gene regulation printout - คณะ ... · pdf filepost-translational...
TRANSCRIPT
REGULATION OF GENE EXPRESSIONREGULATION OF GENE EXPRESSION
Assistant Professor Dr. Chatchawan Srisawat
การแสดงออกของยีน (Gene Expression)
Gene (DNA)
RNA
Protein
Gene expression = ขบวนการทั้งหมดในการนําขอมูลทางพันธุกรรมในยีนไปสรางเปนผลผลิตของยีน (โปรตีน หรือ RNA)
Gen
e ex
pres
sion
• Human genome ~ 20,000 – 25,000 ยีน
• ในชวงเวลาหนึ่งๆ มีเพียง ~ 5,000 ยีน ที่มีการแสดงออกของยีน
• Developmental and differentiation cues.
• Adaptation (nutrients, osmotic pressure, temperature, hormones, etc)
Regulation of gene expressionRegulation of gene expression
myocyte adipocyte neuron erythrocyte
การแสดงออกของยีน (Gene Expression)
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
1. Gene
2. Transcription
3. RNA processing
4. RNA export
5. Translation
6. RNA stability
7. Post-translationalmodifications
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
1. Gene
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION
• การควบคุมที่ระดับยีนเปนกลไกที่ไมพบบอยนักในการควบคุมการแสดงออกของยีน ประกอบดวย
1. Gene amplification
2. Gene rearrangement
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
1. Gene amplificationการเพิ่มจํานวน copy number ของ ribosomal RNA gene ในไขกบ (X. laevis) เพื่อใหพอกบัการผลิต ribosome ที่ zygote จําเปนตองใชหลัง fertilization
Xenopus laevis Oocyte
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
1. Gene amplificationการเพิ่มจํานวน copy number ของ ribosomal RNA gene ในไขกบ (X. laevis) เพื่อใหพอกบัการผลิต ribosome ที่ zygote จําเปนตองใชหลัง fertilization
2. Gene rearrangement
Immunoglobulin (antibody) or T-cell receptor genes
Antigen (bacteria,viruses, cancer)
Antigen-binding site
Heavy chain
Light chain
immunoglobulin (antibody) เปนโปรตีนที่มีความสามารถในการจับ antigen ที่เปนสิ่งแปลกปลอมของรางกายไดอยางจําเพาะ สรางจาก B-lymphocyte
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
• Antibody แตละชนิดจะจับกับ antigen ที่จําเพาะกับ antibody ชนิดนั้นๆ
• รางกายสามารถสราง antibody ที่แตกตางกันไปไดหลายลานชนิด เพื่อรับมือกับ antigen แปลกปลอมหลากหลายชนิดที่ตองพบในชั่วชีวิต (เชน bacteria,viruses, cancer)
bacteria viruses cancer cells
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
ProblemProblem
• ถาขอมูลทางพันธุกรรมจากยีน 1 ยีน ถูกนําไปสรางโปรตีนได 1 ชนิด
Gene (DNA) RNAProtein (e.g. antibody)
ดังนั้น มนุษยควรจะตองมีจํานวนยีนมากกวาหลายลานยีน จึงจะสามารถผลิต antibody หลากหลายชนิดที่สามารถจับกับสิ่งแปลกปลอมจํานวนมากมายได
แตมนุษยมีจํานวนยีนทั้งหมดประมาณ 20,000 – 25,000 ยีน
รางกายสามารถผลิต antibody ที่มีชนิดตางๆอยางมากมายไดอยางไร ?
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
Susumu TonegawaSusumu Tonegawa
ไดรับรางวัล Nobel ในป 1987 จากการคนพบกลไก gene rearrangement ในการสราง antibody
SolutionSolution GENE REARRANGEMENT
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
SolutionSolution GENE REARRANGEMENT
โครงสรางยีน heavy chain ของ antibody
~ 300 V segments (V1, V2, V3, ..., V300)~ 20 D segments (D1, D2, D3, …, D20)~ 4-5 J segments (J1, J2, J3, J4, J5)
Germ cellsGerm cells
แตละ segment ซึ่งเปน coding sequence จะมีลําดับเบสที่ไมเหมือนกัน
1 2 3 300 1 2345 C1 23 204
D JV
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
Transcription and splicingJ
223D CV
An mRNA
J223
DC
V
Rearranged DNA
• เมื่อมีการ differentiation ของเซลลเปน lymphocyte ที่ทําหนาที่สราง antibody จะมีการ rearrangement ของยีนขึ้น ทําใหมีการเชื่อมตอของ V, D, และ J segment เขาดวยกัน
VDJ joining (V2 +D2J3)
DJ joining ( D2+J3)
1 2 3 300 12345 C
Germ cell DNA123 204
D JV
J
Rearranged DNA 1 2 3 300 23
DC
V
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
• การ rearrangement ของ V, D, และ J segment จะเกิดแบบ random ใน lymphocyte ตัวหนึ่งๆ
Rearranged gene ของ heavy chain จะมีชนิดที่แตกตางกันไปได = 300 x 20 x 5 หรือ 30,000 ชนิด
V53D19J1 V6D3J4 V217D8J3 ……...
