Gibt es einen Einfluß der Tageszeit auf die Strahlenempfindlichkeit von Ratten und

Mäusen? U R S U L A REINCKE

Klinisches Strahleninstitut der Universität Freiburg i. Br.

(Z. Naturforsch. 23 b, 393—394 [1968]; eingegangen am 18. Oktober 1967)

Der tageszeitabhängige Aktivitätsrhythmus der Nage-tiere ist bekannt, und die Frage einer Beziehung zwi-schen der Tageszeit und der Strahlenempfindlichkeit von Ratten oder Mäusen wird seit einigen Jahren immer wieder aufgeworfen. Zur Prüfung dieser Frage diente folgendes Experiment: 288 männliche und weibliche Wistar-Ratten im Alter von 32 ± 2 Tagen wurden streng zufällig auf 4 Gruppen verteilt, die eine Röntgenganz-bestrahlung um 0, 6, 12 oder 18 Uhr an einem von drei aufeinanderfolgenden Tagen erhielten. Ein Geschlechts-unterschied der Strahlenempfindlichkeit besteht bei dem verwendeten Tierstamm nicht. Jeder Kasten mit 6 Rat-ten erhielt eine von 5 Dosen zwischen 380 und 610 R in zufälliger Reihenfolge. Die Bestrahlungsbedingun-gen waren: 200 kV, 20 mA; Filter 0,2 Cu + 1,2 AI; HWS 0,81 Cu; FA 50 cm; Dosisleistung 1 0 8 - 1 1 6 R pro Minute. Anordnung und Dosimetrie wurden bereits genauer beschrieben 1. Die Tiere lebten bei künstlicher Beleuchtung (ca. 7 — 19 Uhr) in einem Kellerraum bei ca. 24 °C. Sie wurden in transparenten Makroionkäfigen gehalten und erhielten Wasser und Altromin-Pellets ad libitum. Die Beobachtungszeit erstreckte sich über 30 Tage nach der Ganzbestrahlung.

Die Absterberaten gehen aus Abb. 1 hervor. Man fin-det keinen systematischen Unterschied zwischen den Ta-geszeiten, obgleich die Abweichungen infolge der nied-rigen Zahl von nur 12 oder 18 Ratten pro Gruppe und Tageszeit recht beträchtlich waren. Die Ergebnisse fü-gen sich gut zusammen und lassen sich durch eine ge-meinsame Probitgerade mit engem Vertrauensbereich repräsentieren. Die LD 50(30) beträgt demnach 483 (467 — 498) R, wobei der 95%-Vertrauensbereich die-ser Schätzung in Klammern steht. Es wurden auch Probitanalysen für jede einzelne Tageszeit durchgeführt. Sie führten zu LD 50(30)-Werten von 468(432-503) R für die Zeit 0 Uhr, von 499 R für 6 Uhr, 493 R für 12 Uhr und 466 (428-498) R für 18 Uhr. Die 95%-Vertrauensgrenzen sind, sofern sie überhaupt angege-ben werden konnten, erheblich breiter als bei der ge-meinsamen Datenauswertung und überlappen sich weit-gehend. Es wird deutlich, daß keine signifikanten Un-terschiede hinsichtlich der Tageszeit bestanden. Damit darf die Frage nach einem tageszeitbedingten Einfluß

1 U . REINCKE, J . MELLMANN U. M . ROTHER, S t r a h l e n t h e r a p i e 129, 622 [1966].

2 R . F . KALLMAN, G . SILINI U. E . FRINDEL, J a p . J . G e n e t i c s , Suppl. 40 ,207 [1965].

3 K. PETERS, Strahlentherapie 121, 554 [1963]. 4 R . RUGH, V . CASTRO, S . BALTER, E . V . KENNELLY, D . S .

MARSDEN, J . WARMUND U. M . WOLLIN, S c i e n c e [ W a s h i n g t o n ] 142 ,53 [1963].

5 R. L. STRAUBE, Science [Washington] 142, 1062 [1963].

ÜR % 97

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

3

300 400 500 600 700 R

Abb. 1. 30-Tage-Uberlebensraten nach Bestrahlung zu 4 ver-schiedenen Tageszeiten. Die an die Beobachtungsdaten ange-paßte Probit-Regressionsgerade ist mit dem 95%-Vertrauens-bereich eingezeichnet. Abszisse: Bestrahlungsdosis. Ordinate: Absterberate in Prozent, Einteilung nach dem sog. Wahr-

scheinlichkeitsnetz.

auf die Strahlenempfindlichkeit für den vorliegenden Versuch verneint werden.

