojin v pridobljenih ekstraktih. Ta je namreč nižja

v ekstraktu pridobljenem iz mešanice olupka in jedilnega dela in višja v ekstraktu

pridobljenem iz olupka.

Takšno ugotovitev lahko podkrepimo z rezultati raziskave, ki poročajo, da lahko ekstrakt

čebulnega olupka vsebuje tudi od 3 do 5 krat več fenolnih spojin kot ekstrakt pridobljen iz

jedilnega dela čebule. [30] Iz tega sklepamo, da olupek vsebuje več fenolnih spojin kot

jedilni del in zato smo za pridobitev ekstrakta uporabili material zmletega čebulnega olupka.

4.1.2 Vpliv temperature

Iz slik 4-1 in 4-2 lahko sklepamo tudi o vplivu tempertaure na izkoristek in prisotnost

totalnih fenolov v ekstraktih. Ekstrakcije mešanice olupka in jedilnega dela čebule z vodo

smo izvedli pri štirih različnih temperaturah: 95 °C, 80 °C, 60 °C in 45 °C. Opazili smo, da s

padcem temperature izkoristek ekstrakcije pada. Najvišji je pri 95 °C in znaša 53,88 % in

najnižji pri 45 °C, saj znaša 33,42 %.

Podobno velja tudi za vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih. Najvišjo vsebnost totalnih

fenolov v materialu (22,5 mg/g materiala) smo določili pri temperaturi 95 °C. Najnižjo

vsebnost totalnih fenolov (6,9 mg/g materiala) pa pri ekstraktu mešanice olupka in jedilnega

dela pri temperaturi 60 °C. Iz tega sklepamo da pri višji temperaturi iz mešanice olupka in

jedelnega dela čebule ekstrahiramo več sladkorjev, kar posledično vpliva na slabšo čistost

našega želenega produkta.


51

4.1.3 Vpliv dodatka etanola k topilu

Čeprav pri ekstrakciji čebulnega olupka z vodo dosežemo nizek izkoristek ekstrakcije, ta

ekstrakt vsebuje višjo vsebnost totalnih fenolov. Z namenom, da bi ugotovili ali na vsebnost

totalnih fenolov v ekstraktu vpliva uporaba etanola kot topila, smo kot ekstrakcijsko topilo

uporabili tudi mešanico etanola in vode.

Iz slike 4-1 je razvidno, da smo pri uporabi mešanice zmletega olupka in jedilnega dela

čebule pri ekstrakcijski temperaturi 80 °C z dodatkom etanola dosegli višji izkoristek

ekstrakcije, kot tudi višjo vsebnost totalnih fenolov v ekstraktu.

Najvišjo vsebnost totalnih fenolov smo določili v ekstraktu čebulnega olupka pridobljenega s

35 % mešanico etanola (57,7 mg/g materiala). Uporaba etanola pri ekstrakciji čebulnega

olupka pri temperaturi 80 °C je vsebnost totalnih fenolnih spojin v ekstraktu skoraj

podvojila. Z veliko verjetnostjo lahko sklepamo, da etanol kot ekstrakcijsko topilo, zaradi

svoje izrazite selektivnosti izboljša izkoristek ekstrakcije in omogoča pridobitev višje

vsebnosti totalnih fenolnih spojin v čebulnem ekstraktu.

4.1.4 Izbira ekstrakta za hidrolizo in določitev vsebnosti kvercetina

Kot smo že omenili, je odločitev za izbiro ekstrakta za nadaljnje delo (kislinska hidroliza s

HCl, določitev vsebnosti kvercetina, šaržni in kontinurni proces hidrolize s subkritično vodo)

temeljila na čim višji vsebnosti totalnih fenolov.

Čeprav smo najvišjo vsebnost totalnih fenolov (57,7 mg/g materiala) določili v ekstraktu,

pridobljenem z mešanico etanola in vode, smo za delo vseeno izbrali vodni ekstrakt,

pridobljen s 2 h konvencionalno ekstrakcijo čebulnega olupka pri temperaturi 80 °C in

vsebnostjo 29,8 mg/g materiala.

Na ta način smo si olajšali nadaljno delo in preprečili težave pri raztapljanu čebulnega

ekstrakta v vodi, saj vemo, da etanolni ekstrakti niso oz. so slabše topni v vodi. Ta lastnost,

bi lahko povzročala težave pri prečrpavanju raztopine ekstrakta pri kontinuirni hidrolizi

(črpalka ni suspenzijska in prisotni delci v pretočnem fluidu bi lahko povzročili njeno

okvaro). V ta namen bi potrebovali suspenzijsko črpalko, ki ni bila na voljo pri naših

raziskavah. Poleg tega smo se tako izognili uporabi etanola in nastajanju odpadnih topil, saj


52

smo želeli raziskati prednosti uporabe vode in vodnih ekstraktov pri hidroliznem postopku s

subkritično vodo.

Samo predvidevamo lahko, da bi višji odstotek etanola v ekstrakcijskem mediju zvišal

vsebnost fenolnih spojin v ekstraktu, kako bi to posledčno vplivalo na odstotek hidrolize

tako v šaržnem kot kontinuirnem hidroliznem sistemu, pa bi bilo v prihodnosti potrebno še

dodatno raziskati.

4.2 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta s

subkritično vodo v šaržnem reaktorju

Pri postopku hidrolize vodne raztopine ekstrakta v šaržnem reaktorju smo opazovali vpliv

temperature, kontaktnega časa, izbranega plina in koncentracije uporabljene raztopine

ekstrakta na učinkovitost in izkoristek hidrotermične hidrolize. Naš cilj je bil najti optimalne

reakcijske parametre, pri katerih bi dosegli najvišji odstotek hidrolize glikozidov kvercetina.

