guia parasitologia ..julio 2013

1

DAVID G. QUISPE ARANDA

2 0 1 3

2

PREFACIO

El presente manual de Parasitología Clínica tiene la finalidad de funcionar como

guía de trabajo en la experiencia educativa del curso de Parasitología Clínica, la cual se

encuentra curricularmente establecida en la formación del estudiante de

TECNOLOGÍA MÉDICA.

Mediante este Manual el estudiante conocerá, comprenderá y analizará sus

conocimientos de Parasitología, aplicando y desarrollando sus saberes; en el laboratorio

donde se trabaja en un ambiente de respeto, responsabilidad y ética, haciendo uso de sus

habilidades en el manejo de equipos así como en el desarrollo de metodologías, previo

sustento teórico.

Al final del curso y desarrollo de esta guía el alumno aprenderá la forma correcta de reportar los resultados en el ámbito laboral e integrar sus conocimientos teóricos con los prácticos, consiguiendo así mantener un alto nivel de confiabilidad y satisfacción en su

futura labor.

Espero que los alumnos encuentren en este manual un formato de fácil lectura y que los métodos sean de utilidad para el diagnóstico y reconocimiento

de los parásitos más frecuentes en nuestro medio y más aun de nuestro pais, para plantear la solucion

de los mismos.

El autor

Lic. T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

Esp. Laboratorio Clinico y Anatomia Patologica

3

INDICE

Pag

. REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE PARASITOLOGÍA 7

GENERALIDADES 8

TECNICAS DIRECTAS

Diagnóstico de enteroparasitos 9

Diagnóstico de hemoparasitos e histoparasitos 9

Diagnóstico de artrópodos 11

TECNICAS INDIRECTAS

Diagnóstico de enteroparasitos 12

Diagnóstico de hemoparasitos e histoparasitos

12

RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLINICAS 13

Heces 13

Conservación y transporte (Persevantes)

Test de Graham 17

Gusanos y otros parásitos macroscópicos 17

Contenido duodenal 17

Sangre 17

Suero 18

Líquido Cefalorraquídeo 18

Muestras de tejido 18

Biopsia

Exudado borde ulcera

Aspirado de lesión

Orina 19

Muestras para prueba de PCR 19

REPORTE DE RESULTADOS (enteroparasitos) 20

Cualitativo

Semicuantitativo

4

Ejemplo de reporte de Examen parasitológico 21

PRACTICAS DE LABORATORIO 22

Practica nº 1. Examen directo de Heces 23

Elementos No parasitarios 26

PROTOZOARIOS

Practica nº 2. Observación de Amebas - Rizópodos 33

Practica nº 3. Observación de Flagelados 38

Procedimiento para diagnóstico de Trichomonas 39

Practica nº 4. Observación de Histoparasitos Y Hemoparasitos I 42

Técnicas y procedimientos en Leishmaniosis 42

Técnicas y procedimientos en Tripanosomiasis 45

Practica nº 5. Observacion de Ciliados 50

Practica nº 6. Observacion de Hemoparasitos II: Plasmodium 52

Extensión de sangre 52

Gota gruesa 53

Coloración 55

Determinación de parasitemia 58

Características morfológicas de especies de Plasmodium 62

Practica nº 7. Observacion de Coccideos intestinales 65

Método Kinyoun 65

HELMINTOS

Practica nº 8. Observacion de Nematodes 71

Practica nº 9. Observacion Trichuris trichiura 73

Practica nº 10. Observacion de Uncinarias 74

Observacion Strongyloides stercoralis 76

Practica nº 11. Observacion Enterobius vermicularis 78

Método de Graham 78

Practica nº12. Observacion de Cestodos I 81

Practica nº13. Observacion de Cestodos II 84

Practica nº14. Observacion de Cestodos III 86

Practica nº15 .Observacion de Trematodos 88

ARTROPODOS

5

Practica nº16. Observación de insectos de importancia medica 89

Practica nº17. Examen Coprofuncional 94

Examen Macroscópico 96

Examen Físico-Químico 99

Examen Microscópico 107

Características de los Síndromes Digestivos 113

Modelo de reporte de examen coprológico funcional 115

ANEXOS

Métodos de concentración 117

Sedimentación 117

Sedimentación por Centrifugación 118

Método Ritchie 118

Método Telemann 120

Método Charles-Barthelemy 121

Concentración por centrifugación 122

Concentración por Formalina-Acetato etilo 123

Sedimentación Simple 125

Método Sedimentación simple en copas 125

Sedimentación espontanea en tubo 127

Técnica Baerman Modificada 127

Método de Lumbreras Modificado 128

Flotacion

Metodo Faust 128

Metodo Willis 131

Metodo Sheater 132

Métodos Cuantitativos para el recuento de huevos y larvas 135

Método Dilución Stoll 136

Método Kato-Katz 140

Método Directo 142

Técnica de Ferreira 143

6

Técnica Mac Master 144

Técnicas Especiales 145

Método Harada-Mori 145

Método de Baerman 147

Migración de Larvas en Agar 149

Procedimientos para Fijar Helmintos 152

Métodos de coloración para Helmintos 153

Coloración Carmín clorhídrico 153

Coloración de Bonilla,Naar y Beloy 154

Coloración hematoxilina férrica de Delafield 154

Método de la tinta china 155

Coloraciones Especiales para Protozoarios 157

Hematoxilina férrica 157

Tricromica de gomori 161

Reacción Inflamatoria en Heces 163

Modelo de reporte de reacción inflamatoria 164

Control de Calidad Interno en Parasitología 165

Diagnóstico Inmunológico de Enfermedades Parasitarias 172

Cuadros Comparativos - Resumen 178

Examen de Biopsias del Tubo digestivo 185

Preparación de Reactivos 186

GLOSARIO DE TÉRMINOS PARASITOLÓGICOS 192

ALGORITMOS DIAGNOSTICOS 198

PUZZLE 206

ATLAS DE PARASITOS 208

BIBLIOGRAFIA 215

7

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE

PARASITOLOGIA

1. El alumno deberá llegar puntual en su horario de clase.

2. El alumno debe de ingresar al laboratorio con una bata o mandilón de manga larga. 3. El alumno debe de asistir al laboratorio con su Manual de Practicas 4. Libros y cuadernos deben mantenerse en la mesa de trabajo, solo bajo la indicación del docente

5. El alumno debe contar con su material necesario para la práctica de laboratorio correspondiente.

6. El alumno debe limpiar su área de trabajo con hipoclorito de sodio antes y después de la práctica de laboratorio.

7. Durante la práctica de laboratorio el alumno debe usar guantes y mascarilla. 8. Queda estrictamente prohibido comer, beber, llevarse cosas a la boca y fumar en el Laboratorio. 9. Una vez terminada su práctica, las muestras serán desechadas por el alumno en los depósitos correspondientes. 10. En caso de romperse o derramarse muestra fecal deberá verterse fenol o hipoclorito sobre él y dejarlo cuando menos 10 minutos antes de limpiar y avisar al Docente o personal de laboratorio.

8

GENERALIDADES

El parasitismo es una modalidad de asociación que ha evolucionado con bastante éxito; los organismos que han optado por esta forma de vida tienen, en general un potencial biótico mayor. Incluso se argumenta que existen más parásitos, como especies y como individuos, en relación a seres de vida libre, ya que son raros los últimos que no albergan una o más especies de parásitos. La prevalencia de las parasitosis está estrechamente vinculada a diferenciales climáticas, fenómenos demográficos y al desarrollo socioeconómico de las diferentes zonas del planeta. No es de extrañar que los protozoos y helmintos patógenos sean parte de la vida cotidiana en los trópicos, sin ser privativos de ellos.

Las enfermedades parasitarias afectan a diversos grupos de población de todas las edades y razas, representando un elevado riesgo para la salud y la vida de extensos sectores. Por sus características peculiares, afectan de preferencia a los grupos jóvenes y de mayor productividad, que viven en zonas suburbanas de las grandes ciudades o en zonas rurales. El ciclo de cada parásito expresa la complejidad del fenómeno biológico.

Las variables agente, huésped y ambiente (tríada ecológica) son fundamentales para orientar el diagnóstico parasitario. Se debe tomar en consideración el estado parasitario buscado (huevo, quiste, larva, etcétera.), tanto en el huésped como en el ambiente, para seleccionar el tipo y características de la muestra (orina, deposición, ambiente, etc.) así como escoger el mejor procedimiento o técnica para su diagnóstico.

Debido a la existencia de infecciones transmitidas en forma natural desde animales vertebrados al hombre y viceversa (zoonosis), la búsqueda de los parásitos se extiende incluso al reservorio animal. Por ejemplo, en toxocariasis y equinococosis se puede solicitar colaboración a los laboratorios de medicina veterinaria para estudiar las deposiciones de las mascotas (perros). También se pueden estudiar fuentes infectantes, como carnes (triquinosis, sarcocistosis), tierras en el caso de geohelmintiasis (ascariasis, tricocefalosis, toxocariasis) y aguas en el caso de las enteroparasitosis que se transmiten por contaminación fecal.

El objetivo de las técnicas diagnósticas es pesquisar e identificar al parásito (en cualquiera de sus estados) lo que se realiza con técnicas directas, o a través de técnicas indirectas que evalúan la respuesta inmune del huésped .El hallazgo de una forma parasitaria en cualquiera de sus estados es considerado un diagnóstico patognomónico, en cambio la evidencia de la respuesta inmune positiva hacia un agente parasitario sólo hace posible un diagnóstico presuntivo.

Las técnicas para diagnosticar PARASITOS se pueden dividirse:

I. TECNICAS DIRECTAS permiten observan al parásito ya sea como trofozoito, quiste, larva, gusano adulto, ninfa, etc. II. TECNICAS INDIRECTAS detectan antígenos del parásito o anticuerpos generados en el hospedero producto de la infección (pruebas serológicas) y de otro tipo, que unido a la clínica dan un diagnostico probable.

9

TÉCNICAS DIRECTAS

Diagnóstico de enteroparasitos

Se basan en el diagnóstico morfológico de los distintos estados de los parásitos. Tiene como objetivo pesquisar e identificar distintas formas de protozoos (trofozoíitos, quistes, ooquistes) y helmintos (proglótidas y huevos). Su sensibilidad depende de las características de las técnicas, de la carga infectante, de la biología de los parásitos, del transporte y preparación de la muestra, de la implementación de equipos adecuados y de la disponibilidad de tiempo y experiencia de los observadores.

Las técnicas de uso más habituales son los métodos de Teleman.modificado y el de Burrows o PAF. este último tiene la ventaja de permitir un apropiado diagnóstico de trofozoítos, lo que tiene particular importancia en el estudio de la amebiasis intestinal. Ambas son de gran utilidad para el clínico, pues pueden informar la presencia de varios parásitos y comensales al mismo tiempo.

El reconocimiento de Cryptosporidium spp. como un importante agente etiológico de diarrea, principalmente en pacientes inmunocomprometidos, hizo necesaria la incorporación de la técnica modificada de Ziehl Neelsen a la rutina en el laboratorio. Ella debe ser solicitada en forma explícita por el clínico.

El estudio de enteroparásitos generalmente se realiza con muestras de deposiciones, pero puede efectuarse en forma excepcional en el líquido biliar, y aspirado duodenal. El examen parasitológico de deposiciones puede ser seriado (1 a 3 muestras), o de sólo una muestra (examen directo o en fresco).Este último se utiliza para el diagnóstico de urgencia, frente a cuadros diarreicos y disentéricos en niños y adultos, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. La muestra se envía inmediatamente al laboratorio, en donde se da prioridad a su análisis, por lo que la respuesta puede ser entregada antes de una hora. Otro examen de gran utilidad es el test de Graham, que se utiliza, especialmente para la pesquisa de huevos de helmintos (Enterobius vermicularis) en las márgenes de la zona perianal.

El diagnóstico de tricomoniasis urogenital habitualmente se realiza por examen de una muestra de flujo vaginal, la que se observa directamente al microscopio. Existen técnicas específicas de cultivo e inmunodiagnóstico (imunofluorescencia) que se emplean en investigación clínico-epidemiológica.


Estos métodos se utilizan en la búsqueda de parásitos circulantes en pacientes que están en fase aguda de la infección. Son de utilidad en el diagnóstico de Tripanosomiasis americana (Enfermedad de Chagas) malaria y filariasis.

Se emplean las siguientes técnicas:

Examen de sangre al fresco. Una gota de sangre recién extraída se observa entre lámina y laminilla, directamente al microscopio.

10

Frotis de sangre. Se extiende una gota de sangre recién extraída, sobre un portaobjeto, se tiñe con May Grunwald Giemsa o Wright.

Gota gruesa. Se colocan tres gotas de sangre en un portaobjeto, se mezcla con movimientos concéntricos con un alfiler o con el extremo de un portaobjeto, se extrae la fibrina. se seca a temperatura ambiente y luego se tiñe

Microstrout o microhematócrito. Se toma una muestra de sangre en tubo de microhematócrito y se centrifuga a 100 rpm por tres minutos. Se fractura el capilar en el límite de la capa leucocitaria. Se deposita sobre un portaobjeto la capa de leucocitos y plasma y se observa al microscopio.

Xenodiagnóstico. Esta técnica sólo se utiliza para enfermedad de Chagas. Se emplean ninfas de Triatoma spp. libres de infección, las que se alimentan con sangre del paciente. Los resultados se obtienen a los 30, 60 y 90 días. Esta técnica sólo es utilizada en algunos centros de investigación y puede ser reemplazada por PCR para T cruzi.

PCR Trypanosoma cruzi. Se basa en la pesquisa de fracciones del parásito a partir de secuencias conocidas de su ADN. la técnica se basa en la ampliación de un segmento del ADN del parásito, para luego caracterizarlo e identificarlo.

El Pneumocystis carinii actualmente se diagnostica por el examen de muestras de lavados broncos alveolares o expectoración, que son teñidas con Giemsa o Gomori. Se están implementando técnicas de apoyo diagnóstico complementarias (IFI, y PCR).

El diagnóstico de triquinosis sólo excepcionalmente se realiza mediante una biopsia muscular. Habitualmente se realiza mediante los antecedentes clínicos epidemiológicos, los que pueden ser apoyados por la presencia de eosinofilia en el hemograma y técnicas serológicas (ELISA Trichinella spiralis), la que se ha hace positiva en la fase de invasión.

El diagnóstico directo de la presencia de la larva de Taenia equinococcus se realiza por el estudio histológico de piezas quirúrgicas, en el cual se identifica claramente la capa cuticular (escleroproteica anucleada), patognomónica de esta parasitosis. También se puede estudiar el contenido del quiste, siendo posible encontrar la arenilla hidatídica, que está constituida por diferentes formas del parásito, entre ellas protoescólices; es patognomónico el hallazgo de "ganchitos" que son parte estructural de este cestodo. La biopsia está contra indicada en pacientes en quienes se sospecha hidatidosis, por el riesgo de romper el quiste y provocar un shock anafiláctico o una siembra de parásitos.

11

Diagnóstico de artrópodos

Tienen como objeto identificar el género y la especie y están basadas en la observación con lupa o microscopio del artrópodo en algunos de sus estados. Las muestras pueden ser trasladadas en seco o en agua al laboratorio y pueden ser tomadas del huésped (ectoparásitos permanentes) o del ambiente (ectoparásitos temporales).

Entre los artrópodos que más afectan al hombre se encuentran los ácaros de la piel (Sarcoptos scabiei y Demodex folliculorum). La técnica de toma de muestra, denominada Acaro test, es la ideal para obtener el parásito. Otro artrópodo de alta prevalencia es el arácnido Loxoceles laeta (Araña del rincón), cuyo diagnóstico específico se realiza al examinar su morfología y específicamente la distribución de sus ojos (tres pares distribuidos en forma de triángulo).

El diagnóstico de miasis primarias y secundarias, específicas o accidentales se realiza al visualizar el estado de la larva de estos insectos, que desarrollan una metamorfosis incompleta, así como su tamaño y morfología.

ARTROPODOS DE INTERES MEDICO

CLASE ORDEN EJEMPLOS

Insectos

Dípteros Moscas

Mosquitos

Blattaria Cucarachas

Hemíptero Triatomídeos

Siponaptera Pulgas

Anoplura Piojos

Arácnidos

Scorpionida Arañas

Escorpiones

Acarina Acaros

Garrapatas

Crustáceos Copepodo Cyclops

12

TÉCNICAS INDIRECTAS

Diagnóstico de enteroparasitos

En la Amebiasis la técnica de ELISA podría ser utilizada para el diagnóstico de absceso hepático, pero hasta el momento no ha dado buenos resultados, por la alta prevalencia de la infestación que hace que existan muchas personas infectadas asintomáticas con anticuerpos contra E histolytica.Si bien se han descrito han descrito técnicas ELISA para pesquisa de antígeno de Giardia lamblia en deposición, la presencia de poliparasitismo hace que los métodos de Teleman y PAF sean de elección, pues son de menor costo y mayor rendimiento.


Las técnicas de inmunodiagnóstico son herramientas de gran valor para evaluar la infección por ciertos agentes patógenos, especialmente histoparasitos, pues no requieren de una interpretación subjetiva, de detalles morfológicos o de la toma de muestra invasiva para evidenciar el agente patógeno, como biopsias por ejemplo. La detección de anticuerpos séricos (IgG e IgM), se utiliza para el diagnóstico de diversas histoparasitos Se debe recordar que algunas son enfermedades crónicas, en las cuales los parásitos permanecen en los tejidos en estado latente, por lo que la IgG permanecerá positiva por el resto de la vida, motivo por el cual es muy importante considerar el título de IgG. La presencia de IgM, en cambio refleja una etapa aguada y primo infección de la parasitosis. Se está estudiando la aplicación clínica de rutina de IgE e IgA .

Para determinar la presencia de anticuerpos (IgG, IgM, IgA, IgE) se pueden emplear una variedad de técnicas, entre ellas CIEF (contrainmuno-electroforesis), ELISA (ensayo de inmunoanálisis) e IFI (inmunofluorescencia indirecta). cada una de estas técnicas puede emplear distintos tipos de antígenos del parásito: somáticos (crudos o purificados), metabólicos (secretor - excretor), de superficie (parásito completo o secciones de éste).Para el diagnóstico de patologías parasitarias crónicas se sugiere el uso de dos técnicas complementarias.

En clínica es de mucha utilidad que el análisis de una curva serológica, que se obtiene evaluando en dos momentos la concentración de inmunoglobulinas para determinar la evolución de la respuesta inmune. Es de especial importancia en infecciones cuando se desea objetivar una fase aguda. Por ejemplo se emplea para determinar primo infección en toxoplasmosis, enfermedad de Chagas y toxocariasis. Actualmente se dispone de ELISA Cisticercosis (Cisticercus cellulosae) ELISA Toxocara (Toxocara spp.).ELISA Fasciola (Fasciola hepática),ELISA Triquinosis (Trichinella spiralis) ELISA Hidatidosis (Taenia equinococcus).Las intradermoreacciones, técnicas para medir inmunidad celular, actualmente no se están utilizando de rutina. Se han comenzado a implementar técnicas de biología molecular para algunas parasitosis, entre ellas la PCR (reacción en cadena polimerasa) dirigida a fragmentos del ADN del parásito. Este método sirve como indicador de la presencia de parásito en la sangre y en tejidos. Se están haciendo esfuerzos por montar PCR Amebiasis (Entamoeba histolytica), que sería de utilidad en casos de invasión tisular (abscesos hepáticos).

13

RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLINICAS

HECES

Recogida. Se deben recoger 3 muestras, preferentemente en días no consecutivos ya

que la expulsión de parásitos no es constante. Se recomienda recogerlas en un periodo de 10 días ya que la excreción de protozoos intestinales es cíclica y al hacerlo así es más probable coincidir con los días de máxima excreción. La probabilidad de detectar parásitos en una sola muestra puede ser tan baja como 50%-60% pero es >95% si se analizan 3 muestras. En la estrongiloidiasis crónica la rentabilidad diagnóstica del examen de heces es menor.

Cantidad. En cada recipiente de transporte se debe incluir una cantidad de heces del

tamaño de una nuez o unos 10 ml en el caso de heces líquidas. Cantidades muy escasas reducen la sensibilidad del examen. Con cantidades excesivas de heces los fijadores no alcanzan la proporción adecuada para conservar los posibles protozoos presentes y las heces fermentan y al aumentar la presión en el frasco pueden derramarse durante el transporte o apertura. En los quince días previos a la recogida de las heces no se deberían tomar antibióticos (especialmente tetraciclina o metronidazol) ni sales de bismuto. En los cuatro días previos se deben evitar los contrastes radiológicos, laxantes oleosos y antipalúdicos ya que interfieren en la detección de protozoos.

14

Conservación y transporte. Si el procesamiento se va a demorar es necesario

utilizar productos fijadores que mantengan la morfología (especialmente de los protozoos)

e impidan la evolución de huevos y larvas de helmintos sin necesidad de refrigeración de

la muestra, también disminuyen el riesgo de infección y el hedor en el laboratorio de

microbiología. Las alternativas más habituales son:

- Formol en un tampón de acetato de sodio y ácido acético (SAF): puede ser utilizado para concentración, tinciones y con la mayoría de inmunoensayos.

- Formol al 10%. - Mertiolato-yodo-formol (MIF) - Alcohol Polivinilico (PVA)

a. Muestra en formol al 10%: se recogen durante 7 u 8 días. Se realiza el

examen directo, debe tener una relación de una parte de heces y 3

partes de conservante. Las heces se concentran por el método de

sedimentación (acetato de etilo) Se utiliza el sedimento para realizar los

extendidos para su posterior coloración. Se deposita una gota de ese

sedimento sobre un portaobjeto y con un cepillo de dientes se distribuye, en

ambos sentidos, hasta lograr un extendido fino. Se realizan por lo menos 3 a

5 extendidos. Se procede a realizar la coloración permanente.

Ventajas:

Buen fijador.

Fácil de preparar.

Buena preservación de la morfología de huevos de helmintos, larvas, quistes de protozoos y coccidios.

Adecuado para las técnicas de concentración y de la microscopía de epifluorescencia

Adecuado para las coloraciones ácido-alcohol resistentes (safranina).

Compatible con inmunoensayos y microscopía de epifluorescencia.

En determinados casos las heces deben necesariamente remitirse sin conservantes, ejemplo de ello son:

*Detección de antígeno de Entamoeba histolytica. Si no se va a procesar en

el momento es necesario refrigerar en nevera (2-8 ºC)

*Cultivo de larvas de Strongyloides y Uncinarias (métodos de Baermann, de

Harada-Mori, cultivo en placa de agar etc.). Además, para mantener viables

estos helmintos no deben refrigerarse, conservándose mejor entre 22ºC y

35ºC.

*Estudio de viabilidad de los huevos de Schistosoma spp. No refrigerar.

*PCR. Si se va a demorar su realización, deben congelarse.

15

Desventajas:

No es aconsejado para coloraciones permanentes como Tricromica.

Conservante inadecuado para la morfología de trofozoitos.

Puede interferir con PCR, especialmente luego de un tiempo

prolongado de fijación.

b. Muestra con SAF: se trabaja de la misma manera que el anterior. Debe

tener una relación de una parte de heces y 3 partes de conservante.

Antes de depositar la gota de sedimento sobre el portaobjeto para realizar los

extendidos para su posterior coloración, se coloca una gota de albúmina de

Mayer para fijar las heces al preparado por la escasa capacidad de fijación

que tiene el conservante SAF. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos

Ventajas:

Los componentes fijan y colorean al mismo tiempo.

Fácil de preparar.

Útil para trabajos de campo. Vida media prolongada.

Adecuado para técnicas de concentración. Desventajas:

No es aconsejado para coloraciones permanentes como Tricrómica

Conservante inadecuado para la morfología de trofozoitos.

c. Muestra con PVA: debe tener una relación de una parte de heces y 3

partes de conservante. Mezclar inmediatamente. Deben recogerse 6

muestras en días no consecutivos, en recipientes individuales. Las heces

con PVA se filtran con una gasa en un tubo de centrífuga (preferentemente

de plástico). Se centrifugan 10 minutos a 1500 rpm. Se descarta el

sobrenadante que contiene el exceso de conservante. Se secan las

paredes del tubo con gasa. El sedimento se utiliza para realizar los

extendidos para su coloración posterior. Se deposita una gota del

sedimento sobre un portaobjeto y con un cepillo de dientes se

distribuye, en ambos sentidos, hasta lograr un extendidos fino. Se realizan

por lo menos 3 a 5 extendidos. Se procede a realizar la coloración

permanente (Tricrómica o Hematoxilina férrica)

Ventajas

Buen conservante de la morfología de trofozoitos y quistes.

Fácil de preparar las coloraciones permanentes como Tricrómica.

Las muestras conservadas permanecen estables por mucho tiempo.

16

Desventajas:

Inadecuado para la conservación de la morfología de huevos, larvas, coccidios y microsporidia.

Contiene compuestos mercuriales.

Difícil de preparar en el laboratorio. Difícil y caro de eliminar.

No sirve para técnicas de concentración. No puede usarse para técnicas de ELISA.

No es adecuado para coloraciones ácido-alcohol resistente

17

TEST DE GRAHAM Consiste en una muestra de los márgenes del ano recogida con papel celo al levantarse por la mañana, y se debe recomendar al paciente que no se lave la zona perianal antes de realizar la toma. Se debe utilizar celofán transparente (translúcido tipo Scotch) que se colocará sobre un portaobjetos. Es necesario recoger tres muestras en tres días consecutivos que deben ser transportadas al laboratorio en un sobre de papel cerrado o en un frasco, y nunca sueltos ya que los huevos de E. vermicularis ya son infectivos a las 4-6 horas de haber sido puestos.

GUSANOS Y OTROS PARÁSITOS MACROSCÓPICOS La mayoría de los gusanos adultos o fragmentos eliminados espontáneamente son Áscaris lumbricoides que pueden ser expulsados por el ano, por la boca o por la nariz y Enterobius vermicularis y proglótides de cestodos que pueden verse en la superficie de las heces. Raramente se detectan otros como Trichuris trichiura y Dipylidium caninum. Las proglótides de T. saginata, migran activamente atravesando el ano, por lo que se las puede encontrar en los márgenes del mismo o en la ropa. Ocasionalmente se remiten larvas de mosca, Anisakidae, y otros elementos con aspecto de parásitos (incluyendo restos alimentarios y moldes mucosos intestinales). Cualquiera de ellos se debe enviar al laboratorio en un recipiente limpio, con agua o suero salino y conservar refrigerado.

CONTENIDO DUODENAL La obtención de contenido duodenal puede ser útil en algunas parasitosis pero pocas veces se realiza sólo para este fin. Se puede recoger mediante sonda, endoscopia gastrointestinal útil en la búsqueda de coccidios intestinales (proctoscopías y colonoscopías sirven para la búsqueda de Entamoeba histolytica.) o cuerda encapsulada (Enterotest) o por La cápsula de Beal. Aumenta la sensibilidad en el diagnóstico de parásitos que habitan en el duodeno como Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis, Ancylostoma o Necator y Fasciola hepática o cuyos huevos se eliminan por vía biliar. La cápsula entérica (Enterotest) es un sistema comercializado compuesto por una cápsula de gelatina que contiene un cordón de nailon, con un peso en el extremo y un indicador de pH para comprobar que ha pasado del estómago. Uno de los extremos del cordón se fija a la cara del paciente y la cápsula se deglute, llegando hasta el duodeno, la gelatina se disuelve y el cordón se libera y se impregna de bilis y moco duodenal. Se retira tirando del extremo oral y se analiza el material adherido.

SANGRE Plasmodium spp. La sangre debe extraerse en cuanto se sospeche malaria, haya o no fiebre en ese momento. Puede ser necesario extraer muestras cada 6-12 horas durante 48 horas para descartar por completo la infección con microscopía, sobre todo en pacientes no inmunes, pacientes que han recibido fármacos antipalúdicos como profilaxis o tratamiento o cuando no se disponga de pruebas rápidas de detección antigénica (PRD). Estudios recientes indican que los resultados de la microscopía y las PRD son similares con sangre capilar obtenida por punción digital o con sangre venosa anticoagulada recogida en tubos con EDTA, siempre que las extensiones se preparen en menos de 30 minutos desde la extracción para evitar el deterioro de la morfología parasitaria.

18

Trypanosoma spp. Para el método de Strout se necesita sangre recogida sin anticoagulante. Si la parasitemia es elevada se puede detectar el parásito a partir de sangre anti coagulada, suero o plasma. Para observar los parásitos en movimiento, o conseguir su aislamiento en cultivo, es necesario enviar la muestra al laboratorio inmediatamente y analizarla en un plazo óptimo de menos de 4 horas después de su obtención, para ello se puede conservar refrigerada o a temperatura ambiente. En el diagnóstico parasitológico de la infección congénita, se recomienda la utilización de sangre periférica obtenida del talón. La utilidad de la sangre del cordón es discutida por la posible contaminación con sangre materna. En las infecciones crónicas la parasitemia puede ser indetectable o fluctuante, por lo que se aconseja procesar volúmenes de sangre de al menos 10 ml en adultos y 5 ml en niños.

SUERO Hay que desinfectar la piel y extraer sangre en un tubo seco, sin anticoagulante que se mantendrá refrigerado a 2ºC-6ºC o congelado si su procesamiento se va a demorar unas horas. Algunos ensayos serológicos y de PCR se pueden realizar a partir de muestras de sangre secas en papel absorbente que pueden remitirse por correo. Algunas pruebas serológicas pueden realizarse empleando sangre anticoagulada.

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Cuando se sospecha una enfermedad del sueño, un Chagas cerebral o una meningoencefalitis amebiana se deben priorizar las pruebas a realizar y es esencial contactar con el laboratorio para realizar de inmediato un examen en fresco del LCR.

MUESTRAS DE TEJIDO Para las sospechas de leishmaniasis cutáneas y de chancros de inoculación de tripanosomiasis son adecuadas las siguientes muestras:

- Biopsia: con un sacabocados (biopsy punch), estéril de 3-4 mm de diámetro se toma un cilindro de tejido del reborde indurado de la lesión. Nunca se debe tomar del fondo de la úlcera que suele estar infectado secundariamente siendo difícil la visualización de los parásitos. Se deposita en un tubo con unas gotas de suero salino fisiológico o de tampón NET 10 (NaCl 10 mM, EDTA 10 mM, Tris. HCl, pH 8,0, 10 mM). - Exudado del borde de la úlcera: se realiza una incisión con un bisturí y se raspan los márgenes de dicho corte. El material obtenido se introduce en un tubo de las características anteriores para cultivo y otra parte del material se extenderá en un portaobjetos para examen microscópico. - Aspirado de la lesión: con una jeringuilla de 1 ml, se puede inocular un pequeño volumen de solución salina en el borde de la úlcera y aspirarlo comprimiendo la lesión. Parte del material se deposita en un tubo estéril y se realiza un frotis con el resto. Las muestras se mantendrán a temperatura ambiente hasta su procesamiento. Este sistema se emplea también para aspirar adenopatías en caso de sospecha de tripanosomiasis africana. En el caso de sospecha de leishmaniasis visceral, las muestras de elección son el aspirado o biopsia de médula ósea y la sangre

19

anticoagulada. Se mantendrán a temperatura ambiente hasta su transporte al laboratorio. La sangre preferentemente se debe procesar inmediatamente para la separación de las células mononucleares de sangre periférica y en su defecto se puede conservar hasta 24 horas a 4ºC. La punción esplénica no se recomienda por el riesgo de ruptura. Las muestras de piel para detección de Oncocerca spp. se deben remitir en un tubo con unas gotas de suero salino a temperatura ambiente o bien realizar la toma en el laboratorio.

ORINA Para detectar Schistosoma haematobium en orina se debe enviar al laboratorio un volumen de más de 100 ml de orina incluso toda la orina de 24 horas. La rentabilidad aumenta si la muestra se recoge entre las 10 y las 15 horas del día y si se realiza ejercicio antes de recogerlo. Se envía al laboratorio en un recipiente limpio y se refrigera o se añade aproximadamente un 1% de formol.

