141Capítulo 5 Automatización en Hematología: Contadores Multiparamétricos

Figura 5.25

mezcla se hace en reactivo con la intención de destruir los eritrocitos y fijar los leucoci-tos, preservando sus características f ísicas. En la segunda fase de dilución, se mezcla con reactivo que colorea los gránulos de los eosi-nófilos, lo que mejora la forma de diferencia-ción de esas células para con los neutrófilos. La muestra, entonces diluida, para por un sistema multi-detector que evalúa simultá-

neamente características de impedancia y ab-sorción de luz y, así, diferencia los leucocitos en cuatro partes (en verdad, seis partes, pues es capaz de detectar la presencia de linfocitos atípicos o blastos de pequeño porte, y células grandes mal coloreadas, las LIC).Canal WBC/ Baso: parte de la muestra aspi-rada es diluida en un reactivo cuya función es la de destruir los eritrocitos y todos los

Citogramas para leucocitos Cell-Dyn Sapphire-Abbott.

Lobularidad

Tamaño Complejidad

Tamaño

Eosinóf.Eosinóf.

Gra

nula

r

Gra

nula

r

mono monolinfo linfo

Neutróf Neutróf.

Neutróf.Neutróf.

142 Hemograma: Cómo Hacer e Interpretar

leucocitos, con excepción de los basófilos. Secuencialmente, la muestra diluida pasa por un sistema de apertura de impedancia simple (DC) en la cual se cuentan los ba-sófilos.

Fundamentos de la tecnología CobasLa tecnología Cobas consiste en un colorí-metro a 540nm, dos sistemas de abertura de impedancia simple y un detector múl-tiple que combina impedancia eléctrica y absorción óptica para recuento diferencial.

Sistema de Apertura de impedanciaSistema 1: sistema de recuento con apertu-ra de 100µm de diámetro sin foco hidrodi-námico (mismo canal donde se dosifica la hemoglobina). Se usa para recuento de leu-cocitos (y medición de sus volúmenes – pa-ra aparatos con diferencial de tres partes).Sistema 2: segundo canal de recuento con abertura de 50µm de diámetro, sin foco hidrodinámico. Se usa para conteo y de-terminación del tamaño de los eritrocitos y plaquetas. El límite de 2µm3 se utiliza para discriminar las plaquetas de los ruidos eléc-tricos. A pesar de no utilizar el foco hidrodi-námico, la edición de pulsos se hace solo para las señales eléctricas de trayectoria axial, de modo de evitar que las señales eléctricas de trayectoria no axial (de células que puedan haber circulado en la zona de conteo) sean eliminadas. Después de que los eritrocitos y plaquetas son discriminados, el VCM (fL) se obtiene como promedio y el RDW, como desviación estándar de la amplitud de seña-les que corresponden a los volúmenes, y se expresa como porcentaje del promedio, es decir, como coeficiente de variación (%). De modo análogo, se determinan el VPM y el

PDW para plaquetas, donde el PDW incluye solo una amplitud de 70% de las señales en torno al promedio (VPM).Sistema 3: tercer canal de recuento con abertura de 80µm de diámetro, sin foco hidrodinámico. Se usa para el recuento de basófilos.Sistema de citometría de flujo Cobas que asocia un transductor de señal óptica con foco hidrodinámico y abertura de impedan-cia: En este canal de recuento se acoplan un transductor de señal óptica para absorción de luz y un detector de abertura de impe-dancia, y se utiliza también un sistema de foco hidrodinámico. En este sistema, el foco hidrodinámico limita la zona de sensibilidad de volúmenes, proporcionando que las cé-lulas que pasan por los detectores secuen-ciales, una a una, por medio de flujo conti-nuo, sean contadas de modo exacto y tengan medidos sus impulsos eléctricos de baja fre-cuencia y sus caracteres ópticos. La abertu-ra de impedancia de 60µm de diámetro, con foco hidrodinámico asociado, permite el re-cuento y la definición de los volúmenes leu-cocitarios. La transmisión óptica determina la complejidad interna de los leucocitos.

De forma práctica, en los instrumentos Cobas Argos 5 Diff y Cobas Argos 5000, el recuento en el canal diferencial incluye seis (cuatro + dos) partes (neutrófilos, eosinófi-los, monocitos, linfocitos, además de los lin-focitos atípicos o blastos pequeños, y células grandes mal coloreadas, las LIC, que pue-den incluir granulocitos inmaduros y blas-tos mayores). Este recuento diferencial de seis partes asociado al canal para recuento de basófilos permite que tales instrumentos puedan realizar el recuento diferencial en siete partes.