Odstotke hidrolize smo določili na podlagi s HPLC izmerjene vsebnosti kvercetina v

posameznem vzorcu in smo jih preračunali na podlagi vrednosti določenih s kislinsko

hidrolizo vodne raztopine čebulnega ekstrakta s HCl, kjer je hidroliza potekla 100 %.


Kot smo že omenili, je temperatura pomemben parameter pri izvedbi hidroliznih reakcij s

subkritično vodo in močno vpliva na potek hidroliznega procesa. Meritve smo izvedli pri

koncentraciji raztopine ekstrakta 2 mg/ml pri naslednjih temperaturah: 180 °C, 190 °C, 195

°C, 200 °C in 210 °C. Kot inertni plin, s katerim smo v reaktorju ustvarili atmosfero pri 50

bar, smo uporabili dušik. Kontaktni čas vzorca v reaktorju je znašal 15 min.

Glede na meritve prikazane na sliki 4-3, smo eksperimentalno najvišji % hidrolize kvercetina

določili pri temperaturi 195 °C. Ta je znašal 68,9 ± 1,8 %. Najnižji odstotek hidrolize 66,6 ±

0,8 % smo določili pri temperaturi 180 °C. Glede na dosežen najvišji izkoristek hidrolize,

smo nadaljne eksperimente izvajali pri 195 °C.


53

Slika 4-3: Vpliv temperature na wkvercetina (%).

4.2.2 Vpliv kontaktnega časa

Pri raziskovanju vpliva kontaktnega časa (tk) smo opazovali, kako se spreminja % hidrolize

raztopine ekstrakta s koncentracijo 2 mg/ml pri temperaturi 195 °C in različnem kontaktnem

času: 7,5 min, 10 min, 12,5 min, 15 min in 17,5 min. Kot plin, s katerim smo v reaktorju

ustvarili inertno atmosfero pri 50 bar, smo uporabili dušik.

Slika 4-4: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%).

65

66

67

68

69

180 190 195 200 210

wk

ver

ceti

na (%

)

T (°C)

62

63

64

65

66

67

68

69

70

7,5 10 12,5 15 17,5

wk

ver

ceti

na (%

)

t k (min)


54

Iz slike 4-4 je razvidno, da smo pri kontaknem času 12,5 min dosegli maksimalni odstotek

hidrolize, ki je glede na vsebnost kvercetina znašal 69,1 ± 0,7 %.

Na podlagi te ugotovitve, smo naslednje eksperimente izvajali pri predhodno določeni

temperaturi 195 °C in kontaktnem času 12,5 min.

4.2.3 Vpliv uporabe CO2

V naslednjem koraku smo opazovali tudi vpliv izbire atmosfere, ki smo jo uporabili pri

eksperimentih za doseganje tlaka v sistemu. Pri dosedanjih eksperimentih smo uporabljali

dušik, sedaj pa smo preizkusili, kako na odstotek hidrolize glikozidov v raztopini čebulnega

ekstrakta vpliva prisotnost CO2. Eksperimente smo izvedli pri koncentraciji vzorca 2 mg/ml,

temperaturi 195 °C, kontaktnem času 12,5 min in naslednjih vrednostih tlaka v sistemu: 50

bar, 90 bar, 150 bar, 215 bar, 380 bar in 545 bar.

Iz slike 4-5 je razvidno, da smo najvišji odstotek hidrolize 76,1 ± 1,4 % določili pri

eksperimentu, kjer smo uporabili CO2 pri tlaku 380 bar. V primerjavi z uporabo dušika pri

50 bar, je uporaba CO2 pri tlaku 380 bar izboljšala odstotek hidrolize iz 69,1 ± 0,7 na 76,1 ±

1,4 %, kar izboljša izkoristek hidrolize za 7 %. Z dodatnim višanjem tlaka CO2 v sistemu

(nad 380 bar) se izkoristek hidrolize bistveno več ne spreminja, zato smo nadaljne

eksperimente izvedli pri tlaku 215 bar CO2.

Slika 4-5: Vpliv uporabe CO2 na wkvercetina (%).

64

66

68

70

72

74

76

78

50 90 150 215 380 545

wk

ver

ceti

na (%

)

P (bar)

CO2

N2


55

Prednost uporabe CO2 je v tem, da se pri povišanem tlaku in temperaturi raztaplja v vodi. Pri

tem tvori ogljikovo kislino, ki dodatno znižuje pH reakcijskega medija in tako poveča

hidrolitski potencial vode. Dušik na drugi strani je inerten in zato ne vpliva toliko na

izboljšanje hidrolitskih lastnosti vode. [31]

4.2.4 Vpliv koncentracije

V naslednjem koraku smo študirali vpliv koncentracije raztopine ekstrakta na odstotek

hidrolize. Meritve smo izvedli pri 195 °C, kontaktnem času 12,5 min, uporabi CO2 pri tlaku

215 bar in naslednjih koncentracijah vodne raztopine čebulnega ekstrakta: 0,1 mg/ml; 0,25

mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml in 2 mg/ml.

Slika 4-6: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%).

Na podlagi meritev prikazanih na sliki 4-6 vidimo, da smo najvišji odstotek hidrolize dosegli

pri koncentraciji raztopine ekstrakta 0,1 mg/ml. Ta je znašal 98,0 ± 0,8 %. Sklepamo lahko,

da z naraščujočo koncentracijo vodne raztopine ekstrakta čebulnega olupka odstotek

hidrolize pada. Najnižji je torej pri koncentraciji 2 mg/ml in znaša 75,9 ± 1,45 %.