เนื่องจากลําดับเบสของ DNA ของแตละ V, D, และ J segment มีความแตกตางกัน ดังนั้นโปรตีน antibody ที่สรางจาก rearranged gene (various combinations of V,D,J) ดังกลาวก็จะมีลําดับของกรดอะมิโนตลอดจนโครงสรางแตกตางกันไปดวย
heavy chain gene1 2 3 300 1 2345 C1 23 204
D JV
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
• ยีน light chain ของ antibody ก็มีโครงสรางคลายกับยีน heavy chain แตมี เฉพาะ V และ J segments จํานวน ~100 และ 4 segments ตามลําดับและมีการ rearrangement เกิดขึ้นเชนเดียวกัน
1 2 3 100 1 234 CJV
light chain gene
Rearranged gene ของ light chain จะมีชนิดที่แตกตางกันไปได = 100 x 4 หรือ 400 ชนิด
ดังนั้น antibody ซึ่งประกอบดวย heavy และ light chain จะมีชนิดที่แตกตางกันได = 30,000 x 400 หรือ > 10,000,000 ชนดิ
Gene rearrangement ทําใหเซลลสามารถผลิต antibody ที่มีความหลากหลายทางดานโครงสรางและความสามารถจับกับสิ่ง
แปลกปลอมได โดยไมตองมีจํานวนยีนที่มากมาย
Gene rearrangement ทําใหเซลลสามารถผลิต antibody ที่มีความหลากหลายทางดานโครงสรางและความสามารถจับกับสิ่ง
แปลกปลอมได โดยไมตองมีจํานวนยีนที่มากมาย
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
* การ rearrangement ของยีน เปนการเปลี่ยนแปลงที่ระดับของ DNA(ตางจากขบวนการ splicing ที่เกิดที่ระดับของ RNA) ดังนั้น เซลลที่มีการ rearrange ยีนแลว โครงสรางของยีนจะไมสามารถกลับไปเหมือนเดิมอยางเชนใน germ cell ไดอีก
* การ rearrangement ของยีน เปนการเปลี่ยนแปลงที่ระดับของ DNA(ตางจากขบวนการ splicing ที่เกิดที่ระดับของ RNA) ดังนั้น เซลลที่มีการ rearrange ยีนแลว โครงสรางของยีนจะไมสามารถกลับไปเหมือนเดิมอยางเชนใน germ cell ไดอีก
REGULATION OF GENE EXPRESSION - GENE LEVEL
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
-S-S-
active protein
2. Transcription
REGULATION OF GENE EXPRESSION
• การควบคุมการแสดงออกของยีนที่ระดับ transcription จะเปนตัวกําหนดวา ยีนใดจะ active (ถูกนําไปสรางเปน mRNA และโปรตีน ทําใหมีการแสดงออกของยีนนั้น) หรือ inactive
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• การควบคุมขบวนการ transcription โดยเฉพาะขั้นตอน transcription initiation ถือวาเปนการควบคุมการแสดงออกของยีนที่สําคัญที่สุดอันหนึ่งในเซลลของมนุษย
Transcription initiation step Elongation
Termination
1. ควบคุมผานทาง transcription factors
2. ควบคุมผานทางการเปลี่ยนแปลงโครงสรางของ chromatin
3. ควบคุมผานทางการ methylation ของ DNA
กลไกการควบคุมที่ระดับ transcription มี 3 วิธี คือ
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
โครงสรางของยีนใน eukaryote
promoter(TATA box)
transcription start site
upstream downstream+1-1
exon1 exon2intron
1. ควบคุมผานทาง transcription factors
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
promoter(TATA box)
1. ควบคุมผานทาง transcription factors
RNA polymerase II transcription start site
upstream downstream+1-1
• ขบวนการ transcription จะเริ่มขึ้นเมื่อ RNA polymerase II complex เขาจับที่ promoter TATA box (transcription initiation step)
Transcription elongation
Transcription termination
exon1 exon2intron
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• การเขาจับของ RNA polymerase II complex กับ promoter TATA box ตามลําพังจะเกิดขึ้นไดไมดี (inefficient trancription initiation) ทําใหการเกิดขบวนการ transcription ของยีนนั้นไมมีประสิทธภิาพ
เพื่อใหเกิดการ transcription ไดมีประสิทธิภาพมากขึ้น transcription factors จึงเขามามีบทบาท โดยทําใหเกิด transcription initiation ไดดีขึ้น
เพื่อใหเกิดการ transcription ไดมีประสิทธิภาพมากขึ้น transcription factors จึงเขามามีบทบาท โดยทําใหเกิด transcription initiation ไดดีขึ้น
promoter(TATA box)
RNA polymerase II transcription start site
exon1 exon2intron
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• โครงสรางของ transcription factor สามารถแบงออกไดเปน 2 สวนคือ
What are transcription factors?
