Magistrsko delo
HIDROLIZA GLIKOZIDNO VEZANIH
ANTIOKSIDANTOV V ČEBULNEM
EKSTRAKTU S SUBRKRITIČNO VODO
Julij, 2016 Jožica Ulčnik
Jožica Ulčnik
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v
čebulnem ekstraktu s subkritčno vodo
Magistrsko delo
Maribor, 2016
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v
čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje
Študentka: Jožica Ulčnik
Študijski program: magistrski študijski program II. stopnje Kemijska
tehnika
Predvideni strokovni naslov: magistrica inženirka kemijske tehnike
Mentor: red. prof. dr. Mojca Škerget
Somentor: red. prof. dr. Željko Knez
Maribor, 2016
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
1
Kazalo
Kazalo ....................................................................................................................................... 1
Izjava......................................................................................................................................... 4
Zahvala ..................................................................................................................................... 6
Abstract ..................................................................................................................................... 8
Seznam tabel ............................................................................................................................. 9
Seznam slik ............................................................................................................................. 10
Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ 12
Uporabljene kratice ................................................................................................................. 13
1 Uvod ................................................................................................................................ 14
1.1 Opredelitev problema in pregled literature .............................................................. 14
1.2 Namen, hipoteze in cilji ........................................................................................... 15
2 Teoretični del ................................................................................................................... 17
2.1 Ptujska čebula .......................................................................................................... 17
2.1.1 Kemijska sestava čebule ................................................................................... 18
2.2 Fenolne spojine in njihovo antioksidativno delovanje ............................................. 19
2.2.1 Flavonoidi ......................................................................................................... 20
2.2.2 Antioksidativna aktivnost ................................................................................. 21
2.2.3 Kvercetin........................................................................................................... 22
2.3 Lastnosti subkritične vode ....................................................................................... 25
2.3.1 Dielektrična konstanta ...................................................................................... 27
2.3.2 Ionski produkt ................................................................................................... 27
2.4 Hidroliza in hidrotermični procesi ........................................................................... 28
2.4.1 Hidroliza ........................................................................................................... 28
2.4.2 Hidrotermični procesi ....................................................................................... 29
2.4.3 Razpadni produkti hidrotermične degradacije kvercetina ................................ 30
2.5 Konvencionalna ekstrakcija ..................................................................................... 31
2.6 Šaržni in kontinuirni procesi .................................................................................... 33
3 Eksperimentalni del in metode dela ................................................................................ 36
3.1 Kemikalije, pribor, aparature ................................................................................... 36
3.2 Priprava materiala .................................................................................................... 37
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
2
3.3 Ekstrakcija materiala ................................................................................................ 38
3.4 Določitev totalnih fenolov ........................................................................................ 39
3.4.1 Umeritvena krivulja z galno kislino .................................................................. 39
3.4.2 Vsebnost totalnih fenolov v vzorcu .................................................................. 40
3.5 Kislinska hidroliza čebulnega ekstrakta ................................................................... 41
3.6 HPLC analiza kvercetina .......................................................................................... 41
3.7 Šaržna hidroliza vzorca s subkritično vodo .............................................................. 42
3.8 Kontinuirna hidroliza vzorca s subrkritično vodo .................................................... 44
3.9 Pridobivanje končnega hidroliziranega produkta ..................................................... 47
4 Rezultati in diskusija........................................................................................................ 48
4.1 Vplivi parametrov na izkoristek in vsebnost fenolnih spojin v ekstraktu ptujske
rdeče čebule ......................................................................................................................... 48
4.1.1 Vpliv uporabljenega čebulnega materiala ......................................................... 50
4.1.2 Vpliv temperature ............................................................................................. 50
4.1.3 Vpliv dodatka etanola k topilu .......................................................................... 51
4.1.4 Izbira ekstrakta za hidrolizo in določitev vsebnosti kvercetina ........................ 51
4.2 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta s subkritično vodo
v šaržnem reaktorju ............................................................................................................. 52
4.2.1 Vpliv temperature ............................................................................................. 52
4.2.2 Vpliv kontaktnega časa ..................................................................................... 53
4.2.3 Vpliv uporabe CO2 ............................................................................................ 54
4.2.4 Vpliv koncentracije ........................................................................................... 55
4.3 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta v kontinuirnem
sistemu ................................................................................................................................. 56
4.3.1 Vpliv pretoka in kontaktnega časa .................................................................... 57
4.3.2 Vpliv temperature ............................................................................................. 59
4.3.3 Vpliv koncentracije ........................................................................................... 59
4.4 Primerjava šaržnega in kontinuirnega procesa ......................................................... 60
4.5 Produkti hidrotermične degradacije ......................................................................... 61
4.5.1 Stranski produkti pri šaržnem postopku hidrolize ............................................ 61
4.5.2 Stranski produkti pri kontinuirnem procesu hidrolize ...................................... 63
4.6 Končni hidroliziran produkt ..................................................................................... 65
5 Zaključek ......................................................................................................................... 66
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
3
6 Literatura ......................................................................................................................... 68
7 Priloge ............................................................................................................................. 70
7.1 Umeritvena krivulja z GA ........................................................................................ 70
7.2 HPLC kromatogrami ................................................................................................ 70
7.3 Trendi nihanja % hidrolize med obratovanjem kontinuirnega sistema.................... 74
8 Življenjepis ...................................................................................................................... 76
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
4
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni.
Pregledala sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih:
Vir: ScienceDirect (http://www.sciencedirect.com/)
Gesla: Število referenc
Phenolic compounds in onion 3 459
Properties of subcritical water 18 149
Quercetin 26 009
Flavonoids in dry materials 30 255
Conventional extraction of onion peels 502
Batch and continuos hydrolysis 65
5-hydroxymethylfurfural 7 268
Vir: Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)
Gesla: Število referenc
Phenolic compounds in onion 59
Properties of subcritical water 53
Quercetin 12 828
Flavonoids in dry materials 57
Conventional extraction 7 347
5-hydroxymethylfurfural 217
Vir: American Chemical Society - ACS (http://www.acs.org)
Gesla: Število referenc
Phenolic compounds 75
Properties of subcritical water 5
Quercetin 17
Flavonoids in dry materials 9
Conventional extraction 96
Batch hydrolysis 22
5-hydroxymethylfurfural 7 268
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
5
Vir: Google Scholar, Google Books (http://scholar.google.si/,http://books.google.com/)
Gesla: Število referenc
Phenolic compounds in onion 29 500
Properties of subcritical water 70 300
Quercetin 107 000
Flavonoids in dry materials 128 000
Conventional extraction of onion 36 100
Batch hydrolysis 32 800
5-hydroxymethylfurfural 6 000
Skupno število pregledanih člankov: 48
Skupno število pregledanih knjig: 5
Maribor, julij 2016 Jožica Ulčnik
_____________
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
6
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici, red. prof. dr. Mojci Škerget, za
vodenje, strokovno pomoč in nasvete pri opravljanju
magistrskega dela. Zahvaljujem se tudi somentorju red. prof. dr.
Željku Knezu.
Veliko zahvalo namenjam dipl. ing. kem. teh. Mateju Ravberju
za vso pomoč pri delu v laboratoriju, nasvete in posvečen čas
pri pisanju in oblikovanju moje magistrske naloge. Zahvaljujem
se tudi celotnemu kolektivu Laboratorija za spearacijske
procese in produktno tehniko.
Posebna zahvala gre tudi moji družini, ki mi je v času študija
vedno stala ob strani v vseh dobrih in slabih trenutkih, me
spodbujala in verjela vame.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
7
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s
subkritično vodo
Povzetek
Magistrsko delo prikazuje študijo možnosti uporabe subkritične vode kot hidroliznega
medija za selektivno razgradnjo glikozidno vezanih antioksidantov v ekstraktu rdeče ptujske
čebule. Iz neizkoriščenih čebulnih olupkov smo želeli pridobiti kvercetin, kot produkt z
visoko dodano vrednostjo.
S pomočjo konvencionalne ekstrakcije čebulnih olupkov smo pridobili čebulni ekstrakt, le-
temu smo določili vsebnost totalnih fenolov v ekstraktu s Folin-Ciocalteu metodo. Ekstrakt
smo hidrolizirali po postopku kislinske hidrolize s HCl in s tem določili vsebnost totalnega
kvercetina v ekstraktu. Preučevali smo vpliv parametrov (temperatura, tlak in uporabljena
vrsta plina v avtoklavu, kontaktni čas in koncentracija raztopine ekstrakta) na izkoristek
hidrolize s subkritično vodo v šaržnem reaktorju. Na podlagi optimalnih pogojev v šaržnem
reaktorju smo izvedli kontinuirno hidrolizo ekstrakta s subkritično vodo. Kvalitativno in
kvantitativno vsebnost kvercetina v hidroliziranih vzorcih smo določili s HPLC analizo.
Rezultati kažejo, da smo najvišji izkoristek ekstrakcije dosegli pri ekstrakciji zmlete
mešanice olupka in jedilnega dela čebule z vodo pri temperaturi 95 °C. Najvišjo vsebnost
totalnih fenolov smo določili v ekstraktu čebulnega olupka, pridobljenega s 35 % raztopino
etanola pri 80 °C. Najvišji odstotek hidrolize smo s šaržnim procesom dosegli pri 195 °C,
kontaktnem času 12,5 min, uporabi CO2 pri tlaku 215 bar in koncentraciji raztopine ekstrakta
0,1 mg/ml. Na podlagi rezultatov HPLC meritev sklepamo, da pri šaržnem procesu, z
naraščajočo koncentracijo vodne raztopine čebulnega ekstrakta odstotek hidrolize pada.
Najvišji odstotek hidrolize pri kontinuirnem procesu smo dosegli pri temperaturi 200 °C,
tlaku 102 bar, kontaktnem času 12,9 min in koncentraciji raztopine ekstrakta 0,5 mg/ml.
HPLC analiza je pokazala, da kot stranska produkta med potekom hidrolizne reakcije poleg
ostalih komponent nastajata 3,4-dihidroksi benzojska kislina in 5-hidroksi metil furfural, ki
ga lahko zaradi razlik v topnosti v vodi separiramo od kvercetina.
Ključne besede: olupki rdeče čebule, glikozidi, hidroliza, subkritična voda, kvercetin
UDK: 66.094.941:635.25(043.2)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
8
Hydrolysis of glycoside bounded antioxidants in onion extract with
subcritical water
Abstract
This master thesis describes the possible usage of subcritical water as hydrolysis medium for
selective decomposition of glycoside bounded antioxidants in red onion peel extract. The
main intention was to obtain quercetin from unused red onion peels as a material with added
value.
Convencional extraction of onion peels enabled us to obtain the onion peel extract. The
content of total phenols in the extract was determinated with the Folin-Ciocalteu reagent.
The extract was hydrolyzed according to the procedure of acid hydrolysis with HCl and the
total amount of quercetin in the extract was determined. We studied the effect of reaction
parameters (temperature, pressure and type of gas in autoclave, contact time and
concentration of extract solution) on efficiency of hydrolysis with subcritical water in batch
reactor. Using optimal conditions in the batch reactor, continuous hydrolysis of extract with
subcritical water was performed. Qualitative and quantitative content of quercetin in
hydrolysed samples was determined with HPLC analysis.
Results show that the highest amount of extract was acquired when the grinded mixture of
peels and eadible part of onion was extracted by water at a temperature of 95 °C. The highest
content of total phenols was determined in extract of onion peels that was obtained with a 35
% ethanol solution at 80 °C. The highest percentage of hydrolysis performed in batch
process was achieved at 195 °C, at a contact time of 12.5 minutes, using CO2 at a pressure of
215 bar and a concentration of extract solution of 0.1 mg/ml. Based on results of HPLC
measurements we can conclude that the percentage of hydrolysis in batch process is
decreasing by increasing concentration of water solution of onion extract. The highest
percentage of hydrolysis performed in continuous mode was achieved at a temperature of
200 °C, pressure of 102 bar, treatment time of 12.5 min and 0.5 mg/ml concentration of
extract solution.
HPLC analysis indicated that during the hydrolysis reaction, 5-hydroxymethylfurfural and
3,4-dihydroxybenzoic acid are produced as side products, however 5-HMF could be
separated from quercetin, due to differences in solubility in water.
Key words: red onion peel, glycosides, hydrolysis, subcritical water, quercetin
UDK: 66.094.941:635.25(043.2)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
9
Seznam tabel
Tabela 2-1: Sestava jedilnega dela čebule. ............................................................................. 18
Tabela 2-2: Razredi fenolnih spojin. ...................................................................................... 19
Tabela 2-3: Nekatere fizikalne in kemijske lastnosti vode in pare pri različnih temperaturah
in tlakih. .................................................................................................................................. 26
Tabela 2-4: Lastnosti šaržnega in kontinuirnega procesa. [26] .............................................. 34
Tabela 3-1: Gradient mobilne faze B v %. ............................................................................. 42
Tabela 4-1: Vsebnost stranskih produktov pri šaržnem procesu. .......................................... 62
Tabela 4-2: Vsebnost stranskih produktov pri kont. procesu. ................................................ 63
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
10
Seznam slik
Slika 2-1: a) Zaščitena geografska označba; b) venec ptujske čebule. ................................... 17
Slika 2-2: Fenol z odprtim ogljikovim mostom. ..................................................................... 20
Slika 2-3: Ogljikov most vključen v obroč C. ........................................................................ 20
Slika 2-4: Shema delovanja antioksidanta. ............................................................................. 22
Slika 2-5: Molekula kvercetina. .............................................................................................. 23
Slika 2-6: Glukozidi kvercetina: a) kvercetin-3-Q-β-glikozid, b) kvercetin-4-Q-glikozid, c)
kvercetin 7-O-β-D-glikozid, d) kvercetin-3,4'-diglikozid. ...................................................... 24
Slika 2-7: Fazni diagram vode. ............................................................................................... 25
Slika 2-8: Dielektrična konstanta vode v odvisnosti od temperature. [14] ............................. 27
Slika 2-9: Gostota in Kw v odvisnosti od temperature [16]. .................................................... 28
Slika 2-10: Primer razpadnih produktov pri hidrolizi kvercetin glikozida [17]. .................... 30
Slika 2-11: Molekula 5- hidroksi metil furfurala. [24] ........................................................... 31
Slika 3-1: Zmlet čebulni material............................................................................................ 38
Slika 3-2: Čebulni ekstrakt. ..................................................................................................... 39
Slika 3-3: Visokotemperaturni visokotlačni šaržni avtoklav. ................................................. 43
Slika 3-4: Shema aparature za šaržno hidrolizo. ..................................................................... 44
Slika 3-5: Sistem za kontinuirno hidrolizo ekstrakta. ............................................................. 45
Slika 3-6: Shema aparature za kontinuirno hidrolizo. ............................................................. 46
Slika 4-1: Izkoristki ekstrakcij pri različnih ekstrakcijskih pogojih. ...................................... 48
Slika 4-2: Vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih, pridobljenih pri različnih ekstrakcijskih
pogojih. ................................................................................................................................... 49
Slika 4-3: Vpliv temperature na wkvercetina (%). ........................................................................ 53
Slika 4-4: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%). ............................................................... 53
Slika 4-5: Vpliv uporabe CO2 na wkvercetina (%). ...................................................................... 54
Slika 4-6: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%). ..................................................................... 55
Slika 4-7: Trend nihanja wkvercetina (%) s časom obratovanja kontinuirnega sistema glede na
koncentracijo raztopine ekstrakta............................................................................................ 57
Slika 4-8: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%) pri kontinuirnem procesu. ...................... 58
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
11
Slika 4-9: Vpliv temperature na wkvercetina (%) pri kont. procesu. ........................................... 59
Slika 4-10: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%) pri kont. procesu. ....................................... 60
Slika 4-11: a) Raztopina hidroliziranega vzorca pred in po uparjanju, b) precipitirani delci
kvercetina ob steni bučke........................................................................................................ 65
Slika 7-1: Umeritvena krivulja z GA za določitev totalnih fenolov. ...................................... 70
Slika 7-2: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 15 min, N2. ... 70
Slika 7-3: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, N2. 71
Slika 7-4: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, CO2.
