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MAITÊ COSTA DA SILVA
HIDROLISADOS ENZIMÁTICOS DOCONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DO LEITE:
REMOÇÃO DE FENILALANINA, GRAU DEHIDRÓLISE E PERFIL PEPTÍDICO
Faculdade de Farmácia da UFMGBelo Horizonte, MG
2009
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MAITÊ COSTA DA SILVA
HIDROLISADOS ENZIMÁTICOS DOCONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DO LEITE:
REMOÇÃO DE FENILALANINA, GRAU DEHIDRÓLISE E PERFIL PEPTÍDICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade deFarmácia da Universidade Federal de Minas Gerais,como requisito parcial à obtenção do grau de Mestreem Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra Marialice Pinto C. Silvestre
Faculdade de Farmácia da UFMGBelo Horizonte, MG
2009
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3
Ao meu eterno e grande amor Breno
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a concretização deste trabalho:
À Deus, amigo fiel, quem guia meus passos e me dá força para seguir em frente sempre.
Ao meu marido Breno Barbosa Cerqueira Alves, agradeço por me mostrar a cada dia, de
maneira sutil e com toda a sua sabedoria, que somos o que queremos ser. Considero-me
privilegiada por ter alguém tão especial ao meu lado. Te amo eternamente!
Aos meus pais, Renato César da Silva e Maria Sílvia Costa pelo incentivo, carinho e amor
incondicional. Como é bom poder compartilhar com vocês as minhas vitórias e pedir colo
em minhas angústias: amo vocês!
Aos meus irmãos, Matheus Costa da Silva e Marcus Costa da Silva, por tornar os meus
dias mais alegres e por fazer parte da minha vida de maneira tão especial. Amo vocês!
A toda a minha família que está sempre vibrando por mim, enviando energia positiva em
todos os momentos. Obrigada!
À professora Doutora Marialice Pinto Coelho Silvestre por exercer o seu trabalho de forma
gloriosa, por sua criteriosa orientação e por sua contribuição para o meu crescimento.
Aos membros da banca examinadora, professor Doutor Amintas Fabiano de Souza
Figueiredo (FAFAR/UFMG), à professora Doutora Evelyn de Souza Oliveira
(FAFAR/UFMG) e ao professor Doutor David Lee Nelson (FAFAR/UFMG), pela valiosa
contribuição na finalização deste trabalho.
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, pelo
incentivo e contribuição na minha formação.
Ao professor Doutor José Virgílio Coelho (FAFAR/UFMG), por me transmitir seus
conhecimentos de forma tão gentil e por me incentivar na busca pelo saber.
À professora Doutora Nísia Andrade Villela Dessimoni Pinto (UFVJM), por quem tenho
grande admiração e respeito. Obrigada por contribuir de forma admirável em minha
formação, obrigada pelo carinho e pelos seus ensinamentos.
Às queridas amigas Raquel Linhares Carreira e Michely Capobiango, vocês são muito
especiais para mim! Amigas, irmãs, companheiras, conselheiras, enfim, parte integrante
da minha vida, sempre. Obrigada pelos deliciosos momentos desfrutados com vocês!
5
Á querida amiga Viviane Dias Medeiros pelo aconchego de suas palavras, pelos
ensinamentos, por me ouvir sempre com tanto carinho. Você é muito especial, obrigada
por tudo!
Às estagiárias do Laboratório de Bromatologia/Pesquisa por suas valiosas contribuições
para a conclusão deste trabalho. Obrigada!
A todas as colegas de mestrado, pela amizade pelos divertidos momentos, conversas,
conselhos e trocas de experiências. Obrigada meninas!
Aos funcionários da FAFAR/UFMG por trabalharem de forma harmoniosa, permitindo
contribuindo de alguma forma para o desenvolvimento de minhas atividades acadêmicas.
Ao Marcão, por deixar o meu dia mais alegre, por sua simpatia e sua satisfação em ajudar.
Obrigada Marcão!
Á Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pela concessão da bolsa de mestrado.
6
“Viva como se fosse morrer amanhãAprenda como se fosse viver para sempre”.
Mahatma Gandhi
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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS............................................................................................... 11
LISTA DE FIGURAS................................................................................................ 12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.............................................................. 13
RESUMO..................................................................................................................... 14
ABSTRACT................................................................................................................ 16
INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 18
OBJETIVO GERAL.................................................................................................. 21
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 22
1 REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................. 22
1.1HIPERFENILALANINEMIAS.................................................................................... 221.1.1 Classificação........................................................................................................ 251.1.2 Fenilcetonúria clássica....................................................................................... 261.1.3 Diagnóstico.......................................................................................................... 271.1.4 Tratamento........................................................................................................... 30
2 RECOMENDAÇÕES NUTRICIONAIS PARA FENILCETONÚRICOS.... 30
2.1 Substitutos protéicos............................................................................................. 312.2 Mistura de aminoácidos......................................................................................... 322.3 Hidrolisados protéicos com baixo teor de fenilalanina...................................... 33
3 SORO DO LEITE................................................................................................... 34
3.1 Proteínas do soro do leite..................................................................................... 35
3.1.1 α-Lactoglobulina.................................................................................................. 36
3.1.2 β - Lactoalbumina................................................................................................ 37
3.2 Concentrado protéico do soro do leite (WPC)..................................................... 40
4 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS................................................. 40
4.1 Importância............................................................................................................. 414.2 Processo de hidrólise............................................................................................ 424.3 Fatores interferentes.............................................................................................. 44
8
4.4 Proteases................................................................................................................ 464.5 Algumas proteases comerciais............................................................................. 464.5.1 Protezyn L............................................................................................................ 464.5.2 Corolase LAP....................................................................................................... 474.5.3 Protemax N200..................................................................................................... 474.5.4 Corolase L10........................................................................................................ 474.5.5 Protemax N411..................................................................................................... 484.5.6 Corolase PP......................................................................................................... 484.5.7 Corolase TS.......................................................................................................... 494.5.8 Flavourzyme......................................................................................................... 49
5 REMOÇÃO DA FENILALANINA....................................................................... 49
5.1 Métodos de remoção.............................................................................................. 505.2 Avaliação da eficiência da remoção..................................................................... 51
6 CARACTERIZAÇÃO DOS HIDROLISADOS PROTÉICOS....................... 52
6.1 Grau de Hidrólise.................................................................................................... 536.2 Perfil Peptídico....................................................................................................... 55REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 64TRABALHO EXPERIMENTAL...................................................................................... 67CAPÍTULO I- OBTENÇÃO DE HIDROLISADOS ENZIMÁTICOS DOCONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DO LEITE (WPC) COM BAIXO TEOR DEFENILALANINA.............................................................................................................
67
RESUMO........................................................................................................................ 68ABSTRACT.................................................................................................................... 691 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 712 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 712.1 MATERIAL............................................................................................................... 712.2 MÉTODOS............................................................................................................... 712.2.1 Determinação da composição química da matéria-prima............................... 712.2.2 Preparo dos hidrolisados protéicos.................................................................. 722.2.3 Remoção de fenilalanina dos hidrolisados protéicos.............................. 732.2.4 Efeito de alguns parâmetros sobre o preparo dos hidrolisados protéicoscom baixo teor de fenilalanina....................................................................................
73
9
2.2.5 Avaliação da eficiência da remoção de fenilalanina........................................ 752.2.6 Análise estatística............................................................................................... 753 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................. 763.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO CONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DOLEITE.............................................................................................................................
76
3.2 EFICIÊNCIA DA REMOÇÃO DE FENILALANINA.................................................. 773.3 EFEITO DE ALGUNS PARÂMETROS SOBRE A REMOÇÃO DEFENILALANINA.............................................................................................................
79
3.3.1 Efeito do tipo de enzima.................................................................................... 803.3.2 Efeito da relação enzima: substrato.................................................................. 813.3.3 Efeito da concentração da matéria-prima........................................................ 823.3.4 Efeito do tempo de reação.................................................................................. 834 CONCLUSÃO ........................................................................................................... 83REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 84CAPÍTULO II-GRAU DE HIDRÓLISE E PERFIL PEPTÍDICO DE HIDROLISADOSENZIMÁTICOS DO CONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DO LEITE....................
87
RESUMO........................................................................................................................ 87ABSTRACT.................................................................................................................... 881 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 892 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 912.1 MATERIAL............................................................................................................... 912.2 MÉTODOS............................................................................................................... 922.2.1 Preparo dos hidrolisados protéicos.................................................................. 922.2.2 Determinação do Grau de Hidrólise (GH).......................................................... 922.2.3 Caracterização do perfil peptídico dos hidrolisados de WPC........................ 932.2.4 Análise Estatística............................................................................................... 933 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................. 953.1 GRAU DE HIDRÓLISE............................................................................................ 953.2 PERFIL PEPTÍDICO DOS HIDROLISADOS PROTÉICOS DE WPC..................... 963.2.1 Teor de peptídeos e aminoácidos livres dos hidrolisados de WPC .............. 973.3 EFEITO DOS PARÂMETROS HIDROLÍTICOS SOBRE O GRAU DE HIDRÓLISEE PERFIL PEPTÍDICO..............................................................................
99
10
3.3.1 Efeito de diferentes enzimas.............................................................................. 993.3.2 Efeito da relação E: S e concentração da matéria-prima................................ 1013.4 CORRELAÇÃO ENTRE PERFIL PEPTÍDICO E GRAU DE HIDRÓLISE.............. 1044 CONCLUSÃO............................................................................................................. 105REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 107CONCLUSÕES INTEGRADAS E PERSPECTIVAS..................................................... 110
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LISTA DE TABELAS
1 Classificação das hiperfenilalaninemias, de acordo com a atividadeenzimática e os níveis séricos de fenilalanina ................................................... 24
2 Prescrição dietética de Phe, de acordo com os níveis séricos obtidos pelatriagem neonatal .................................................................................................... 29
3 Composição centesimal dos produtos do soro do leite .................................... 38
I.1 Características das proteases utilizadas para o preparo dos hidrolisadosprotéicos ................................................................................................................ 72
I.2 Parâmetros empregados no preparo dos hidrolisados protéicos doconcentrado protéico do soro do leite (WPC) .................................................... 74
I.3 Composição química do concentrado protéico do soro do leite ..................... 77
I.4 Percentual de remoção e teor final de fenilalanina dos hidrolisadosprotéicos do concentrado protéico do soro do leite ......................................... 78
II.1 Características das proteases utilizadas para o preparo doshidrolisados protéicos .......................................................................................... 94
II.2 Parâmetros empregados no preparo dos hidrolisados protéicos deconcentrado protéico do soro do leite (WPC) .................................................... 95
II.3 Grau de hidrólise dos hidrolisados protéicos de WPC ..................................... 96
II.4 Teor de peptídeos e de aminoácidos livres nas frações cromatográficas doshidrolisados do concentrado protéico do soro de leite .................................... 100
II.5 Correlação entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico dos hidrolisadosenzimáticos do WPC ............................................................................................. 105
12
LISTA DE FIGURAS
1 Vias metabólicas da fenilalanina e tirosina ........................................... 232 Principais etapas do trabalho experimental do Capítulo 1................... 653 Principais etapas do trabalho experimental do Capítulo 2................... 66II.1 Perfil cromatográfico do hidrolisado H1 a 230 nm ............................... 97
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACE - Enzima conversora de angiotensina
ACF - Área corrigida da fração
BH4 - Tetrahidrobiopterina
EDS - Espectrofotometria Derivada Segunda
E:S - Relação enzima e substrato
GH - Grau de hidrólise
HPA - Hiperfenilalaninemias
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular
PAH - Fenilalanina hidroxilase
SE-PHEA - Cromatografia líquida de alta eficiência
PKU - Fenilcetonúria
WHEY - Soro de leite
WPC - Whey Protein Concentrate
14
RESUMO
Um dos objetivos deste trabalho consistiu em estudar as condições enzimáticas de
hidrólise protéica e a remoção de fenilalanina (Phe), utilizando-se o concentrado protéico
do soro do leite (WPC) como matéria-prima, com o intuito de obter um alimento ou
ingrediente alimentar para ser utilizado na dieta de fenilcetonúricos. Além disso,
caracterizou-se os hidrolisados do WPC, em relação ao grau de hidrólise (GH) e o perfil
peptídico, avaliando-se o efeito do tipo de enzima, da relação enzima:substrato e da
concentração da matéria-prima. Foi, igualmente, verificada a existência de correlação
entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico. Inicialmente, foram estudadas diferentes
condições de hidrólise enzimática das proteínas do WPC e o carvão ativado (CA) foi
empregado como meio adsorvente na remoção de Phe. O Efeito de alguns parâmetros,
tais como tipo de enzima, relação E: S, concentração da matéria prima e tempo de
hidrólise foi avaliado. Após passagem dos hidrolisados por coluna de CA, a Phe foi
quantificada por espectrofotometria derivada segunda (EDS). O emprego da pancreatina
na relação E:S de 1:100, concentração da matéria-prima de 10% e tempo de hidrólise de 5
horas, mostrou ser a condição mais eficiente, obtendo-se 81,3% de remoção de Phe,
correspondentes a um teor final de 394,1 mg/100 g de hidrolisado. Posteriormente, foi
avaliado o grau de hidrólise dos doze hidrolisados do WPC, que apresentaram maior
percentual de remoção de Phe, por meio da relação entre os teores de nitrogênio α-
aminado e total. Da mesma forma, esses doze hidrolisados foram analisados quanto ao
perfil peptídico, empregando-se o fracionamento por cromatografia líquida de alta
eficiência de exclusão molecular, seguido do método rápido da Área Corrigida da Fração
que foi aplicado na quantificação dos peptídeos e aminoácidos livres. O hidrolisado de
WPC obtido pela ação da pancreatina e da protease do A. oryzae, ambas na relação E:S
de 1:100 e concentração da matéria-prima de 10%, levaram à obtenção dos maiores
valores de grau de hidrólise (30% e 27%, respectivamente). Em relação ao perfil peptídico,
a utilização da protease do A. oryzae e da pancreatina, na relação E:S de 1:100 e
concentração da matéria-prima de 10% e 7%, respectivamente, levou à obtenção do
hidrolisado com maior conteúdo de di-tripeptídeos (16,14% e 9,12%, respectivamente) e
menor teor de grandes peptídeos (média de 20%). Além disso, foi observada a existência
15
de correlação de fraca intensidade de associação entre o grau de hidrólise e o perfil
peptídico, tendo sido positiva para as frações F2, F3 e F4 e negativa para a F1.
Palavras-chave: WPC; hidrolisados enzimáticos; fenilalanina; grau de hidrólise; perfil
peptídico.
16
ABSTRACT
ENZYMATIC HYDROLYSATES OF WHEY PROTEIN CONCENTRATE:PHENYLALANINE REMOVAL, DEGREE OF HYDROLYSIS AND PEPTIDE PROFILE.
One of the purposes of this work was to study the enzymatic conditions for hydrolyzing
proteins and the phenylalanine (Phe) removal, using whey protein concentrate (WPC) as
substrate, aiming the preparation a food or a food ingredient to be used in phenilketonuric’s
diet. Moreover, WPC hydrolysates were characterized in relation to degree of hydrolysis
(DH) and peptide profile, and the effect of the enzyme type, E:S ratio and substrate
concentration was analyzed. In addition, the existence of a correlation between the degree
of hydrolysis and the peptide profile was verified. Initially, different enzymatic hydrolysis
conditions of WPC proteins were studied, and the activated carbon (AC) was used as
adsorbent for Phe removal. The effect of some parameters such as enzyme type, E:S ratio,
substrate concentration and time of hydrolysis was evaluated. After passing the
hydrolysates through an AC column, Phe was quantified by second derivative
spectrophotometry (SDS). The use of pancreatin in a E:S of 1:100, substrate concentration
of 10% and reaction time of 5 hours showed to be the most efficient condition, leading to a
Phe removal of 81,3%, which corresponds with a final Phe content of 394,1 mg/100g.
Then, the degree of hydrolysis of the twelve WPC hydrolysates that showed the highest
phenylalanine removal percentage was evaluated by the ratio between α-amino and total
nitrogen. Also, these twelve WPC hydrolysates were analysed in respect to their peptide
profile, using the high performance size-exclusion liquid chromatography for the
fractionation followed by the Rapid Correct Fraction Area method for quantifying the
peptides and free aminoacids. The WPC hydrolysate obtained by the action of pancreatin
and A. oryzae protease, both at E:S ratio of 1:100 and substrate concentration of 10%, led
to the highest values of degree of hydrolysis (30% and 27% respectively). In respect to
peptide profile, the use of the protease from A. oryzae and pancreatin, at E:S ratio of 1:100
and substrate concentration of 10% and 7%, respectively, gave rise to the hydrolysate with
the highest di-tripeptide contents (16,14% and 9,12%, respectively) and the lowest level of
large peptides (20%, in average). Also, a correlation of low intensity association between
the degree of hydrolysis and peptide profile was observed, with positive values for F2, F3
and F4 fractions and negative for F1.
17
Key words: WPC, enzymatic hydrolysates, phenylalanine, degree of hydrolysis, peptide
profile.
18
INTRODUÇÃO
O presente trabalho faz parte da linha de pesquisa “Propriedades funcionais e
nutricionais de proteínas alimentares” que visa à produção de suplementos nutricionais e
alimentos para fins dietéticos especiais, importantes para as áreas de nutrição e saúde,
como também a obtenção de ingredientes ou agentes funcionais para alimentos e
medicamentos.
A fenilcetonúria (PKU) constitui uma desordem genética causada pela mutação no
gene que codifica a enzima fenilalanina-hidroxilase. Essa enzima é responsável pela
conversão da fenilalanina em tirosina, dessa forma, sua deficiência impossibilita a
hidroxilação da fenilalanina (Phe) conduzindo a um acúmulo sanguíneo desse aminoácido
(MONTEIRO & CÂNDIDO, 2006).
O tratamento da fenilcetonúria é quase que estritamente dietético e se baseia numa
dieta restrita em proteínas, utilizando fórmulas especiais isentas ou com baixos teores de
fenilalanina que podem ser suplementadas por tirosina e outros aminoácidos, além de
vitaminas e minerais (ACOSTA, 1998; MIRA & MARQUEZ, 2000).
O Brasil importa misturas de aminoácidos livres, isentas de Phe, as quais são
distribuídas para os centros de saúde do país. Essas misturas apesar da facilidade de
prescrição e distribuição apresentam odor e paladar desagradáveis, além de serem
monótonas e hiperosmóticas podendo causar diarréia (MIRA & MARQUEZ, 2000, GUADIX
et al., 2000).
Uma alternativa viável para a substituição das misturas de aminoácidos seria o
desenvolvimento de formulações à base de hidrolisados protéicos isentos ou com reduzido
teor de fenilalanina. Tais hidrolisados apresentam melhor tolerância, sabor e odor mais
agradáveis e menor osmolaridade. Além disso, são prontamente utilizáveis devido à
presença de di- e tripeptídeos que são melhores absorvidos do que os aminoácidos livres
(GONZÁLES-TELLO et al., 1994).
O processo de hidrólise constitui uma importante etapa para a obtenção de
produtos isentos de fenilalanina, pois promove a exposição deste aminoácido facilitando a
sua remoção através de um meio adsorvente (SINHA et al., 2007).
19
Diferentes métodos têm sido utilizados para a remoção da Phe, como emprego do
carvão ativado, resinas de troca iônica e exclusão molecular. Os melhores resultados têm
sido obtidos com o uso do carvão ativado (MOSZCZYNSKI & IDIZIAK, 1993). Em estudos
realizados no laboratório de Bromatologia/Pesquisa da Faculdade de Farmácia da UFMG,
o carvão ativado foi utilizado com eficiência para a remoção de fenilalanina de hidrolisados
enzimáticos de leite em pó desnatado (93,6 a 99 %) (LOPES et al., 2005; SOARES et al.,
2007), de soro de leite em pó (75 a 99 %) (BIASUTTI, et al., 2006; SILVA et al., 2007;
DELVIVO et al., 2006) e de arroz (85 a 100 %) (LOPES et al., 2008), utilizando diferentes
enzimas e condições hidrolíticas.
A proteína mais comumente utilizada para a obtenção dos hidrolisados é a caseína.
Entretanto, essa proteína é normalmente importada o que eleva os custos de produção
(FREITAS, et al., 1993; LAMAS, et al., 2001). Dessa forma, surge a necessidade de
investimentos em fontes alternativas para a obtenção dos hidrolisados protéicos, como por
exemplo, o soro do leite, um subproduto da indústria de lacticínios.
As proteínas do soro apresentam alto valor biológico em virtude do elevado
conteúdo de aminoácidos essenciais (BOUNOUS & GOLD, 1991). O concentrado protéico
do soro do leite (WPC) é um produto originado da separação em membranas das
proteínas do soro do leite, podendo apresentar de 35 a 80% de proteínas. Diversas
aplicações importantes estão associadas ao WPC, sendo um ingrediente alimentar
amplamente utilizado na indústria de alimentos em uma grande variedade de produtos
como cárneos, bebidas, produtos de padaria e formulações infantis, devido às excelentes
propriedades funcionais destas proteínas (BRANS et al., 2004).
A caracterização dos peptídeos formados após a hidrólise protéica constitui um
passo relevante, uma vez que o comprimento da cadeia desses peptídeos influencia
diretamente sua taxa de absorção (FRENHANI & BURINI, 1999). Dessa forma, deve-se
levar em consideração o controle do processo de hidrólise, e o perfil peptídico dos
hidrolisados protéicos. O grau de hidrólise tem sido um dos mecanismos de controle da
hidrólise, representando o percentual de grupos amino livres clivados da proteína. Já o
perfil peptídico tem sido eficientemente caracterizado por meio da técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (SE-HPLC) (SILVESTRE et
al., 1994a), o que determina o tamanho dos peptídeos formados e, conseqüentemente, a
capacidade de absorção do hidrolisado.
20
Diante do exposto, a obtenção de hidrolisados protéicos com baixo teor de
fenilalanina, a partir do concentrado protéico do soro do leite, disponibilizaria um
ingrediente ou alimento para a dieta de fenilcetonúricos, de alto valor nutricional e baixo
custo.
21
OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do presente trabalho foi a obtenção de hidrolisados protéicos a
partir do concentrado protéico do soro do leite (WPC), com baixo teor de fenilalanina.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Os objetivos específicos foram: 1-conhecer a composição centesimal do
concentrado protéico do soro do leite (WPC); 2- obter hidrolisados enzimáticos do WPC; 3-
remover a Phe destes hidrolisados; 4- determinar o grau de hidrólise destes hidrolisados;
5-caracterizar o perfil peptídico destes hidrolisados; 6-verificar a existência de correlação
entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico.