• Transcription factors (TF) เปนโปรตีนที่สามารถเขาจับอยางจําเพาะกับ DNA เพื่อกระตุนใหเกิดการ transcription ไดมีประสิทธิภาพมากขึ้น
CTF SP1 Oct1 etc.example
1. สวนที่ทําหนาที่จับกับ DNA (DNA-binding domain)
2. สวนที่ทําหนาที่กระตุนขบวนการ transcription (Transcription-regulatory domain)
* ใน eukaryote มีการคนพบ transcription factors มากกวารอยชนิด
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
DNA-binding domainTranscription-regulatory domain
DNA
transcription element1. 1. สวนที่ทําหนาที่จับกับสวนที่ทําหนาที่จับกับ DNA (DNADNA (DNA--binding domain)binding domain)
rasmol
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
จะจับกับ DNA ที่มีลําดับเบสจําเพาะกับ TF ชนิดนัน้ๆ (transcription element)
DNA-binding domainTranscription-activation domain
DNA
transcription element1. 1. สวนที่ทําหนาที่จับกับสวนที่ทําหนาที่จับกับ DNA (DNADNA (DNA--binding domain)binding domain)
จะจับกับ DNA ที่มีลําดับเบสจําเพาะกับ TF ชนิดนัน้ๆ (transcription element)
examples Transcription factors
DNA sequence(transcription element)
CTF GGCCAATCTSP1 GGGCGGOct-1 ATTTGCAT
SP1 CTF
5’ CAGGGCGGATCTAAGAGGCCAATCTTATAGACTACTTATAAATCTCTCTAGACC 3’3’ TGCCCGCCTAGATTCTCCGGTTAGAATATCTGATGAATATTTAGAGAGATCTGG 5’
rasmol
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
SP1 CTF
5’ CAGGGCGGATCTAAGAGGCCAATCTTATAGACTACTTATAAATCTCTCTAGACC 3’3’ TGCCCGCCTAGATTCTCCGGTTAGAATATCTGATGAATATTTAGAGAGATCTGG 5’
CTFSP1
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
2.2. สวนที่ทําหนาที่กระตุนขบวนการสวนที่ทําหนาที่กระตุนขบวนการ transcription (Transcriptiontranscription (Transcription--regulatory domain)regulatory domain) ชวยใหเกิด transcription โดย
- interact กับ RNA polymerase II ชวยทําให enzyme complex เขามาที่ promoter ไดดียิ่งขึ้น
SP1 CTF promoter(TATA box)
RNA polymerase II
- interact กับ RNA polymerase II ชวยทําให enzyme complex เขามาที่ promoter ไดดียิ่งขึ้น- modulating enzyme complex activity
ทําใหเกิดการกระตุน transcription
5’ CAGGGCGGATCTAAGAGGCCAATCTTATAGACTACTTATAAATCTCTCTAGACC 3’3’ TGCCCGCCTAGATTCTCCGGTTAGAATATCTGATGAATATTTAGAGAGATCTGG 5’
CTFSP1
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
2.2. สวนที่ทําหนาที่กระตุนขบวนการสวนที่ทําหนาที่กระตุนขบวนการ transcription (Transcriptiontranscription (Transcription--regulatory domain)regulatory domain) ชวยใหเกิด transcription โดย
• Transcription factor นอกจากจะกระตุนใหเกิดขบวนการ transcription แลว transcription factor บางตัวสามารถยับยั้ง transcription ไดดวย
5’ CAGGGCGGATCTAAGCCATGGATCATAGGCCAATCTTATAGACTACTTATAAATCTCTCTAGACC 3’3’ TGCCCGCCTAGATTCGGTACCTAGTATCCGGTTAGAATATCTGATGAATATTTAGAGAGATCTGG 5’
SP1 CTF promoter (TATA box)
activatoractivator
RNA polymerase II
TF ที่กระตุน transcription = activator