70

75

80

85

90

95

100

0,1 0,25 0,5 1 1,5 2

wk

ver

ceti

na (%

)

γ (mg/ml)


56

4.3 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta v

kontinuirnem sistemu

Na podlagi izvedenih meritev v šaržnem reaktorju, smo določili optimalne pogoje šaržne

hidrolizne reakcije čebulnega ekstrakta s subkritično vodo. Maksimalni odstotek hidrolize

98,0 ± 0,8 % smo dosegli pri uporabi vodne raztopine čebulnega ekstrakta s koncentracijo

0,1 mg/ml, pri temperaturi 195 °C, kontaktnem času 12,5 min in uporabi CO2 pri tlaku 215

bar. Glede na te pogoje smo načrtovali kontinuirni hidrolizni sistem s fiksno dolžino

reaktorske cevi 700 mm. Spreminjali smo lahko reakcijsko temperaturo, koncentracijo

uporabljene raztopine čebulnega ekstrakta in pretok, ki je vplival na kontaktni čas reakcije.

V tem primeru nismo uporabili atmosfere CO2 v pretočnem sistemu, saj bi tako potrebovali

še eno dodatno CO2 črpalko in pretočni ventil, ki pa pri naših raziskavah nista bila na voljo.

Dejansko smo za vzpostavitev tlaka v sistemu uporabili hidrostatski tlak. Prav tako smo tudi

tukaj želeli došeči najvišji možni odstotek hidrolize.

Za doseganje stacionarnega obratovanja kontinuirnega pretočnega sistema pri izbrani

temperaturi, tlaku in pretoku je potreben določen čas zagona in ustrezna regulacija

parametrov med obratovanjem. Med potekom hidrolizne reakcije pri posamezni

koncentraciji ekstrakta smo v 3 urah na vsakih 15 minut spremljali, kako se s časom

spreminja odstotek hidrolize. Pri nobenem od izvedenih eksperimentov po 3 urah

obratovanja sistema nismo dosegli stacionarnega stanja, ampak je med obratovanjem

odstotek hidrolize pri vseh izvedenih eksperimentih nihal s časom (slika 4-7). Pri izvedbi

eksperimentov sta minimalno nihali vrednosti temperature in tlaka, saj smo ju regulirali

ročno.


57

Slika 4-7: Trend nihanja wkvercetina (%) s časom obratovanja kontinuirnega sistema glede na

koncentracijo raztopine ekstrakta.

4.3.1 Vpliv pretoka in kontaktnega časa

Pri opazovanju vpliva pretoka na hidrolizo čebulnega ekstrakta v subkritični vodi v

kontinuirnem sistemu, smo izvedli poskuse pri koncentraciji raztopine ekstrakta 0,25 mg/ml,

temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar. Reakcije smo izvedli pri različnih pretokih: 1,1

ml/min (tk= 17,5 min), 1,3 ml/min (tk= 14,9 min), 1,5 ml/min (tk= 12,9 min) in 1,7 ml/min

(tk= 11,4 min). Pri opazovanju vpliva pretoka in kontaktnega časa smo vzorec za analizo

vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirne posode po 1 h obratovanja posameznega

eksperimenta.

Iz meritev na sliki 4-8 je razvidno, da smo pri tk= 12,9 min dosegli najvišji odstotek hidrolize

58,1 ± 1,2 %. Najnižji odstotek hidrolize smo dosegli pri tk= 17,5 min. Ta je znašal 45,8 ±

1,4 %.

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

0 50 100 150 200 250 300

wk

ver

ceti

na (%

)

t (min)

0,1 mg/ml

0,25 mg/ml

0,5 mg/ml

1 mg/ml


58

Slika 4-8: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%) pri kontinuirnem procesu.

Kontaktni čas (tk), v katerem sta znotraj reaktorske cevi v stiku raztopina ekstrakta in

subkritična voda pri pretoku 1,5 ml/min, znaša 12,9 minut in je pri kontinuirnem hidroliznem

procesu daljši za 0,4 min kot v šaržnem reaktorju. Pri kontinuirnem sistemu se hidroliziran

vzorec v kriostatu (vodni hladilnik) avtomatsko ohladi na sobno (oz. še nižjo) temperaturo.

Pri šaržnem sistemu je razlika ta, da smo vzorec ohlajali ročno, tako da smo odvili izolacijski

ovoj, odstranili grelno kačo in nato avtoklav potopili v mrzlo vodno kopel. Tako smo pri

ohlajanju potrebovali nekaj dodatnega časa. Prav tako je razlika tudi pri procesu segrevanja,

saj v reaktor šaržiramo raztopino ekstrakta pri sobnih pogojih in nato segrejemo. Pri tem

poteče nekaj časa dokler se vsebina reaktorja segreje na reakcijsko temperaturo. Pri

kontinuirnem sistemu pa sta tako raztopina vzorca kot voda ki vstopata v kontakt predhodno

segreta na izbrano temperaturo eksperimenta. Na podlagi tega lahko sklepamo, da sta tako

pri šaržnem kot pri kontinuirnem hidroliznem sistemu kontaktna časa, pri katerih je dosežen

maksimalni izkoristek hidrolize, zelo podobna.

30

35

40

45

50

55

60

11,4 12,9 14,9 17,5

wk

ver

ceti

na (%

)

tk (min)


59


Pri opazovanju vpliva temperature na odstotek hidrolize v kontinuirnem sistemu smo izvajali

reakcije pri koncentraciji raztopine ekstrakta 0,25 mg/ml, tlaku 100 ± 5 bar in predhodno

določenem kontaktnem času 12,9 min. Reakcije smo izvedli pri naslednjih temperaturah:

180 °C, 190 °C, 200 °C in 210 °C. Pri opazovanju vpliva temperature smo vzorec za analizo

vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirne posode po 1 h obratovanja posameznega

eksperimenta.

Iz slike 4-9 je razvidno da smo najvišji odstotek hidrolize 53,4 ± 1,2 % dosegli pri

temperaturi 200 °C, najnižjega pa pri 180 °C 44,2 ± 0,9 %. V primerjavi s šaržnim

reaktorjem je tukaj določena optimalna temperatura, ki daje najvišji odstotek hidrolize, višja

za 5 °C.