143Capítulo 5 Automatización en Hematología: Contadores Multiparamétricos

Figura 5.26

Sistema ABX (Horiba, ABX Diagnostics®)

El sistema ABX era anteriormente repre-sentado por la Roche Diagnostics (Sistema Cobas Argos). La Roche, actualmente, re-presenta los contadores Sysmex.

La tecnología utilizada por los conta-dores más sofisticados de la ABX (repre-sentados hoy por Horiba) se basa en seis métodos de análisis que incluyen, aislada o simultáneamente, la impedancia eléctrica, la fotometría (dosificación espectrofotomé-trica), la citometría de flujo (células anali-zadas en un flujo continuo), la fluorometría (detección de fluorocromos – intensidad de fluorescencia en las células marcadas con fluorocromos), la citoquímica y el sistema DHSS: En resumen, el conteo global de cé-lulas (CBC) se hace por impedancia eléc-trica y fotometría (para dosificación de he-moglobina); el recuento diferencial se hace simultáneamente por medio de impedancia eléctrica, citometría de flujo, citoquímica y sistema DHSS; el recuento de reticuloci-tos se hace simultáneamente por medio de impedancia eléctrica, citometría de flujo, fluorometría y sistema DHSS; el recuento de

eritroblastos se hace utilizando un sistema integrado de todos los métodos de análisis, excepto la fotometría.

La patente ABX para recuento diferen-cial se basa en el sistema DHSS (double hydrodynamic sequential system – sistema secuencial hidrodinámico doble – Figura 5.26). Este sistema permite medir el volu-men de la célula y su contenido en un úni-co flujo celular. Se aplica un dispositivo de tiempo en dos evaluaciones (conteos) en un mismo flujo continuo, en momentos distintos (no simultáneos): el paso inicial de la célula por el sistema de abertura de impedancia eléctrica (primera evaluación de la célula) se combina con su paso poste-rior a través de un haz de luz halógena; éste, a su vez, en un período de tiempo menor a 200 microsegundos (segundo conteo), para la perfecta absorción de luz de la célula y determinación de su contenido. El tiempo escaso del segundo paso evita el conteo de burbujas o conteo estático que resultará en una diferenciación cuidadosa de los leuco-citos en linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos (sistema ABX matriz LMNE, que cruza valores de volumen y absorción de luz). Esta matriz ABX LMNE también

Sistema secuencial hidrodinámico do-ble (DHSS) que permite medir el volu-men y el contenido celular en un único ciclo.

Absorbancia (Contenido celular)

Sistema DHSS: ABX

Impedancia (Volumen

celular)

144 Hemograma: Cómo Hacer e Interpretar

Figura 5.27

incluye linfocitos atípicos y células grandes e inmaduras (Figura 5.27)

Para el recuento diferencial en cinco partes, cada célula de la serie blanca se es-tabiliza en su forma nativa y luego se apli-can tres principios de medidas. El referido sistema DHSS incluye: impedancia (para medir el volumen – focused flow impedan-ce) y citometría celular (por medio de la absorción de luz halogénica como pará-metro para medir la complejidad interna, es decir, el contenido celular), asociado a un sistema de citoquímica.

La tecnología ABX está sintetizada en la Figura 5.28.

Sistema AbX modelo Pentra dX 120

Sistema con capacidad para 120 muestras/hora. Funciona en modo abierto o cerrado. Posee cuarenta y cinco parámetros: doce para CBC, veinte para recuento diferencial, diez para recuento de reticulocitos y tres para recuento de eritroblastos, incluyen-do: WBC, RBC, HGB, HCT, VCM, HCM, CHCM, RDW, VPM, PCT, PLT, PDW% (L,M,N, B, E), # (L,M,N,B,E), Ly atípicos (% y #) y LIC – células grandes inmaduras (% y #), células granulocíticas inmaduras – IMG (% y #), células monocíticas inmaduras – IMM (% y #), células linfocíticas inmaduras

Linfocitos

Sistema de detección de células inma-duras, Pentra DX- 120, Sistema Horiba- ABX.

Sistema doble matriz: ABX

Tecnología ABX: Pentra DX 120

Neutrófilos maduros

Eosinófilos

Precursores granulocíticos

Precursores monocíticos

Precursores linfoides

Figura 5.28

Métodos de análisis utilizados por el ABX: (1) = láser de Argón; (2) = foto-multiplicador; (3) = citómetro de flujo; (4) = impedanciometría; (5) = medi-ción óptica.

1

2

3

4

5