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Gentechnik/Biotechnik
Vorlesung im WS 2010/2011
Prof. Theo DingermannInstitut für Pharmazeutische Biologie
Goethe-Universität Frankfurt/[email protected]
Rekombinante Wirkstoffe
Dienstag, 23. November 2010
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1984•Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms;
Die Geschichte der Gentechnik
• Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks;
Dienstag, 23. November 2010
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Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)an repetitiven Allelen (Minisatelliten)
Allel 1 Allel 2
Gelelektrophorese
repetitive Allele:zwei Banden pro diploidem Chromosom
Banden auf mehrern Chromosomen
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik DNA-Typisierung
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik DNA-Typisierung
TatortspurDienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik DNA-Typisierung
VerdächtigeDienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik DNA-Typisierung
ÜbereinstimmungDienstag, 23. November 2010
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Repetitive DNA-Sequenzen
GAGGACCACCAGGAAG
Minisatellit
MikrosatellitShort Tandem Repeat (STR)
AGAT
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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PCR-Analyse mit Mikrosatelliten (STRs = Short Tandem RepeatsDie Geschichte der Gentechnik
STR Allel 1 STR Allel 2
STR Allel 3 STR Allel 4
spezifische, STR-flankierende Primer!
Dienstag, 23. November 2010
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Repetitive DNA-Sequenzen für DNA-Typisierungen mit PCR Minisatelliten Größe 400-1000 bp (Kernmotive 10-100 bp) u.U. schlechte Ergebnisse mit degradierter DNA Probleme mit allelic dropout
Mikrosatellieten (STRs) Größe 100-400 bp (Kernmotive 2-6 bp) bessere Ergebnisse mit stark degradierter DNA geringere allelic dropout Problematik kleinere Fragmente sind mit besserer Auflösung trennbar
Neue PCR-spezifische Probleme: Kontaminationen PCR-Inhibitoren Allelic dropout
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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DNA-Typisierung
Multiplex STR-Analyse (2 Individuen)
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Nachweis der Amplimeredurch Autoradiographie
Allel# 1 9 7 6 5 4 3 2 8 Σ
Dienstag, 23. November 2010
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D16S539
DNAChromosom 16
"single copy" (Einzelsequenz)
539. Genlocus auf Chromosom 16
Die Geschichte der Gentechnik Nomenklatur der STR-Marker
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik Vergleich RFLP und PCR
RFLP PCR
benötigte Zeit 6-8 Wochen 1-2 Tagebenötigte DNA-Menge 50-500 ng 0,1-1 ngbenötigte DNA-Qualität hochmolekular, intakt fragmentiertautomatisierbar? nein ja
Dienstag, 23. November 2010
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DNA-Typisierung durch Multiplex STR-AnalysenDiskriminierungsgrade – praktische Berechnungen
Ein Individuum hat die Wahrscheinlichkeit F, an einem Locus zwei bestimmte Allele zu besitzen:
F = 2pqIst ein Individuum homozygot für ein Allelpaar, gilt:
F = p2
Beispiel:Am Genlocus D3S1358 werden zwei Allele mit 15 bzw. 18 Repeats gefunden. Die Frequenzen sind 0,2825 bzw. 0,1450
F = 2 • 0,2825 • 0,1450 = 0,0819 oder 8,2%
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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DNA-Typisierung durch Multiplex STR-AnalysenMultiplex STR-AnalyseBeispiel: PowerPlex® 16
16 verschiedene Loci werden gleichzeitig amplifiziertCSF1PO
FGATPOXTH01VWA
D3S1358D5S818D7S820D8S1179D13S317D16S539D18S51D21S11Penta DPenta E
Amelogenin
1 : 1,8•1017
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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1984•Klonierung und Sequenzierung des kompletten HIV-Genoms;
Die Geschichte der Gentechnik
• Entwicklung des genetischen Fingerabdrucks;• Entwicklung der ersten gentechnisch hergestellten Vakzine.