KALLMAN U. a.2 kamen mit einer ähnlichen experi-mentellen Anordnung an Mäusen zum gleichen Ergeb-nis. Auch andere Untersuchungen konnten keinen Ein-fluß der Tageszeit auf die Überlebensrate nachweisen3-5. Auf die Möglichkeit tageszeitbedingter Unterschiede der Strahlenempfindlichkeit hatte zuerst PIZZARELLO 6 hin-gewiesen, der von 20 abends um 21 Uhr bestrahlten Ratten alle verlor, während von 20 morgens um 9 Uhr bestrahlten Ratten alle überlebten. In einer späteren Arbeit7 untersuchte er 7 Tageszeiten und erhielt keinen Unterschied der Überlebensraten, wohl aber eine Dif-ferenz der mittleren Uberlebenszeiten, die in der Va-rianzanalyse mit 0,1% signifikant war.

FOCHEM U. a. 8- 9 bestrahlten Gruppen von je 20 Rat-ten oder Mäusen um 9 oder 21 Uhr. Den Tieren war Yoshida-Ascitestumor implantiert oder eines von mehre-ren Pharmaka injiziert worden. Aus den Sterblichkeits-Unterschieden zwischen den Gruppen schließen die Autoren auf einen Einfluß der Tageszeit. Eine weitere Untersuchung brachte eine gewisse Bestätigung der PizzARELLo-Befunde: NELSON 10 bestrahlte 400 Mäuse

6 D . J . PIZZARELLO, R . L . WITKOVSKI U. E . A . LYONS, S c i e n c e [Washington] 139,349 [1963].

7 D . J . PIZZARELLO, D . ISAAK, CHUA KIAN ENG U. A . L . RHYNE, Science [Washington] 145, 286 [1964].

8 K . FOCHEM, W . MICHALICA U. E . PICHA, S t r a h l e n t h e r a p i e 132,618 [1967].

9 F . FOCHEM, W . MICHALICA U. E . PICHA, S t r a h l e n t h e r a p i e 113, 256 [1967].

10 R. F. NELSON, Acta radiol. [Stockholm] 4, 91 [1966].

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mit 800 R in 12 Gruppen zu je 2 Stdn. Abstand. Dabei ließ er die Tiere audi während der nächtlichen Bestrah-lung im Dunkeln sitzen. Die 30-Tage-Sterblidikeit be-trug bei den Taggruppen (8 — 18 Uhr) im Mittel 84,3% und bei den Nachtgruppen (20 — 6 Uhr) im Mittel 95,1 Prozent. Erst nach Zusammenfassung aller Tag- und aller Nachtgruppen war der Unterschied im £2-Test signifikant.

Man sollte bei Versuchen dieser Art allerdings vor Augen haben, daß die biologische Variabilität der Ab-sterberaten von Ratten und Mäusen groß ist. Infolge des bisher nicht erklärten, aber wohlbekannten „Käfig-faktors" sterben Tiere aus dem gleichen Käfig über-zufällig oft ganz aus oder bleiben alle am Leben. Die Streuung der Beobachtungsdaten wird dadurch vergrö-ßert. Der Käfigfaktor läßt sich auch nicht durch ein-maliges Umordnen der Tiere ausschalten, sondern 11 nur durch tägliches, zufälliges Umsetzen während der gan-zen Beobachtungsdauer. Daraus ergibt sich, daß Resul-tate von Versuchen, die viele Behandlungsgruppen, aber keine Wiederholungen aufweisen, mit Vorsicht zu inter-pretieren sind. Im vorliegenden Experiment wurde die Untersuchung des Tageszeiteffekts auf 5 verschiedenen

Dosierungsstufen wiederholt. Dabei kam es zu so ab-weichenden Daten, daß man wesentliche Tageszeiteffekte auf jeder Dosierungsstufe herausgefunden hätte, wenn nur diese eine Dosis geprüft worden wäre. Erst die Wiederholung zeigte, daß die Abweichungen unsyste-matisch auftraten.

Die innerhalb der Käfige bestehende Abhängigkeit der Todesfälle bringt es mit sich, daß irrtümlich Unter-schiede zwischen verschiedenen Behandlungen angenom-men werden können, die in Wirklichkeit der Streuung zwischen den Tieren zuzuschreiben sind. Die Auswer-tung der Überlebenszeiten an Stelle der Absterberaten verringert diesen Fehler nicht. Andererseits sind echte Unterschiede zwischen verschiedenen Behandlungen so-lange nicht zu beweisen, als sie nicht das Ausmaß der Streuung in den Tierkollektiven überschreiten. Aus die-sem Grunde ist ein geringer Einfluß der Tageszeit auf die Strahlenempfindlichkeit schwer auszuschließen. Aber ein schwerwiegender Effekt besteht offenbar nicht.

