Generalidades de Nutricin y Metabolismo de los Protozoarios Parsitos

NutricinDependencia metablica del hospederoCapacidad biosinttica limitadaConocimiento derivado de cultivos y en pocas especiesSingle omission tests: difcil sacar conclusionesSustancias nutritivas universales: HC, aa, vitaminas, minerales y oligoelementos. Se suman: nuclesidos, AG, esteroles y porfirinas

Nutricin - MecanismosDifusin simple: molculas apolares, liposolubles, AG no disociados, drogas hidrofbicasTransporte mediado: PM bajo, iones, H, Na, Cl, aa, azcares. No utiliza energa, cintica de saturacin y especificidadTransporte activo: sistemas de transporte contra gradiente de concentracin Endocitosis: pinocitosis y fagocitosis

GlcidosTransporte mediado en membranas celularesT. brucei: 2 sistemas, a) glucosa y manosa y b) fructosa y glucosaminaT. equiperdium: 1 sitio de hexosas y 1 de glicerolE. histolytica: glucosa por 2 sitios, paso limitantePlasmodium: modulacin de la membrana de la clula husped (eritrocito) con poros.

Caso: Metabolismo de Galactosa en T. brucei.El metabolismo de la Gal es esencial para la sobrevida de T. brucei.Gal est presente en cantidades importantes en las VSGLos transportadores de hexosas de T. brucei son incapaces de transportar Gal que se obtiene por la epimerizacin de la UDP-glucosa a la UDP-galactosa por la UDP-glucosa 4epimerasa (galE).

Generacin de mutante condicional para galELnea celular knock-out condicional (cKO) conteniendo una copia ectpica de galE inducible por Tetraciclina y ambas copias allicas del gen reemplazadas con genes resistentes al antibitico.En presencia de Tetraciclina (+Tet) las clulas cKO expresan suficiente galE para crecer normalmente.En (Tet) se detiene la divisin en 3-4 das seguida de muerte celular.

Efecto de la deprivacin de Gal en el crecimiento de T. brucei y contenido de nucletidosGrowth of galE-cKO with and without Tet(B) ratio of UDP-Gal/UDP-Glc in the galE-cKO Tet(C) Sugar nucleotide levels of the galE-cKO Tet cells.Los niveles celulares de UDP-galactosa caen rpidamente luego de la deprivacin de Gal llegando a niveles indetectables a las 72 hs.

Impacto de la deprivacin de Gal sobre las VSGEl anlisis de las glicoprotenas extradas por lectin blotting muestra que la Gal est virtualmente ausente y que se reducen las estructuras de poli-N-acetillactosamina

Mutante condicional null para galEBajo condiciones no permisivas que induce la deprivacin de Gal.

Por medio de la adicin de Tetraciclina al medio se produce la expresin de galE

Despus de 96h la divisin cesa y la ME revela una morfologa alterada y aparicin de vesculas aberrantes cerca del bolsillo flagelar.

Scanning electron microscopy of galE-cKO Tet. Effects on cellular morphology after galactose starvation for 0 h (A), 48 h (B), 96 h (C and D), and 144 h (E and F) are shown. Scale bars, 2 m.

Impacto de la deprivacin de Gal sobre las VSGEl anlisis por MALDI-TOF de una VSG (221) confirma la prdida completa de galactosa del ancla de glicosilfosfatidylinositol

AminocidosTranslocacin mediada en su gran mayoraEndocitosis de protenas.T. brucei: 4 sitios operativosT. cruzi: Arg altamente especfico, con 3 sistemas; Thr es contra gradiente, se intercambia con AlaPlasmodium: Hb es la mayor fuente de aa, ingresa por endocitosis a travs del citostoma

Caso: la Arginina es un aa esencial para Toxoplasma gondiiEn la mayora de los eucariotes existen dos genes de carbamoil fosfatasa sintetasa (CPS), una es glutamina dependiente y se requiere para sintetizar pirimidinas (CPSII), la otra (CPSI) est dedicada a la biosntesis de Arg a partir de carbamoil fosfatoT. gondii carece del gen de la CPSIDeprivacin de Arg bloquea multiplicacin en taquizotos, lo rescata la citrulina.