TF ที่ยับยั้ง transcription = repressor
Transcription element = enhancer
Transcription element = silencer
repressor
การทํางานของ repressor - inhibit activation domain ของ activator- ขัดขวางไมให activator เขามาจับกับ DNA
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
start site
core promoter(TATA box)
exon1 exon2intronup to 10 kilobases from the start site
upstream downstream
enhancersilencer
• ยีนหนึ่งๆ อาจจะถูกควบคุมดวย transcription factor ไดหลายชนิด
activator จับกับ DNA สวนที่เปน enhancer
repressor จับกับ DNA สวนที่เปน silencer
transcription
transcription
* ตําแหนงของ enhancer หรือ silencer อาจจะอยูไกลจากยีนมาก (ไปทาง upstream หรือ downstream ตอยีน), ใกล promoter, หรือ อาจจะอยูในยีนก็ได
+
+
+
++
-
RNA polymerase II
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
สรุป: ขบวนการควบคุมโดย transcription factor
เซลลสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนไดโดยการควบคุมการทํางานของ TFเซลลสามารถควบคุมการแสดงออกของยีนไดโดยการควบคุมการทํางานของ TF
กลไกการควบคุม
• Transcription factors จะถูกสรางขึ้นมาในเนื้อเยื่อบางชนิดหรือบางชวงชีวิตของเซลล
Tissue-specific gene expressionDifferentiation-specific gene expression
example
C/EBP และ HNF-1 (hepatic nuclear factor-1) พบในปริมาณมากในตับแตพบนอยในเนื้อเยื่ออื่น
albumin gene
albumin ถูกสรางจากตับเทานั้น
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
กลไกการควบคุม
nucleuscytosol
steroid hormones (e.g. glucocorticoid, estrogen)
steroid receptor
inhibitor
GRE
glucocorticoid response element
Examples
• activity ของ transcription factors ถูกควบคุมโดยกลไกตางๆ เชน การจับกับ ligand ที่จําเพาะ หรือขบวนการ protein modification (เชน phosphorylation หรือ dephosphorylation) ของ TF เพื่อใหมีการแสดงออกของยีนที่ตองการในภาวะตางๆ
Inducible transcription factor
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
Examples
nucleuscytosol
Interferon
Response element
inteferonreceptor
phosphorylation
JAK kinase (transducer)
unphosphorylatedSTAT1 monomer
P P phosphorylatedSTAT1 dimer
P P
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
กลไกการควบคุม
• activity ของ transcription factors ถูกควบคุมโดยกลไกตางๆ เชน การจับกับ ligand ที่จําเพาะ หรือขบวนการ protein modification (เชน phosphorylation หรือ dephosphorylation) ของ TF เพื่อใหมีการแสดงออกของยีนที่ตองการในภาวะตางๆ
Inducible transcription factor
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• Transcription factor หลายๆชนิด (activator/repressor) ที่ควบคุมยนีหนึ่งๆ จะควบคุม transcription ของยนีแบบ cooperative regulation ทําให transcription activity และการแสดงออกของยนีเพิ่มขึ้นหรือลดลงไดในระดับที่ตอเนื่องตามความตองการของเซลล ไมใชเพียงแคทําใหยนีแสดงออกหรือไมแสดงออกเทานั้น (switch on/off).