................................................................................................................................................ 71
Slika 7-5: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 0,1 mg/ml, 195 °C, 12,5 min,
CO2. ........................................................................................................................................ 72
Slika 7-6: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,25 mg/ml, 200 °C, 12,9
min, 96 bar. ............................................................................................................................. 72
Slika 7-7: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,25 mg/ml, 180 °C, 12,9
min, 97 bar. ............................................................................................................................. 73
Slika 7-8: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,5 mg/ml, 200 °C, 12,9
min, 98 bar. ............................................................................................................................. 73
Slika 7-9: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 0,1 mg/ml. .................................... 74
Slika 7-10: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 0,25 mg/ml. ................................ 74
Slika 7-11: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 0,5 mg/ml. .................................. 75
Slika 7-12: Nihanje % hidrolize s časom pri koncentraciji 1 mg/ml. ..................................... 75
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
12
Uporabljeni simboli in kratice
Simboli
a naklon premice umeritvene krivulje GA
Abs absorbanca raztopine vzorca
b odsek premice umeritvene krivulje GA
cp toplotna kapaciteta (kJ/ kg °C)
D premer cevi (mm)
Fv0 volumski pretok (mm3/min)
γ(QU) koncentracija kvercetina v posamezni fazi določena na HPLC (ng/μl),
ε dielektrična konstanta
η izkoristek ekstrakcije (%)
γGA koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/ml)
γekstrakt koncentracija ekstrakta v raztopini vzorca (mg/ml)
Kw ionski produkt vode (mol2/dm
6)
L dolžina cevi (mm)
mekstrakt masa ekstrakta (g)
mmateriala masa vhodnega materiala (g)
msuh. pre. masa suhega preostanka v posamezni fazi (mg)
P tlak (bar)
Pcr kritični tlak (bar)
q volumski pretok (ml/min)
ρ gostota (kg/m3)
ρ0 gostota vode pri normalnih pogojih (g/ml)
ρn gostota vode pri temp. eksperimenta (g/ml)
T temperatura (°C)
Tcr kritična temperatura (°C)
t čas (min)
tk kontaktni čas (min)
λ toplotna prevodnost (mW/mK)
υ dinamična viskoznost (mPa·s)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
13
Uporabljene kratice
3,4-DHBA 3,4- dihidroksi benzojska kislina
FC reagent Folin-Ciocalteu reagent
FOS fruktooligosaharidi z nizko molekulsko maso
GA galna kislina
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
5-HMF 5-hidroksi metil furfural
KE konvencionalna ekstrakcija
SCW superkritična voda
SubCW subkritična voda
UV ultravijolično
QU kvercetin
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
14
1 Uvod
Čebula je ena izmed glavnih in dnevno uporabljenih vrst zelenjave v Evropi. Uporabljamo jo
bodisi surovo ali predelujemo na različne načine. Znano je, da uživanje čebule deluje
stimulativno na srce, kot diuretik, pomaga pri izkašljevanju, ima antibakterijske lastnosti,
spodbujaja prebavo, spodbuja proizvodnjo žolča in zmanjšuje raven sladkorja in lipidov v
krvi. V Sloveniji se izmed vseh vrst čebule vse pogosteje uporablja ptujska rdeča čebula.[1]
1.1 Opredelitev problema in pregled literature
Čebulno predelovalna industrija letno proizvede več kot 450.000 ton čebulnih odpadkov
znotraj Evropske unije. Mednje uvrščamo olupke, zunanje mesnate liste, rastne liste in
spodnje koreninske dele. Ti odpadki zaradi močne arome čebulnih ostankov niso primerni za
uporabo kot krma za živali, niti se ne morejo uporabiti kot organsko gnojilo, zaradi hitrega
razvoja fitopatogenih agentov. Prav tako zaradi visoke vsebnosti vlage, njihova odstranitev s
sežigom postane precej draga. Zaradi navedenih vzrokov, so proizvajalci čebule in
prehrambena industrija začeli iskati načine za pretvorbo čebulnih odpadkov v uporabne
sestavine živil, kot so npr.: fenolne spojine za ojačitev okusa, dodatna prehranska vlakna,
pigmenti, želirni pektini ali naravni antioksidanti. [1]
Glede na znane podatke o vsebnosti fenolnih in drugih spojin v odpadnem čebulnem
materialu, ki ga uvrščamo med biološke odpadke, želijo pridobiti izdelke z dodano
vrednostjo, povečati prihodek procesa in nenazadnje na ta način zmanjšati količino
odpadkov. [1]
Z namenom pridobivanja bioproduktov in energije iz naravnih in odpadnih materialov se
vedno več uporablja voda, ki jo glede na kemijske in fizikalne lastnostni uvrščamo med tako
imenovana zelena oz. okolju prijazna topila. Zaradi svoje polarnosti in sposobnost, da tvori
vodikove vezi, je odlično ekstrakcijsko oz. reakcijsko topilo. V njej se raztaplja veliko
različnih vrst molekul. [2]
Pri standardnih pogojih (temperaturi - T = 25 °C, tlaku - P = 1 bar ) je voda slabo mešljiva z
nepolarnimi ogljikovodiki in plini. Zaradi svoje visoke dielektrične konstante (78,5) in
visoke gostote (997 kg/m3) je dobro topilo za soli in druge močno polarne komponente. Pri
pogojih pod kritično temperaturo in tlakom (Tcr = 374 °C in Pcr = 220,6 bar) je voda v
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
15
subkritičnem stanju (SubCW), ko pa doseže pogoje nad kritičnimi pogoji, preide v
superkritično stanje (SCW). [3]
Znano je, da so v sub- in superkritičnem stanju, reakcijske lastnosti vode precej drugačne od
lastnosti pri atmosferskih pogojih. Zaradi možnosti spreminjanja temperature, tlaka in
posledično gostote, je pri uporabi vode kot reakcijskega agenta, možno manipulirati
selektivnost oz. vrste reakcij in jih uporabiti za pretvorbo odpadkov in pridobitev
raznovrstnih kemikalij. [3]
V primerjavi s klasičnimi postopki za pridobivanje izdelkov z dodano vrednostjo, kot sta
ekstrakcija z organskimi topili in hidroliza v močno kislem mediju, ima obdelava materiala s
subkritično vodo pomembno prednost, saj ni potrebnega predhodnega procesa sušenja
vhodnega materiala in lahko vrsta reakcij (hidroliza, dehidracija, aromatizacija…) poteka pri
višji vsebnosti vlage, ki je tipična za biomaso. Pri uporabi vode kot reakcijskega topila gre
nenazadnje za tako imenovano ''zeleno'' in trajnostno tehnologijo obdelave odpadnega
materiala, ki nadomešča uporabo dragih in okolju škodljivih organskih topil. [4]
Glede na to, da ima pri subkritičnih pogojih voda edinstvene lastnosti, saj ostane v tekočem
stanju in lahko deluje kot topilo, reaktant ali katalizator, jo lahko uporabimo kot hidrolizni
medij za procesiranje čebulnih glikozidov, pri čemer nastane aglikon kvercetina.
1.2 Namen, hipoteze in cilji
Namen magistrske naloge je bil raziskati možnost uporabe subkritične vode kot hidroliznega
medija za selektivno razgradnjo glikozidno vezanih antioksidantov v ekstraktu ptujske
čebule. Naše raziskave so se osredotočale na pridobitev prostega aglikona kvercetina,
produkta z visoko dodano vrednostjo v najvišjem možnem izkoristku, brez uporabe močnih
kislin ali baz.
V ta namen smo najprej izvedli konvencionalno ekstrakcijo lupine ptujske čebule z
namenom, da smo pridobili vhodni material – čebulni ekstrakt. Dobljenem produktu smo
določili vsebnost totalnih fenolih spojin in totalnega kvercetina. Totalne fenolne spojine smo
določili s kolorimetrično Folin-Ciocalteu metodo. Vsebnost totalnega kvercetina smo
določili na takšen način, da smo ekstrakt naprej hidrolizirali v močno kislem mediju in
hidroliziran produkt nato analizirali na tekočinskem kromatografu za prosti kvercetin. Tako
dobljena koncentracija kvercetina v ekstraktu se je smatrala kot popolnoma hidroliziran
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
16
produkt in ta vrednost se je uporabila pri izračunu odstotka hidrolize izvedene s subkritično
vodo.
V naslednjem koraku smo z dobljenimi podatki preučevali vpliv parametrov (temperatura,
kontaktni čas, uporaba plina za vzpostavitev tlaka v reaktorju in koncentracija ekstrakta) na
izkoristek hidrolize v šaržnem reaktorju, kjer smo uporabili subkritično vodo kot hidrolizni
medij. Na podlagi določitve optimalnih pogojev hidrolize v šaržnem reaktorju smo izvedli
tudi kontinuirno hidrolizo ekstrakta s subkritično vodo. Na koncu smo hidroliziran medij
precipitirali in s tem pridobili produkt z visoko vsebnostjo aglikona kvercetina.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
17
2 Teoretični del
2.1 Ptujska čebula
Ptujski čebula (Ptujski lük) je staro ime za čebulo značilne rdečo-rjave barve suholistov, bele
in vijolično-rdeče barve mesa, srčasto-ploščate oblike in izrazitega okusa. Spada v družino
Liliaceae, njeno latinsko ime je Allium cepa var. cepa. Izhaja iz Azije, od koder se je preko
Italije razširila v srednjo Evropo. Cenjena je kot zelenjadnica in zdravilna rastlina, ki jo v
Sloveniji pridelujejo že več kot 200 let. Območje pridelovanja je zgodovinsko pogojeno in
obsega ravninski del Ptujskega polja, ki se razteza med reko Dravo, reko Pesnico, mestoma
Ptuj in Ormož ter obronki Slovenskih goric. [5]
Leta 2011 je pridobila oznako: Zaščitena geografska označba (slika 2-1a). V slovenski sorti
list je vpisana kot sorta Ptujska rdeča. Navedena je tudi v katalogu sort Evropske unije in v
opisu priporočenih sort poljščin in vrtnin, ki ga je izdal Kmetijski inštitut Slovenije. [6]
Navadno se shranjuje v obliki tradicionalnega venca prikazanega na sliki 2-1b, ali manjših
pakiranjih. Zaradi pletenja v kite ima ptujska čebula več zelenega listja, ki je žilavo in se ne
lomi ob puljenju. Slednje je zelo pomembno, saj kmetje čebulo že od nekdaj spravljajo
izključno ročno. Suho podnebje ob dozorevanju ter plitva, peščena in s hranili slabše
založena tla, so razlog, da je sorta razvila izrazit in ostrejši okus. [7]
Slika 2-1: a) Zaščitena geografska označba; b) venec ptujske čebule.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
18
2.1.1 Kemijska sestava čebule
Dejstvo je, da je kemijska sestava čebule zelo zapletena. Študije kažejo, da suha čebulna
lupina vsebuje do 80 masnih % ogljikovih hidratov med katere uvrščamo glukozo, fruktozo,
saharozo, fruktooligosaharide z nizko molekulsko maso (FOS) in različne razvejane
polisahraide, ki so prisotni v večini rastlin. Različni avtorji poročajo, da prav zaradi velikega
zanimanja potrošnikov o dietni prehrani, vse več podjetij poskuša pridobiti dovoljenje za
uporabo in trženje FOS kot naravne sestavine živil v ZDA in Evropi. [8]
Tabela 2-1: Sestava jedilnega dela čebule.
100 g jedilnega dela čebule vsebuje: (g)
Voda 89,11
ogljikovi hidrati 9,34
Maščobe 0,10
Proteini 1,10
Vitamini: (mg)
tiamin (B1) 0,046
riboflavin (B2) 0,027
niacin (B3) 0,116
pantotenska kislina (B5) 0,123
vitamin B6 0,120
folna kislina (B9) 0,019
vitamin C 7,400
Minerali: (mg)
Kalcij 23
Železo 0,21
Magnezij 10
Fosfor 29
Žveplo 146
Cink 0,17
Od vseh zdravilnih snovi prisotnih v čebuli, izstopajo predvsem spojine žvepla in kvercetin,
ki delujejo kot močni antioksidanti in pomagajo nevtralizirati proste radikale v telesu ter
ščitijo membrane telesnih celic pred poškodbami. Poleg kvercetina, čebula dokazano vsebuje
tudi izorhamnetin in kaempferol glikozide, ki jih prav tako uvrščamo med flavonoide. [8]
Znanstveniki so dokazali, da čebula vsebuje tudi znatne količine natrija, kalcija, železa in
folne kisline (tabela 2-1). Pri rednem uživanju čebula zagotavlja priporočljiv vnos
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
19
prehranskih vlaknin, vitamina C, vitamina B6, kalija in ključnih fitokemikalij v obliki
disulfidov, trisulfidov in drugih sulfidnih spojin, ki so aromatskega izvora. [8]
2.2 Fenolne spojine in njihovo antioksidativno delovanje
Strukturno fenolne spojine obsegajo aromatski obroč, ki nosi enega ali več hidroksilnih
substituentov. V skupino fenolnih spojin uvrščamo številne enostavne fenolne spojine z
nizko molsko maso, kot tudi strukturno zapletene molekule z visoko molsko maso. Kljub
strukturni raznolikosti, se ta skupina spojin pogosto označuje kot "polifenoli". [9]
V naravi prisotne fenolne spojine najdemo v obliki konjugatov mono- in polisaharidov, ki so
povezani z eno ali več fenolnimi skupinami in se lahko pojavijo tudi kot funkcionalni
derivati v obliki estrov in metil estrov. Imajo pomembno vlogo pri rasti in razmnoževanju
rastlin, saj zagotavljajo zaščito pred patogeni in plenilci, poleg tega prispevajo tudi k barvi in
senzoričnim lastnostim sadja in zelenjave. [9]
V grobem jih razdelimo v več razredov, kot je prikazano v tabeli 2-2. Izmed spodaj
navedenih imajo fenolne kisline, flavonoidi in tanini vodilno vlogo glavnih prehranskih
fenolnih spojin. [9]
Tabela 2-2: Razredi fenolnih spojin.
Razred Struktura
enostavni fenoli, benzokinoni C6
hidroksibenzojske kisline C6–C1
acetofenoli, fenolocetne kisline C6–C2
hidroksicinamične kisline, fenilpropanoidi
(kumarini, izokumarini, kromini, kromeni)
C6–C3
naftokinoni C6–C4
ksantoni C6–C1–C6
stilbeni, antrakinoni C6–C2–C6
flavonoidi, izoflavonoidi C6–C3–C6
lignani, neolignani (C6–C3)2
biflavonoidi (C6–C3–C6)2
lignini (C6–C3)n
kondenzirani tanini (proantocianidini) (C6–C3–C6)n
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
20
2.2.1 Flavonoidi
Flavonoidi predstavljajo največjo skupino rastlinskih fenolov in predstavljajo več kot
polovico od vseh osem tisoč v naravi prisotnih fenolnih spojin. So spojine, molekulsko
sestavljene iz petnajstih ogljikovih atomov, ki so razvrščeni v konfiguraciji C6-C3-C6.
Osnovna struktura flavonoidov je sestavljena iz dveh fenilnih skupin, ki sta povezani z
mostom, sestavljenim iz treh atomov ogljika. Delimo jih v dva glavna razreda. V prvi razred
sodijo spojine, v katerih je ogljikov most "odprt" (slika 2-2), v drugi razred sodijo tiste, pri
katerih je ogljikov most vključen v heterociklični obroč C (slika 2-3). [10]
Slika 2-2: Fenol z odprtim ogljikovim mostom.
Variacije v obroču C in različni vzorci substitucije, ki so na voljo za obroča A in B
omogočajo različne strukture flavonoidov. [10]
Slika 2-3: Ogljikov most vključen v obroč C.
Podrazrede flavonoidov razlikujemo glede na funkcionalne skupine, vezane na obroču C
(slika 2-3). Flavanoli in antocianidini sta le dva podrazreda, kjer ni skupne 4-okso skupine,
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
21
vendar pa imajo molekule na tretjem ogljikovem atomu v obroču C vezano hidroksilno
skupino (-OH). Flavone, izoflavone in flavonole prepoznamo po dvojni vezi med
ogljikovima atomoma na drugem in tretjem mestu C obroča. Antocianidini imajo dve dvojni
vezi znotraj C obroča. Različna mesta dvojnih vezi in skupine vezane na različnih mestih
določajo podrazrede in vplivajo tudi na njihovo absorpcijo in njihovo sposobnost, da
delujejo kot antioksidanti. [10]
2.2.2 Antioksidativna aktivnost
Snovi, sposobne zavirati širjenje oksidativnih verižnih reakcij, ki jih povzročajo prosti
radikali, imenujemo antioksidanti. Oksidativne poškodbe s prostimi radikali povzročajo
oksidativni stres, ki je povezan z več degenerativnimi boleznimi. [11]
Prosti radikali so reaktivne molekulske vrste npr.: superoksid itd., ki nastajajo v celicah ali
jih telo absorbira iz okolja. Imajo neparno število elektronov, ki oksidirajo druge molekule z
namenom, da bi pridobili elektrone in sami stabilizirali svojo strukutro (slika 2-4).