Slika 4-9: Vpliv temperature na wkvercetina (%) pri kont. procesu.

4.3.3 Vpliv koncentracije

Pri opazovanju vpliva koncentracije na odstotek hidrolize v kontinuirnem sistemu smo

poskuse izvedli pri tk = 12,9 min, T= 200 °C, P= 100 ± 5 bar in koncentracijah 0,1 mg/ml,

0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml in 1 mg/ml. Pri opazovanju vpliva koncentracije smo vzorec za

30

35

40

45

50

55

60

180 190 200 210

wk

ver

ceti

na (%

)

T (°C)


60

analizo vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirne posode na vsakih 15 min

obratovanja posameznega eksperimenta. Kot rezultat na sliki 4-10 smo predstavili najvišji

dosežen odstotek hidrolize pri posamezni koncentraciji raztopine ekstrakta.

Iz slike 4-10 je razvidno, da smo najvišji odstotek hidrolize dosegli pri koncentraciji

ekstrakta 0,5 mg/ml. Ta je znašal 82,5 ± 1,5 %. Najnižji odstotek hidrolize 58,2 ± 2,1 % pa

smo dosegli pri koncentraciji ekstrakta 0,25 mg/ml.

Slika 4-10: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%) pri kont. procesu.

4.4 Primerjava šaržnega in kontinuirnega procesa

Če primerjamo najvišje odstotke hidrolize pri šaržnem in pri kontinuirnem procesu hidrolize

vodne raztopine čebulnega ekstrakta ugotovimo, da smo maksimalni odstotek hidrolize 98,0

± 0,8 % pri šaržnem procesu dosegli pri uporabi raztopine ekstrakta s koncentracijo 0,1

mg/ml, pri temperaturi 195 °C, tlaku 215 bar CO2 in kontaktnem času 12,5 min, medtem ko

smo pri kontinuirnem procesu hidrolize pri uporabi raztopine ekstrakta s koncentracijo 0,5

mg/ml, pri temperaturi 200 °C, hidrosatskem tlaku 100 bar in kontaktnem času 12,9 min

dosegli 82,5 ± 1,3 % hidrolizo.

15,5 % razliko med maksimalnim % hidrolize pri šaržnem in kontinuirnem procesu lahko

pripišemo temu, da nismo dosegli stacionarnega delovanja kontinuirnega sistema in tudi

50

55

60

65

70

75

80

85

0,1 0,25 0,5 1

wk

ver

ceti

na (%

)

γ (mg/ml)


61

temu da pri kontinuirnem sistemu nismo vključili atmosfere CO2. Pri izvedbi tako šaržnega

kot kontinuirnega procesa smo temperaturo in tlak v sistemu regulirali ročno in posledično

nismo dosegli dokončnega stacionarnega stanja obratovanja procesa. Z regulacijo tlaka in

temperature med samimi eksperimenti (tako šaržimi in kotinuirnimi) ni bilo večjih težav.

Peristaltična črpalka, ki je v kontinuirnem sistemu prečrpavala našo vodno raztopino

ekstrakta je črpala enakomerno v krajših presledkih, saj je bil njen pretok nastavljen na 0,2

ml/min. Iz tega razloga, znotraj reaktorske cevi, kjer sta v kontakt prišla ekstrakt in voda ni

bilo možno zagotoviti enakomernega mešanja in konstantne koncentracije vodne raztopine

vzorca. Pri šaržnih eksperimentih je bilo mešanje znotraj avtoklava zagotovljeno z

magnetnim mešalom.

Pri kontinuirnem sistemu eksperimentov nismo izvedli v atmosferi s CO2. V primeru, da bi v

sistem vključili še CO2, ki znižuje pH reakcijskega medija in tako poveča hidrolitski

potencial vode, bi verjetno dodatno izboljšali izkoristek hidrolize, tako kot se je to izkazalo

pri šaržnem procesu.

4.5 Produkti hidrotermične degradacije

Kot smo že omenili, pri procesu hidrotermičnih rekcij naravnih materialov nastajajo različni

stranski degradacijski produkti. Tako pri šaržnem kot tudi pri kontinuirnem procesu hidrolize

smo pri rezulatih HPLC analiz zasledili prisotnost različnih komponent. Kvantitativno smo

definirali prisotnost 5-hidroksi metil furfurala (5-HMF) in protokatehuične kisline (3,4-

DHBA).

4.5.1 Stranski produkti pri šaržnem postopku hidrolize

Vsebnosti stranskih produktov v ekstraktih pridobljenih s šaržnimi eksperimenti so zbrane v

spodnji tabeli (tabela 4-1). Vsebnosti 5-HMF in 3,4-DHBA v posameznem vzorcu so podane

kot mg komponente na g hidroliziranega materiala.


62

Tabela 4-1: Vsebnost stranskih produktov pri šaržnem procesu.

T (°C) tk (min) P (bar) γ vzorca (mg/ml) 5-HMF (mg/g mat.) 3,4-DHBA (mg/g mat.)