1. ควบคุมผานทาง transcription factors
2. ควบคุมผานทางการเปลี่ยนแปลงโครงสรางของ chromatin
3. ควบคุมผานทางการ methylation ของ DNA
กลไกการควบคุมที่ระดับ transcription มี 3 วิธี คือ
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
2. ควบคุมผานทางการเปลี่ยนแปลงโครงสรางของ chromatin(chromatin remodeling)
• DNA ของเซลล eukaryote รวมทั้งของมนุษยจะรวมอยกับโปรตีน histone เปน nucleosome
• Histone เปนโปรตีนที่มีกรดอะมิโนที่มีประจุบวก (เชน lysine, arginine) เปนสวนประกอบอยูมาก ดังนั้นจึงมีความสามารถในการจับกับ DNA (negatively-charged molecule) ไดดี
histone
DNA
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• Nucleosome สามารถประกอบกันเขาเปนโครงสรางระดับที่สูงขึ้นเปน chromatin fiber และ chromosome
free DNA
10 nm chromatin fibril
30 nm chromatin fiber
chromosome
transcription factor
transcriptional element
• การที่ DNA อยูรวมกับ histone เปน nucleosome สวนใหญจะทําใหขบวนการ transcription เกิดขึ้นไดไมด ีเนื่องจาก nucleosome จะรบกวนการจับของ transcription factor กับ DNA
transcription transcription
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
nucleus
• heterochromatin = densely-packed chromatin
ยีนที่อยูใน heterochromatin จะไม active เนื่องจากไมเกิดขบวนการ transcription
example Condensation of X chromosome in cells derived from females
Barr body
drumstick
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
nucleus
• euchromatin = loosely-packed chromatin
ยีนที่อยูใน euchromatin จะอยูในรูปที่ active สามารถเกิดขบวนการ transcription ได
increase chromatin condensationsuppress transcription
decrease chromatin condensationenhance transcription
ดังนั้น การควบคุมโครงสรางของ chromatin (chromatin remodeling) สามารถใชควบคุมการแสดงออกของยีนได
ดังนั้น การควบคุมโครงสรางของ chromatin (chromatin remodeling) สามารถใชควบคุมการแสดงออกของยีนได
เซลลควบคุมโครงสรางของ chromatin โดยใชเอ็นซัยมที่ทําหนาที่เติมหรือกําจัด acetyl group ของ histone
เซลลควบคุมโครงสรางของ chromatin โดยใชเอ็นซัยมที่ทําหนาที่เติมหรือกําจัด acetyl group ของ histone
1. Histone acetyl transferase
2. Histone deacetylase
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
C
O
CHNHCH2C
O
NH... ...CH2CH2CH2
CH2
NH 3+
Gly Lys... C
O
CHNHCH2C
O
NH ...CH2CH2CH2
CH2
NHCCH3
O
AcCoA CoA
Ac
Histone acetyl transferases
Histone deacetylases
Acetylated histone
Deacetylated histone เพิ่ม chromatin condensation
ลด chromatin condensation
ทําให transcription factors สามารถเขามาจับ DNA ไดดีขึ้น ทําให transcription เพิ่มขึ้น
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
1. ควบคุมผานทาง transcription factors
2. ควบคุมผานทางการเปลี่ยนแปลงโครงสรางของ chromatin
3. ควบคุมผานทางการ methylation ของ DNA
กลไกการควบคุมที่ระดับ transcription มี 3 วิธี คือ
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
3. ควบคุมผานทางการ methylation ของ DNA
• ประมาณ 2-7% ของ cytosine ใน DNA จะอยูในรูป 5-methylcytosine
• methylation ของ cytosine สวนใหญจะพบบริเวณ DNA ที่มีลําดับเบสเปน 5’ CG 3’ (CpG)
5’ A T G C G A C C 3’3’ T A C G C T G G 5’
สวนใหญ methylation จะเกิดกับ cytosine ของ DNA ทั้งสองสาย
m
m
DNA methyl-transferases
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• โดยเฉลี่ยจะพบเพียง 1 CpG ทุกๆ 100 bp แตจะมีบางบริเวณที่จะพบ CpG กระจุกตัวอยูหนาแนน (>10 CpG ทุกๆ 100 bp) ทําใหเรียกบริเวณดังกลาววา “CpG island”
3. ควบคุมผานทางการ methylation ของ DNA
ซึ่งพบวา ตําแหนงของยีนสวนใหญจะอยูในบริเวณที่มี CpG island นี้
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
มีบทบาทตอขบวนการ transcription
• จากการศึกษาการแสดงออกของยีน พบวามีความสัมพันธอยางชัดเจนระหวาง state of methylation ของ CpG และ activity ของ gene