Oksidirajo lahko makromolekule, kot so DNK, beljakovine, ogljikovi hidrati in maščobe.
[11]
Poznamo različne metode zaustavljanja delovanja prostih radikalov. Ena izmed njih je
uporaba aromatskih spojin, ki imajo strukturo polifenolov. Ta je sestavljena iz številnih
dvojnih vezi in hidroksilnih skupin, ki lahko darujejo elektrone za stabilizacijo prostih
radikalov. Prav antioksidativne lastnosti, povezane s strukturo flavonoidov, branijo celice
pred oksidativnim stresom. [11]
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
22
Slika 2-4: Shema delovanja antioksidanta.
V splošnem obstajata dve osnovni skupini antioksidantov. Ločimo jih na naravne in
sintetične. Raziskave v zadnjem obdobju kažejo, da se je znatno povečalo zanimanje po
iskanju antioksidantov iz naravnih virov, ki se uporabljajo kot dodatek za izboljšano
obstojnost živil v prehrambeni industriji in zdravil v farmacevtski industriji. Na ta način
želijo izpodriniti uporabo sintetičnih antioksidantov, za katere je dokazano, da so zdravju
škodljivi. Zaradi dokazane zmožnosti zaviranja verižnih oksidativnih reakciji med naravne
antioksidante uvršamo tudi molekulo kvercetina. [10]
2.2.3 Kvercetin
Kvercetin (C15H10O7) uvrščmo med flavonole in je eden izmed najbolj izraženih flavonoidov
v rastlinah. Njegovo kemijsko ime je 3,3',4',5,7 – penta hidroksi flavon (slika 2-5). Je široko
dostopen, saj se večinoma pridobiva z ekstrakcijo naravnih materialov v obliki rumenega
prahu. Spekter njegove uporabe je širok. Najpogosteje se dodaja kot antioksidant ali naraven
prehranski dodatek k živilskim, kozmetičnim in farmacevtskim proizvodom. [12]
Njegov vpliv na zdravje posameznika se kaže predvsem v sodelovanju pri vzpostavitvi
normalnega zdravja dihal, srca in ožilja, spodbujanju uravnovešenega krvnega tlaka in
zaščiti proti stresu, saj je močan antioksidant. Dokazano deluje protivnetno, saj inhibira
začetne vnetne procese, nastajanje in izločanje histamina ter drugih vnetnih mediatorjev.
Zanj je bilo ugotovljeno tudi protitumorno delovanje. Je antitrombotik, saj preprečuje
nastajanje krvnih strdkov. Sodeluje pri preprečevanju oksidacije maščob in preprečevanju
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
23
poškodb arterij ter tako skrbi za čistost in pretočnost ožilja (tudi v očeh). Učinkuje na več
načinov in je eden izmed najmočnejših protirakavih snovi, kar jih poznamo. Deaktivira več
karcinogenov, preprečuje poškodbe DNK in zavira encime, ki pospešujejo rast tumornih
celic. Zaradi vsebnosti kvercetina ima čebula, ki vsebuje celo do 10 odstotkov kvercetina na
suho maso materiala, sloves zdravila proti astmi in alergijam. [12]
Slika 2-5: Molekula kvercetina.
Različne študije poročajo o prisotnosti kvercetina v čebuli, jabolkah, zelenem čaju,
brokoliju, špinači, ajdi, citrusih, rdečem vinu itd. Njegova vsebnost v živilih je odvisna tudi
od učinkov shranjevanja. V prvih dvanajstih dneh neustreznega skladiščenja lahko čebula
izgubi od 25 % do 33 % vsebnosti kvercetina. Pri skladiščenju za tem lahko pride le še do
minimalnih izgub. Znano je tudi, da lahko čebulni olupek vsebuje celo 77-krat več
kvercetina, kot se le tega nahaja v jedilnem delu. [13]
Kvercetin in njegove s sladkorji vezane oblike, ki jih imenujemo glikozidi, predstavljajo od
60 % do 75 % prisotnih flavonoidov v ekstraktu čebulnega olupka. Eden izmed običajnih
načinov za hidrolizo kvercetin glukozidov iz čebule je uporaba kislinske hidrolize s HCl, ki
poenostavi kvalitativno in kvantitativno analizo prisotnosti kvercetina v materialu. Pri tem
postopku se prekine glikozidna vez in na ta način se poveča vsebnost kvercetin aglikona v
materialu. Poleg tega nastanejo tudi razpadni produkti kvercetina, ki so večinoma neznane
spojine. Najpogosteje zastopani glikozidni obliki v čebuli sta predvsem kvercetin-4-glukozid
in kvercetin-3,4-diglukozid. [13]
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
24
2.2.3.1 Glikozidi kvercetina
Številni flavonoidi so vezani na sladkorje v naravnem stanju. Imenujemo jih glikozidi.
Pojavi se glikozilacija na katerikoli hidroksilni skupini, kamor se veže sladkor. Tako kot pri
večini bioaktivnih komponent je tudi v primeru kvercetina prosta oz. aglikonska oblika
molekule v naravi manj pogosta. Najpogosteje ima kvercetin vezano skupino sladkorja na
tretjem mestu C obroča, 4. mestu obroča B in 7. mestu obroča A. [11]
Primeri so: kvercetin-3-Q-β-glikozid (slika 2-6 a), kvercetin-4-Q-glikozid (slika 2-6 b) in
kvercetin-7-O-β-D- glikozid (slika 2-6 c). Na molekulo kvercetina je lahko vezanih tudi več
skupin sladkorja v različnih kombinacijah. Primer takšne molekule je kvercetin-3,4'-
diglikozid (slika 2-6 d). [11]
Slika 2-6: Glukozidi kvercetina: a) kvercetin-3-Q-β-glikozid, b) kvercetin-4-Q-glikozid, c)
kvercetin 7-O-β-D-glikozid, d) kvercetin-3,4'-diglikozid.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
25
2.3 Lastnosti subkritične vode
Vodo poznamo kot univerzalno polarno topilo, saj lahko v njej raztopimo več snovi, kot v
kateri koli drugi vrsti topila. Kaže zanimive lastnosti kot reakcijsko topilo pri subkritičnih ali
superkritičnih pogojih. Tehnologija s subkritično vodo (SubCW) je trenutno v svetu hitro
razvijujoča se metodologija, ki uveljavlja SubCW kot reakcijski medij pri temperaturah (T)
med 100 °C in 374 °C in pri tlaku (P), ki je dovolj visok, da ostane le-ta v tekočem stanju.
Kadar se reakcijska temperatura in/ali tlak dvigne nad kritično temperaturo (Tcr) in/ali tlak
(Pcr), se stanje vode pretvori iz subkritičnega v superkritično (SCW). Ti pogoji omogočajo,
da so lastnosti vode precej drugačne od običajne tekoče vode ali pare pri atmosferskem
tlaku. Slika 2-7 prikazuje trojno točko, kritično točko vode in območji SubCW in SCW. [4]
Slika 2-7: Fazni diagram vode.
V skladu s spremembami ionskega produkta ima SubCW pomembno vlogo pri kislinsko- in
bazično-kataliziranih reakcijah, ki se večinoma uporabljajo za hidrolizo biomase. Edinstveno
obnašanje SubCW in SCW izhaja tudi iz transportnih lastnosti, saj ima pri teh pogojih voda
visok difuzijski koeficient in toplotno prevodnost (maksimalna v kritičnem stanju) in nizko
viskoznost, zaradi česar je po svojih lastnostih bolj podobna plinom, kot tekočinam. Zaradi
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
26
odlične možnosti spreminjanja nekaterih lastnosti vode, kot sta temperatura in gostota, je
možno manipulirati selektivnost vrste reakcij in jih uporabiti za pretvorbo odpadkov s
SubCW in SCW vodo, ki ju uvrščamo med najbolj obetavne poti za pridobitev raznovrstnih
kemikalij. Tako za pridobitev manjših količin kemikalij z visoko dodano vrednostjo kot tudi
večjih količin cenejših kemikalij. [14]
Lastnosti vode, kot sta gostota (ρ) in dielektrična konstanta (ε), lahko neprekinjeno
nadzorujemo s spreminjanjem temperature (T) in tlaka (P). Njena dielektrična konstanta pri
sobni temperaturi in normalnem tlaku znaša 78,5. Pri normalnih pogojih ima konstanten
ionski produkt Kw = 10-14
mol2/dm
6 in ρ= 997 kg/m
3, toda ko je segreta pri visoki temperaturi,
se število vodikovih vezi med molekulami vode zniža, kar povzroči padec dielektrične
konstante ter drugih njenih tipičnih fizikalno-kemijskih lastnosti, z izjemo Kw, ki pri 300 °C
doseže maksimalno vrednost in nato strmo pade. [14]
Pri temperaturah pod 300 ° C je voda precej nestisljiva, kar pomeni, da povišan tlak nima
izrazitega vpliva na njene fizikalne lastnosti, omogoča pa, da voda ostaja v tekočem stanju.
Vrednost tlaka, ki zagotavlja, da je pri izbrani temperauri voda v tekočem stanju, razberemo
iz parnih tabel kot vrednost nasičenega parnega tlaka. Npr.: nasičen parni tlak pri 121 °C
znaša 1 bar, pri 150 °C 4,7 bar, pri 200 °C 15,5 bar in v kritični točki 374 °C 220,6 bar. V
območju med 300 °C in 374 °C, ko se voda približuje kritični točki, se njene fizikalne
lastnosti s povišanjem tlaka bistveno spremenijo. Tabela 2-3 prikazuje številne variacije
fizikalno-kemijskih lastnosti vode pridobljenih s tlačnimi in temperaturnimi spremembami.
[14]
Tabela 2-3: Nekatere fizikalne in kemijske lastnosti vode in pare pri različnih temperaturah
in tlakih.
Voda SubCW SCW Para
T (°C) 25 250 400 400 400
P (bar) 1 50 250 500 1
ρ (kg/m3) 997 800 170 580 0,3
ε 78,5 27,1 5,9 10,5 1,0
pKw 13,6 11,2 19,4 11,9 /
Cp (kJ/kgK) 4,22 4,86 13,0 6,8 2,1
υ (mPa·s) 0,89 0,11 0,03 0,07 0,02
λ (mW/mK) 608 620 160 438 55
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
27
2.3.1 Dielektrična konstanta
Dielektrična konstanta (ε) je brezdimenzijska konstanta ki kaže, kako enostavno se material
lahko polarizira z uvedbo električnega polja in prikazuje afiniteto vode, ki se uporablja kot
industrijski reakcijski medij. Ko vodo segrejemo nad 100 °C se ε zmanjšuje (slika 2-8). Pri
200 °C in tlaku 16 bar je dielektrična konstanta vode, enaka dielektrični konstanti metanola
(32,5) pri sobnih pogojih. Pri 250 °C je ε vode, ki jo ohranjamo v tekočem stanju, enaka
dielektrični konstanti etanola (27,1) pri sobnih pogojih. Pri temperaturi 297 °C postane celo
benzen popolnoma mešljiv z vodo. Voda v subkritičnem stanju tako postane mnogo boljše
topilo za hidrofobne organske snovi, kot voda pri sobni temperaturi. Deluje lahko kot
katalizator pri reakcijah, ki normalno zahtevajo dodatek katalizatorja. [4]
Slika 2-8: Dielektrična konstanta vode v odvisnosti od temperature. [14]
2.3.2 Ionski produkt
Ionski produkt (Kw) je definiran kot produkt koncentracije vodikovih in hidroksidnih ionov
in ponazarja stopnjo disociacije vode:
Kw = [H+]·[OH
-];
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
28
pKw= -log10Kw. [15] (2.1)
Slika 2-9: Gostota in Kw v odvisnosti od temperature [16].
Slika 2-9 prikazuje Kw in ρ v odvisnosti od temperature. Ionski produkt s povišano
reakcijsko temperaturo narašča. Po velikosti je pri subkritičnih pogojih približno trikrat višji
kot pri sobnih pogojih, kar omogoča SubCW, da sočasno deluje kot kislina in baza. Pri
temperaturi 250 °C in tlaku 50 bar znaša pKw = 11,2. Pri okoli 300 °C doseže maksimum ter
se postopoma zmanjšuje s povišano temperaturo do vrednosti 19,4, pri temperaturi 400 °C in
250 bar. Pri navedenih pogojih pride do zmanjšanja solvatacije ionov, kar je posledica
zmanjšanja gostote vode pri višjih temperaturah. Iz teh razlogov ima subkritična voda
pomembno vlogo v kislinsko in bazno kataliziranih reakcijah. Posebej je to vidno pri
pospešenih hidrolizah biomasnih komponent brez dodatka katalizatorja. [15]
2.4 Hidroliza in hidrotermični procesi
2.4.1 Hidroliza
Hidroliza je proces pri katerem v stiku z vodo pride do prekinitve vezi znotraj molekule.
Reakcija v glavnem poteče med vodno molekulo in ionom pri spremenjeni pH vrednosti
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
29
raztopine. Poznamo tri glavne vrste hidrolize: hidroliza soli, kislinska hidroliza in bazna
hidroliza. [16]
V primeru hidrotermične degradacije (hidrolize) glikozidno vezanih biopolimerov lahko
molekula vode, ki v subkritičnem stanju deluje kot močna kislina ali baza, prekine
glikozidno vez s katero je na molekulo vezan sladkor. [17]
2.4.2 Hidrotermični procesi
Postopek v vodi pri povišani temperaturi in tlaku se imenuje hidrotermični proces.
Hidrotermične reakcije za predelavo kompleksov kmetijskih in živilskih odpadnih
proizvodov zajemajo širok spekter fizikalnih in kemijskih reakcij. Koncept izhaja prvotno iz
geologije. Čim višja je potrebna temperatura za določen proces, višji tlak moramo zagotoviti
z namenom, da se izognemo uparevanju vode in jo s tem ohranimo v tekočem stanju. [9]
Splošno med hidrotermične reakcije uvršamo sintezne reakcije kot so: hidrolizne reakcije,
oksidacijske reakcije, kondenzacijske reakcije, reakcije hidrogeniranja in dehidrogeniranja,
reakcije izomerizacije, reakcije aromatizacije, reakcije alkiliranja, reakcije spajanja,
ciklizacijske reakcije, reakcije dekarboksilacije, Diels-Alderjeve reakcije,
dispropocionacijske reakcije, reakcije izločanja, organokovinske reakcije in reakcije
transformacije molekul, pri katerih se SubCW in SCW, zaradi selektivnih lastnosti
uporabljata kot reakcijsko topilo z nizko viskoznostjo in visoko sposobnostjo raztapljanja
substrata. Poleg tega se uporabljata kot reakcijski medij pri sintezi različnih materialov,
razgradnji odpadkov, recikliranju plastičnih materialov in obdelavi biomase. [18]
Med glavne procesne parametre, ki vplivajo na učinkovitosti hidrotermičnih reakcij
uvrščamo: reakcijsko temperaturo (T), tlak (P), hitrost pretoka (q) (v primeru kontinuirnih
procesov), kontaktni čas (tk), razmerje med materialom in topilom ter dodatek katalizatorja.