MUESTRAS PARA PRUEBAS DE PCR Para la detección de ácidos nucleicos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es conveniente que la muestra no sufra muchos cambios de temperatura y es preferible que se conserve a 4ºC. Para tiempos de conservación prolongados conviene congelarlo a -20ºC. Dependiendo de la prueba a realizar, la adición a la muestra de proteinasa K o guanidina-EDTA puede mejorar la sensibilidad del ensayo.

20

REPORTE DE RESULTADOS

(Enteroparasitos)

Los resultados indicarán el(los) método(s) empleado(s), el género o la especie del parásito

observado y su estadio evolutivo. La densidad parasitaria puede expresarse como el número de

formas parasitarias observadas por campo de microscopio con objetivo de 10X y 40X.

Todo formato de respuesta de resultados debe contener los siguientes datos:

Nombre paciente , edad, sexo, fecha,

Características organolépticas de las heces : consistencia, color

Presencia de sangre y moco

Observación microscópica (presencia de leucocitos, eritrocitos, levaduras, fibras

musculares no digeridas y parénquima de células vegetales en cantidad considerable),

“Esta información facilitará un mejor diagnóstico clínico”

Resultado positivo El informe debe contener el nombre del paciente, los agentes observados y su estadio o forma evolutiva:

quistes (q)

ooquistes (o)

trofozoítos (t)

esporas (e)

huevos (h)

larvas (l)

Cualitativo

Escaso

Regular

Buena cantidad Semicuantitativo

Contando las formas parasitarias. Si se observan 1 ó 2 elementos en toda la lámina,

escribir el nombre del agente y su estadio evolutivo

(+) Si se observan de 2 a 5 elementos por campo microscópico 10X ó 40X.

(++) Si se observan de 6 a 10 elementos por campo microscópico 10X ó 40X.

(+++) Si se observan >10 elementos por campo microscópico 10X ó 40X.

Resultado negativo

Informar que no se observaron quistes, trofozoítos, ni huevos de parásitos.

21

EJEMPLO DE REPORTES DE EXAMEN PARASITOLOGICO

LABORATORIO X

NOMBRE : xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx EDAD : xxxxxx CODIGO :xxxxx

Muestra : Heces Metodo : Directo

1 era muestra : Se observan Quistes de Entamoeba histolytica + 2 da muestra : Se observan Quistes de Entamoeba histolytica ++ 3 era muestra :

Se observan Quistes de Entamoeba histolytica ++

FECHA : xx/xx/xxxx FIRMA RESPOSANBLE

LABORATORIO X

NOMBRE : xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx EDAD : xxxxxx CODIGO :xxxxx

Muestra : Heces Metodo : Directo

1 era muestra :

No se observaron quistes, trofozoítos, ni huevos de parásitos 2 da muestra :

No se observaron quistes, trofozoítos, ni huevos de parásitos 3 era muestra :

No se observaron quistes, trofozoítos, ni huevos de parásitos

FECHA : xx/xx/xxxx FIRMA RESPOSANBLE

23

PRACTICA Nº 1. EXAMEN DIRECTO (Observación de elementos no parasitarios en las heces)

El método del EXAMEN DIRECTO de las heces, sigue siendo el “Gold standard” para el diagnóstico de la enfermedades parasitarias, es una técnica simple, rápida y económica. Se usa principalmente para observar las características morfológicas de los protozoos y detectar la movilidad de los mismos en su forma de trofozoito. El preparado directo se realiza con una pequeña cantidad (una gota) de heces entre porta y cubreobjeto; no debe ser mayor porque resultaría demasiado espesa para el examen, ni menor porque disminuiría la posibilidad de encontrar parásitos. La observación se realiza utilizando un objetivo de 10x aumentos y ante un elemento sospechoso se examina con 40x aumentos. Los trofozoitos y quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos y ooquistes de Isospora belli pueden ser identificados en el extendidos directo. Los ooquistes de Cryptosporidium difícilmente son observados, salvo en grandes infecciones, al igual que las esporas de Microsporidium que son muy pequeñas y de forma semejante a restos de materia fecal.

Examen General de Heces

- Examen Macroscópico: Donde se observan las características de las heces como:

Olor y Color Consistencia (Líquida, Sólida, Semisólida, Pastosa). Aspecto (presencia de mucus, sangre). Presencia de nematodos adultos (áscaris, oxiuros), estructuras de tenias,

larvas u otros.

- Examen Microscópico: En general se emplean dos métodos:

Método directo:

Este método permite observar formas vegetativas de protozoarios (trofozoitos de amebas) ,ooquistes de coccideas y algunas larvas.

Es útil en las necropsias, para analizar el contenido intestinal. Cuando al agregado se le agrega 1 gota de lugol, se observa los quistes.

Método de enriquecimiento o concentración: Sirve para concentrar las formas parasitarias (huevos, larvas) en las heces,

de manera que puedan ser diagnosticadas, aun cuando existan pequeñas cantidades.

Se recomiendan para la demostración de quistes, ooquistes, huevos o larvas Pueden ser: Cualitativos (métodos de flotación, métodos de sedimentación) o

cuantitativos (Método de Stoll, etc.)

24

Requisitos para la toma de muestras de heces: la recolección y el manejo

adecuado de las muestras fecales son indispensables para la identificación correcta de los parásitos en el laboratorio, es así que se debe de tomar en cuenta lo siguiente:

- Sirven las heces recién emitidas y evacuadas espontáneamente - Materia fecal del tamaño de una aceituna. - Deben recogerse en un recipiente limpio y seco. - No debe mezclarse con orina. - En los lactantes se recomienda tomar la muestra de heces directamente del pañal o

estimular la evacuación mediante una sonda rectal. - Debe transcurrir el menor tiempo posible entre la toma de muestra y el examen - Debido a la eliminación irregular de los elementos parasitarios, el examen

parasitológico de una sola muestra de heces puede ser insuficiente. Objetivos

- Análisis y procesamiento correcto de la muestra. - Diferenciar un parásito de un elemento general de las heces. - Conocer y diferenciar algunas estructuras parasitarias.

Materiales

Porta-objetos, 7.5 X 2.5 cm (3 X 2 pulgadas) limpio y seco

Cubre-objetos, 22 X 22 mm

Aplicadores de madera-bajalenguas

Solución salina fisiológica (0.85% cloruro de sodio)

Solución de Lugol

Frasco con desinfectante para descartar material (lejia, fenol, etc) Procedimiento

Con suero fisiológico (SSF): Para observar trofozoitos de protozoos y larvas de nematodos, todas en movimiento y elementos que aparecen en situaciones anormales, también es utilizada para ejecutar cuenta de huevos de algunos helmintos (estimar intensidad de la infección)

1. Con un aplicador de madera, tome una pequeña cantidad de heces y

disuélvala en suero fisiológico sobre una lámina portaobjetos. 2. Cubra la preparación con una laminilla cubreobjetos y observe al

microscopio con objetivo de 10 y 40X.

Con lugol: Para observar la morfología de los parásitos. Colorea en forma temporal trofozoítos y quistes de protozoos, además de huevos de helmintos e Inmovilizar larvas

1. Repita el mismo procedimiento anterior usando lugol parasitológico. 2. Examine en un microscopio con objetivo de 10X y 40X.

25

Forma de cargar la muestra de heces

Forma de observar la lámina con muestra en el microscopio

SSF LUGOL Resultados

Visualizar la presencia o ausencia de parasitos: quistes, trofozoitos, larvas, etc

Informar otras estructuras, cuando estén presentes, ya que indican alguna

patología: leucocitos, eritrocitos, macrófagos, cristales de Charcot-Leyden.

Después de la observación , descarte las láminas colocándolas en la mezcla

sulfocrómica o hipoclorito de sodio (lejía 10%)

C

O

D

I

G

O

1

3

2

4

26

ELEMENTOS NO PARASITARIOS

En un análisis parasitológico los restos o elementos no parasitarios deben diferenciarse de

los parásitos. Hay muchos y diferentes elementos microscópicos de restos alimenticios o

restos no parasitarios, de origen endógeno o exógeno que están presentes en las heces.

Podemos citar varios ejemplos:

-Tejido conjuntivo: las fibras se entrecruzan en una red muy fina.

-Carne: las fibras musculares están unidas por trabéculas. Las fibras de carne

insuficientemente digeridas son de tamaño variable, de forma rectangular, de ángulos

bien marcados, de color marrón con una neta estriación doble, longitudinal y transversal;

las fibras de carne bien digeridas presentan formas más redondeadas, de color marrón

más claro a amarillo pálido y sin estrías.

-Grasas: grasas neutras se ven como gotas muy refringentes y los ácidos grasos con

aspecto de finas agujas a veces agrupadas.

-Elementos vegetales: los gránulos de almidón están agrupados en masas celulósicas.

El grado de digestión del almidón se determina por la coloración que toma con el lugol,

violeta oscura cuando el almidón está intacto, rosa pálido cuando está totalmente

digerido y tonos de marrón para los distintos grados de degradación.

-Celulosa no digerible: los vasos espiralados de legumbres verdes aparecen como

resortes cuando están de perfil y de frente se presentan como elementos redondeados

de doble contorno cuyo interior puede estar lleno o vacío, los pelos vegetales, alargados,

que tienen un polo irregular y el otro agusado, muy refringentes y en el medio un canal

que puede confundirse con el intestino, restos de pólenes y esporas de hongos

con estructuras semejantes a huevos de parásitos de los que hay que distinguir; tejidos

de revestimiento de los vegetales aparecen con formas complejas como son las células

en empalizada, etc.

-Cristales: de oxalato de calcio, de fosfato amónico-magnésico, de Charcot-Leyden o

agujas de brújula.

-Células endógenas: leucocitos, que pueden estar aislados o en grupos

denominados piocitos, hematíes, células epiteliales, células rectales, bacterias, etc.

EXISTEN MUCHÍSIMAS FIGURAS MICROSCÓPICAS DE RESTOS QUE NO

PUEDEN SER IDENTIFICADAS CON PRECISIÓN Y SERÍA UNA TAREA INÚTIL

TRATAR DE RECONOCERLAS. LO MÁS IMPORTANTE ES PODER

DIAGNOSTICAR CORRECTAMENTE LOS DIFERENTES PARÁSITOS QUE

PUEDEN HALLARSE EN EL INTESTINO HUMANO.

27

ELEMENTOS NO PARASITOS EN LAS HECES

0

1. gotas de grasa

2. células vegetales en empalizada

3. pared de célula vegetal

4. hongos – levaduras

5. pelo vegetal

6. grano de polen

7. fibra de algodón

8. granos de almidón

9. estructura vascular vegetal

10. células vegetales

ELEMENTOS DE ORIGEN VEGETAL

11) acido úrico

12) fosfato calcico neutro

13) leucina

14) ácidos grasos

15) oxalato de calcio

16) colesterol

17) cristales de charcot leyden

18) carbonato de calcio

19) fosfato amonio – magnesio

20) cistina

ELEMENTOS DE ORIGEN MINERAL

15. 16. 17. 18. 19. 20.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

28

Notas

Causas de error o resultados poco satisfactorios:

Esperar más de una hora antes de buscar trofozoítos de protozoos

Preparación muy gruesa o muy fina

Demasiada fibra, arenilla, burbujas

Demasiada iluminación, poca iluminación

Solución de Lugol muy fuerte o muy diluida

No examinar la preparación en forma sistemática

Preparación reseca

Informe incompleto

El no encontrar trofozoítos en una muestra líquida, diarreica o con moco y sangre que no es fresca, no tiene ningún significado.

Para asegurar un control de calidad:

Verificar que la solución salina esté limpia, sin contaminación de bacterias, hongos o protozoos de vida libre.

Verificar que la solución de Lugol tenga la concentración adecuada.

CUANDO LA MUESTRA ES DIARREICA O LÍQUIDA

Debe tomarse una muestra del fondo del frasco, o centrifugar una porción y

examinar el sedimento. Si la muestra contiene moco, hacer otra preparación

tomando muestra del moco con o sin sangre, ya que aquí podrían encontrarse los

elementos patógenos en mayor cantidad. Ejemplo: larvas de S. stercoralis,

trofozoítos o quistes de G. lamblia, ooquistes de apicomplexa intestinales,

trofozoítos de E. histolytica en caso de disentería, trofozoítos y quistes de

Balantidium coli o huevos de T. tríchiura atrapados en el moco.

29

ESQUEMATICE LO QUE OBSERVA EN EL MICROSCOPIO

………………………. ………………………. Aumento : …………x Aumento : …………x ………………………. ……………………….

Aumento : …………x Aumento : …………x

30

ESQUEMATICE LO QUE OBSERVA EN EL MICROSCOPIO

………………………. ………………………. Aumento : …………x Aumento : …………x ………………………. ……………………….


31

Cuestionario

1. ¿Cuáles son las características de las heces en cantidad, color, olor y número de

evacuaciones diarias?

2. ¿A qué se debe el color y olor de las heces?

3. ¿Cuál es el examen de laboratorio de elección para la búsqueda de huevos, quistes

o larvas en heces?:

4. ¿Cuál es el examen de laboratorio de elección para la búsqueda de trofozoítos en

heces?:

5. ¿Cuáles son las indicaciones para el uso de la cucharilla rectal?:

6. ¿Por qué se recomienda qué en los exámenes coproparasitologicos se estudien

tres muestras seriadas de materia fecal?:

7. ¿Cuál es la función de las sustancias conservadoras como el alcohol polivinílico o el

merthiolate-iodo-formol en los estudios coproparasitologicos?:

8. ¿Qué entiende por examen coproparasitologico cualitativo?:

33

PRACTICA Nº 2. OBSERVACION DE AMEBAS - RIZOPODOS

Entamoeba histolytica Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Quiste

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio

Metodo : …………………………….. Aumento : …………x Aumento : …………x

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..

Otras características : …………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

34

Entamoeba coli Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Quiste


Metodo : ……………………………..

Aumento : …………x Aumento : …………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

35

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Endolimax nana - quiste Iodamoeba butschlii - quiste


Metodo : ……………………………..


Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………….………

Forma : ………………………………………..…..

Núcleos : ………………………...……. ….…….

Vacuola : .. ……………….………………………

Otras caracteristicas : …………….….……………

………………………………………….………….

……………………………………………….…….

……………………………………………….…….

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..

Otras caracteristicas : …………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

OOQUISTE

Tamaño :

…………………………………………..……

Forma :

………………………………….….…………..

Esporozoitos

:…………………………………….……

Otras

caracteristicas……………………………..……

……………………………………………………..

36

** Blastocystis hominis(forma vacuolar) ** Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria


Metodo : ……………………………..


FORMA VACUOLADA

Tamaño : …………………………….……….……

Forma : …………………………………………....

Núcleos : ……………………………...……. …….

Vacuola : .. ………………: ………………………

Otras características : …………….….……………

………………………………………….…………

……………………………………………….……

……………………………………………….……

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Nucleolo : ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

OOQUISTE

Tamaño :

…………………………………………..……

Forma :

………………………………….….…………..

Esporozoitos

:…………………………………….……

Otras

caracteristicas……………………………..……

……………………………………………………..

……

……………………………………………………..

……

37

Cuestionario

1. ¿Qué características son importantes para diferenciar Entamoeba histolytica de

Entamoeba coli?

2. ¿Qué recursos de laboratorio son esenciales para identificar las amebas

comensales?

3. Aun cuando Entamoeba coli, Endolimax nana no son amebas patógenas, ¿en qué

radica la relevancia de su hallazgo?

4. Al observar al microscopio a partir de cuantas formas de blastocystis hominis por

campo se considera como patógeno?

5. Realice un cuadro con las diferencias estructurales entre E. coli e histolytica

6. Esquematice el ciclo biológico de E. histolytica

38

PRACTICA Nº 3. OBSERVACION DE FLAGELADOS

Giardia lamblia Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Quiste


Metodo : ……………………………..


Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Flagelos : ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

39

PROCEDIMIENTO PARA DIAGNOSTICO DE TRICHOMONA vaginalis

Materiales:

Material Biológico (Secreciones)

NaCl 0.85 %

Agua destilada

Colorante Wright

Pipeta Pasteur con bulbo

Cubreobjetos

Portaobjetos

Microscopio

Procedimiento:

1.- Se coloca a la paciente en posición ginecológica.

2.-Introducir con cuidado el espejo vaginal.

3.- Con un hisopo tomar la muestra de secreción vaginal

4.- Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido.

5.- La segunda toma depositarla en un tubo con solución salina conservando a 37°C.

6.- Una vez seco el extendido se tiñe con el colorante de Wright .

7.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a éste

último aceite de inmersión.

8.- Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensayo y se

deposita en un portaobjetos y se cubre.

9.- Examinar con objetivos de 10X y 40X.

Coloque las partes a la siguiente forma parasitaria Trofozoito

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Flagelos: ……………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

40


Metodo : ……………………………..


Metodo : ……………………………..


41

Cuestionario

1. Mencione dos liquidos o secreciones biológicos útiles para realizar el diagnóstico de la giardiasis

2. Indica los diferentes tipos de Trichomonas existen y cual es la más común en el

hombre.

3. Indica las diferencias que existen entre la T. vaginalis y Giardia Lambia

4. Realice un esquema o flujograma para diagnóstico de laboratorio de tricomoniasis

5. Esquematice el ciclo biológico de Giardia lamblia

42

PRACTICA Nº 4. OBSERVACION DE HISTOPARASITOS y

HEMOPARASITOS I

TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS EN LEISHMANIASIS

a. Frotis directo

El examen directo puede realizarse de dos maneras: haciendo un raspado del borde

interno de la úlcera o haciendo una incisión y raspando el borde activo de la lesión. La

primera metodología tiene la ventaja de ser menos dolorosa, sangrar menos y ser más

fácil, rápida y económica que la segunda. La sensibilidad de ambas metodologías es

comparable. Si existen dos o más lesiones debe escogerse para el examen directo la

que tenga un menor tiempo de evolución.

b.Frotis (raspado) del borde interno de la úlcera

Guantes de cirugía, alcohol, algodón, solución salina, jabón quirúrgico, gasa estéril,

láminas porta-objetos, lancetas u hojas de bisturí, colorante de Giemsa o Wright,

microscopio óptico, aceite de inmersión.

1. Con manos enguantadas realice limpieza del sitio de la lesión utilizando algodón

impregnado en alcohol o solución salina y jabón quirúrgico. Si hay costra

remuévala cuidadosamente.

2. Sobre la cara interna del borde de la úlcera realice un raspado con el borde romo

de una lanceta u hoja de bisturí. Hágalo de manera tal que no sangre mucho.

3. El material así obtenido se extiende en forma suave sobre una lámina

portaobjetos previamente limpiada, desengrasada y debidamente rotulada.

4. Tome otras tres muestras de la misma manera colocando dos muestras por

lámina en dos láminas portaobjetos.

5. Deje secar las muestras a temperatura ambiente. Fije con metanol y deje secar.

6. Tiña las láminas con colorante de Giemsa al 10% en solución amortiguada de

fosfatos pH 7,2 durante 10 minutos, o con colorante de Wright. Para evitar la

formación de precipitados de colorante es aconsejable realizar la tinción con las

láminas invertidas sobre una superficie que tenga el colorante.

7. Observe al microscopio de luz con un aumento de 100 X (objetivo de inmersión),

para buscar los amastigotes que pueden encontrarse intra o extracelularmente.

Para identificar un amastigote como tal debe observarse las formas ovaladas o

redondeadas características y distinguirse claramente el núcleo del cinetoplasto.

c.Incisión y raspado del borde activo de la lesión.

1. Con manos enguantadas realice limpieza del sitio de la lesión utilizando algodón

impregnado en alcohol o solución salina y jabón quirúrgico. Si hay costra remuévala

2. Previa infiltración con una pequeña cantidad de xilocaína (0.1 a 0.2 ml), sobre el

borde activo de la lesión realice una pequeña incisión con la hoja de bisturí de 3 a 6

mm de longitud por 1 a 3 mm de profundidad. La hemostasia se debe lograr

haciendo presión en pinza con los dedos.

43

3. Con gasa estéril, limpie la sangre que emana de la incisión y con la misma gasa

presione el borde de la lesión para hacer hemostasis y evitar el sangrado.

4. Con el borde romo de la hoja del bisturí levante la piel de la parte superior de la

incisión y raspe tejido del interior de la incisión desde la profundidad hacia la

superficie.

5. El material así obtenido se extiende en forma suave sobre una lámina portaobjetos

previamente limpiada, desengrasada y debidamente rotulada.

6. Tome otras tres muestras de la misma manera colocando dos muestras por lámina

en dos láminas portaobjetos.

7. Deje secar, fije, tiña y observe al microscopio en la misma forma que para el frotis

interno del borde interno de la úlcera.

Interpretación:

Se interpreta como positivo cuando se encuentran uno o más amastigotes. Se considera como negativo cuando no se encuentran amastigotes después de haber recorrido un mínimo de 100 campos. Si el primer examen es negativo, debe repetirse el procedimiento en la misma forma señalada. Si dos exámenes directos tomando en cada uno dos láminas con dos muestras por lámina son negativos, y persiste la sospecha clínica de leishmaniasis, debe practicarse biopsia

44


Amastigote Promastigote


Metodo : ……………………………..



Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Cinetoplasto : ………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Flagelo : …………………………………………


…………………………………………………

…………………………………………………

45

TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS EN TRYPANOSOMIASIS

a.Examen de sangre en fresco Materiales

Portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio

Procedimiento:

1. Deposite una gota de sangre sobre un portaobjetos

2. Cubra la gota con un cubreobjetos, observe directamente la preparación al

microscopio con el objetivo de 40X con el condensador bajo y con una abertura

reducida del diafragma del condensador.

Los tripanosomas pueden ser reconocidos por su movimiento entre los

hematíes inmóviles

b.Extensión de sangre

Esta técnica resulta especialmente útil para confirmar la identidad de la especie

de tripanosoma detectada con las técnicas precedentes.

Materiales:

2 portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio

Solución de Giemsa

Procedimiento:

1. Coloque una gota de sangre sobre un

portaobjetos.

2. Con un segundo porta objetos haga el

extendido de sangre como se indica en la figura.

3. Cubrimos el frotis con metanol durante 3

minutos (con esto procedemos a fijar el frotis) .Escurrimos y lo dejamos secar al aire.

4. Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de giemsa con 2 ml de solución tampón pH

7,2. Es importante realizar esta dilución en el momento de la tinción, ya que el

colorante precipita y no es válido para otro día.

46

4. Cubrimos el frotis con la dilución de colorante, dejándolo actuar durante 25

minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con

tampón pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos

en posición vertical.

Este método permite identificar las especies de trypanosoma por sus características

morfológicas.

c.Semiextensión de sangre (gota gruesa)

1. Se coloca una gota grande de sangre sobre un portaobjetos y utilizando el borde de

otro portaobjetos, se extiende sobre un área circular de unos 2 cm de

diámetro.

2. Se secará rápidamente abanicando el portaobjetos en el aire y sin fijar

previamente, se tiñe durante 30 minutos con una solución de colorante Giemsa al

4% en agua corriente. Considerando que el tiempo y la dilución de tinción pueden

variar en función del fabricante del colorante y del protocolo concreto que se

utilice, se recomienda empezar siguiendo las indicaciones del fabricante y,

posteriormente, modificar el tiempo de coloración y la concentración de colorante

hasta obtener resultados óptimos.

3. Tras la tinción, el portaobjetos se lava suavemente con agua corriente y se observa

al microscopio, usando para ello el objetivo de inmersión de 100X.Es fácil reconocer

a los tripanosomas por su morfología general.

Resultado frotis y gota gruesa : Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.

d.Centrifugación en tubos de hematocrito

Muchos parásitos inducen en la mayoría de sus hospedadores evoluciones benignas o

subclínicas de la enfermedad. En tales condiciones, la parasitemia es baja y la

Identificación del parásito difícil. Ello hace indispensable la aplicación de técnicas de

concentración de parásitos como la diseñada por Woo

Materiales:

Capilares heparinizados

Plastilina

Microscopio

Microcentrifuga

47

Procedimiento

1. Llene ¾ partes (aproximadamente 70 μl) de un tubo capilar heparinizado con sangre.

2. Selle uno de los extremos del tubo capilar con plastilina.

3. Coloque el capilar en la centrífuga y centrifugue a 10000 rpm durante 5 minutos

4. Coloque el capilar en microscopio y examine la franja que separa el plasma de la

zona leucocitaria(franja blancuzca), en esta zona se deben encontrar los tripanosomas.

Plasma Zona en la que debe observar. Plastilina

e.Concentración de STROUT Esta técnica se basa en la concentración de los parásitos en la muestra sanguínea por centrifugación y examen del sedimento al microscopio en busca de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi. Es una técnica simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas y en el seguimiento de congénitos. El suero se debe conservar para ser examinado por técnicas inmunológicas. Equipos y materiales

- Microscopio. - Centrífuga. - Jeringa hipodérmicas estéril o sistema de tubos al vacío sin anticoagulante. - Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. - Tubos de centrífuga. - Láminas portaobjetos. - Laminillas cubreobjetos. - Asas microbiológicas.

Procedimiento

1. Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante 2. Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule. 3. Separar el suero. 4. Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para descartar los

glóbulos rojos. 5. Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm), durante

diez minutos. 6. Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 ºC para el análisis serológico. 7. Colocar una alícuota del sedimento obtenido en una lámina portaobjetos. 8. Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura.

Lectura Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi, con objetivos de 10X ó 40X de aumento. Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca de formas móviles del parásito.

48

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias Amastigote Tripomastigote


Metodo : ……………………………..


Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Cinetoplasto : ………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….

Flagelo : …………………………………………


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

49


Cuestionario:

1.- ¿Cómo se manifiesta el mal de chagas en el humano? 2.- ¿Cuál son otros reservorios del tripanosoma cruzi? 3.- ¿Esquematicé el ciclo de vida del tripanosoma cruzi? 4.- ¿En qué forma se encuentra el tripanosoma Cruzi en la sangre humana? 5.- ¿En que forma se encuentra el tripanosoma cruzi en la vinchuca o chinche? 6.- ¿En que consiste el xenodiagnostico explique? 7.- Esquematicé el ciclo de vida de leishmania 8.- ¿En qué forma se encuentra la leishmania en el humano? 5.- ¿En que forma se encuentra la leishmania en el vector?

50

PRACTICA Nº 5. OBSERVACION DE CILIADOS

Balantidium coli


Trofozoito Quiste


Método : …………………………….. Aumento : …………x Aumento : …………x

Tamaño : ……………………………...……

Forma : …………………...………….……..

Macroúcleo : ……………………………….

Micronucleo: ………………………………..

Otras caracteristicas : …………………….…

………………………………………………

………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ……………………………...……

Forma : …………………...………….……..

Macroúcleo : ……………………………….

Micronucleo: ………………………………..

Otras caracteristicas : …………………….…

………………………………………………

………………………………………………

…………………………………………………

51

Cuestionario:

1.- ¿Que región del cuerpo humano invade el Balantidium coli?

2.- ¿Cuál es la vía de entrada para el ser humano y cuál es la fase infectante del ciliado?

3.- ¿Cuáles son las manifestaciones clínicas más frecuentes de la Balantidiosis?

4.- Esquematicé el ciclo de vida del Balantidium coli

52

PRACTICA Nº 6. OBSERVACION DE HEMOPARASITOS II – PLASMODIUM

EXTENSIÓN DE SANGRE ( FROTIS)

Materiales:

Laminas Portaobjetos

Microscopio

Solución de Giemsa Procedimiento:

1. Coloque una gota de sangre sobre una lámina portaobjetos.

2. Tomar una segunda lámina del laminero y colocar sobre la primera en ángulo de 45°, por delante de la gota de sangre pero contactando con ella. Dejar que se extienda sin que llegue a los bordes e iniciar un movimiento suave y uniforme en dirección al dedo pulgar izquierdo, con lo cual se obtendrá el extendido. El extendido debe tener unos 35 milímetros de largo por 20 mm. de ancho aproximadamente.

3. Inmediatamente de realizado el extendido, agitar al aire, para obtener una rápida desecación de la sangre y evitar la deformación de los glóbulos rojos. Por este motivo es necesario obtener el extendido antes que la gota gruesa.

Fijación de extendido Tiene por finalidad conservar la morfología de los elementos celulares y por lo tanto, poder realizar el diagnóstico de especie del parásito 1. Colocar sobre el extendido unas gotas de alcohol metílico y dejar actuar por 2 minutos cuando el extendido tiene 24 horas ó más de haber sido tomado y por 30 segundos si es reciente. 2. Quitar el exceso de alcohol metílico, inclinando la lámina en dirección contraria a la gota gruesa para evitar que se ponga en contacto con ella y la fije. 3. Colocar la lámina en el porta-lámina con la gota gruesa hacia arriba y dejar que se seque al aire.

53

SEMIEXTENSIÓN DE SANGRE (GOTA GRUESA)

1. Se coloca una gota grande de sangre sobre un portaobjetos y utilizando el borde de

otro portaobjetos, se extiende sobre un área circular de unos 2 cm de

diámetro.

Deshemoglobinización Tiene por finalidad romper los glóbulos rojos, extraer la hemoglobina y evidenciar los

parásitos maláricos que pueden estar dentro de ellos y que queden adheridos a la

lámina.

1. Colocar en un vaso de precipitado de 50 ml solución buffer pH 7.2 en cantidad suficiente para cubrir la gota gruesa.

2. Introducir la lámina con la gota gruesa hacia abajo, verticalmente, para que quede completamente cubierta por el buffer pero sin llegar al extendido.

3. Deshemoglobinizar durante 5 minutos; si la gota gruesa es de reciente recolección, menos de 24 horas, se omite este proceso. Puede necesitarse más tiempo para lograr la deshemoglobinización completa, si tiene más de 24 horas de recolección.

4. Sacar la lámina y dejarla secar en el porta-láminas.

55

Coloración Luego de fijado el extendido, y deshemoglobinizada la gota gruesa, se procede a la coloración con la finalidad de diferenciar las distintas especies de parásitos maláricos y los demás elementos celulares de acuerdo a la afinidad por el colorante (Giemsa). El colorante Giemsa debe prepararse en el momento de usarlo, de la siguiente manera:

Colorante Giemsa............................................................... 3 gotas Buffer pH 7.2....................................................................... 1 ml

Esta solución, debe prepararse en un vaso de precipitado previamente lavado con agua destilada y seco, de la siguiente manera: con un gotero se toman 20 gotas de buffer pH 7.2 o se mide 1 ml con pipeta (1 ml equivale a 20 gotas) y se colocan en el vaso de precipitado, se le agregan 3 gotas de colorante Giemsa, que se tomarán con un gotero totalmente seco. Agitar suavemente el vaso de precipitado hasta completar la dilución. Si se agita fuertemente, se puede producir la precipitación del colorante.

Coloración Sucesiva Primero se colorea la gota gruesa, si está positiva a malaria, se colorea el extendido.

1. Medir con una pipeta graduada 2 ml de buffer pH 7.2 y añadir 6 gotas de colorante.

2. Agitar suavemente para evitar la precipitación del colorante. 3. Colocar la lámina en la bandeja de coloración y cubrir la gota gruesa y se

deja actuar el colorante por un tiempo de 20 minutos. 4. Terminando el tiempo, lavar con buffer pH 7.2. 5. Dejar secar la lámina en el porta-lámina.

Coloración Simultánea

Se colorea la gota gruesa y extendido al mismo tiempo; se utilizan 5 ml de buffer pH 7.2 para cubrir una lámina.

1. Se prepara la dilución del colorante de la misma forma, dicha anteriormente (3 gotas de colorante y 1 ml de buffer pH 7.2; para 5 ml se toman 15 gotas de colorante. Agitar suavemente. 2. Cubrir totalmente el extendido y la gota gruesa, con la solución colorante y dejar actuar por 20 minutos. 3. Lavar con buffer pH 7.2 estando la lámina en posición horizontal en el

soporte sobre la cubeta, para impedir que se deposite sobre la lámina, una fina película metálica, que flota sobre la disolución del Giemsa. Después puede continuarse el lavado con la lámina en posición inclinada, hasta que el agua del lavado no arrastre color.