ดังนั้น การควบคุม state of methylation ของยีน จึงเปนกลไกที่สามารถใชควบคุมการแสดงออกของยีนได
ดังนั้น การควบคุม state of methylation ของยีน จึงเปนกลไกที่สามารถใชควบคุมการแสดงออกของยีนได
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
Methylated genesNon-methylated genesDNA methyltransferase
5-methylcytosine glycosylase
Methylated genes inactive genes
Non-methylated genes active genes
ผลของ DNA methylation ตอขบวนการ transcription
a) ผลโดยตรง
การเกิด methylation ของยีน จะมีผลตอ transcription ไดทั้งโดยตรงและโดยออม
• methylation ของ cytosine อาจรบกวนการจับของ transcription factor กับ DNA
• transcription factor ที่ยับยั้งขบวนการ transcription (repressor) บางชนิด เชน MeCP1, 2 จะจับกับ DNA ที่มี 5-methylcytosine
5’ CAGGGCGGATCTAA 3’3’ TGCCCGCCTAGATT 5’
m
m
transcription
RNA pol II
repressor
activator
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
ผลของ DNA methylation ตอขบวนการ transcription
a) ผลโดยตรง
การเกิด methylation ของยีน จะมีผลตอ transcription ไดทั้งโดยตรงและโดยออม
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
• นอกจากนั้น การจับของ MeCP บริเวณภายในของ gene (transcribed region) จะขัดขวางการทํางานของ RNA polymerase ทําให transcription เกิดไดลดลง
methylation ของยีนจะทําใหเกิด chromatin remodeling
increase chromatin condensation
suppress gene expression
b) ผลโดยออม
ผลของ DNA methylation ตอขบวนการ transcription
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
Transcription factors
Chromatin remodeling DNA methylation
activator
repressor
chromatin condensation
chromatin condensation
DNA methylation
DNA methylation
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
กลไกในการควบคุมทั้ง 3 ชนิดจะรวมกันทํางานเพื่อควบคุม transcription ของยนี
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
3. RNA processing
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
1. RNA splicing
2. RNA editing
1. RNA splicing
Exon, Intron, 5’ and 3’ untranslated regions (UTR)
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
a) Alternative 5’ splice sites
b) Alternative 3’ splice sites
Various machanisms in alternative splicing
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
d) Mutually exclusive use of exons
e) Intron retention
c) Exon inclusion or skipping
Various machanisms in alternative splicing
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
• Alternative splicing เปนกลไกที่ควบคุมการแสดงออกของยีนที่มีประโยชนมากอันหนึ่ง เนื่องจากสามารถทําใหเซลลสรางผลผลิตของยีนที่มีความหลากหลายมากขึ้น
Alternative splicing is often tightly regulated depending on cell types or developmental stages.
Alternative splicing
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
แบคทีเรีย (E. coli)~ 4000 ยนี
แมลงหวี่~13000 ยีน
มนษุย~ 20000 ยีน
Alternative splicing
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
> 90% ของ human genes จะถูก process โดย alternative splicing ทําใหได mRNAs หลายชนิด
• Alternative splicing เปนกลไกที่ควบคุมการแสดงออกของยีนที่มีประโยชนมากอันหนึ่ง เนื่องจากสามารถทําใหเซลลสรางผลผลิตของยีนที่มีความหลากหลายมากขึ้น
2. RNA editing
• RNA editing เปนขบวนการควบคุมการแสดงออกของยีนที่พบไดไมบอย ขบวนการนี้จะทําการเปลี่ยนแปลงลําดับเบสของ RNA transcripts โดยอาจจะเปลี่ยน, เพิ่ม หรือ ตดัเบสออก ทําใหไดโปรตีนที่แตกตางไปจากเดิม
apolipoprotein B pre-mRNAExample
Deamination: C to U
Ribose
N
NO H
H
NHH
deamination
Ribose
N
NO H
H
O
H
cytosine uracil
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA PROCESSING LEVEL
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