Sntesis de la Arginina

Deprivacin de Arg dispara transformacin de taquizotos en bradizotos

Verde: protena expresada por taquizotosRojo: protena expresada por bradizotosAzul: ncleos teidos con DAPIA: 48hs medio normalB: 48hs medio sin ArgC: 7 d sin ArgD: 14 d sin ArgE: Contraste de fase de DF: Cepa PLK 4 d sin Arg

La deprivacin de Arg produce una detencin del crecimiento en taquizotos de T. gondii que es rescatada por citrulina pero no por ornitina

Caso: Degradacin de la Hb en Plasmodium

Hemoglobina95% de las protenas totales de GRAbundante (>300 mg/ml o aprox 5 mM)60-80% es degradada durante el estadio eritrocitario 110 g (en un total de 750) se consume en 48 hs con una parasitemia del 20%

Erythrocytic Shizogonic Cycle Los merozotos interactan con la membrana del GR e invaden activamente la clula formando una vaculoa parasitforaTrofozoto en GRMerozoto entrando un GR

Endocitosis del citoplasma eritrocitariofood vacuolecytostomepinocytosis (rings)

Vacuola DigestivaUn lisosoma especializadoATPADPH+(pH 5-5.4)Proteases de la vacuolaplasmepsinas I & II (acid)falcipainas I - III (tiol)falcilysinas (metallo)

Digestin de HbcitoplasmaparasitarioCamino endoctico

El clivaje inicial de las plasmepsina es especfico y desestabiliza la HbHb es clivada entre Phe-33 y Leu-34 (cadena )regin bisagraconservadaImportante para la estabilidad del tetrmeroSe disocian grandes fragmentos de globinaSe libera el grupo HemLos fragmentos de globina son susceptibles de posterior hidrlisisa-F33/L34

La digestion de Hb es un proceso ordenadoexopeptidasasaa libres?

El Heme libre es txicoDestabiliza and lisa membranasHidrolasas liberadas al citoplasma del parsito que muere Posibles Mecanismos de Detoxificacinheme hemozona (pigmento malrico)Degradacin mediada por H2O2Degradacin mediada por GSHheme oxygenasa (P.b. and P.k.)

Hemozona = b-Hematinahemeb-hematin

b-hematina forma cristales insolubles'biocristalizacin' o 'biomineralizacin'

NucletidosNo pueden sintetizar nucletidos de purinas (A G) de novoPurinas y pirimidinas deben adquirirse en forma de bases o nuclesidos. No tienen transportadores de nucletidosEn kinetoplstidos Adenosina es fuente ms importante de sntesis de nucletidos de purinaLocus para transporte de nuclesidosRibonucleasas y nucleotidasas de superficiePlasmodium: hipoxantina es fuente de purina

Vas de salvataje de purinas en parsitos

LpidosTransportadores para AG Difusin pasiva para AG no disociadosApicomplexa: transporte a travs de vacuola parasitforaApicoplasto: plstido no fotosinttico encontrado en apicomplexa adquirido por endosimbiosis secundariaSntesis de AG e isoprenoides en apicoplasto

Metabolismo del colesterol en Toxoplasma gondii

METABOLISMO ENERGTICO EN PROTOZOARIOS PARSITOS

Generalidades Objetivos del metabolismo energtico

a) Catabolizar sustancias orgnicas y acoplar el proceso a la conservacin de energab)Formar y degradar biomolculas requeridas en funciones especficas

KINETOPLASTIDOS

Trypanosoma brucei como modelo:a) Depende nicamente de gliclisis para producir ATP. Prefiere Glu, pero tambin Fru, Man y Glicerolb) Mitocondria escasamente desarrollada sin Krebs ni CRc) Abundantes enzimas glicolticas: 90% del glicosomad) Flujo glicoltico es relativamente altoe) Enzimas glicosmicas no glicolticas deprimidas

GliclisisGlicosomas: Caractersticos de Tripanosomatidos. 0.3um, 4% del volumen celular. T. brucei=200.