4. Dejar secar.

56

Examen microscópico de la gota gruesa El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscópicos óptimos a un aumento final de 1000 X, con lente de inmersión. Una lámina puede declararse como negativa, sólo después de observar 100 campos microscópicos sin haber encontrado parásitos. Si se encuentran parásitos, deben examinarse también los 100 campos microscópicos; esto asegura detectar la posibilidad de infección mixta (más de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parásitos.

Procedimiento 1. Verificar el número de la lámina que va examinar en la hoja de registro de datos. 2. Colocar la lámina entre los soportes de la platina mecánica y verificar que esté sostenida firmemente al momento de mover el carro, de lo contrario se pueden perder de vista objetos sospechosos antes de que puedan ser ubicados. 3. Examinar la gota gruesa completa con el objetivo de 10X, hasta localizar una zona conveniente para la búsqueda de los parásitos (que se observen leucocitos numerosos y bien coloreados). 4. Colocar aceite de inmersión sobre la zona seleccionada de la gota gruesa y girar el objetivo de 100X hasta ponerlo en posición sobre ella. 5. Bajar el objetivo hasta ponerlo en contacto con el aceite de inmersión. 6. Verificar que la parte seleccionada de la lámina sea óptima (leucocitos de 10 a 20 por campo microscópico). 7. Examinar 100 campos. Desplazar la lámina que contiene la muestra de sangre siguiendo el patrón mostrado. Recuerde usar el ajuste fino para enfocar, accionando el tornillo micrométrico hacia delante y atrás, con el fin de observar el mayor número posible de capas sanguíneas. 8. Anotar el número de parásitos observados y la especie a la que pertenecen (si le fue posible identificarla).

OTRA TECNICA DE COLORACION 1. Preparar en un tubo de ensayo una solución con una proporción de 1:9 con

Giemsa y tampón PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). 2. Sumergir la muestra de forma vertical en la solución preparada durante 10

minutos. 3. Tras la tinción, el portaobjetos se lava suavemente con agua corriente y se

observa al microscopio, usando para ello el objetivo de inmersión de 100X. Es fácil reconocer a los hemoparasitos por su morfología general.

57

Examen microscópico del extendido de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observación en comparación con la gota gruesa, debido a que la concentración de los elementos sanguíneos es mucho menor. Se debe realizar en las siguientes circunstancias:

a. Cuando no es posible examinar la gota gruesa por alguna razón (Ejemplo: por ser muy pequeña). b. Cuando no es posible identificar en la gota gruesa la(s) especie(s) de Plasmodium.

El aspecto que debe presentar esta preparación al microscopio debe ser: a. Fondo limpio y libre de residuos los eritrocitos deben estar teñidos de color rosa pálido. b. El núcleo de los leucocitos, de color morado oscuro y gránulos bien definidos. c. Los gránulos de Schüffner deben verse como un moteado en los eritrocitos que contienen P. vivax. d. La cromatina de los plasmodios se tiñe de color rojo grosella intenso y el citoplasma de azul violáceo o azul cielo.

Procedimiento 1. Colocar la lámina sobre la platina mecánica entre los soportes de esta.

2. Enfocar con el objetivo de 10X el extremo menos denso del frotis, donde los glóbulos

rojos estén dispuestos en una sola capa.

3. Bajar el objetivo de inmersión hasta poner en contacto con el aceite de inmersión.

4. Enfocar y examinar la película de sangre siguiendo el patrón mostrado.

5. Examinar el mayor número de campos microscópicos (300) para determinar si la

muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnóstico es dudoso

deberá examinar de 400 a 500 campos microscópicos

58

Determinacion de parasitemia

Método a partir de Gota gruesa: Sistema de cruces recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), Metodo a partir de Gota gruesa y Extendido fino (frotis) : método semicuantitativo que permite estimar la parasitemia y que se informa como número de parasitos en 100 leucocitos (gota gruesa) o porcentaje de eritrocitos parasitados (extendido fino). El cálculo inicial se puede traducir a número de parásitos por microlitro (ul) de sangre, unidad estandarizada que permite comparaciones.

Sistema de cruces La estimación de la parasitemia se debe realizar con la observación de 100 campos microscópicos. En el Cuadro siguiente se describe la densidad parasitaria correspondiente al sistema de cruces.

Sistema semicuantitativo Gota Gruesa: Se cuentan leucocitos y parásitos simultáneamente. El conteo se detiene cuando se llega a 100 leucocitos y se han identificado dos o más parásitos.

Por ejemplo 40 parásitos en 100 leucocitos. Si solamente se identificó un parásito, el conteo sigue hasta que se identifica un parásito más y se informa como tal, por ejemplo, "2 parásitos en 320 leucocitos". Si no se identifican más parásitos, el conteo se detiene en 500 leucocitos y la densidad se informa como "1 parásito en 500 leucocitos".

59

Extendido Fino: Se localiza una porción del extendido en que los campos contengan cantidades similares de eritrocitos y se cuenta el número de eritrocitos en un campo. Luego se cuentan simultáneamente eritrocitos parasitados y campos, hasta llegar a un número de campos equivalentes a 10,000 eritrocitos. Los eritrocitos infectados por más de un parásito se cuentan como uno.

Por ejemplo, si el área escogida contiene 280 eritrocitos por campo, se deben contar los parásitos presentes en 36 campos. Si el conteo arroja un resultado de 40 parásitos en 10,000 eritrocitos, la parasitemia se informa como 0.4%. Una parasitemia de 1% es una densidad parasitaria elevada. Densidad parasitaria estimada por microlitro de sangre Se debe disponer de conteo de eritrocitos y de leucocitos. Si no se cuenta con un hemograma, se asumen concentraciones constantes de 5,000,000 eritrocitos/ul y 8,000 leucocitos/ul de sangre.

Gota Gruesa: si se contaron 40 parásitos en 100 leucocitos, entonces 40 x 8000/100 = 3,200 parásitos/ul de sangre. Extendido fino: Si se estimó una parasitemia de 0.4%, entonces 0.4 x 5,000,000/100 = 20,000 parásitos/ul de sangre.

60


Plasmodium vivax

TROFOZOITO

Tamaño : …………………………………………..……

Forma : …………………………………….…………..

Otras caracteristicas : …………………………….……

…………………………………………………….……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

ESQUIZONTE

Tamaño : …………………………………………..……

Forma : ………………………………….….…………..

Esporoquiste.: ……….…………………………….……

Esporozoitos :…………………………………….……

Otras caracteristicas……………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

ESQUIZONTE

Tamaño : …………………………………………..……

Merozoitos ………………………………….…………..


…………………………………………………….……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

GAMETOCITO

Tamaño : …………………………………………..……

Forma : …………………………………….…………..


…………………………………………………….……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

……………………………………………………..……

63

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ……………………………..

Aumento : …………x Aumento : …………x Aumento : …………x Aumento : …………x Aumento : …………x Aumento : …………x

64

Cuestionario 1.- Menciona las diferencias que existen en los diferentes tipos de plasmodium. 2.- Dibuja el ciclo vital del plasmodium 3.- ¿En qué etapa de la fiebre se debe obtener la muestra de sangre para el diagnóstico? 4.- Describe el método de diagnóstico de la malaria o paludismo

65

PRACTICA Nº 7. OBSERVACION DE COCCIDEOS INTESTINALES

Método Acido Resistente Modificado (KINYOUN) Se realiza para poner en evidencia por medio de una coloración, los ooquistes de Cryptosporídium spp. excretados por individuos infectados. Ooquistes de otros apicomplexa como Isospora belli, Cyclospora cayetanensis también pueden colorearse con este método. Muestra a examinar Heces frescas o fijadas en formalina al 10%, por lo general de pacientes con gastroenteritis, niños inmunonormales entre 0-5 años de edad y pacientes de cualquier edad que presenten diarrea crónica y deficiencia inmunológica por cualquier razón. En algunas circunstancias {personas con SIDA), puede utilizarse esputo, bilis, impronta de biopsia de mucosas. Reactivos

Carbol-fucsina

Fucsina básica 4 g

Etanol al 95% 20 mL

Fenol (líquido o cristales) 8 g

Agua destilada 100 mL Disolver los cristales de fucsina básica en el alcohol etílico, en un matraz de 250 mL de capacidad, agitar con una varilla de vidrio hasta disolución completa de la fucsina. Añadir el fenol, seguir mezclando y completar a 100 mL con agua destilada. Guardar en frasco tapado y rotulado. Solución lista para trabajar. Alcohol etílico al 50%

Alcohol etílico puro 50 mL

Agua destilada 50 mL Mezclar y guardar en frasco tapado y rotulado. Diferenciador. Solución de alcohol-ácido 3%

Ácido clorhídrico concentrado 3,00 mL

Etanol al 95% 97,00 mL Azul de metileno alcalino

Azul de metileno en cristales 0.3 g

Alcohol etílico al 95% 30 mL Mezclar hasta disolución de los cristales. Para alcalinizar, mezclar con 100 mL de solución acuosa de hidróxido de potasio (KOH) al 0.01%. Guardar en frasco tapado y rotulado. Solución lista para utilizar.

Materiales

Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm (3 X 1 pulgada)

Aplicadores de madera

Pipetas Pasteur con perilla

Metanol puro

66

Gasa quirúrgica en cuadrados o papel absorbente

Aceite de inmersión

Papel para limpiar lentes de microscopio

Procedimiento Identificar el porta-objetos con la muestra a examinar Heces formadas o blandas, sin moco: tomar una porción cualquiera de las heces con un aplicador y hacer un extendido fino en el tercio medio del porta-objetos. Dejar secar Heces diarreicas con moco: - tomar del moco para hacer el extendido fino.Dejar secar Heces líquidas: - si hay moco, tomar de éste para hacer un extendido fino. Si no hay, mezclar las heces con una pipeta Pasteur y tomar una pequeña cantidad para hacer un extendido fino sobre un portaobjetos. bien sin mezclar, aspirar una porción pequeña del sedimento y extender. Dejar secar Heces fijadas en formalina: al 10% mezclar las heces y hacer un extendido fino sobre un porta-objetos. Dejar secar

1. Fijar con metanol puro 30 segundos. Dejar secar 2. Introducir en carbol fucsina 5 minutos 3. Enjuagar en agua corriente 4. Introducir en alcohol acido durante 8-10 segundos. Este es un paso crítico, por lo

que debe asegurarse del tiempo necesario según sus reactivos 5. Lavar en agua corriente por ambos lados, escurrir sobre gasa 6. Introducir en azul de metileno alcalino 1 minuto Lavar, dejar secar y observar al

microscopio óptico. 7. Para examinar la lámina, algunos autores recomiendan colocar una película muy

fina de aceite sobre la coloración para buscar ooquistes rápidamente con el objetivo 40 X. Una vez que se encuentren cuerpos parecidos a ooquistes teñidos, asegure el diagnóstico cambiando para el objetivo de inmersión.

Características de la coloración Los ooquistes de Cryptosporidium se tiñen de rojo brillante, que se destacan sobre un fondo azul en coloraciones adecuadas. Su tamaño (4-6 μm) y su forma redonda son uniformes. A menudo se observa una vacuola y un granulo denso dentro del ooquiste, otras veces no se observa esto. Se diferencian de levaduras porque estas son más pequeñas, redondas o alargadas, a veces se observa la gemación y se tiñen de azul oscuro denso o de rosado. Los ooquistes del. Isospora belli miden entre 18-25 μm, tienen forma de cigarro o de huso, el esporoblasto se colorea de rojo intenso, pero no siempre. Los ooquistes de C. cayetanensis miden de8-10 μm, son redondos, no se colorean uniforme ni intensamente, algunos permaneces sin color, su contenido aparece granuloso o no revela ninguno; en ocasiones la pared del ooquiste se observa arrugada. Observaciones La expulsión de ooquistes en pacientes infectados es intermitente, por lo que es necesario repetir el examen durante algunos días. La cantidad de ooquistes presente puede ser escasa, por lo que se hace necesario concentrar la muestra y colorear el concentrado ( método de Weber). Heces de cualquier consistencia pueden contener ooquistes, no solamente las diarreicas o líquidas. Guardar las láminas positivas, debidamente rotuladas, para referencia y control.

67


Isospora belli

Cryptosporidium parvum


OOQUISTE

Tamaño : ……………………………………..……

Forma : ………………………………….………..

Esporoquistes : ……………………………………

Esporozoitos :……………………………………..

Otras caracteristicas : ……………..........................

……………………………………………………..

…………………………………………………….

…………………………………………………….

…………………………………………………….

…………………………………………………….

………………………………………..……

……………………………………………………..

……

OOQUISTE

Tamaño : ……………………………………..……

Forma : ………………………………….………..

Esporozoitos :……………………………………..

Otras características : ……………..........................

……………………………………………………..

…………………………………………………….

…………………………………………………….

……………………………………………………..

……………………………………………………..

…………………………………………………….

…………………………………………………….

…………………………………………………….

68

Metodo : ……………………………..



Aumento : …………x Aumento : …………x Cuestionario

69

1. ¿Cuál es la fase de Isospora belli en el ser humano?

2. ¿Cuál es la vía de infección de Isospora belli?

3. ¿Qué técnica se emplea para el diagnóstico de la Isosporiosis?

4. Esquematice ciclo biológico de Isospora Belli

5. ¿Cuál es la fase del Criptosporidium parvum en el ser humano?

6. ¿Cuál es la vía de infección de Criptosporidium parvum?

7. ¿Qué técnica se emplea para el diagnóstico de la Criptosporidium parvum?

8. Esquematice ciclo biológico de Criptosporidium parvum

9. Realice un cuadro de diferencias de las Coccideas intestinales

71

PRACTICA Nº 8. OBSERVACION DE ASCARIS LUMBRICOIDES


HUEVO GRAVIDO ( FERTIL ) –

MAMELONADO ( CORTICADO )

Tamaño : …………………………………………..

Forma :……………………………………………..

Cubiertas ( capas ) : …………………………….….

………………………………………………….…..

……………………………………………………...

……………………………………………………..

Otras características : ………………………………

……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

HUEVO INGRAVIDO ( INFERTIL ) –

MAMELONADO ( CORTICADO )

Tamaño : …………………………………………..

Forma :……………………………………………..

Cubiertas ( capas ) : …………………………….….

………………………………………………….…..

……………………………………………………...


……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

HUEVO LARVADO

Tamaño : …………………………………………..

Forma :……………………………………………..

Cubiertas ( capas ) : …………………………….….

………………………………………………….…..

……………………………………………………...


……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

72


Metodo : …………………………….. Aumento : …………x Aumento : …………x Aumento : …………x Aumento : …………x Cuestionario

1. Que es el ciclo de Looss ?

2. Dibuje un Ascaris adulto macho y hembra indicando sus partes

3. Esquematice el ciclo biológico de Ascaris lumbricoides

73

PRACTICA Nº 9 : OBSERVACION TRICHURIS TRICHIURA Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria


Metodo : ……………………………..


Cuestionario

1. Dibuje un Trichuris adulto macho y hembra indicando sus partes 2. Esquematice el ciclo biológico de Trichuris trichiura

HUEVO

Tamaño : …………………………………………..

Forma :……………………………………………..

Cubiertas ( capas ) : …………………………….….

………………………………………………….…..

……………………………………………………...


……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

……………………………………………………..

74

PRACTICA Nº 10. OBSERVACION DE UNCINARIAS

Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria


Metodo : ……………………………..


HUEVO

Tamaño : …………………………………………..………..

Forma :…………………………………………………..…..

Cubierta : ………………….……………..…….….…..…..

………………………………………………….…..…..…..

Otras características : …………………………………..…..

……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

75

Cuestionario

1. Esquematice ciclo biológico de Ancylostoma duodenale y Necator americanus

2. Realice un cuadro de diferencias entre Ancylostoma duodenale y Necator

americanus

3. Dibuje los huevos y región bucal de gusano adulto de Ancylostoma duodenale y

Necator americanus

76

STRONGYLOIDES STERCORALIS Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria


Metodo : ……………………………..


LARVA RHABDITOIDE

Tamaño : …………………………………………..………..

Forma :…………………………………………………..…..

Cubierta ( capas ) : ………………….………….….…..…..

………………………………………………….…..…..…..

……………………………………………………...…..…..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

77

Cuestionario

4. Esquematice ciclo biológico de Strongyloides stercoralis

5. Esquematice una larva rhabtiotoide y coloque sus partes

6. Esquematice una larva filariforme y coloque sus partes

78

PRACTICA Nº 11. OBSERVACION ENTEROBIUS VERMICULARIS

MÉTODO DE LA CINTA TRANSPARENTE ADHESIVA (TEST DE GRAHAM) Recobrar huevos de Taenia sp. o de Enterobius vermicularis de la región anal y perianal de individuos infectados. Hembras de E. vermicularis migran del ciego e intestino grueso a la región exterior del ano, adonde depositan huevos casi infectantes, razón por la cual casi nunca se ven en las heces. Los proglótidos grávidos de Taenia saginata y a veces de T. solium que se desprenden de la estróbila y fuerzan el esfínter anal, dejan rastros de huevos en la región perianal mientras tienen movimientos de extensión o retracción. Para diagnosticar infecciones por E. vermicularis, la cinta transparente adhesiva es el método indicado; para identificar individuos infectados con Taenia sp. este método, en combinación con otros métodos y la observación clínica, aumenta la probabilidad de diagnóstico. Preparación del paciente La toma de esta muestra es fácil de realizar aún por personas de poca preparación o analfabetas, siempre que se provea una explicación clara y sencilla. Para este o cualquier otro método que se utilice, la muestra debe tomarse antes que el paciente se lave, bañe o defeque, durante la noche o inmediatamente al levantarse por la mañana o en cualquier momento (Taenia) antes del examen.

NOTA: En ocasiones se pueden ver los gusanos adultos al separar los glúteos o sobre las heces a! defecar. Si esto sucede, deberán llevarse al laboratorio para la confirmación morfológica. Como instrucción a la madre, se le indica de recogerlos y colocarlos en alcohol o vinagre en un bote limpio y llevarlos al laboratorio.

Materiales

Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm

Baja-lenguas o palo de paleta

Cinta transparente adhesiva de 2 cm de ancho

Etiquetas

Xilol

Pipeta Pasteur y bulbo o perilla de goma

Frasco con desinfectante para descartar material Procedimiento

1. Colocar una tira de cinta transparente adhesiva sobre un porta-objetos limpio y seco, dejando un extremo doblado por debajo de la lámina y en el otro pegar una etiqueta y escribir la identificación del paciente

2. Al momento de tomar la muestra, pelar la cinta suavemente del porta-objetos, tomándola por la parte etiquetada.

3. Colocar el porta-objetos sobre un baja-lenguas o palo de paleta y doblar la cinta sobre un extremo de éste, con la parte adhesiva hacia fuera

4. Con el paciente en decúbito, apartar los glúteos con una mano y apretar la cinta adhesiva firmemente a un lado y otro de los pliegues perianales

5. Volver a colocar la cinta sobre el porta-objetos y descartar el baja-lenguas

79

6. La muestra puede transportarse o guardarse protegida, hasta el momento del examen.

7. Para examinar, desprender la cinta transparente hasta la parte expuesta agregar 1-2 gotas de xilol a la lámina y apretar de nuevo la cinta en su lugar. El xilol (puede ser tolueno) aclara la preparación, elimina las burbujas de aire y hace más visibles los huevos. Examinar inmediatamente al microscopio.

Características de los huevos de taenia y de enterobius vermicularis

- Los huevos de Taenia se reconocen por su forma redonda, de igual tamaño (31 a 43 μm), pero se ven café, densos y en unos pocos ejemplares se pueden visualizar los ganchos de la oncósfera. Utilizar mayor aumento para ver detalles.

- Los huevos de Enterobius vermicularis se observan de cáscara transparente, alargados u ovoides, con un lado más aplanado; tienen un embrión en su interior y miden entre 50-60 μm por 20-30 μm.

Resultados (observaciones):

80

Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria


Metodo : …………………………….. Aumento : …………x Aumento : …………x

Cuestionario

1. Esquematice el ciclo biológico de Enterobius vermicularis

2. Diferencias entre parasito adulto macho y hembra

HUEVO

Tamaño : …………………………………………..………..

Forma :…………………………………………………..…..

Cubierta : ………………….……………..…….….…..…..

………………………………………………….…..…..…..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

81

PRACTICA Nº12 .OBSERVACION DE CESTODES I

TENIA sp Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

HUEVO

Tamaño : …………………………………………..………..

Forma :…………………………………………………..…..

Cubierta : ………………….……………..…….….…..…..

………………………………………………….…..…..…..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

CISTICERCO

Tamaño : …………………………………………..………..

Forma :…………………………………………………..…..

Cubierta : ………………….……………..…….….…..…..

………………………………………………….…..…..…..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

Proglotide - Tenia ……..….. Proglotide - Tenia ………....

82


Metodo : ……………………………..


ESCOLEX –Tenia ……………..……..

Forma :…………………………………………………..…

Ganchos : ………………………………………….………

Ventosas :………………………………………….………..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

ESCOLEX –Tenia …………………….

Forma :…………………………………………………..…

Ganchos : ………………………………………….………

Ventosas :………………………………………….………..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

83

Cuestionario

1. Esquematice ciclo biológico de Tenia solium

2. Esquematice ciclo biológico de Tenia saginata

3. Realice un cuadro de diferencias de las dos tenias

4. Existe alguna diferencia entre huevos de estas dos tenias? ¿Cuáles son?

84

PRACTICA Nº13. OBSERVACION DE CESTODES II

Hymenolepis nana Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria

Escolex Proglotide


Metodo : ……………………………..


HUEVO

Tamaño : …………………………………………..………

Forma :…………………………………………………..…

Cubierta : ………………….……………..…….….…..…..

Otras características : …………………………………..….

……………………………………………………..…...….

……………………………………………………..……….

……………………………………………………..……….

85

Cuestionario

1. Esquematice ciclo biológico de Hymenolepis nana

2. Realice un cuadro de diferencias entre Hymenolepis nana y diminuta


86

PRACTICA Nº14 .OBSERVACION DE CESTODES III

Diphyllobothrium sp. Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria


Metodo : ……………………………..


HUEVO

Tamaño : …………………………………………..………..

Forma :…………………………………………………..…..

Cubierta : ………………….……………..…….….…..…..

………………………………………………….…..…..…..


……………………………………………………..…...…..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

……………………………………………………..………..

87

Cuestionario

1. Esquematice ciclo biológico Diphyllobothrium sp.

2. Realice un cuadro de diferencias entre Diphyllobothrium latum y pacificum


88

PRACTICA Nº15 .OBSERVACION DE TREMATODES

Fasciola hepatica

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias Huevo Adulto


Metodo : ……………………………..


1.

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

Tamaño : ………………………………………

Forma : ………………………………………..

Núcleo : ……………………………………….


…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

90

PRACTICA Nº16 . OBSERVACION DE INSECTOS DE IMPORTANCIA MEDICA

Material necesario

Insectos

Lupa binocular.

Objeto de la práctica

Estudio de los insectos: Artrópodos, antenados con el cuerpo dividido en cabeza, tórax y

abdomen, con tres pares de patas.

Se pretende que los alumnos observen y dibujen las características que son comunes a

todos los insectos de interés medico. Además pueden observar las características que

diferencian a los principales órdenes.

Desarrollo de la práctica:

1. Cada alumno aporta un pequeño insecto (mosca, avispa, pulga, etc.), deben

observarlo a la lupa, dibujarlo y clasificarlo.

2. Con las caracteristicas de insectos deben localizar un ejemplo de cada uno de los

siguientes órdenes y clasificarlo asi como describir sus características.

Coloque las partes de los siguientes insectos

Anopheles sp.

Características : ……………………..……………

………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……

91

Musca domestica

Periplaneta americana

Pulex irritans


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

92

Sarcoptes scabiei

Pediculus humanus

Phthirus pubis


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

93

Demodex folliculorum

Triatoma infestans


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……


………………………………………………….…

………………………………………………….…

…………………………………………….………

…………………………………………….………

………………………………………………….…

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

……………………………………………….……

94

PRACTICA Nº17 .EXAMEN COPROFUNCIONAL

El examen coprológico funcional es un conjunto de pruebas que brindan información oportuna y de fácil acceso sobre la fisiopatologia digestiva, especialmente dirigida a patologías relacionadas con: pérdida de peso, diarreas crónicas, desnutrición – malnutrición, pancreopatias, procesos inflamatorios intestinales, anemia macro - microcíticas y hemorragias

Las heces tienden a ser blandas y voluminosas cuando se sigue una dieta alta en vegetales, escasa y seca con comidas en que se ingiere mucha carne. El 75% del contenido de las heces es agua mientras que el 25% restante es materia fecal. El 30% de este 25% va a ser de desechos celulares y bacterianos. Entre un 30 y un 50% dependiendo de la dieta va a ser de residuos de esta, aproximadamente entre un 10 y 15% va a ser grasa y el 5% restante va a estar formado por sustancias inorgánicas, principalmente fosfatos y carbonatos El estudio coprofuncional muestras fecales de origen humano, permite obtener datos que nos sirve para determinar:

1.- La situación del funcionalismo digestivo. 2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos. 3.- Infecciones causadas por parásitos intestinales.

La prueba se realiza en tres fases:

La fase Macroscópica consiste en reportar las características físicas u organolepticasde la muestra (forma, consistencia, color, aspecto, presencia de sangre o moco)

La fase Química consiste en analizar varios parámetros como el pH, sustancias reductoras, sangre oculta, grasas, entre otras.

La fase Microscópica, la muestra es analizada para identificar y cuantificar células inflamatorias (leucocitos), bacterias, hongos, el tipo de fibras que predominan como producto del metabolismo del aparato digestivo u otros elementos anormales que pueden estar presentes en la muestra

ALIMENTACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS Se debe seguir con el régimen habitual de comidas, pero hay que añadir aquellos elementos que nos pueden suministrar una base para el diagnóstico, como son:

Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe comerse lo más cruda posible…..cuidado con este dato

Patatas: Se investiga la digestión de almidón.

Grasa: Se tomará en forma de leche, mantequilla o carne. Este plan se sigue durante 3 días y luego se recoge la muestra de heces.

95

Se le pide al paciente que lleve al laboratorio una muestra de heces (debe ser una evacuación completa), con una dieta mínimo de tres días sin ingerir carnes rojas y sus derivados (chorizos, embutidos, etc.), antes de su estudio.

NO COMER: coliflor, pepinos betabel, melón y toronja.

RECOLECCIÓN DE MUESTRA

Recibir la deposición en un recipiente limpio; no es necesaria la esterilidad., evitando que

se contamine con orina. Escoger una porción característica de las heces (con moco o

sangre si hubiese) y colectar con una espátula aproximadamente una muestra equivalente

a 1/4 del frasco (no lo llene). Coloque en cada etiqueta su nombre completo, fecha y hora

de la obtención.

Muestras No Adecuadas

*Muestras con mas de 2 horas de haber sido obtenidas.

*Muestras obtenidas del inodoro.

*Muestras en cantidad insuficiente o excesiva.

*Muestras contaminadas con orina

Las muestras inadecuadas no serán analizadas y se solicitará una nueva muestra.

MATERIALES

- Portaobjetos.

- Cubreobjetos.

- Tubos de ensayo.

- Gradillas

- Pinzas

- Bajalenguas

- Mechero

- Ácido acético al 10%.

- Kit reacción de thevenon

- Reactivo benedict

- Lugol

- Tiras reactivas para medir Ph

- Agua destilada

- Microscopio.

96

PROCEDIMIENTO

EXAMEN MACROSCOPICO ( ORGANOLÉPTICO )

OLOR:Tiene un olor en particular debido a ciertos productos aromáticos originados en

el intestino por la acción de microorganismos de fermentación o de putrefacción que

actúan sobre hidratos de carbono y proteínas. El escatol (3-metil-indol), es químicamente

muy similar al indol y es otro de los constituyentes de las fermentaciones intestinales

que le dan a las heces su olor característico.

a) Fecaloide. normal.

b) Pútrido (olor a amoniaco). Debido a la flora proteolítica aumentada. Provoca

diarreas de putrefacción (heces alcalinas y gases).

c) Agrio penetrante o rancio Debido a la flora sacarolítica aumentada. Provoca

diarreas de fermentación (heces ácidas y gases).

d) Nauseabundo . Debido a la descomposición de tejidos, ocasionada por carcinoma,

úlceras.

COLOR: La coloración parda habitual se deben a urobilina y estercobilina, el color es

según la alimentación.

a) Marrón: Es el color habitual.

b) Verde: Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la presencia

de biliverdina (rapidez del tránsito intestinal, diarreas infantiles).

c) Rojo: Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias próximas al

ano.

d) Negro: Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos

e) (carbón, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas, melenas).

f) Blanco - grisáceo. : Debido a la ingesta (leche, bario -peptobismol, caolín...) o a la

ausencia de bilis fundamentalmente. (ictericias obstructivas, hepatitis)

g) Amarillo: Debido a la ingesta (régimen lácteo - Lactantes) o a diarreas de

fermentación hidrocarbonada (ingesta de Pan o papas), también pueden indicar

que el paciente sufre una infección conocida como giardiasis. Síndrome de Gilbert.

Esta enfermedad está condicionada por brotes de ictericia y de hiperbilirubinemia y

ocurre cuando hay un exceso de bilirrubina en la sangre.

h) Castaño oscuro “café”: Ingesta de carnes

97

CONSISTENCIA: Normalmente es pastosa-dura. Puede modificarse en distintas

circunstancias.

En las diarreas la consistencia es líquida, en cantidad abundante cuando se

deben a patología intestino delgado y escaso y mucosas si proceden del

intestino grueso.

Las deposiciones semiblandas indican un tránsito rápido por el intestino

delgado o son propias de las afecciones pancreáticas o biliares.

En el estreñimiento son duras, en forma de grandes bolos en la atonía, y

acintadas en las obstrucciones mecánicas.

Las deposiciones caprinas son propias de los estados espásticos acentuados.

CONSISTENCIA RELACIONADA CON:

Agua de arroz Cólera

Puré de lentejas Tifoidea

Papilla Insuficiencia gástrica

Pegajosa Esteatorrea origen biliar, pancreático

Pegajosa oscura Melenas

Pastosa espumosa Dispepsia (Indigestion)

Restos gruesos de alimentos Insuficiencia pancreática

En los seres humanos la primera vez que los bebés vacían su intestino echan unas deposiciones, espesas y pegajosas que se denominan MECONIO. El meconio es de color verde oscuro a negro compuesta por células muertas y secreciones del estómago e hígado, que reviste el intestino del recién nacido. Su formación comienza en el periodo fetal. El término meconio, deriva de la palabra griega mekoni, que significa jugo adormecedor u opio. Desde que Aristóteles observara una relación entre la tinción por meconio del líquido amniótico y un estado de sueño fetal o la depresión neonatal, los obstetras se han interesado por el bienestar del feto cuando se presenta meconio en el líquido amniótico. A veces, las parturientas al romper aguas, observan la presencia de meconio en el líquido amniótico. Esto es síntoma de que el bebé tiene dificultades antes del parto. El meconio se expulsa durante las primeras 24 horas de vida, gracias a la acción laxante del calostro, pero puede tardar hasta 48 horas en ser expulsado por el bebé. Después las deposiciones serán más sólidas y de color amarillo. Si el bebé no realiza sus deposiciones tras ese periodo, debe acudir urgentemente a su pediatra para su valoración

http://es.wikipedia.org/wiki/Humano

http://es.wikipedia.org/wiki/Intestino

http://es.wikipedia.org/wiki/Meconio

http://es.wikipedia.org/wiki/Jugo

http://es.wikipedia.org/wiki/Opio

http://es.wikipedia.org/wiki/Arist%C3%B3teles

http://es.wikipedia.org/wiki/Sue%C3%B1o

http://es.wikipedia.org/wiki/Obstetra

http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADquido_amni%C3%B3tico

http://es.wikipedia.org/wiki/Horas

http://es.wikipedia.org/wiki/Calostro

98

FORMA: Varía con la consistencia

a) Cilíndrica: Es la normal. La superficie presenta depresiones y relieves, b) Laminada o en cinta: Debido a papilomas. c) Bolitas secas y duras: Estreñimiento. d) Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis. e) Bola maleable del tamaño de un puño: Se presenta en la atonía del recto (personas ancianas).