22
REVISÃO DE LITERATURA
2 HIPERFENILALANINEMIAS
2.1. Classificação
As hiperfenilalaninemias (HPA) constituem uma desordem primária do sistema de
hidroxilação da Phe (fenilalanina), de caráter autossômico recessivo, podendo ser
causada pela deficiência da enzima hepática fenilalanina hidroxilase (PAH) (EC1 14.16.1)
ou das enzimas que sintetizam ou reduzem a coenzima tetrahidrobiopterina (BH4) (MIRA
& MARQUEZ, 2000).
A PAH catalisa a primeira etapa da catabolização da Phe, isto é, sua conversão à
tirosina (Tyr), apresentando como substratos a Phe, o oxigênio, e a biopterina (BH4) como
co-fator, conforme demonstrado na Figura 1. A enzima é classificada como uma
oxidorredutase, atuando na introdução de um átomo de O2 na Phe para formar o grupo
hidroxila da tirosina. O BH4, importante cofator para a hidroxilação da Phe, Tyr e triptofano
(Trp), age transferindo elétrons do NADH para o oxigênio durante a hidroxilação, sendo
oxidado a diidrobiopterina e, subseqüentemente, reduzido pela diidrobiopterina redutase.
(MARCO & WAITZBERG, 2000; MIRA & MARQUEZ, 2000). O cofator é ainda essencial
nas reações de hidroxilação de Phe em Tyr, da tirosina em L-Dopa e do (Trp) em 5-
hidroxitriptofano e, posteriormente, em serotonina. Sua deficiência produz distúrbios no
metabolismo desses aminoácidos diminuindo a formação de catecolaminas, melanina e
serotonina.
De acordo com o erro metabólico envolvido, as hiperfenilalaninemias, podem ser
divididas em três grandes grupos. O primeiro relaciona-se com a deficiência da atividade
da enzima PAH, sendo esse grupo subdividido em três subgrupos em função do nível de
atividade da PAH presente. O segundo e terceiro grupo, estão relacionados com a
deficiência na atividade das enzimas que catalisam a regeneração e a biossíntese do co-
23
fator, respectivamente, sendo denominada PKU atípica ou HPA não fenilcetonúria (MIRA
& MARQUEZ, 2000; SANTOS et al., 2003).
Figura 1 – Vias metabólicas da fenilalanina e tirosina (WYNGAARDEN & SMITH JR,1984).
As hiperfenilalaninemias são classificadas de acordo com a atividade enzimática e
os níveis séricos de fenilalanina, constatados por dosagens sangüíneas freqüentes
(Tabela 1).
A PKU clássica, de maior incidência entre as variantes, apresenta mudanças nos
níveis de tirosina, excreção de diversos metabólitos da Phe na urina e reduzida ou
nenhuma atividade PAH. Indivíduos com PKU clássica que não restringem a Phe da dieta
podem desenvolver um grave, progressivo e irreversível atraso do desenvolvimento
neuropsicomotor (MIRA & MARQUEZ, 2000).
24
Tabela 1. Classificação das hiperfenilalaninemias, de acordo com a atividadeenzimática e os níveis séricos de fenilalanina.
Tipo AtividadeEnzimática
Phe sérica
(µmol/L)
Tolerância máximaPhe (mg/dia)
PKU Clássica <1% >1200 250 – 350
PKU Leve 1-3% 600 - 1200 < 1000
HPP* > 3% 240 - 600 > 1000
HPP = Hiperfenilalaninemia permanente.PKU = fenilcetonúriaAdaptado de MARTINS et al. (1993)
A forma leve é caracterizada por deficiência na atividade da enzima fenilalanina-
hidroxilase, porém os níveis séricos de fenilalanina apresentam-se entre 600 -1200
µmol/L, inferiores aos encontrados na fenilcetonúria clássica. Entretanto, o indivíduo deve
ser submetido à dieta, porém com restrições mais moderadas do que na fenilcetonúria
clássica (TRAHMS, 1998).
A HPA permanente ou benigna não apresenta alterações clínicas aparentes e, em
geral, não exige tratamento dietético. As concentrações séricas de fenilalanina neste
distúrbio não excedem a 600 µmol/L (TRAHMS, 1998).
Distúrbios no metabolismo do BH4, cofator essencial no metabolismo da
fenilalanina, também provocam o aumento da concentração sanguínea de fenilalanina.
Este tipo raro de hiperfenilalaninemia era antigamente rotulado de fenilcetonúria maligna,
uma vez que dietas pobres em fenilalanina não impedem a deterioração neurológica. O
tratamento para esta deficiência inclui, além da dieta restrita em fenilalanina, a utilização
de medicamentos específicos, tais como o L-DOPA, 5-OH-triptofano e BH4 (SCRIVER,
1997; MARTINS et al., 1993).
Existem ainda casos de HPA materna, na qual a alta concentração de Phe na mãe
produz uma síndrome clínica no feto. Uma hipótese para a patogênese dessa síndrome
seria a inibição no transporte competitivo de outros aminoácidos aromáticos (triptofano e
tirosina) através da placenta provocados pelos elevados níveis de fenilalanina sangüíneos,
acarretando baixa disponibilidade de tirosina para o desenvolvimento fetal (MIRA &
MARQUEZ, 2000). Há significativo aumento na incidência de retardo do crescimento
(40%) e microcefalia (73%), (CUNNIFF et al., 2001).
25
Deve-se citar ainda a HPA transitória ou neonatal que é aparentemente benigna,
não exigindo tratamento. A ocorrência desse tipo de HPA está freqüentemente relacionada
com prematuridade, fornecimento precoce de formulações dietéticas com elevada
concentração de proteínas, diluição inadequada ou hiperfervura do leite (STARLING et al.,
1999)
2.1.2 Fenilcetonúria clássica
A fenilcetonúria ou PKU, como é mundialmente conhecida, é uma doença genética,
causada pela mutação no gene que codifica a fenilalanina-hidroxilase, responsável pela
hidroxilação da Phe e conseqüente transformação em tirosina (Tyr). Assim, a não
hidroxilação da Phe tem como resultado o acúmulo de Phe no sangue e outros tecidos
(MONTEIRO & CÂNDIDO, 2006).
O fenillactato, fenilacetato e fenilpiruvato, na presença da enzima fenilalanina
hidroxilase, não são encontrados em quantidades significativas na urina de pessoas
normais, apresentando-se elevados na PKU. O acúmulo desses metabólitos anormais e
de Phe no plasma têm graves conseqüências no sistema nervoso central, como falhas no
andar ou falar, hiperatividade, tremor, microcefalia, falha no crescimento e retardo mental,
sendo essa última a manifestação clínica mais severa (MIRA & MARQUEZ, 2000).
A incidência da fenilcetonúria varia consideravelmente em todo o mundo, com altas
taxas na Irlanda (aproximadamente 1:4500) e menores taxas na Finlândia, Japão e
Tailândia (taxas aproximadas: 1:100.000 1:108.000 e 1:212.000, respectivamente). Na
América do Norte a incidência é de 1:10.000, sendo estimado que mais que 350 crianças
nesse continente são diagnosticadas com fenilcetonúria a cada ano e requerem
tratamento ao longo da vida (WAISBREN, et al., 2007).
No Brasil a prevalência de fenilcetonúria, segundo o Ministério da Saúde era
estimada em 1:12.000 a 15.000 nascidos vivos, sendo que em Minas Gerais ocorre a cada
20.000 nascimentos (MONTEIRO & CÂNDIDO, 2006; AGUIAR, 2002).
Os pacientes fenilcetonúricos apresentam deficiência na pigmentação (cabelo e
pele claros) devido à inibição completa da hidroxilação da tirosina pela tirosinase (primeira
etapa na formação do pigmento melanina). Eczemas, complicações neurológicas e
26
algumas vezes atividade autística, bem como transtornos de conduta, também podem se
fazer presentes (MIRA & MARQUEZ, 2000).
Os metabólitos fenillactato, fenilacetato e fenilpiruvato são encontrados em
quantidades elevadas na urina de pacientes fenilcetonúricos, não sendo normalmente
encontrados na urina de indivíduos normais. Como conseqüência, o acúmulo desses
metabólitos e de Phe no plasma, acarreta problemas no sistema nervoso central, como
falhas no andar e falar, hiperatividade, tremor, microencefalia, falhas no crescimento e
retardo mental (GREVE et al., 1994; MIRA & MARQUEZ, 2000).
2.1.3 Diagnóstico
Atualmente, o diagnóstico da fenilcetonúria é realizado através da dosagem dos
níveis de fenilalanina sangüínea, devido à sua alta confiabilidade. Os métodos mais
utilizados para a dosagem da fenilalanina no sangue têm sido: o teste de Guthrie-BIA
(semiquantitativo) e o de McCaman e Robins modificado (quantitativo). No teste de
Guthrie-BIA, um pequeno disco de papel contendo excesso de Phe provoca a inibição do
crescimento da bactéria Bacillus subtilis em um meio de cultura. Já para o método
quantitativo como o de McCaman e Robins, utiliza-se fluorimetria ou espectrometria de
massa. Entretanto, deve-se estar atento para a possibilidade da ocorrência de falsos
negativos para o teste de Guthrie-BIA e falsos positivos para o teste de McCaman. A
metodologia enzimática tem sido utilizada por muitos especialistas em programas de
triagem neonatal, em virtude do menor custo e maior precisão (MIRA & MARQUEZ, 2000).
Os níveis de fenilalanina sanguínea em crianças fenilcetonúricas são normais após
o nascimento, entretanto, aumentam rapidamente nos primeiros dias de vida. A análise de
fenilalanina em sangue capilar de crianças recém-nascidas coletadas 24 h após o
nascimento é efetiva e sensível. A análise da enzima PAH não é requerida, por ser um
método invasivo (requer biópsia do fígado), mas desordens na biopterina (BH4) devem ser
excluídas pela medida da biopterina sangüínea ou urinária e análise da diidrobiopterina
redutase (DHPR) no sangue (HENDRIKSZ & WALTER, 2004).
Após confirmação da PKU a criança deve ser prontamente submetida a dieta com
baixo teor de fenilalanina, a fim de se reduzir os níveis plasmáticos para uma
27
concentração próxima a de crianças sadias (60-180 µmol/L) (STEGINK et al., 1991;
AGUIAR, 2002).
O diagnóstico diferencial entre a fenilcetonúria clássica e as demais
hiperfenilalaninemias, pode ser obtido no sexto mês de vida administrando-se à criança
alimentos com alto teor de fenilalanina e posterior dosagem sangüínea. Este procedimento
é conhecido como Teste de Sobrecarga (O’FLYNN et al., 1980).
O Programa Nacional de Triagem Neonatal foi criado em 2001, tendo como objetivo
o diagnóstico de doenças genéticas e acompanhamento dos indivíduos afetados. No
estado de Minas Gerais foi criado o NUPAD (Núcleo em Pesquisa de Apoio Diagnóstico)
que coordena a triagem, executa o tratamento e acompanhamentos clínicos, nutricionais e
psicológicos de todos os indivíduos afetados, além de fornecer gratuitamente os
substitutos protéicos aos pacientes fenilcetonúricos (AGUIAR, 2002).
2.1.4 Tratamento
A principal meta do tratamento da fenilcetonúria é manter a concentração
sanguínea de fenilalanina em níveis limites seguros (120-360 µmol/L; e mulheres grávidas
120-240 µmol/L) sendo conseguido através da introdução de dieta com baixo nível de
fenilalanina. A concentração elevada de fenilalanina no sangue é neurotóxica, pois
compete com outros aminoácidos aromáticos para o transporte através da barreira
hemato-encefálica resultando em uma deficiência de metabólitos necessários ao
desenvolvimento do sistema nervoso central. Um dos objetivos da dieta é, portanto, evitar
um aumento crônico da concentração sangüínea de fenilalanina e, conseqüentemente no
tecido cerebral, o que pode conduzir a danos do sistema neuronal e comportamental
(GIOVANINI et al., 2007).
Alguns estudos relacionados à ingestão oral de Phe por crianças com PKU
revelaram que estas apresentavam ingestão adequada de proteínas. Entretanto, as
calorias, cálcio, ferro, zinco e cobre estavam abaixo da recomendação, enfatizando-se a
importância da vigilância nutricional em fenilcetonúricos (ACOSTA, 1998; WAITZBERG,
2000).
28
A ingestão dietética para os fenilcetonúricos envolve a regulação cuidadosa dos
níveis de L-fenilalanina com ingestão menor que 500mg/dia, quantidade esta suficiente
para prevenir sua acumulação em excesso na circulação sangüínea e satisfazer as
necessidades nutricionais (SARKISSIAN & GÁMEZ, 2005).
A dieta deve ser iniciada o mais precocemente possível, preferencialmente até os
21 dias de vida, visando manter os níveis séricos nos valores de referência, de acordo
com a idade, promovendo assim, o crescimento pôndero-estatural, o desenvolvimento
neuropsicomotor e mental adequados. Atualmente, preconiza-se que o tratamento deva
ser realizado por toda a vida (ACOSTA & YANNICELLI, 1997). Crianças com diagnóstico
tardio podem iniciar o tratamento em qualquer idade. A prática clínica comprova as
vantagens da instituição da dieta nestes casos, quando o retardo mental já é evidente e
irreversível. As crianças e adolescentes tornam-se mais sociáveis, há melhora da
concentração e aprendizado nas escolas especiais, além de melhorar a hiperatividade.
Segundo ACOSTA (1998), a adequação dietética é avaliada pelos parâmetros de
controle dos níveis séricos de fenilalanina, ganho de peso e altura satisfatórios e registros
alimentares de 72 horas de acordo com a prescrição. A dieta visa controlar a ingestão de
Phe existente em quase todas as proteínas e deve promover a adequação do aporte
calórico e demais nutrientes, assim como o controle dos níveis séricos de fenilalanina. A
definição da dieta em função da oferta de Phe é estimada, a partir da primeira consulta,
pelos níveis séricos de fenilalanina de acordo com a Tabela 2.
Uma dieta com baixo nível de fenilalanina pode prevenir problemas cognitivos,
entretanto, é uma opção difícil para adolescentes e adultos. Embora existam muitas
tentativas para o melhoramento dos produtos isentos ou com baixa quantidade de
fenilalanina, esses ainda continuam com propriedades sensoriais insatisfatórias
(SARKISSIAN & GÁMEZ, 2005).
ACOSTA (1998) recomenda uma ingestão protéica 50% maior para crianças
fenilcetonúricas em uso de fórmulas especiais constituídas de misturas de aminoácidos,
considerando as alterações na absorção de aminoácidos isolados. Esta recomendação é
atingida utilizando os alimentos permitidos com baixos teores de Phe e suplementos
especiais isentos de Phe.
29
Tabela 2. Prescrição dietética de Phe, de acordo com os níveis séricos obtidos pelatriagem neonatal.
Phe sérica (µmol/L) ( mg/dL) Phe na dieta ( mg/kg/dia)
< 605605 – 12101211 - 18151816 – 2420
>2420
<1010 - 20 21 - 30 31 - 40
>40
7055453525
Adaptado de ACOSTA & YANNICELLI (1997)
Em alguns estudos tem sido sugerido o uso da enzima fenilalanina amônio-liase
(PAL) como forma de tratamento para fenilcetonúricos. Essa enzima promove a catálise
da desaminação não-oxidativa da fenilalanina a ácido trans-cinâmico t-CA e amônia
(MacDonald & CUNHA, 2007). A administração da enzima PAL sob a forma de injeções
subcutâneas em ratos promoveu redução dos níveis séricos de fenilalanina em maior
proporção do que a ingestão oral. Tal fato pode ser explicado pela inativação da enzima
por proteólises digestivas quando administrada na forma oral. Entretanto, a forma
subcutânea, pode promover a ocorrência de resposta imune, com produção de anticorpos
contra a PAL e reação alérgica. Verifica-se, portanto, a necessidade de maiores estudos
quanto a utilização da PAL para o tratamento de fenilcetonúricos (SARKISSIAN & GÁMEZ,
2005).
A administração oral de tetrahidrobiopterina diminuiu o nível sanguíneo de
fenilalanina em pacientes com HPA atípica ou não-fenilcetonúrica e variantes de
hiperfenilalaninemias leves (ocasionalmente algumas com fenilcetonúria clássica), os
quais apresentam mutações nos genes da fenilalanina hidroxilase. Pacientes com
mutações em diferentes genes na enzima PAH, apresentaram respostas diferentes ao
tratamento com BH4 sugerindo que a composição das subunidades da PAH pode ser
importante para a resposta ao BH4 (AGUADO et al., 2007).
30
3 RECOMENDAÇÕES NUTRICIONAIS PARA FENILCETONÚRICOS
3.1 Substitutos protéicos
O tratamento da fenilcetonúria clássica requer severa restrição de proteína natural e
o consumo de substitutos protéicos. Os substitutos apresentam todos os aminoácidos com
exceção da fenilalanina e permitem o suprimento acima de 75% da recomendação
protéica em pacientes com fenilcetonúria clássica. Algumas preparações ainda contêm as
quantidades suficientes para atender os requerimentos diários em vitaminas, minerais e
elementos traços (MACDONALD & D’CUNHA, 2007).
Os substitutos protéicos tradicionais são oferecidos na forma de bebidas,
entretanto, quando dissolvidos em água, geralmente apresentam sabor amargo, cheiro
desagradável, hiperosmolaridade da solução, devendo ser administrados em grandes
volumes (MACDONALD et al., 1997). Estudo com crianças de idade entre 1-5 anos que
apresentavam problemas com alimentação, revelou que 48% das mães alegaram que
seus filhos tinham dificuldades em continuar o tratamento com substitutos protéicos, sendo
que, a maioria o ingeria na forma líquida, como bebida (MACDONALD et al., 1997).
Existem poucos substitutos protéicos desenvolvidos para jovens e adultos. Esses,
entretanto, raramente atingem o controle do nível de fenilalanina sangüínea recomendado,
o que pode estar relacionado com a baixa aceitação ao substituto protéico (MACDONALD,
et al., 2004).
Os substitutos protéicos tradicionais com carboidratos adicionais vêm sendo
substituídos por aqueles com um maior conteúdo de aminoácidos, reduzido teor de
carboidratos e adição extra de vitaminas e minerais. Esses novos substitutos protéicos
apresentam volume reduzido e contém todas as vitaminas essenciais, minerais e
elementos traços (MACDONALD et al., 2004).
Uma das preocupações em relação aos substitutos protéicos tem sido a
suplementação de tirosina. O trabalho de SPRONSEN et al., (2001) demonstrou uma
incapacidade de dietas enriquecidas com tirosina em manter os níveis da mesma,
31
havendo uma diminuição da concentração da tirosina com a queda da concentração da
fenilalanina.
De acordo com estudos de MACDONALD et al. (2004), os substitutos protéicos são
componentes essenciais para o tratamento dietético de fenilcetonúricos, entretanto como
eles têm pouca aceitação pelos pacientes é necessário mais pesquisas para melhorar a
composição e qualidade desses produtos.
3.2 Mistura de aminoácidos
As misturas de L-aminoácidos foram adotadas desde a década de 80, sendo
constituídas por uma mistura de aminoácidos livres, isentas de fenilalanina que fornecem
o suprimento de nitrogênio, podendo ser acrescidas de carboidratos, gorduras, minerais,
vitaminas e elementos-traços para suprir as necessidades nutricionais de diversas faixas
etárias (MIRA & MARQUEZ, 2000).
Essas misturas, apesar da facilidade na prescrição e distribuição aos pacientes,
possuem odor e paladar desagradáveis, além de serem monótonas, dispendiosas e
hiperosmóticas. Sua administração que deveria ocorrer em pequenas porções durante o
decorrer do dia, freqüentemente é feita de uma só vez, levando a um prejuízo na sua
utilização biológica e aumento da metabolização dos aminoácidos por via oxidativa (MIRA
& MARQUEZ, 2000, GUADIX et al., 2000).
Existem diversas formulações disponíveis no mercado, sendo que no Brasil estão
disponíveis mediante a sua importação e apresentam elevado custo. Dentre essas
formulações se encontram o Lofenalac (com alto teor calórico), PKU-1, PKU-2 e PKU-3
(isentos da adição de gordura e teor reduzido de carboidratos, formulados para faixas
etárias específicas), outros como XP Analog, XP Maxamaid e XP Maxamum, que contêm
5 mg de Phe ou menos, sendo que o XP Maxamaid e XP Maxamum não contêm lipídios
(MIRA & MARQUEZ, 2000; GUADIX et al., 2000; MACDONALD et al., 2003).
32
3.3 Hidrolisados protéicos com baixo teor de fenilalanina
Os hidrolisados protéicos são fontes de nitrogênio utilizadas primeiramente para o
uso nutricional de indivíduos que apresentam necessidades nutricionais e ou fisiológicas
não cobertas pela alimentação convencional (MIRA & MARQUEZ, 2000). Os hidrolisados
protéicos enzimáticos constituem-se de peptídeos de cadeia curta com composição
característica de aminoácidos e massa molecular definida, sendo altamente desejáveis no
desenvolvimento de formulações específicas. Eles apresentam importantes vantagens em
relação às misturas de aminoácidos, em que o componente protéico consiste
exclusivamente de aminoácidos livres, os quais são de mais difícil absorção quando
comparados aos oligopeptídeos (especialmente di- e tripeptídios). Os peptídeos
apresentam ainda menor hiperosmolaridade do que a mistura de aminoácidos sendo
melhores absorvidos e evitando problemas osmóticos (CLEMENTE, 2000).
A produção de hidrolisados protéicos isentos de fenilalanina iniciou-se no Japão
nos anos 70, na tentativa de se obter concentrados protéicos inodoros, sem cor e sem
sabor a partir de proteínas de soja e de peixe, através da proteólise enzimática (MIRA &
MARQUEZ, 2000).
O preparo dos hidrolisados protéicos com reduzido teor de fenilalanina é baseado
na hidrólise enzimática com a conseqüente exposição deste aminoácido, seguida da sua
remoção por um meio adsorvente (SHIMAMURA et al., 1999).