Das Hepatitis-B-Virus (HBV) gehört zur Gruppe der Hepadnaviren, die ein zirkuläres, teils doppelsträngiges DNA-Genom und einer Lipidhülle besitzen. Der zweitgrößte Leserahmen codiert für die verschiedenen Formen des Oberflächenproteins HBsAg der acht verschiedene Genotypen (A – H).
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik Hepatitis-B-Impfstoff
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Funktionelles Klonieren: Voraussetzung ist, dass die biochemische Basis der Erkrankung bekannt ist oder dass Kenntnisse über das Protein vorliegen, das unmittelbar an der Krankheit beteiligt ist.
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Positionelles Klonieren: Für diesen Ansatz müssen Kenntnisse über die subchromosomale Position des vermeintlichen Gens vorliegen. Den genauen Pathogenitäts-Mechanismus bzw. die biochemische Funktion des Genproduktes braucht man nicht zu kennen.
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Positions-unabhängiges Klonieren eines Kandidaten-Gens: Besteht ein begründeter Verdacht, dass ein Defekt in einem bestimmten Gen die Krankheit verursacht, kann das ohne Kenntnisse der chromosomalen Lokalisation Gen kloniert werden. Ein solches Gen bezeichnet man als ein „Kandidaten-Gen“.
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Positionelles Klonieren eines Kandidaten-Gens: Für diesen Ansatz werden sowohl Kenntnisse über die Pathogenitäts-Mechanismen als auch über die chromosomale Lokalisation des Gens benötigt, das im Verdacht steht, eine Erbkrankheit zu verursachen. Ist das gegeben, dann ist dieser Ansatz sehr effizient.
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
RFLP-Marker D7S15
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
• Der RFLP-Marker D7S15 markiert in der DNA von Eltern kranker Kinder zwei DNA-Fragmente.
• Dagegen hybridisiert die gleiche Sonde in der DNA kranker Kinder nur mit einem DNA-Fragment.
• Die Eltern sind also für diesen Marker heterozygot und daher gesund.
• Dagegen haben die kranken Kinder von beiden Eltern jeweils das defekte Allel geerbt. Sie sind somit für den Marker homozygot und folglich krank.
Durch in-situ-Hybridisation konnte die chromosomale Position dieses Markers als 7q31.3 identifiziert werden. Damit war die Voraussetzung für positionelles Klonieren geschaffen.
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
Es konnte nicht nur das Gen identifiziert werden, sondern es wurde auch eine entscheidende Mutation entdeckt, die bei mehr als 70% aller Patienten mit Cystischer-Fibrose in Nordeuropa vorkommt.Diese Patienten tragen die DF508-Mutation, die dadurch gekennzeichnet ist, dass an Position 508 im CFTR-Protein (cystic fibrosis transmembrane conductants regulator) die Aminosäure Phenylalanin fehlt.Das CF-Gen ist 230 kBp lang, besteht aus 24 Exons und codiert für ein Protein aus 1.480 Aminosäuren. Das Protein ist bekanntlich ein Chloridkanal und somit ein Protein, das in der Membran verankert ist.
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;
Die Geschichte der Gentechnik
• Erfindung der PCR-Technik:
Kary B. Mullis 1993
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;•Erfindung der PCR-Technik;
Die Geschichte der Gentechnik
• Sequenzierung des humanen Insulinrezeptors
Dienstag, 23. November 2010
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1985:•Identifizierung genetischer Marker für die Cystische Fibrose;•Erfindung der PCR-Technik;
Die Geschichte der Gentechnik
• Sequenzierung des humanen Insulinrezeptor• Zulassung von rekombinantem, humanem Wachstumsfaktor
durch die FDA.