MUCUS: Su presencia en las heces es propia de los estados inflamatorios del intestino

principalmente el colon. (enteritis y colitis), pero también se presenta en los estados

espásticos, aún sin Inflamación. La presencia de mucus es indicio de irritación compatible

con la existencia de un parasitismo.

El procedimiento es utilizar un aplicador de madera para buscar la presencia de mucus

en la muestra.

Mezclado con las heces, aspecto brillante procede del intestino delgado.

Moco visible proviene del colon.

Transparente: como catarro alérgico (colon irritable), estrés.

Opaco con células epiteliales: proceso inflamatorio agudo.

Mocó sanguinolento: neoplasma, amebas o bactérias.

Mocó sanguinolento y pus: colitis ulcerosa, carcinoma, desinteria basilar, diverticulitis aguda o tubérculos intestinales.

La presencia de moco es importante, salvo en los recién nacidos, y siempre deberá resaltarse en el informe.

Resultados: Se expresa en (+), (++), (+++).

Para distinguir entre tejido conjuntivo y moco se agregan unas gotas de Ácido acético glacial 1:3, y se observa al microscopio, colocando en un portaobjetos con una pipeta de pasteur una gota de la dilución y cubriendo con un cubreobjetos; el tejido conjuntivo se aclara, mientras que el moco se hace más compacto.

99

EXAMEN FÍSICO-QUÍMICO pH

La apreciación de la reacción de las heces se hace con papeles indicadores de pH. El valor normal es de 6.9 a 7.2, Varía dependiendo del régimen alimenticio. no es valida la determinación si el paciente está en tratamiento con antibióticos orales. El pH de las heces es un dato orientador sobretodo en diarreas infantiles, cuando es ácido es de origen bacteriano. El pH fecal depende en parte de la fermentación de los azúcares. La fermentación en el colon de una cantidad normal de carbohidratos y de producción de ácidos grasos explica un pH normal ligeramente acidificado. Si se sospecha intolerancia a los disacáridos, se realiza un simple test de screening

Se emplea una tira de papel indicador universal, sobre el cual se aplica una pequeña

cantidad de materia fecal, se espera unos minutos y se compara con la escala de colores.

Se van a modificar según el proceso digestivo.

pH ácidos indican EDA de tipo BACTERIANO y viral.

pH alcalinos indican EDA invasivas.

pH ligeramente alcalinos, se dan en casos de diarreas secretorias sin

ingesta de alimentos, colitis, adenoma velloso, y posiblemente con el uso de

antibióticos.

Un pH fecal menor de 6.0 es evidencia sugestiva de malabsorción de

azúcares. En niños y en algunos adultos se nota que sus heces tienen un olor dulce

como resultado de ácidos grasos volátiles y la presencia de intolerancia a la lactosa.

pH fecales bajos también contribuyen a escoriaciones de la piel de la región

perianal, frecuentemente acompañadas de diarrea. La determinación de sustancias

reductoras en la materia fecal es un test más confiable la deficiencia de

disacaridasa.

Un pH fecal alto puede ser un factor de riesgo de cáncer colo-rectal. La

ingesta de cereales con fibra (75-100g/días x 14 días) demuestra la capacidad de

reducir el pH fecal en 0,4 unidades. Sin embargo, esto significa que un pH alto se

relaciona en segunda instancia con el riesgo de cáncer.

100

SANGRE OCULTA

También se llama este análisis investigación de hemorragias ocultas. Se puede observar sangre en heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o hemorroides. Esto no se considera importante. Cuando proviene de hemorragias gástricas, duodenales, cáncer de colon, etc., la sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si es importante. Para este análisis es importantísimo que el paciente durante los 2-3 días anteriores a la toma de muestras se someta a un régimen riguroso (“blanco”), sin carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, plátanos etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deberá tomar medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar pérdidas sanguíneas como salicilatos o esteroides. La alimentación permitida consiste en: Huevos, patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche. La mayoría de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinación de peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina.

a. THEVENON

PRUEBA EN PAPEL FILTRO

4. Sobre un papel de filtro manchado de heces y unas gotas de acido acetico, 5. Se ponen unas gotas de piramidon ,disolución etanólica y 6. Se agregan unas gotas de agua oxigenada de 10 volúmenes. 7. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se

formará un halo de color morado en torno a la mancha PRUEBA EN TUBO

1. Con una varilla de vidrio se colocan en un tubo de ensayo heces del tamaño de un maiz

2. Se agregan 2 ml de agua destilada y 2ml de acido acetico al 50 % y 1 ml de agua oxigenada, adicionando por zona 5 gotas de Agua Oxigenada (3%)

3. La presencia de sangre se pone de manifiesto por un halo de color violeta .

101

b. REACCIÓN DE LA BENCIDINA: Sobre un papel de filtro manchado de heces, se

ponen unas gotas de bencidina y agua oxigenada de 10 volúmenes. Si el resultado

es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formará un halo de color

verde-azulado en torno a la mancha.

c. REACCIÓN DE WEBER O DEL GUAYACO: La prueba es igual que la anterior

pero en lugar de poner bencidina se pone guayaco. La reacción es la siguiente:

HEMOGLOBINA + H2O2 Þ H2O + O2

BENCIDINA O2 + o Þ Color Azul-verdoso

d. PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO: No se basa en la peroxidasa: Tiene más

sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la capacidad del Cr

radioactivo (Cr51) para ser fijado por los hematíes y por el hecho de no ser

reabsorbido en el tracto gastrointestinal. Así pues, es excretado por las heces en

las que puede ser medido por espectrofotometría de rayos.

e. HEMA SCREEN TEST. La prueba se realiza empleando el TEST de Hema Screen, es una prueba en placa para la detección cualitativa de sangre oculta. El Hema Screen está compuesto de un papel impregnado de guaiaco encerrado en una tarjeta, con lo que se permite la aplicación de la muestra en un lado y el desarrollo e interpretación al reverso.

El Hema Screen, está basado en la oxidación de los compuestos fenoliticos presentes en el guanaco con la producción de compuestos quinonas de color azul. Debido a su similitud con los grupos proteicos de la peroxidasa, la porción hematina de la molécula de hemoglobina puede funcionar en una manera pseudoenzimática, catalizando la oxidación del guaiaco. Nota: La reacción de color ocurrirá después de 30 segundos. El Hema Sceen incluye un lado para el monitoreo, el cuál proporciona un sistema de control de calidad para cada prueba. Procedimiento

1. Abra la tapa frontal, utilizando un extremo del aplicador, colecte una pequeña cantidad de muestra. Aplique una capa muy delgada en la ventana 1.

2. Utilice el otro extremo del aplicador para obtener una segunda muestra a partir de una porción diferente de la muestra de heces. Aplicar una capa muy delgada en la ventana 2.

3. Permitir que las muestras se sequen al aire, después cierre la cubierta. 4. Habrá la ventana perforada en la parte trasera de la placa.

102

5. Aplicar dos gotas de revelador Hema Screen en la parte trasera de las ventanas 1 y 2.

6. lea el resultado después de 30 segundos y antes de 2 minutos. 7. Registre los resultados cualquier traza de color azul, dentro o fuera del

margen de la muestra, indica un resultado positivo para sangre oculta.

POSITIVO : INDICA UN COLOR AZÙL NEGATIVO : UN COLOR INCOLORO

Fuentes de error

Falsos positivos: la peroxidasa de frutas y vegetales crudos.

Falsos negativos: la ingestión de ac. Ascórbico (Vit. C) en altas dosis.

Nota: Los medicamentos orales (como aspirina. Indometacina, reserpina, fenilbutazona, corticosteroides), y el consumo fuerte de alcohol puede causar irritación o sangrado del tracto intestinal y deben ser descontinuados por siete días antes y durante el periodo de la prueba.

Resultados y valores de referencia. Todos los parámetros del estudio de Coprológico funcional se reportan en cruces siempre y cuando sea positivo, de acuerdo a la siguiente tabla y criterio del analista.

AZUCARES REDUCTORES a. TEST DE BENEDICT

Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar más de una hora desde que

son emitidas hasta que se realiza el examen.

1. Con una varilla de vidrio se colocan en un tubo de ensayo heces del tamaño de un maiz 1 gramo de heces (pastoso).

2. Se agregan 2 ml de agua destilada se homogeneiza 3. Se agrega 2ml de reactivo de benedict 4. Se somete al calor hasta la ebullición. Moviendo el tubo lentamente. 5. Dejar en reposo y evaluar en cruces.

CRITERIO CRUCES

ABUNDANTE 4

MODERADO 3 a 2

ESCASO 1

103

Azul verdoso: vestigio o trazas.

Amarillo verdoso: (+).

Amarillo intenso: (++).

Naranja ladrillo: (+++).

b. CLINITEST,

104

La determinación de cuerpos reductores (lactosa o glucosa sacarosa, maltosa, etc.) en las heces. Se recogen las heces líquidas en un pañal de plástico, se hace una mezcla con 2 partes de agua y 1 de heces. Se toman 15 gotas de la mezcla en un tubo al que se añade un comprimido de clinitest. Cuando finaliza la reacción se compara el color con una escala contenida en dicho método y se valora la concentración de sustancias reductoras, según la coloración obtenida. Se considera anormal la presencia de 0,5% (dos cruces) o más.

Si sospechamos diarrea por sacarosa la prueba nos dará negativa, por lo que

debemos hacer otro tipo de prueba separando la fructosa y glucosa.

Nota: Las heces de los niños con intolerancia a los azucares son generalmente acuosas, y quienes tienen intolerancia a la lactosa, son generalmente ácidas. GRASAS

a. Metodo de Saathoff - cualitativo 1. Sudan III 2 gramos 2. Alcohol 96° 10 ml. 3. Ácido acético glacial 90 ml.

Se realiza una dilución de la muestra fecal con solución salina, se toma 1.0 ml. Más una gota de reactivo de Saathoff en un tubo de ensayo, se agita y se coloca una gota de la suspensión entre portaobjeto y cubreobjeto y se lee al microscopio, se observan gotas rojas, de 2 a 3 por campo son de grasas neutras y es normal. Más de 3 gotas por campo son patológicas. Lo cuál puede deberse a: Transito acelerado, deficiencia enzimática en absorción.

105

b. Reacción de azul de nilo para grasa fecal - cuantitativo

1. Diluir en un tubo de ensayo una porción de muestra con 9 volúmenes de agua.

2. Añadir:

1 ml. de esta suspensión fecal.

1 ml. de agua.

3 gotas de ClH al 10%.

3 gotas de Oxalato amónico saturado.

3. Calentar a ebullición durante unos segundos. Enfriar.

4. Echar el líquido en un vaso de precipitado.

5. Lavar el tubo de ensayo con 2,5 ml. de solución de CO3Na2 al 20% y añadirlos

al contenido del vasito.

6. Agregar 15 ml. de agua y 1 ml. de solución de Azul de Nilo (0,05% en agua)

dejando resbalar por las paredes.

7. Leer los resultados inmediatamente:

NEGATIVO: Rosado que vira a gris (aproximadamente < 7 g./día)

POSITIVO: Azul (aproximadamente > 7 g./día)

Cuando la reacción de azul de Nilo es negativa, la grasa fecal no excede

nunca de 5% en peso. Una reacción claramente positiva corresponde a más

del 5% de grasa.

c. Método de van de kamer - cuantitativo

Se separan los lípidos de las heces mediante tratamiento de estas con una solución

de hidróxido potásico alcohólico y que contenga pequeñas cantidades de alcohol

amílico. De ésta manera se produce la formación de jabones.

Posteriormente se hidrolizan los jabones con ClH y se convierten en ácidos grasos,

extrayéndose estos a continuación con éter de petróleo.

Por último se titulan los ácidos grasos con NaOH 0,1 N

Peso total de heces x Vol. cc. NaOH g. de grasa = Peso de la muestra

PIGMENTOS BILIARES

La presencia de bilirrubina y estercobilinógeno en heces mediante 2 métodos:

a) Prueba del Sublimado: Sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de

ensayo:

Dilución de heces.................................... 5 ml.

Sublimado (ClHg).................................... 5 ml.

Se agita y se incuba a 37oC durante 1 - 2 horas y se observan los resultados:

ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINÓGENO

VERDE............................ BILIRRUBINA.

BLANCO......................... Ausencia de Pigmentos.

106

b) Prueba de grigaut: Sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

ClH concentrado...................................... 5 ml.

Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas. (Tricloruro de monohierro)

Dilución de heces.................................... 5 ml.

Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados:

VERDE..................................... BILIRRUBINA.

ROJO........................................ ESTERCOBILINÓGENO.

Las 2 pruebas se hacen simultáneamente, debido a su diferente sensibilidad, y los

resultados se interpretan así:

SUBLIM GRIGA

ESTERCOBILINOGENO + + Heces normales

BILIRRUBINA + + Tránsito intestinal acelerado

ESTERCOBILINÓGENO + - Tránsito intes. medianamente acelerado

BILIRRUBINA - + - Obstrucción biliar

ENZIMAS PROTEOLÍTICAS

Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces normales

(hasta una dilución 1/100) licuan la gelatina.

La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100) de

la heces a estudiar de heces sobre una película de gelatina. Se considera un resultado

positivo si la gelatina queda disuelta en ½ hora.

Positivo hasta una dilución 1/100........................... Digestión normal.

Positivo hasta una dilución 1/50............................. Digestión media.

Positivo hasta una dilución 1/10..............................Digestión deficiente.

107

EXAMEN MICROSCOPICO (CITOLOGICO)

Nos aporta datos más fidedignos acerca de los trastornos de la digestión. Para ello habrá que instaurar la alimentación explicada anteriormente, si no se hace así la significación del estudio es muy limitada. Para este estudio se hace una suspensión de heces en suero fisiológico.

1. Se coge una cantidad de heces, del tamaño de una castaña, y se coloca en un mortero, copa, vaso de precipitado o tubo de ensayo. 2. Se añade agua o suero fisiológico y mezclar con una varilla hasta formar una papilla homogénea y fina, ni muy fluida ni muy espesa. 3. Se coloca una gota de esta suspensión en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa delgada, homogénea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el cubre. Se observará con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visión de conjunto, y luego se enfoca con el de x40 aumentos.

Cuando se trata de heces líquidas, se debe hacer una mezcla homogénea y se coloca una gota directamente al portaobjeto. a) LEUCOCITOS: Se mejora la observación agregando una gota de ácido acético al

10% (o líquido de turk), mas una gota de materia fecal, se realiza una suspensión

en un tubo de ensayo. Su presencia indica infección bacteriana. Si hay más de 10

leucocitos por campo debe realizarse una diferencial de la muestra fecal por medio de

la técnica de Wrigth , y se debe diferenciar entre Polimorfonucleares

(PMN) y Mononucleares (MN). Mayor cantidad de PMN la infección es causada

por bacterias o amebas y en la enfermedad inflamatoria crónica del colon., mayor

cantidad de MN la infección es viral.


108

b) PIOCITOS: Se presenta en pequeñas cantidades en la enteritis y colitis de

cualquier etiología. Pero la presencia brusca de pus abundante es indicio de la

evacuación a la luz intestinal de un absceso próximo.

c) HEMATIES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Los glóbulos rojos tienen

un diámetro de 7,5 μm. Su presencia en las heces puede indicar ulceración a nivel

del tacto intestinal bajo u otro problema hemorrágico o una evacuación muy rápida,

también pueden aparecer en infecciones por parásitos, bacterias, virus, etc.


d) CRISTALES: Indican una excesiva irritabilidad. Presentan el mismo aspecto que en

el sedimento urinario.

Cristales de Oxalato de Calcio: Normal y aumentada su presencia

en insuficiencia gástrica.

Cristales de Colesterol: Cálculos vesiculares

Cristales de Hamatoidina: Agujas amarillas, se presentan en

grupos, aparecen después de hemorragias.

Cristales de Charcot Leyden: Presentes en amibiasis, diarreas por

Isospora belli, son cristales octaédricos alargados, producidos

por la degradación de eosinófilos.}

109


e) HONGOS – LEVADURAS: Células ovoides de 4 a 6 μm y que pueden encontrarse

en forma de levaduras o hifas.

Son altamente hepatotóxicos y lesionan la mucosa gastrointestinal (agravando el

problema de hiperpermeabilidad). Junto con los hongos, erradican al resto de la

flora.


110

f) CÉLULAS EPITELIALES: Mucosa intestinal. Indican una excesiva irritabilidad.

Las células epiteliales o células escamosas pueden estar presentes en las heces,

más aún si la muestra se obtiene por sigmoidoscopía. El tamaño de estas células

son semejantes al de las amebas, la coloración es verde pálido con apariencia

uniforme no granular cuando se les colorea con Tricomico-Gomori. Normalmente de

las últimas porciones del intestino.

g) PÁRASITOS: Es un análisis de la materia fecal para verificar la presencia de un

parásito o de una infección del intestino causada por organismos similares

a gusanos. Los huevos se refieren a la primera etapa del ciclo de vida del parásito.

Algunos parásitos son organismos unicelulares como la Amebiasis, la Giardia y las

Tricomonas, etc., mientras que otros tienen apariencia de gusanos.

h) FIBRAS

Fibras musculares: Se pueden observar de diferentes formas dependiendo del grado de digestión:

a) Mal digeridas: Fragmentos rectangulares estriados, amarillos. Las estrías son transversales y longitudinales. Los bordes del rectángulo son rectos. b) Parcialmente digeridas: Trozos más pequeños con los bordes redondeados y las estrías longitudinales. c) Bien digeridas: Trozos muy pequeños con los bordes redondeados y sin estrías.

La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se puede deber a una insuficiencia gástrica o pancreática

Fibras vegetales: Se caracterizan por ser de doble pared, contienen clorofila y poseen un canal central muy marcado (se observan como resortes o espirales).

Aumento : …………x


111

i) LÍPIDOS: Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este

colorante se mezclará con una gota de la suspensión fecal. Los lípidos o grasas se encuentran en las heces en forma de:

a) Ácidos grasos: Tienen aspecto cristalino, en forma de escamas o agujas finas rectas o curvadas. Difícilmente se tiñen. b) Grasa neutra: Aparece como gotitas de color rojo o naranja Si la temperatura es fría (< 20º C) las gotas se transforman en masas o placas algo amarillentas o rojas. El aumento patológico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (ácidos grasos, neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojo-anaranjado (con Sudam III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados.


j) ALMIDÓN: Los gránulos de almidón tomarán un u otro dependiendo del grado de digestión. También podrán estar dentro de células o aislados: a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro. b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa. c) Digeridos: Amarillos o color arenilla. El tejido muscular, al añadir almidón a la preparación toma un color rojo-caoba. La presencia de almidón no digerido en las heces se llama AMILORREA.

112


k ) TEJIDO CONJUNTIVO: Se observa como fibras o filamentos que se reúnen en

fascículos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no poseen estriación. Se podría confundir con el moco, pero se distinguen porque se transparentan al añadirle ácido acético al 30 %.

RESULTADO DEL EXAMEN MICROSCOPICO

La presencia de células epiteliales, eritrocitos y demás estructuras microscopicas se reporta en cruces de la siguiente manera:

ABUNDANTES (+++)

MODERADAS (++)

ESCASAS (+) Se pueden reportar por campo :

leucocitos 10-15 por campo,

hematíes: 5-1 por campo

113

CARACTERÍSTICAS EN LOS DISTINTOS SÍNDROMES DIGESTIVOS

1) Tránsito global ultrarrápido. Diarrea verde. Lienteria y microscópicamente grasas,

fibras musculares y almidón sin digerir. Sublimado verde.

2) Insuficiencia gástrica. Heces pastosas o líquidas ("diarrea gastrógena") si está

descompensada, de color pardo y alcalinas. Tejido conjuntivo, abundante, en fieltros y

fibras arborescentes que constituyen el dato más característico. Fibras musculares en

manojos y a veces trozos groseros de carne. Grumos de almidón y células de patata.

3) Insuficiencia biliar. Heces acólicas arcillosas, blancogrisáceas en la obstrucción total,

con sublimado blanco; hipocoloreadas si es parcial. Esteatorrea con abundantes ácidos

grasos y jabones, y escasa grasa neutra.

4) Insuficiencia pancreática. Deposición voluminosa, maloliente y de color amarillento

brillante, con reacción alcalina habitualmente. Creatorrea, en forma de fibras musculares

sueltas bien conservadas, con estriación, angulosas y nucleadas; no se observa tejido

conectivo, a no ser que coexista una insuficiencia gástrica. Esteatorrea en forma de gotas

de grasa neutra. Amilorrea, menos aparente, representada por granos de almidón.

5) Trastornos de absorción (sprue, celiaquia). Heces muy voluminosas, de aspecto

cremoso y de color ocre o como mantequilla, con superficie brillante y con burbujas.

Esteatorrea a base, sobre todo, de ácidos grasos y jabones. No existe, por lo general,

creatorrea y apenas almidón.

6) Dispepsia de fermentación. Heces pastosas, en torta, amarillentas, espumosas y de

olor rancio, con reacción ácida y abundante fermentación en la prueba de Strasburger.

Abundante almidón sin digerir, flora iodófila y clostridias.

7) Heces de putrefacción (etiología diversa). Color oscuro, aspecto líquido o pastoso,

olor fétido y reacción alcalina.

8) Enteropatías alérgicas. Abundante moco transparente. Cristales de Charcot-Leyden.

Eosinófilos.

9) Enteropatías inflamatorias. Moco opaco en cantidad, con sangre o pus

frecuentemente. Albúmina disuelta. A menudo heces de putrefacción. Células epiteliales

abundantes, y gérmenes.

114

DIAGRAMA COPROLÓGICO FUNCIONAL

Llevar una muestra de excremento debe de ser una

evacuación completa y no haber ingerido carnes rojas

y de vitamina C o ácido acetil como mínimo tres días

antes de tomar la muestra, cuidando que no haya

contaminación con las heces.

Realizar estudio macroscopico: cantidad,

consistencia, forma, color restos alimenticios, fécula,

tejido conjuntivo, moco.

Diluir las heces en solución salina en una caja Petri.

Realizar estudio microscópico: fibras

musculares, vegetales, grasas, células

epiteliales, leucocitos, azucares reductores,

sangre oculta en heces, pH.

Reportar y registrar los resultados

115

MODELO : REPORTE DE EXAMEN COPROLOGICO FUNCIONAL

EXAMEN MACROSCOPICO :

COLOR : MARRON

CONSISTENCIA : PASTOSO

OLOR : FETIDO

MOCO : NEGATIVO

EXAMEN QUÍMICO :

PH : 7.0

THEVENON : POSITIVO 1+

GRASAS ( SUDAN III ) : No hay esteatorrea

SUSTANCIAS REDUCTORAS: Negativo

EXAMEN MICROSCOPICO :

GRANULOS DE ALMIDON : ESCASOS

FLORA YODOFILA : ESCASAS

LEUCOCITOS : 10 – 12 POR CAMPO

HEMATIES : 10 – 12 POR CAMPO

SE OBSERVAN QUISTES DE Entamoeba histolytica

116

EXAMEN COPROLOGICO FUNCIONAL

EXAMEN MACROSCOPICO :

COLOR :

CONSISTENCIA :

OLOR :

MOCO :

EXAMEN QUÍMICO :

PH :

THEVENON :

GRASAS ( SUDAN III ) :

SUSTANCIAS REDUCTORAS:

EXAMEN MICROSCOPICO :

GRANULOS DE ALMIDON :

FLORA YODOFILA :

LEUCOCITOS :

HEMATIES :

117

ANEXOS

METODOS DE CONCENTRACION

La concentración de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la detección de los parásitos intestinales y se puede realizar como complemento del examen directo. Los procedimientos de concentración permiten la detección de protozoos y/o helmintos empleándose dos métodos: de sedimentación y flotación, o una combinación de ambos, para separar los protozoos y los huevos de helmintos de las heces, utilizando las diferencias en el peso específico. Se deben emplear cuando la cantidad de muestra fuera pequeña, en un control de tratamiento o cuando se deba transportar poca cantidad de muestra a un lugar distante.

118

SEDIMENTACION POR CENTRIFUGACION MÉTODO DE RITCHIE: Formol – Éter

Examen coproparasitoscópico cualitativo de concentración por sedimentación con centrifugación. Se utiliza para huevos, quistes y larvas. Elimina bastantes delitrus orgánicos como el éter. Debido a que se utilizan varios reactivos y tubos cónicos, resulta poco económico. Las preparaciones quedan muy sucias porque con la sedimentación, aparte de concentrase formas parasitarias, se concentran otros materiales

Materiales

Tubos de ensaye cónicos de 15 ml

Embudo de cristal

Vaso de precipitados 50 ml

Gasa cortada en cuadro

Bajalenguas

Pipetas Pasteur con bulbo

Portaobjetos

Cubreobjetos

Gradilla

Centrifuga

Microscopio .

Reactivos

Solución salina isotónica

Solución de formaldehído al 10%

Éter etílico

Solución de yodo-lugol Procedimiento 1. Tomar con el batelenguas aproximadamente 1 gr de materia fecal y colocar en el vaso de precipitados, añadir 10 ml de solución salina y homogeneizar 2. Se filtra la suspensión a través de la gasa doblada en cuatro partes y colocada en el

embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico. 3. Centrifugar el filtrado a 2000 rpm por 2 minutos 4. Decantar el líquido sobrenadante y resuspender con el aplicador de madera el sedimento con solución salina. Centrifugar nuevamente, decantar y resuspender dos veces más. 5. Al último sedimento se agregan 5 ml de solución de formaldehído al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos en la gradilla 6. Se añaden 0.5 ml de éter, se tapan los tubos y se agitan enérgicamente durante 30 segundos. 7. Centrifugar durante 2 minutos a 2000 rpm 8. Después de centrifugar se observan cuatro capas (se hablara de ellas mas adelante) 9. Decantar el sobrenadante 10. Introducir la pipeta Pasteur hasta el sedimento, extraer con cuidado una gota del sedimento y colocarla en el portaobjetos 11. Añadir una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos homogeneizar, y

cubrir con el mismo 12. Observar la preparación con al microscopio con objetivos 10x y 40x

119

Luego agregamos 2/3 partes de formol

y 1/3 de éter (en este caso xilol)

De la soluc. filtrada

anteriormente vaciamos

a un tubo una pequeña

cantidad

Mezclar por

inversión

Centrifugar a 3000

rpm x 1 min.

Eter

Restos Líp.

disueltos

Formol

Sedimento

Parásitos

Tubo, después de la centrifugación

Se observó huevos de

Hymenolepis

Se elimina el

sobrenadante y

se observa el

sedimento al

microscopio

120

MÉTODO DE TELEMANN

Se usa para concentración de huevos, quistes y larvas, sobre todo para aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y ácidos grasos libres.

En 1908, Telemann describe su método, el cual es modificado por Rivas en 1928, quien cambio el ácido clorhídrico por ácido acético. En esta sección se describirá el original.

La utilidad es para concentración de huevos, quistes y larvas, sobre todo aquellas

muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y ácidos grasos libres.

Reactivos

· Éter etílico

· Ácido clorhídrico concentrado

· Agua destilada

· Solución de ácido clorhídrico al 15% Materiales

· Vaso de precipitado

· Tubos cónicos

· Pipeta pasteur

· Portaobjetos

· Cubreobjetos

· Microscopio compuesto

· Centrifuga

· Aplicadores

· Tapón de goma o caucho

· Gasa o algodón

· Gradilla Procedimiento

1. Se coloca un fragmento de heces del tamaño de un fríjol ( aprox. 1 g)

2. Se le agrega en el vaso de precipitados ácido clorhídrico al 15%, y se homogeneiza con el aplicador cuidadosamente

3. Se pasa la suspensión por dos capas de gasa o algodón previamente humedecido.

4. Se añade éter en cantidades iguales y se coloca un tapón de caucho o se tapa con el pulgar.

5. Se agita vigorosamente y se afloja el tapón o el dedo para disminuir la presión y se destapa.

6. Se centrífuga a 1500 rpm durante 1´.

121

7. Se saca de la centrifuga y se observan cuatro capas: 1) Éter; 2) Tapón de restos fecales; 3) Capa de ácido; 4) Sedimento inferior que contiene la forma parasitaria.

8. Se mantiene en el tubo horizontal y con un aplicador de madera y con un movimiento circular, se despega el tapón de restos fecales.

9. Rápidamente, pero con cuidado se vierten el éter, tapón y capa de asido, de manera que quede el sedimento en el tubo.

10. Se mantiene el tubo en posición horizontal, para evitar que los restos de extracto graso y de tapón fecal bajen por las paredes al sedimento.

11. Se introduce un aplicador con hisopo de algodón y se limpian las paredes del tubo.

12. Con el tubo vertical, se toma parte del sedimento con una pipeta.

13. Se coloca en un portaobjetos y se coloca encima el cubreobjetos.

14. Se examina con el microscopio con los objetivos 10X y 40X.

MÉTODO DE CHARLES - BARTHELEMY

Bueno no hay mucho que decir pero su utilidad es para hacer una buena concentración de quistes, huevos y larvas. Pero como todo buen método tiene una limitación que es por resulta antieconómico por los reactivos que utilizan.

Reactivos

· Formaldehídos Q.P.

· Cloruro de sodio

· Ácido cítrico cristalizado

· Agua destilada

· Éter etílico Soluciones

· Solución salina formolada

· Solución cítrica formulada

· Lugol Materiales

· Tubos de ensayé

· Portaobjetos

· Cubreobjetos

· Pipeta Pasteur


· Centrifuga

· Cápsula de porcelana

· Tela metálica de malla fina o gasa

· Tapones de caucho

122

Metodo

1. Suspender 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml aprox. En la solución salina formulada, utilizando la cápsula de porcelana para homogenizar.

2. Pasar la suspensión a través de la malla o gasa.

3. Centrifugar a 1,8000 rpm durante 60”

4. Decantar y agregar el sedimento de solución cítrica formulada, hasta llenar unos dos tercios de tubos.

5. Agitar con fuerza y añadir el éter hasta ½ del borde.

6. Tape el tubo con el tapón de caucho y agite violentamente hasta lograr la homogenización de las sustancias que contiene.

7. Destapar con cuidado el tubo, para evitar la proyección de la mezcla y centrifugar durante 30” a 1,800 rpm.

8. Con un aplicador, se rompe el tapón de las heces, gasas y otros restos, agitando ligeramente con el aplicador.

9. Se vuelve a centrifugar durante 30”

10. Se rompe nuevamente el tapón superior de restos fecales, desprendiéndolo de las paredes del tubo con cuidado, ayudándose con el aplicador.

11. S decanta de una sola vez, procurando que quede una pequeña cantidad de 2 a 4 gotas liquidas junto con el sedimento.

12. Agrega al sedimento una gota de lugol y agitar el tubo ligeramente para homogenizar.

13. Con la pipeta, se toma una gota de la suspensión coloreada del fondo del tubo y se coloca en el porta y se cubre.

14. Se observa en el microscopio con objetivos 10X y 40X.

TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN

1.Emulsionar la muestra de heces en agua ó S.S.F.

2. Filtrar a través de un colador.

3. Colocar el filtrado en un tubo de centrífuga y centrifugar a 2,000 rpm durante 2 minutos.

4. Eliminar el sobrenadante, agregar agua y volver a centrifugar. Esto puede repetirse hasta que el líquido sobrenadante sea transparente. Observar el sedimento al microscopio.

123

CONCENTRACIÓN POR FORMALINA - ACETATO DE ETILO Esta técnica se basa en concentrar huevos y larvas de helmintos, ooquistes y quistes de

protozoos de las heces. Se recurre a este método cuando el examen directo es negativo,

cuando la excreción de quistes/ooquistes es baja e intermitente o para descartar

infecciones leves en general, sobre todo si otros métodos (sulfato de zinc por Ej.) no han

ofrecido resultados esperados. El método original utilizaba éter, pero esta sustancia se ha

sustituido por acetato de etilo por ser menos inflamable y explosiva que el éter. Algunos

sugieren centrifugar por 10 minutos en vez de dos minutos para recobrar ooquistes de

apicomplexa, pero encontramos que se forma demasiado sedimento que impide realizar el

examen parasitológico.