Dentre as diversas fontes protéicas que podem ser utilizadas no preparo dos
hidrolisados, a caseína é a escolhida na maioria dos casos (SHIMAMURA et al., 1999;
NEVES et al., 2004). Entretanto, no Brasil essa proteína é normalmente importada, o que
eleva os custos de produção (LAMAS et al., 2001).
As formulações especiais para fenilcetonúricos são elaboradas utilizando-se os
hidrolisados protéicos com baixo teor de Phe como fonte de proteína (maior proporção de
di- e tripeptídeos), acrescidos de gordura, carboidratos, minerais e/ou elementos-traço.
Normalmente os aminoácidos lisina e cistina são adicionados após esta etapa para repor
eventuais perdas durante a secagem (TESMER et al., 1998).
33
4 SORO DO LEITE
O soro do leite é um subproduto da produção de queijos, sendo o líquido
remanescente após a precipitação da caseína (SGARBIERI, 1996).
Os principais constituintes do soro do leite são a lactose (4,5-5,0%), proteínas
solúveis (0,6-0,8%), lipídios (0,4-0,5 %) e sais minerais (8,0-10 %) (SISO et al., 1996).
CHERYAN (1998), em seu estudo, considerou o soro do leite o mais importante
rejeito da indústria de laticínios, sendo desperdiçado aproximadamente 47% das 115
milhões de toneladas de soro produzidas mundialmente.
A produção do soro do leite vem crescendo desde a década de 90, tanto a nível
nacional quanto mundial, aumento este relacionado à maior produção de queijo, sendo
produzidos 9 a 11 Kg de soro para cada Kg de queijo (MCINTOSH et al. 1998).
O descarte do soro além de causar problemas de ordem ambiental, quando
encarado como efluente líquido, em virtude de sua alta demanda de oxigênio, é também
um desperdício protéico e de outros nutrientes, uma vez que retém aproximadamente 55%
dos nutrientes do leite (TORRES, 2005). Entretanto, a descoberta de propriedade
bioativas e funcionais do soro do leite e seus componentes chama a atenção para a
agregação de valor ao produto (WALZEN et al., 2002).
De acordo com SGARBIERI (2004), podem ser obtidos dois tipos diferentes de
soro: o soro ácido (pH < 5,0) e o soro doce (pH 6,0-7,0). O soro doce é obtido pelo
processo de coagulação enzimática, enquanto o soro ácido resulta da precipitação ácida
no pH isoelétrico das caseínas (pH=4,6). O soro ácido geralmente apresenta o maior teor
de minerais e menor conteúdo de proteínas que os soros doces, sendo sua utilização na
alimentação mais restrita devido ao sabor ácido e elevado teor salino (SISO, 1996). Já o
soro doce, apresenta maior quantidade de peptídeos e aminoácidos (SGARBIERI, 1996).
A tradicional tendência do soro de leite de ser visto como um resíduo sem qualquer
valor comercial está sendo abandonada, dadas as suas excelentes propriedades
nutricionais e funcionais (HINRICHS, 2001).
Diversas utilidades são atribuídas ao soro de leite como a fabricação de bebidas
lácteas, produção de ricota e de ingredientes na produção de alimentos industrializados
como salsichas, biscoitos, bolos, doces, etc. (CHERYAN et al., 1998).
34
O soro de leite pode ainda ser utilizado na formulação de hidrolisados protéicos
com baixa concentração de gordura e lactose para alimentação de atletas (CORSI et al.,
2003); na utilização in natura para alimentação de animais (BERTOL et al., 1996) e na
formulação de hidrolisados protéicos isentos ou com baixa concentração de fenilalanina
para pacientes fenilcetonúricos (KITAGAWA et al., 1987; SHIMAMURA et al., 1999).
Desde a primeira metade do século XX têm sido desenvolvidas tecnologias capazes
de concentrar ou separar, em larga escala, os componentes mais importantes do soro de
leite, do ponto de vista nutricional e tecnológico: as proteínas (HUFFMAN & HARPER,
1999). Os processos desenvolvidos utilizam membranas semipermeáveis e a pressão
como força diretriz, sendo que a separação dos componentes do soro baseia-se,
essencialmente, no tamanho molecular dos compostos (LEWIS, 1996).
4.1 Proteínas do soro do leite
A fração protéica do soro representa em torno de 18-20% do total de proteínas do
leite. As duas principais proteínas do soro α-lactoalbumina (α-La) e β-lactoglobulina (β-Lg)
perfazem 70-80% das proteínas totais do soro (JOVANOVIC et al., 2005). As sub-frações
ou peptídeos secundários, assim denominados por se apresentarem em pequenas
concentrações no soro do leite, são compostas por glicomacropeptídeo, imunoglobulinas,
albumina, lactoferrina, lactoperoxidase, lisozima, lactolina, relaxina, lactofano, fatores de
crescimento IGF-1 e IGF-2, proteoses-peptonas e aminoácidos livres (HARAGUCHI et al.,
2006).
Em relação às caseínas, as proteínas do soro são mais termolábeis, menos
sensíveis ao cálcio e podem formar estruturas oligoméricas. Em relação à estrutura, as
proteínas do soro são globulares com um limitado número de ligações dissulfeto, as quais
conferem um determinado grau de rigidez estrutural e estabilidade (KINSELLA &
WHITEHEAD, 1989).
Em virtude do seu conteúdo em aminoácidos essenciais, as proteínas do soro
apresentam alto valor biológico quando comparado a outras proteínas da dieta. O seu
elevado teor de aminoácidos sulfurados proporciona um alto coeficiente de eficiência
protéica (CEP-3,2) quando comparado à caseína (2,6) (BOUNOUS & GOLD, 1991).
O relativo excesso de alguns aminoácidos essenciais (lisina, treonina, metionina,
isoleucina), apresentado pelas proteínas do soro, possibilita sua utilização como um
35
efetivo suplemento para proteínas vegetais, as quais são freqüentemente limitadas nesses
aminoácidos. Dessa forma, as proteínas do soro apresentam efeito favorável sobre
proteínas comuns que apresentam CEP menor que 2,5 incluindo soja, amêndoas, milho e
glúten do trigo (WALZEM et al., 2002).
As proteínas do soro têm sido reconhecidas como valiosos ingredientes alimentares
com importantes propriedades nutricionais e funcionais, que possuem elevada quantidade
de aminoácidos sulfurados, os quais apresentam funções antioxidantes (SINHA et al.,
2007).
A desnaturação térmica das proteínas do soro do leite ocorre em temperaturas
superiores a 60 ºC, após trinta minutos de aquecimento. Já a 95 ºC verifica-se completa
desnaturação térmica, sofrendo extensa transformação conformacional com exposição de
grupos nucleofílicos, altamente reativos, e de áreas hidrofóbicas (SGARBIERI, 1996).
As propriedades funcionais das proteínas do soro estão relacionadas a processos
de emulsificação, gelatinização, capacidade de ligação com a água, solubilização, poder
espulmante e desenvolvimento de viscosidade (KORHONEN et al., 1998). Tais
propriedades estão relacionadas fundamentalmente, com suas características físicas,
químicas e estruturais/conformacionais, que incluem: tamanho, composição, e seqüência
aminoacídica, segmentos polipeptídicos do arranjo terciário e secundário, inter- e
intraligações cruzadas, flexibilidade em resposta a condições externas (JOVANOVIC et al.,
2005).
Além disso, uma importante característica que tem sido atribuída às proteínas do
soro é a sua capacidade de aumento da resposta imune através de uma maior produção
de glutationa celular. A glutationa, por sua vez, desempenha funções metabólicas como
antioxidante celular, protegendo contra efeitos deletérios de radicais livres e como
substrato para a enzima glutationa peroxidase com ação desintoxicante sobre o peróxido
de hidrogênio e outros hidroperóxidos (BRINK, 1996).
4.1.1 α-Lactoalbumina
A α-lactalbumina (α-LA) é uma proteína do soro globular compacta, ácida, que
apresenta 14,2 kDa de massa molar. É estabilizada pelas quatro ligações dissulfídricas e
não apresenta grupo tiol livre, entretanto, uma dessas ligações é mais sensível à clivagem
36
que as demais, devido à sua menor estabilidade inerente (JOVANOVIC et al., 2005;
CONSIDINI et al., 2007).
A α-LA é uma proteína ligante do cálcio e apresenta alta afinidade por outros íons
metálicos, incluindo Zn+2, Mn+2, Cd+2, Cu+2 e Al+3. Essa proteína representa uma das
proteínas do complexo enzimático da síntese de lactose que catalisa o último ponto da
biossíntese. Por essa razão, essa proteína é a de maior interesse em termos de controle
da secreção do leite (CONSIDINI et al., 2007). Entretanto, em valores de pH igual ou
inferior a 4,0, a α-LA encontra-se susceptível à digestão pela pepsina do estômago
(LECTURE, 1998).
Essa proteína constitui-se de uma cadeia polipeptídica que apresenta 123 resíduos
de aminoácidos, sendo 67 desses, aminoácidos essenciais que contém quatro ligações
dissulfídricas e não apresentam grupos sulfidril livres. Moléculas nativas de α-lactalbumina
apresentam dois domínios: um domínio longo α-helicoidal e um domínio curto β-folheados
que se encontram conectados com cálcios ligantes (JOVANOVIC et al., 2005).
A forma purificada da α-LA é usada comercialmente em fórmulas infantis devido à
sua similaridade estrutural e conformacional com as proteínas do leite materno, sendo
também utilizada em alimentos da nutrição esportiva em razão do seu conteúdo de
aminoácidos ramificados. Tais aminoácidos são utilizados pelos músculos tanto para o
fornecimento de energia quanto para a síntese de proteínas, sendo também reportado
melhoria no desempenho físico, mediante o consumo de dietas enriquecidas com os
aminoácidos de cadeia ramificada (WALZEM et al., 2002).
4.1.2 β-Lactoglobulina
A β-lactoglobulina (β-Lg) é a proteína globular que apresenta massa molar de 36,6
kDa com estrutura secundária e terciária definidas. É composta por 162 resíduos de
aminoácidos; 84 desses são aminoácidos essenciais e quatro resíduos de cisteína
(JOVANOVIC et al., 2005).
Em valores de pH de 5,1 e 6,7 a β-lactoglobulina se apresenta como um dímero
estável consistindo de duas unidades esféricas. Em valores de pH menor que 3,0 ou maior
que 8,0, os dímeros se dissociam em monômeros. Na faixa de pH entre 5,1 e 3,8 a β-
37
lactoglobulina tende a formar octâmeros, a baixas temperaturas e elevadas concentrações
de proteína (SGARBIERI, 1996).
O tratamento térmico da β-Lg em pH neutro, causa a dissociação da forma nativa
da proteína a dímero, sendo parcialmente desdobrada havendo sua desnaturação e
agregação. A taxa e via metabólica da dissociação é dependente da concentração da
proteína, do pH, temperatura e outros fatores.
Embora isolada há 60 anos atrás, a função desta proteína, segundo WALZEM et al.,
(2002), ainda é desconhecida, mas ela se liga ao cálcio e zinco e a uma variedade de
pequenas moléculas hidrofóbicas. Entretanto, LECTURE (1998), em seu trabalho, atribuiu
à β-Lg a propriedade de transportar a provitamina A. De acordo com o autor, a estrutura
globular da β-Lg é extraordinariamente estável aos ácidos e enzimas proteolíticas do
estômago, tornando-a um resistente carreador de retinol (provitamina A).
A alergenicidade das proteínas do leite está associada à β-Lg e afeta 1-2% das
crianças de idade inferior a 2 anos, entretanto, essa proteína não está presente no leite
humano (TORRES, 2005).
A presença do aminoácido essencial cisteína, na β-Lg é relevante devido a sua
propriedade de estímulo à síntese da glutationa, um tripeptídeo anticarcinogênico
produzido pelo fígado para a proteção contra tumores intestinais (LECTURE, 1998).
Frações enriquecidas de β-Lg têm sido utilizadas em produtos manufaturados de
carne e peixes, alimentos formulados, proteína ácida fortificada através ou como
substituição do ovo branco (SMITHER et al., 1996).
4.2 Concentrado protéico do soro do leite (WPC)
Desde 1980, existe um grande interesse no estudo das proteínas do soro do leite
devido ao seu alto valor nutritivo e propriedades nutricionais. Com o advento de técnicas
de fracionamento por membrana incluindo ultrafiltração, osmose reversa, e microfiltração,
foi possível o desenvolvimento de produtos à base do soro do leite. Esses produtos
incluem a proteína do soro em pó, o concentrado protéico do soro (WPC), o isolado
protéico do soro (WPI), hidrolisado protéico do soro (WPH) dentre outros como a
lactoglobulina e lactalbumina puras (POPOVIC-VRANJES & VUJICIC, 1997).
38
Os concentrados protéicos de soro (WPC) são produtos com teor protéico de 35-
80% e um conteúdo lipídico maior que 4%. A presença dos lipídios afeta as propriedades
funcionais do WPC e promove o desenvolvimento de reações de oxidação as quais
promovem o surgimento de off-flavor ou aroma desagradável. Por essa razão, têm sido
desenvolvidos métodos para reduzir o conteúdo lipídico em produtos de WPC. Um desses
métodos é a precipitação lipídica termocálcica que consiste na adição de íons cálcio
divalentes à solução de WPC, com ajustamento do pH para valor de 7,3 e aquecimento da
solução final. O resultado é a agregação e precipitação do complexo fosfolipoprotéico,
sendo removido por microfiltração e produzindo WPC com reduzido teor lipídico (0,5%)
(KARLESKIND et al., 1995).
A composição dos produtos típicos do soro está representada na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3 - Composição centesimal dos produtos do soro do leite.
Soro em Pó WPC 34 WPC 80 Lactoalbumina WPIProteína% 13 34 80 90 92Lactose% 75 53 6 0,5 1
Cinzas% 8 7 3 0,5 2
Gorduras% 1 3 7 4 1Umidade% 3 3 4 4 4
Fonte: HUFFMAN & HARPER (1999) WPC: concentrado protéico de soro; WPI= isolado protéicode soro.
Os produtos do concentrado protéico do soro (WPC) existem no mercado em
concentrações de proteínas que variam de 34% a 85%. Na denominação comercial, é
referido o teor aproximado de proteínas, assim o WPC80 terá um teor de proteínas
próximo a 80%. Os isolados protéicos do soro (WPI) têm, por norma, concentrações
superiores e, em muitos casos, acima de 90% (HUFFMN & HARPER, 1999).
Nota-se uma considerável variabilidade na composição dos WPCs 80 e WPIs
existentes no mercado americano e europeu que é demonstrada na Tabela 3. Essa
variabilidade pode ser explicada pela composição inicial do soro, que depende da
39
composição do leite, e, sobretudo dos processos de obtenção de queijo ou caseínas (DE
LA FUENTE et al., 2002).
Apesar do soro do leite apresentar nutrientes de alto valor biológico, sua utilização
in natura é limitada devido à alta perecibilidade do material atribuída à alta diluição de
seus componentes e conteúdo em minerais. Entretanto, diversas tecnologias de
processamento têm sido aplicadas nessa matéria- prima como forma de agregação de
valor.
Dentre as referidas tecnologias inclui-se a separação por membranas que produz
proteínas nativas, sem impacto em suas propriedades funcionais e nutricionais, garantindo
assim sua utilização como ingrediente na indústria alimentícia (USHIKUBO et al., 2001;
ROMAN & SGARBIERI, 2005).
A produção do concentrado protéico do soro inclui as etapas de clarificação,
ultrafiltração (permeável), filtração e secagem (HUFFMAN & HARPER, 1999).
Originalmente, o WPC era utilizado nos Estados Unidos (USA) para reduzir a
poluição ambiental e na alimentação animal. Atualmente, o WPC vem ganhando espaço
na utilização como ingrediente alimentar (HUFFMAN & HARPER, 1999).
Enquanto os Estados Unidos (USA) focavam na produção do WPC com um
percentual protéico de 34%, outros países buscavam desenvolver produtos com alta
concentração protéica e propriedades funcionais específicas. Diversas aplicações têm sido
atribuídas utilizando-se WPC com alto teor protéico (acima de 80%) como, por exemplo,
em carnes, produtos de panificação, sopas, dentre outros (HUFFMAN & HARPER, 1999).
Alguns autores têm reportado a ação inibitória das proteínas do soro (peptídeos
bioativos) sobre a enzima conversora da angiotensina (ACE) e atividade hipotensiva em
animais e humanos (VAN DER VEM et al., 2002; VERMEIRSSEN et al., 2003). Em estudo
realizado por COSTA et al., (2007) foi verificado que o uso de isolados de soro submetido
ao tratamento térmico apresentou atividade inibitória da ACE e atividade antihipertensiva.
Existem controvérsias em relação à atividade biológica das proteínas do soro.
Alguns autores relataram que a atividade dessas proteínas depende da preservação de
sua estrutura nativa (SMITHER et al., 1996), outros já acreditam na ocorrência de
peptídeos bioativos de proteínas desnaturadas, sem, contudo especificar o grau de
desnaturação (FITZGERALD & MEISEL, 1999; TAKADA et al., 1997).
40
O WPC apresenta uma concentração protéica, estabilidade e conservação das
características físico-químicas superior ao soro do leite. Além disso, apresenta facilidade
de manipulação laboratorial, o que justifica sua escolha como melhor forma da utilização
das proteínas do soro (BRANS et al., 2004).
5 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS
5.1 Importância
A hidrólise enzimática das proteínas produz peptídeos de tamanhos diferentes e
aminoácidos livres, como resultado da clivagem das ligações peptídicas (SINHA et al.,
2007).
As soluções de hidrolisados protéicos contendo di- e tripeptídeos apresentam uma
osmolaridade menor do que as soluções de aminoácidos livres e, por isso são mais bem
toleradas por indivíduos com dificuldade de absorção (GONZÁLES-TELLO et al., 1994).
Além disso, a imunogenicidade dos hidrolisados protéicos é menor do que a apresentada
por proteínas e peptídeos de elevado peso molecular. Dessa forma, os hidrolisados são
bastante utilizados na alimentação de pessoas que apresentam dificuldades na absorção
de proteínas, como idosos e crianças com diarréia e fibrose cística (AUBES-DUFAU et al.,
1995).
De acordo com LAHL & BRAUN (1994), a hidrólise de proteínas alimentares
favorece as características nutricionais da proteína, aumenta a vida de prateleira e confere
melhorias nas propriedades sensoriais devido à remoção de odores e ingredientes tóxicos
ou inibitórios.
O uso dos hidrolisados enzimáticos é destinado geralmente, a três grandes grupos:
(1) formulações infantis para crianças que apresentam alergia à proteína intacta ou algum
problema causado por um erro inato do metabolismo; (2) formulações especiais para
adultos com função gastrintestinal prejudicada ou doenças em órgãos específicos; e (3)
suplementos nutricionais para facilitar a assimilação de nitrogênio (MIRA & MARQUEZ,
2000).
41
Problemas de alergenicidade podem ocorrer na presença de hidrolisados protéicos
e peptídeos de alto peso molecular. Durante o processo de hidrólise pode haver o
aparecimento de sabor amargo que parece estar relacionado com a hidrofobicidade das
cadeias laterais e com a fonte protéica utilizada. Esses fatores desaparecem para
produtos formados por peptídeos de massas molares inferiores a 1000 Da (OTANI et al.,
1990).
Estudos têm sido conduzidos na tentativa de identificar os fatores relacionados com
a ocorrência do sabor amargo e desenvolver métodos para evitar o seu aparecimento.
Peptídeos com sabor amargo apresentaram alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos
(AUBES-DUFAU et al., 1995).
De acordo com FREITAS et al., (1998), o controle da quantidade da enzima
utilizada na hidrólise pode favorecer a formação de peptídeos de massa molecular
maiores que aqueles responsáveis pelo desenvolvimento de sabor amargo. O trabalho de
MORAIS et al., (2004, 2005) realizado no laboratório de Bromatologia/Pesquisa utilizou o
encapsulamento em lipossomas e lipoesferas, sendo eficiente para mascarar o sabor
amargo de hidrolisados de caseína, obtidos pela ação da papaína.
5.2 Processo de hidrólise
A hidrólise das proteínas pode ser conduzida por métodos ácidos, alcalinos ou
enzimáticos, cujas vantagens e desvantagens irão depender da forma de utilização do
hidrolisado e objetivos a serem alcançados (SINHA et al., 2007).
A hidrólise ácida e alcalina tende a ser um processo de difícil controle, e os
produtos obtidos apresentam qualidade nutricional reduzida. A hidrólise química pode
formar substâncias tóxicas como a lisino-alanina devido à racemização dos aminoácidos,
reduzindo, assim, a qualidade nutricional dos produtos formados (GUADIX, et al., 2000).
O processo enzimático de hidrólise apresenta inúmeras vantagens em relação aos
métodos tradicionais (ácido e alcalino). Dentre estas, vale ressaltar: a seletividade, uma
vez que as enzimas são específicas para seus substratos, o que reduz a possibilidade do
aparecimento de produtos de degradação; condições moderadas de temperatura
(40-60 0C) e pH (6-8); manutenção do valor nutritivo, já que não ocorre degradação dos
aminoácidos, ao contrário da hidrólise ácida que destrói triptofano e desamina os
42
aminoácidos serina e treonina, e da hidrólise alcalina que elimina arginina e cisteína
(GUADIX et al., 2000).
A hidrólise enzimática pode conduzir ao desenvolvimento de componentes
nutricionais biologicamente ativos, capazes de promover oportunidades de ganhos na
saúde. Além disso, esse processo tem se destacado na melhoria das propriedades
funcionais das proteínas, tais como solubilidade, poder emulsificante, textura, tendo
grande aplicabilidade em vários produtos alimentícios (VOJDANI & WHITAKER, 1994).
Diversos trabalhos realizados no Laboratório de Bromatologia/Pesquisa
empregaram a hidrólise enzimática no intuito de elevar o teor de oligopeptídios de
hidrolisados protéicos (MORATO et al., 2000; MORAIS et al., 2005; BARBOSA et al.,
2004; LOPES et al., 2005; DELVIVO et al., 2006; SOARES et al., 2007; SILVA et al., 2007;
SOUZA et al., 2008; LOPES et al., 2008; AFONSO et al., 2008) ou de melhorar as
propriedades funcionais de proteínas (SILVA & SILVESTRE, 2003; BIZZOTO et al., 2005;
CAPOBIANGO et al., 2007).