Dienstag, 23. November 2010
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1986:•Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik
Anfang der 80er-Jahre gab es erste Verdachtsfälle auf Kontaminationen in Blutkonserven.1984 stand fest: Viele Blutkonserven und für Bluter lebenswichtige Blutprodukte waren mit HIV verseucht.Zu diesem Zeitpunkt hatten sich jedoch bereits 50 Prozent aller deutschen Bluter, also rund 1500 Menschen mit dem tödlichen Virus infiziert. Obwohl Mitte der 80er-Jahre bereits bekannt war, dass die Produkte lebensgefährlich sind, versäumte die Regierung, eine Regelung zum Schutz der Bluter zu schaffen. Dass die Blutpräparate auch mit Hepatitis A, B und C belastet waren, wurde kaum erwähnt. So kommt es, dass zum Beispiel alle Bluter mit Hepatitis C infiziert sind.
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik
Erst als Anfang der 90er-Jahre der Skandal richtig zum Kochen kam, entschuldigte sich der damalige Gesundheitsminister Horst Seehofer offiziell bei den Blutern wegen Verletzung der Aufsichtspflicht.Das BGA wurde aufgelöst und das BfArM geschaffen. Heute garantiert die PCR-Testung auf Hepatitis A-, B- und C-, HI- und Parvoviren, dass Blutkonserven sicher sind.
Dienstag, 23. November 2010
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1986:•Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;•Zulassung der ersten Interferone – Intron A® und Roferon A® – für die Krebstherapie;
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:
Protein Funktion Induktion durchInduktion durch
Typ-I-IFN Typ-II-IFN
2'-5'(A)-Synthetase dsRNA-abhängige Synthese von 2'-5'(A); Aktivator der RNase L
+ +
Protein (p68) Kinase (PKR) (durch dsRNA aktivierbare Proteinkinase)
Phosphorylierung des Translations-Initiationsfaktors eIF-2a
+ ±
Klasse-I-MHC-Antigene (HLA-A,B,C) (incl.β2-Mikroglobulin)
Antigenpräsentation gegenüber zytotoxische T-Lymphozyten
+ +
Klasse-II-MHC-Antigene (HLA-DR)
Antigenpräsentation gegenüber TH-Lymphozyten
± +
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010
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Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:Die Geschichte der Gentechnik
Protein Funktion Induktion durchInduktion durch
Typ-I-IFN Typ-II-IFN
Indolamin-2,3-dioxygenase
Tryptophanmetabolismus (Katabolismus)
± +
Guanylat-Bindeproteine (GPB; γ67)
GTP-, GDP-Bindung ± +
Mx-Protein GTPase, spezifischer Inhibitor des Influenza-Virus
+ -
IP-10 CXC-Chemokin ± +
Metallothionin Metall-Entgiftung + +
TNF-Rezeptoren Vermittler von TNF-Effekten ± +
IL-2-Rezeptoren Vermittler von IL-2-Effekten - +
Dienstag, 23. November 2010
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Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:Die Geschichte der Gentechnik
Protein Funktion Induktion durchInduktion durch
Typ-I-IFN Typ-II-IFN
GM-CSF-Rezeptor Vermittler von GM-CSF-Effekten
- +
Interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1; CD54)
Endotheliales Zelladhäsionsmolekül GTP-, GDP-Bindung
- +
Immunglobulin-Fc-Rezeptor (FcR)
Immunglobulinbindung durch Makrophagen/Neutrophile
± +
Thymosin β4 Induktion der Terminalen Transferase in B-Lymphozyten
+ ?
Dienstag, 23. November 2010
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1986:•Einführung von AIDS- und Hepatitis-Tests für Blutkonserven;•Zulassung der ersten Interferone – Intron A® und Roferon A® – für die Krebstherapie;•Zulassung des ersten monoklonalen Antikörpers – Orthoclone® OKT3 – als Medikament zur Prophylaxe von Abstoßungsreaktionen bei der Nierentransplantation;
Die Geschichte der Gentechnik
Dienstag, 23. November 2010