170 15 50 2,01 3,81 67,53

180 15 50 2,02 3,79 67,23

190 15 50 2,01 3,82 67,70

200 15 50 2,01 3,80 67,38

210 15 50 2,00 3,83 67,94

200 7,5 50 2,04 11,48 37,40

200 10 50 2,02 11,62 37,85

200 12,5 50 2,02 11,60 37,78

200 15 50 2,02 11,65 37,93

200 17,5 50 2,03 11,61 37,80

200 12,5 50 2,06 18,34 4,27

200 12,5 90 2,01 18,75 4,36

200 12,5 150 2,04 18,52 4,31

200 12,5 215 2,02 18,72 4,36

200 12,5 380 2,06 18,28 4,25

200 12,5 545 2,04 18,50 4,31

200 12,5 215 2,02 27,48 2,67

200 12,5 215 1,52 36,52 3,56

200 12,5 215 1,02 54,24 5,27

200 12,5 215 0,53 105,08 10,21

200 12,5 215 0,29 191,29 18,57

200 12,5 215 0,28 201,74 19,59

200 12,5 215 0,11 498,90 48,43

200 12,5 215 0,11 501,15 48,65

200 12,5 215 0,11 522,03 50,68

Iz tabele 4-1 je razvidno, da sta tako 5-HMF kot tudi 3,4-DHBA prisotna v vseh šaržno

hidroliziranih vzorcih, pri vseh obratovalnih pogojih. Najvišjo vsebnost 5-HMF smo

analizirali pri koncentraciji vzorca 0,1 mg/ml, temperaturi 200 °C, tlaku 215 bar (CO2) in

kontaktnem času 12,5 minut. Ta je znašala 522 mg/g mat. Najvišjo vsebnost 3,4- DHBA smo

določili pri koncentraciji vzorca 2 mg/ml, temperaturi 210 °C, tlaku 50 bar (N2) in

kontaktnem času 15 minut. Ta je znašala 67,94 mg/g mat.

Določili smo kar visoke vsebnosti 5-HMF v hidroliziranih vzorcih. Ker ekstrakt vsebuje

ogromne količine sladkorjev, so rezultati tudi pričakovani. Vendar prisotnost 5-HMF ni

zaželjena iz vidika prehrambene industrije, saj ponazarja kvarjenje živil in je strupen.


63

4.5.2 Stranski produkti pri kontinuirnem procesu hidrolize

Vsebnosti stranskih produktov v ekstraktih pridobljenih s kontinuirnim sistemom smo zbrali

v spodnji tabeli 4-2. Vsebnosti 5-HMF in 3,4-DHBA v posameznem vzorcu smo preračunali

kot mg komponente na g hidroliziranega materiala.

Tabela 4-2: Vsebnost stranskih produktov pri kont. procesu.

tk (min) γ (mg/ml) 5-HMF

(mg/g mat.)

3,4-DHBA

(mg/g mat.)

0 0,1 / /

15 0,1 / /

30 0,1 / /

45 0,1 / /

60 0,1 / /

75 0,1 / /

90 0,1 / /

105 0,1 / /

120 0,1 / /

135 0,1 / /

150 0,1 / /

165 0,1 / /

180 0,1 / /

195 0,1 / /

210 0,1 / /

225 0,1 / /

240 0,1 / /

0 0,25 / 47,51

15 0,25 / 52,98

30 0,25 / 54,24

45 0,25 / 58,87

60 0,25 / 47,65

75 0,25 / 44,52

90 0,25 / 57,33

105 0,25 / 46,95

120 0,25 / 59,16

135 0,25 / 62,36

150 0,25 / 33,68

165 0,25 / 62,25

180 0,25 / 62,40

195 0,25 / 60,53

210 0,25 / 65,43

225 0,25 / 64,14

240 0,25 / 31,58

0 0,5 / 43,17

15 0,5 / 29,86


64

30 0,5 / 22,43

45 0,5 / 29,34

60 0,5 / 17,41

75 0,5 / 33,35

90 0,5 / 19,10

105 0,5 / 41,09

120 0,5 / 47,87

135 0,5 / 32,93

150 0,5 / 42,58

165 0,5 / 36,10

180 0,5 / 40,10

195 0,5 / 39,26

210 0,5 / 40,56

225 0,5 / 31,75

240 0,5 / 27,18

0 1 / 9,61

15 1 2,66 17,36

30 1 3,54 18,91

45 1 3,43 20,28

60 1 3,60 19,27

75 1 3,61 17,78

90 1 3,85 17,99

105 1 4,38 18,20

120 1 4,57 17,23

135 1 4,17 16,97

150 1 3,34 14,81

165 1 2,67 15,15

180 1 2,25 12,74

195 1 / 12,16

Iz tabele 4-2 je razvidno, da smo vsebnost 5-HMF pri kontinuirnem eksperimentu določili le

v hidrolizirani vodni raztopini čebulnega ekstrakta s koncentracijo 1 mg/ml. 2,3-DHBA je

kot stranski produkt identificiran pri hidroliziranih vzorcih s koncentracijo ekstrakta: 0,25

mg/ml, 0,5 mg/ml in 1 mg/ml. Najvišjo vsebnost 5-HMF pri kontinurnem procesu hidrolize

smo zasledili pri koncentraciji vzorca 1 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar. Ta

je znašala 4,57 mg/g mat. Najvišjo vsebnost 3,4-DHBA pri kontinuirnem procesu hidrolize

smo analizirali pri koncentraciji vzorca 0,25 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar.

Ta je znašala 65,43 mg/g mat.


65

4.6 Končni hidroliziran produkt

Kot naš končni hidroliziran produkt, smo pri kontinuirnem eksperimentu s koncentracijo 0,5

mg/ml zbrali celoten hidrolizirani vzorec (250 ml) in uparili 90 ml topila. S tem smo produkt

koncentrirali do stopnje, pri kateri so delci vidno precipitirali v raztopini (slika 4-11 a in b).

S centrifugo smo ločili delce in vodno fazo. Delce smo nato raztopili v metanolu ter vodno

in metanolno fazo analizirali glede na vsebnost kvercetina. Maso suhega preostanka v

posamezni fazi smo določili gravimetrično s sušenjem. Rezultati določanja vsebnosti

kvercetina v posamezni fazi so prikazani v tabeli 4-3.

Tabela 4-3: Rezultati gravimetričnega določanja vsebnosti kvercetina.