5.3 Fatores interferentes
A otimização do processo de hidrólise enzimática depende do controle de diversas
variáveis como: pH, temperatura, tempo de hidrólise, tipo e concentração de matéria-
prima, relação enzima:substrato, inativação enzimática ao final do processo (CÂNDIDO et
al., 1998). De acordo com CLEMENTE (2000), dentre os fatores que devem ser levados
em consideração para a obtenção de hidrolisados protéicos com características físicas,
químicas e nutricionais definidas são: a fonte protéica, enzimas proteolíticas apropriadas e
o desenvolvimento de processos pós-hidrólise.
A escolha da enzima proteolítica é muito importante, uma vez que sua ação
específica irá influenciar a composição final dos produtos de hidrólise, principalmente com
relação ao tamanho médio dos peptídeos e teor de aminoácidos livres desejáveis (HAQUE
& MOZAFFAR, 1992).
De acordo com SCHIMIDT & POOL (1991), o processo de hidrólise da α-La
utilizando-se diferentes enzimas, variou com a composição do meio (presença de Ca+),
temperatura de incubação e grau de desnaturação da proteína.
43
PINTADO et al., (1999) verificaram significativas diferenças na ação das enzimas
Aspergillus niger e a tripsina, em termos de performance catalítica, ao analisar a
concentração total de aminoácidos livres dos hidrolisados.
Entretanto, diferentes enzimas (alcalase, pancreatina e mistura de enzimas
proteolíticas) apresentaram resultados similares de hidrólise das principais proteínas do
soro do leite (α-La e a β-Lg), em relação ao tamanho médio dos peptídeos formados.
Esses resultados estão de acordo com os de CHOBERT et al. (1988) que, empregando
duas enzimas diferentes (tripsina e protease V8 (S. aureus), na hidrólise da caseína, não
observaram variações no tamanho dos peptídeos obtidos nos dois processos.
Em trabalho realizado por SILVESTRE et al., (1994b), empregando-se as mesmas
condições hidrolíticas, o hidrolisado preparado com pancreatina, apresentou maior
conteúdo de peptídeos nas frações cromatográficas do que aquele preparado com
tripsina, exceto a fração de grandes peptídeos (> 7 resíduos de aminoácidos).
De acordo com KILARA (1985), o tempo requerido para atingir um determinado
grau de hidrólise diminui exponencialmente com o crescente aumento da temperatura da
reação, até o momento em que a inativação enzimática pelo calor se torna significativa.
Em calor de desnaturação ocorre uma perda gradual das propriedades catalíticas da
enzima, sendo crescente a taxa de inativação com o aumento da temperatura (REED,
1975).
A ação do calor sobre a atividade enzimática tem sido utilizada por alguns autores,
visando a interrupção da reação hidrolítica, empregando-se temperaturas na faixa de 80 a
90 ºC, por 10 a 20 min (SILVESTRE et al., 1993; MORATO et al., 2000).
A relação enzima: substrato (E:S) interfere no processo de hidrólise tanto na
velocidade da reação quanto no tamanho dos peptídeos formados no final do processo
(GAUTHIER et al., 1986).
SILVESTRE et al., (1994b), comparando dois hidrolisados pancreáticos de caseína,
mostraram que uma redução na relação E:S de 1:25 para 1:200 levou a um maior
conteúdo de grandes peptídeos (> 7 resíduos de aminoácidos), e a uma menor proporção
de peptídeos médios (4 a 7 resíduos de aminoácidos) e aminoácidos livres. Por outro lado,
o teor de di- e tripeptídeos permaneceu inalterado.
44
Já SCHIMIDT & POOL (1991), utilizando enzimas diferentes, verificaram que a
redução da relação E:S de 1:100 para 1:1000, aumentou ou diminuiu a velocidade de
hidrólise da α-La e/ou da β-Lg dependendo da enzima utilizada.
Um outro fator que deve ser controlado é o grau de hidrólise (SILVESTRE et al.,
1993). Esse representa a relação entre o número de aminoácidos livres e o conteúdo total
de aminoácidos, indicando o percentual de clivagem das ligações peptídicas
(NEVES et al., 2004).
Muitos processos pós-hidrólise têm sido utilizados para a produção de hidrolisados
protéicos com características desejáveis. Um dos aspectos a ser considerado relaciona-se
com o tamanho dos peptídeos resultantes. Neste contexto, a ultrafiltração apresenta
resultados eficientes para a remoção de peptídeos e proteínas de alto peso molecular
(CLEMENTE & CHAMBERS, 2000).
5.4 Proteases
De acordo com o sistema internacional de nomenclatura as enzimas proteolíticas,
pertencem à subclasse 4 da classe 3 (EC 3.4 Peptídeo hidrolase). Essas enzimas
pertencem a um grupo grande e complexo e diferem entre si por suas especificidades pelo
substrato, sítio ativo, mecanismo catalítico, perfis de estabilidade e atividade quanto à
temperatura e ao pH (BEYNON & BOND, 2001).
Em relação ao mecanismo de hidrólise, as enzimas proteolíticas são classificadas
em endopeptidases e exoproteases. As endopeptidases hidrolisam as ligações peptídicas
das moléculas de proteína até determinado nível, dando origem a peptídeos de cadeia
longa. Já as exopeptidases removem sistematicamente aminoácidos da porção N terminal
e C terminal das ligações peptídicas terminais, através da hidrólise (CLEMENTE, 2000).
A associação de enzimas introduzidas na reação, simultânea ou sucessivamente,
pode conduzir a um grau de hidrólise superior àquele obtido com uma única enzima, o que
demonstra um caráter de ação sinérgica ou complementar. Assim, na produção de
hidrolisados, enzimas de ampla especificidade têm sido utilizadas em associações,
levando a uma hidrólise extensa, com a obtenção de pequenos peptídeos e aminoácidos
(SILVESTRE et al., 1993).
45
A associação de enzimas foi empregada em alguns estudos realizados no
Laboratório de Bromatologia/Pesquisa, como por exemplo, MORATO et al. (2000), que
utilizaram a associação das enzimas tripsina e subtilisina; CARREIRA et al. (2001), que
empregaram as enzimas tripsina, subtilisina e pepsina, associadas; LOPES et al. (2005)
que associaram papaína e protease do Aspergillus oryzae e SOARES et al. (2006) que
fizeram as associações papaína/protease do Aspergillus oryzae e pepsina/protease do
Aspergillus oryzae.
As enzimas proteolíticas podem ser provenientes de plantas, animais ou
microorganismos. Os microrganismos proteolíticos parecem ser as mais promissoras
fontes de proteases, por produzirem uma maior variedade de enzimas específicas, em
comparação às plantas ou aos animais (DINIZ & MARTIN, 1999).
Existem também certas desvantagens no uso das enzimas proteolíticas. Entre elas
pode-se citar sua instabilidade ou alteração da atividade sob certas condições de pH,
temperatura e concentração de substrato, além da difícil recuperação após o uso (DINIZ &
MARTIN, 1999).
Aproximadamente 60% do total das enzimas industriais são proteases, empregadas
na indústria de alimentos como auxiliares no processamento de cerveja, vinho, cereais,
laticínios, chocolate, produtos a base de ovos, produtos a base de carne e de peixe,
legumes e na produção de proteína hidrolisada e flavorizante (FURLAN & OETTERER,
2002).
As primeiras enzimas proteolíticas utilizadas na indústria alimentícia foram as
proteases pancreáticas de origem animal, no entanto, as de origem bacteriana ou fúngica
têm adquirido maior importância. Outros possíveis usos para essas enzimas na indústria
de alimentos são baseados em suas propriedades inerentes, como a elevada atividade
molecular em baixas temperaturas, a habilidade para catalisar hidrólises de proteínas
nativas e a atenuação da desnaturação pelo calor. Além disso, as enzimas proteolíticas de
animais marinhos são preferidas para aplicações específicas, em relação às fontes
convencionais microbiana, vegetal e animal (FURLAN & OETTERER, 2002).
46
5.5 Algumas Proteases comerciais
Existem no mercado diversas proteases, apresentadas, geralmente como misturas
de enzimas, sendo vendidas na forma líquida ou em pó. A comercialização dessas
enzimas, com o intuito de utilização no processamento de alimentos, apresenta como pré-
requisito a aprovação por organismos internacionais (FAO/WHO e FCC-Food Chemical
Codex) e, no Brasil, pela ANVISA (BRASIL, 2005). Essas enzimas são provenientes de
microrganismos ou vegetais, e diferem entre si por suas especificidades pelo substrato,
sítio ativo e mecanismo catalítico, perfis de estabilidade e atividade quanto à temperatura
e ao pH (BEYNON & BOND, 2001). Algumas características das proteases comerciais que
foram utilizadas no presente trabalho, estão apresentadas abaixo.
5.5.1 Protezyn L
A Protezyn L é produzida pela Prozyn (São Paulo, SP, Brasil), obtida de cepas do
Bacilus subtillis, classificada como endopeptidase. Segundo a Prozyn, esta enzima
apresenta estabilidade de atuação na faixa de pH de 8 a 12 e temperatura ótima de
atuação de 50 a 60ºC. É comercializada na forma de um líquido marrom, com cheiro
característico, com densidade de 1,05 a 1,15 g/mL.
5.5.2 Corolase LAP
Segundo dados do fabricante (AB ENZYMES, Barueri, SP, Brasil), a Corolase® LAP
é um preparado enzimático proteolítico, contendo exclusivamente atividade de
exopeptidase. Esta enzima é um produto derivado do Aspergillus sojae (EC 3.4.11.1), e
classifica-se no grupo das metalo-proteases, apresentando um íon metálico no seu centro
ativo, o qual participa do mecanismo catalítico.
Ainda, de acordo com a AB ENZYMES (2001), a Corolase® LAP é
preferencialmente utilizada em conjunto com outras proteases para hidrólise de proteínas
de origem animal e vegetal, como por exemplo, caseína, proteína de soro de leite, soja,
etc. Apresenta atividade de atuação ótima na faixa de pH entre 6 e 9 e temperatura de 50
a 70 ºC. O produto é comercializado na forma de um líquido marrom claro com cheiro
característico, com densidade igual a 1,2 g/mL.
47
5.5.3 Protemax N200
A Protemax® N200 (Prozyn; São Paulo, SP, Brasil), de origem microbiana derivada
de cepas Bacillus subtilis, apresenta como característica a capacidade de hidrolisar
diferentes fontes protéicas em peptídeos de baixo peso molecular e aminoácidos.
Segundo a Prozyn, esta enzima é classificada como uma subtilisina
(EC 3.4.21.62), sendo uma serino-protease, portanto uma endopeptidase, que exibe
atividade catalítica na faixa de pH de 7 a 10. Todas as endopeptidases apresentam em
comum ácido aspártico, histidina e serina no sítio ativo (BEYNON & BOND, 2001).
Os benefícios desta protease estão relacionados com a alta velocidade e
especificidade para degradar proteínas, além de possuir alta solubilidade. O produto é
comercializado sob a forma de um pó fino, de cor branca e totalmente solúvel em água
(PROZYN, 2005).
5.5.4 Corolase L10
A Corolase® L10 é um preparado enzimático obtido a partir da Papaya carica,
produzido pela AB ENZYMES (Barueri, SP, Brasil), sendo, portanto, uma papaína.
Possibilita uma hidrólise protéica de alta eficiência e baixo custo. Possui ampla faixa de pH
de atuação (3<pH<9), adaptando-se aos mais diversos processos. Apresenta estabilidade
em temperaturas de 60 a 80ºC e sua inibição ocorre na presença de agentes sulfidrílicos.
Segundo a AB ENZYMES (2003) a Corolase® L10 é uma cisteíno-protease
(EC 3.4.22.2) e apresenta benefícios, tais como alta velocidade e especificidade para
degradar proteínas e elevada solubilidade. O produto é comercializado sob a forma de um
líquido amarelo claro com cheiro característico, com densidade igual a 1,2 g/mL.
5.5.5 Protemax N411
A Protemax N411 é uma neutrase, produzida pela Prozyn (São Paulo, SP, Brasil),
oriunda do Bacillus amyloquefaciens. De acordo com as especificações técnicas da
Prozyn, a Protemax N411 apresenta atuação em ampla faixa de pH (4,5 a 7,5), e sua
temperatura ótima de ação é de 55ºC. É comercializada na forma líquida, apresentando
densidade de 1,28 g/mL.
48
5.5.6 Corolase PP
Corolase® PP é um preparado enzimático proteolítico, obtido de pâncreas suíno,
composto por várias enzimas proteolíticas (tripsina, quimiotripsina, amino e
carboxipeptidase). De acordo com seu fabricante, a AB ENZYMES (Barueri, SP, Brasil), o
produto é comercializado sob a forma sólida, apresenta coloração bege e cheiro
característico. As proteases pancreáticas são divididas em serino-proteases (tripsina e
quimiotripsina) e metalo-proteases (carboxipeptidases A e B) (HINSBERGER & SANDHU,
2004).
A tripsina catalisa apenas a hidrólise das ligações peptídicas em que o grupo
carbonila (-CO) é fornecido pela arginina ou lisina. A quimiotripsina hidrolisa ligações
peptídicas em que o referido grupo é fornecido pela Phe, Tyr e Trp (SGARBIERI, 1996;
HINSBERGER & SANDHU, 2004).
A carboxipeptidase A (EC 3.4.17.1) é uma exopeptidase produzida no pâncreas de
animais superiores como um composto de três cadeias polipeptídicas, que, por ativação
com tripsina, produz a enzima com uma única cadeia polipeptídica, contendo 307 resíduos
de aminoácidos. O pâncreas produz também outro zimogênio que, por ativação, produz a
carboxipeptidase B. As duas enzimas são similares nos detalhes gerais do mecanismo
catalítico, ou seja, ambas requerem que o grupo carboxílico do resíduo carboxi-terminal
esteja livre e ambas possuem Zn2+ no sítio ativo, essencial para a atividade catalítica.
Entretanto, possuem especificidades bem diferentes, uma vez que a carboxipeptidase B
hidrolisa ligações peptídicas contendo arginina e lisina carboxi-terminais, enquanto que a
carboxipeptidase A requer que os resíduos carboxi-terminais não sejam arginina, lisina ou
prolina (WHITAKER, 1994).
5.5.7 Corolase TS
A Corolase® TS, derivada de Bacillus stearothermophilus, é um preparado
enzimático proteolítico que possui atividade exclusiva de endopeptidase. Segundo seu
fabricante, a AB ENZYMES (Barueri, SP, Brasil), a Corolase TS apresenta melhor
desempenho em valores de pH neutro a ligeiramente alcalino, com pH ótimo igual a 8,0.
Além disso, apresenta excelente estabilidade térmica, podendo ser utilizada em reações
com elevada temperatura. É comercializada sob a forma líquida, apresentando coloração
49
marrom clara e cheiro característico, com densidade igual a 1,15 g/mL (AB ENZYMES,
2002).
5.5.8 Flavourzyme
A Flavourzyme é uma enzima mista, ou seja, atua como endo e exopeptidase,
sendo obtida a partir de cepas do Aspegillus oryzae. Apresenta estabilidade na faixa de
pH de 5 a 7, e temperatura ótima de atuação de 55ºC. É comercializada na forma líquida,
apresentando coloração marrom escuro, cheiro característico e densidade de 1,18 g/mL.
6. REMOÇÃO DA FENILALANINA
6.1 Métodos de remoção
Diversos métodos foram desenvolvidos para remover a fenilalanina de proteínas
hidrolisadas (MIRA e MARQUEZ, 2000).
De acordo com SHIMAMURA et al. (1999) os métodos utilizados para a remoção da
Phe, baseiam-se na liberação deste aminoácido por tratamento químico ou enzimático,
sendo posteriormente removido por processos diferenciados.
Em alguns trabalhos foram produzidos peptídeos com baixo teor de Phe em escala
laboratorial, outros ainda em escala piloto. A remoção da Phe foi realizada segundo
técnicas e procedimentos diferenciados, como: uso de carvão ativado, peneira molecular,
cromatografia de troca iônica, biorreator com células imobilizadas de Rhodotorula glutinis,
ou por filme de membrana líquida (LOPEZ-BAJONERO et al.,1991).
A enzima fenilalanina amônio-liase é capaz de reduzir os níveis de Phe plasmáticos
através da desaminação da fenilalanina a ácido cinâmico e amônia, que podem ser
excretados na urina. Entretanto, a utilização desta enzima para a obtenção de produtos
50
alimentícios isentos de fenilalanina ainda é desconhecida (MACDONALD & D’CUNHA,
2007).
MOSZCZYNSKI & IDIZIAK (1993) avaliaram a eficiência da remoção da fenilalanina
através dos seguintes métodos: uso de carvão ativado, resinas de troca iônica e exclusão
molecular. Esses autores obtiveram uma maior remoção da fenilalanina através do uso do
carvão ativado (90% de Phe removida), de hidrolisados de caseína, os quais foram
preparados utilizando a associação das enzimas quimiotripsina, carboxipeptidase A e
leucina aminopeptidase.
Em estudos realizados no mesmo laboratório do presente trabalho, o carvão ativado
foi utilizado com eficiência na remoção de Phe (valores superiores a 90%) de diversas
fontes protéicas, tais como leite (SOARES et al, 2006; LOPES et al, 2007), soro de leite
(DELVIVO et al, 2006; SILVA et al, 2007), arroz em grãos (LOPES et al, 2008), fubá de
milho (CAPOBIANGO et al., 2007), farinha de arroz (SILVESTRE et al., 2008) e feijão
(LOPES Jr., 2008). Uma resina de adsorção foi, igualmente, utilizada por este mesmo
grupo de pesquisa na remoção de Phe de soro de leite, tendo levado a resultados
inferiores (95%) aos obtidos com o emprego do carvão ativado (99%) (LOPES et al.,
2007).
6.2 Avaliação da eficiência da remoção
A avaliação da eficiência da remoção de Phe é realizada pela sua quantificação na
matéria-prima, assim como em suas proteínas hidrolisadas, após emprego de um meio
adsorvente.
Vários métodos são descritos na literatura para a quantificação de Phe, tais como a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa (ZEZZA et al., 1992),
HPLC de troca iônica (FANG et al.,1992) e sensor enzimático de
membrana (SHIMAMURA et al., 1999)
Outro método cromatográfico foi desenvolvido no laboratório do presente trabalho,
baseado na cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), que permitiu a determinação,
não apenas da Phe, mas dos demais aminoácidos essenciais (CARREIRA et al., 2002).
A espectrofotometria derivada segunda (EDS) representa uma outra alternativa
reportada na literatura para a quantificação de Phe, pois trata-se uma técnica analítica
51
simples, rápida e de custo relativamente baixo, tendo sido considerada, por vários autores
como um método quantitativo e qualitativo vantajoso, de grande utilidade. Baseia-se na
derivação do espectro de absorção normal dos compostos analisados, originando picos
negativos sendo que os correspondentes à fenilalanina vão de 250 a 280 nm, do triptofano
de 285 a 295 e da tirosina de 300 a 310 (O´HARVER, 1979; RAGONE et al., 1984;
GRANT & BHATTACHARYYA, 1985; ROJAS et al., 1988).
Vários autores utilizaram esta técnica. Assim, ICHIKAWA & TERADA (1977, 1979,
1981) relataram a eficiência da EDS para medir Phe em proteínas ou em proteínas
hidrolisadas. Estes autores, primeiramente, examinaram resíduos de Phe em proteínas e
demonstraram que entre 245 e 270 nm os resíduos de aminoácidos de tirosina e triptofano
não causam diferença significativa nas propriedades da Phe. Dois anos mais tarde,
determinaram a Phe, por este método, em proteínas desnaturadas, encontrando
resultados que concordavam com os descritos na literatura. Vários autores têm relatado a
grande confiabilidade do uso da EDS, entre 245 e 270 nm para quantificar os resíduos de
Phe em proteínas, desde que as variáveis como o pH e a adição de outras substâncias
sejam controladas (BRANDTS & KAPLAN, 1973; O´HAVER, 1979; MATSUSHIMA et al.,
1975; ICHIKAWA & TERADA, 1977, 1979; CAHILL & PADERA, 1980; ICHIKAWA &
TERADA, 1981a,b; GRANT & BHATTACHARYYA, 1985; ROJAS et al., 1988).
Em estudos realizados no mesmo laboratório do presente trabalho, a EDS foi
utilizada para a quantificação de Phe em várias fontes protéicas, tais como leite em pó
(LOPES et al., 2006; SOARES et al., 2006), soro de leite (LOPES et al., 2007; SILVA et
al., 2007), arroz em grão (LOPES et al., 2008), fubá de milho (CAPOBIANGO et al., 2007),
farinha de arroz (SILVESTRE et al., 2009) e feijão (LOPES Jr., 2008).
7 CARACTERIZAÇÃO DOS HIDROLISADOS PROTÉICOS
A caracterização do hidrolisado protéico apresenta, normalmente, um dos seguintes
objetivos: determinação do grau de hidrólise; avaliação da distribuição dos peptídeos de
acordo com o tamanho da cadeia; identificação de peptídeos bioativos; determinação da
especificidade de novas endoproteases; verificação e localização de modificações
52
100 X(NT) total nitrogênio
(NA) aminado-α nitrogênio %GH =
químicas na estrutura primária dos peptídeos, nomeadamente, alterações nas cadeias
laterais de alguns aminoácidos e glicação dos aminoácidos por açúcares redutores
(LÉONIl et al., 2000).
Neste trabalho, a caracterização dos hidrolisados protéicos envolveu, apenas, dois
dos objetivos citados acima, ou seja, a determinação do grau de hidrólise e a distribuição
dos peptídeos; de acordo com o tamanho da cadeia. Portanto, abaixo, estão descritos os
métodos utilizados para a avaliação destes dois parâmetros.
7.1 Grau de Hidrólise
Para o acompanhamento e controle da hidrólise de proteínas, é necessária a
avaliação do grau de hidrólise (GH), que se define como o percentual de rompimento das
ligações peptídicas de uma proteína, podendo ser expresso através da razão:
sendo:
-GH= percentual de grau de hidrólise.
-NA=nitrogênio α-aminado (correspondente às ligações peptídicas clivadas da
proteína).
-NT=nitrogênio total (considerado o total de ligações peptídicas da proteína).
Os diferentes métodos utilizados para medir o GH baseiam-se, principalmente, em
três fundamentos: na determinação do nitrogênio solúvel, após precipitação da proteína
com ácido tricloroacético; na determinação de grupos amino livres ou na determinação de
prótons liberados após ruptura das ligações peptídicas em determinados valores de pH.