[19]
Reakcijska temperatura je eden izmed najpomembnejših dejavnikov, ki vplivajo na
učinkovitost poteka rekcij v SubCW, saj temperatura bistveno vpliva na fizikalno-kemijske
lastnosti vode. Raziskovalci so dokazali, da povišanje temperature povzroči izredno
povečanje hitrosti masnega prenosa snovi in izboljša topnost bioaktivnih spojin v vodi. Z
naraščanjem temperature se viskoznost in površinska napetost vode kot ekstrakcijskega
topila zmanjšata. Iz tega razloga je reakcije v SubCW najučinkovitejše izvajati pri najvišji
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
30
dovoljeni temperaturi, ki še ne povzroči degradacije želenih komponent v izbranem
materialu. Vpliv temperature se spreminja glede na različne naravne materiale, in je povezan
tudi s koncentracijo bioaktivne spojine v materialu. [16]
Pomemben dejavnik, ki poleg temperature in vrste vzorca, vpliva na potek reakcije s SubCW
je kontaktni čas v katerem je material, ki ga želimo hidrolizirati v stiku s SubCW. Znano je,
da je kontaktni čas močno odvisen od lastnosti in občutljivosti uporabljenega materiala, kot
tudi od občutljivosti komponente, ki jo želimo pridobiti. [16]
Na uspešnost hidrolize s subkritično vodo vpliva tudi vrsta glikozidne vezi. Znano je, da je
beta glikozidna vez stabilnejša kot alfa vez. Na potek hidrolize vplivata tudi lokacija
glikozidne vezi v polisaharidni verigi in njena dolžina. Reakcija je učinkovitejša pri
prekinitvi vezi na koncu molekule polisaharida. [16]
2.4.3 Razpadni produkti hidrotermične degradacije kvercetina
Subkritična voda je zaradi svojih lastnosti sposobna degradirati oz. hidrolizirati mnogo
organskih spojin, kot so biopolimeri (ogljikovi hidrati in proteini) na njihove enostavnejše
molekule kot so sladkorji, aminokisline, itd. Hkrati pa povzroči tudi nastanek stranskih
produktov. [17]
Slika 2-10: Primer razpadnih produktov pri hidrolizi kvercetin glikozida [17].
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
31
Slika 2-10 prikazuje primer razpadnih produktov kvercetin glikozida, kjer nastanejo poleg
proste molekule kvercetina, 3,4-dihidroksibenzojska kislina in druge komponente, tudi
sladkorji, ki so znani po tem da razpadejo v furfurale (5-HMF, itd.), aldehide (glicerol
aldehid, glikol aldehid, itd.), ketone (1,3-dihidroksi aceton), organske kisline (levulinsko
kislino, itd.), katehol, itd. [17]
Furfurali so najpogosteje zastopani enostavni furani v naravi in jih pridobivamo iz naravnih
materialov, ki vsebujejo lignocelulozo. Pri tem pride do hidroliznega procesa in nastanka
hemiceluloze. Molekule pentoze dehidrirajo v furfural in molekule heksoze dehidrirajo v 5-
hidroksi metil furfural (5-HMF), ki je sestavljen iz furan prstana in vsebuje funkcionalne
skupine aldehida in alkohola (slika 2-11). Ena izmed njegovih lastnosti je, da je zelo dobro
topen v vodi. Njegova prisotnost ni zaželjena ker je znak kvarjenja živil, označuje razpad
sladkorjev in je strupen. [20, 21, 22]
Slika 2-11: Molekula 5- hidroksi metil furfurala. [24]
2.5 Konvencionalna ekstrakcija
Pridobivanje bioaktivnih spojin iz rastlinskih snovi je prvi korak pri izkoriščanju naravnih
fitokemikalij, pri pripravi prehranskih dopolnil ali farmacevtskih dodatkov, sestavin živil in
proizvodnji farmacevtskih ter kozmetičnih izdelkov. Ekstrahiramo lahko sveže, zamrznjene
ali posušene rastlinske materiale. Ponavadi večje dele materiala pred ekstrakcijo zrežemo,
zmeljemo in homogeniziramo tako, da dobimo delce podobne velikosti. Če materiali
vsebujejo večjo količino vlage lahko izvedemo sušenje na zraku ali sušenje s postopkom
liofilizacije. [23]
Raziskave na tem področju so pokazale, da liofiliziran material, kot so npr. jagode in koruza,
vsebuje višjo vsebnost fenolnih spojin v primerjavi s tistim, ki ga posušimo na zraku. Vendar
sušenje, vključno z liofilizacijo, lahko povzroči neželene učinke na sestavnih profilih
vzorcev rastlin, zato je potrebna pazljivost pri načrtovanju sušenja. [23]
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
32
Pogosto se uporablja širok spekter ekstrakcijskih tehnik trdno-tekoče tudi za zgodnje
čiščenje naravnih izdelkov pridobljenih iz rastlinskega materiala ali mikroorganizmov.
Klasično lahko ekstrakcijske metode razdelimo na tradicionalne in novejše. K tradicionalnim
metodam vključujemo konvencionalno ekstrakcijo, Soxhletovo ekstrakcijo, maceracijo,
perkolacijo, turbo-ekstrakcijo z visokimi hitrostmi mešanja in ultrazvočno ekstrakcijo. Te
tehnike se večinoma uporabljajo v zadnjih nekaj desetletjih. [23]
Konvencionalna ekstrakcija (KE) je najpogosteje uporabljeni postopek za pripravo
ekstraktov iz rastlinskih materialov prav zaradi enostavnosti, učinkovitosti in široke
uporabnosti. Splošno znano je, da je izkoristek ekstrakcije odvisen od vrste in lastnosti
uporabljenega topila, njegove polarnosti, časa ekstrakcije, temperature, uporabljenega
razmerja med trdnim materialom in topilom kot tudi od kemijske sestave in fizikalnih
lastnosti materiala. Rastlinski materiali vsebujejo različne fenolne spojine od preprostih
fenolnih kislin, antocianov, do visoko polimeriziranih snovi kot so tanini. Iz teh razlogov
univerzalen postopek ekstrakcije, ki bi bil najprimernejši za pridobivanje rastlinskih fenolov,
ne obstaja. [23]
Naravni materiali vsebujejo tudi ne-fenolne snovi, kot so sladkorji in druge oblike ogljikovih
hidratov, organske kisline, proteine in maščobe, zaradi česar so lahko pri pridobivanju
ekstrakta potrebni tudi dodatni koraki za odstranitev teh komponent. [23]
Kot ekstrakcijska topila za pridobivanje fenolov so največkrat uporabljena naslednja
organska topila: metanol, etanol, aceton, etilacetat, in njihove kombinacije z različnimi
deleži vode. Prav izbira topila ključno vpliva na količino ekstrahiranih polifenolov v
ekstraktu. Znano je, da uporaba metanola poveča učinkovitost ekstrakcije fenolnih spojin z
nižjo molekulsko maso, med tem ko z uporabo acetona učinkoviteje ekstrahiramo flavanole
z višjo molekulsko maso. Zaradi svojih kemijskih lastnosti je v uporabi tudi etanol, saj je
varen za prehrano ljudi. [23]
V skladu z direktivo Evropske skupnosti (88/344/EEC) se lahko v ekstrakcijskih procesih
brez omejitev uporabljajo neslednja topila: voda, propan, butan, butilacetat, etilacetat, etanol,
ogljikov dioksid, aceton in N2O. Vsa druga topila so prepovedana ali imajo zelo natančno
določena področja uporabe (ne za prehrambeno, kozmetično in farmacevtsko industrijo).
[24]
Na izkoristek ekstrakcije fenolnih spojin iz rastlinskih materialov poleg časa vpliva tudi
temperatura, ki odraža nasprotja med topnostjo in degradacijo komponent pri procesu
oksidacije. Povišanje ekstrakcijske temperature po navadi spodbuja višjo topnost
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
33
komponente v topilu, saj se poveča hitrost prenosa snovi. Poleg tega se pri višji temperaturi
zmanjšata viskoznost in površinska napetost topila, kar pomaga izboljšati izkoristek
ekstrakcije. Vendar so mnoge fenolne spojine občutljive na visoko temperaturo, kar poveča
možnost oksidacije fenolov in posledično zmanjša izkoristek fenolnih spojin v ekstraktih.
Zato je ključnega pomena, da izberemo učinkovito metodo ekstrakcije z namenom, da
ohranimo stabilnost fenolnih spojin. [25]
Slabost konvencionalnih metod ekstrakcije kot sta npr. maceracija in Soxhlet ekstrakcija se
kažejo predvsem v večinoma nizki učinkovitosti, potencialnem onesnaževanju okolja zaradi
uporabljenih večjih količin organskih topil in daljšega ekstrakcijskega časa. V zadnjih letih
so se razvile številne novejše ekstrakcijske metode kot so ekstrakcija z mikrovalovi,
ekstrakcijo s subkritično vodo in ekstrakcija s superkritično vodo. [25]
2.6 Šaržni in kontinuirni procesi
Proizvodne procese v kemijski industriji lahko izvedemo na več načinov: šaržno, kontinuirno
ali semikontinuirno. [20]
Šaržni proces je eno- ali večstopenjski proces, pri katerem se določena količina surovin,
pomožnih materialov, energije, itd., predhodno dovede v kemijsko reakcijsko enoto pod
pogoji, ki so primerni za potek željene reakcije. Za takšne procese je značilno, da se
posamezne naloge oz. operacije izvajajo prekinjeno in po določenem receptu
(diskontinuirno). Zato se obratovalni parametri, npr. masa, koncentracija, temperatura in
tlak, spreminjajo s časom. Znotraj reaktorja v danem času pride do padca koncentracije
reaktantov in nastanka produktov. Ob zaključku postopka zmes odstranimo iz reaktorja in
nato opravimo ustrezne stopnje ločevanja in predelave (bodisi fizične ali kemične), da
pridobimo zahtevano raven čistote končnega produkta. To običajno narekujejo kupci, za
katere se posamezen izdelek proizvaja. Reaktanti, ki ne reagirajo in so ločeni od reakcijske
zmesi se lahko ponovno uporabijo za nadaljnjo reakcijo (običajno potem, ko so bili obdelani
ali očiščeni). [26]
Pri kontinuirnem procesu se vhodne surovine dovaja v sistem s konstantno hitrostjo, v
želenih razmerjih (surovin, pomožnih materialov, energije, itd.) in hkrati poteka konstantno
pridobivanje produktov, izdelkov, energije, itd. Za normalno obratovanje postopka je
potrebno doseči stacionarno stanje, v katerem je koncentracija tako reaktantov kot tudi
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
34
produktov v izbranem časovnem intervalu v vsaki točki reaktorskega sistema enaka. Nadzor
postopka poteka s konstantnim in enakomernim dotokom surovin in doseganjem konstantnih
pogojev (temperature, tlaka…). [26]
Kontinuirni procesi so značilni za proizvodnjo večjih količin osnovnih kemikalij. Za
proizvodnjo specialnih kemikalij in zdravil so primernejši šaržni procesi. V praksi je pogosta
tudi kombinacija obeh primerov tj. semikontinuirno obratovanje, kar pomeni, da proces v
določenem časovnem intervalu obratuje kontinuirno, vendar se periodično zaustavlja in
ponovno zaganja. Lastnosti posameznega procesa so prikazene v tabeli 2-4. [27]
Tabela 2-4: Lastnosti šaržnega in kontinuirnega procesa. [26]
Šaržni proces Kontinuirni proces
Material Lahko se uporablja za vse vrste
materialov (za materiale v trdnem
stanju je lažja uporaba šaržnega
procesa).
Lažja uporaba materialov v
tekoči obliki (danes, se lahko
skoraj vsak produkt proizvaja
z neprekinjenim procesom;
strošek investicije je odločilen
dejavnik).
Velikost naprav Relativno velike naprave. Visoke
naložbe pri nakupu zemljišča in
naprav.
Relativno majhne naprave.
Pomembni prihranki pri
nakupu zemljišča in naprav.
Reaktorji Pride do sprememb pri
koncentracijah snovi znotraj sistema
v daljšem časovnem obdobju.
Na vseh točkah sistema so po
določenem času zagona
doseženi konstantni pogoji
(stacionarno stanje).
Vtok surovin Sistem napolnimo s surovinami
pred začetkom reakcijskega
procesa.
Konstanten vtok surovin med
celotnim reakcijskem
procesom.
Kontrola
obratovalnih
pogojev
Enostavna kontrola. Lažje je
nadzorovati pogoje reakcije (pH ,
tlak, temperatura). Možno je tudi
ročno upravljanje.
Zahtevnejša kontrola
reakcijskih pogojev.
Zagotoviti je potrebno
avtomatično kontrolo.
Kontrolirati je potrebno tudi
pretok surovin.
Produkti Pridobivanje produktov šele na
koncu, ko so vsi deli reakcije
končani.
Stalno pridobivanje
produktov, ves čas reakcije.
Odpravljanje težav Napake, ki zahtevajo popravilo pri
določenem delu serije ne
povzročajo težav v drugih fazah.
Ustrezni preizkusi, se izvajajo
redno, po vsaki fazi.
Naprave so med seboj
povezane, tako da napaka v
enem delu procesa povzroča
zastoje v vseh drugih delih.
Dela, ki je bil poškodovan, ni
mogoče popraviti pod enakimi
delovnimi pogoji. Postopek je
potrebno zaustaviti.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
35
Proizvedene količine
produkta
Uporabni proces za proizvodnjo
manjših količin produkta.
Uporabni proces za
proizvodnjo večjih količin
produkta.
Raznolikost
produktov v obratu
Pri uporabi istega reaktorja, lahko
vsako naslednjio šaržo prilagodimo
na nove pogoje obratovanja, ki
dajejo nov produkt.
Zaželjeno, da se pri
vzpostavljenih pogojih trajno
prizvaja en produkt.
Faza razvoja
produkta
Bolje na začetku, ko je postopek
relativno nov in še ne poznan. V
tem primeru sta začetna investicija v
manjši šaržni reaktor in s tem tudi
gospodarsko tveganje manjša.
Bolje po opravljenih vseh
fazah načrtovanja širjenja
procesa in testov gospodarske
izvedljivosti.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
36
3 Eksperimentalni del in metode dela
Z namenom, da bi pridobili vhodni material – čebulni ekstrakt smo naprej izvedli
konvencionalno ekstrakcijo lupine ptujske čebule. Dobljenem produktu smo določili
vsebnost totalnih fenolih spojin in totalnega kvercetina. Totalne fenolne spojine smo določili
s kolorimetrično Folin-Ciocalteu metodo. Vsebnost totalnega kvercetina smo določili na
takšen način, da smo ekstrakt naprej hidrolizirali v močno kislem mediju (HCl) in
hidroliziran produkt nato analizirali na tekočinskem kromatografu za prosti kvercetin.
3.1 Kemikalije, pribor, aparature
Kemikalije:
Metanol (99 %)
Etanol (99 %)
Milli-Q voda
Galna kislina (standard, 98 %)
Kvercetin dihidrat (standard, 98 %)
5 - hidroksi metil furfural (standard, 99 %)
3,4 - dihidroksi benzojska kislina (standard, 99 %)
Folin - Ciocalteau (FC) reagent
Na2CO3
Pribor:
Steklena bučka z okroglim dnom (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml)
Steklena bučka z ravnim dnom (50 ml, 100 ml, 250 ml)
Steklen merilni valj (50 ml, 100 ml, 250 ml)
Steklene viale z zamaškom (10 ml)
Steklena čaša (250 ml, 500 ml, 1000 ml)
Steklena kristalizirka (500 ml)
Steklene viale z zamaški za HPLC
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
37
Vodni hladilnik
Stojalo in prižeme za bučke
Nuča
Prisesalka za nučiranje
Filter papir
Avtomatska pipeta (1 ml, 2 ml, 5 ml, 100 μl)
Plastični nastavki za pipeto (1 ml, 2 ml, 5 ml, 100 μl)
Plastične centrifugirke
Plastične inekcije
Teflonski membranski filter 0,25 μl
Aparature:
Liofilizator (Kambič, Slovenija)
Električni mlinček (Bosch)
Magnetni mešalnik z grelno ploščo
Ultrazvočna kopel (Kambič, Slovenija)
Analitska tehtnica (Mettler Toledo, Švica)
Termogravimetrična tehnica za določitev vlage v materialu (Mettler Toledo, Švica)
Rotacijski vakuumski uparjalnik (Büchi, Nemčija)
UV spektrofotometer Varian, Cary 50 (Varian, ZDA)
HPLC sistem Agilent 1100 (Agilent, ZDA)
3.2 Priprava materiala
Ptujsko čebulo smo najprej olupili in tako nejedilni del kot prvi jedilni sloj le-te posušili v
liofilizatorju. Suhi material smo zmleli z električnim mlinčkom. Zmletemu materialu,
prikazanem na sliki 3-1, smo določili vlažnost s termogravimetrično tehtnico. Vlažnost je
znašala 8,9 % ± 0,3 %.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
38
ekstrakt
ekstrakcije
material
100 %m
m
Slika 3-1: Zmlet čebulni material.