Puede utilizarse con heces frescas o heces fijadas previamente en formalina o en MIF; los

quistes de protozoos no se deforman; puede demorarse en examinar el sedimento más

que en métodos por flotación; es adecuado tanto para huevos de nemátodos como de

céstodos y tremátodos; produce menos errores técnicos que otras concentraciones.

Desventajas

Los huevos infértiles de Ascarís y en ocasiones quistes de Giardia pueden flotar y

descartarse inadvertidamente con el tapón de detritus; utiliza tubos de ensayo de

vidrio (cuando se usa éter), ya que los tubos de plástico son dañados por éste; no es

adecuado para concentrar trofozoítos de protozoos.

Muestra a examinar Heces frescas recolectadas en frasco limpio y seco, de boca ancha, identificado correctamente. Reactivos

Formalina al 10%

Formaldehído 10 mL

Solución salina 0.85% 90 mL (Puede usar agua destilada )

Materiales

-Vasitos de plástico o cartón (30 ml de capacidad) -Tubos de centrífuga de ensayo 13 X 100 mm - Marcadores - Embudos de 5 cm de diámetro -Gasa quirúrgica en rectángulos de 16 X 16 cm en 2 dobleces -Parafilm o tapones de hule -Solución de formalina al 10% -Acetato de etilo -Aplicadores con algodón en un extremo

124

-Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm (3 X 1 pulgada) o de 7.5 X 5 cm (3 X 2 pulgadas) -Cubre-objetos -Gradilla para tubos -Pipeta graduada de 5 mL -Balanza de 2 platos para equilibrar tubos -Solución de Lugol -Acetato de etilo -Frascos con desinfectante para descartar material

Procedimiento

1. Identificar frascos, tubos y láminas con la muestra a examinar.

2. Transferir 1-2 g de heces a un vaso de plástico o cartón y agregar 10 mL de

formalina.

3. Desmenuzar y suspender completamente las heces con ayuda de aplicadores.

4. Descartar aplicadores. Dejar fijar mínimo 30 minutos.

5. Filtrar por 2 dobleces de gasa a un tubo cónico o de ensayo ayudado por embudo.

6. Descartar gasa. Tapar tubos

7. Equilibrar los tubos en balanza de 2 platos junto con los tapones.

8. Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos; destapar.

9. Descartar el sobrenadante.

10. Agregar más formalina al sedimento, agitando éste con un aplicador, hasta ± la

mitad del tubo.

11. Agregar 2-3 mL de acetato de etilo.

12. Tapar el tubo con parafilm o tapón de hule y agitar vigorosamente 15 segundos.

13. Centrifugara 1,500 rpm por 2 minutos.

14. Al final de la centrifugación se obtienen 4 capas : sedimento, formalina, tapón de

detritus y acetato de etilo. Destapar con cuidado y con un aplicador desprender el

tapón de detritus todo alrededor y decantar el sobrenadante de un solo movimiento.

15. En el fondo quedará el sedimento a estudiar

16. Con un aplicadorcon algodón limpiar las paredes interiores del tubo

17. Transferir el sedimento a un porta-objetos , cubrir con un cubre-objetos y examinar

toda preparación con objetivo 10X. Pasar a mayores magnificaciones cuando sea

necesario.

18. Para colorear quistes, agregar una gota de solución de Lugol.

19. Descartar material utilizado en desinfectante

125

SEDIMENTACIÓN SIMPLE

Los parásitos se concentran por acción de la gravedad, suspendiendo las heces en agua corriente, agua destilada o solución salina y dejando que sedimenten naturalmente o por centrifugación. Estos métodos son principalmente útiles para la concentración de quistes, ooquistes y huevos.

Ventajas: es fácil de realizar, no requiere observación microscópica inmediata y se puede aplicar a la concentración de la mayoría de los parásitos intestinales.

Desventajas: la observación microscópica puede dificultarse por concentración de elementos no parasitarios

MÉTODO DE SEDIMENTACIÓN SIMPLE EN COPAS

Este procedimiento de decantación en copas es una técnica conocida desde muchos años en el cual se utiliza un procedimiento físico para la separación de mezclas. Este método también es utilizado para el diagnostico de aquellas muestra de heces fecales sospechosas de contener huevos de Fasciola hepatica; el método ha demostrado ser bondadoso para otro tipo de huevos de helmintos e incluso para quistes de protozoario. Las ventajas que tiene, sobre otro, es que hace una concentración de volúmenes

considerablemente grandes de materia fecal.

Reactivos

· Verde de malaquita

· Agua de la llave ó Agua destilada

· Solución de detergente al 5% ( Se pasan 5 g de detergente de cualquier marca y se disuelve en 1000 ml de agua; el detergente que no se alcance a disolver, se sedimenta y decanta el sobrenadante o se deja en el frasco donde se guarda la solución, pues no interfiere en el proceso)

· Solución de verde de malaquita al 1% ( Se disuelve el verde de malaquita en los 100 ml de agua y se guarda la solución en frascos con tapón esmerilado).

Materiales

· Copas crónicas

· Pipeta pasteur

· Portaobjetos

· Cubreobjetos.

· Embudo


· Aplicadores de madera

· Bulbos de caucho

· Gasa

126

Huevo de

Ascaris

Eliminar

sobrenadante

Emulsionar la muestra en 10

a 20 vol. de agua de caño

Filtrar el preparado y

completar el vol. con agua

Dejar reposar

por 10 min.

Observar Repetir los

pasos anteriores

(x 2 veces más)

Procedimiento

1. En el recipiente donde se llevo la muestra al laboratorio se homogeneiza la muestra con agua de la llave y se hace pasar a través de la gasa previamente colocada en un embudo y recibiendo la suspensión en la copa.

2. Se colocan 5 ml de colorante y se agita con un aplicador

3. Se agregan 5 ml de la solución de detergente y se agita nuevamente

4. Se completa el volumen de la copa y se deja reposar durante 15 min.

5. Se decanta el sobrenadante y se agrega mas agua, mezclando con el aplicador y se deja reposar otros 15 min. Se decanta nuevamente el sobrenadante.

7. Con la pipeta con bulbo, se toma del sedimento la muestra que se coloca en el portaobjetos y se pone el cubreobjetos.

8. Se observa con el microscopio, usando objetivos de 10X y 40X, cuando sea necesario.

9. Se hacen tres preparaciones de cada sedimento para asegurar la positividad de la muestra. Cuando se tiene suficiente practica se puede utilizar la lupa del microscopio, sobre todo cuando se busca la F. hepatica.

Es un método lento y de poca concentración para los protozoos intestinales. Los huevos de helmintos sedimentan en el fondo del recipiente en un estado viable y sin deformación.

127

TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN ESPONTÁNEA EN TUBO

1. Homogenizar 2.5 g de heces con 10 - 20ml de solución salina fisiológica.

2.Verter la mezcla en un tubo cónico de centrifuga de 50 ml de capacidad filtrándola a través de gasa.

3. Completar el volumen del tubo con más solución salina y tapar el mismo herméticamente.

4. Agitar y dejar reposar por 45 minutos, como mínimo.

5. Tomar con una pipeta dos alícuotas: una de la mitad del sedimento y otra del fondo del tubo, colocarlos en portaobjetos diferentes y a la alícuota del fondo agregarle gotas de lugol, luego cubrirla con laminilla. Observar al microscopio.

TÉCNICA DE BAERMAN MODIFICADA

1. Emulsionar la muestra de heces en agua corriente.

2. Homogenizar y filtrar la muestra a través de un colador hacia una copa cónica. Agregar agua corriente hasta completar su capacidad. Dejar en reposo por 24 horas.

3. Eliminar el sobrenadarme.

4. Con una pipeta Pasteur, tomar una parte del sedimento y observar al microscopio

Dejar en

reposo 24

horas

En la coladera agregar la

muestra y verter SSF a 37º

hasta cubrirla

Eliminar sobrenadante Huevo de

Ascaris

Homogenizar

la muestra

Observar

128

MÉTODO DE LUMBRERAS MODIFICADO

Se utiliza para la búsqueda de huevos de Fasciola hepática en heces o bilis. No se puede utilizar un método de centrifugación porque los huevos se rompen ni de flotación porque son muy pesados.

1- Colocar 2 ml de la muestra (heces o bilis) en una copa de Lumbreras o tubo de centrífuga. 2- Agregar 5 ml de solución detergente al 10% para emulsionar las grasas. 3- Agregar 0,5 ml de alumbre férrico al 1% para favorecer el gradiente de densidad. 4- Homogeneizar suavemente. 5- Dejar en reposo 30 minutos. 6- Sacar con pipeta pasteur una gota del fondo de la copa. 7- Observar con microscopio.

TÉCNICAS DE FLOTACIÓN

Los métodos de flotación fecal se utilizan para separar los parásitos en todos sus estadios (huevos, ooquistes, quistes, larvas) de otros objetos, basados en sus diferentes densidades, pues se emplea un medio líquido más pesado que los parásitos permitiendo que los mismos suban a la superficie y puedan ser recuperados de la película superficial. La densidad es el peso de un parásito u otro objeto por unidad de volumen, se expresa en forma de gravedad específica. Para obtener un resultado preciso al realizar una flotación fecal, es necesario utilizar la solución correcta.

La densidad (gravedad específica) de las diferentes soluciones está determinada por la cantidad de sal o azúcar que contienen. La densidad de la mayoría de las soluciones está entre 1.18 y 1.20; y la densidad de la mayoría de los parásitos comunes es menor a 1.18.

Ventajas: el preparado es más límpido, facilitando la observación microscópica. Desventajas: debe hacerse la observación microscópica en menor tiempo debido a que la película superficial puede destruirse y los parásitos caer al fondo del tubo, a su vez, los parásitos de mayor peso que la solución empleada no flotarán. Existen varios métodos de flotación, el más utilizado es el método de Faust

MÉTODO DE FAUST (sulfato de zinc) Examen cualitativo de concentración que incluye centrifugación y flotación. Hace que se concentren los quistes, huevos y larvas. Es eficaz para separar e identificar huevos pesados como Ascaris lumbricoides, Taenia sp. y Fasciola hepática.cuando las infecciones son muy leves y no se detectan en preparaciones directas. Muestra requerida Heces frescas recolectadas en frasco {vidrio, plástico o cartón) de boca ancha, con tapadera, limpio, sin contaminantes (agua del inodoro, orina, tierra etc.) debidamente identificado.

129

Reactivos Disolver 330 g de cristales de sulfato de zinc en 670 mL de agua destilada. Para verificar la densidad, verter dentro de un cilindro de 1,000 mL de capacidad e introducir el hidrómetro, dejándolo flotar libremente, sin tocar las paredes del cilindro. Debe leerse 1.18. Agregar más agua si está más denso, o más cristales si está menos denso. Se recomienda verificar la densidad cada vez antes de usar o una vez por semana. Cuando la muestra de heces fue fijada, usar una solución con densidad 1.20

Materiales

Hidrómetro (Curtis Matheson Scientific Inc) para medir gravedad especifica, rango 1,000-2,000)

Solución de sulfato de zinc, densidad 1.18 (para heces frescas)

Cuadrados de gasa de 16 X 16 cm, en 2 dobleces

Embudos de 5 cm de diámetro

Tubos de ensayo, vasos de papel o vasos plásticos pequeños para hacer una suspensión de heces

Porta objetos, 7.5 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada) ó 7.5 x 5 cm (3 X 2 pulgadas)

Cubre-objetos 22 X 22 mm, No. 1 ó No. 2

Solución de Lugol

Asa bacteriológica de 5-7 mm de diámetro

Gradilla para tubos

Solución salina fisiológica Procedimiento

1. Identificar la muestra con el vaso y el tubo de ensayo a trabajar.

2. Con un aplicador, tomar 1-1.5 g de heces y hacer una suspensión en unos pocos ml de agua destilada* en un vaso o tubo.

3. Filtrar a través de gasa humedecida a un tubo de ensayo. 4. Centrifugar a 1,500-2,000 rpm por 2 minutos. Descartar el

sobrenadante. 5. Agregar 2-3 mL de solución de sulfato de zinc y agitar con un

aplicador hasta suspender totalmente el sedimento. Agregar más solución de sulfato de zinc hasta 1 cm abajo del borde del tubo de ensayo, sin dejar de agitar.

6. Centrifugar a 2,000 por 2 minutos. Los tubos deben tener posición vertical en la centrífuga, no inclinada.

7. Sin sacar el tubo de la centrifuga, remover varias asadas de la película superficial y colocarlas sobre un porta-objetos. Esterilizar el asa por flameo.

8. Cubrir con un cubre-objetos. Examinar sistemáticamente la preparación. Para colorear los quistes, remover con cuidado el cubre-objetos y añadir una gota pequeña de Lugol.

9. Para identificar los quistes se procede a examinarlos con el objetivo X100, para lo cual debe colocarse antes una pequeña gota de aceite sobre el cubre-objetos.

10. Puede ejecutarse este método cuando se reciben heces fijadas, para lo cual la solución de sulfato de zinc debe tener una densidad de 1.20. Para trabajar la muestra, mezclar bien las heces fijadas, filtrar si necesario y continuar con el procedimiento como se ha descrito.

130

Causas de error o resultados poco satisfactorios

En general, si no se sigue el método fielmente -

Solución de sulfato de zinc de otra gravedad específica

Esperar mucho tiempo después de preparar la muestra, antes de observarla al microscopio (más de 20 minutos)

Deformación de los quistes de protozoos, que dificulta su identificación

A veces no flotan los huevos infértiles de Ascaris

No es el método adecuado para huevos de céstodos ni de trematodo.

Nota: “Las larvas se encogen y no se puede reconocer su morfología específica”

Huevo de

Hymenolepis

Centrifugar 2 a

5 min.

Agua

Filtrado

Eliminar

sobrenadante

Repetir

procedimiento

una vez más

Después de eliminar

sobrenadante, agregar el

sulfato de Zinc

Centrifugar x 2 a 5

min. y luego eliminar

sobrenadante

Observar al

microscopio

Película

superficial

Sulfato

de cinz

Sedimento

131

MÉTODO DE WILLIS

El método de Willis es cualitativo de concentración por flotación simple. Se usa para la búsqueda e identificación de formas parasitarias como huevos, quiste o larvas. La densidad elevada de la salmuera donde se introducen las muestras, hacen que las formas parasitarias se distorsionen, y se puedan observar fácilmente bajo el microscopio. Esta técnica requiere solución saturada de sal, la cual se obtiene mezclando 38g de sal de cocina en 100 ml de agua caliente o calentar la mezcla a fin de homogenizarla.

1. Desmenuzar con la ayuda de una baqueta 1 ó 2 g de heces en un tubo de ensayo o en un frasco vacío (vial) que contenga aproximadamente 4 mL de solución saturada de sal.

2. Adicionar la misma solución hasta formar un menisco sobre el borde del tubo o frasco.

3. Cubrir el menisco del tubo o frasco con una laminilla evitando la formación de burbujas.

4. Dejar en reposo durante 15 a 20 minutos para que los huevos y quistes de parásitos floten y se adhieran por viscosidad a la laminilla.

5. Depositar una gota de lugol en una lámina portaobjetos y sobre ella colocar la laminilla.

6. Observar al microscopio.

Adicionar hasta forma un

menisco, luego cubrirlo

con una laminilla

Del filtrado se adiciona

una pequeña porción + la

sol. sat. de sal

Dejar en reposo

x 15 a 20 min.

Observar al

microscopio

132

METODO DE SHEATHER

Separar, concentrar y recobrar ooquistes de Isospora belli de las heces para facilitar el diagnóstico de isosporiasis en el laboratorio. Ooquistes de Cryptosporidium spp. Y Cyclospora cayetanensis pueden también concentrarse; sin embargo, para asegurar el diagnóstico de estas dos especies es preferible además, procesar la muestra por otros métodos (coloración, concentración por Webery medición de ooquistes). Importancia del diagnóstico El hallazgo de Isospora belli ha cobrado importancia desde 1983 en que se recobró de 3 homosexuales con diarrea crónica, pérdida de peso y una inmunodeficiencia severa. Aunque se le ha informado en el pasado en brotes de gastroenteritis en personas inmunonormales, cada vez más se le relaciona con estados inmuno-deficientes y SIDA. El hallazgo de Isospora belli requiere informe inmediato al médico. El Servicio de Parasitología del Hospital-Escuela, Tegucigalpa, Honduras, acostumbra agregar una nota diciendo: 'Investigar causa de posible inmunocompromiso". Muestra requerida Heces frescas recolectadas en frasco {vidrio, plástico, cartón) de boca ancha, con tapadera, limpio y debidamente identificado. Aspirado duodenal.

Heces líquidas a) Tomar una muestra del fondo del frasco con una pipeta Pasteur; o b) Mezclar las heces con la pipeta Pasteur y aspirar una cantidad; o c) Mezclar las heces, verter 2-3 mL en un tubo de ensayo rotulado, centrifugar, descartar el sobrenadante al frasco con la muestra original de heces o en un recipiente con desinfectante y continuar trabajando con el sedimento. Heces con moco a) Tomar una porción del moco y examinar al microscopio como frote directo; o, b) Utilizar un mucolítico (10 gotas de KOH al 10%) para disolver el moco y liberar ooquistes que estuvieran atrapados. Dejar actuar el mucolítico a temperatura ambiente durante 15 minutos, agitando con un aplicador. Una vez disuelto, agregar agua destilada, mezclar, centrifugar, decantar y continuar la técnica utilizando el sedimento.

Reactivos Solución concentrada fenolada de azúcar

Azúcar en cristales 500 g

Agua destilada 320 mL

Fenol en cristales. 6.5 g Disolver el azúcar en el agua destilada, usando calor sin dejar llegar a ebullición. Filtrar por gasa. Agregar el fenol y agitar hasta disolución. Guardar en frasco tapado y rotulado. Para trabajar es más fácil mantener la solución de trabajo en un frasco con dispensador.

133

Materiales

Vasitos de plástico para preparar suspensión

Tubos de ensayo de 13 X 100 mm

Cubre-objetos 22 X 22 mm, No.1 ó No.2

Porta-objetos de 3 X 1 pulgadas (7.5 X 2.5 cm) o de 3 X 2 pulgadas (7.5 cm X 5 cm)

Asa bacteriológica, 5-7 mm de diámetro

Marcador

Aplicadores sin algodón

Gasa quirúrgica

Solución fenolada de azúcar

Mechero de gas o lámpara de alcohol

Embudo de 5 cm de diámetro

Agua destilada

Frasco con desinfectante para descartar material

Parafilm o tapón de hule para tubos de ensayo

Procedimiento 1. Identificar los tubos de ensayo con la muestra a examinar. 2. Hacer una suspensión de una pequeña porción de las heces (±1 mL ó 1 g) en un

vasito plástico o tubo con la ayuda de un aplicador. 3. Colocar gasa en 2 dobleces dentro del embudo introduciendo éste en otro tubo de

ensayo rotulado y filtrar la suspensión de heces para remover fibras y partículas grandes. Tapar con parafilm o tapón de hule.

4. Equilibrar el tubo en balanza de 2 platos. 5. Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos. Destapar. Decantar el sobrenadante. 6. Añadir un poco de solución fenolada azucarada al sedimento y agitar

vigorosamente con un aplicador. Completar con más solución hasta 2 cm bajo el borde del tubo sin dejar de agitar. Tapar con parafilm o tapón de hule.

7. Equilibrar el tubo en balanza de 2 platos. 8. Centrifugara 1000 rpm durante 10 minutos. 9. Remover el tapón con sumo cuidado para no agitar. Tomar 2-3 asadas de la

superficie del menisco y colocar sobre un porta-objetos. Flamear el asa en el mechero.

10. Cubrir la preparación con un cubre-objetos y examinar en el microscopio óptico toda la preparación.

11. Buscar los ooquistes con objetivo 10X a diferentes profundidades; a menudo flotan y se colocan justo debajo del cubre-objetos.

12. Para confirmar, utilizar mayor magnificación. Puede usar esta preparación para colorear; basta remover el cubre-objetos, dejar secar y colorear.

13. Descartar el material utilizado en frasco con desinfectante. Características de la flotación Los ooquistes de apicomplexa pueden deformarse un poco; pueden tomar un color rosa pálido en su interior. Habrá que diferenciar de levaduras, Blastocystis hominis, otras estructuras. Existen otros métodos de flotación en los que se utiliza un detergente (Tween 80) y gradientes discontinuos de solución de azúcar de densidades 1:2 y 1:4 o Percoll

135

MÉTODOS CUANTITATIVOS PARA RECUENTO DE HUEVOS Y

LARVAS

Estos metodos tiene con propósito, evaluar la efectividad de tratamiento terapéutico pues se asume que la producción de huevos estará en relación directa con el número de hembras fecundas que deponen huevos. Una variable importante es el propósito para determinar esta intensidad: puede ser clínica, para encuestas, evaluar terapéutica, etc.

Se fundamenta en la estimación de la intensidad de una infección intestinal por Ascarís lumbricoides, Trichuris trichiura y uncinarias u otros nematodos del humano en forma práctica, en una cantidad conocida de heces. La intensidad de las infecciones se determina contando el número de huevos por gramo de heces. Este dato permite clasificar la infección en leve, moderada o intensa, aspecto muy importante ya que aunque el paciente sea asintomático, debemos tomar en cuenta que sigue siendo un importante foco de contaminación para las demás personas en la comunidad.

El conocer la intensidad de la infección también nos ayuda cuando se trabaja con limitaciones de fondos. En estos casos generalmente no podemos dar tratamiento a toda la comunidad. Utilizando este parámetro podemos tomar una decisión y dar tratamiento a los pacientes con mayor riesgo de ser focos de contaminación para la comunidad

136

MÉTODO DE DILUCIÓN DE STOLL

Este método se basa en el estudio de una cantidad conocida de heces, que se diluye en un volumen determinado. La cantidad de heces es medida por desplazamiento; al final del proceso se cuentan los huevos en una alícuota de la dilución. El diluyente, hidróxido de sodio, saponifica la grasa de las heces y ayuda a liberar los huevos de impurezas. La mayor desventaja es el equipo que requiere y el tiempo de preparación. Impráctico en encuestas. No se ha estandarizado y ha caído en desuso. Reactivos Solución de Hidróxido de sodio

Hidróxido de sodio 4 g

Agua destilada 1,000 mL

Disolver inicialmente el hidróxido de sodio en un volumen pequeño del agua destilada. Completar después a 1,000 mL. Guardar en frasco tapado y rotulado.

Materiales

Frasco de Stoll, marcado 2 veces: a 56 mL de volumen y a 60 mL de volumen; en su defecto, probeta graduada con tapón de hule, que tenga las dos marcas, a 56 mL y a 60 mL.

Solución de hidróxido de sodio

Pipetas graduadas a 0.15 mL (dispensador automático para serología)

Porta-objetos 7.5 X 2.5 cm ó 7.5 X 5 cm

Cubre-objetos 22 X 40 mm


Frascos con desinfectante para descartar material

Perlas de vidrio

Contador manual

Marcador

Frascos con desinfectante para descartar material sucio.

Procedimiento 1. Identificar el frasco de Stoll con la muestra a examinar 2. Añadir hidróxido de sodio hasta la marca 56 mL en el frasco para ello 3. Con cuidado agregar heces hasta subir el nivel del líquido a la marca 60 mL 4. Agregar las perlas de vidrio, tapar y agitar vigorosamente. Si las heces son muy

duras, deberá dejarse 24 horas agitando esporádicamente 5. CUENTA DE HUEVOS DE NEMÁTODOS TRASMITIDOS POR EL SUELO 6. Con la pipeta Stoll remover 0.15 mL del centro de la suspensión inmediatamente

después de agitar y antes que los huevos comiencen a sedimentarse 7. Colocar ésta suspensión sobre un porta-objetos y cubrir con un cubre-objetos 8. Contar todos los huevos presentes en toda la preparación. Multiplicar el resultado

por 100 y reportar No. de huevos/g o No. de huevos/ mi de heces, sin factor de corrección

9. Para reportar con factor de corrección, debe considerarse la consistencia de las heces y multiplicar por 2 para heces blandas; por 3 para heces diarreicas. Cuentas en heces líquidas no son confiables.

138

MÉTODO DE KATO (VARIACIÓN KATZ)

El método Kato Katz para el conteo de huevos de helmintos intestinales permite determinar los niveles y la intensidad de la infestación parasitaria en los individuos muestreados. Consiste en el examen microscópico de una cantidad fija de material fecal lo que permite un diagnostico semi cuantitativo basado en el número de huevos en las heces, En una medida indirecta de la carga parasitaria, generalmente a mayores conteos de huevos mayores número de hembras adultas presentes.

El método, originalmente introducido por japoneses para hacer encuestas epidemiológicas de schistosomiasis, ha sido mejorado y modificado varias veces. La variación KATZ entrega una cantidad conocida de heces, que depende del tamaño del templete utilizado, con la condición quesean heces formadas. El tamaño del templete varia; para asegurar resultados comparables, el templete debe estandarizarse en el país a una sola medida. El que se describe aquí entrega 41.7 mg de heces. Huevos de Taenia sp o de Hymenolepis nana se informan sin contar. La Organización Mundial de la Salud considera este método como el de elección y el más adecuado en encuestas, monitoreo y evaluación de programas de control de nemátodos transmitidos por el suelo y schistosomiasis.

Ventajas Las heces no se diluyen, se utiliza materiales baratos y accesibles, puede transportarse una vez preparado en el campo, puede guardarse varios meses para verificar resultados, puede estandarizarse para encuestas en diferentes regiones geográficas por diferentes investigadores. Desventajas Tiene varias limitantes: sólo puede utilizar heces frescas; no es adecuada para heces diarreicas, líquidas o mucoides; no se aplica para la detección de protozoos ni larvas de nemátodos; huevos frágiles como los de uncinaria y a menudo de Hymenolepis nana se vuelven irreconocibles en pocas horas; no es indicado para heces que contengan mucha fibra o grasa.

Reactivos

Glicerina pura 100 mL

Agua destilada 100 mL

Verde de malaquita al 3% 1 mL (Solución acuosa)

Mezclar bien en frasco de boca ancha con tapadera e introducir los cuadrados de celofán para sumergir en esta solución 24 horas o más antes de usar. (El verde de malaquita no es indispensable en caso que no se cuente con él).

Un armazon de 9 mm X 1 mm entrega 50 mg de heces. El factor de multiplicación para determinar huevos por gramo será de 20.

Un arm azon de 6 mm de diámetro X 1.5 mm de grosor entrega 41.7 mg de heces. El factor de multiplicación será de 24.

Materiales

Cuadrados de celofán que miden 22 X 30 mm. Sumergir durante 24 horas o más en la solución de glicerina

Espátulas plásticas de madera o palos de paletas o de helados

139

Templete de plástico del tamaño seleccionado, en este caso de 6 mm de diámetro x 1.5 mm de grosor

Cuadrados de 4 cm X lado de tela metálica o nylon de trama 210 o de nitrel de 250/rni

Papel absorbente

Papel de periódico

Pinzas


Porta-objetos 7.2 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada) ó 7.5 x 5 cm (3 X 2 pulgadas)

Marcador

Baja-lenguas o palo de paleta o de helados, que es más barato

Contador manual

Procedimiento 1. Extender el papel periódico o de estraza sobre la mesa de trabajo 2. Identificar el porta-objetos con la muestra a examinar. Colocar sobre éste el

templete de plástico 3. Con el palo de paleta tomar una cantidad de heces y colocarla sobre una superficie

plana (tapadera del frasco, papel periódico) 4. Colocar sobre estas heces un cuadrado de tela metálica, plástica o nylon que hace

las veces de colador 5. Raspar la superficie de la tela con el espátula plástica tomando suficientes heces

coladas para llenar el agujero del templete. Descartar el espátula si es de madera 6. Remover el templete, descartar éste y la tela en desinfectante y cubrir el redondel

de heces con un cuadrado de celofán empapado en glicerina 7. Invertir el porta-objetos con esta preparación sobre una hoja de papel absorbente y

hacer presión con el pulgar hasta extender las heces por todo el cuadrado. 8. Darle vuelta y colocar sobre una superficie protegida de insectos (mosca,

cucaracha) y agua. Esperar que aclare. Esto dependerá de la temperatura y humedad del ambiente, entre 30 min y 45 min. Si se desea interrumpir el aclaramiento, invertirla lámina sobre una superficie plana lo necesario hasta continuar el proceso.

9. Observar al microscopio óptico con objetivo de 10 X. Contar sistemáticamente y en forma individual todos los huevos de Ascaris, Trichuris, uncinaria en toda la preparación

10. Multiplicar el resultado por 24 e informar «Numero de huevos/gramo de heces». Descartar material usado en desinfectante

11. Los huevos de Taenia se confirmarán si se observan los ganchos de la oncósfera con objetivo X40 .

142

METODO DIRECTO en Frote de heces

Este método es una simplificación del método estándar de Beaver en 2 mg de heces en el que se utiliza una célula foto-eléctrica adaptada y calibrada que mide con precisión 2 mg de heces en una preparación en solución salina. La simplificación deriva del conocimiento que las preparaciones directas que se utilizan en la rutina para el examen de heces contienen entre 1.5 mg y 2.5 mg. Muestra requerida Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plástico o cartón) limpio, de boca ancha, sin contaminación de agua, orina, tierra etc. Preparación de reactivos

Solución salina fisiológica

Cloruro de sodio 0.85 g.

Agua destilada 100 mL Mezclar hasta disolución completa de los cristales. Guardar en frasco rotulado. Para uso diario mantener en frasco gotero rotulado. Materiales

Porta-objetos de 3 X 1 pulgada (7,5 x 2.5 cm) ó 3 X 2 pulgadas {7.5 x 5cm)

Cubre-objetos de 22 X 22 mm, #1 ó #2


Solución salina fisiológica (0.85%)

Marcador

Contador manual

Frasco con solución desinfectante para descartar material

Procedimiento 1. Identificar el porta-objetos con la muestra de heces a examinar 2. Colocar 1 - 2 gotas de solución salina en cada extremo del porta-objetos 3. Con un aplicador, tomar una porción de heces y emulsificar en cada una de las

gotas de solución salina 4. Cubrir cada preparación con un cubre-objetos 5. Contar en forma individual los huevos según la especie: de Ascaris, Trichuris y/o

uncinaria presentes en cada preparación. Sacar la media 6. Informar por especie de parásito: No. de huevos/frote de heces o bien No. de

huevos/2 mg de heces 7. Descartar material usado en el frasco con desinfectante.

Causas de error

1. Preparación muy gruesa o muy fina 2. Observación no sistemática de la preparación 3. Huevos no distribuidos al azar en la preparación, o aglomerados por la presencia de

mucho moco 4. Heces líquidas

143

TÉCNICA DE FERREIRA El método fue descrito por Biagi y Cols. En 1959 y fue puesto en practica por Ferreira y Abreu. Método cuantitativo es útil para el recuento de huevos y larvas de todos los parásitos considerados metazoarios y además hace una buena concentración de los protozoarios: quistes y ooquistes. Debido a la utilización del tamiz y a los lavados aplicados, se logra una materia fecal fina que facilita su estudio microscópico Esta técnica se basa en la utilización del formol como preservador y desinfectante y de la diferencia de densidades con el empleo del sulfato de zinc con una densidad de 1.192, que hará que los parásitos existentes en las muestra floten. Tiene como limitante que el material a utilizar no se consigue fácilmente. Reactivos *Sulfato de Zinc 35% 500 ml *Formaldehído 10% 300 ml *Sol. Salina 0.9% 500 ml *Lugol 50 ml Materiales

*Microscopios

*Centrifuga

*Balanza granataria

*Campana de Ferreira *Frasco de Gerber *Aplicadores *Tubos de ensaye de 100 x 25 mm *Portaobjetos *Embudo *Tubos de látex de 15 cm de largo

Técnica o procedimiento 1. Pesar un frasco de ancha junto con un abate lenguas

2. Depositar materia fecal en el frasco ayudándose con el abate lenguas

3. Medir 36 ml de la solución de formaldehído, vaciar en el frasco

4. Homogeneizar la materia fecal con la solución de formol hasta una suspensión.

5. Pasar la mezcla por malla previamente colocada en un embudo y recibir la suspensión en un tubo colocado en una gradilla.

6. Centrifugar a 2000 rpm. Durante 1 minuto.

7. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento con sol. Salina.