Para a determinação do GH através do nitrogênio solúvel, as técnicas mais
utilizadas são: o método de Kjeldhal (AOAC, 1995); a reação de Biureto (Hung et al.,
1984) ou através da determinação de peptídeos contendo grupos aromáticos, por meio da
técnica da espectrofotometria na região UV. A determinação dos grupos amino livres,
pode ser realizada através de sua reação com substâncias químicas, tais como ninidrina,
53
ácido tricloroacético (TNBS) ou ortofenillaldeído (OPA), e a medida espectrofotométrica
dos produtos formados.
O controle da hidrólise enzimática das proteínas em pH alcalino pode ser realizado,
de forma sensível e precisa, através da medida do consumo de base, necessária para
manter constante o pH na reação de hidrólise (ADLER-NISSEN, 1986). Entretanto, o
consumo da quantidade de base não está diretamente relacionado com o grau de
hidrólise, sendo necessário o conhecimento de outros parâmetros, como o pK médio dos
grupamentos amino liberados na hidrólise (CAMACHO et al., 2001).
A quantificação do grau de hidrólise, através da determinação de grupos amino
liberados durante a hidrólise na presença de formol, é relevante, devido à sua eficácia,
rapidez e reduzidos custos. O método de SORENSEN (A.O.A.C., 1995), baseado na
titulação com formol, determina o grau de hidrólise por meio da relação do nitrogênio
α-aminado (sendo considerado o número de ligações peptídicas clivadas pelas proteínas),
e o nitrogênio total (considerado o número total de ligações peptídicas) (NILSANG et al.,
2005).
7.2 Perfil Peptídico
Diversos métodos têm sido relatados na literatura visando o fracionamento de
hidrolisados protéicos. Atualmente, em escala laboratorial, as técnicas cromatográficas
são as mais utilizadas para a caracterização de hidrolisados. Para avaliação da
distribuição dos peptídeos de acordo com o tamanho da cadeia, a cromatografia líquida de
alta performance de exclusão molecular (SE-HPLC), baseada nas diferenças de volumes
hidrodinâmicos das moléculas, tem sido largamente utilizada. A cromatografia líquida de
alta performance de fase reversa (RP-HPLC), baseada na diferença da hidrofobicidade,
vem sendo, igualmente, empregada na caracterização de hidrolisados protéicos, sendo
possível, através do perfil cromatográfico, prever a distribuição dos pesos moleculares dos
peptídeos (VAN DER VEN et al. 2002). Esta técnica, ao ser utilizada por LEMIEUX et al.,
(1991), mostrou ser eficiente para separar peptídeos de hidrolisados protéicos de caseína
obtidos pela ação da tripsina e quimiotripsina, além de fornecer algumas informações
sobre a sua hidrofobicidade ou hidrofilicidade. A cromatografia de troca iônica (IE-HPLC),
baseada na separação de cargas das moléculas, ou aquela fundamentada na afinidade
54
específica por determinados ligantes (LE-HPLC), é outro método que, também, tem sido
utilizado para analisar os hidrolisados protéicos (VAN DER VEN et al. 2002).
A combinação de SE-HPLC e AE-HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência de
troca iônica) mostrou grande sucesso na separação de peptídeos fosforilados e
desfosforilados no hidrolisado de caseína, além da identificação de mais de 200 destes
compostos (LEMIEUX & PIOT, 1990).
O fracionamento de oligopeptídeos apresenta problemas, ainda mais complexos,
pois envolve a interação com o suporte cromatográfico. SILVESTRE et al. (1994a)
desenvolveram um método eficiente para este fim, empregando uma coluna
cromatográfica de exclusão molecular contendo o complexo poli (2-hidroxietil-
aspartamido)-sílica (PHEA), que lhes possibilitou separar peptídeos com massas
moleculares menores do que 1000Daltons.
A espectrofotometria derivada segunda (EDS) foi empregada por SILVESTRE et al.
(1993) para analisar hidrolisados de caseína. Com este método, os autores estimaram o
grau de hidrólise e a homogeneidade do hidrolisado (presença de hidrolisado protéico ou
mistura de aminoácidos). Essa técnica já foi empregada, no mesmo laboratório onde foi
realizado o presente projeto, para a avaliação do grau de encapsulação de hidrolisados
enzimáticos de caseína (MORAIS et al., 2004), como também para a determinação de
aminoácidos aromáticos de hidrolisados enzimáticos de leite em pó (SOARES et al., 2006;
LOPES et al., 2005), de soro de leite (SILVA et al., 2007; DE MARCO et al. 2005) e de
arroz (BIZZOTTO et al., 2006).
55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Estas referências bibliográficas incluem as citadas na Introdução e na Revisão de
Literatura.
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64
TRABALHO EXPERIMENTAL
1 APRESENTAÇÃO
A parte experimental deste trabalho está apresentada na forma de fluxograma, nas
Figuras 1 e 2. Os resultados foram divididos em dois capítulos e redigidos sob a forma de
artigos científicos.
O primeiro capítulo refere-se à obtenção de hidrolisados protéicos a partir do
concentrado protéico do soro do leite (WPC), com baixo teor de fenilalanina. Inicialmente,
foi realizada a determinação da composição centesimal do WPC. A partir disso, foram
preparados, enzimaticamente, hidrolisados protéicos, sob diversas condições de reação.
As variáveis empregadas foram: tipo de enzima, relação E:S, concentração da matéria-
prima e tempo de hidrólise. Utilizou-se o carvão ativado (CA) para remoção da fenilalanina
dos hidrolisados protéicos, e a eficiência da remoção foi avaliada pela espectrofotometria
derivada segunda (EDS), determinando-se o teor de fenilalanina livre na matéria-prima
inicial e nos hidrolisados do WPC após tratamento com o CA.
O segundo capítulo refere-se à caracterização dos hidrolisados protéicos do WPC
quanto ao grau de hidrólise e perfil peptídico, tendo sido avaliado o efeito dos seguintes
parâmetros: tipo de enzima, relação enzima:substrato e concentração da matéria-prima. O
grau de hidrólise foi determinado por meio da relação entre os teores de nitrogênio α-
aminado e total. A análise do perfil peptídico envolveu o fracionamento dos hidrolisados
por cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular e, para a quantificação
dos componentes das frações cromatográficas, empregou-se o método rápido da Área
Corrigida da Fração. Além disso, foi verificada a existência de correlação entre o grau de
hidrólise e o perfil peptídico utilizando-se o coeficiente de correlação de Pearson.
Capítulo I
Figura 2 - Pr
Determinação dacomposição química
Concentrado protéico do sorodo leite(WPC)
incipais etapas do trabalho experi
Cálculo do percentualde remoção de Phe
Hidrólise ácida
Medida do teorde Phe por EDS
Preparo de hidrolisadosenzimáticos do WPC
65
mental do Capítulo I.
Tratamento comcarvão ativado
Hidrólise ácida
Medida do teorde Phe por EDS
Capítulo II
1SE-HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecula2ACF: método rápido da área corrigida da fração (SILVESTRE et al., 199
Figura 3 - Principais etapas do trabalho experim
Hidrolisados enzimáticos doWPC
Determinação doGrau de Hidrólise
Fracionamento dospeptídeos por
SE-HPLC em colunaPHEA1
r (4b
e
Quantificação dospeptídeos pelo
Método da ACF2
Caracterização doperfil peptídico
Correlação entre ograu de hidrólise e o
perfil peptídico
66
SILVESTRE et al., 1994a). ).
ntal do Capítulo II
67
Capítulo I
OBTENÇÃO DE HIDROLISADOS ENZIMÁTICOS DOCONCENTRADO PROTEICO DO SORO DE LEITE COM BAIXO
TEOR DE FENILALANINA
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de hidrolisados enzimáticos a partir do
concentrado protéico do soro do leite (WPC), servindo como alimento ou ingrediente
alimentar na dieta de fenilcetonúricos. Foram preparados 17 hidrolisados enzimáticos,
avaliando-se o efeito de alguns parâmetros, como tipo de enzima, relação
enzima:substrato (E:S), concentração da matéria-prima e tempo de hidrólise. O carvão
ativado foi utilizado como meio adsorvente, e mostrou-se eficaz na remoção da Phe,
obtendo-se percentuais acima de 70%. O melhor resultado foi encontrado utilizando-se a
pancreatina na relação E:S de 1:100, com a concentração da matéria prima de 10% (p/v)
após 5 horas de hidrólise, tendo atingido 81,3% de remoção e o teor final de Phe de 394,1
mg/100g de hidrolisado.
Palavras-chave: Concentrado protéico do soro do leite; hidrólise enzimática; fenilalanina;
fenilcetonúria.
68
ABSTRACT
PREPARATION OF WHEY PROTEIN CONCENTRATE HYDROLYSATES WITH LOWPHENYLALANINE CONTENT. The objective of this work was to prepare enzymatic
hydrolysates from whey protein concentrate (WPC) with low phenylalanine (Phe) content,
serving as food or ingredient in the phenylketonuric’s diet. Seventeen enzymatic
hydrolysates were prepared and the effect of some parameters, such as type of enzyme;
enzyme:substrate ratio; substrate concentration and time of hydrolyse was evaluated. The
activated carbon was used as adsorbent and showed to be efficient for removing Phe,
leading to values above 70%. The best results were found using a pancreatin in a E:S ratio
of 1:100, a substrate concentration of 10% (w/v) after 5 hours of hydrolysis, obtaining
81.3% of removal and a final Phe content of 394.1 mg/ 100g of hydrolysate.
Key words: Whey protein concentrate; enzymatic hydrolysis; phenylalanine;
phenilketonuria.
69
1 INTRODUÇÃO
A fenilcetonúria (PKU) é uma doença genética causada pela mutação do gene que
codifica a enzima fenilalanina hidroxilase (PAH), ativa no fígado e responsável pela
transformação da fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr) (STRYER, 1996; LOPEZ-
BAJONERO et al., 1991; MARTINS et al., 1993). A deficiência ou inatividade da PAH
resulta no acúmulo da Phe e seus metabólitos no sangue e outros tecidos, acarretando
retardo mental, microcefalia, hiperatividade, ou comportamento autista, tremor, falhas de
crescimento, convulsões, menor pigmentação da pele e cabelos e odor característico na
urina (MIRA & MARQUEZ, 2000).
A incidência da fenilcetonúria é bastante variável, abrangendo números que vão de
1:3.000 nascidos vivos na Turquia até 1:60.000 no Japão. Nos Estados Unidos, a
fenilcetonúria atinge aproximadamente uma criança para cada 15.000 nascidas. No Brasil,
a prevalência gira em torno de 1:15.000 a 1:20.000 nascidos vivos (BRASIL, 2004).
O tratamento para a PKU consiste, acima de tudo, numa dieta pobre em Phe, que
deve ser iniciada o mais precocemente possível e mantida por toda a vida (LOPEZ-
BAJONERO et al., 1991; MARTINS et al., 1993; SHIMAMURA et al., 1999; MIRA &
MARQUEZ, 2000). As necessidades protéicas dos fenilcetonúricos são, geralmente,
supridas pelas misturas de aminoácidos livres, isentas de fenilalanina, disponíveis no
mercado, podendo ser acrescidas de outros nutrientes. Entretanto, essas misturas
possuem odor e paladar desagradáveis, são monótonas, dispendiosas, hiperosmóticas,
além de apresentarem elevado custo (MIRA & MARQUEZ, 2000, GUADIX et al., 2000).
Dessa forma, os hidrolisados protéicos isentos ou com baixo teor de fenilalanina,
constituem boa alternativa para o tratamento dos fenilcetonúricos, pois, apresentam
melhor tolerância, sabor e odor agradável e menor osmolaridade (MILUPA, 1995; MIRA &
MARQUEZ, 2000).
As formulações especiais descritas na literatura para fenilcetonúricos são
elaboradas a partir de fontes protéicas como caseína e concentrado protéico do soro
(KITAGAWA et al., 1987; LOPEZ-BAJONERO, et al., 1991). O concentrado protéico do
soro de leite (WPC) foi a matéria-prima de escolha do presente trabalho por apresentar
70
alto teor protéico (34%) e conter proteínas de elevado valor nutricional e biológico
(HUFFMAN & HARPER, 1999; BRANS et al., 2004).
O WPC é um produto originado da separação em membranas das proteínas do
soro do leite, podendo apresentar de 35 a 80% de proteínas. Diversas aplicações
importantes estão associadas ao WPC, sendo um ingrediente amplamente utilizado na
indústria de alimentos em uma grande variedade de produtos como cárneos, bebidas,
produtos de padaria e formulações infantis, devido às excelentes propriedades funcionais
destas proteínas (KINSELLA & WHITEHEAD, 1989; BRANS et al., 2004).
Os métodos utilizados para a remoção da Phe baseiam-se na liberação deste
aminoácido por hidrólise química ou enzimática, sendo posteriormente removidos por
processos diferenciados, tais como tratamento com carvão ativado ou resina de troca
iônica, uso de peneira molecular e cromatografia de troca iônica. A desaminação com a
enzima fenilalanina amônio liase também é sugerida. A escolha do método deve sempre
considerar a relação custo/eficiência (LOPEZ-BAJONERO et al., 1991; MOSZCZYNSKI &
IDIZIAK, 1993).
O carvão ativado e uma resina de adsorção foram testados, anteriormente, no
Laboratório de Bromatologia/Pesquisa, tendo sido eficientes na remoção de Phe de
hidrolisados protéicos de fontes diversas e empregando condições de hidrólises variadas
(DELVIVO et al., 2006; SOARES et al., 2006; SILVA, et al., 2007; CAPOBIANGO et al.,
2007; LOPES et al., 2008).
A eficiência da remoção de Phe é efetuada por meio de sua quantificação na
matéria-prima, assim como em seus hidrolisados protéicos após tratamento por um meio
adsorvente. Para quantificar o teor de Phe em proteínas ou em hidrolisados protéicos, a
espectrofotometria derivada segunda (EDS) tem sido utilizada por diversos autores,
mostrando ser uma técnica rápida, útil e confiável (O´HARVER, 1979; CAHILL & PADERA,
1980; GRANT & BHATTACHARYYA, 1985; ROJAS et al., 1988). Esta técnica foi,
igualmente, utilizada no mesmo laboratório do presente trabalho para a avaliação da
porcentagem de remoção de Phe de hidrolisados de leite em pó desnatado (LOPES et al.,
2005 SOARES et al., 2006), de soro de leite em pó (LOPES, et al., 2007), fubá de milho
(CAPOBIANGO, et al., 2007), de arroz (VIERA, et al., 2008) e de feijão (LOPESJR, 2008).
Diante da necessidade da criação de ingredientes ou produtos alimentares que
sirvam, primordialmente, como fonte protéica de alta qualidade para fenilcetonúricos, o
presente trabalho apresentou como objetivo a obtenção de hidrolisados protéicos com
71
baixo teor de fenilalanina, a partir do concentrado protéico do soro do leite. Dessa forma,
verificou-se o efeito de diversos parâmetros neste processo, tais como, tipo de enzima;
relação enzima:substrato; concentração da matéria-prima e tempo de hidrólise.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MATERIAL
O concentrado protéico do soro do leite (Whey Protein Concentrate - WPC) na
forma de pó (Kerrylac 750) foi gentilmente doado pela Kerry do Brasil Ltda (Três
Corações, MG, Brasil). A papaína (Corolase® L10) foi comprada da AB Enzymes
(Darmstadt, Alemanha). As demais proteases foram gentilmente doadas pela Prozyn (São
Paulo, Brasil) (B. subtillis - Protemax N200 e B. subtillis - Protezyn L) e pela AB Enzymes
(B. stearotothermophilus - Corolase® TS, pancreatina - Corolase® PP, A. sojae -
Corolase® LAP; A. oryzae - Flavourzyme e B. amyloquefaciens - Protemax N411).
Algumas características destas enzimas estão apresentadas na Tabela I.1. Os
aminoácidos L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, EUA). O carvão ativado (granulado n° 119, 20 x 50 mesh, 12 x 25 mesh, 6 x 12
mesh série Tyler) foi adquirido da Carbomafra S.A. (Curitiba, PR, Brasil).
2.2 MÉTODOS
2.2.1 Determinação da composição química da matéria-prima
A composição química do WPC foi determinada segundo os métodos descritos na
Association of Analytical Communities (AOAC, 1995), sendo todas as análises realizadas
em triplicata. O método de secagem em estufa ventilada (Quimis Q-314M242, série 020,
Diadema, SP), a 105 ºC até peso constante, foi utilizado para a determinação da umidade;
o teor de cinzas foi determinado por incineração, em mufla a 550 ºC; os lipídeos, por
extração com éter etílico (Soxhlet modificado, Quimis Q-308G26, série 018, Diadema, SP);
72
as proteínas, pelo método de micro-Kjeldahl, utilizando-se 6,38 como fator de conversão
de nitrogênio total para proteína total (NIELSEN, 1998); e o teor de carboidratos foi
calculado pela diferença entre 100 e a soma das porcentagens de água, proteínas,
lipídeos totais e cinzas totais.
Tabela I.1 - Características das proteases utilizadas para o preparo dos hidrolisadosprotéicos.
EstabilidadeGrupo Nome comercial Origem
Atividadeenzimática5
U/mL pH T (ºC)
Metaloprotease Corolase® TS2 Bacillus
stearothermophilus 44,13 7<pH<8 60<T<80
Serino eMetalo
proteaseCorolase® PP2 Pancreatina 34,71 7<pH<9 45<T<55
CisteínoProtease Corolase® L102
Carica papaya 31,56 3<pH<9 50<T<70
Metaloprotease Corolase® LAP2 Aspergillus sojae 63,19 3<pH<9 50<T<70
Metaloprotease Flavourzyme®1 Aspergillus oryzae 512,43 6<pH<9 50<T<70
Serinoprotease Protemax N4111 Bacillus
amyloquefaciens 53,00 7<pH<7,5 55
Serinoprotease Protemax ® N2001 Bacillus subtilis 20,19 4,5<pH<7 50<T<55
Serinoprotease Protezyn® L1 Bacillus subtilis 29,83 9 55
Fonte: 1PROZYN (2005); 2, 3, 4AB ENZYME (2001, 2002, 2003); 5Valor determinado no presente trabalho de acordocom a metodologia descrita por DIAS et al., 2008.
2.2.2 Preparo dos hidrolisados protéicos
Foram preparados 17 hidrolisados enzimáticos a partir de soluções do WPC,
variando-se os seguintes parâmetros: tipo de enzima, relação enzima:substrato (E:S),
concentração da matéria-prima (p/v) e tempo de hidrólise (Tabela I.2). A relação
proteína: carvão ativado (CA) utilizada foi de 1:88.
1 PROZYN. Especificações técnicas de enzimas. s.n., 2005. 2p;2AB ENZYMES. Corolase® PP, Corolase® 7089, Corolase® LAP, Corolase® N: Description and Specification. Rev. Nr. 02. 2001,8p;3AB ENZYMES. Corolase® TS: Description and Specification. Rev. Nr. 00. 2002, 2p;4AB ENZYMES. Corolase® L10: Description and Specification. Rev. Nr. 03. 2003, 2p.5CALIK et al., (2002). Enzyme and Microbial Technol., 31, pp. 685-697; KUMAR, C.G. (2002). Lettrers in Applied Microbiology,34, pp. 13-17.
73
Para a obtenção dos hidrolisados, 100 mL de solução do WPC a 10% (p/v) foram
inicialmente colocados em um erlenmeyer e o pH foi ajustado a um valor compreendido na
faixa ótima apresentada nas fichas técnicas de cada enzima, disponibilizadas pelos
fornecedores. Em seguida, a temperatura foi estabilizada, também de acordo com as
especificações técnicas dos fornecedores, e as enzimas adicionadas em quantidade
suficiente para se obter a relação E:S desejada. Ao final da reação, o processo foi
interrompido por aquecimento em banho-maria a 75ºC, por 15 segundos, a fim de inativar
a enzima, o que foi confirmado pela medida da atividade enzimática, antes e após o
tratamento enzimático, pelo método descrito por DIAS et al., 2008, porém sem adição de
caseína.
2.2.3 Remoção de fenilalanina dos hidrolisados protéicos
A Phe foi removida dos hidrolisados protéicos do WPC pela utilização do carvão
ativado como meio adsorvente. Foi empregado o procedimento de passagem por coluna,
desenvolvido no mesmo laboratório do presente trabalho (SOARES et al., 2006). O CA foi
hidratado com água destilada por 10 min sob agitação constante e, em seguida, colocado
em seringa descartável de 10 mL contendo filtro de nylon com lã de vidro. A coluna de
carvão ativado foi montada colocando-se embaixo o carvão de menor granulometria,
seguido pelo de média e por cima o de maior granulometria. Em seqüência, os
hidrolisados foram passados pela coluna, em quantidade suficiente para atingir a relação
proteína:CA desejada, e submetidos à pressão (compressor Diapump, Fanem, mod. 089-
A, série BE 11778, São Paulo, SP, Brasil), tendo sido recolhidos os eluatos.
2.2.4 Efeito de alguns parâmetros sobre o preparo dos hidrolisados protéicos combaixo teor de fenilalanina
Os parâmetros estudados estão citados na Tabela I.2. O efeito do tipo de enzima foi
testado empregando-se seis diferentes proteases de microrganismos, uma pancreatina e
uma papaína. Para o estudo da influência da relação enzima:substrato foram utilizadas as
relações de 1:100, 2:100 e 4:100. O efeito da concentração da matéria-prima foi estudado
nos valores de 7%, 8%, 9% e 10% (p/v). Finalmente, estudou-se o efeito do tempo de
hidrólise, sendo testados os valores de 1, 2, 3, 4 e 5 horas.
74
Tabela I.2 - Parâmetros empregados no preparo dos hidrolisados protéicos de concentradoprotéico do soro do leite (WPC).