3.3 Ekstrakcija materiala
Zmlet material smo zatehtali v bučko in v masnem razmerju 1/20 (g/ml) dodali vodo ali
mešanico etanol/voda (20 vol % EtOH, 35 vol % EtOH, 65 vol % EtOH) kot ekstrakcijski
medij ter magnetni mešalček. Bučko smo termostatirali na vodni kopeli pri različnih
temperaturah (45 °C, 60 °C, 80 °C in 95 °C) namestili povratni vodni hladilnik ter vklopili
mešanje. Ekstrakcijo smo vzdrževali 2 uri pri danih pogojih. Ekstrakcijsko zmes smo
ohladili ter prefiltrirali na nuči s filter papirjem s pomočjo podtlaka. Raztopino ekstrakta smo
prelili v stehtano bučko z okroglim dnom, jo namestili na rotacijski uparjalnik (rotavapor) in
uparili vodo do ostanka suhega ekstrakta. Bučko s suhim ekstraktom smo stehtali, določili
maso ekstrakta in izračunali izkoristek ekstrakcije. Tako pripravljen suhi ekstrakt, prikazan
na sliki 3-2, smo postrgali iz bučke in ga uporabili za nadalnje delo. [28]
Izkoristek ekstrakcije (ηekstrakcije, v mas. %) izračunamo po enačbi:
(3.1)
kjer je:
mekstrakt – masa pridobljenega ekstrakta (g) in
mmaterial – masa zatehtanega materiala (g). [28]
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
39
Slika 3-2: Čebulni ekstrakt.
3.4 Določitev totalnih fenolov
Kolorimetrične reakcije se pogosto uporabljajo pri UV/VIS spektrofotometričnih metodah,
saj so hitre in enostavne za izvedbo. Za kolorimetrični test je potrebno uporabiti referenčno
snov, šele nato je ta metoda primerna za določanje koncentracije skupnih fenolnih spojin v
rastlinskih ekstraktih. Polifenoli v rastlinskih izvlečkih reagirajo z določenimi redoks
reagenti, kot je npr. Folin-Ciocalteu reagent. Pri tem se tvori modri kompleks, ki ga je
mogoče določiti spektrofotometrično pri valovni dolžini 760 nm. Metoda temelji na
kompleksu fosfovolframove kisline v alkalni raztopini. Absorbanca nastalega kompleksa je
sorazmerna s številom aromatskih fenolnih skupin v vzorcu in se izraža z ekvivalentom
galne kisline. [29]
3.4.1 Umeritvena krivulja z galno kislino
Galna kislina se uporablja kot standard pri določevanju vsebnosti totalnih fenolov v vzorcu.
Vsebnost totalnih fenolov v materialu podamo kot ekvivalent v mg/g materiala. V ta namen
smo pripravili umeritveno krivuljo galne kisline. Enačbo premice umeritvene krivulje smo
uporabili pri izračunu vsebnosti totalnih fenolov v vzorcih.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
40
3.4.1.1 Postopek priprave umeritvene krivulje
V 10 ml merilne bučke smo odpipetirali: 1,75 ml; 1,5 ml; 1,25 ml; 1 ml; 0,5 ml; 0,25 ml in
0,1 ml osnovne raztopine GA s koncentracijo 0,4 mg/ml ter razredčili z vodo do oznake.
Nato smo v stekleničke odpipetirali 0,5 ml razredčene raztopine GA, dodali 2,5 ml raztopine
Folin-Ciocalteu reagenta ter 2 ml raztopine Na2CO3 s koncentracijo 75 g/l, dobro premešali
in termostatirali na vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 °C. Čas za pripravo vzorca ni smel
presegati 2 min. Raztopine smo ohladili in izmerili absorbanco na UV spektofotometru pri
valovni dolžini 760 nm. Hkrati smo pripravili slepi vzorec, kjer smo namesto raztopine GA
uporabili destilirano vodo. [28]
3.4.2 Vsebnost totalnih fenolov v vzorcu
Vsebnost totalnih fenolov v čebulnem ekstraktu smo določili po podobnem postopku, kot
smo ga uporabili pri pripravi umeritvene krivulje z GA. V 10 ml merilne bučke smo zatehtali
20 mg ekstrakta in dopolnili do oznake z destilirano vodo. 0,5 ml raztopine ekstrakta smo
odpipetirali v stekleničke, dodali 2,5 ml raztopine Folin-Ciocalteu reagenta razredčenega z
vodo v razmerju 1:10 ter 2 ml Na2CO3 s koncentracijo 75 g/l. Čas za pripravo vzorca ni smel
presegati 2 min. Vzorce smo termostatirali na vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 °C, jih
ohladili na sobno temperaturo in izmerili absorbanco pri 760 nm. Za pripravo kontrolnega
vzorca smo namesto raztopine ekstrakta uporabili destilirano vodo. [28]
Koncentracijo totalnih fenolov v ekstraktu smo izračunali na podlagi umeritvene krivulje z
GA po naslednji enačbi:
Abs = a·γGA + b (3.2)
pri čemer je:
Abs – absorbanca raztopine vzorca izmerjena pri 760 nm (/),
a – naklon premice umeritvene krivulje GA (/),
b – odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance (/) in
γGA – koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/ml). [28]
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
41
Vsebnost totalnih fenolov smo izrazili v mg GA na g ekstrakta (wGA ekstrakt) oz. na g materiala
(wGA material) po naslednjh enačbah:
GA
GA, ekstrakt
ekstrakt
1000w
(3.3)
ekstrakcije
GA material GAekstrakt 100
w w
(3.4)
kjer je:
γekstrakt – koncentracija ekstrakta v raztopini vzorca (mg/ml),
ηekstrakcije – izkoristek ekstrakcije (%). [28]
3.5 Kislinska hidroliza čebulnega ekstrakta
Totalno vsebnost kvercetina v čebulnem ekstraktu smo določili s pomočjo kislinske hidrolize
s HCl. Smatrali smo, da je pri tem postopku proces hidrolize potekel 100 %.
V 20 ml merilno bučko smo zatehtali 50 mg ekstrakta in z destilirano vodo dopolnili do
oznake. Bučko z vodno raztopino ekstrakta smo za 10 min postavili v ultrazvočno kopel, kar
je omogočilo učinkovitejše raztapljanje ekstrakta. V 100 ml bučko z okroglim dnom smo
odmerili 16 ml pripravljene raztopine ekstrakta, dodali 5 ml 6 M HCl in 24 ml čistega
etanola, namestili povratni vodni hladilnik in bučko termostatirali na vodni kopeli pri 90 °C.
Po 2 urah smo vsebino bučke ohladili, dodali 5 ml destilirane vode in dobro premešali na
ultrazvočni kopeli. Tako pripravljen hidroliziran vzorec smo analizirali glede na vsebnost
kvercetina na HPLC. [30]
3.6 HPLC analiza kvercetina
Prisotnost in količino kvercetin aglikona v hidroliziranem vzorcu smo določili s pomočjo
Agilentov-ega HPLC serije 1100, sestavljenega iz binarne črpalke, avtomatskega
vzorčevalnika, grelnika kolone in detektorja s spremenljivo valovno dolžino (VWD).
Uporabili smo kromatografsko kolono Agilent Zorbax SB-C18 z dolžino 150 mm, notranjim
premerom 4,6 mm in velikostjo delcev 1,8 μm. Temperatura kolone je bila nastavljena na 35
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
42
°C in pretok mobilne faze na 0,55 ml/min. Volumen injiciranja vzorca je znašal 10 μl.
Mobilna faza je bila sestavljena iz dveh delov. Mobilna faza A je bila 2 % metanolna
raztopina ocetne kisline in mobilna faza B 2 % vodna raztopina ocetne kisline. [17]
Gradient mobilne faze v določenem času meritve vzorca je prikazan v tabeli 3-1.
Tabela 3-1: Gradient mobilne faze B v %.
Čas (min) % mobilne faze B
0 95
5 80
15 15
18 95
20 95
Na začetku metode je bila valovna dolžina nastavljena na 280 nm, in po 14,5 min
spremenjena na 365 nm vse do konca metode. Kvantitativna opredelitev vsebnosti kvercetina
in drugih produktov je bila opravljena na podlagi umeritvenih krivulj, pridobljenih s
standardi. [17]
3.7 Šaržna hidroliza vzorca s subkritično vodo
Hidrolizo vzorca s subkritično vodo smo izvedli v 75 ml visokotemperaturem in
visokotlačnem šaržnem avtoklavu iz nerjavečega jekla serije 4740 (Parr instruments, Moline,
ZDA). Delovno območje avtoklava je tovarniško določeno na maksimalno temperaturo 350
°C in tlak 586 bar. Prikazan je na sliki 3-3. Sestavljajo ga: 1- dovod plina, 2- manometer, 3-
tipalo digitalnega termometra, 4- avtoklav ovit z grelnim kablom in izolacijskim trakom, 5-
digitalni termometer, 6- magnetni mešalnik z grelno ploščo, 7- ventil za izpust plina iz
sistema.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
43
Slika 3-3: Visokotemperaturni visokotlačni šaržni avtoklav.
Za posamezni poskus smo avtoklav napolnili s 20 ml sveže pripravljene vodne suspenzije
čebulnega ekstrakta z znano koncentracijo (2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25
mg/ml ali 0,1 mg/ml) in dodali magnetno mešalo. Avtoklav smo ovili z električnim grelnim
kablom in izolacijskim trakom, s katerim smo zmanjšali toplotne izgube pri segrevanju.
Mešanje suspenzije znotraj avtoklava med potekom reakcije smo zagotovili z magnetnim
mešalom. Pred segrevanjem na želeno temperaturo, smo avtoklav prepihali z inertnim
dušikom ali CO2 in na ta način odpravili prisotnost kisika, ki bi lahko povzročil oksidacijo
komponent v vzorcu in potek neželenih stranskih reakcij. Sledilo je segrevanje na določeno
temperaturo (180 °C, 190 °C, 195 °C, 200 °C ali 210 °C) in vzpostavitev tlaka uporabljenega
plina (N2 ali CO2) v sistemu (slika 3-4) na želeno vrednost (50 bar, 90 bar, 150 bar, 215 bar,
380 bar ali 545 bar). Po obratovanju pri zgoraj navedenih pogojih in določenem kontaktnem
času (7,5 min, 10 min, 12,5 min, 15 min ali 17,5 min) smo avtoklav hitro ohladili v hladni
vodni kopeli in iz sistema spustili preostali plin. Nato smo iz avtoklava odvzeli hidroliziran
vzorec in ga primerno redčili z metanolom. Posamezni eksperiment pri izbranih parametrih
smo ponovili dvakrat. Pripravljeno raztopino vzorca smo filtrirali skozi teflonski
membranski filter 0,2 μm in jo v treh zaporednih meritvah analizirali na napravi HPLC.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
44
Odstopanje meritev od povprečne vrednosti % hidrolize posameznega vzorca je
predstavljeno s standardno deviacijo.
Slika 3-4: Shema aparature za šaržno hidrolizo.
3.8 Kontinuirna hidroliza vzorca s subrkritično vodo
Kontinuirno hidrolizo vzorca smo izvedli s pomočjo sistema, ki je prikazan na sliki 3-4.
Sistem sestavljajo: 1- rezervoar za Milli-Q vodo, 2- rezervoar za suspenzijo ekstrakta, 3-
visokotlačna črpalka Gilson 305, 4- visokotlačna črpalka Shimadzu LC-10AS, 5- navitje
električnega grelca, 6- manometer, 7- digitalni termometer, 8- reaktorska cev ovita z grelnim
kablom in izolirnim trakom, 9- ekspanzijski ventil, 10- kriostat, 11- zbirna posoda za
iztekajoči vzorec, 12- grelnik za reaktorsko cev.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
45
Slika 3-5: Sistem za kontinuirno hidrolizo ekstrakta.
S peristaltično črpalko Gilson 305 pump smo v sistem črpali Milli-Q vodo in s črpalko-
Shimadzu LC-10AS suspenzijo ekstrakta. Skupni volumski pretok obeh črpalk je znašal 1,5
ml/min. Glede na željeno koncentracijo ekstrakta (0,1 mg/mL, 0,25 mg/ mL, 0,5 mg/mL, 1
mg/ mL) v reakcijski mešanici smo nastavili pretok črpalke ekstrakta na 0,1 mL/min, 0,2
mL/min, 0,4 mL/min in pretok vode ustrezno na 1,4 mL/min, 1,3 mL/min in 1,1 mL/min.
Z elektičnim grelcem znamke Parr, smo segrevali vodo na želeno temperaturo tako, da smo
jo vodili skozi ogrevano navitje grelca. Voda in suspenzija ekstrakta sta bili v stiku v
reaktorski cevi dolžine (L) 700 mm in premera (D) 6,35 mm. Cev smo dodatno segrevali
tako, da smo jo ovili z grelno kačo in izolacijskim trakom, s katerim smo zmanjšali možnost
toplotnih izgub. Ker so reakcije potekale pod vplivom tlaka (okoli 100 bar), smo za
regulacijo tlaka v sistemu potrebovali tudi tlačni ventil. Tlak v sistemu je prikazoval digitalni
barometer. Hidroliziran vzorec, ki je iz sistema pritekal segret na temperaturo sistema smo
vodili v kriostat (vodni hladilnik), kjer se je ohladil na sobno temperaturo (slika 3-6).
Ohlajen vzorec smo zbirali v merilni valj.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
46
Pri opazovanju vpliva pretoka, kontaktnega časa in temperature, smo vzorec za analizo
vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirnega merilnega valja po 1 h obratovanja
posameznega eksperimenta. Pri opazovanju vpliva koncentracije na % hidrolze pa smo
vzorec odvzeli na vsakih 15 min v 240 minutah obratovanja, ga filtrirali skozi teflonski
membranski filter (0,25 μm), redčili z metanolom v ustreznem razmerju in analizirali na
HPLC. Odstopanje meritev od povprečne vrednosti % hidrolize posameznega vzorca je
predstavljeno s standardno deviacijo.
Slika 3-6: Shema aparature za kontinuirno hidrolizo.
Kontaktni čas (tk) v reaktorju smo določili s pomočjo enačbe :
2
04
n
vo
DL
k Ft
(3.5)
pri čemer je:
D - premer cevi (mm),
L - dolžina cevi (mm),
ρn – gostota vode pri normalnih pogojih (g/ml),
ρ0 – gostota vode pri eksperimentalinih pogojih (g/ml),
Fv0 – skupni volumski pretok pri izbranih koncentracijah ekstrakta (mm3/min).
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
47
( )
( . .)
100%kvercetina
QU
suh pre
wm
Pri izvedbi kontinuirnih eksperimentov smo študirali vpliv kontaktnega časa, temperature in
koncentracije uporabljene raztopine ekstrakta na % hidrolize. Eksperimente smo izvedli pri
kontaktnem času 11,4 min, 12,9 min, 14,9 min in 17,5 min, temperaturah 180 °C, 190 °C,
200 °C in 210 °C in koncentracijah raztopine ekstrakta 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml in
0,1 mg/ml.
3.9 Pridobivanje končnega hidroliziranega produkta
Z namenom, da bi pridobili kvercetin kot želen končni produkt, smo zbrali celoten
hidrolizirani vzorec pridobljen s kontinuirnim postopkom pri optimalnih pogojih. Vodo, ki jo
je vsebovala vodna raztopina vzorca smo uparili na rotavaporju do stopnje, pri kateri so delci
vidno precipitirali v raztopini.
S pomočjo centrifuge smo ločili precipitirane delce in vodno fazo. Precipitirane delce smo
raztopili v znani količini metanola in tako pripravili metanolno (s kvercetinom bogato) fazo.
Določili smo tudi volumen vodne (s kvercetinom revne) faze. V obeh fazah (metanolni in
vodni fazi) smo določili vsebnost kvercetina in 5-hidroksi metil furfurala na HPLC.