8. Volver a centrifugar bajo las condiciones anteriores.

9. Decantar nuevamente el sobrenadante y agregar 2 a 3 ml de sulfato de zinc, mezclar hasta hacer una nueva suspensión.

10. Introducir la campana de Ferreira en el tubo de ensaye.

144

11. Llenar el tubo con más solución para que el menisco suba.

12. Centrifugar a 2000 rpm. Durante 1 min.

13. Sacar el tubo de la centrífuga y con el pulgar y el índice se comprime fuertemente el trocito de manguera de caucho del extremo anterior de la campana y de un golpe se saca este del tubo.

14. Lavar el exterior de la campana.

15. Invertir la campana sobre el portaobjetos y poner 2 a 3 gotas de lugol, de tal manera que arrastren el contenido de la parte estrecha de la campana, que es donde se encuentran las formas parasitarias.

16. Homogeneizar la suspensión con el ángulo de un cubreobjetos colocar este sobre el portaobjetos

17. Examinar la preparación con el microscopio seco débil y seco fuerte. Contar todos los huevos de la totalidad de la preparación

Técnica de Mac. Master Modificado:

- Homogenizar 3g de heces en 42 ml de agua.

- Tamizar y colocar 15 ml del filtrado en un tubo de prueba.

- Dejar sedimentar por 30 minutos o centrifugar a 1,000 r.p.m. durante 1 minuto.

- Eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con la solución saturada de cloruro de sodio.

- Homogenizar y con el gotero tomar una muestra y llenar la cámara de Mac. Master. Esperar 2 minutos. Observar y contar los huevos ubicados dentro del recuadro de lectura

Recuento En Cámara De Malassez:

- Esta cámara de recuento se utiliza entre otras para recuento de células en líquido lumbar o para recuento de nemátodes.

145

TECNICAS ESPECIALES

MÉTODO DE HARADA-MORI Para estudiar la distribución regional o geográfica de las uncinarias de humanos Necator americanus y Ancylostoma duodenale; para la diferenciación entre larvas de uncinaria ybde los «huevos parecidos a los de uncinaria» (Trichostrongylus, Temidens, Strongyloidesbfulleborni); en la diferenciación entre larvas de uncinaria y otras larvas, para determinar la viabilidad de los huevos y/o larvas en estudios sobre efectividad anti-helmíntica, para cultivar estadios de vida libre de Strongyloides, para embrionar huevos de tremátodos (Paragonimus y Fasciola) y de céstodos (Diphyllobothrium y Spirometra), para estadios similares en parasitología veterinaria. Estas preparaciones pueden transportarse del campo al laboratorio, cuidando de no agitarlos, derramarlos ni permitir que se sequen. Muestra requerida Heces frescas, sin refrigerar, recolectadas en frasco (vidrio, plástico o cartón) limpio, de boca ancha, con tapadera, debidamente identificado, sin contaminación. Variaciones Existen 2 variaciones: una en tubo de ensayo y otra en preparación inclinada en caja de Petri. Se describirá la original en tubo de ensayo y se mencionará lo más importante en la que utiliza caja de Petri.

Nota: Las larvas recobradas pueden ser infectantes. Aplicar medidas de seguridad: usar guantes, limpiar inmediatamente cualquier cultivo derramado con una solución de clorox, Lugol o fenol, descartar material en frascos con desinfectante.

Materiales

Tubos de ensayo de preferencia cónica, de 15 mL de capacidad, en su defecto,

tubos de ensayo de 25 X 175 mm

Tiras de papel filtro (Whatman #2 u otro similar) cortadas 2 mm menos anchas que el diámetro del tubo y 2 cm más largas, con un extremo más afinado.

Agua destilada, en una pizeta

146

Baja-lenguas, palos de paleta o aplicadores de madera

Gradilla o soporte para tubos

Guantes

Lente de aumento o lupa de mano (opcional)

Pipetas Pasteur

Bulbo de goma o perilla para pipetas

Lápiz de grafito

Cajas de Petri de 5 cm de diámetro

Porta-objetos de 7.5 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada)

Cubre-objetos 22 X 22 No.1 ó No.2

Frasco con desinfectante para descartar material Procedimiento en tubo de ensayo

1. Con un lápiz de grafito, escribir la identificación de la muestra en el extremo más delgado de la tira de papel filtro.

2. Con un aplicador o palo de paleta tomar y extender unos 0.5-1.0 g de heces sobre el tercio medio de la tira; descartar aplicador.

3. Insertar esta tira con la parte escrita dentro del tubo de ensayo. Quedará una porción extendida fuera del tubo por la que pasarán elementos solubles de las heces.

4. Con todo cuidado agregar agua destilada hasta que el nivel llegue por debajo del extendido de heces. Tener cuidado de no mojar las heces.

5. (Aunque no es necesario tapar los tubos, en lugares muy calientes se prefiere hacerlo para evitar la evaporación rápida del agua).

6. Colocar los tubos así preparados en una gradilla y mantener en lugar seguro a temperatura ambiente.

7. Revisar diariamente el nivel de agua. Reemplazar aquélla perdida por evaporación, con mucho cuidado. Para verificar si hay larvas móviles en el sedimento:

8. Colocarse los guantes. 9. Obtener una porción del sedimento con una pipeta Pasteur, colocarlo en la caja de 10. Petri y observar al microscopio estereoscópico. 11. Para estudiar la morfología diferencial, deberá aspirar larvas con la pipeta y colocar

las larvas entre porta y pubre, calentar suavemente o agregar solución de Lugol para inmovilizarlas; observar al microscopio óptico. Identificar por morfología.

12. Descartar material en frasco con desinfectante. Descartar guantes.

147

Procedimiento en caja de petri El propósito es el mismo que el método en tubo de ensayo, excepto que aquí puede utilizar mayor cantidad de heces y puede observar el sedimento directamente al microscopio, para determinar la presencia de larvas. La identificación específica requiere observar en detalle la morfología de las larvas. Puede utilizar una caja de Petri de 9 cm, o una de 14 cm de diámetro, según cuanto material desee obtener y una tira de papel filtro del tamaño de un porta objetos de 3 X 2 pulgadas u otro soporte conveniente para heces. La identificación específica requiere observar en detalle la morfología de las larvas. Procedimiento

1. Extender las heces sobre la tira de papel, la que se coloca sobre el porta-objetos u soporte.

2. Colocar esta preparación en la caja de Petri soportada en un extremo poraplicadores por una varilla de vidrio para lograr una inclinación.

3. Agregar agua destilada a la caja de Petri asegurando que el agua ascienda por capilaridad en la tira de papel con heces.

4. Tapar y dejar a temperatura ambiente por 2-3 días. Asegurar que la preparación no se seque.

5. Al cabo de 2-3 días, colocarse los guantes. 6. Colocar la preparación en el microscopio estereoscópico y buscar larvas en el agua. 7. Si no se observan, Con una pipeta Pasteur obtener una porción del agua de la caja

y examinar entre porta y cubre en un microscopio óptico buscando larvas. O bien, verter el líquido en un tubo de ensayo, centrifugar y recobrar las larvas del sedimento. Identificarlas según características morfológicas específicas.

8. Todo material se descarta en la solución desinfectante.

9. Consultar con los diagramas provistos para identificar larvas.

MÉTODO DE BAERMANN

Recobrar larvas de nemátodos y en algunos casos gusanos adultos, de las heces, suelo, tejidos, etc. Es el método de elección más eficiente para recobrar larvas de infecciones por Strongyloides stercoralis. Existen 2 variaciones: una que utiliza un embudo de vidrio y otra que utiliza un vaso de sedimentación. El principio del método es exactamente igual en ambos: recobrar larvas sedimentadas en el fondo del embudo o del vaso. Se considerará aquí el método en vaso de sedimentación. Detectar una estrongiloidiasis latente en aquellos pacientes en riesgo a quiénes se les provoca o desarrollan una inmunodeficiencia; en personas desnutridas, alcohólicas, quemadas severas, que recibirán radiaciones. Para verificación terapéutica. Se aumenta la probabilidad de diagnóstico con exámenes repetidos durante varios días o semanas. Muestra requerida Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plástico, cartón), limpio, de boca ancha, con tapadera, correctamente identificado. No se deben refrigerar, ya que esto inmoviliza las larvas y les impide migrar al agua.

148

Materiales

Vaso de sedimentación de 250 mL de capacidad

Círculo o cuadrado de papel filtro

Círculo o cuadrado de gasa quirúrgica en 4 dobleces

Baja-lenguas o palos de paleta

Pipetas Pasteur, tallo de 9 cm de largo

Bulbo de hule para las pipetas

Agua corriente a 37° C

Cajas de Petri de 5 cm de diámetro

Porta-objetos de 7.5 X 5 cm (3 X 2 pulgadas)

Cubre-objetos de 22 X 22 mm No. 1 o No. 2


Procedimiento 1. Identificar el vaso con la muestra a

examinar. 2. Verter el agua a 37°C dentro del vaso de

sedimentación más o menos hasta 3 cm antes del borde.

3. Tomar un redondel de papel filtro y con un baja-lenguas o palo de paleta, extender unos 5 g de heces frescas en capa delgada sobre éste, descartar baja-lenguas.

4. Cubrir esta preparación con la gasa. 5. Colocar esta preparación con la gasa hacia

abajo, dentro del vaso, procurando que las heces queden sumergidas en el agua

6. Esperar una hora. Las larvas migrarán de las heces al agua y caerán al fondo del vaso.

7. Después de la hora, preparar la caja de Petri identificándola. Colocar el bulbo de hule en la pipeta Pasteur. Con un aplicador de madera apartar suavemente la gasa, apretar el bulbo entre índice y pulgar e introducir la pipeta hasta el fondo del vaso.

8. Absorber sedimento del fondo sin removerlo. 9. Colocar este sedimento en la caja de Petri. Esta operación puede repetirse 2-4

veces. 10. Examinar bajo microscopio estereoscópico, buscando larvas en el fondo de la caja. 11. Para identificarlas específicamente, aspirar algunas con la pipeta Pasteur,

colocarlas sobre un porta-objetos, cubrir con un cubre-objetos y buscarlas con objetivo 10X primero. Si están muy móviles, calentar suavemente la preparación o agregar por capilaridad una gota de solución de Lugol. Para determinar los detalles morfológicos, utilizar objetivo de 40X.

12. Reconocer las características: Cápsula bucal corta, primordio genital grande.

13. Descartar material en frasco con desinfectante.

149

MIGRACIÓN DE LARVAS EN AGAR

Aumentar la sensibilidad de detección por métodos no agresivos una infección por Strongyloides stercoralis. Incidentalmente podrían recobrarse larvas de Necator americanus y Ancylostoma duodenale si la infección está presente. Detectar una estrongíloidiasis latente en aquellos pacientes a riesgo a quienes se provoca o desarrollan una inmunodeficiencia; en personas desnutridas, alcohólicas, quemadas severas, cirróticos, que reciben radiación, estudios epidemiológicos.

Ventajas Sensibilidad de diagnóstico aumentada, adecuado en casos problema o para diagnosticar la infección en niños en quienes no puedan realizarse exámenes más agresivos (aspirado duodenal, bíopsia). Desventajas Necesidad de más equipo de laboratorio, más tiempo para preparar el método, mayor tiempo de espera antes de ofrecer un resultado, menor cantidad de heces de donde se podrían extraer las larvas, necesidad de personal de laboratorio muy calificado, trabajo laborioso, impropio en lugares con una rutina voluminosa y pocos empleados poco calificados, material potencialmente infectante.

Muestra requerida Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plástico, cartón) limpio, de boca ancha, con tapadera, correctamente identificado. No se debe refrigerar la muestra, ya que esto inmoviliza las larvas. Materiales

Cajas de Petri de vidrio o plástico, tamaño estándar (10 cm de diámetro)

Cajas de Petri de 5 cm de diámetro Agar simple Extracto de res

Peptona

Cloruro de sodio

Erler-Meyer de capacidad según la cantidad de medio a preparar

Mechero de gas

Bolsas plásticas

Baja-lenguas de madera o palos chatos de paleta o aplicadores de madera

Formalina al 10% en una pizeta

Porta objetos de 7.5 X 5.0 cm (3 X 2 pulgadas)

Cubre-objetos de 22 X 22 mm

Pipetas Pasteur tallo corto

Bulbo de goma o perilla

Incubadora (opcional) a 37°C

Microscopio estereoscópico

Microscopio óptico

Guantes desechables

Tubos de centrífuga de 13 X 100 mm

Centrífuga

Cuaderno para anotar y lápiz

Frascos con desinfectante para descartar material

150

Preparación del medio (suficiente para 10 placas):

Agar 1.5 g

Peptona 1.0 g

Extracto de res 0.5 g

Cloruro de sodio 0.5 g Agregar 100 mL de agua destilada. Llevar a baño María hasta completa disolución de las sustancias. Esterilizaren autoclave a 121°C, 21 libras de presión, durante 15 minutos. Verter en capa fina (10 mL/caja de Petri), dejar endurecer toda la noche y guardar en bolsa plástica sellada a 4o C. Antes de usar cada placa, dejar un rato a temperatura ambiente. Preparación del campo de trabajo

Tener a mano y listo: Microscopio estereoscópico Pipetas Pasteur y bulbo o perilla Cajas de Petri de 5 cm de diámetro Formalina al 10% en una pizeta Tubos de ensayo de 13 X 100 mm, previamente rotulados

Solución desinfectante: clorox, solución yodada, etc

Cuaderno para anotar y lápiz Nota: Material potencialmente infectante. Utilizar guantes durante todo momento de la observación de las muestras. La literatura japonesa ofrece otras ideas, pero en nuestra experiencia el uso de guantes y el tener solución desinfectante a mano es adecuado. Limpiar con desinfectante inmediatamente cualquier líquido derramado. 5e necesita determinar circunstancias de bioseguridad en la adecuación del método para estudios epidemiológicos.

Procedimiento

1. Identificar la placa de agar con la muestra de heces a examinar. 2. Con la ayuda de baja-lenguas, palo de paleta o aplicadores de madera, colocar 1 g 3. de heces en el centro de la placa. Si las heces están duras o formadas, ablandar

con unas gotas de agua destilada estéril. Tratar de que las heces queden extendidas lo más posible y en contacto con el medio de agar.

4. Tapar la placa. 5. Incubar a 37°C. Pueden asimismo dejarse en un lugar protegido a temperatura

ambiente, pero el tiempo de observación se prolonga. 6. Incubar 24 horas. 7. Antes de sacar las placas de la incubadora, ponerse los guantes. Sacar las placas y

llevar a la mesa de trabajo. 8. Colocar una placa en el microscopio estereoscópico y sin destapar buscar caminos

de larvas y/o larvas en la superficie del medio. Si se forma agua de condensación en la tapadera, limpiar ésta con papel absorbente y descartar en desinfectante.

9. Volver a tapar y continuar. 10. Si no se observan caminos ni larvas, dejar en incubación otras 24 h. Al cabo de ese

tiempo, volver a examinar en microscopio estereoscópico. 11. Anotar resultados. Verter formalina al 10% sobre la superficie del agar, sin verterla

sobre las heces. 12. Inclinar la placa y con una pipeta Pasteur aspirar la formalina y colocar en un tubo

de ensayo previamente identificado. 13. Centrifugar a 1,500 rpm durante 2 minutos. 14. Decantar o extraer cuidadosamente el sobrenadante.

151

15. Recobrar el sedimento con otra pipeta y colocaren un porta-objetos, cubrir y observar al microscopio óptico.

16. Identificar larvas presentes por morfología específica bajo objetivo 40 X: cápsula bucal corta y primordio genital grande para larvas rabdiformes; esófago largo y punta de la cola en forma de M para larvas filariformes de S. stercoralis.

17. En ocasiones se han observado larvas dentro del medio. Enfocar bien al buscar para no perderlas en caso que no se encuentren en la superficie.

18. No basta con observar la presencia de surcos. Es necesario recobrar las larvas y diferenciarlas.

152

PROCEDIMIENTO PARA FIJAR HELMINTOS

Procedimiento para fijar tremátodos

Para no dañar la morfología de los metazoarios, éstos se manipularán extremando

cuidados, y antes de fijarlos hay que someterlos a una fase de relajación:

a) Para relajarlos los trematodos se colocan en agua destilada durante 5 a 10 minutos

(no dejar más de 20 minutos debido a que las estructuras internas se destruyen por

la lisis osmótica). La incubación de los tremátodos adultos en agua también

favorecen la salida de huevo, lo cual es benéfico debido a que se observarán

mejor las estructuras internas.

b) El espécimen se coloca entre dos portaobjetos en posición dorsoventral y se

presionan con cuidado sin macerarlo.

c) Por un extremo de los portaobjetos se seca el exceso de agua con una gasa; por el

otro extremo se añade el fijador (AFA :Alcohol, formaldehído, ácido acético) y

se deja reposar 10 minutos.

d) Los trematodos se separan de los portaobjetos y se colocan en el fijador (AFA)

durante 48 horas

e) Se transfieren a un recipiente con etanol al 70%; en estas condiciones, los

trematodos se pueden almacenar en forma permanente o quedan listos para la

tinción.

Procedimiento para fijar cestodos

Los cestodos, igual que los tremátodos, primero se relajan.

a) Se colocan en agua destilada o solución isotónica a 37°C durante 5 a 30 minutos

(más tiempo ocasionará lisis osmótica de varios órganos internos). Otra opción es

utilizar etanol al 5.0% a temperatura ambiente.

b) Si el parásito es de un tamaño medio, se coloca entre dos portaobjetos en posición

dorsoventral y se presionan con cuidado sin macerarlo.

c) Por un extremo de los portaobjetos se seca el exceso de agua con una gasa; por el

otro extremo se añade el fijador (AFA) y se deja reposar 30 minutos.

d) El ejemplar se retira y se coloca en un recipiente con el fijador (AFA) durante 24

horas.

e) Los cestodos se transfieren a un recipiente con etanol al 70%.

Procedimientos para fijar nemátodos.

Para hacer una buena observación de las estructuras internas de los nematodos, éstos

necesitan tinciones. Basta con un procedimiento adecuado para aclararlos y fijarlos.

a) Debido a que el fijador puede contraer la estructura de los nematodos vivos, éstos

se colocan durante 30 segundos en ácido acético glacial frío y después en etanol al

70%.

b) Los nematos pueden almacenarse de manera permanente en etanol alo 70% con

5% de glicerol (que suaviza y aclara). Si se desean preparaciones fijas, entonces se

usa el glicerogel.

153

METODOS DE COLORACIÓN PARA HELMINTOS Coloración Carmín clorhídrico Coloración de estructuras internas de especímenes adultos o segmentos de éste. Se usa

de preferencia para el estudio de céstodes y tremátodes, ya que los nemátodes suelen

deformarse con el montaje. La muestra debe ser lo más fresca posible.

Materiales

- Láminas portaobjetos.

- Laminillas cubreobjetos.

- Pinza de punta fina.

- Cytoseal o bálsamo de Canadá.

- Alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto.

- Creosota de la Haya o xilol.

- Colorante Carmín (Anexo C).

- Acido clorhídrico.

- Agua destilada.

- Pabilo.

- Placas petri conteniendo colorante, decolorante, alcoholes de 70%, 85%, 95% y

absoluto.

Procedimiento.

1. Los proglótidos de céstodes y los adultos de tremátodes son lavados y aplanados,

colocándolos entre dos láminas, sujetándolos con pabilo o usando pesas

sumergiéndolos en formol al 10%.

2. En caso de estar fijados en formol 10%, se lavan con agua corriente durante 10 a

30 minutos y luego se realiza el aplanamiento del vermex o gusano.

3. Colocar el gusano en alcohol 70% durante 10 a 20 minutos.

4. Pasar por el colorante Carmín durante 5 a 10 minutos.

5. Pasar por alcohol ácido controlando la coloración al estereoscopio.

6. Deshidratar el espécimen pasando por alcohol 85%, 95% y absoluto, durante 10

minutos en cada uno.

7. Pasar por la creosota o xilol, controlando al estereoscopio o microscopio la

coloración apropiada.

8. Secar el exceso de creosota con papel filtro y realizar el montaje con bálsamo de

Canadá.

Observación.

La observación y estudio de la morfología del ejemplar se realiza macroscópicamente e

incluso sólo usando el estereomicroscopio

154

Coloración de Bonilla, Naar y Beloy Utilidad. Las larvas de los nemátodes absorben el colorante, permitiendo diferenciar sus

estructuras internas.

Materiales



- Alcohol 25%, 30%, 70%, 85% y 95%.

- Solución rojo de Congo (Anexo C).

- Solución de salicilato de metilo (Anexo C).

- Láminas excavadas.

- Bálsamo de Canadá o cytoseal.

- Pipeta Pasteur.

- Placas Petri 60 x 90 mm conteniendo los alcoholes.

Procedimiento

1. Preparar un set de placas Petri 60 x 90 mm conteniendo los reactivos

correspondientes y colocar las larvas en alcohol 25% - 30% con unas gotas de

solución de rojo de Congo por 20 a 30 minutos.

2. Controlar por la observación microscópica el color de las larvas.

3. Deshidratar la muestra, pasándola por alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto, de 20 a

30 minutos en cada uno.

4. Colocar en solución de salicilato de metilo durante 3 minutos.

5. Colocar los especímenes en cytoseal, bálsamo de Canadá o Permount y observar

al microscopio.

Lectura

Los especímenes y sus estructuras internas se tiñen de color rojo.

Coloración hematoxilina férrica de Delafield Utilidad

Se usa en casos de céstodes y tremátodes. Permiten colorear estructuras internas de

especímenes adultas o fragmentadas del mismo.

Materiales



- Alcohol de 25%, 30%, 70%, 85% y 95%.

- Hematoxilina férrica.

- Bálsamo de Canadá o cytoseal.

- Pipeta Pasteur.

- Placas Petri 150 x 100 mm conteniendo los alcoholes.

155

Procedimiento

1. Preparar un set de placas Petri 60 x 90 mm o 100 x 150 mm conteniendo los

reactivos correspondientes, dependiendo de los especímenes a colorear.

2. Los tremátodes y céstodes fijados con formol 10% se lavan en agua corriente.

3. Diluir el colorante stock de 8 a 10 gotas en agua destilada y colocar los

especímenes (35 mL por placa) por 12 horas.

4. Lavar con agua corriente y pasar por agua (segundos), dependiendo del

espécimen.

5. Pasar por alcohol 50%, 30% y 10% por 10 minutos en cada uno y pasar por agua

corriente el tiempo necesario para sacar el exceso de colorante.

6. Deshidratar en alcohol 10%, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% y 100% cada uno, por 10

minutos.

7. Pasar dos veces por xilol, montar con bálsamo de Canadá y observar al

microscopio.

Lectura

La observación de los especímenes se realiza en forma microscópica o con el uso del

microscopio estereoscopio.

MÉTODO DE LA TINTA CHINA Identificar específicamente proglótidos de Taenia expulsados por individuos infectados. No se puede enfatizar suficiente la importancia de identificar infecciones por T. solium, por el peligro que representa para el individuo, su familia y la comunidad la diseminación de los huevos de este parásito y el riesgo de adquirir una císticercosis, tanto humana como animal. Aunque cualquier expulsión de proglótidos debe considerarse como si fueran de T. solium mientras no se identifique la especie, es necesario identificar, registrar y tratar los casos verdaderos. Muestra requerida Proglótidos grávidos sin fijar, colocados en un frasco tapado e identificado con el nombre, edad, sexo y procedencia del individuo. Pueden mantenerse en refrigeración por un fin de semana, pero deben llevarse al laboratorio lo más pronto posible.

Ventajas Se ofrece un diagnóstico rápido; pueden guardarse sellados e identificados para demostración y referencia. Desventajas Material infectante al humano cuando es T. solium; requiere manipulación cuidadosa, puede contaminar fácilmente el área del laboratorio. Puede no inyectarse bien el proglótido, o éste puede estar semimacerado y no revelar claramente el número de ramas uterinas necesarias para diagnóstico.

Alternativa: Los proglótidos lavados y limpios sin fijar, se pueden aclarar en alcohol al 70% y glicerina o bien con Lactofenol. El resultado demora mientras los proglótidos se aclaran. Para la diferenciación entre especies, puede decirse que si las ramas uterinas son muchas es Taenia saginata y si son pocas es T. solium.

156

Materiales

Jeringa y aguja de tuberculina

Tinta china

Papel absorbente

Agua destilada

Aplicadores

Caja de petri

Porta-objetos de 7.5 x 5 cm {3 x 2 pulgadas)

Cinta adhesiva opaca

Frasco con desinfectante o agua hirviendo Procedimiento

1. Si el o los proglótidos están sucios con heces, colocarlos con ayuda de aplicadores en una caja de Petri y lavar por agitación suave con agua destilada.

2. Colocar un proglótido sobre 3-4 dobleces de papel absorbente y secarlo por ambos lados.

3. Aspirar algunas gotas de tinta china en la jeringa de tuberculina. 4. Inyectar el proglótido afianzado sobre el pape! absorbente, introduciendo la aguja

en la rama uterina central del proglótido como si fuera inyección subcutánea. 5. Secar con otro papel el exceso de tinta y humedad y colocar el proglótido entre 2

porta-objetos. 6. Ejercer presión para apretar el proglótido al mismo tiempo que otra persona sella

alrededor de la preparación con cinta adhesiva. 7. Contar las ramas uterinas coloreadas con la tinta china con una lente de aumento. 8. Número de ramas para 7. solium: 5, 7, 9 ó 13. Número de ramas para 7. saginata:

más de 15. 9. Cuando hay duda en situaciones de cuenta intermedia solicitar más proglótidos sin 10. fijar o el parásito que se expulsará con tratamiento específico, recolectado

directamente en una bolsa plástica o en un frasco grande limpio y seco. 11. Cuando los proglótidos se reciben fijados, se colorean con carmín, que es una

coloración permanente. 12. Descartar todo material utilizado en frasco con desinfectante o en agua hirviendo.

13. Desinfectar la mesa de trabajo. Lavarse bien las manos.

157

COLORACIONES ESPECIALES PARA PROTOZOARIOS

La detección y la correcta identificación de la mayoría de los protozoos intestinales dependen del examen de estos extendidos observados con un aumento de 100x. La utilización de extendidos permanentes no solamente nos proporciona un archivo durable de los protozoos, sino que pueden ser utilizados, cuando la identificación es dificultosa, para consultar con especialistas. El método más clásico es la hematoxilina férrica de Heidenhain, pero la generalidad de los laboratorios seleccionan técnicas más breves como la coloración Tricrómica. Es importante mencionar que la mayoría de las dificultades en las coloraciones de trofozoitos y quistes se deben a una fijación inadecuada, al uso de preparados muy densos o por heces muy viejas.

COLORACIÓN CON HEMATOXILINA FÉRRICA DE HEIDENHAIN Método clásico para colorear e identificar estadios de protozoos comunes en heces del humano, sobretodo cuando sólo hay trofozoítos y las infecciones son mixtas. Las descripciones en los libros sobre la morfología y características de cada estadio y de cada especie están basadas en organismos coloreados por este método. Ventajas y desventajas Es un método caro porque exige reactivos de primera clase, sobre todo el fijador y los deshidratantes (alcohol, xileno); requiere un tiempo de preparación y coloración de las muestras (mínimo 2 horas) y exige un personal de laboratorio con conocimiento sólido sobre principios celulares y morfología diferencial de los organismos. Sin embargo, para la especiación de protozoos es la más adecuada, la preparación puede guardarse para control, referencia, confirmación por terceras personas y material de estudio. NOTA: Desde la década anterior, con la redescripción de las especies de Entamoeba histolytica y de Entamoeba dispar, la identificación por morfología de Entamoeba histolytica no es aceptada. Se prefiere utilizar métodos inmunológicos o de biología molecular. Podría hacerse una excepción en presencia de trofozoítos hematófagos recobrados de casos clínicos agudos (disentérica o amebiasis extraintestinal). Por otra parte, esta coloración en manos adiestradas ofrece la diferenciación más confiable de otras especies de protozoos patógenos y no patógenos del humano. Hay 3 momentos claves en la ejecución de este método:

1. Fijación 2. Diferenciación 3. Deshidratación

158

Al final los resultados dependerán de que se haya hecho una pronta y correcta recolección y fijación de la muestra. No se debe perder tiempo examinando una muestra mal fijada y peor teñida. Para una discusión más completa y acertada sobre el tema, consultar las referencias citadas. Para una coloración rápida (8-10 minutos) consultar la referencia de Flournoy y colaboradores. Muestra requerida Evitar purgantes de aceite mineral o la administración de medios radiológicos de contraste por lo menos 2 semanas antes de tomar la muestra. Cualquier terapia con antibióticos reduce la posibilidad de encontrar organismos. Heces recolectadas en un frasco (vidrio, plástico, cartón) limpio, seco, con tapadera, sin contaminación (agua, tierra, orina). Cuando haya moco y sangre, recoger de esta parte. Evitar colocar la muestra a temperaturas extremas. Deben ser fijadas al momento de evacuarlas o llevarlas al laboratorio en los próximos 30-60 minutos. Reactivos

Shaudinn modificado Solución saturada acuosa de cloruro de mercurio 62.5 mL Alcohol etílico al 95% 31.2 ml Ácido acético glacial 5.0 ml Glicerol 1.5 ml Mezclar la solución saturada de cloruro de mercurio con el alcohol etílico. Puede guardarse en frasco rotulado. El ácido acético y el glicerol sólo se mezclan al momento de usar el fijador. Fijar una muestra de heces en este fijador en relación de 10:1 (10 mi de fijador para 1 g ó 1 mi de heces). Las heces deben estar totalmente suspendidas en el fijador, para lo cual se utiliza un aplicador. Albúmina de Mayen Mezclar una clara de huevo en partes iguales con glicerol. Guardar en frasco tapado, rotulado, en el refrigerador. Para preparar las láminas, agregar en partes iguales al sedimento del centrifugado de heces. Alcohol yodado. Solución madre: Agregar suficientes cristales de lodo a un volumen X de alcohol al 70% en un frasco oscuro con buen tapón. Se obtendrá una solución oscura. Rotular y guardar. Para trabajar, agregar un poco de esta solución a un volumen X de alcohol al 70%, hasta obtener una solución color té o color coñac (ámbar). Mordiente: Cristales de sulfato férrico amónico (Fe2(SO4)3 (NH4)2 SO4 + 24H2O) 2 g. Agua destilada 100 mL. Mezclar, preparar fresco cada día. No puede guardarse. Colorante de hematoxilina. Solución madre. Cristales de hematoxilina 10 g Alcohol etílico de 95% 100 mL Mezclar y dejar madurar varias semanas (entre 5-6) en un frasco con tapón de algodón, a la luz, a temperatura ambiente. Para trabajar: agregar 0.5 mL de esta solución a 95 mL

159

de agua destilada. Ácido Pícrico: Ácido pícrico en cristales 2 g Agua destilada 100 mL Mezclar y agitar, dejar reposar varios días en un frasco rotulado, agitando de vez en cuando. Si todos los cristales se disuelven, añadir más cristales de ácido pícrico. Utilizar del líquido sobrenadante para diferenciar, tomando ¡a cantidad necesaria con una pipeta. Alcohol al 70%

Materiales

Porta-objetos 7.5 X 2.5 cm. ( 3 X 2 pulgadas)

Cubre-objetos 22 X 30 mm ó 22 X 22 mm No.1

Tubos de ensayo para centrifugar ( 1 3 X 1 000 mm}

Viales para fijar las heces

Gasa quirúrgica

Lápiz de diamante para rotular porta objetos

Embudos de 5 cm de diámetro

Aplicadores

Albúmina de Mayer

Fijador Schaudinn modificado

Alcohol yodado

Mordente

Colorante de hematoxilina

Solución de diferenciación

Alcohol etílico al 70%, 80%, al 95%

Alcohol absoluto

Xileno o tolueno

Permount

Frascos con desinfectante para descartar material.

Procedimiento 1. Fijar una muestra de heces o de moco con sangre recién obtenida en el fijador en

relación 10:1 (10 mL de fijador para 1 g ó 1 mL de heces). Las heces deben estar totalmente suspendidas en el fijador, para lo cual se mezcla con un aplicador.