Hidrolisados Enzima pH
(ótimo)
Temperatura
(ºC)
E:S WPC
(p/v)
Tempo
(h)
H1 B.subtillis (Protezyn L) 9 55 1:100 10% 5
H2 A. sojae (Corolase LAP) 9 55 1:100 10% 5
H3 B.subtlillis (Protemax N200) 7 55 1:100 10% 5
H4 Papaína (Corolase L10) 7 55 1:100 10% 5
H5 B. amyloquefaciens (Protemax N411) 7 55 1:100 10% 5
H6 A.oryzae (Flavourzyme) 7 50 1:100 10% 5
H7 B. stearothermophilus (Corolase TS) 8 60 1:100 10% 5
H8 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 10% 5
H9 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 2:100 10% 5
H10 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 4:100 10% 5
H11 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 7% 5
H12 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 8% 5
H13 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 9% 5
H14 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 10% 1
H15 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 10% 2
H16 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 10% 3
H17 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 10% 4
WPC = Whey Protein Concentrate; E:S = relação enzima:substrato
75
2.2.5 Avaliação da eficiência da remoção de fenilalanina
A avaliação da eficiência da remoção de Phe foi realizada pela medida do teor de
Phe livre, no WPC e em seus hidrolisados, após tratamento com CA, empregando-se a
espectrofotometria derivada segunda (LOPES et al., 2005). As amostras foram submetidas
a hidrolise ácida (HCl a 5,7 mol/L, 110 °C, 24 h) e, após ajuste do pH para 6,0, com
solução de fosfato de sódio dibásico (1 mol/L), foram submetidas às leituras de
absorbância na faixa de 250 a 280 nm. Foram traçados os espectros de derivada segunda
(Espectrofotômetro CECIL modelo CE2041, Buck Scientific, Hanslope, Inglaterra) e a área
do terceiro pico negativo foi usada para calcular a quantidade de Phe presente nas
amostras, empregando-se a curva padrão. O software GRAMS-UV (Galactic Industries
Corporation, Salem, EUA) foi utilizado para traçar os espectros da derivada segunda.
Para a curva padrão, soluções estoques de Phe (6,05 x 10-4 mol/L), Tyr (5,52 x 10-4
mol/L) e Trp (4,90 x 10-4 mol/L) foram preparadas em tampão fosfato de sódio a 0,01 mol/L
(pH 6,0). Em seguida, 10 mL de cada uma destas soluções foram misturados e a solução
obtida foi diluída, sucessivamente, de maneira a se obter concentrações de Phe variando
de 0,067 a 2,018 x 10-4 mol/L.
A eficiência da remoção de Phe foi calculada de acordo com a equação (1):
% Remoção de Phe (1)
sendo:
A = Teor de Phe no concentrado protéico do soro do leite.
B = Teor de Phe no hidrolisado protéico, após tratamento com CA. C = Teor de proteína no concentrado protéico do soro do leite.
D = Teor de proteína no hidrolisado protéico do concentrado protéico do soro do leite.
2.2.6 Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em 3 repetições, e as análises realizadas
em triplicata. Para comparar a porcentagem de remoção de fenilalanina dos hidrolisados
100)]/([ xA
DBxCA −=
76
protéicos, utilizou-se a Análise de Variância (ANOVA fator único) e o Teste de Duncan
para comparação de médias, ambos a 5% de probabilidade (PIMENTEL-GOMES, 2000).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO CONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DO LEITE
O conhecimento da composição química do WPC é relevante, pois esse
concentrado representa a matéria-prima para o desenvolvimento de novos ingredientes ou
produtos que, no caso do presente trabalho, serão destinados a um grupo específico de
pacientes, os fenilcetonúricos.
Observa-se na Tabela I.3 que os teores obtidos para proteínas, cinzas totais e
lactose estão próximos aos encontrados por outros autores. Além disso, o teor de umidade
está de acordo com a ficha técnica do produto que informa apenas sobre este valor (> 5
g%), porém é superior aos obtidos pelos outros autores. Por outro lado, a quantidade de
lípides aqui encontrada é bem inferior à reportada na literatura. Esta diferença deve estar
relacionada ao fato de que o método utilizado por MORTENSON et al. (2007) para a
determinação deste nutriente (método de Mojonnier) não foi o mesmo do presente
trabalho. No caso de SAMMEL & CLAUS (2003), não foi relatada a metodologia utilizada.
Outros autores também relataram diferenças na composição química de WPC
proveniente de diversas empresas. Assim, ONWULATA, et al., (2004) observaram
significantes variações na composição química de 6 concentrados protéicos de soro de
leite fornecidos por diferentes empresas, especialmente com relação aos teores de
umidade, proteína, lipídios, cinzas e carboidratos. Da mesma forma, REGESTER et al.
(1992), ao analisarem 6 concentrados protéicos de soro de leite de diferentes empresas,
encontraram consideráveis variações quanto ao teor de cinzas totais.
77
Tabela I.3 – Composição química do concentrado protéico de soro do leite
Componentes 1Valores obtidos (g%) WPC 1(g%)
WPC2(g%)
WPC 3(g%)
Proteínas 32,64 --- 34,5 38,6
Umidade 5,06 > 5 3,5 2,4
Lipídeos 0,15 --- 3,5 2,8
Cinzas totais 7,40 --- 6,4 6,5
Lactose 54,75 --- 52,1 49,8
1Valores encontrados após análise do concentrado protéico do soro de leite utilizado no experimento (KERRYLAC 750,Kerry do Brasil Ltda, MG, Brasil). WPC 1 - Valores disponibilizados na ficha técnica do produto KERRYLAC 750 da Kerrydo Brasil Ltda (Três Corações, MG, Brasil); WPC 2 - Valores encontrados por SAMMEL & CLAUS, 2003 analisando oWPC Foremost 365 (Foremost Farms, Baraboo, WI, USA). WPC 3 – Valores encontrados por MORTENSON et al.(2007).
3.2 EFICIÊNCIA DA REMOÇÃO DE FENILALANINA
Na Tabela I.4 estão representados os resultados obtidos para a remoção de Phe
dos hidrolisados do concentrado protéico do soro do leite.
Os valores estão apresentados em termos de porcentagem de remoção de Phe e
em teor final de Phe (mg Phe/ 100g de hidrolisado do concentrado protéico do soro),
sendo esta última forma a mais apropriada para os cálculos de adequação das prescrições
dietéticas de substitutos protéicos destinados a fenilcetonúricos, além de atender à
regulamentação técnica que normatiza a rotulagem nutricional de alimentos no Brasil
(ANVISA, 2003). O teor de Phe encontrado no WPC foi de 2106,7 mg de Phe/100g do
produto, sendo que não foram encontrados na literatura dados de outros autores sobre o
teor de Phe do WPC utilizado no presente trabalho (WPC com 32,64% de proteína,
conforme Tabela I.3). Entretanto, foi encontrado na literatura um trabalho realizado com
WPC proveniente da empresa Mahaan (New Delhi, USA) contendo 75,6% de proteína, o
qual apresentou teor de Phe de 3620 mg de Phe/100g do produto (SINHA, et al., 2007).
78
Tabela I.4- Percentual de remoção e teor final de fenilalanina dos hidrolisadosprotéicos do concentrado protéico do soro do leite.
Hidrolisados Remoção de Phe(%)
Teor final de Phe(mgPhe/100 g do hidrolisado de WPC1)
H1 77,8b 467,6
H2 61,7d,e,f 806,4
H3 55,6g 934,1
H4 64,7d 743,2
H5 60,8e,f 826,4
H6 79,0a,b 441,1
H7 69,6c 641,2
H8 81,3a 394,1
H9 63,0d,e 778,6
H10 63,2d,e 775,3
H 11 62,7d,e 785,5
H 12 62,3d,e,f 794,8
H 13 59,1f 861,8
H 14 19,4k 1697,3
H 15 22,6j 1631
H 16 30,3i 1468,4
H 17 33,5h 1400,91WPC= Whey protein concentrate
Como pode ser observado, o uso do carvão ativado mostrou-se eficaz na remoção
de Phe dos hidrolisados protéicos do WPC, tendo o percentual de remoção variado de
19,4% a 81,3%, e o teor final de Phe de 394,1 a 1697,3 mg de Phe/100g de hidrolisado de
WPC, dependendo dos parâmetros empregados. Ressalta-se, ainda que, dos 17
hidrolisados estudados, o H8 foi o que apresentou a maior remoção de Phe (81,3%).
Levando-se em conta que o teor máximo de Phe permitido pela legislação brasileira
(BRASIL, 2002) para pacientes fenilcetonúricos é de 0,1g/100g de produto, o hidrolisado
H8 poderia ser utilizado como fonte protéica na elaboração de um suplemento nutricional
para fenilcetonúricos na quantidade de 25,4g, o que corresponde a 0,1 g de Phe/100g e a
um teor protéico de 8,28 g/100 g. Apesar deste valor ser bem menor que o do WPC,
79
representa um valor superior ao teor protéico de alimentos convencionais, fontes de
proteínas, tais como o leite (3,0%), bebida láctea (2,0%) e iogurte (3,0%) (TACO, 2006).
Vale a pena ressaltar que a possibilidade de introduzir o WPC na dieta de
fenilcetonúricos, através da utilização do hidrolisado H8 em uma formulação dietética, teria
um elevado impacto nutricional, já que os alimentos de origem animal não são permitidos
na alimentação destes pacientes, devido ao elevado teor de Phe.
Além disso, a introdução de proteínas na forma hidrolisada na dieta destes
pacientes é vantajosa, do ponto de vista nutricional, uma vez que os oligopeptídeos,
especialmente di-tripeptídeos, são mais rapidamente absorvidos do que misturas de
aminoácidos livres (FRENHANI & BURINI, 1999), que são normalmente usadas na
alimentação de fenilcetonúricos.
Deve-se ressaltar, ainda, que a presença de uma certa quantidade de Phe no
produto final para fenilcetonúricos é desejável, do ponto de vista nutricional, uma vez que,
por ser um aminoácido essencial, a Phe é fundamental para o crescimento normal de
crianças. Além disso, as condições operacionais necessárias para atingir cerca de 100%
de remoção de Phe, aumentariam demasiadamente os custos do processo (LOPES et al.,
2006; SOARES et al., 2006).
Não foram encontrados na literatura dados de outros autores sobre a remoção de
Phe de WPC. Por outro lado, em estudos previamente realizados no Laboratório de
Bromatologia/Pesquisa da UFMG, a remoção de Phe foi realizada partindo-se de outras
fontes protéicas. Assim, o CA foi utilizado com eficiência para a remoção de Phe de leite
em pó (93,6 a 99%) (SOARES et al., 2006; LOPES et al., 2006), do soro de leite
(75 a 99 %) (SILVA et al., 2007; DELVIVO et al., 2006), do arroz (85 a 100%) (LOPES et
al., 2008) e do fubá de milho (68,63 a 97,55%) (CAPOBIANGO et al., 2007). Observa-se
que, para a maioria dos hidrolisados de WPC aqui estudados, a porcentagem de remoção
de Phe está próxima dos valores destes outros trabalhos.
3.3 EFEITO DE ALGUNS PARÂMETROS SOBRE A REMOÇÃO DE FENILALANINA
O efeito do tipo de enzima foi avaliado com o intuito de se obter o hidrolisado
protéico com o maior percentual de remoção de Phe. Os demais parâmetros – relação
enzima:substrato (E:S), concentração da matéria-prima (p/v) e tempo de hidrólise – foram
80
analisados levando-se, igualmente, em consideração a redução dos custos do processo
para adaptação em larga escala. Assim, o emprego de uma menor relação E:S está
associado à utilização de menor quantidade de enzima necessária para hidrólise; a
utilização de uma maior concentração da matéria-prima, facilita posterior processo de
secagem na obtenção do produto final; e o menor tempo de hidrólise está associado à
diminuição da contaminação bacteriana, à redução da formação de produtos de
degradação, além de menor gasto de energia.
3.3.1 Efeito do tipo de enzima
Para a avaliação do efeito do tipo de enzima, foram comparados os hidrolisados de
H1 até H8. Dentre as enzimas utilizadas, a pancreatina (H8) foi a mais eficiente, levando à
obtenção do hidrolisado com o menor teor final de Phe (394,1 mg Phe/100g). Este
resultado poderia ser, pelo menos em parte, explicado pelo fato de que a pancreatina é
um complexo enzimático que apresenta tanto endopeptidases (tripsina, quimiotripsina)
como exopeptidases (carboxipeptidase A e B) sendo, portanto, capaz de hidrolisar
ligações peptídicas tanto no interior quanto nas porções N- ou C- terminais da cadeia
peptídica, favorecendo uma maior exposição da fenilalanina, o que facilitaria a sua
remoção pelo carvão ativado.
Pode-se observar, ainda, na Tabela I.4, que o emprego de duas enzimas obtidas do
mesmo microrganismo (B. subtillis; H1 e H3) levou a resultados diferentes, tanto para a
atividade enzimática quanto para a remoção de Phe. De fato, como essas enzimas foram
preparadas por fabricantes distintos, os processos utilizados não devem ter sido os
mesmos, o que influenciaria na composição dos extratos enzimáticos, alterando não
apenas a quantidade, mas também a qualidade das atividades das enzimas.
O efeito do tipo de enzima sobre a remoção de Phe de hidrolisados protéicos foi,
anteriormente, avaliado em três estudos realizados no mesmo laboratório do presente
trabalho. Assim, ao se utilizar uma papaína (Biobrás, Montes Claros, Brasil) e uma
pepsina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para preparar hidrolisados protéicos de leite
em pó, não foi observada diferença significativa nos percentuais de remoção de Phe
(97,6% e 97,1%, respectivamente) (SOARES et al., 2006). Por outro lado, o uso desta
mesma papaína na obtenção de hidrolisados protéicos de farinha de arroz levou a uma
maior remoção de Phe (94,1%) do que a obtida com uma pancreatina (AB Enzymes,
81
Darmstadt, Alemanha, 69,1%) ou proteases de quatro diferentes microrganismos (76,67%,
em média) (VIEIRA et al., 2008). Da mesma maneira, a ação desta mesma papaína levou
a uma maior remoção de Phe de hidrolisados protéicos de feijão (81,5%), quando
comparada com a ação de proteases de cinco diferentes microrganismos (70,26%, em
média) (LOPESJR, 2008).
Não foram encontrados na literatura dados de outros autores comparando o efeito
do uso de diferentes enzimas na remoção de Phe de hidrolisados protéicos.
3.3.2 Efeito da relação enzima:substrato
Visando manter constantes os demais parâmetros, para se avaliar o efeito da
relação E:S sobre a remoção de Phe, foram comparados entre si os seguintes
hidrolisados: H8 (E:S = 1:100), H9 (E:S = 2:100) e H10 (E:S = 4:100). Observa-se na
Tabela I.4 que a vantagem da utilização de uma menor quantidade de enzima (menor
relação E:S) foi obtida ao se comparar E:S de 2:100 (63% de remoção) com 1:100 (81,3%
de remoção). O mesmo não ocorreu ao se comparar E:S de 4:100 com 2:100, uma vez
que os resultados obtidos foram praticamente os mesmos.
Em estudo realizado, anteriormente, no Laboratório de Bromatologia/Pesquisa,
utilizando o fubá de milho como matéria-prima (CAPOBIANGO et al., 2007), diversas
condições de hidrólise foram testadas, e os valores reportados foram bastante variados,
sendo que, em alguns casos, o emprego de uma menor relação E:S (1:100 e 2:100) levou
a uma remoção de Phe mais elevada (86,68% e 79,01%, respectivamente), como
aconteceu no presente trabalho ao se comparar 1:100 e 2:100. Entretanto, em outro
estudo deste mesmo laboratório (LOPES et al., 2008), observou-se que o emprego de
uma menor relação E:S não afetou a remoção de Phe de hidrolisados protéicos de arroz,
assim como ocorreu ao se comparar 2:100 com 4:100 no presente trabalho.
Não foram encontrados na literatura dados de outros autores comparando o efeito
do uso de diferentes relações E:S na remoção de Phe de hidrolisados protéicos.
O conjunto destes resultados demonstra que, apesar de se esperar, teoricamente,
que o emprego de uma maior relação E:S leve a um maior grau de hidrólise e,
conseqüentemente, a uma maior exposição de Phe e a um menor teor final de Phe, na
prática, esse procedimento é bem mais complexo do que o esperado e depende de outros
fatores, tais como tipo e atividade da enzima, tipo e concentração de substrato e pH.
82
3.3.3 Efeito da concentração da matéria-prima
A avaliação do efeito deste parâmetro pode ser feita comparando-se os hidrolisados
H11 (7%), H12 (8%), H13 (9%) e H8 (10%). Observa-se na Tabela I.4, que o emprego de
uma maior concentração da matéria-prima (10%) foi altamente favorável, uma vez que
obteve o hidrolisado com o maior percentual de remoção de Phe (81,3%). Entretanto, ao
se comparar os hidrolisados H11 (7%) e H12 (8%), observou-se que o emprego de uma
menor concentração da matéria-prima não teve efeito sobre o percentual de remoção de
Phe (62,7% e 62,3%, respectivamente), os quais não diferiram significativamente entre si.
Em estudo anterior, realizado no mesmo laboratório, avaliando-se a concentração
do extrato protéico do arroz sobre a remoção de Phe foi, também, observado que a
utilização de uma maior concentração da matéria-prima (3 g/100mL) foi favorável, pois
levou a 95% de remoção de Phe, ao passo que ao se usar 2 g/100 mL este percentual
caiu para 90% (LOPES, et al., 2008).
Entretanto, em outro trabalho também realizado neste laboratório avaliando-se a
concentração do extrato protéico do fubá de milho, observou-se que o emprego de um
maior valor (2 g/100 mL) foi prejudicial, uma vez que obteve-se percentual de remoção de
Phe (68,72%) bem inferior ao obtido com a concentração de 1 g/100mL, cujo valor obtido
foi de 97,31% (CAPOBIANGO, et al., 2007).
Estes resultados demonstram que o efeito da concentração da matéria-prima sobre
a remoção de Phe é mais complexo do que o esperado e pode estar associado a outros
parâmetros empregados no processo. Dessa forma, o aumento vantajoso da concentração
protéica poderia levar a resultados tanto positivos quanto negativos. Assim, se por um lado
contribuiria para aumentar a probabilidade da enzima entrar em contato com o substrato,
levando a uma maior exposição e remoção de Phe, por outro, uma maior quantidade de
proteínas poderia provocar uma sobrecarga na coluna de carvão, reduzindo,
conseqüentemente, a remoção de Phe.
Não foram encontrados na literatura dados de outros autores avaliando-se o efeito
da concentração da matéria-prima sobre a remoção de Phe de hidrolisados protéicos.
83
3.3.4 Efeito do tempo de reação
A avaliação deste efeito pode ser feita comparando-se os hidrolisados
14 (1h), H15 (2h), H16 (3h), H17 (4h) e H8 (5h). Os resultados apresentados na Tabela I.4
indicam que não foi observada a vantagem da utilização de um menor tempo de reação,
uma vez que uma hidrólise menos demorada levou a uma menor remoção de Phe. Na
verdade, quanto maior o tempo de reação, mais pronunciada foi a remoção de Phe, sendo
que o tempo de 5h foi muito mais vantajoso que os demais valores testados. Este
resultado está de acordo com que seria esperado teoricamente, uma vez que o emprego
de um maior tempo de reação deve ser capaz de promover uma hidrólise mais acentuada
das proteínas, elevando a exposição de Phe e facilitando a sua adsorção pelo carvão
ativado.
Não foram encontrados na literatura dados sobre o efeito do tempo de hidrólise na
eficiência da remoção de Phe.
4 CONCLUSÃO
Empregando-se várias proteases para a hidrólise das proteínas do concentrado
protéico do soro do leite, e o CA como meio adsorvente, foi possível obter hidrolisado
protéico com baixo teor de Phe (394,1 mg/100 g), que poderia ser utilizado em uma
quantidade de até 25,4 g/100g como ingrediente alimentar ou alimento na dieta de
fenilcetonúricos. O melhor resultado obtido foi aquele em que se utilizou a pancreatina na
relação E:S de 1:100, concentração da matéria-prima de 10% e tempo de reação de 5
horas, tendo atingido 81,3% de remoção de Phe.
84
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87
Capítulo II
GRAU DE HIDRÓLISE E PERFIL PEPTÍDICO DE HIDROLISADOS
ENZIMÁTICOS DO CONCENTRADO PROTÉICO DO SORO DO LEITE
RESUMO
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar hidrolisados enzimáticos de WPC
quanto ao grau de hidrólise e perfil peptídico. Foi avaliado o efeito dos seguintes
parâmetros: tipo de enzima (subtilisina; papaína; pancreatina; proteases do A. sojae, B.
amyloquefaciens, A. oryzae e B. stearothermophillus), relação E:S (1:100, 2:100 e 4:100) e
concentração da matéria-prima (7%, 8%, 9% e 10%). O grau de hidrólise foi obtido pela
relação entre os teores de nitrogênio α-aminado e total. A análise do perfil peptídico
envolveu o fracionamento dos hidrolisados por cromatografia líquida de alta eficiência de
exclusão molecular e, para a quantificação dos componentes das frações cromatográficas,
empregou-se o método rápido da Área Corrigida da Fração. Além disso, foi estudada a
correlação entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico, utilizando-se o coeficiente de
correlação de Pearson. Concluiu-se que a pancreatina e a protease do A. oryzae, ambas
na relação E:S de 1:100 e concentração da matéria-prima de 10%, levaram à obtenção
dos maiores valores de grau de hidrólise (30% e 27%, respectivamente). Em relação ao
perfil peptídico, a utilização da protease do A. oryzae e da pancreatina, na relação E:S de
1:100 e concentração da matéria-prima de 10% e 7%, respectivamente, foi a mais
vantajosa, do ponto de vista nutricional, uma vez que levou à obtenção do maior conteúdo
de di-tripeptídeos (16,14% e 9,12%, respectivamente) e do menor teor de grandes
peptídeos (média de 20%). Além disso, foi observada a existência de correlação de fraca
intensidade de associação entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico, tendo sido positiva
para as frações F2, F3 e F4 e negativa para a F1.
Palavras-chave: WPC; hidrolisados enzimáticos; grau de hidrólise; perfil peptídico;
correlação.