Metanolna

faza

Vodna

faza

m (suh pre.) (mg) 1270 1240

γ (QU) (ng/μl) 678,38 16,29

w kvercetina 53,42 1,31

5-HMF (mg/g mat.) / 23,62

Po HPLC analizi obeh faz se je izkazalo, da suh preostanek metanolne faze vsebuje 53,4 %

kvercetina, suh preostanek vodne faze pa le 1,3 % kvercetina (enačba 3.5). Takšen rezultat

lahko utemeljimo z dejstvom, da je kvercetin komponenta, ki je dobro topna v metanolu in le

v sledovih topna v vodi. Vidimo tudi, da smo pri tem od metanolne (s kvercetinom bogate

faze) odstranili neželeni 5-HMF.

Slika 4-11: a) Raztopina hidroliziranega vzorca pred in po uparjanju, b) precipitirani delci

kvercetina ob steni bučke.


66

5 Zaključek

Pri nastanku magistrskega dela smo izvedli študijo možnosti uporabe subkritične vode kot

hidroliznega medija za selektivno razgradnjo glikozidno vezanih antioksidantov v

konvencionalno ekstrahiranem ekstraktu ptujske rdeče čebule. Ekstraktu smo določili

vsebnost totalnih fenolov s Folin-Ciocalteu metodo. Prav tako smo izvedli hidrolizo

ekstrakta po postopku kislinske hidrolize s HCl in s tem določili maksimalno vsebnost

kvercetina. Preučevali smo vpliv parametrov (temperatura, tlak, uporabljena vrsta plina v

avtoklavu, kontaktni čas in koncentracija raztopine ekstrakta) na izkoristek hidrolize s

subkritično vodo v šaržnem in kontinuirnem reaktorju. Na ta način smo želeli razviti proces

hidrotermične hidrolize s subkritično vodo brez uporabe korozivnih kislin. Kvalitativno in

kvantitativno vsebnost kvercetina v hidroliziranih vzorcih smo določili s HPLC analizo.

Ugotovili smo, da je bil najvišji izkoristek ekstrakcije dosežen pri uporabi zmlete mešanice

olupka in jedilnega dela čebule z vodo pri temperaturi 95 °C. Znašal je 53,9 %. Najnižji

izkoristek ekstrakcije smo določili pri ekstrakciji čebulnega olupka s 20 % raztopino etanola.

Ta je pri temperaturi 80°C znašal 9,9 %.

Najvišjo vsebnost totalnih fenolov (57,7 mg/g materiala) smo določili v ekstraktu čebulnega

olupka pridobljenega s 35 % mešanico etanol-voda. Dodatek etanola je vsebnost fenolnih

spojin v ekstraktu čebulnega olupka skoraj podvojil. Kljub nižji vsebnosti totalnih fenolnih

spojin smo za nadaljne eksperimente s subkritično vodo uporabili vodni ekstrakt, ki je

vseboval 29,8 mg ekvivalenta GA/g materiala.

Najvišji odstotek hidrolize smo dosegli s šaržnim postopkom pri eksperimentalno optimalno

določenih pogojih: 195 °C, kontaktnem času 12,5 min, uporabi CO2 pri tlaku 215 bar in

koncentraciji vodne raztopine ekstrakta 0,1 mg/ml. Ta je znašal 98,0 ± 0,8 %.

Najvišji odstotek hidrolize glukozidov kvercetina s kontinuirnim procesom smo dosegli pri

temperaturi 200 °C, tlaku 100 ± 5 bar in koncentraciji raztopine ekstrakta 0,5 mg/ml. Ta je

znašal 82,5 %.

HPLC analize so pokazale, da poleg ostalih, neznanih stranskih produktov, kot stranska

produkta med postopkom hidrolizne reakcije nastajata 5-hidroksi metil furfural in 3,4-

dihidroksi benzojska kislina. Najvišjo vrednost 5-HMF pri šaržnem procesu (522,03 mg/g

materiala) smo določili pri koncentraciji vzorca 0,1 mg/ml, temperaturi 200 °C, tlaku 215

bar (CO2) in kontaktnem času 12,5 minut. Najvišjo vrednost 3,4-DHBA pa smo določili pri


67

koncentraciji vzorca 2 mg/ml, temperaturi 210 °C, tlaku 50 bar (N2) in kontaktnem času 15

minut in je znašala 67,94 mg/g materiala. Pri kontinurnem procesu hidrolize smo najvišjo

vsebnost 5-HMF določili pri koncentraciji vzorca 1 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100

± 5 bar. Ta je znašala 4,57 mg/g materiala.

Najvišjo vsebnost 3,4-DHBA pri kontinuirnem procesu hidrolize pa pri koncentraciji vzorca

0,25 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar in je znašala 65,43 mg/g materiala.

Na podlagi šaržno in kontinuirno izvedenih meritev opazimo, da s kontinuirnim

obratovanjem hidrolize s subkritično vodo, zmanjšamo nastanek strupenega 5-HMF.

Pri gravimetričnem določanju prisotnosti čistega kvercetina v kontinuirno hidroliziranem

vzorcu s koncentracijo 0,5 mg/ml se je izkazalo, da suh preostanek metanolne faze (s

kvercetinom bogate faze) vsebuje 53,4 % kvercetina in ne vsebuje 5-HMF, suh preostanek

vodne faze (s kvercetinom revne faze) pa le 1,3 % kvercetina.