Maso suhega preostanka v posamezni fazi smo določili gravimetrično. Na dve manjši
petrijevki smo ločeno odpipetirali 1 ml vodne in 1 ml metanolne faze in določili maso pred
sušenjem. Nato smo izvedli sušenje pri temperauri 120 °C. Razlika v masi pred in po 6
urnem sušenju pri temperaturi 120 °C je predstavljala maso suhega preostanka v posamezni
fazi. % kvercetina v vsaki izmed fazi smo določili po spodnji enačbi:
(3.6)
pri tem je:
γ(QU) - koncentracija kvercetina v posamezni fazi določena na HPLC (ng/μl),
m(suh pre.) - masa suhega preostanka v posamezni fazi (mg).
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
48
4 Rezultati in diskusija
4.1 Vplivi parametrov na izkoristek in vsebnost fenolnih spojin v
ekstraktu ptujske rdeče čebule
Izkoristek ekstrakcije smo določili kot razmerje med maso suhega ekstrakta in maso suhega
vhodnega materiala na začetku ekstrakcije po enačbi (3.1). Slika 4-1 prikazuje izkoristke
izvedenih ekstrakcij pri različnih pogojih.
Slika 4-1: Izkoristki ekstrakcij pri različnih ekstrakcijskih pogojih.
Na sliki 4-1 vidimo, da smo najvišji izkoristek pridobljenega ekstrakta, ki znaša 53,9 %,
dosegli pri ekstrakciji mlete mešanice olupka in jedilnega dela čebule z vodo pri temperaturi
95 °C. Najnižji izkoristek ekstrakcije smo določili pri ekstrakciji čebulnega olupka z 20 %
raztopino etanola, kot ekstrakcijskim medijem. Ta je pri temperaturi 80 °C znašal 9,9 %.
0
10
20
30
40
50
60
Izko
rist
ek e
kst
rakci
je (
mas
. %
)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
49
Izkaže se, da uporaba samega olupka zniža izkoristek ekstrakcije. Na podlagi tega sklepamo,
da pri ekstrakciji mešanice olupka in jedilnega dela ptujske čebule z vodo eksrahiramo več
sladkorjev in ostalih komponet iz jedilnega dela čebule.
Slika 4-2 prikazuje, da smo najvišjo vsebnost totalnih fenolov (slika 4-2), ki znaša 57,7 mg/g
materiala, določili v ekstraktu čebulnega olupka pridobljenega s 35 % raztopino etanola pri
80 °C. Najmanj totalnih fenolov (6,1 mg/g materiala) vsebuje vodni ekstrakt olupka,
pridobljen pri temperaturi 60 °C.
Slika 4-2: Vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih, pridobljenih pri različnih ekstrakcijskih
pogojih.
0
10
20
30
40
50
60
mg e
kviv
alen
ta G
A/g
mat
eria
la
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
50
4.1.1 Vpliv uporabljenega čebulnega materiala
Iz slik 4-1 in 4-2 je razviden vpliv na izkoristek ekstrakcije in vsebnost totalnih fenolov
glede na uporabljeno mešanico zmletega olupka in jedilnega dela čebule ali samo zmletega
čebulnega olupka.
Vidimo, da pri uporabi mešanice olupka in jedilnega dela dosežemo višje izkoristke
ekstrakcije, kot pri uporabi samega olupka. Sklepamo lahko, da je to posledica visoke
vsebnosti sladkorjev v jedilnem delu čebule, ki jih voda kot polarno topilo s svojimi
specifičnimi lastnostmi lažje ekstrahira.
Ravno obratno velja za vsebnost fenolnih spojin v pridobljenih ekstraktih. Ta je namreč nižja
v ekstraktu pridobljenem iz mešanice olupka in jedilnega dela in višja v ekstraktu
pridobljenem iz olupka.
Takšno ugotovitev lahko podkrepimo z rezultati raziskave, ki poročajo, da lahko ekstrakt
čebulnega olupka vsebuje tudi od 3 do 5 krat več fenolnih spojin kot ekstrakt pridobljen iz
jedilnega dela čebule. [30] Iz tega sklepamo, da olupek vsebuje več fenolnih spojin kot
jedilni del in zato smo za pridobitev ekstrakta uporabili material zmletega čebulnega olupka.
4.1.2 Vpliv temperature
Iz slik 4-1 in 4-2 lahko sklepamo tudi o vplivu tempertaure na izkoristek in prisotnost
totalnih fenolov v ekstraktih. Ekstrakcije mešanice olupka in jedilnega dela čebule z vodo
smo izvedli pri štirih različnih temperaturah: 95 °C, 80 °C, 60 °C in 45 °C. Opazili smo, da s
padcem temperature izkoristek ekstrakcije pada. Najvišji je pri 95 °C in znaša 53,88 % in
najnižji pri 45 °C, saj znaša 33,42 %.
Podobno velja tudi za vsebnost totalnih fenolov v ekstraktih. Najvišjo vsebnost totalnih
fenolov v materialu (22,5 mg/g materiala) smo določili pri temperaturi 95 °C. Najnižjo
vsebnost totalnih fenolov (6,9 mg/g materiala) pa pri ekstraktu mešanice olupka in jedilnega
dela pri temperaturi 60 °C. Iz tega sklepamo da pri višji temperaturi iz mešanice olupka in
jedelnega dela čebule ekstrahiramo več sladkorjev, kar posledično vpliva na slabšo čistost
našega želenega produkta.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
51
4.1.3 Vpliv dodatka etanola k topilu
Čeprav pri ekstrakciji čebulnega olupka z vodo dosežemo nizek izkoristek ekstrakcije, ta
ekstrakt vsebuje višjo vsebnost totalnih fenolov. Z namenom, da bi ugotovili ali na vsebnost
totalnih fenolov v ekstraktu vpliva uporaba etanola kot topila, smo kot ekstrakcijsko topilo
uporabili tudi mešanico etanola in vode.
Iz slike 4-1 je razvidno, da smo pri uporabi mešanice zmletega olupka in jedilnega dela
čebule pri ekstrakcijski temperaturi 80 °C z dodatkom etanola dosegli višji izkoristek
ekstrakcije, kot tudi višjo vsebnost totalnih fenolov v ekstraktu.
Najvišjo vsebnost totalnih fenolov smo določili v ekstraktu čebulnega olupka pridobljenega s
35 % mešanico etanola (57,7 mg/g materiala). Uporaba etanola pri ekstrakciji čebulnega
olupka pri temperaturi 80 °C je vsebnost totalnih fenolnih spojin v ekstraktu skoraj
podvojila. Z veliko verjetnostjo lahko sklepamo, da etanol kot ekstrakcijsko topilo, zaradi
svoje izrazite selektivnosti izboljša izkoristek ekstrakcije in omogoča pridobitev višje
vsebnosti totalnih fenolnih spojin v čebulnem ekstraktu.
4.1.4 Izbira ekstrakta za hidrolizo in določitev vsebnosti kvercetina
Kot smo že omenili, je odločitev za izbiro ekstrakta za nadaljnje delo (kislinska hidroliza s
HCl, določitev vsebnosti kvercetina, šaržni in kontinurni proces hidrolize s subkritično vodo)
temeljila na čim višji vsebnosti totalnih fenolov.
Čeprav smo najvišjo vsebnost totalnih fenolov (57,7 mg/g materiala) določili v ekstraktu,
pridobljenem z mešanico etanola in vode, smo za delo vseeno izbrali vodni ekstrakt,
pridobljen s 2 h konvencionalno ekstrakcijo čebulnega olupka pri temperaturi 80 °C in
vsebnostjo 29,8 mg/g materiala.
Na ta način smo si olajšali nadaljno delo in preprečili težave pri raztapljanu čebulnega
ekstrakta v vodi, saj vemo, da etanolni ekstrakti niso oz. so slabše topni v vodi. Ta lastnost,
bi lahko povzročala težave pri prečrpavanju raztopine ekstrakta pri kontinuirni hidrolizi
(črpalka ni suspenzijska in prisotni delci v pretočnem fluidu bi lahko povzročili njeno
okvaro). V ta namen bi potrebovali suspenzijsko črpalko, ki ni bila na voljo pri naših
raziskavah. Poleg tega smo se tako izognili uporabi etanola in nastajanju odpadnih topil, saj
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
52
smo želeli raziskati prednosti uporabe vode in vodnih ekstraktov pri hidroliznem postopku s
subkritično vodo.
Samo predvidevamo lahko, da bi višji odstotek etanola v ekstrakcijskem mediju zvišal
vsebnost fenolnih spojin v ekstraktu, kako bi to posledčno vplivalo na odstotek hidrolize
tako v šaržnem kot kontinuirnem hidroliznem sistemu, pa bi bilo v prihodnosti potrebno še
dodatno raziskati.
4.2 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta s
subkritično vodo v šaržnem reaktorju
Pri postopku hidrolize vodne raztopine ekstrakta v šaržnem reaktorju smo opazovali vpliv
temperature, kontaktnega časa, izbranega plina in koncentracije uporabljene raztopine
ekstrakta na učinkovitost in izkoristek hidrotermične hidrolize. Naš cilj je bil najti optimalne
reakcijske parametre, pri katerih bi dosegli najvišji odstotek hidrolize glikozidov kvercetina.
Odstotke hidrolize smo določili na podlagi s HPLC izmerjene vsebnosti kvercetina v
posameznem vzorcu in smo jih preračunali na podlagi vrednosti določenih s kislinsko
hidrolizo vodne raztopine čebulnega ekstrakta s HCl, kjer je hidroliza potekla 100 %.
4.2.1 Vpliv temperature
Kot smo že omenili, je temperatura pomemben parameter pri izvedbi hidroliznih reakcij s
subkritično vodo in močno vpliva na potek hidroliznega procesa. Meritve smo izvedli pri
koncentraciji raztopine ekstrakta 2 mg/ml pri naslednjih temperaturah: 180 °C, 190 °C, 195
°C, 200 °C in 210 °C. Kot inertni plin, s katerim smo v reaktorju ustvarili atmosfero pri 50
bar, smo uporabili dušik. Kontaktni čas vzorca v reaktorju je znašal 15 min.
Glede na meritve prikazane na sliki 4-3, smo eksperimentalno najvišji % hidrolize kvercetina
določili pri temperaturi 195 °C. Ta je znašal 68,9 ± 1,8 %. Najnižji odstotek hidrolize 66,6 ±
0,8 % smo določili pri temperaturi 180 °C. Glede na dosežen najvišji izkoristek hidrolize,
smo nadaljne eksperimente izvajali pri 195 °C.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
53
Slika 4-3: Vpliv temperature na wkvercetina (%).
4.2.2 Vpliv kontaktnega časa
Pri raziskovanju vpliva kontaktnega časa (tk) smo opazovali, kako se spreminja % hidrolize
raztopine ekstrakta s koncentracijo 2 mg/ml pri temperaturi 195 °C in različnem kontaktnem
času: 7,5 min, 10 min, 12,5 min, 15 min in 17,5 min. Kot plin, s katerim smo v reaktorju
ustvarili inertno atmosfero pri 50 bar, smo uporabili dušik.
Slika 4-4: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%).
65
66
67
68
69
180 190 195 200 210
wk
ver
ceti
na (%
)
T (°C)
62
63
64
65
66
67
68
69
70
7,5 10 12,5 15 17,5
wk
ver
ceti
na (%
)
t k (min)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
54
Iz slike 4-4 je razvidno, da smo pri kontaknem času 12,5 min dosegli maksimalni odstotek
hidrolize, ki je glede na vsebnost kvercetina znašal 69,1 ± 0,7 %.
Na podlagi te ugotovitve, smo naslednje eksperimente izvajali pri predhodno določeni
temperaturi 195 °C in kontaktnem času 12,5 min.
4.2.3 Vpliv uporabe CO2
V naslednjem koraku smo opazovali tudi vpliv izbire atmosfere, ki smo jo uporabili pri
eksperimentih za doseganje tlaka v sistemu. Pri dosedanjih eksperimentih smo uporabljali
dušik, sedaj pa smo preizkusili, kako na odstotek hidrolize glikozidov v raztopini čebulnega
ekstrakta vpliva prisotnost CO2. Eksperimente smo izvedli pri koncentraciji vzorca 2 mg/ml,
temperaturi 195 °C, kontaktnem času 12,5 min in naslednjih vrednostih tlaka v sistemu: 50
bar, 90 bar, 150 bar, 215 bar, 380 bar in 545 bar.
Iz slike 4-5 je razvidno, da smo najvišji odstotek hidrolize 76,1 ± 1,4 % določili pri
eksperimentu, kjer smo uporabili CO2 pri tlaku 380 bar. V primerjavi z uporabo dušika pri
50 bar, je uporaba CO2 pri tlaku 380 bar izboljšala odstotek hidrolize iz 69,1 ± 0,7 na 76,1 ±
1,4 %, kar izboljša izkoristek hidrolize za 7 %. Z dodatnim višanjem tlaka CO2 v sistemu
(nad 380 bar) se izkoristek hidrolize bistveno več ne spreminja, zato smo nadaljne
eksperimente izvedli pri tlaku 215 bar CO2.
Slika 4-5: Vpliv uporabe CO2 na wkvercetina (%).
64
66
68
70
72
74
76
78
50 90 150 215 380 545
wk
ver
ceti
na (%
)
P (bar)
CO2
N2
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
55
Prednost uporabe CO2 je v tem, da se pri povišanem tlaku in temperaturi raztaplja v vodi. Pri
tem tvori ogljikovo kislino, ki dodatno znižuje pH reakcijskega medija in tako poveča
hidrolitski potencial vode. Dušik na drugi strani je inerten in zato ne vpliva toliko na
izboljšanje hidrolitskih lastnosti vode. [31]
4.2.4 Vpliv koncentracije
V naslednjem koraku smo študirali vpliv koncentracije raztopine ekstrakta na odstotek
hidrolize. Meritve smo izvedli pri 195 °C, kontaktnem času 12,5 min, uporabi CO2 pri tlaku
215 bar in naslednjih koncentracijah vodne raztopine čebulnega ekstrakta: 0,1 mg/ml; 0,25
mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml; 1,5 mg/ml in 2 mg/ml.
Slika 4-6: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%).
Na podlagi meritev prikazanih na sliki 4-6 vidimo, da smo najvišji odstotek hidrolize dosegli
pri koncentraciji raztopine ekstrakta 0,1 mg/ml. Ta je znašal 98,0 ± 0,8 %. Sklepamo lahko,
da z naraščujočo koncentracijo vodne raztopine ekstrakta čebulnega olupka odstotek
hidrolize pada. Najnižji je torej pri koncentraciji 2 mg/ml in znaša 75,9 ± 1,45 %.
70
75
80
85
90
95
100
0,1 0,25 0,5 1 1,5 2
wk
ver
ceti
na (%
)
γ (mg/ml)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
56
4.3 Vpliv parametrov na učinkovitost hidrolize čebulnega ekstrakta v
kontinuirnem sistemu
Na podlagi izvedenih meritev v šaržnem reaktorju, smo določili optimalne pogoje šaržne
hidrolizne reakcije čebulnega ekstrakta s subkritično vodo. Maksimalni odstotek hidrolize
98,0 ± 0,8 % smo dosegli pri uporabi vodne raztopine čebulnega ekstrakta s koncentracijo
0,1 mg/ml, pri temperaturi 195 °C, kontaktnem času 12,5 min in uporabi CO2 pri tlaku 215
bar. Glede na te pogoje smo načrtovali kontinuirni hidrolizni sistem s fiksno dolžino
reaktorske cevi 700 mm. Spreminjali smo lahko reakcijsko temperaturo, koncentracijo
uporabljene raztopine čebulnega ekstrakta in pretok, ki je vplival na kontaktni čas reakcije.
V tem primeru nismo uporabili atmosfere CO2 v pretočnem sistemu, saj bi tako potrebovali
še eno dodatno CO2 črpalko in pretočni ventil, ki pa pri naših raziskavah nista bila na voljo.
Dejansko smo za vzpostavitev tlaka v sistemu uporabili hidrostatski tlak. Prav tako smo tudi
tukaj želeli došeči najvišji možni odstotek hidrolize.