4. RNA export
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION
• เปนการควบคุมที่ขั้นตอนการขนสง mRNAs ที่ processed แลว ออกจาก nucleus สู cytoplasm เพื่อนําไปเปน template สําหรับขบวนการ translation
• Quality controls mRNAs ที่ผิดปกติจะไมถูกสงออกไป เพื่อปองกันผลเสียที่อาจเกิดจากการสรางโปรตีนที่ผิดปกตติามมา
- Abnormally-spliced RNAs
- RNAs containing nonsense mutations
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA EXPORT LEVEL
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
5. Translation
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSLATIONAL LEVEL
A) Global regulation of protein synthesis
โดยการ modification of eukaryotic initiation factors (eIFs) เชน phosphorylation/ dephosphorylation ทําใหขบวนการ translation เพิ่มขึ้นหรือลดลงได ซึ่งผลดังกลาวเกิดกับ protein synthesis ทุกชนิด
• การควบคุมที่ระดับ translation สวนใหญจะเกิดที่ขั้นตอน translation initiation
B) mRNA-specific gene regulation
• การควบคุมที่ระดับ translation สวนใหญจะเกิดที่ขั้นตอน translation initiation
ควบคุมขบวนการเกิด translation ของ mRNA ชนิดหนึ่งๆ โดยขึ้นกับโครงสรางของ mRNA ชนิดนั้นๆ
preinitiation complex จะเคลื่อนที่ไปตาม mRNA จากปลาย 5’ จนถึง AUG start codon (scanning) จึงจะมีการสราง initiation complex
preinitiation complex
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSLATIONAL LEVEL
• mRNA ของยีนบางชนิด จะมีโครงสรางแบบ hairpin ที่ปลาย 5’ กอนถึง AUG start codon ทําใหขัดขวางการจับ หรือ การ scanning ของ preinitiation complex translation
REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSLATIONAL LEVEL
• ความเสถียรของโครงสรางดังกลาวสามารถถูกควบคุมใหเปลี่ยนแปลงได ทําใหประสิทธภิาพของกระบวนการ translation ของยีนนั้น เปลี่ยนแปลงตามไปดวย
ดูตัวอยางการควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับ iron metabolism ใน slide ถัดไป
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol6. RNA stability
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION
mRNA in closed-loop configuration ทําให RNA มีความเสถียร ไมถูกยอยสลายงายดวย ribonuclease
Functions of 5´ cap• Transport to cytoplasm• Increase translational efficiency• Protection of mRNA from degradation
mRNA stability
Functions of poly(A) tail
• Increase translational efficiency• Protection of mRNA from degradation
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA STABILITY LEVEL
• อัตราสลายของ mRNA (mRNA decay rate) เปนปจจัยสําคัญอีกอันหนึ่งที่กําหนดระดับ mRNA ของยีนภายในเซลล นอกเหนือจากอัตราการสังเคราะหจากกระบวนการ transcription.
การควบคุม RNA decay จึงเปนอีกขั้นตอนที่สําคัญในการควบคุมการแสดงออกของยีน
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA STABILITY LEVEL
mRNA levelmRNA levelTranscription RNA decay
• Half-life ของ mRNA ของยีนตางๆภายใน eukaryotic cells อาจจะแตกตางกันไดอยางมาก ตั้งแตไมกี่นาที ไปจนถึงหลายชั่วโมงหรือหลายวัน
Regulation of RNA decay:
• mRNA ของยีนบางยีน อาจจะมี sequence ที่มีความสําคัญในการกําหนด stability ของ mRNA
AU-rich element (ARE) at 3’ UTRpromotes poly-A shortening
Iron-responsive element (IRE) at 3’UTR
e.g.
makes mRNA susceptible to endonuclease attacks.
ดังนั้น การควบคุม activity ของ sequence ดังกลาว สามารถทําใหเกิดการเปลี่ยนแปลงของอัตราการสลายของ mRNA เปนผลใหการแสดงออกของยีนนั้นๆ เปลี่ยนแปลงตามไปดวย
REGULATION OF GENE EXPRESSION - RNA STABILITY LEVEL
ดูตัวอยางการควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับ iron metabolism ใน slide ถัดไป
REGULATION OF GENE EXPRESSION
ตัวอยางการควบคุมการแสดงออกของยนีที่เกี่ยวของกับ iron metabolism ที่ใชกลไกการควบคุมที่ระดับ translation และ RNA stability