Magistrsko delo bi v prihodnosti lahko nadgradili in dopolnili tako, da bi izvedli dodatne

HPLC analize ostalih komponent, ki nastanejo kot stranski produkt hidroliznih reakcij s

subkritično vodo. Glede na to, da pri kontinuirnem procesu nismo dosegli stacionarnega

stanja hidrolize, bi morali posamezni eksperiment izvajati dlje časa, dovršiti regulacijo

parametrov (predvsem tlaka in temperature) in zagotoviti suspenzijsko črpalko, ki bi

omogačala enakomerno črpanje vzorca ekstrakta skozi sistem. Za šaržni in kontinuirni

postopek hidrolize bi lahko poskusili uporabiti tudi etanolni ekstrakt, saj vsebuje višjo

vsebnost totalnih fenolov. Na podlagi tega sklepamo, da bi na ta način lahko izboljšali

pridobljeno količino kvercetina iz hidroliziranega vzorca. Dodatno izboljšanje odstotka

hidrolize pri kontinuirnem sistemu bi najvrjetneje dosegli tudi z uporabo CO2 v sistemu.


68

6 Literatura

[1] Laura Jaime, Esperanza Molaa, Almudena Fernandez, Maria A. Martin-Cabrejas,

Fracisco J. Loapez-Andreau, Androsa M. Esteban. Structural Carbohydrate

Differences and Potential Source of Dietary Fiber of Onion (Allium cepa L.) Tissues.

J. Agric. Food Chem. 50, 122-128, 2002.

[2] Feridoun Salak, Somayeh Daneshvar, Jalal Abedi, Koji Furukawa. Adding value to

onion (Allium cepa L.) waste by subcritical water treatment. Fuel Processing

Technology. 112, 86–92, 2013.

[3] Keerthi Srinivas, Jerry W. King, Luke R. Howard, Jeana K. Monrad. Solubility and

solution thermodynamic properties of quercetin and quercetin dihydrate in subcritical

water. Journal of Food Engineering. 100, 208–218, 2010

[4] Wahyudiono, Siti Machmudah and Motonobu Gotol. Utilization of Sub and

Supercritical Water Reactions in Resource Recovery of Biomass Wastes.

ENGINEERING JOURNAL. 17, Issue 1, 2013.

[5] http://www.ptujski-luk.si/slovenska-avtohtona-sorta.html (dostop 29.6.2015)

[6] http://www.deloindom.si/vrt-zivali/sejem-agra-o-slovenski-cebuli-cesnu(dostop

15.5.2015)

[7] http://www.mko.gov.si/fileadmin/mko.gov.si/pageuploads/podrocja/Varna_in_kakovo

stna_hrana_in_krma/zasciteni_kmetijski_pridelki/Specifikacije/PTUJSKI_LUK_01

dostop 2.7.2015)

[8] http://www.herballegacy.com/Wilson_Chemical.html (dostop 6.7.2015)

[9] Nagendran Balasundrama, Kalyana Sundramb, Samir Sammana. Phenolic compounds

in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and

potential uses. Food Chemistry. 99, 191–203, 2006.

[10] Alexandra B. Bentz. A Review of Quercetin: Chemistry, Antioxidant Properties, and

Bioavailability. Journal of jung investigators. 2009.

[11] Wei Zheng, Shiow Y. Wang. Antioxidant Activity and Phenolic Compounds in

Selected Herb. J. Agric. Food Chem. 49, 5165−5170, 2001.

[12] http://www.jyi.org/issue/a-review-of-quercetin-chemistry-antioxidant-properties-and-

bioavailability/ (dostop 10.7.2015)

[13] Min-Jung Koa, Chan-Ick Cheigha, Sang-Woo Choa, Myong-Soo Chunga. Subcritical

water extraction of flavonol quercetin from onion skin, Journal of Food Engineering

102, 327–333, 2011.

[14] Irena Pavlovič, Željko Knez, Mojca Škerget. H drothermal Reactions of Agricultural

and Food Processing Wastes in Sub- and Supercritical Water: A Review of

Fundamentals, Mechanisms, and State of Research. J. Agric Food Chem. 2013.

[15] A. Shitu, S. Izhar, T. M. Tahir. Sub-critical water as a green solvent for production of

valuable materials from agricultural waste biomass. A review of recent work. Global

Journal of Environmental Science and Managment. 1, 255-264, 2015.

[16] A. A. Peterson, F. Vogel, R.P. Lachance, M. Frohling, M.J.Antal, J. W. Tester:

Thermochemical biofuel production in hydrothermal media; A reviu of sub- and

supercritical water tehnologies. Energy and Enviromental Science. Issue 1, 2008.

[17] Matej Ravber, Željko Knez, Mojca Škerget. Optimization of h drol sis of rutin in

subcritical water using responsesurface methodology. The Journal of Supercritical

Fluids. 2015

http://www.ptujski-luk.si/slovenska-avtohtona-sorta.html

http://www.deloindom.si/vrt-zivali/sejem-agra-o-slovenski-cebuli-cesnu

http://www.mko.gov.si/fileadmin/mko.gov.si/pageuploads/podrocja/Varna_in_kakovostna_hrana_in_krma/zasciteni_kmetijski_pridelki/Specifikacije/PTUJSKI_LUK_01.pdf

http://www.mko.gov.si/fileadmin/mko.gov.si/pageuploads/podrocja/Varna_in_kakovostna_hrana_in_krma/zasciteni_kmetijski_pridelki/Specifikacije/PTUJSKI_LUK_01.pdf

http://www.herballegacy.com/Wilson_Chemical.html


69

[18] Nermin Simsek Kus, Organic reactions in subcritical and supercritical water,

Tetrahedron 68 (2012), str. 949-958

[19] Željko Knez, Mojca Škerget. Termodifuzijski separacijski procesi. Fakulteta za

kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, Maribor, 2006.

[20] R. Boopathy, H. Bokang, L. Daniel. Biotransformation of furfural and 5-

hydroxymethyl furfural by enteric bacteria. Journal of Industrial Microbiology. 11,

147-150, 1993.