88
ABSTRACT
DEGREE OF HYDROLYSIS AND PEPTIDE PROFILE OF ENZYMATICHYDROLYSATES FROM WHEY PROTEIN CONCENTRATE. The present work aimed to
characterize enzymatic hydrolysates from whey protein concentrate by the degree of
hydrolysis and peptide profile. The effect of the following parameters was evaluated:
enzyme type (subtilisin; papain; pancreatin; proteases from A. sojae, B. amyloquefaciens,
A. oryzae, and B. stearothermophillus), enzyme:substrate ratio (1:100, 2:100 e 4:100) and
substrate concentration (7%, 8%, 9% e 10%). The degree of hydrolysis was obtained by
the ratio between α-amino and total nitrogen. The analysis of peptide profile involved the
fractionation of hydrolysates by high performance size-exclusion liquid chromatography
and the Rapid Correct Fraction Area method was used to quantify the chromatographic
fractions components. Moreover, the correlation between the degree of hydrolysis and
peptide profile was studied, using the Pearson correlation coefficient. It was concluded that
the pancreatin and the protease from A. oryzae, both in E:S ratio of 1:100 and substrate
concentrate of 10%, produced the best values for the degree of hydrolysis (30% and 27%,
respectively). In respect to peptide profile, the use of the protease from A. oryzae and
pancreatin, on the E:S ratio of 1:100 and substrate concentration of 10% and 7%,
respectively, was more advantageous, from the nutritional point of view, since it gave rise
to the highest di-tripeptide contents (16,14% and 9,12%, respectively) and the lowest level
of large peptides (20%, in average). Also, a correlation of low intensity association between
the degree of hydrolysis and peptide profile was observed, with positive values for F2, F3
and F4 fractions and negative for F1.
Key words: WPC; enzymatic hydrolysates; degree of hydrolysis; peptide profile;
correlation.
89
1 INTRODUÇÃO
O processo de clivagem das ligações peptídicas, originando peptídeos de
diferentes tamanhos e aminoácidos livres, é denominado de hidrólise protéica. Este
processo pode ser catalisado por ácidos, bases ou enzimas. Cada um apresenta aspectos
positivos e negativos, dependendo da sua utilização e dos objetivos a serem alcançados
(ADLER-NISSEN, 1981).
A hidrólise enzimática apresenta vantagens em relação ao tratamento químico, pois
possui alta especificidade, controle do grau de hidrólise, condições moderadas de ação,
disponibilidade comercial em larga escala, custo moderado, menor teor de sal no produto
final e formação mínima de subprodutos (MANNHEIM e CHERYAN, 1992; PEARCE,
1995; CLEMENTE, 2000).
O uso dietético dos hidrolisados protéicos deve levar em consideração o controle do
processo da reação de hidrólise e a caracterização dos hidrolisados com base no tamanho
dos peptídeos formados, pois, sabe-se que o comprimento da cadeia dos peptídeos
influencia sua taxa de absorção (VIJAYALAKSHIMI et al., 1986; GUADIX, et al., 2000).
Além disso, diversos trabalhos têm relatado que fórmulas contendo oligopeptídeos,
especialmente di-tripeptídeos, possuem maior valor nutricional do que uma mistura
equivalente de aminoácidos livres ou proteínas intactas (FRENHANI & BURINI, 1999;
BOZA et al., 2000).
Dentre as proteínas mais usadas em formulações especiais, contendo hidrolisados
protéicos, encontram-se a caseína e as proteínas do soro de leite e da soja. Outras fontes
podem ser empregadas, mas, por razões nutricionais, econômicas ou práticas, são menos
satisfatórias (LAHL & BRAUN, 1994).
O concentrado protéico do soro de leite (WPC - Whey protein concentrate) foi a
matéria-prima de escolha do presente trabalho, devido ao seu alto teor protéico de 35-
80%, e à presença de proteínas de alto valor biológico, sendo obtido a partir da separação
das proteínas do soro por membranas. Além disso, diversas aplicações importantes estão
associadas ao WPC, devido às excelentes propriedades funcionais destas proteínas,sendo um ingrediente amplamente utilizado na indústria de alimentos em uma grande
90
variedade de produtos como cárneos, bebidas, produtos de padaria e formulações infantis
(KINSELLA & WHITEHEAD, 1989; BRANS et al., 2004).
A extensão da proteólise pode ser avaliada pelo grau de hidrólise (GH), referente ao
percentual de clivagem das ligações peptídicas de uma proteína. A avaliação do GH
depende de três princípios básicos: do teor de nitrogênio liberado pela hidrólise da
proteína, na presença de um agente precipitante; da determinação de grupos amino livres
e da titulação de prótons liberados (WANG, et al., 2007). Dessa forma, diversos métodos
são utilizados para a quantificação do GH, como por exemplo, através da determinação do
teor de nitrogênio liberado durante a hidrólise, solúvel na presença de um agente
precipitante (como o ácido tricloroacético). Outros métodos incluem o de Kjeldahl (AOAC,
1995), a determinação em espectrofotometria na região do visível após reação
colorimétrica, por exemplo, pela reação de biureto (HUNG, VAS, CHEKE & BOLCSI, 1984)
ou, ainda, pelo uso de compostos que reagem especificamente com grupos amino, como
ácido trinitrobenzenosulfônico (TNBS).
Em relação ao perfil peptídico de hidrolisados protéicos, SILVESTRE et al. (1994a)
desenvolveram um método baseado no fracionamento dos peptídeos por cromatografia
líquida de alta eficiência de exclusão molecular (SE-HPLC), que lhes possibilitou separar e
quantificar peptídeos com massas moleculares menores do que 1000Da. Este método foi,
posteriormente, utilizado em estudos realizados no mesmo laboratório do presente
trabalho, para caracterizar o perfil peptídico de hidrolisados protéicos de diversas fontes
protéicas, tais como concentrado protéico do soro do leite (AFONSO, 2008), soro de leite
(DE MARCO et al., 2005; DELVIVO et al., 2006; BIASUTTI et al., 2007; SILVA et al.,
2007), caseína (MORATO et al., 2000; BARBOSA et al., 2004; CARREIRA et al., 2004;
MORAIS et al., 2005), leite (LOPES et al., 2005; SOARES et al., 2006) e arroz (BIZZOTTO
et al., 2006).
O objetivo do presente trabalho consistiu em caracterizar hidrolisados enzimáticos
do concentrado protéico do soro do leite (WPC), em relação ao grau de hidrólise e perfil
peptídico, avaliando-se o efeito do tipo de enzima, relação E:S e concentração da matéria-
prima. Além disso, considerando que não foi encontrado na literatura qualquer relato
abordando a correlação entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico, este tema foi,
igualmente, aqui estudado.
91
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MATERIAL
O concentrado protéico do soro do leite (Whey Protein Concentrate - WPC) na
forma de pó (Kerrylac 750) foi gentilmente doado pela Kerry do Brasil Ltda (Três
Corações, MG, Brasil). A papaína (Corolase® L10) foi comprada da AB Enzymes
(Darmstadt, Alemanha). As demais proteases foram gentilmente doadas pela Prozyn (São
Paulo, Brasil) (B. subtillis - Protemax N200 e B. subtillis - Protezyn L) e pela AB Enzymes
(B. stearotothermophilus - Corolase® TS, pancreatina - Corolase® PP, A. sojae -
Corolase® LAP; A. oryzae - Flavourzyme e B. amyloquefaciens - Protemax N411).
Algumas características destas enzimas estão apresentadas na Tabela II.1. Os
aminoácidos L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, EUA). O carvão ativado (granulado n° 119, 20 x 50 mesh, 12 x 25 mesh, 6 x 12
mesh série Tyler) foi adquirido da Carbomafra S.A. (Curitiba, PR, Brasil). Um agitador
magnético (Fisatom, modelo 752A) com temperatura controlada e agitação constante foi
utilizado para homogeneizar a mistura. Um liofilizador (Freeze Dry System/FreeZone 4,5,
model 77500, LABCONCO) foi usado para secar as amostras. O sistema de cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC), usado no fracionamento dos hidrolisados protéicos era
constituído por uma coluna cromatográfica PHEA [poli-(2-hidroxietil-aspartamida)-sílica],
250 x 9,4 mm, 5 µm e 200 Å (PolylC, Columbia, MD, USA), uma bomba isocrática e um
detector espectrofotométrico UV-VIS (série HP1100, Waldbronn, Alemanha), acoplado a
um computador com software (HPchemstation, Avondale, USA). A água usada no
cromatógrafo foi purificada em Sistema de Purificação (Áries Vaponics, Rockland, USA).
Todos os reagentes utilizados eram de grau analítico.
92
100 X(NT) total nitrogênio
(NA) aminado-α nitrogênio %GH =
2.2 MÉTODOS
2.2.1 Preparo dos hidrolisados protéicos
Foram preparados 12 hidrolisados do concentrado protéico do soro do leite (WPC),
tendo sido variados os seguintes parâmetros: pH, tipo de enzima, relação enzima:
substrato (E:S) e concentração da matéria-prima. Estes hidrolisados com seus respectivos
parâmetros de hidrólise estão representados na Tabela II.2.
Para a obtenção dos hidrolisados, um volume de 100 mL de solução aquosa do
WPC a 10% (p/v) foi, inicialmente, colocado em um erlenmeyer e o pH foi ajustado a um
valor compreendido na faixa ótima apresentada nas fichas técnicas de cada enzima,
disponibilizadas pelos fornecedores. Em seguida, a temperatura foi estabilizada também
de acordo com as especificações técnicas dos fornecedores, e as enzimas foram
adicionadas para se obter a relação E:S desejada. Após 5 horas, o processo foi
interrompido por aquecimento em banho-maria a 75ºC, por 15 segundos, a fim de inativar
a enzima, confirmado pela medida da atividade da enzima, antes e após tratamento
enzimático, pelo método de DIAS et al., 2008, sem adição de caseína.
2.2.2 Determinação do Grau de Hidrólise (GH)
O grau de hidrólise (GH) é definido como a porcentagem de grupamentos amino
que são liberados no rompimento da molécula protéica pela ação de enzimas. Neste caso,
o GH foi calculado por meio da relação entre o nitrogênio α-aminado (NA) e o nitrogênio
total (NT) de acordo com a equação 1.
(1)
Para a determinação do NA utilizou-se o método de Sorensen (AOAC, 1995)
baseado na titulação com formol. Dessa forma, um volume de 5 mL da amostra foi
adicionado a um mesmo volume de solução de formaldeído-fenolftaleína. Após ajuste do
pH para 7,0, usando uma solução de NaOH a 0,2 mol/L, a amostra foi titulada com esta
93
mesma solução até viragem de cor, sendo, em seguida, adicionado um excesso,
equivalente ao volume titulado, dessa mesma solução. Por fim, fez-se uma retro-titulação
com uma solução de HCL a 0,2 mol/L. O NT foi determinado pelo método de Kjeldahl,
utilizando-se 6,38 como fator de conversão de nitrogênio total para proteína total (AOAC,
1995).
2.2.3 Caracterização do perfil peptídico dos hidrolisados de WPC
A caracterização do perfil peptídico foi realizada em duas etapas: fracionamento
dos peptídeos de acordo com o tamanho da cadeia, e sua posterior quantificação.
O fracionamento dos peptídeos foi realizado por cromatografia líquida de alta
eficiência de exclusão molecular (SE-HPLC) em coluna PHEA, conforme descrito por
SILVESTRE et al., (1994a). As amostras foram dissolvidas em uma concentração de
1g% (p/v) na fase móvel (ácido fórmico a 0,05 mol/L, pH 2,5) e submetidas à
cromatografia à temperatura ambiente, sob condições isocráticas, a um fluxo de
0,5 mL/ min, durante 35 min, sendo que o volume injetado foi de 30µL. A fase móvel foi
filtrada, através de membrana de 0,45 µm, e desgaseificada imediatamente antes do uso.
As frações foram separadas de acordo com o tempo de eluição, sendo F1, de 11,5 a 16,0
min; F2, de 16,0 a 19,5 min; F3, de 19,5 a 20,5 min; e F4, de 20,5 a 32,0 min.
O método rápido da Área Corrigida da Fração (ACF), desenvolvido por SILVESTRE
et al., (1994b), foi utilizado para quantificar os peptídeos e aminoácidos livres presentes
nos hidrolisados do WPC. Após a multidetecção das frações a 230, 280 e 300 nm, para se
eliminar a interferência da absorção dos aminoácidos aromáticos, calcula-se a ACF. Esta,
por sua vez, é levada a uma curva padrão, para se encontrar a quantidade de peptídeos
de cada fração, preparada como descrito em outros trabalhos realizados no mesmo
laboratório em que o presente estudo foi desenvolvido (SILVESTRE et al., 1994b;
MORATO et al., 2000; LOPES et al., 2005).
2.2.4 Análise estatística
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casual com 12
hidrolisados em 3 repetições, e as análises realizadas em triplicata. Os dados foram
submetidos à análise de variância (ANOVA) e, para a avaliação das diferenças entre as
94
médias dos percentuais de grau de hidrólise e dos teores de peptídeos e aminoácidos
livres dos hidrolisados do WPC, foi utilizado o Teste de Duncan (p ≤ 0,05) (PIMENTEL-
GOMES, 2000). O teste t-Student foi utilizado para as análises descritivas referentes ao
grau de hidrólise, aos teores de peptídeos das frações cromatográficas e ao valor de “p”. A
correlação entre as variáveis grau de hidrólise e perfil peptídico foi obtida pelo coeficiente
de correlação de Pearson (r), que mede o grau de associação entre duas variáveis.
Tabela II.1- Características das proteases utilizadas para o preparo doshidrolisados protéicos.
EstabilidadeGrupo
Nomecomercial
OrigemAtividade
enzimática5
(U/mL) pH T (ºC)
Metaloprotease Corolase® TS2 Bacillus
stearothermophilus 44,13 7<pH<8 60<T<80
Serino eMetalo
proteaseCorolase® PP2 Pancreatina 34,71 7<pH<9 45<T<55
CisteínoProtease
Corolase®L102 Carica papaya 31,56 3<pH<9 50<T<70
Metaloprotease
Corolase®LAP2 Aspergillus sojae 63,19 3<pH<9 50<T<70
Metaloprotease Flavourzyme®1 Aspergillus oryzae 512,43 6<pH<9 50<T<70
Serinoprotease
ProtemaxN4111
Bacillusamyloquefaciens 53,00 7<pH<7,5 55
Serinoprotease
Protemax ®N2001 Bacillus subtilis 20,19 4,5<pH<7 50<T<55
Serinoprotease Protezyn® L1 Bacillus subtilis 29,83 9 55
Fonte: 2PROZYN (2005); 2, 3, 4AB ENZYME (2001, 2002, 2003); 5Valor determinado no presentetrabalho de acordo com a metodologia de Dias et al., (2008).
2 PROZYN. Especificações técnicas de enzimas. s.n., 2005. 2p;2AB ENZYMES. Corolase® PP, Corolase® 7089, Corolase® LAP, Corolase® N: Description and Specification. Rev.Nr. 02. 2001, 8p;3AB ENZYMES. Corolase® TS: Description and Specification. Rev. Nr. 00. 2002, 2p;4AB ENZYMES. Corolase® L10: Description and Specification. Rev. Nr. 03. 2003, 2p.5CALIK et al., (2002). Enzyme and Microbial Technol., 31, pp. 685-697; KUMAR, C.G. (2002). Lettrers in AppliedMicrobiology, 34, pp. 13-17.
95
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 GRAU DE HIDRÓLISE
Os resultados do GH dos hidrolisados enzimáticos do WPC estão representados na
Tabela II.3. Observa-se que o grau de hidrólise apresentou uma ampla faixa de valores,
indo de 2,5% para o hidrolisado preparado com a protease do A. sojae a 30% para o
hidrolisado preparado com a pancreatina, o que se explica pela variedade de parâmetros
utilizados no preparo dos hidrolisados enzimáticos do WPC. Ressalta-se, ainda, que o
hidrolisado preparado com a pancreatina (H7) apresentou o maior grau de hidrólise (30%),
sendo esta enzima a escolhida para o estudo do efeito dos parâmetros (relação E:S e
concentração da matéria-prima) sobre o grau de hidrólise e o perfil peptídico dos
hidrolisados enzimáticos do WPC.
Tabela II.2 - Parâmetros empregados no preparo dos hidrolisados protéicos deconcentrado protéico do soro do leite (WPC).
WPC =Concentrado protéico do soro do leite; E:S = relação enzima:substrato
Hidrolisados Enzima(Tipo / Nome comercial)
pH Temperatura(ºC)
E:S WPC(p/v)
H1 B.subtillis (Protezyn L) 9 55 1:100 10%
H2 A. sojae (Corolase LAP) 9 55 1:100 10%
H3 Papaína (Corolase L10) 7 55 1:100 10%
H4 B. amyloquefaciens (Protemax N411) 7 55 1:100 10%
H5 A.oryzae (Flavourzyme) 7 50 1:100 10%
H6 B. stearothermophilus (Corolase TS) 8 60 1:100 10%
H7 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 10%
H8 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 2:100 10%
H9 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 4:100 10%
H10 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 7%
H11 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 8%
H12 Pancreatina (Corolase PP) 7 50 1:100 9%
96
3.2 PERFIL PEPTÍDICO DOS HIDROLISADOS PROTÉICOS DE WPC
A técnica de SE-HPLC, utilizada no presente trabalho, foi eficiente na
caracterização de hidrolisados protéicos, especialmente com relação ao fracionamento de
peptídeos de baixas massas moleculares, ou seja, inferiores a 1000Da. Assim, os
hidrolisados protéicos foram separados em quatro frações (F1, F2, F3 e F4), conforme
descrito anteriormente em diversos trabalhos realizados no mesmo laboratório do presente
estudo (SILVESTRE et al., 1994b, MORATO et al., 2000, CARREIRA et al., 2004; LOPES
et al., 2005; MORAIS et al., 2005; DELVIVO et al., 2006; DE MARCO et al., 2005;
SOARES et al., 2006 SILVA et al., 2007). A fração F1 corresponde aos peptídeos com
mais de 7 resíduos de aminoácidos, a fração F2 aos peptídeos médios contendo de 4 a 7
resíduos de aminoácidos, a fração F3 contém os di- e tripeptídeos e a fração F4 os
aminoácidos livres. A título de exemplo, o perfil cromatográfico do hidrolisado H1, a
230nm, está apresentado na Figura II.1.
Tabela II.3- Grau de hidrólise dos hidrolisados protéicos de WPC.
Hidrolisados Grau de Hidrólise(%)
H1 20b,c
H2 2,5e
H3 15d
H4 14d
H5 27ª
H6 17d
H7 30ª
H8 23b
H9 15d
H10 19b,c
H11 17d
H12 17c,d
WPC=Concentrado protéico do soro do leite; GH (%)= percentual de grau dehidrólise, ou seja, percentual de clivagem das ligações peptídicas dos hidrolisadosdo WPC. Médias seguidas por letras distintas diferem entre si pelo teste de Duncana 5% de probabilidade.
97
3.2.1 Teor de peptídeos e aminoácidos livres dos hidrolisados de WPC
Observa-se na Tabela II.4, uma significativa variação do perfil peptídico entre os
diferentes hidrolisados enzimáticos do WPC. Para a escolha do hidrolisado que
apresentou o melhor perfil peptídico, do ponto de vista nutricional, as ponderações de
alguns autores devem ser consideradas. Assim, segundo FRENHANI & BURINI (1999),
durante o metabolismo de proteínas, o primeiro estágio de hidrólise leva à formação de
oligopeptídeos contendo de 2 a 6 resíduos de aminoácidos e aminoácidos livres. Estes
peptídeos são, então, quebrados em di- e tripeptídeos e, finalmente, as proteínas são
absorvidas na forma de di- e tripeptídeos e de aminoácidos livres. Ainda, de acordo com
estes mesmos autores os di- e tripeptídeos são mais eficientemente absorvidos que os
aminoácidos livres, os quais, por sua vez, são melhores que os tetra- ou peptídeos
superiores. Em quantidades equivalentes de di- e tripeptídeos e misturas de aminoácidos
livres, os di- e tripeptídeos apresentam velocidade de absorção aproximadamente 10
vezes maior. GONZÁLEZ-TELLO et al., (1994) também relataram as vantagens dos di- e
tripeptídeos sobre os aminoácidos livres por apresentarem maior velocidade de absorção.
Figura II.1 - Perfil cromatográfico do hidrolisado H1 a 230 nm.
Coluna: PHEA em equipamento HPLC; fase móvel: ácido fórmico a 0,05 mol/L. F1: grandes peptídeos (> 7resíduos de aminoácidos); F2: médios peptídeos (4 a 7 resíduos de aminoáciods); F3: di- e tripeptídeos; F4:aminoácidos livres. Y = pico da tirosina, W = pico do triptofano. Hidrolisado H1: substrato a 10%; tempo dehidrólise = 5h; relação E:S = 1%.
98
Desta maneira, conclui-se que, do ponto de vista nutricional, os melhores perfis
peptídicos foram obtidos para os hidrolisados H5 e H10, uma vez que apresentaram os
menores teores de grandes peptídeos (média de 20%) e os maiores de di-tripeptídeos
(16,14% e 9,12%, respectivamente). Além disso, ressalta-se a semelhança entre os perfis
peptídicos destes dois hidrolisados, já que não houve diferença significativa com relação
aos teores de grandes peptídeos e, além disso, embora o teor de di-tripeptídeos do H5
(16,14%) tenha sido superior ao do H10 (9,12%), o oposto foi observado com relação à
quantidade de aminoácidos livres (18,43% para H5 e 38,04% para H10). Por outro lado,
deve-se ressaltar uma ligeira superioridade de H5 sobre H10 com relação ao teor de
oligopeptídeos (F2+F3), que foi de 62,38% e 40,61%, respectivamente, o que daria a H5
uma certa vantagem sobre H10, do ponto de vista nutricional.
Considerando que não foram encontrados na literatura estudos de outros autores
sobre o perfil peptídico de hidrolisados enzimáticos de WPC ou soro de leite, os resultados
do presente trabalho foram comparados com os obtidos, anteriormente, no mesmo
laboratório para estas duas fontes protéicas. Assim, ao se utilizar a mesma pancreatina do
presente trabalho, mas para hidrolisar o soro de leite, o resultado obtido para o perfil
peptídico foi inferior ao do H5 aqui encontrado, com relação ao menor teor de di-
tripeptídeos (10,45%) e maior de grandes peptídeos (23,34%). Por outro lado, este
tratamento produziu uma maior quantidade de aminoácidos livres (36,97%) do que a
obtida no presente trabalho para o H5 (SOUZA et al., 2008).
O efeito da ação de uma subtilisina (Protemax N200, Prozyn, São Paulo, SP) na
hidrólise das proteínas do soro do leite foi, igualmente, testado, sendo observado que o
melhor resultado obtido para o perfil peptídico foi inferior ao resultado do H5 do presente
trabalho, uma vez que apresentou um maior teor de grandes peptídeos (43,21%), e menor
conteúdo de di-tripeptídeos (10,89%) e de aminoácidos livres (15,37%) (SOUZA et al.,
2008).