Gliclisis: De Glu a 3fosfoglicerato en glicosomas. Citoplasma: de 3GP a 3PEP Piruvato. Termina en Piruvato (98%) y trazas de CO2 y Glicerol- Fermentacin G3P pasa los equivalentes reductores a travs de una oxidasa al O2 dentro de la mitocondria

Alta eficiencia. Sobrevive an en condiciones anaerbicas a razn de 1ATP por 1Glucosa.Enzimas: sectores de carga + para ingresar al glicosoma.

Formas procclicas en vector: Cambio a metabolismo ms mitocondrial, aumenta volumen mitocondrial, cristas desarrolladas. CR respiratoria convencional. PRO: metabolizada en CO2, ALA y ASP

Gliclisis y glicosomas

Amebas Intestinales y GiardiaGliclisis via Embden-Meyerhof pero sin lactato deshidrogenasa. Piruvato se convierte en etanol y CO2 en anaerobiosis, en aerobiosis acetato y etanolAmitocondriados, por tanto sin Ciclo de Krebs ni fosforilacin oxidativaSin citocromosAlmacenan glucgenoToleran bajas concentraciones de oxgeno

Figure 2 Nucleoside phosphate and pyrophosphate metabolism in the glycolytic pathway of the eukaryotic anaerobic amoeba, Entamoeba histolytica. (A) The glycolytic pathway of E. histolytica. (B) PPDK uses PEP and PPi to catalyze the conversion of AMP to ATP (i.e., the production of two high-energy phosphoanhydride bonds equals two "ATP equivalents"). (C) The ATP and PPi "balance sheet" for E. histolytica glycolysis. Abbreviations are as follows: 1,3-DPGA, 1,3-diphosphoglycerate; Fru-1,6-P2, fructose-1,6-bisphosphate; Fru-6-P, fructose-6-phosphate; Glu-6-P; glucose-6-phosphate; 3-PGA, 3-phosphoglycerate; PEP, phosphoenolpyruvate; PPDK, pyruvate orthophosphate dikinase; and PPi-PFK, PPi-dependent phosphofructokinase

Enzimas glicolticas de Entamoeba histolytica

TrichomonasGliclisis clsica hasta piruvato que se convierte en lactato y ste en acetato, CO2 y H2OLa oxidacin del piruvato se cataliza por decarboxilacin oxidatica en reacciones ligadas a Ferredoxina, proteina sulfurada con Fe como transportador de electronesLa reaccin se produce en los hidrogenosomas donde el H+ es el aceptor final de los electrones

HidrogenosomaGeneracin de ATP por compartimentalizacin del metabolismo fermentativo del piruvato con produccin de Hidrgeno molecular1. Piruvato (de la gliclisis o por conversin del malato) es descarboxilado por la piruvato:ferredoxina oxidorreductasa para formar AcetilCoA2. Los e- son transferidos desde la oxidorreductasa hasta la ferredoxina (Fe-S) y luego a protones para formar H2 catalizdo por la hidrogenasa.3. Acetil-CoA es convertida a acetato con la conversin concomitante de succinato a Succinil-CoA por la succinil-CoA sintetasa. 4. La generacin de succinyl-CoA est acoplada a la produccin de ATP via fosforilacin a nivel de substrato

MalatePyruvateMENAD(P)+NAD(P)H2Fd-2FdPFOAcetyl-CoAAcetateASCTSuccinyl-CoASuccinateADP + PiATPAACSTK[Fe]HydNAD(P)-FO2H+H2Double membranehsp70cpn60Schematic Map of Hydrogenosomes (after Muller 1993)CO2CO2ADPATPTransitpeptidesProtein importNEnzyme found also in mitochondriaAlpha-proteobacterial ancestryUnknown ancestryCoASHFungi and Trichomonas