[21] https://sl.wikipedia.org/wiki/Hidroksimetilfurfural (dostop 20.1.2016)

[22] Suzan Zein ALabdeen Makawi, Mohammed Idrees Tah.a, Badawi Ahmed Zakaria,

.Babeker Siddig, Hazeim Mahmod, Abedel Rahim Mohamed Elhussein, Elrasheed

Ahmed Gad Kariem. Identification and Quantification of 5-Hydroxymethyl Furfural

H) MF in Some Sugar-Containing Food Products by HPLC. Pakistan Journal of

Nutrition. 8, 1391-1396, 2009

[23] Beatrice Kaufmann and Philippe Christen. Recent Extraction Techniques for Natural

Products: Microwave-assisted Extraction and Pressurised Solvent Extraction.

[24] Željko Knez, Mojca Škerget. Termodifuzijski separacijski procesi. Fakulteta za kemijo

in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, Maribor, 2006.

[25] Jin Dai, Russell J. Mumper. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their

Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules. 15, 7313-7352, 2010.

[26] www.weizmann.ac.il/g-chem/.../continious%20batch.do...(dostop 5.2.2016)

[27] Zorka Novak Pintarič, Načrtovanje in integracija procesov, zbrano gradivo za predmet

Načrtovanje procesov, Maribor 2013

[28] M. Škerget, K. Makovšek, T. Perko, Osnove tehnologije živilskih izdelkov, navodila

za vaje, Maribor, 2012

[29] Andressa Blainski, Gisel Cristin Lopes and João Carlos Palazzo de Mello.

Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the

Total Phenolic Content from Limonium Brasiliense. Molecules. 18, 6852-6865, 2013.

[30] M. Škerget, L.Majhenič, M. Bezjak, Ž. Knez. Antioxidant, Radical Scavenging and

Antimicrobial Activities of red onion (Allium cepa L) Skin and Edible Part Extracts.

Chem. Biochem. Eng. 435-444, 2009.

https://sl.wikipedia.org/wiki/Hidroksimetilfurfural

http://www.weizmann.ac.il/g-chem/.../continious%20batch.do...(dostop


70

7 Priloge

7.1 Umeritvena krivulja z GA

Slika 7-1: Umeritvena krivulja z GA za določitev totalnih fenolov.

7.2 HPLC kromatogrami

Slika 7-2: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 15 min, N2.

Abs = 9,9312γ + 0,0113

R² = 0,9988

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08

Abs

(AU

)

γ (mg/ml)


71

Slika 7-3: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, N2.

Slika 7-4: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, CO2.


72

Slika 7-5: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 0,1 mg/ml, 195 °C, 12,5 min,

CO2.


min, 96 bar.


73


min, 97 bar.


min, 98 bar.


74

7.3 Trendi nihanja % hidrolize med obratovanjem kontinuirnega

sistema

Slika 7-9: Nihanje wkvercetina (%) s časom pri koncentraciji 0,1 mg/ml.


20

25

30

35

40

45

50

55

60

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

wk

ver

ceti

na (%

)

t (min)

20

30

40

50

60

70

80

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

wk

ver

ceti

na (%

)

t (min)


75


Slika 7-12: Nihanje wkvercetina (%) s časom pri koncentraciji 1 mg/ml.

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

wk

ver

ceti

na (%

)

t (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250

wk

ver

ceti

na (%

)

t (min)


76

8 Življenjepis

OSEBNI PODATKI:

Ime in priimek: Jožica Ulčnik

Naslov: Zagaj 24, 3256 Bistrica ob Sotli

Spol: ženski

Datum rojstva: 27. 5. 1991

Kraj rojstva: Brežice

Državljanstvo: slovensko

Kontaktna št.: 031/868-613

E-mail: [email protected]

IZOBRAZBA:

Fakulteta

Leto: 2013- (predvidoma) 2016

Naziv šole: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor

Smer/Program: kemijska tehnika, univerzitetni magistrski program

(Pridobljeni naziv: magistra inženirka kemijske tehnike (UN))

Leto: 2010- 2013

Naziv šole: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor

Smer/Program: kemijska tehnologija, univerzitetni program

Pridobljeni naziv: diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN)

Srednja šola

Leto: 2006-2010

Naziv šole: Škofijska gimnazija Antona Martina Slomška Maribor

Smer/Program: klasična gimnazija

Pridobljeni naziv: gimnazijski maturant

Osnovna šola

Leto:1998-2006

Naziv šole: Osnovna šola Bistrica ob Sotli


77

DELOVNE IZKUŠNJE:

Leto (od-do): 9.6.-21.7.2013

Podjetje: Krka d.d., Šmarješka cesta 6, 8501 Novo mesto

Delovno mesto: ORSM

Delovne naloge:

- Opravljanje delovne prakse

Leto (od-do): 1.6.-19.7.2014


Delovno mesto: ORSM

Delovne naloge:

- Opravljanje delovne prakse

Leto (od-do): 16.11.2015 -


Delovno mesto: LOA

Delovne naloge:

- Študenstko delo- tehnik v laboratoriju

ZNANJE JEZIKOV (1 - SLABO, 5 - ODLIČNO):

JEZIK GOVORNO PISNO RAZUMEVANJE

slovenski 5 5 5

hrvaški 4 4 4

nemški 3 3 4

angleški 4 4 4

RAČUNALNIŠKA ZNANJA (1 - SLABO, 5 - ODLIČNO):

Word 5

Excel 5

PowerPoint 5

internet 5

e- pošta 5

MOJE KOMPETENCE:

- komunikativnost,

- hitra prilagodljivost,

- samostojnost pri delu,

- odgovornost,

- kreativnost

- natančnost,

- organizacijske sposobnosti,

- sposobnost pomagati drugim ljudem oz. sodelavcem,

- vztrajnost,

- potrpežljivost,

- vozniško dovoljenje B kategorije


78

hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v …

Documents