Za doseganje stacionarnega obratovanja kontinuirnega pretočnega sistema pri izbrani
temperaturi, tlaku in pretoku je potreben določen čas zagona in ustrezna regulacija
parametrov med obratovanjem. Med potekom hidrolizne reakcije pri posamezni
koncentraciji ekstrakta smo v 3 urah na vsakih 15 minut spremljali, kako se s časom
spreminja odstotek hidrolize. Pri nobenem od izvedenih eksperimentov po 3 urah
obratovanja sistema nismo dosegli stacionarnega stanja, ampak je med obratovanjem
odstotek hidrolize pri vseh izvedenih eksperimentih nihal s časom (slika 4-7). Pri izvedbi
eksperimentov sta minimalno nihali vrednosti temperature in tlaka, saj smo ju regulirali
ročno.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
57
Slika 4-7: Trend nihanja wkvercetina (%) s časom obratovanja kontinuirnega sistema glede na
koncentracijo raztopine ekstrakta.
4.3.1 Vpliv pretoka in kontaktnega časa
Pri opazovanju vpliva pretoka na hidrolizo čebulnega ekstrakta v subkritični vodi v
kontinuirnem sistemu, smo izvedli poskuse pri koncentraciji raztopine ekstrakta 0,25 mg/ml,
temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar. Reakcije smo izvedli pri različnih pretokih: 1,1
ml/min (tk= 17,5 min), 1,3 ml/min (tk= 14,9 min), 1,5 ml/min (tk= 12,9 min) in 1,7 ml/min
(tk= 11,4 min). Pri opazovanju vpliva pretoka in kontaktnega časa smo vzorec za analizo
vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirne posode po 1 h obratovanja posameznega
eksperimenta.
Iz meritev na sliki 4-8 je razvidno, da smo pri tk= 12,9 min dosegli najvišji odstotek hidrolize
58,1 ± 1,2 %. Najnižji odstotek hidrolize smo dosegli pri tk= 17,5 min. Ta je znašal 45,8 ±
1,4 %.
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
0 50 100 150 200 250 300
wk
ver
ceti
na (%
)
t (min)
0,1 mg/ml
0,25 mg/ml
0,5 mg/ml
1 mg/ml
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
58
Slika 4-8: Vpliv kontaktnega časa na wkvercetina (%) pri kontinuirnem procesu.
Kontaktni čas (tk), v katerem sta znotraj reaktorske cevi v stiku raztopina ekstrakta in
subkritična voda pri pretoku 1,5 ml/min, znaša 12,9 minut in je pri kontinuirnem hidroliznem
procesu daljši za 0,4 min kot v šaržnem reaktorju. Pri kontinuirnem sistemu se hidroliziran
vzorec v kriostatu (vodni hladilnik) avtomatsko ohladi na sobno (oz. še nižjo) temperaturo.
Pri šaržnem sistemu je razlika ta, da smo vzorec ohlajali ročno, tako da smo odvili izolacijski
ovoj, odstranili grelno kačo in nato avtoklav potopili v mrzlo vodno kopel. Tako smo pri
ohlajanju potrebovali nekaj dodatnega časa. Prav tako je razlika tudi pri procesu segrevanja,
saj v reaktor šaržiramo raztopino ekstrakta pri sobnih pogojih in nato segrejemo. Pri tem
poteče nekaj časa dokler se vsebina reaktorja segreje na reakcijsko temperaturo. Pri
kontinuirnem sistemu pa sta tako raztopina vzorca kot voda ki vstopata v kontakt predhodno
segreta na izbrano temperaturo eksperimenta. Na podlagi tega lahko sklepamo, da sta tako
pri šaržnem kot pri kontinuirnem hidroliznem sistemu kontaktna časa, pri katerih je dosežen
maksimalni izkoristek hidrolize, zelo podobna.
30
35
40
45
50
55
60
11,4 12,9 14,9 17,5
wk
ver
ceti
na (%
)
tk (min)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
59
4.3.2 Vpliv temperature
Pri opazovanju vpliva temperature na odstotek hidrolize v kontinuirnem sistemu smo izvajali
reakcije pri koncentraciji raztopine ekstrakta 0,25 mg/ml, tlaku 100 ± 5 bar in predhodno
določenem kontaktnem času 12,9 min. Reakcije smo izvedli pri naslednjih temperaturah:
180 °C, 190 °C, 200 °C in 210 °C. Pri opazovanju vpliva temperature smo vzorec za analizo
vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirne posode po 1 h obratovanja posameznega
eksperimenta.
Iz slike 4-9 je razvidno da smo najvišji odstotek hidrolize 53,4 ± 1,2 % dosegli pri
temperaturi 200 °C, najnižjega pa pri 180 °C 44,2 ± 0,9 %. V primerjavi s šaržnim
reaktorjem je tukaj določena optimalna temperatura, ki daje najvišji odstotek hidrolize, višja
za 5 °C.
Slika 4-9: Vpliv temperature na wkvercetina (%) pri kont. procesu.
4.3.3 Vpliv koncentracije
Pri opazovanju vpliva koncentracije na odstotek hidrolize v kontinuirnem sistemu smo
poskuse izvedli pri tk = 12,9 min, T= 200 °C, P= 100 ± 5 bar in koncentracijah 0,1 mg/ml,
0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml in 1 mg/ml. Pri opazovanju vpliva koncentracije smo vzorec za
30
35
40
45
50
55
60
180 190 200 210
wk
ver
ceti
na (%
)
T (°C)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
60
analizo vsebnosti kvercetina na HPLC odvzeli iz zbirne posode na vsakih 15 min
obratovanja posameznega eksperimenta. Kot rezultat na sliki 4-10 smo predstavili najvišji
dosežen odstotek hidrolize pri posamezni koncentraciji raztopine ekstrakta.
Iz slike 4-10 je razvidno, da smo najvišji odstotek hidrolize dosegli pri koncentraciji
ekstrakta 0,5 mg/ml. Ta je znašal 82,5 ± 1,5 %. Najnižji odstotek hidrolize 58,2 ± 2,1 % pa
smo dosegli pri koncentraciji ekstrakta 0,25 mg/ml.
Slika 4-10: Vpliv koncentracije na wkvercetina (%) pri kont. procesu.
4.4 Primerjava šaržnega in kontinuirnega procesa
Če primerjamo najvišje odstotke hidrolize pri šaržnem in pri kontinuirnem procesu hidrolize
vodne raztopine čebulnega ekstrakta ugotovimo, da smo maksimalni odstotek hidrolize 98,0
± 0,8 % pri šaržnem procesu dosegli pri uporabi raztopine ekstrakta s koncentracijo 0,1
mg/ml, pri temperaturi 195 °C, tlaku 215 bar CO2 in kontaktnem času 12,5 min, medtem ko
smo pri kontinuirnem procesu hidrolize pri uporabi raztopine ekstrakta s koncentracijo 0,5
mg/ml, pri temperaturi 200 °C, hidrosatskem tlaku 100 bar in kontaktnem času 12,9 min
dosegli 82,5 ± 1,3 % hidrolizo.
15,5 % razliko med maksimalnim % hidrolize pri šaržnem in kontinuirnem procesu lahko
pripišemo temu, da nismo dosegli stacionarnega delovanja kontinuirnega sistema in tudi
50
55
60
65
70
75
80
85
0,1 0,25 0,5 1
wk
ver
ceti
na (%
)
γ (mg/ml)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
61
temu da pri kontinuirnem sistemu nismo vključili atmosfere CO2. Pri izvedbi tako šaržnega
kot kontinuirnega procesa smo temperaturo in tlak v sistemu regulirali ročno in posledično
nismo dosegli dokončnega stacionarnega stanja obratovanja procesa. Z regulacijo tlaka in
temperature med samimi eksperimenti (tako šaržimi in kotinuirnimi) ni bilo večjih težav.
Peristaltična črpalka, ki je v kontinuirnem sistemu prečrpavala našo vodno raztopino
ekstrakta je črpala enakomerno v krajših presledkih, saj je bil njen pretok nastavljen na 0,2
ml/min. Iz tega razloga, znotraj reaktorske cevi, kjer sta v kontakt prišla ekstrakt in voda ni
bilo možno zagotoviti enakomernega mešanja in konstantne koncentracije vodne raztopine
vzorca. Pri šaržnih eksperimentih je bilo mešanje znotraj avtoklava zagotovljeno z
magnetnim mešalom.
Pri kontinuirnem sistemu eksperimentov nismo izvedli v atmosferi s CO2. V primeru, da bi v
sistem vključili še CO2, ki znižuje pH reakcijskega medija in tako poveča hidrolitski
potencial vode, bi verjetno dodatno izboljšali izkoristek hidrolize, tako kot se je to izkazalo
pri šaržnem procesu.
4.5 Produkti hidrotermične degradacije
Kot smo že omenili, pri procesu hidrotermičnih rekcij naravnih materialov nastajajo različni
stranski degradacijski produkti. Tako pri šaržnem kot tudi pri kontinuirnem procesu hidrolize
smo pri rezulatih HPLC analiz zasledili prisotnost različnih komponent. Kvantitativno smo
definirali prisotnost 5-hidroksi metil furfurala (5-HMF) in protokatehuične kisline (3,4-
DHBA).
4.5.1 Stranski produkti pri šaržnem postopku hidrolize
Vsebnosti stranskih produktov v ekstraktih pridobljenih s šaržnimi eksperimenti so zbrane v
spodnji tabeli (tabela 4-1). Vsebnosti 5-HMF in 3,4-DHBA v posameznem vzorcu so podane
kot mg komponente na g hidroliziranega materiala.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
62
Tabela 4-1: Vsebnost stranskih produktov pri šaržnem procesu.
T (°C) tk (min) P (bar) γ vzorca (mg/ml) 5-HMF (mg/g mat.) 3,4-DHBA (mg/g mat.)
170 15 50 2,01 3,81 67,53
180 15 50 2,02 3,79 67,23
190 15 50 2,01 3,82 67,70
200 15 50 2,01 3,80 67,38
210 15 50 2,00 3,83 67,94
200 7,5 50 2,04 11,48 37,40
200 10 50 2,02 11,62 37,85
200 12,5 50 2,02 11,60 37,78
200 15 50 2,02 11,65 37,93
200 17,5 50 2,03 11,61 37,80
200 12,5 50 2,06 18,34 4,27
200 12,5 90 2,01 18,75 4,36
200 12,5 150 2,04 18,52 4,31
200 12,5 215 2,02 18,72 4,36
200 12,5 380 2,06 18,28 4,25
200 12,5 545 2,04 18,50 4,31
200 12,5 215 2,02 27,48 2,67
200 12,5 215 1,52 36,52 3,56
200 12,5 215 1,02 54,24 5,27
200 12,5 215 0,53 105,08 10,21
200 12,5 215 0,29 191,29 18,57
200 12,5 215 0,28 201,74 19,59
200 12,5 215 0,11 498,90 48,43
200 12,5 215 0,11 501,15 48,65
200 12,5 215 0,11 522,03 50,68
Iz tabele 4-1 je razvidno, da sta tako 5-HMF kot tudi 3,4-DHBA prisotna v vseh šaržno
hidroliziranih vzorcih, pri vseh obratovalnih pogojih. Najvišjo vsebnost 5-HMF smo
analizirali pri koncentraciji vzorca 0,1 mg/ml, temperaturi 200 °C, tlaku 215 bar (CO2) in
kontaktnem času 12,5 minut. Ta je znašala 522 mg/g mat. Najvišjo vsebnost 3,4- DHBA smo
določili pri koncentraciji vzorca 2 mg/ml, temperaturi 210 °C, tlaku 50 bar (N2) in
kontaktnem času 15 minut. Ta je znašala 67,94 mg/g mat.
Določili smo kar visoke vsebnosti 5-HMF v hidroliziranih vzorcih. Ker ekstrakt vsebuje
ogromne količine sladkorjev, so rezultati tudi pričakovani. Vendar prisotnost 5-HMF ni
zaželjena iz vidika prehrambene industrije, saj ponazarja kvarjenje živil in je strupen.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
63
4.5.2 Stranski produkti pri kontinuirnem procesu hidrolize
Vsebnosti stranskih produktov v ekstraktih pridobljenih s kontinuirnim sistemom smo zbrali
v spodnji tabeli 4-2. Vsebnosti 5-HMF in 3,4-DHBA v posameznem vzorcu smo preračunali
kot mg komponente na g hidroliziranega materiala.
Tabela 4-2: Vsebnost stranskih produktov pri kont. procesu.
tk (min) γ (mg/ml) 5-HMF
(mg/g mat.)
3,4-DHBA
(mg/g mat.)
0 0,1 / /
15 0,1 / /
30 0,1 / /
45 0,1 / /
60 0,1 / /
75 0,1 / /
90 0,1 / /
105 0,1 / /
120 0,1 / /
135 0,1 / /
150 0,1 / /
165 0,1 / /
180 0,1 / /
195 0,1 / /
210 0,1 / /
225 0,1 / /
240 0,1 / /
0 0,25 / 47,51
15 0,25 / 52,98
30 0,25 / 54,24
45 0,25 / 58,87
60 0,25 / 47,65
75 0,25 / 44,52
90 0,25 / 57,33
105 0,25 / 46,95
120 0,25 / 59,16
135 0,25 / 62,36
150 0,25 / 33,68
165 0,25 / 62,25
180 0,25 / 62,40
195 0,25 / 60,53
210 0,25 / 65,43
225 0,25 / 64,14
240 0,25 / 31,58
0 0,5 / 43,17
15 0,5 / 29,86
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
64
30 0,5 / 22,43
45 0,5 / 29,34
60 0,5 / 17,41
75 0,5 / 33,35
90 0,5 / 19,10
105 0,5 / 41,09
120 0,5 / 47,87
135 0,5 / 32,93
150 0,5 / 42,58
165 0,5 / 36,10
180 0,5 / 40,10
195 0,5 / 39,26
210 0,5 / 40,56
225 0,5 / 31,75
240 0,5 / 27,18
0 1 / 9,61
15 1 2,66 17,36
30 1 3,54 18,91
45 1 3,43 20,28
60 1 3,60 19,27
75 1 3,61 17,78
90 1 3,85 17,99
105 1 4,38 18,20
120 1 4,57 17,23
135 1 4,17 16,97
150 1 3,34 14,81
165 1 2,67 15,15
180 1 2,25 12,74
195 1 / 12,16
Iz tabele 4-2 je razvidno, da smo vsebnost 5-HMF pri kontinuirnem eksperimentu določili le
v hidrolizirani vodni raztopini čebulnega ekstrakta s koncentracijo 1 mg/ml. 2,3-DHBA je
kot stranski produkt identificiran pri hidroliziranih vzorcih s koncentracijo ekstrakta: 0,25
mg/ml, 0,5 mg/ml in 1 mg/ml. Najvišjo vsebnost 5-HMF pri kontinurnem procesu hidrolize
smo zasledili pri koncentraciji vzorca 1 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar. Ta
je znašala 4,57 mg/g mat. Najvišjo vsebnost 3,4-DHBA pri kontinuirnem procesu hidrolize
smo analizirali pri koncentraciji vzorca 0,25 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar.
Ta je znašala 65,43 mg/g mat.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
65
4.6 Končni hidroliziran produkt
Kot naš končni hidroliziran produkt, smo pri kontinuirnem eksperimentu s koncentracijo 0,5
mg/ml zbrali celoten hidrolizirani vzorec (250 ml) in uparili 90 ml topila. S tem smo produkt
koncentrirali do stopnje, pri kateri so delci vidno precipitirali v raztopini (slika 4-11 a in b).
S centrifugo smo ločili delce in vodno fazo. Delce smo nato raztopili v metanolu ter vodno
in metanolno fazo analizirali glede na vsebnost kvercetina. Maso suhega preostanka v
posamezni fazi smo določili gravimetrično s sušenjem. Rezultati določanja vsebnosti
kvercetina v posamezni fazi so prikazani v tabeli 4-3.
Tabela 4-3: Rezultati gravimetričnega določanja vsebnosti kvercetina.
Metanolna
faza
Vodna
faza
m (suh pre.) (mg) 1270 1240
γ (QU) (ng/μl) 678,38 16,29
w kvercetina 53,42 1,31
5-HMF (mg/g mat.) / 23,62
Po HPLC analizi obeh faz se je izkazalo, da suh preostanek metanolne faze vsebuje 53,4 %
kvercetina, suh preostanek vodne faze pa le 1,3 % kvercetina (enačba 3.5). Takšen rezultat
lahko utemeljimo z dejstvom, da je kvercetin komponenta, ki je dobro topna v metanolu in le
v sledovih topna v vodi. Vidimo tudi, da smo pri tem od metanolne (s kvercetinom bogate
faze) odstranili neželeni 5-HMF.