A ação desta mesma subtilisina sobre o perfil peptídico de hidrolisados do WPC foi,
igualmente, estudada neste mesmo laboratório. Neste caso, o melhor perfil peptídico
obtido foi, também inferior ao H5 em termos de di-tripeptídeos (13,43%). Por outro lado,
apresentou vantagens quanto aos teores de aminoácidos livres (45,56%) e de grandes
peptídeos (12,28%). Em outro estudo, utilizou-se a mesma pancreatina do presente
trabalho para hidrolisar as proteínas do WPC, porém em condições diferentes de reação.
Apesar de ter sido encontrado um teor de di-tripeptídeos inferior (12,11%, em média), o
99
conteúdo de aminoácidos livres foi superior (49,06%, em média) e o de grandes peptídeos
inferior (12,8%, em média), quando comparado com os resultados do H5 do presente
trabalho (AFONSO, 2008).
3.3 EFEITO DOS PARÂMETROS HIDROLÍTICOS SOBRE O GRAU DE HIDRÓLISE EPERFIL PEPTÍDICO
O efeito do tipo de enzima foi avaliado com o intuito de se obter o hidrolisado com o
maior percentual de grau de hidrólise e o melhor perfil peptídico. Os demais parâmetros –
relação enzima:substrato (E:S) e concentração da matéria-prima (p/v) - foram analisados
levando-se, igualmente, em consideração a redução dos custos do processo paa
adaptação em larga escala. Assim, o emprego de uma menor relação E:S está associado
à utilização de menor quantidade de enzima necessária para hidrólise e a utilização de
uma maior concentração da matéria-prima, facilita posterior processo de secagem na
obtenção do produto final.
3.3.1 Efeito de diferentes enzimas
Para a avaliação do efeito da utilização das diferentes enzimas no preparo dos
hidrolisados do WPC sobre o grau de hidrólise e perfil peptídico, foram comparados os
hidrolisados de H1 até H7.
Observa-se na Tabela II.3 que a pancreatina e a protease do A. oryzae levaram à
obtenção dos hidrolisados com os maiores valores de grau de hidrólise (H7-30% e
H5-27%, respectivamente). No caso da pancreatina, este resultado poderia ser explicado
pelo fato de que trata-se de um complexo enzimático que apresenta tanto endopeptidases
(tripsina, quimiotripsina) como exopeptidases (carboxipeptidase A e B) sendo, portanto,
capaz de hidrolisar ligações peptídicas tanto no interior quanto nas porções N- ou C-
terminais da cadeia peptídica. Quanto à protease do A. oryzae, a sua maior eficiência na
hidrólise das proteínas, poderia estar associada ao fato de que esta enzima é a que possui
a maior atividade enzimática, dentre todas as testadas (Tabela II.1).
100
Tabela II.4 – Teor de peptídeos e de aminoácidos livres nas frações cromatográficas doshidrolisados do concentrado protéico do soro de leite.
HidrolisadosF1
(>7 resíduos de AA)
F2(4-7 resíduos de AA)
F3(di-tripeptídeos)
F4(AA livres)
H1 72,25b/1 24,23d/2 2,81d/3 0,70g/4
H2 75,77b/1 12,95e,f/2 2,56d/4 8,72f/3
H3 24,42f/2 34,41b/1 6,29c/3 34,87b/1
H4 46,46d/1 29,56c/2 3,51d/4 20,47c,d/3
H5 18,76g,h/2 46,66a/1 16,14a/2 18,43d/2
H6 34,37e/1 38,21b/1 9,79b/3 17,62d,e/2
H7 15,75h/3 22,29d,e/2 6,51c/4 55,43a/1
H8 53,99c/1 19,39e,f/3 2,76d/4 23,86c/2
H9 80,64a/1 9,81f/2 5,75c/3 3,80g/4
H10 21,35f,g/3 31,49c/2 9,12b/4 38,04b/1
H11 24,20f/2 33,23b/1 5,37c/3 37,17b/1
H12 52,27c/1 27,10c,d/2 5,14c/4 15,47e/3
AA: aminoácidos.Todos os valores são apresentados em % nmols das quatro frações. Os resultados representam amédia das triplicatas. Médias indicadas por números iguais não diferem entre si a 5% de significância na comparação dediferentes frações de um mesmo hidrolisado (linha). Médias indicadas por letras iguais não diferem entre si a 5% designificância na comparação de uma mesma fração para diferentes hidrolisados (coluna).
Com relação ao perfil peptídico, observa-se na Tabela II.4 que o emprego de
diferentes enzimas afetou de forma variada o perfil peptídico dos hidrolisados de WPC,
sendo que o melhor resultado foi obtido pela ação da protease do A. oryzae (H5),
enquanto as enzimas do B. subtillis (H1) e do A. sojae (H2) produziram os perfis
peptídicos mais desfavoráveis do ponto de vista nutricional.
Nenhum relato foi encontrado na literatura abordando o efeito da utilização de
diferentes enzimas sobre o grau de hidrólise de hidrolisados protéicos. Com relação ao
efeito deste parâmetro sobre o perfil peptídico, não foram encontrados na literatura
estudos de outros autores. Portanto, os resultados aqui obtidos foram comparados com os
encontrados, anteriormente, no mesmo laboratório para o soro de leite e o WPC.
101
Assim, o estudo da ação isolada de três enzimas, papaína (Biobrás, Montes Claros,
MG), protease de A. sojae (Sigma, St. Louis, MO, USA) e pepsina (Sigma, St. Louis, MO,
USA) sobre o perfil peptídico de hidrolisados protéicos de leite desnatado, revelou que a
papaína deu origem ao melhor perfil peptídico apresentando teores de 25,6%, 19,9% e
25,7% para os grandes peptídeos, di- e tripeptídeos e aminoácidos livres, respectivamente
(SOARES et al., 2007).
O efeito da utilização de uma papaína (P-1500, Sigma, St. Louis, MO, USA) e de
uma pancreatina (Sigma, St. Louis, MO, USA), imobilizadas em carvão ativado e alumina,
sobre o perfil peptídico de hidrolisados enzimáticos do soro do leite foi também avaliado.
Observou-se que a ação da pancreatina foi favorável à obtenção do hidrolisado com o
maior teor de di- e tripeptídeos (17%). Entretanto, a papaína apresentou o maior conteúdo
de aminoácidos livres (34%) e menor quantidade de grandes peptídeos (45%) (SILVA, et
al., 2007).
No caso de se utilizar, separadamente, a mesma pancreatina do presente trabalho,
e uma subtilisina (Protemax N200, Prozyn, São Paulo, SP), para hidrolisar as proteínas do
soro do leite, o resultado encontrado para o melhor perfil peptídico foi obtido pela
pancreatina, tendo apresentado teores de 22,98%, 9,77% e 40,91% para grandes
peptídeos, di- e tripeptídeos e aminoácidos livres, respectivamente (SOUZA et al., 2008).
Estas mesmas enzimas citadas acima foram, igualmente, empregadas para
hidrolisar o concentrado protéico do soro do leite (WPC), tendo sido observado que os
teores de di- e tripeptídeos originados da ação das duas enzimas (13,34% para subtilisina
e 12,11 %, em média, para a pancreatina) foram estatisticamente iguais e os de
aminoácidos livres (45,56 % para subtilisina e 49,06 %, em média, para a pancreatina) e
de grandes peptídeos (12,28% para subtilisina e 12,80%, em média, para a pancreatina),
situaram-se muito próximos, apesar de serem estatisticamente diferentes (AFONSO,
2008).
3.3.2 Efeito da relação E:S e concentração da matéria-prima
A influência da relação E:S sobre o grau de hidrólise e o perfil peptídico dos
hidrolisados enzimáticos do WPC, pode ser avaliada comparando-se os hidrolisados H7,
H8 e H9, para os quais empregou-se a pancreatina nas relações E:S de 1:100, 2:100 e
102
4:100, respectivamente. Observa-se na Tabela II.3 que o emprego de uma menor relação
E:S (1:100; H7) levou à obtenção do hidrolisado com o maior grau de hidrólise (30%).
No que se refere ao efeito da relação E:S sobre o perfil peptídico, observa-se na
Tabela II.4, que a utilização da menor relação E:S (1:100) foi benéfica pois, quando
comparada com 2:100, levou à obtenção de uma menor quantidade de grandes peptídeos,
maior de di- e tripeptídeos e de aminoácidos livres. Ainda, com relação ao valor de 4:100,
esta vantagem não foi observada apenas para os teores de di- e tripeptídeos, os quais não
diferiram significativamente entre si.
Uma provável explicação para estes resultados poderia estar relacionada à autólise
enzimática, uma vez que a enzima pode conter em sua estrutura ligações peptídicas
compatíveis com sua especificidade. Este fenômeno sofre influência de fatores físico-
químicos, tais como a concentração da enzima que, quando elevada, favorece a autólise
em detrimento da hidrólise (FORTES-DIAS & ROGANA, 1986).
Para analisar o efeito da concentração inicial do WPC, sobre o grau de hidrólise e
perfil peptídico, devem ser comparados os hidrolisados H10, H11, H12 e H7, para os quais
foram utilizados valores de 7%, 8%, 9% e 10%, respectivamente. Como observado na
Tabela II.3, pode-se dizer que, como esperado teoricamente, o emprego de uma maior
concentração da matéria-prima, ou seja, do substrato, embora não tenha sido de forma
linear, levou a um maior GH, uma vez que passando-se de uma concentração de 7% para
10%, o GH variou de 19% para 30%. Neste caso, não deve ter sido ultrapassado o ponto
de saturação dos sítios ativos da enzima, e, portanto, uma maior quantidade de substrato
levou, conseqüentemente, a uma maior formação de produto.
Resultado semelhante foi obtido para o efeito da concentração da matéria-prima
sobre o perfil peptídico, já que comparando-se os valores encontrados ao se utilizar 7% e
10% de WPC, observa-se uma hidrólise enzimática relativamente mais pronunciada. Isto
ocorre com relação aos teores de grandes peptídeos e de aminoácidos livres, para os
quais foram observados uma redução e uma elevação, respectivamente. Por outro lado, o
emprego de uma maior concentração do substrato (10%) produziu menor teor de di- e
tripeptídeos.
Este estudo revelou, ainda, um certo paralelismo entre os resultados obtidos para o
GH e o perfil peptídico. Assim, em linhas gerais, quanto maior foi o GH mais elevados
foram os teores de peptídeos de cadeias média e curta (di-tripeptídeos) e de aminoácidos
livres, enquanto que os teores de grandes peptídeos caminharam no sentido contrário.
103
Estes resultados se devem, provavelmente, ao fato de que o método empregado para a
avaliação do GH baseia-se na medida da quantidade de grupamentos amino liberados no
meio da reação. Assim sendo, este valor será tanto mais elevado quanto maior for a
quantidade de peptídeos de cadeias média e curta ou de aminoácidos livres encontrados.
Não foi encontrado qualquer relato na literatura abordando o efeito da relação E:S e
da concentração da matéria-prima sobre o grau de hidrólise de hidrolisados protéicos.
Com relação ao efeito destes parâmetros sobre o perfil peptídico, nenhuma publicação de
outros autores foi encontrada. Desta maneira, os resultados aqui obtidos foram
comparados com os encontrados, anteriormente, no mesmo laboratório para a hidrólise do
soro do leite e do WPC. Para estas duas matérias-primas, foram utilizadas as mesmas
enzimas do presente trabalho (subtilisina e pancreatina) e, para cada enzima, foram
testados os efeitos da relação E:S (1:100, 2:100 e 4:100) e da concentração da matéria-
prima (10% e 15%) sobre o perfil peptídico.
No caso de se utilizar o soro de leite e a subtilisina, foi observado que, ao contrário
do presente trabalho, não foram encontradas diferenças entre os perfis peptídicos obtidos
com uma relação E:S de 1:100 e 2:100 e, ainda, este menor valor de E:S levou a um perfil
peptídico inferior ao obtido com uma E:S de 4:100. Observou-se, também, que ao se
utilizar a concentração mais elevada de substrato (15%), os resultados obtidos para as 3
frações foram semelhantes aos encontrados no presente trabalho, uma vez que houve
uma elevação dos teores de grandes peptídeos e de aminoácidos livres e uma redução na
quantidade de di-tripeptídeos, quando comparados com a concentração de 10% (SOUZA
et al., 2008).
Ao se utilizar a pancreatina para hidrolisar o soro do leite, observou-se que com o
uso da menor relação E:S (1:100) obteve-se resultado semelhante ao do presente trabalho
apenas para os di-tripeptídeos, cujos teores apresentaram uma elevação. Entretanto, este
tratamento produziu uma maior quantidade de grandes peptídeos e menor conteúdo de
aminoácidos livres, sendo estes resultados o oposto ao obtido no presente trabalho. Com
relação à concentração da matéria-prima, observou-se que a utilização do maior valor
(15%), diferentemente do presente trabalho, não alterou o teor de grandes peptídeos e,
ainda, reduziu a quantidade de aminoácidos livres. Por outro lado, da mesma maneira
como aqui observado, os teores de di-tripeptídeos sofreram uma redução (SOUZA et al.,
2008).
104
Em outro estudo, utilizando uma subtilisina para hidrolisar as proteínas do WPC,
observou-se que o emprego da menor relação E:S (1:100) produziu resultados opostos
aos do presente trabalho, referentes a todas as três frações, uma vez que obteve-se um
maior teor de grandes peptídeos, e menor conteúdo de di- e tripeptídeos e aminoácidos
livres. Ao se avaliar o efeito da concentração da matéria-prima, foi observado que o uso de
maior valor (15%) levou a resultados diferentes aos do presente trabalho, uma vez que
não houve alteração dos teores de grandes peptídeos e de di- e tripeptídeos, enquanto
que a quantidade de aminoácidos livres foi reduzida (AFONSO et al., 2008).
Ao se utilizar a pancreatina para hidrolisar as proteínas do WPC, observou-se que o
emprego da menor relação E:S (1:100), levou a resultados semelhantes aos do presente
trabalho, uma vez que reduziu o teor de grandes peptídeos e elevou os conteúdos de di- e
tripeptídeos e aminoácidos livres. Com relação ao efeito da concentração do substrato, a
única semelhança observada referente ao presente trabalho está associada à redução dos
teores de di- e tripeptídeos. Para as outras duas frações, os resultados obtidos foram os
opostos aos aqui encontrados, uma vez que obteve-se uma elevação dos teores de
grandes peptídeos e uma queda dos aminoácidos livres (AFONSO, et al., 2008).
3.4 CORRELAÇÃO ENTRE PERFIL PEPTÍDICO E GRAU DE HIDRÓLISE
Estão apresentados na Tabela II.5 os dados referentes à correlação entre o grau de
hidrólise e as frações peptídicas e de aminoácidos livres dos hidrolisados enzimáticos do
WPC. Pode-se observar que existe correlação (p< 0,05) entre o grau de hidrólise e os
teores de peptídeos e aminoácidos livres obtidos para os hidrolisados do WPC, entretanto,
observa-se que esta correlação (r) apresentou fraca intensidade de associação, pois todos
os valores apresentados encontram-se abaixo de 0,7, de acordo com o estabelecido por
SAMPAIO (2002). A intensidade de associação entre as variáveis (grau de hidrólise e
perfil peptídico), em termos absolutos, foi mais forte para a fração F1 (-0,523), o que
poderia ser explicado, provavelmente, pelo menor desvio da linearidade observado ao se
analisar esta correlação. Ressalta-se, ainda, que as frações F2, F3 e F4 apresentaram
correlação positiva com o GH, enquanto que para a F1 foi negativa, conforme esperado,
uma vez que com o aumento da taxa de hidrólise das proteínas do WPC, ocorre uma
105
diminuição do teor de grandes peptídeos e um aumento da quantidade de peptídeos
menores e de aminoácidos livres.
Tabela II.5- Correlação entre o grau de hidrólise e o perfil peptídico dos hidrolisadosenzimáticos do WPC.
Variáveis r p
GH com F1 -0.523 0.001
GH com F2 0.335 0.0455
GH com F3 0.452 0.0056
GH com F4 0.434 0.0081
r: correlação; p:determinado pelo teste t-Student com diferenças significativas para p< 0,05; GH: Grau dehidrólise; Frações cromatográficas: F1: grandes peptídeos; F2: Peptídeos médios; F3:di-tripeptídeo; F4:aminoácidos livres.
Para as demais frações, a correlação foi positiva, ou seja, uma maior taxa de
hidrólise elevou os teores de peptídeos e de aminoácidos livres, ou seja, reduziu o
tamanho das moléculas como era, igualmente, esperado. Além disso, é importante
ressaltar o resultado obtido para fração F3, que apresentou associação relativamente forte
com o grau de hidrólise (r= 0,452), uma vez que os di-tripeptídeos são, preferencialmente,
absorvidos pelo trato gastrointestinal, quando comparados aos aminoácidos livres e
grandes peptídeos (FRENHANI & BURINI, 1999).
4 CONCLUSÃO
O emprego da pancreatina e da protease do A. oryzae levaram à obtenção de
hidrolisados protéicos que apresentaram o maior grau de hidrólise (30% e 27%,
respectivamente) e os teores mais elevados de di- e tripeptídeos (9,12% e 16,14%,
respectivamente). Estes resultados foram obtidos com uma relação E:S de 1:100 para
106
ambas as enzimas, e valores de 7% e 10%, respectivamente, para a concentração da
matéria-prima. Além disso, o grau de hidrólise apresentou correlação com o perfil
peptídico, com fraca intensidade de associação (0,7).
107
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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110
CONCLUSÕES INTEGRADAS E PERSPECTIVAS
Na primeira etapa deste trabalho, as condições de reação testadas para a hidrólise
enzimática do concentrado protéico do soro do leite (WPC), assim como o emprego do
carvão ativado (CA), como meio adsorvente, levaram à obtenção de hidrolisados
enzimáticos com teor reduzido de fenilalanina (Phe), tendo o percentual de remoção
ultrapassado os 80%. Este procedimento deu origem a um hidrolisado protéico que
poderia ser utilizado, em uma quantidade de 25,4g/100g, como alimento ou ingrediente
alimentar na dieta de fenilcetonúricos.
Durante a remoção de Phe pelo CA, os outros aminoácidos aromáticos, tirosina
(Tyr) e triptofano (Trp), também podem ser removidos. Propõe-se, primeiramente, que
estas perdas sejam quantificadas, para que, posteriormente, pesquisas sejam realizadas
para minimizar tais perdas ou que seja reincorporada ao produto final, a quantidade
perdida. Propõe-se a realização do aminograma desses hidrolisados, para verificar
possíveis perdas de outros aminoácidos, assim como para avaliar, com mais detalhe, o
valor nutricional dessas preparações.
Dentre as condições testadas para a remoção de Phe nos hidrolisados, o melhor
resultado foi obtido ao se empregar a pancreatina na relação E:S de 1:100, concentração
da matéria-prima de 10% (p/v) e tempo de reação de 5 horas, tendo atingido 81,3% de
remoção e o teor final de Phe de 394,1 mg/100g de hidrolisado. Sugere-se o
desenvolvimento de uma bebida que forneça 8,28g/100g de proteína, adicionada de
carboidratos e aromatizantes, para o oferecimento aos pacientes portadores de
fenilcetonúria, sendo as porções recomendadas de acordo com a tolerância de cada
paciente ao aminoácido fenilalanina, ou ainda, a utilização do hidrolisado como um
ingrediente alimentar para a produção de bebidas lácteas, produção de ricota e como
ingrediente na produção de alimentos industrializados diversos.
Na segunda etapa, foi possível caracterizar os hidrolisados protéicos de WPC,
quanto ao grau de hidrólise e perfil peptídico, sendo observado que as condições
hidrolíticas testadas neste estudo levaram à obtenção de hidrolisados com percentuais
variados de grau de hidrólise e, ainda, ricos em di- e tripeptídeos e aminoácidos livres e
com baixo teor de grandes peptídeos. Ou seja, a partir do WPC, foi possível obter
111
produtos de melhor valor nutricional, uma vez que na forma de pequenos peptídeos a
proteína é mais completa e rapidamente absorvida pelo organismo.
Os hidrolisados obtidos pela ação da pancreatina e da protease do A. oryzae ,
ambos na relação E:S de 1:100 e concentração da matéria-prima de 10%, apresentaram
os maiores valores de grau de hidrólise (30% e 27%, respectivamente). Em relação ao
perfil peptídico, os melhores resultados foram obtidos pela ação da protease do A. oryzae
e pancreatina, ambas com relação E:S de 1:100 e concentração da matéria-prima de 10%
e 7%, respectivamente, uma vez que levaram à formação de uma maior quantidade de di-
e tripeptídeos (16,14% e 9,12%, respectivamente) e menor teor de grandes peptídeos
(20%, em média).
Considerando-se os resultados aqui obtidos, sugere-se a realização de estudos
envolvendo o emprego de condições hidrolíticas diferentes das que aqui foram utilizadas,
que poderão incluir o teste de outras enzimas de diversas origens (animal, vegetal ou
microorganismos), na busca de hidrolisados protéicos com teores ainda mais elevados de
di- e tripeptídeos. Além disso, outras fontes protéicas poderiam ser utilizadas como
matéria-prima. Nesse caso, torna-se importante avaliar economicamente a escolha do
substrato.
Estes resultados levam à conclusão de que os hidrolisados do WPC poderiam ser
utilizados como fonte protéica na elaboração de suplementos alimentares para os diversos
casos de nutrição clínica, apresentando como vantagem, além do enriquecimento do teor
protéico, uma melhor absorção das proteínas.
Propõem-se, também, o estudo de diversas propriedades bioativas destes
hidrolisados protéicos, assim como foi feito com os hidrolisados obtidos a partir das
proteínas do arroz desenvolvidos no mesmo laboratório do presente trabalho, os quais
foram testados e mostraram ser eficientes na redução da translocação bacteriana em
ratos.
Finalmente, propõe-se o estudo das propriedades funcionais destes hidrolisados
(capacidade emulsionante, solubilidade, formação de espuma, geleificação etc), visando
seu emprego em diversos produtos alimentícios.
Em relação à avaliação da existência de correlação entre o grau de hidrólise e o
perfil peptídico, observou-se que existe correlação entre estes dois parâmetros, entretanto,
com fraca intensidade de associação. A realização deste estudo, empregando-se um
número maior de amostras (hidrolisados analisados), poderia elevar a precisão quanto à
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avaliação da associação entre estas variáveis, sendo importante, neste caso, considerar o
custo do trabalho, tanto do ponto de vista econômico, quanto em relação ao tempo de
execução.