2. Antes de proceder con la coloración la muestra debe permanecer 6 horas como 3. mínimo en el fijador. El examinar láminas mal fijadas y peor teñidas es una pérdida

de tiempo. 4. Identificar tubos y láminas con la muestra a procesar. 5. Agitar el frasco conteniendo la muestra fijada y verter 1 mL a un tubo de centrífuga. 6. Si hubiere partículas muy gruesas, en este momento puede filtrarse por un embudo

con gasa en 2 dobleces. Descartar la gasa y poner el embudo en solución desinfectante.

7. Llenar el tubo con agua destilada y centrifugar 2 min. a 2,000 rpm. 8. Descartar el sobrenadante. Este paso puede repetirse otra vez para eliminar fijador

en exceso. Agregar al sedimento un volumen igual de albúmina de Mayer, mezclar

160

y extender finamente 1-2 gotas de esto sobre un porta-objetos rotulado. También puede colocar sobre el porta-objetos 1-2 gotas de sedimento de heces, agregar 1-2 gotas de albúmina de Mayer, mezclar y extender finamente. Permitir que la preparación se seque unos minutos, dependiendo de la temperatura ambiente. Si no lo seca suficiente, el extendido se desprende; si lo deja secar demasiado, los protozoos se deforman. Introducir en las siguientes soluciones por el tiempo indicado:

1. Alcohol 50% 5 min 2. Alcohol 70% yodado 2- 5 min 3. Alcohol 70% 2-5 min 4. Alcohol 50% 3-5 min 5. Lavar en agua corriente 3-10 min 6. Solución mordente sulfato férrico amónico 10 min 7. Lavar en agua corriente 3 min 8. Hematoxilina acuosa 10 min 9. Lavar en agua corriente 2 min 10. Ácido pícrico saturado 10-15 min 11. Lavar en agua corriente 15-30 min 12. Deshidratar por una batería de alcohole en incremento 70%, 95%, y 2 cambios en 100% 2 min en c/uXilol 2 min 13. Colocar 1-2 gotas de permount, cubrir con cubre-objetos, dejar secar y observar con objetivo de inmersión.

Problemas y su corrección

Para mantener las soluciones lo más limpias posibles, escurrir la lámina tocando

brevemente un papel absorbente o una gasa con el extremo inferior de la misma

antes de pasar a otra solución.

Presencia de numerosos cristales amarillos u oscuros indica que el alcohol yodado

no removió los cristales y que requiere más tiempo en dicha solución.

Evitar la evaporación de los alcoholes manteniendo los frascos bien tapados.

Si el xilol se pone lechoso al introducir una lámina, esto indica que la lámina todavía

contiene agua. Los pasos anteriores no han deshidratado correctamente.

Debe cambiar por lo menos el alcohol del paso anterior y el xilol y secar bien los

frascos coplin antes de verter el nuevo.

El extendido no debe dejarse secar en ningún momento durante la coloración.

Los extendidos pueden permanecer toda la noche en cualquier cambio de alcohol

al 70% o xilol. Para los otros cambios mantener el tiempo indicado.

161

TINCIÓN TRICRÓMICA DE GOMORI-WHEATLEY

Al principio la tinción de Gomori se utilizó en tejidos y Wheatley la uso en parásitos. Este

método es más rápido que el de hematoxilina férrica. Es útil para diferenciar protozoarios

intestinales en donde se pueden ver algunos detalles del citoplasma y el núcleo. La

tinción se puede hacer en frotis de muestra previamente preservadas en PVA o en frotis

con muestras frescas y fijas con Schaudinn.

Esta técnica combina un colorante plasmático (Cromotropo 2R) y un colorante de fibras

conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solución de ácido fosfotúngstico y ácido

acético glacial. El ácido fosfotúngstico favorece la coloración roja de citoplasmas.

Colorante de Gomori:

2R cromotropo 0.6 g

SF verde claro 0.3 g

Ácido fosfotúngstico 0.7 g

Ácido acético glacial 1 ml

Agua destilada 100 ml

Agregar 1 ml de ácido acético glacial a los componentes secos. Dejar reposar de 15 a

30 minutos y luego agregar 100 ml de agua destilada

Procedimiento

1. La preparación de las laminillas y la fijación se realizan de manera similar al descrito

en la tinción de hematoxilina.

2. Para eliminar el exceso de cloruro de mercurio del fijador de Schaudinn, las

laminillas se colocan el alcohol 70%-yodo durante un minuto

3. Se lavan dos veces con etanol al 70%, durante minutos.

4. Las laminillas se colocan en solución concentrada durante 5 a 10 minutos

5. Se transfieren a etanol al 90% con un 1% de ácido acético (10-15 segundos)

6. Se sumergen dos veces en etanol absoluto.

7. Se ponen en etanol absoluto durante 30 segundos

8. Se meten en xileno durante un minuto.

9. Las preparaciones se cubren con resina o bálsamo de Canadá, se les coloca un

cubre objeto de numero 1 y se dejan secar.

162

Resultados

Los protozoarios adquieren diferentes tonalidades. El fondo se ve sobre todo rojo o verde,

en tanto que los protozoarios toman un color más neutro, casi siempre gris o verde pálido.

Los cuerpos cromatoides y eritrocitos toman tanto el color rojo como el colorante verde

con lo que se genera un fuerte contraste con el citoplasma. Por lo regular los elementos

nucleares se tiñen de un color más oscuro.

Cuestionario 1. ¿Por qué es necesario usar colorantes para teñir a los protozoarios parásitos?

2. ¿Cuál es la diferencia entre tinciones efímeras y tinciones permanentes? ¿En qué

circunstancias se recomienda se cada una de ellas?

3. ¿Por qué es necesario fijar las estructuras parasitarias?

4. ¿Cuál es la solución fijadora que se utiliza con mayor frecuencia para las

preparaciones permanentes del frotis de heces

Los procesos inflamatorios se caracterizan por el reclutamiento y activación de “células

inflamatorias”, constituidas por leucocitos, macrófagos y linfocitos que se desplazan

atraídas por citoquinas pro-inflamatorias y se concentran en sitios donde existe injuria

tisular. Diversos agentes de naturaleza física, química o biológica pueden provocar

alteraciones en algunas de las estructuras hepáticas desencadenando señales de

peligro que son captadas por el sistema inmunológico y hematológico. Las citoquinas

pro-inflamatorias son sintetizadas y secretadas por casi todos los tipos de células.

En la práctica, las enfermedades parasitarias son muy útiles por permitir la

observación, de manera muy gráfica, de todas las variantes del proceso inflamatorio y

aun de sus secuelas.

Hay algunos hechos curiosos en patología parasitológica. Usualmente en la inflamación

se busca la presencia de exudado, con determinado tipo de células predominantes; sin

embargo, en la hepatitis o encefalitis palúdica, se sabe que no hay reacción leucocitaria

en el tejido: solo se observa al componente alternativo y algunos trastornos

circulatorios, como el edema.

Es muy fácil demostrar en muchos casos, como en la amebiasis hepática o en la

toxoplasmosis encefálica, que es el parásito, como ente extraño, el que desencadena

el proceso inflamatorio; pero hay situaciones, como sucede a veces en la miocarditis

chagásica y en la toxoplásmica, especialmente en las formas crónicas, en que cerca de

una colonia de parásitos no se aprecia reacción inflamatorio; en cambio, ésta puede ser

importante lejos del sitio en que el parásito está, lo que hace suponer que está, lo que

hace suponer que hay sustancias antigénicas, producidas por el parásito, que provocan

reacción a distancia.

Objetivos

- El propósito de la práctica es que el estudiante establezca la diferencia en el laboratorio entre la infección intestinal que ocasiona diarrea infamatoria y la no inflamatoria.

- Esta diferencia puede establecerse determinando la presencia de Leucocitos en materia fecal. Los Leucocitos se encuentran asociados a moco y su presencia indica una diarrea tipo inflamatoria lo cual sugiere bacteriana o parasitaria

Materiales

- Muestra fecal

- Laminas portaobjetos y cubreobjetos

- Colorante azul de metileno

- Colorante Wright

- Aceite de Cedro

- Microscopio

REACCIÓN INFLAMATORIA Y DIFERENCIACIÓN CELULAR

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA

164

LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

Procedimiento 1.

- Colocar una pequeña porción de materia fecal sobre una lámina portaobjeto, agregarle una gata de azul de metileno, cubrirla con una laminilla y observar al microscopio en busca de leucocitos.

- Para un estudio cuantitativo contar 200 células con objetivo de 40x. La interpretación es la siguiente:

o Positivo + : menos de 10 leucocitos /campo.

o Positivo ++ : de 10 a 30 leucocitos/campo.

o Positiva +++: más de 30 leucocitos/campo

Procedimiento 2.

- Hacer una extensión de materia fecal sobre una lámina portaobjeto dejar secar y colorear con wrigth.

- Observar al microscopio y observar los leucocitos coloreados.

- Realizar un conteo de 200 leucocitos, diferenciando los mononucleares y polimorfonucleares y expresarlo en porcentaje (%).

FORMA DE REPORTE:

Reportar el porcentaje de leucocitos encontrados con el predominio del que tenga

mayor porcentaje. Polimorfonucleares por ciento.Mononucleares por ciento.

Interpretación:

Predominio de polimorfonucleares se asume que existe un proceso infeccioso de

origen bacteriano.

Predominio de Mononucleares se asume que el proceso infeccioso es de origen

viral.

MODELO: REPORTE DE EXAMEN - REACCION INFLAMATORIA

REACCION INFLAMATORIA : POSITIVO

LEUCOCITOS : 25 - 30 POR CAMPO

DIFERENCIACIÓN : POLIMORFONUCLEARES : 80 % MONONUCLEARES : 20 %


165


CONTROL DE CALIDAD INTERNO EN PARASITOLOGÍA CLÍNICA

El diagnóstico parasitológico es fundamentalmente morfométrico y la identificación de los parásitos de modo fiable y exacto, requiere:

i) utilizar muestras satisfactorias; ii) preparar y conservar adecuadamente los reactivos; iii) realizar cuidadosamente los procedimientos técnicos seleccionados; iv) examinar meticulosamente las preparaciones realizadas.

No obstante, existen procedimientos diagnósticos alternativos, no excluyentes, complementarios de los procedimientos convencionales, y en algunos casos imprescindibles para el diagnóstico, que deben ser controlados por el laboratorio y por lo tanto sujetos a los controles internos de calidad, como son los cultivos específicos, los estudios serológicos y las técnicas de diagnósticos moleculares. Estas recomendaciones tienen como finalidad describir como se debe efectuar el control de calidad interno de las técnicas de laboratorio relacionadas con el diagnóstico de las parasitosis humanas. Estos procedimientos se aplicarán a los diferentes ensayos que se realicen en los laboratorios de Microbiología, encaminados al diagnóstico de las parasitosis humanas. En los laboratorios debe existir un supervisor del control de calidad y el personal debe rellenar los registros de control de calidad en los formularios preparados para tal efecto. El supervisor de calidad debe:

i) revisar mensualmente los datos generados por el control interno de calidad; ii) clasificar los registros para facilitar su inspección; iii) conservar los registros durante un periodo mínimo de dos años.

Los análisis deben ser realizados por personal TECNOLOGO calificado con experiencia en Parasitología, además de supervisar el proceso diagnóstico. Dadas las peculiaridades de la Parasitología Clínica, sería aconsejable que el personal tuviese una formación adicional específica en esta materia.

FASES DEL

PROCESO DE

LABORATORIO

PRE ANALITICA

Es la que insume mayor

tiempo, solicitud,obtención,

almacenamiento, transporte,

recepción y la que está

sujeta a mayor porcentaje

de errores.

ANALITICA

corresponde a la realización

del procedimiento

diagnóstico. Incluye

validación de las técnicas,

calibración de

equipos, ejecución de

controles de calidad, etc.

POS ANALITICA

Cálculos, interpretación de

resultados, validación,

emisión del informe.


166


Las características del laboratorio requeridas para realizar el diagnóstico de las parasitosis humanas son similares a las de cualquier laboratorio del área de Microbiología. Debe disponer de programas de seguridad, de limpieza y de eliminación de residuos, que pueden ser los generales del laboratorio, y de los equipos necesarios (microscopios, lupas, centrífugas, refrigeradores, congeladores, incubadores, pH-metros, etc) para realizar los procedimientos diagnósticos. Así como, del correspondiente Manual de Procedimientos de Diagnóstico Parasitológico, que debe de recoger los procedimientos y los correspondientes algoritmos diagnósticos.

Requerimientos para un adecuado control de calidad interno Dado que a diferencia de las otras áreas de la especialidad no existen cepas de control, de todas las especies parásitas que afectan al hombre, el laboratorio:

• Debe disponer de una colección propia de muestras fecales conservadas, con los parásitos prevalentes en su área geográfica, adecuadamente identificadas. • Debe disponer de fuentes documentales propias (libros, atlas) y de acceso online, para poder efectuar las consultas pertinentes. • Debe conservar las preparaciones positivas teñidas con tinciones permanentes. • Debería disponer de concentrados fecales de parasitosis exóticas en su medio. Así como, de preparaciones permanentes de los principales hemoparásitos, especialmente de las diferentes especies plasmodios que afectan al hombre, y de las tinciones diferenciales utilizadas en los exámenes coproparasitológicos. • El material de referencia (colección de especimenes de helmintos, huevos, larvas y quistes de protozoos preservados en formol; tinciones fecales con ooquistes, quistes y trofozoítos de protozoos y tinciones sanguíneas positivas; atlas; manuales y libros de referencia) debe ser clasificado y almacenado de forma adecuada, de modo de que su consulta con fines diagnósticos, de entrenamiento y adiestramiento, sea fácil.

Recomendaciones para el control de calidad de la fase pre-analítica La adecuada programación de la fase pre-analítica es de capital importancia para el buen funcionamiento de los laboratorios clínicos, por ello consideramos que el laboratorio:

• Debería disponer de una “solicitud propia de análisis” en la que, además de los datos demográficos del paciente y del estudio solicitado, debería de estar recogida la información clínica y terapéutica necesarias para la adecuada implementación de la fase analítica, que en el caso del diagnóstico parasitológico debería de incluir, entre otros:

* Tipo de proceso y tiempo de evolución * Datos biológicos concomitantes (esosinofilia, anemia, etc) * Estancia en otros lugares y otros datos epidemiológicos de interés

• Debe facilitar la información necesaria para la adecuada obtención, conservación y transporte de las muestras. En el caso de los exámenes coproparasitológicos el laboratorio debe facilitar contenedores con conservantes que permitan la realización de tinciones diferenciales . Recomendaciones para el control de calidad en la fase analítica

Control del equipamiento: El personal del laboratorio debe controlar el equipamiento del mismo.

CENTRIFUGA.se comprobara que la velocidad es correcta, calibrándose una vez al año. Se verificara la eficacia de la calibración procesando una muestra positiva (por ejemplo con quistes de guardia) por el método de concentración y


167


comprobando que el número de quistes es al menos cinco veces mayor que el examen en fresco.

REFRIGERADORA, CONGELADOR, ESTUFAS. Se controlara la temperatura a diario, anotando los resultados en una hoja de control, se limpiaran mensualmente por dentro y por fuera

MICROSCOPIO. Se limpiara tras cada uso y de forma más exhaustiva al terminar la jornada laboral, utilizando papel lente o servilletas de papel, nunca tela. Se revisara y limpiara semestralmente por un técnico especializado y se calibrara una vez al año.

Control de los reactivos: La adecuada preparación y conservación de los reactivos es de capital importancia en el control interno de la fase analítica, por lo cual:

• En los correspondientes Procedimientos de Diagnóstico Parasitológico debe figurar la composición, preparación, conservación y vida media de los reactivos.

• Todos los reactivos deben estar adecuadamente identificados y en la correspondiente etiqueta deben figurar las fechas de preparación y de caducidad.

• El personal del laboratorio debe comprobar la fecha de caducidad de los reactivos antes de su utilización, y proceder en su caso a su sustitución.

• Cada vez que se proceda a la sustitución de un reactivo, o se introduzca uno nuevo, debe realizarse el correspondiente control de eficacia.

.


168


DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO DE ENFERMEDADES PARASITARIAS

Desde principios de este siglo, cuando Landsteiner inició la era de la inmunología hasta nuestros días, se han realizado muchos hallazgos que comprometen al huésped en la reacción antígeno-anticuerpo y al modo de realizar la investigación de dicho proceso. Actualmente la inmunología interviene en la mayoría de las disciplinas médicas y la parasitología no es la excepción a esta afirmación, además desde hace cincuenta años las pruebas inmunológicas se utilizan en esta área. En la actualidad el diagnóstico inmunológico de las enfermedades parasitarias tiene ciertas limitaciones para su aplicación en la mayoría de los laboratorios clínicos asistenciales o en los centros de docencia, sin embargo estas pruebas se realizan con cierta frecuencia en los laboratorios de referencia nacionales seccionales o en unidades docentes con recursos económicos amplios. El uso clínico de las pruebas de inmunodiagnóstico parasitológico está restringido a pocas entidades nosológicas en nuestro medio, debido a los escasos recursos económicos que tienen nuestras Instituciones, al hecho de existir otros análisis menos costosos y más dicientes de una infección actual y quizá lo más importante, es el comportamiento biológico del parásito, el cual es diferente al de la bacteria y el virus, por lo tanto su papel como antígeno tiene otras! características. De lo anterior se puede deducir que la utilización de estas pruebas en el diagnóstico debe limitarse a aquellos casos en los cuales los resultados conlleven una información sobre el estado de infecciosidad del agente. Los otros empleos de estas pruebas, están destinados a obtener datos seroepidemiológicos que impliquen una anterior exposición al parásito, por ende tiene alto valor en el estudio de la prevalencia de las enfermedades parasitarias. Las pruebas más importantes en el diagnóstico inmunológico de enfermedades parasitarias son las siguientes:

Precipitación: Esta reacción se realiza cuando un antígeno soluble reacciona con su anticuerpo y forma un precipitado.

Aglutinación: Es una prueba en donde el antígeno celular o particulado se halla en suspensión, este antígeno aglutina con su anticuerpo específico.

FIoculacion: Esta prueba es una variante de la precipitación pero la reacción se manifiesta por formación de grumos.

Hemaglutinación indirecta: Con algunos antígenos parasitarios se sensibilizan glóbulos rojos, como resultado estos glóbulos rojos sensibilizados son aglutinados por anticuerpos específicos.

Fijación de complemento: Se realiza cuando un antígeno se pone en contacto con un anticuerpo específico en presencia de complemento.

Doble difusión: Consiste en poner en una serie de pozos los posibles anticuerpos contra un antígeno determinado. Al difundiisen antígeno y anticuerpo, forman al encontrarse específicamente una banda de precipitado.


169


Contrainmunoelectroforesis: Llamada también electroinmuno-difusión, la cual consiste en hacer reaccionar antígeno y anticuerpo en un gel sometido a campo eléctrico.

Inmunoelectroforesis: Esta prueba es una combinación de métodos fisioquímicos e inmunoquímicos, el material a investigar (antígeno) inicialmente es sometido a una separación por electroforesis y posteriormente se enfrenta al antígeno fraccionado con el suero (anticuerpo) a examinar, de tal manera que los antígenos y anticuerpos se difunden en un medio apropiado (gel) el uno hacia el otro para evidenciar la formación de bandas de precipitación al encontrarse.

Anticuerpos fluorescentes (Método indirecto): En el cual un suero desconocido (anticuerpo) se pone en contacto con antígenos conocidos, luego se añade antigamaglobulina marcada con fluoresceina y posteriormente se observa en microscopio de fluorescencia. Esta prueba ha sido modificada para obtener un antígeno soluble adherido a una base de acetato de celulosa y su lectura se realiza en un fluorómetro.

Análisis Inmunoenzimático: Es una prueba creada en esta década, consiste en ligar a un tubo o placa de poliestireno el antígen el cual se pone en contacto con suero (anticuerpo), posteriormente se nace contactar esta unión (antígeno-anticuerpo) con antiglobulina marcada con enzima y luego esta enzima se hace reaccionar sobre un substráete dando una reacción de color.

Intradermorreacción: Es una prueba consistente en la aplicación intradérmica de un antígeno determinado y la posterior reacción celular por la presencia de anticuerpos específicos.


170


Selección La selección de la prueba depende de las características de cada una de ellas en relación al estado de la enfermedad y al parásito que la produce, sinembargo, cada laboratorio debe estar familiarizado con un grupo de técnicas cuyo uso esté estandarizado y cumplan los objetivos para lo cual son empleadas y que sean de utilidad para el médico. Caracteristicas Una prueba inmunológica tiene las siguientes características:

Especificidad: La especificidad de una prueba está dada por la relación de individuos no infectados que den prueba positiva, de tal manera que hay dos tipos de especificidad: alta y baja. Alta especificidad significa que en presencia de individuos no infectados la posibilidad de que la prueba sea positiva (detecte anticuerpos) es mínima. La baja especificidad se refiere a que en presencia de los mismos individuos no infectados se puede hallar positiva la prueba en muchos individuos. Sensibilidad: La sensibilidad es la relación entre los individuos infectados que den una prueba positiva (detectar anticuerpos), generalmente se expresa como las otras características en porcentaje, así un 95% de sensibilidad quiere decir que la prueba es altamente sensible y que de cada 100 individuos infectados 95 dan la prueba positiva y 5% de sensibilidad significa que la prueba tiene baja sensibilidad y por lo tanto de cada 100 individuos infectados, 5 dan la prueba positiva. Reactividad La reactividad se relaciona con la cantidad de anticuerpos infectados, así una prueba de alta reactividad es aquella que detecta una mínima cantidad de anticuerpos y al contrario, una prueba de baja reactividad es la que detecta el nivel de anticuerpos cuando estos han llegado a cifras o diluciones altas. Por lo tanto la elección de la prueba es aquella que cumple con una alta especificidad y sensibilidad y se acompaña de una baja reactividad, lo que elimina en lo posible la determinación de anticuerpos cruzados o residuales de una infección previa. En general se considera la calidad de la reactividad para las siguientes pruebas, así:

Alta Reactividad: Hemaglutinación / Intradermorreacción Baja Reactividad: Fijación de complemento / Inmunoelectroforesis / Doble difusión /Contrainmunoelectroforesis

Aplicacion Aunque existen aproximadamente 24 entidades en donde es posible aplicar el inmunodiagnóstico, solo se utiliza en 18 enfermedades a nivel asistencial en los laboratorios clínicos y en nuestro medio la existencia y utilización de tales pruebas se reducen a no más de seis entidades.


171


PROTOZOARIOS

AMEBIASIS Aunque la amibiasis en nuestro medio es frecuente, su diagnóstico se realiza por las técnicas parasitoscópicas corrientes, sin embargo hay que considerar que si la amibiasis es invasiva las pruebas serológicas son de mayor valor que cuando la amiba está limitada a luz intestinal; entre estas dos presentaciones existen lesiones intermedias en las cuales es inflamatoria o ulcerativa y la utilización de las pruebas no sigue una norma general. Las pruebas más usadas para la amibiasis son:

Contrainmunoelectroforesis: Cuya positividad alcanza el 92% en personas con amibiasis invasiva y 7% en portadoras asintomáticos. Hemaglutinación indirecta: El título se considera positivo cuando alcanza valores de 1:128, pero en Colombia este título debe ser considerado como bajo, ya que esta prueba es de alta reactividad, sin embargo es una prueba muy específica, ya que solo es positiva en 1.2% de los pacientes sin evidencia de amibiasis. La prueba más específica pero de más bala reactividad que la Contrainmunoelectroforesis es la inmunodifusión. Actualmente se usa con cierta frecuencia una prueba a base de latex sensibilizado con antigeno, esta prueba tiene importantes restricciones por lo tanto su uso es muy limitado tanto por las reacciones cruzadas como por el mismo comportamiento biológico de la amiba.

Una prueba moderna es la utilización de análisis inmunoenzimático la cual tiene mayor sensibilidad que la fluorescencia. Sinembargo deben esperarse otros estudios para completar la información sobre el uso clínico de la prueba. También se ha descrito su utilidad para ei diagnóstico de enfermedad de Chagas, malaria y triquinosis. Hay consenso general de que la presencia de anticuerpos no refleja una infección activa y que su papel como protectores es dudoso.

TOXOPLASMOSIS Con los nuevos descubrimientos desde 1969, sobre el ciclo vital del toxoplasma y la implicación de felinos que como el gato entraron activamente en el ciclo evolutivo del toxoplasma y dada la importancia que este hecho reviste dentro de la epidemiología y la clínica, cada vez se recurre más al diagnóstico inmunológico de toxoplasma para completar el estudio epidemiológico o clínico, para aplicar el tratamiento y posteriormente para un control adecuado de los posibles riesgos para el paciente o su descendencia. La tradicional prueba del colorante denominada de Sabin y Feldman, la cual es muy sensible y especifica, ha sido reemplazada en la actualidad por otras pruebas menos peligrosas para el personal del laboratorio y de iguales características. Esta prueba se vuelve positiva en un período de dos semanas a partir de la infección


172


aguda y quizá la positividad perdura a través de la vida del individuo. La inmunofluorescencia es una de las pruebas que ha reemplazado satisfactoriamente a la prueba del colorante y está indicada en casos de toxoplasmosis aguda congénita porque puede determinar la IgM. Así, cuando un niño nace con defectos congénitos se hace la prueba al momento de nacimiento, si ésta da un resultado positivo se presentan dos alternativas: o que el niño tiene toxoplasmosis congénita activa o que los anticuerpos pasaron a través de una grieta placentaria, por ello se debe hacer una nueva prueba 3 o 4 semanas después y si ésta es positiva indica que hay una toxoplasmosis activa. Un resultado negativo indica que los anticuerpos pasaron a través de la placenta mecánicamente. Un título de 1:64 o superior tiene importancia clínica según algunos autores pero la mayoría acepta sólo como indicador de infección activa una cifra igual o superior a 1:128.

La fijación del complemento: Es la prueba que más tarda en dar resultados positivos y más tempranamente se vuelve negativa. Asi, cuando un suero es negativo por este método y presenta un título de 1:64 a 1:256 con las otras pruebas, quiere decir que se trata de una infección reciente o de anticuerpos residuales de una infección pasada. La Hemaglutinación indirecta: Es similar en sus resultados a la del colorante y se usa sobre todo en estudios epidemiológicos. Como da positiva más tardíamente que la de Sabin y Feldman tiene el problema de no poder determinar anticuerpos en la fase aguda de la enfermedad. En la interpretación de la prueba se deben tener en cuenta los siguientes títulos: 1:64. Refleja experiencia toxoplasmósica pasada, incluso de años atrás o una muy reciente exposición al parásito. 1:256 Reciente exposición, debe observarse evolución del paciente. 1:1024 Es una cifra significativa y nos indica probable toxoplasmosis. La inmunidad conferida por el toxoplasma es muy sólida, si se adquiere la enfermedad durante los dos primeros trimestres del embarazo es muy posible que tenga un hijo con toxoplasmosis congénita, pero un segundo hijo ya no presentará la enfermedad debido a la inmunidad conferida a la madre.

ENFERMEDAD DE CHAGAS Aunque recientemente en nuestro medio no se ha cuantificado la magnitud de este problema, hay zonas del país como los Llanos orientales en donde se presentan estos casos y los individuos que emigran a diversas partes del país introducen el problema diagnóstico. Las pruebas más utilizadas en el diagnóstico de este padecimiento son la hemaglutinación indirecta, la fijación de complemento y la inmunofluorescencia. Con la utilización de las tres técnicas en forma simultánea se obtiene una mayor sensibilidad y especificidad. En un período de 4-24 meses el 81% de los pacientes que han sido


173


sometidos a tratamiento, la prueba positiva retorna negativa. Se considera como títulos positivos las siguientes cifras:

Hemoglutinación indirecta 1:128 Fluorescencia indirecta 1:64 Fijación de complemento 1:8

Recientemente se ha adaptado la AGLUTINACION DIRECTA, la cual es una prueba muy sensible a sueros de pacientes con infección aguda porque en estos casos se eleva la IgM, la cual es detectada por este método, al contrario de lo que sucede en los casos crónicos donde hay más IgG, la cual es determinada por la prueba de hemaglutinación. La fijación de complemento determina las dos inmunoglobulinas.

Para la prueba de aglutinación directa se usa un antígeno preparado con epimastigotes (critidia) de T. Cruzi fijados y tripsinizados, habiéndose encontrado que la prueba es muy sensible y relativamente muy específica en relación a las reacciones cruzadas con leishmaniasis, se considera que un título de 1:512 o más alto es específico para la enfermedad de chagas, los sueros con títulos de 1:128 y 1:256 son dudosos y deben ser analizados por otras pruebas como la fijación de complemento y la inmunofluorescencia.

Los títulos altos de anticuerpos no parecen limitar la infección en el hombre, sinembargo se ha descrito inmunidad para cepas virulentas obtenidas con infecciones previas de cepas poco virulentas.

LEISHMANIASIS Las pruebas serológicas para diagnósticos de la leishmaniasis son utilizadas según el tipo de leshmanias que ataca al individuo y por ende según la forma clínica que presenta en el paciente, aunque en la actualidad una clasificación exclusivamente clínica de la enfermedad es más difícil y ofrece dificultades de determinación etiológica. . El tercer tipo de leshmania es la L.trópica, la cual produce la leishmaniasis cutánea; en este tipo hay divergencias en cuanto a si presentación en Colombia. Recientemente se han realizado clasificaciones de los diferentes tipos de leishmaniasis las cuales incluyen varios subtipos, que presentan una patología especial en una área determinada. Se utilizan pruebas como la fijación de complemento, la hemaglutinación indirecta y la fluorescencia indirecta, cada una de es tas pruebas tiene una muy buena aplicación en el diagnóstico de la leishmaniasis visceral causada por L.donovani.

La hemaglutinación indirecta se ha aplicado a pacientes con leishmaniasis cutánea y se efectúa con antígenos de las tres leishmanias, sinembargo su sensibilidad es baja.

La inmunofluorescencia se realiza con un anígeno en la forma de amastigote y los resultados para la leishmaniasis cutánea son buenos, los títulos decrecen con la quimioterapia. Una variante es utilizar el promastigote como antígeno y aunque los resultados son satisfactorios es una prueba muy compleja de realizar.

Recientemente se ha utilizado la prueba de aglutinación, empleando las formas de promastigote de las tres especies de leishmaniasis; la prueba es más sensible que la


174


Inmunofluorescencia para la leishmaniasis americana. Los títulos de aglutinación directa que se consideran positivos para cada uno de los tipos de leishmanias son:

1. L.braziliensis 1:32 2. L.donovani 1:64 3. L.trópicalis 1:128

MALARIA La inmunología parece brindar una esperanza y apoyo esencial al problema de la malaria, tanto para su prevención como para su diagnóstico seroepidemiológico.

Dos pruebas han sido utilizadas para el diagnóstico de la malaria, una de ellas, la fluorescencia indirecta, tiene una sensibilidad del 95%. Sin embargo se deben usar los antígenos homólogos debido al comportamiento del Plasmodium. Se sabe que títulos de 1:16 para esta técnica son considerados como positivos. Otro método es la hemaglutinación indirecta, la cual emplea antígenos de P. cynomolgy el título considerado positivo para esta prueba es superior o igual a 1:16.

HELMINTIASIS

CISTICERCOSIS La cisticercosis es tanto un problema en medicina humana como veterinaria, ya sea por las lesiones que en sí causa la trasmisibilidad accidental a que se está expuesto o a las pérdidas económicas.

Varias pruebas son usadas para el diagnóstico de la lesión: la fijación de complemento, la hemaglutinación indirecta, la doble difusión y la contrainmunoelectroforesis.

La mayoría de ellas carecen de sensibilidad y especificidad comprensible por la complejidad morfológica del estado larvatorio.

Quizá la prueba que mejor correlación ofrece entre el estado clínico del paciente y los resultados del laboratorio es la contrainmunoelectroforesis.

TOXOCARIASIS Las pruebas para toxocariasis han tenido una sensibilidad que no sobrepasa el 70% y además su especificidad es baja.

Las pruebas más utilizadas son la hemaglutinación indirecta y floculación con bentonita.