Slika 4-11: a) Raztopina hidroliziranega vzorca pred in po uparjanju, b) precipitirani delci
kvercetina ob steni bučke.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
66
5 Zaključek
Pri nastanku magistrskega dela smo izvedli študijo možnosti uporabe subkritične vode kot
hidroliznega medija za selektivno razgradnjo glikozidno vezanih antioksidantov v
konvencionalno ekstrahiranem ekstraktu ptujske rdeče čebule. Ekstraktu smo določili
vsebnost totalnih fenolov s Folin-Ciocalteu metodo. Prav tako smo izvedli hidrolizo
ekstrakta po postopku kislinske hidrolize s HCl in s tem določili maksimalno vsebnost
kvercetina. Preučevali smo vpliv parametrov (temperatura, tlak, uporabljena vrsta plina v
avtoklavu, kontaktni čas in koncentracija raztopine ekstrakta) na izkoristek hidrolize s
subkritično vodo v šaržnem in kontinuirnem reaktorju. Na ta način smo želeli razviti proces
hidrotermične hidrolize s subkritično vodo brez uporabe korozivnih kislin. Kvalitativno in
kvantitativno vsebnost kvercetina v hidroliziranih vzorcih smo določili s HPLC analizo.
Ugotovili smo, da je bil najvišji izkoristek ekstrakcije dosežen pri uporabi zmlete mešanice
olupka in jedilnega dela čebule z vodo pri temperaturi 95 °C. Znašal je 53,9 %. Najnižji
izkoristek ekstrakcije smo določili pri ekstrakciji čebulnega olupka s 20 % raztopino etanola.
Ta je pri temperaturi 80°C znašal 9,9 %.
Najvišjo vsebnost totalnih fenolov (57,7 mg/g materiala) smo določili v ekstraktu čebulnega
olupka pridobljenega s 35 % mešanico etanol-voda. Dodatek etanola je vsebnost fenolnih
spojin v ekstraktu čebulnega olupka skoraj podvojil. Kljub nižji vsebnosti totalnih fenolnih
spojin smo za nadaljne eksperimente s subkritično vodo uporabili vodni ekstrakt, ki je
vseboval 29,8 mg ekvivalenta GA/g materiala.
Najvišji odstotek hidrolize smo dosegli s šaržnim postopkom pri eksperimentalno optimalno
določenih pogojih: 195 °C, kontaktnem času 12,5 min, uporabi CO2 pri tlaku 215 bar in
koncentraciji vodne raztopine ekstrakta 0,1 mg/ml. Ta je znašal 98,0 ± 0,8 %.
Najvišji odstotek hidrolize glukozidov kvercetina s kontinuirnim procesom smo dosegli pri
temperaturi 200 °C, tlaku 100 ± 5 bar in koncentraciji raztopine ekstrakta 0,5 mg/ml. Ta je
znašal 82,5 %.
HPLC analize so pokazale, da poleg ostalih, neznanih stranskih produktov, kot stranska
produkta med postopkom hidrolizne reakcije nastajata 5-hidroksi metil furfural in 3,4-
dihidroksi benzojska kislina. Najvišjo vrednost 5-HMF pri šaržnem procesu (522,03 mg/g
materiala) smo določili pri koncentraciji vzorca 0,1 mg/ml, temperaturi 200 °C, tlaku 215
bar (CO2) in kontaktnem času 12,5 minut. Najvišjo vrednost 3,4-DHBA pa smo določili pri
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
67
koncentraciji vzorca 2 mg/ml, temperaturi 210 °C, tlaku 50 bar (N2) in kontaktnem času 15
minut in je znašala 67,94 mg/g materiala. Pri kontinurnem procesu hidrolize smo najvišjo
vsebnost 5-HMF določili pri koncentraciji vzorca 1 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100
± 5 bar. Ta je znašala 4,57 mg/g materiala.
Najvišjo vsebnost 3,4-DHBA pri kontinuirnem procesu hidrolize pa pri koncentraciji vzorca
0,25 mg/ml, temperaturi 200 °C in tlaku 100 ± 5 bar in je znašala 65,43 mg/g materiala.
Na podlagi šaržno in kontinuirno izvedenih meritev opazimo, da s kontinuirnim
obratovanjem hidrolize s subkritično vodo, zmanjšamo nastanek strupenega 5-HMF.
Pri gravimetričnem določanju prisotnosti čistega kvercetina v kontinuirno hidroliziranem
vzorcu s koncentracijo 0,5 mg/ml se je izkazalo, da suh preostanek metanolne faze (s
kvercetinom bogate faze) vsebuje 53,4 % kvercetina in ne vsebuje 5-HMF, suh preostanek
vodne faze (s kvercetinom revne faze) pa le 1,3 % kvercetina.
Magistrsko delo bi v prihodnosti lahko nadgradili in dopolnili tako, da bi izvedli dodatne
HPLC analize ostalih komponent, ki nastanejo kot stranski produkt hidroliznih reakcij s
subkritično vodo. Glede na to, da pri kontinuirnem procesu nismo dosegli stacionarnega
stanja hidrolize, bi morali posamezni eksperiment izvajati dlje časa, dovršiti regulacijo
parametrov (predvsem tlaka in temperature) in zagotoviti suspenzijsko črpalko, ki bi
omogačala enakomerno črpanje vzorca ekstrakta skozi sistem. Za šaržni in kontinuirni
postopek hidrolize bi lahko poskusili uporabiti tudi etanolni ekstrakt, saj vsebuje višjo
vsebnost totalnih fenolov. Na podlagi tega sklepamo, da bi na ta način lahko izboljšali
pridobljeno količino kvercetina iz hidroliziranega vzorca. Dodatno izboljšanje odstotka
hidrolize pri kontinuirnem sistemu bi najvrjetneje dosegli tudi z uporabo CO2 v sistemu.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
68
6 Literatura
[1] Laura Jaime, Esperanza Molaa, Almudena Fernandez, Maria A. Martin-Cabrejas,
Fracisco J. Loapez-Andreau, Androsa M. Esteban. Structural Carbohydrate
Differences and Potential Source of Dietary Fiber of Onion (Allium cepa L.) Tissues.
J. Agric. Food Chem. 50, 122-128, 2002.
[2] Feridoun Salak, Somayeh Daneshvar, Jalal Abedi, Koji Furukawa. Adding value to
onion (Allium cepa L.) waste by subcritical water treatment. Fuel Processing
Technology. 112, 86–92, 2013.
[3] Keerthi Srinivas, Jerry W. King, Luke R. Howard, Jeana K. Monrad. Solubility and
solution thermodynamic properties of quercetin and quercetin dihydrate in subcritical
water. Journal of Food Engineering. 100, 208–218, 2010
[4] Wahyudiono, Siti Machmudah and Motonobu Gotol. Utilization of Sub and
Supercritical Water Reactions in Resource Recovery of Biomass Wastes.
ENGINEERING JOURNAL. 17, Issue 1, 2013.
[5] http://www.ptujski-luk.si/slovenska-avtohtona-sorta.html (dostop 29.6.2015)
[6] http://www.deloindom.si/vrt-zivali/sejem-agra-o-slovenski-cebuli-cesnu(dostop
15.5.2015)
[7] http://www.mko.gov.si/fileadmin/mko.gov.si/pageuploads/podrocja/Varna_in_kakovo
stna_hrana_in_krma/zasciteni_kmetijski_pridelki/Specifikacije/PTUJSKI_LUK_01
dostop 2.7.2015)
[8] http://www.herballegacy.com/Wilson_Chemical.html (dostop 6.7.2015)
[9] Nagendran Balasundrama, Kalyana Sundramb, Samir Sammana. Phenolic compounds
in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and
potential uses. Food Chemistry. 99, 191–203, 2006.
[10] Alexandra B. Bentz. A Review of Quercetin: Chemistry, Antioxidant Properties, and
Bioavailability. Journal of jung investigators. 2009.
[11] Wei Zheng, Shiow Y. Wang. Antioxidant Activity and Phenolic Compounds in
Selected Herb. J. Agric. Food Chem. 49, 5165−5170, 2001.
[12] http://www.jyi.org/issue/a-review-of-quercetin-chemistry-antioxidant-properties-and-
bioavailability/ (dostop 10.7.2015)
[13] Min-Jung Koa, Chan-Ick Cheigha, Sang-Woo Choa, Myong-Soo Chunga. Subcritical
water extraction of flavonol quercetin from onion skin, Journal of Food Engineering
102, 327–333, 2011.
[14] Irena Pavlovič, Željko Knez, Mojca Škerget. H drothermal Reactions of Agricultural
and Food Processing Wastes in Sub- and Supercritical Water: A Review of
Fundamentals, Mechanisms, and State of Research. J. Agric Food Chem. 2013.
[15] A. Shitu, S. Izhar, T. M. Tahir. Sub-critical water as a green solvent for production of
valuable materials from agricultural waste biomass. A review of recent work. Global
Journal of Environmental Science and Managment. 1, 255-264, 2015.
[16] A. A. Peterson, F. Vogel, R.P. Lachance, M. Frohling, M.J.Antal, J. W. Tester:
Thermochemical biofuel production in hydrothermal media; A reviu of sub- and
supercritical water tehnologies. Energy and Enviromental Science. Issue 1, 2008.
[17] Matej Ravber, Željko Knez, Mojca Škerget. Optimization of h drol sis of rutin in
subcritical water using responsesurface methodology. The Journal of Supercritical
Fluids. 2015
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
69
[18] Nermin Simsek Kus, Organic reactions in subcritical and supercritical water,
Tetrahedron 68 (2012), str. 949-958
[19] Željko Knez, Mojca Škerget. Termodifuzijski separacijski procesi. Fakulteta za
kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, Maribor, 2006.
[20] R. Boopathy, H. Bokang, L. Daniel. Biotransformation of furfural and 5-
hydroxymethyl furfural by enteric bacteria. Journal of Industrial Microbiology. 11,
147-150, 1993.
[21] https://sl.wikipedia.org/wiki/Hidroksimetilfurfural (dostop 20.1.2016)
[22] Suzan Zein ALabdeen Makawi, Mohammed Idrees Tah.a, Badawi Ahmed Zakaria,
.Babeker Siddig, Hazeim Mahmod, Abedel Rahim Mohamed Elhussein, Elrasheed
Ahmed Gad Kariem. Identification and Quantification of 5-Hydroxymethyl Furfural
H) MF in Some Sugar-Containing Food Products by HPLC. Pakistan Journal of
Nutrition. 8, 1391-1396, 2009
[23] Beatrice Kaufmann and Philippe Christen. Recent Extraction Techniques for Natural
Products: Microwave-assisted Extraction and Pressurised Solvent Extraction.
[24] Željko Knez, Mojca Škerget. Termodifuzijski separacijski procesi. Fakulteta za kemijo
in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, Maribor, 2006.
[25] Jin Dai, Russell J. Mumper. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their
Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules. 15, 7313-7352, 2010.
[26] www.weizmann.ac.il/g-chem/.../continious%20batch.do...(dostop 5.2.2016)
[27] Zorka Novak Pintarič, Načrtovanje in integracija procesov, zbrano gradivo za predmet
Načrtovanje procesov, Maribor 2013
[28] M. Škerget, K. Makovšek, T. Perko, Osnove tehnologije živilskih izdelkov, navodila
za vaje, Maribor, 2012
[29] Andressa Blainski, Gisel Cristin Lopes and João Carlos Palazzo de Mello.
Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the
Total Phenolic Content from Limonium Brasiliense. Molecules. 18, 6852-6865, 2013.
[30] M. Škerget, L.Majhenič, M. Bezjak, Ž. Knez. Antioxidant, Radical Scavenging and
Antimicrobial Activities of red onion (Allium cepa L) Skin and Edible Part Extracts.
Chem. Biochem. Eng. 435-444, 2009.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
70
7 Priloge
7.1 Umeritvena krivulja z GA
Slika 7-1: Umeritvena krivulja z GA za določitev totalnih fenolov.
7.2 HPLC kromatogrami
Slika 7-2: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 15 min, N2.
Abs = 9,9312γ + 0,0113
R² = 0,9988
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
Abs
(AU
)
γ (mg/ml)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
71
Slika 7-3: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, N2.
Slika 7-4: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 2 mg/ml, 195 °C, 12,5 min, CO2.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
72
Slika 7-5: Kromatogram šaržno hidroliziranega vzorca γ = 0,1 mg/ml, 195 °C, 12,5 min,
CO2.
Slika 7-6: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,25 mg/ml, 200 °C, 12,9
min, 96 bar.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
73
Slika 7-7: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,25 mg/ml, 180 °C, 12,9
min, 97 bar.
Slika 7-8: Kromatogram kontinuirno hidroliziranega vzorca γ = 0,5 mg/ml, 200 °C, 12,9
min, 98 bar.
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
74
7.3 Trendi nihanja % hidrolize med obratovanjem kontinuirnega
sistema
Slika 7-9: Nihanje wkvercetina (%) s časom pri koncentraciji 0,1 mg/ml.
Slika 7-10: Nihanje wkvercetina (%) s časom pri koncentraciji 0,25 mg/ml.
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
wk
ver
ceti
na (%
)
t (min)
20
30
40
50
60
70
80
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
wk
ver
ceti
na (%
)
t (min)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
75
Slika 7-11: Nihanje wkvercetina (%) s časom pri koncentraciji 0,5 mg/ml.
Slika 7-12: Nihanje wkvercetina (%) s časom pri koncentraciji 1 mg/ml.
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
wk
ver
ceti
na (%
)
t (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
wk
ver
ceti
na (%
)
t (min)
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
76
8 Življenjepis
OSEBNI PODATKI:
Ime in priimek: Jožica Ulčnik
Naslov: Zagaj 24, 3256 Bistrica ob Sotli
Spol: ženski
Datum rojstva: 27. 5. 1991
Kraj rojstva: Brežice
Državljanstvo: slovensko
Kontaktna št.: 031/868-613
E-mail: [email protected]
IZOBRAZBA:
Fakulteta
Leto: 2013- (predvidoma) 2016
Naziv šole: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor
Smer/Program: kemijska tehnika, univerzitetni magistrski program
(Pridobljeni naziv: magistra inženirka kemijske tehnike (UN))
Leto: 2010- 2013
Naziv šole: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Maribor
Smer/Program: kemijska tehnologija, univerzitetni program
Pridobljeni naziv: diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN)
Srednja šola
Leto: 2006-2010
Naziv šole: Škofijska gimnazija Antona Martina Slomška Maribor
Smer/Program: klasična gimnazija
Pridobljeni naziv: gimnazijski maturant
Osnovna šola
Leto:1998-2006
Naziv šole: Osnovna šola Bistrica ob Sotli
Hidroliza glikozidno vezanih antioksidantov v čebulnem ekstraktu s subkritično vodo
77
DELOVNE IZKUŠNJE:
Leto (od-do): 9.6.-21.7.2013
Podjetje: Krka d.d., Šmarješka cesta 6, 8501 Novo mesto
Delovno mesto: ORSM
Delovne naloge:
- Opravljanje delovne prakse
Leto (od-do): 1.6.-19.7.2014
Podjetje: Krka d.d., Šmarješka cesta 6, 8501 Novo mesto
Delovno mesto: ORSM
Delovne naloge:
- Opravljanje delovne prakse
Leto (od-do): 16.11.2015 -
Podjetje: Krka d.d., Šmarješka cesta 6, 8501 Novo mesto
Delovno mesto: LOA
Delovne naloge:
- Študenstko delo- tehnik v laboratoriju
ZNANJE JEZIKOV (1 - SLABO, 5 - ODLIČNO):
JEZIK GOVORNO PISNO RAZUMEVANJE
slovenski 5 5 5
hrvaški 4 4 4
nemški 3 3 4
angleški 4 4 4
RAČUNALNIŠKA ZNANJA (1 - SLABO, 5 - ODLIČNO):
Word 5
Excel 5
PowerPoint 5
internet 5
e- pošta 5
MOJE KOMPETENCE:
- komunikativnost,
- hitra prilagodljivost,
- samostojnost pri delu,
- odgovornost,
- kreativnost
- natančnost,
- organizacijske sposobnosti,
- sposobnost pomagati drugim ljudem oz. sodelavcem,
- vztrajnost,
- potrpežljivost,
- vozniško dovoljenje B kategorije