Die Untersuchung wurde mit Unterstützung der Deut-schen Forschungsgemeinschaft durchgeführt.

11 A. RAVENTOS, Brit. J. Radiol. 28, 410 [1955].

Anwendung der Reflexmikroskopie in der Histochemie R . BRETTHAUER

Zoologisches Institut der Universität Bonn (Z. Naturforsch. 23 b, 394^395 [1968] ; eingeg. am 13. September 1967)

Metalle bzw. Metallsalze in Gesteinen kann man reflexmikroskopisch besonders deutlich darstellen. Diese Erfahrung nutzte schon WESTPHAL 1 für biologische Objekte, der das Pigment des Malariaerregers, das Hämatin, das bekanntlich Eisen enthält, reflexmikro-skopisch nachwies. Angeregt durch diese Untersuchun-gen und eigene Beobachtungen an jungen Melano-blasten, deren Propigmentgranula nach der Methode von MASSON 2 durch Reduktion der Silberionen sichtbar gemacht wurden 3, wandte ich die Auflicht- oder Reflex-mikroskopie auch bei enzymatisch-cytochemischen Un-tersuchungen an. Da mich bei meinen Untersuchungen über Fischmelanome die saure Phosphatase besonders interessierte, versuchte ich, die Reaktionen dieses En-zyms reflexmikroskopisch zu verfolgen. Die saure Phos-phatase kommt außerdem nur in bestimmten Zellberei-chen vor, in den G o 1 g i - Apparaten und den Cyto-somen, als deren Leitenzym sie bekanntlich gilt 4.

1 A . WESTPHAL, Z . T r o p e n m e d . P a r a s i t o l . 1 4 , 4 9 [ 1 9 6 3 ] . 2 Cit. B. ROMEIS, Mikroskopische Technik, Leibnitz-Verlag,

München 1948. 3 R . BRETTHAUER, u n v e r ö f f e n t l i c h t . 4 C. DE DUVE, in: Funktionelle und morphologische Organi-

sation der Zelle, Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-Hei-delberg 1963.

Für solche Untersuchungen eignen sich Gewebekul-turen besonders gut 5~7. Ich führte daher meine Ver-suche an gezüchteten Myoblasten und Epithelzellen aus dem Rumpf ca. 4 Wochen alter Embryonen von Xipho-phorus helleri/maculatus-Bastardens durch. Die Ge-webestücke wurden 48 Stdn. bei 30 °C in folgendem Nahrungsgemisch kultiviert: 4 Tie. Embryonalextrakt + 4 Tie. verdünnte P e n n e t - C o m p t o n - Lösung + 1 Tl. menschliches Nabelschnurserum. Anschließend führte ich folgende Behandlung durch:

Fixierung: 2% Glutaraldehyd + 0,2-m. Glucose in 0,1-m. Cacodylatpuffer pH 7,4; 15 Min. bei 0 °C; mo-difiziert nach GORDON et al. 9 und WEISSENFELS 7 .

Wasserung: 0,2-m. Glucose in 0,1-m. Cacodylatpuf-fer pH 7,4; 8-mal je 30 Min. bei 20 °C. Anschließend wurden die Kulturen in einem Medium gleicher Zu-sammensetzung, jedoch mit pH 5,0, in 30 Min. lang-sam auf 30 °C erwärmt.

Inkubation: 0,1-m. Glucose-f 0,01-m. Na-/?-Glycero-phosphat + 0,005-m. Bleinitrat in 0,2-m. Cacodylatpuf-fer pH 5,0; 60 Min. bei 30 °C. (Der Cacodylatpuffer wurde jeweils mit Essigsäure eingestellt, um ein Aus-fallen von Bleisalzen im Inkubationsgemisch zu ver-hindern.)

Wässerung: 0,2-m. Glucose in 0,1-m. Cacodylatpuffer pH 7,4; 4-mal 10 Min. bei 20 °C.

5 N . WEISSENFELS, I V . I n t . K o n g r . E l e k t r o n e n m i k r o s k o p i e p. 60 (1960).

6 N. WEISSENFELS, Z. Zellforsch, mikroskop. Anatom. 62, 667 [1964].

7 N . WEISSENFELS, H i s t o c h e m i e 9 , 1 8 9 [ 1 9 6 7 ] . 8 Herrn Prof. Dr. F. ANDERS (Gießen) danke ich für die

freundliche Bereitstellung der Xiphophorus-BastaiTde. 9 G . B . GORDON et a l . , E x p . C e l l R e s . 3 1 , 4 4 0 [ 1 9 6 3 ] .