Otros Helmintos Para otras helmintiasis como son las esquistomiasis, equinococosis, triquinosis, paragominiasis o ascariasis existen pruebas immunológicas para su diagnóstico, pero o estas enfermedades no se presentan hasta el momento en Colombia o como en el caso de 1a ascariasis que aunque se presenta en Colombia, estas ayudas diagnósticas


175


son menos útiles que los métodos tradicionales. INTRADERMORREACCION Capítulo aparte son las pruebas intradérmicas que se utilizar en clínica para diagnóstico o evolución epidemilógica de alguna de las enfermedades ya mencionadas y para otras patologías, las cuales tienen el carácter experimental.

En las siguientes enfermedades las pruebas intradérmicas han sido evaluadas y tienen alguna aplicación:

Leishmaniasis Toxoplasmosis Clonorchiasis Equinococosis Paragonomiasis Esquistosomiasis Triquinosis. En forma experimental se han desarrollado pruebas por las siguientes entidades:

Amibiasis Ancylostomiasis Ascariasis Toxocariasis Filariasis Fascioliasis En nuestro medio la utilización de las pruebas intradérmicas son de muy poco interés, no solo por las condiciones epidemiológicas del país, sino por su utilidad en comparación con otras pruebas y otros análisis de práctica común.


176



177



178


CUADRO COMPARATIVOS


179


PARASITOSIS MAS COMUNES


180



181



182


DIAGNOSTICO SEGÚN LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE PARASITOS

TECNICAS DE DIAGNOSTICO DE CHAGAS


183



184



185


EXAMEN DE BIOPSIAS DEL TUBO DIGESTIVO

Las biopsias que son útiles para la búsqueda de parásitos son las obtenidas del antro

pilórico, duodeno y recto mediante endoscopías.

Los parásitos diagnosticados frecuentemente en biopsias del antro-pilórico y del

duodeno son Strongyloides stercoralis y Giardia lamblia, menos frecuente es la

observación de coccidias intestinales como Cryptosporidium y Cyclospora.

Las biopsias de ulceraciones del intestino grueso muestran Entamoeba histolytica o

Balantidium coli.

Las piezas operatorias que son objeto de examen histológico pueden demostrar la

presencia de parásitos intestinales, por ejemplo: Enterobius vermicularis adultos en la

luz del apéndice o Ascaris lumbricoides en una obstrucción mecánica de intestino, vías

biliares o conducto pancreático.

Recomendaciones La búsqueda de parásitos intestinales en cortes histológicos obtenidos por

biopsia o necropsia no requiere, en general, de técnicas de coloración

especiales.

La coloración de hematoxilina-eosina es útil, aunque generalmente no es posible

reconocer la morfología del parásito, pues el corte microscópico afecta su

integridad.

Las piezas anatómicas pueden conservarse en formol al 10% para ser usadas

como piezas de museo o muestras de referencia.


186


PREPARACION DE REACTIVOS Ac. acético 5% Se disuelven 5 ml de acido acético en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico. Acido acético 36% Se disuelven 36 ml de acido acético en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico. Ac. fénico 75% Se disuelven 5 ml de acido fénico en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico. Acido tricloroacético 5% Se disuelven 5 ml de acido tricloacetico e se llevan a 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico.

Alcohol ácido

Ácido clorhídrico (HCl) 3.0 ml

Etanol (95%9 97.0 ml

Primero se vierte el etanol y se le agrega después el HCl; la reacción provoca

calor.

Alcohol, formaldehído, ácido acético (AFA)

Reactivos

Etanol (95%) 30.0ml

Formaldehído 10.0 ml


Ácido acético glacial 10.0ml

La mezcla de etanol, formaldehído y agua destilada dura varios meses. Cuando

se agrega el ácido acético dura un mes.

Azul de metileno alcalino de Loêffler

Solución A

Azul de metileno 0.3g

Etanol (95%) 30.0 ml

Solución B

Hidróxido de potasio (0.10% peso) 100ml


187


Buffer fosfato (PBS) 0.01 M pH 7.2

Na2HP0412 H20 ...................................................... 2,60 g Na Na2P04 H20 ....................................................... 0,38 g NaCl....................................................................... 8,38 g Completar el agua a ..................................... 1000,00 mL

Carbolfucsina

Solución A

Fucsina básica 0.3g

Etanol (95%) 10.0 ml

Solución B

Fenol (cristales fundidos) 5.0g

Agua destilada 95.0ml

Se mezclan las dos soluciones y antes de su uso se dejan reposar una semana

Cloruro de sodio 2% Se pesan 20 g NaCl, se disuelven en agua destilada y se completa el volumen a 1000 ml en matraz volumétrico Cloruro férrico 3% Se disuelven 3 ml de cloruro férrico en 100 ml agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico.

Colorante de wright

Reactivos:

Colorante de wright en polvo

Alcohol metílico absoluto, libre de acetona.

Procedimiento:

Se pesan 0.60 grs. de colorante de wright y se disuelven en 360 ml de alcohol Fijador de Shaudinn

Alcohol etílico 95%......................................1 parte Solución saturada cloruro mercurio( disolver 9 gramos de cloruro de mercurio en 205 ml de agua destilada)…………….…..2 partes. Antes de usar agregue 5 ml de acido acético glacial a 100 ml de la solución fijadora.

Formaldehído 10% Se disuelven 10 ml de formaldehído en 90 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico. Formaldehído 40% Se disuelven 40 ml de formaldehído en 60 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico.


188


HCl 5% Se disuelven 5 ml de acido clorhídrico en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico. Hematoxilina férrica

Solución concentrada A

Hematoxilina 10.0 g

Etanol absoluto 1000.0ml

Solución concentrada B

Sulfato ferroso de amonio 10.0g

Sulfato férrico de amonio 10.0g

Ácido clorhídrico 10.0 ml

Agua destilada 1000.0 ml

Soluciones se almacenan a temperatura ambiente y su vida media es 6 meses.

Solución de trabajo

Solución concentrada A 15ml

Solución concentrada B 15ml

La solución de trabajo tiene vida media de 7 día Hidróxido de sodio NaOH 3% Se pesan 3 g de hidróxido de sodio lo más rápido posible para evitar la hidratación y la alteración del peso, se lleva 100 ml de agua destilada, se agita para homogenizar la solución. Se guarda en un FRASCO CON TAPON DE CAUCHO. NO SE DEBE UTILIZAR FRASCO CON TAPON ESMERILADO, pues los hidróxidos de sodio disuelven el vidrio y se sellan los frascos. Hidróxido de sodio - NaOH 10% Se pesan 10 g de hidróxido de sodio lo más rápido posible para evitar la hidratación y la alteración del peso, se agregan 100 ml de agua destilada, se agita para homogenizar la solución. Se guarda en un FRASCO CON TAPON DE CAUCHO. NO SE DEBE UTILIZAR FRASCO CON TAPON ESMERILADO, pues los hidróxidos de sodio disuelven el vidrio y se sellan los frascos. Lugol parasitológico

Solución madre Se disuelven 10 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua destilada y en seguida se agregan 5 g de yodo cristaloide, se agita constantemente para que se disuelva la mayor cantidad posible, se guarda en frasco ámbar. No importa que quede exceso de yodo en el fondo; esto se hace para que la solución permanezca con la concentración deseada durante mucho tiempo e inclusive se puede reintegrar el volumen con adición de agua destilada. Solución de trabajo de lugol. Se mezclan volumen a volumen solución madre de lugol y agua destilada. Se sugiere evitar los frascos goteros con bulbo de caucho porque el lugol los destruye rápidamente, es mejor utilizar frascos goteros especiales con tapón esmerilado


189


Merthiolate-yodo-formaldehído (MIF)

Solución concentrada:

Tintura de merthiolate 200.0ml

Formaldehído USP 25.0 ml

Glicerina 5.0 ml

Agua destilada 250.0 ml

Solución de yodo (lugol):

Yoduro de potasio 10.0g

Yodo cristaloide 5.0g

Agua destilada 100.0ml

Solución de trabajo:

Solución concentrada 2.35 ml

Solución de yodo 0.15 ml

La solución de trabajo se prepara en el momento en que se va a preservar la

muestra. En un recipiente se mezcla la muestra de matera fecal con la solución de

trabajo, pero conservando una relación de 1:3-5 (muestra: MIF).

PVA (alcohol polivinilico)

PVA 10 g

Alcohol etílico 62,5 ml

Cloruro de mercurio,acuoso saturado 125 ml

Cloruro de Mercurio 110 g



Glicerina 3 ml

Preparación

1 - Mezclar los ingredientes líquidos.

2- Agregar el PVA (no agitar)

3- Cubrir el erlenmeyer con papel aluminio, dejarlo toda la noche en

contacto. 4- Al día siguiente calentar hasta 75º C. Luego agitar hasta obtener una

solución homogénea ligeramente lechosa (30 segundos)


190


Reactivo de Benedict: solución de 17.3 g de sulfato de cobre cristalizado, 173 g de

citrato de sodio o potasio, 200 g de carbonato de sodio en 1.000 ml de agua destilada.

SAF

Acetato de sodio 1,5 g


Formaldehído al 40% 4 ml

Agua destilada 92,5 ml

Soluciones alcohólicas a partir de alcohol de 95%.

El alcohol del comercio viene a una concentración de 95%; como resulta demasiado caro el uso de alcohol absoluto para hacer soluciones alcohólicas de concentraciones variables, se puede partir de 95%, si se toma en consideración la siguiente regla. Es necesario recordar que el alcohol tiene qué ser puro de caña, pues el desnaturalizado, por contener sustancias que lo hacen tener mal sabor, hay interferencia en los procesos de tinción. Alcohol 70%: Se mezclan 70 volúmenes de alcohol de 95% y 30 volúmenes de agua destilada.

Solución buffer de fosfatos

Reactivos:

Fosfato monopotásico

Fosfato disódico

Procedimiento:

Se pesan 0.49 grs. de fosfato monopotásico y 1.14 de fosfato di sódico, se

mezclan y se disuelven hasta completar un volumen de 1000 ml en un matraz

volumétrico.

Solución de trabajo Giemsa

Reactivos:

Colorante de Giemsa en polvo

Glicerina QP.

Alcohol metílico

Solución buffer de fosfato

Procedimiento:

Primero se va a realizar la solución madre de giemsa. Se pesan 3.8 grs. de giemsa en polvo, se coloca en un mortero de 500 ml, se agregan 250 ml de glicerina, mientras que con el pistilo se mezcla con mucho cuidado hasta que


191


homogeneice y no haya grumos. Se agregan 250 ml de alcohol metílico absoluto libre de acetona. Se dejan 100 ml de alcohol sin incorporar La mezcla se vacía en un frasco oscuro, con el resto del alcohol se enjuaga el mortero y el pistilo de tal manera que no queden restos del colorante. Después de haber realizado la solución madre de giemsa, se mezcla volumen a volumen con la solución buffer de fosfato.

Solución de piramidón 3% Se disuelven 3 ml de piramidon en 100 ml destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico.

Sol. Salina 0.9% Se pesan 9 g NaCl, se disuelven en agua destilada y se completa el volumen a 1000 ml en matraz volumétrico. Solución de verde de malaquita y glicerina Se mezclan 1 ml de solución de verde de malaquita, 100 ml de glicerina pura y 100 ml de agua, se homogenizan y se guarda la solución, que es estable durante mucho tiempo, en un frasco ámbar de boca ancha y tapa de baquelita. Se recomienda cortar los cuadros de celofán y mantenerlos dentro del frasco con la solución de trabajo y así, siempre tendremos el material listo Solución 0.1 N de hidróxido de sodio Se pesan 4 g de hidróxido de sodio lo más rápido posible para evitar la hidratación y la alteración del peso, se coloca en un matraz volumétrico de un litro. Se agregan unos 100 a 200 ml de agua y se disuelve. Se afora el matraz a la marca y se agita para homogenizar la solución. Se guarda en un FRASCO CON TAPON DE GAUCHO. NO SE DEBE UTILIZAR FRASCO CON TAPON ESMERILADO, pues los hidróxidos de potasio y sodio disuelven el vidrio y se sellan los frascos. Sulfato de zinc 33% Sulfato de zinc…………… 33 grs. Agua destilada…………….aforar a 100 ml.

Disolver el sulfato de zinc en el agua destilada en un matraz de vidrio adecuado utilizando un agitador magnético.

Ajustar a la gravedad específica (δ) a 1.18 por la adición de sulfato de zinc o agua destilada, según sea el caso.

En el caso de muestras frescas formalinadas usar sulfato de zinc con gravedad especifica (δ) de 1.20.

Aforar y guardar el frasco de vidrio con tapón de rosca.

Marcar el nombre del reactivo, la concentración y la fecha de caducidad de doce meses posterior a la fecha de elaboración.

Almacenar a 4 ºC.

Checar la gravedad especifica ante de usar. Verde de malaquita 3% Se disuelven 3 g de verde de malaquita en 100 ml de agua y se guarda en frasco ámbar con tapón esmerilado. Xilol 25% Se disuelven 25 ml de xilol en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapón hermético no metálico.


192


GLOSARIO DE TÉRMINOS

AGENTE ETIOLOGICO: Factor o elemento de naturaleza viva o inerte, que inicia o perpetúa un proceso morboso.

AGENTE INFECCIOSO: Organismo (bacteriano, rickettsioso, viral, micótico, protozoario o helmíntico) capaz de producir una infección o una enfermedad infecciosa.

ANTROPOFILIA: Apetencia selectiva de ciertos artrópodos por la sangre humana. (Ej.: Pediculus capitis).

ARACNIDO: Artrópodo con 4 pares de patas.

ARTROPODOS: Invertebrado con patas articuladas y esqueleto quitinoso.

AXOSTILO: Estructura rígida de posición axial que constituye el sostén de algunos protozoos flagelados.

BIOTOPO: Lugar o área donde vive una especie. Está caracterizado por factores del suelo, climáticos y biológicos.

BOTRIUM: Surco longitudinal que sirveun como elemento de fijación en el escólex de cestodos seudofilideos. Plural: botria.

CALCIFICACION METASTASICA: Calcificación patológica que se produce en tejido necrosado.

CICLO EVOLUTIVO: Etapas secuenciales del desarrollo de un parásito. Si existen fases sexuales, comprende desde el cigoto hasta la generación de gametos, o desde el huevo hasta el estado adulto.

CICLO DE TRANSMISION: Etapas por las cuales pasa un parásito desde el huésped infectado hasta un huésped susceptible.

COLONIA: Grupo de organismos unicelulares que viven en asociación, a menudo derivado de una sola célula.

COMENSALISMO: Relación simbiótica en la cual una especie, el comensal, vive a expensas de otra especie, el hospedero, sin ocasionarle ningún daño.

CONTAMINACION: Presencia de agentes infecciosos en objetos (ropa, instrumentos, juguetes), sustancias inanimadas (agua, leche, alimentos) o en la superficie de organismos vivos.

CTENIDIO: Peine característico de la cabeza y porción anterior del tórax en las pulgas.

CONTACTO: Individuo (humano o animal) que ha estado en asociación con un individuo infectado, teniendo la oportunidad de adquirir la infección.

CONTAGIO: Transferencia directa del agente infeccioso desde la fuente de infección al nuevo huésped.

CONTROL: Conjunto de medidas para reducir la prevalencia o incidencia de una enfermedad o infección.

DEPOSICION: Evacuación intestinal.


193


DEYECCION: Descarga o deposición de materias excrementicias, especialmente fecales.

DIARREA: Eliminación de deposiciones con mayor contenido de agua que lo normal (contenido normal de agua: 85%).

DISENTERIA: Evacuación frecuente de deposiciones, generalmente en escasa cantidad las cuales contienen sangre y mucosidades. Por lo general traduce inflamación del colon y se acompaña de dolor abdominal, pujo y tenesmo.

ECTOPARASITO: Parásito que vive en la superficie externa del hospedero.

EMBRIOFORO: Cubierta que rodea a la oncósfera de los platelmintos.

ENDOPARASITO: Parásito que vive en el interior del hospedero.

ENFERMEDAD: Conjunto de fenómenos que se producen en un organismo a consecuencia de la acción de una causa patógena, reaccionando contra ella.

ESCOLEX: Organo de fijación o "cabeza" de un cestode.

ESTROBILA: Conjunto de proglótidas de un cestode.

EXUVIA: Muda resultante de las ecdisis.

ECOLOGIA: Estudio de las relaciones recíprocas entre los organismos y las regiones donde viven.

EMBRIOFORO: Membrana (s) que envuelve (n) al estado embrionario de los cestodes (oncosféra), cuyo conjunto constituye el huevo.

ENCUESTA: Conjunto de acciones destinadas a lograr una información sobre un objetivo determinado.

ENCUESTA EPIDEMIOLOGICA: Conjunto de métodos usados para obtener datos que sirvan para caracterizar un fenómeno en una comunidad. Orienta y permite obtener información sobre la prevalencia de casos clínicos, portadores, contactos y susceptibles, o bien, sobre el factor o factores causales o vinculables al proceso que se investiga.

ENDEMIA: Prevalencia elevada y mantenida de una enfermedad humana determinada dentro de un área geográfica.

ENZOOTIA: Prevalencia elevada y mantenida de una enfermedad animal determinada dentro de un área geográfica.

EPIDEMIA: Producción, en una comunidad o región, de casos similares en un determinado período, en número claramente superior a la frecuencia habitual y derivados de una fuente común o por diseminación.

EPIZOOTIA: Lo mismo que epidemia, pero referido a animales.

INESPECIFICIDAD. Porcentaje de casos en que la reacción resulta falsamente positiva.

ESPOROGONIA: Fase de reproducción sexuada de los esporozoítos.

ESPOROZOO: Protozoo parásito que se reproduce por esporogonia.


194


ESPOROZOITO: Elemento resultante de la esporogonia de los esporozoos.

ESQUIZOGONIA: Ciclo de reproducción asexuada de los esporozoos.

ESQUIZONTE: Elemento resultante del ciclo esquizogónico.

ESTROBILA: Conjunto total de proglótidas que constituyen el cuerpo de un cestode.

EXCRETAS: Productos de desperdicios líquidos y sólidos procedentes de seres humanos y de animales.

FOMITE: Objeto (agua, aire, toalla, etc.) que contiene elementos infectantes y pasivamente puede ser vehículo mecánico en su transmisión indirecta.

FORMA INFECTANTE: Fase del parásito capaz de infectar el huésped.

FRECUENCIA: Número de veces que se ha verificado o registrado un suceso o una característica determinada en una población.

FUENTE DE INFECCION: Persona, animal, vegetal o sustancia desde la cual el agente infeccioso pasa al huésped.

GAMETOGONIA: proceso de reproducción sexuada de los esporozoos.

GEOHELMINTIASIS: Infecciones trasmitidas por helmintos que requieren del suelo y ciertas condiciones ambientales favorables para llegar a ser infectantes.

HABITAT: Lugar donde en forma natural vive un ser biológico.

HECES: Materias fecales.

HELMINTO: Nombre genérico de los vermes parásitos y que abarca acantocéfalos, nematodos, cestodos y trematodos.

HUESPED: Persona o animal que alberga a un agente o comensal. También suelen utilizarse los términos hospedador, hospedero y mesonero.

HUESPED DEFINITIVO: Hospedero en el cual el parásito alcanza su madurez sexual.

HUESPED INTERMEDIARIO: Hospedero en el cual el parásito desarrolla parte de su ciclo evolutivo, sin alcanzar su madurez sexual.

ICTIOFAGO: Animal que se alimenta de peces.

IMAGO: Artrópodo adulto. Se usa especialmente en el caso de insectos.

INFECCION: Entrada y desarrollo o multiplicación de un agente infeccioso en el organismo de una persona o animal.

INFESTACION: Alojamiento, desarrollo y reproducción de artrópodos en la superficie del cuerpo, pelos, ropas objetos e incluso ambientes. Se emplea también en el caso de roedores.

INSECTO: Artrópodo con 3 pares de patas.

INCIDENCIA: Número de casos nuevos de una enfermedad que se presentan durante un período determinado, en relación con la población donde ocurren. Generalmente se expresa en forma de tasa.


195


INSECTICIDA: Sustancia química, natural o sintética, utilizada en el exterminio de artrópodos. Se puede aplicar en forma de polvo, líquido, pulverizado, o aerosol.

LARVA: Forma inmadura en el ciclo evolutivo de helmintos y artrópodos.

LIENTERIA: Diarrea que contiene alimentos sin digerir.

LETALIDAD: Relación entre el número de casos mortales y el número total de casos de una determinada enfermedad.

LETRINA: Instalación para la recepción de excretas humanas.

MECANISMO DE TRANSMISION: Las circunstancias mediante las cuales el parásito pasa de un huésped a otro.

MEROZOITO: Célula resultante del proceso de esquizogonia o división múltiple que presentan algunos protozoos.

METAZOO: Animal Pluricelular.

MORBILIDAD: Relación entre el número de afectados de una enfermedad determinada y la población total de una zona.

MORTALIDAD: Relación entre el número de muertos por todas las causas y la población total de una zona.

MUDA: (ECDISIS): Vaina o tegumento que envuelve a artrópodos y a algunos gusanos (nematodos) y que en las etapas juveniles, de crecimiento, se desprende dando lugar a una nueva envoltura que puede desprenderse a su vez o ser definitiva.

MUTUALISMO: Tipo de simbiosis en la cual se benefician recíprocamente hospedero y simbionte.

MYASIS: Parasitación de órganos o tejidos humanos o animales por larvas de mosca.

NEMATELMINTO: Son gusanos de sección redonda (algunos son parásitos).

NINFA: Estadios juveniles tanto de insectos con metamorfosis incompleta como de ácaros y garrapatas.

ONCOSFERA: Larva con seis ganchitos que emerge de los huevos de los eucestodos. También se llama hexacanto.

OOQUISTE: Forma quística que contiene el cigoto resultante de la esporogonia en los Apicomplexa y los cuales pueden estar cubiertos por una envoltura translúcida (Isospora) o estar desnudos (Plasmodium).

OOTECA: Receptáculo elaborado por las hembras de algunos artrópodos en cuyo interior depositan sus huevos (Ej.: cucarachas y arañas).

OPERCULO: Cubierta o tapa de los huevos de algunos platelmintos e insectos.

PARASITO: Ser que vive a expensas de otro de distinta especie llamado huésped y al cual puede producir daño de magnitud variable.

PARASITO ACCIDENTAL: Parásito que se encuentra en un huésped no habitual.


196


PARASITO FACULTATIVO: Es aquel que desarrolla algunos protozoarios y hongos que viven sobre materias orgánicas en descomposición, pero en ocasiones parasitan sobre heridas, ulceraciones, etc.

PARASITO OBLIGADO: Es aquel que necesariamente en alguna etapa o permanentemente ejerce su acción parasitaria.

PARASITO PERIODICO: Parásito que cumple parte de su ciclo en el ambiente y en el huésped.

PARASITO PERMANENTE: Parásito que vive toda su existencia en o sobre su hospedero.

PARASITO TEMPORAL: Parásito que intermitentemente depende de un hospedero para subsistir y luego lo abandona.

PERIODO PREPATENTE: Etapa de la infección parasitaria comprendida desde el momento de la infección hasta la aparición de la sintomatología o la presencia del parásito.

PLATELMINTO: Gusano de sección plana, todos son parásitos (excepción planarias).

PORTADOR (INFECTADO ASINTOMATICO): Individuo que alberga un agente infeccioso específico, sin presentar manifestaciones de enfermedad y que puede ser fuente de infección para otros individuos.

PROGLOTIDA: Segmento de la estróbila de los cestodos, la cual contiene los órganos reproductores masculinos y femeninos.

PROTISTA: Agente biológico con caracteres del reino vegetal y animal (hongos, bacterias y virus).

PROTOZOO: Animal unicelular.

PERIODO DE INCUBACION: Intérvalo que transcurre entre la infección de un sujeto susceptible (persona o animal) y el momento que presenta las primeras manifestaciones de la respectiva enfermedad.

PESTICIDAS: Sustancias químicas que se usan para combatir distintas plagas (Ej.: insecticidas, rodenticidas, moluscocidas, herbicidas).

PREDADOR: Ser que ataca y destruye animales o plantas para obtener alimento; habitualmente organismos más pequeños y más débiles que constituyen su presa.

PREVALENCIA: Número de casos de una infección o enfermedad que existe en un grupo específico de población en un momento determinado.

PREVENCION: Medidas para proteger al hombre o animales contra una enfermedad. Pueden ser independientes de las destinadas al control.

PROFILAXIS: Conjunto de medidas que sirven para prevenir o atenuar enfermedades o dolencias, o sus complicaciones o secuelas.

PUPA: Etapa en la metamorfosis de los dípteros, caracterizada por la existencia de un pupario en cuyo interior se producen importantes cambios que culminan con la formación del imago o insecto adulto.


197


QUISTE: Forma inmóvil de resistencia y de multiplicación, envuelta por una doble membrana formada por los protozoos.

RESERVORIO (DE AGENTES INFECCIOSOS): Hombre, animal, planta, suelo o materia orgánica inanimada, en los cuales el agente infeccioso vive y se multiplica, y de los que depende principalmente para su subsistencia, de manera que pueda ser transmitido a un huésped susceptible.

RESISTENCIA: Conjunto de mecanismos que algunas especies tienen para defenderse de la invasión o multiplicación de agentes patógenos, o contra los efectos nocivos que pueden causar los productos tóxicos, ya sea producidos por éstos o de otra procedencia. (Ejs.: resistencia del hombre a algunos microorganismos; resistencia de algunos microorganismos a antibióticos y quimioterápicos; resistencia de algunos artrópodos a insecticidas).

SANEAMIENTO: Aplicación de procedimientos especiales para procurar que los factores del medio resulten impropios para mantener o vehiculizar agentes o causas de enfermedades.

SANEAMIENTO AMBIENTAL BASICO: Adecuado suministro de agua potable, disposición de excretas y eliminación de basura.

SENSIBILIDAD (DE UNA REACCION INMUNODIAGNOSTICA): Porcentaje de resultados positivos encontrados en individuos afectados por una determinada infección.

SEROLOGIA (REACCION): Reacción inmunodiagnóstica de laboratorio que se practica en el suero de un sujeto sospechoso con el objeto de detectar anticuerpos y/o antígenos producidos frente a una determinada infección.

SIMBIOSIS: Condición en la cual dos seres vivos de diversas especies, habitualmente (pero no necesariamente) viven juntos, con beneficio para uno o para ambos.

SUSCEPTIBLE: Persona o animal que carece de resistencia contra un agente patógeno y que en consecuencia puede contraer la enfermedad si se expone a la infección por dicho agente.

TROFOZOITO: Forma vegetativa activa y que se alimenta, entre los protozoos.

VECTOR: organismo animal, generalmente artrópodo, que puede transportar activamente un agente desde la fuente infectante hasta un susceptible.

VECTOR MECANICO: Es el vector que lleva en el exterior de su cuerpo o en interior agentes patógenos.

VIA DE INFECCION: Sitio (s) a través de los cuales se introduce el agente etiológico en el organismo del huésped.

XENO: Huésped.

ZOONOSIS: Infección que se transmite en forma natural entre el hombre y animales vertebrados y viceversa


198


ALGORITMOS DIAGNOSTICOS


199



200



201



202


ALGORITMO DIAGNOSTICO TRYPANOSOMIASIS


203


DIAGNOSTICO TRYPANOSOMIASIS CONGENITA


204



205



206


PUZZLE – PARASITOLOGIA

entamoeba

plasmodium

quiste

cruzi

huevo

nana

toxoplasma

hominis

tenia

trichuris

m n a b e o m a t n e v s

o m u i d o m s a l p i t

a a t r i a t o m a l v r

m x r s r r d i a a a a o

s j i a g a h c r u m x n

a s c a r i s o c z b q g

l l h n q g c l v i l u y

p e u a r r t i l m i i l

o v r n e c a t o r a s o

x o i t e n i a y e v t l

o t s i n i m o h c s e d

necator

triatoma

coli

strongyloides

chagas

giardia

ascaris

vivax

lamblia

stercoralis


207


EXAMEN PRACTICO:………………………….

COLOQUE EL NOMBRE DE LA ESTRUCTURA(s) PARASITARIA(s) QUE

OBSERVA EN EL MICROSCOPIO ( CAMPO O PUNTERO ) Y/O METODO O

COLORACION UTILIZADA (SEGÚN INDIQUE EL DOCENTE)

1. ……………………………………………………………………………………………

2. ……………………………………………………………………………………………

3. ……………………………………………………………………………………………

4. ……………………………………………………………………………………………

5. ……………………………………………………………………………………………

6. ……………………………………………………………………………………………

7. ……………………………………………………………………………………………

8. ……………………………………………………………………………………………

9. ……………………………………………………………………………………………

10. ……………………………………………………………………………………………

NOMBRE ALUMNO : ……………………………………………………………………..

FECHA : …………………………… NOTA :

………………………………


208


ATLAS PARASITOS


209



210



211



212



213



214



215


BIBLIOGRAFIA

1. Alvarez B. Parasitosis intestinales: aspectos diagnósticos. Ginebra: OMS; 1964. Serie de Informes Técnicos.

2. Atías y col. Parasitología Clínica. Publicaciones Técnicas Mediterráneo, Santiago

Chile 1991

3. Beltrán M. Enteroparásitos. Manual de nivel local. Washington DC: OPS; 1993.

4. Botero, d. Y restrepo, M. 1998. Parasitosis humanas. Corporación para

investigaciones biológicas, Medellín, Colombia.

5. Bos, H. J., and Van Den eijk, A. A.: Emzime inmunosorbent assay (E LISA) in

Serodiagnosis of amebiasis. Conference International Amebiasis. IMSS, México,

p 721. 1975.

6. Brown, W.: Parasitología Clínica. Interamericana, México. 4a edi ción. 1976.

7. Cohén, S., Sadun, H.: Inmunology of Parasitic Infection. Blackweil, Edigburgh,

1996.

8. Concepción gimeno cardona. Recomendaciones generales para el control de

calidad interno en Microbiología Clínica

9. Faust, E., Craig. R.: Parasitología Clínica, Salvat, México. 4a edición, México,

1990.

10. García L., Bruclanes D. Diagnostic Medical Parasitology. Clínical Microbiology,

Clinical Laboratorioes UCLA Medical Center, Los Angeles. Elsevier Science

Publisher 1988

11. Gutiérrez Y. Diagnosis of Important Parasitic Diseases. Laboratory

Management:Payment for Hospital-Based Pathologist Services. Clinics in

Laboratory Medicine 1991; 11:1089.

12. INS- Manual de procedimientos de Laboratorio - Serie de Normas Técnicas

/Lima – 2003

13. Kagan, I. G.: Advances in the Inmunodiagnosis of Parasitic Infec-tiones. 2.

Parasitenk. 45: 163 - 195, 1994.

14. Koneman m. Elmer Diagnóstico microbiológico : texto y atlas color / 5ª ed.

Buenos Aires: Panamericana, 1999

15. Leventhal, ruth Parasitología Médica : texto autodidáctico.1a. ed, México,

Interamericana.. .


216


16. Murray. P. R. Microbiología Médica. 2006. Mosby

17. Organización Mundial de la Salud. Métodos básicos de laboratorio en parasitología. Ginebra: OMS; 1991.

18. Organización Mundial de la Salud. Medios auxiliares para el diagnóstico de las parasitosis intestinales. Ginebra: OMS; 1995.

19. Pierce G. Health Issues of International Travelers. Infectous Disease Clinics of

North America 1992 Vol 6 número 2. Philadelphia. Saunders Company

Philadelphia.

20. Rose N. R., Friedman, H.: Manual of clinical Inmunology, American Society for

Microbiology, Washington, 1986.

21. Shore L, Lawrence R. Diagnostic Parasitology. Manual of clinical laboratory. C.V Mosby Co.; 1975.

22. Tiersen D. and col. Clinical and Economic Practice of Quality, Control Clinics in

LaboratoryMedicine. December 1986. Saunders Company. Philadelphia.

23. Zaman, v. 1982. Atlas de Parasitología Clínica. Ed. Panamericana, México,

guia parasitologia ..julio 2013

Documents