เพื่อใหการทํางานของยีนตางๆสอดคลองกัน อาจมีการใชกลไกเพื่อควบคุมการแสดงออกของยีนหลายๆกลไก เพื่อใหเกดิการแสดงออกของยีนที่เหมาะสม
เพื่อใหการทํางานของยีนตางๆสอดคลองกัน อาจมีการใชกลไกเพื่อควบคุมการแสดงออกของยีนหลายๆกลไก เพื่อใหเกดิการแสดงออกของยีนที่เหมาะสม
example
ยีนที่เกี่ยวของกับขบวนการ metabolism ของ iron จะใชทั้งการควบคุมระดับ translation และ RNA stability ในการควบคุมการแสดงออกของยีน
Transferrin receptor gene และ ferritin gene
Iron metabolism
transferrin (iron-transport protein)
transferrin receptor
Fe2+/Fe3+
ferritin
cell usage (e.g. cytochrome, heme)
(iron-storage protein)
cell
• Transferrin receptor ทําหนาที่ขนสง iron เขาสูเซลล
• Ferritin ทําหนาที่จับกับ iron เปนแหลงเก็บสะสม iron สําหรับเซลล
• โปรตีนทั้งสองชนิดจะตองมี gene expression ที่เหมาะสมเพื่อให iron metabolism ดําเนินไปตามความตองการของเซลล
Iron metabolism
transferrin (iron-transport protein)
transferrin receptor
Fe2+/Fe3+
ferritin
cell usage (e.g. cytochrome, heme)
(iron-storage protein)
cell
Iron metabolism
transferrin (iron-transport protein)
transferrin receptor
Fe2+/Fe3+
ferritin
cell usage (e.g. cytochrome, heme)
(iron-storage protein)
cell
ถา gene expression ไมเหมาะสม
Transferrin receptor Ferritin Iron excessFenton reaction and oxidative damages to cells
Transferrin receptor Ferritin Iron depletion Defective cellular functions
• IRE-binding proteins (IRPs) = โปรตีนที่จับกับ IRE อยางจําเพาะ
• iron-responsive elements (IREs) = RNA sequence forming a hairpin structure.
Iron-bound IRP no binding to IRE
IRP มีคณุสมบัติในการจับกับ iron ดวย IRP ที่อยูในรูปที่จับกับเหล็ก (iron-bound IRP) จะเสียคุณสมบัติในการจับกับ IRE
5’ 3’RNA
IRE
IRP
เมื่อระดับของ iron ในเซลลลดลง เซลลจะสราง transferrin receptor มากขึ้นเพื่อชวยพา iron เขาสูเซลล และลดการสราง ferritin เพือ่เพิ่มระดับ free iron ที่เซลลจะเอาไปใชได ใหมากขึ้น
เมื่อระดับของ iron ในเซลลลดลง เซลลจะสราง transferrin receptor มากขึ้นเพื่อชวยพา iron เขาสูเซลล และลดการสราง ferritin เพือ่เพิ่มระดับ free iron ที่เซลลจะเอาไปใชได ใหมากขึ้น
Transferrin receptor mRNATransferrin receptor mRNA • contains IRE at 3’ UTR
• binding of IRP to IREs blocks endonucleolytic cleavage of mRNA
mRNA stability
translation and level of transferrin receptor
endonucleolytic cleavage
ใชกลไก RNA stability controlใชกลไก RNA stability control
• contains an IRE at 5’ UTR
• binding of IRP to IRE stabilizes the hairpin structure and blocks translation initiation.
Ferritin mRNAFerritin mRNA
translation initiation
translation and level of ferritin
ใชกลไก translational controlใชกลไก translational control
เมื่อระดับของ iron ในเซลลลดลง เซลลจะสราง transferrin receptor มากขึ้นเพื่อชวยพา iron เขาสูเซลล และลดการสราง ferritin เพือ่เพิ่มระดับ free iron ที่เซลลจะเอาไปใชได ใหมากขึ้น
เมื่อระดับของ iron ในเซลลลดลง เซลลจะสราง transferrin receptor มากขึ้นเพื่อชวยพา iron เขาสูเซลล และลดการสราง ferritin เพือ่เพิ่มระดับ free iron ที่เซลลจะเอาไปใชได ใหมากขึ้น
เมื่อระดับของ iron ในเซลลเพิ่มขึ้น เซลลจะลดการสราง transferrin receptor เพื่อลดการนํา iron เขาสูเซลล และเพิ่มการสราง ferritin เพื่อไปจับ free iron ทําใหลดระดับ free iron ที่อาจจะทําอันตรายกับเซลลได
เมื่อระดับของ iron ในเซลลเพิ่มขึ้น เซลลจะลดการสราง transferrin receptor เพื่อลดการนํา iron เขาสูเซลล และเพิ่มการสราง ferritin เพื่อไปจับ free iron ทําใหลดระดับ free iron ที่อาจจะทําอันตรายกับเซลลได
Transferrin receptor mRNATransferrin receptor mRNA • contains IRE at 3’ UTR
• binding of IRP with iron prevents it from bindng to IREs.
mRNA stability
translation and level of transferrin receptor
endonucleolytic cleavage
IRPFe • no blocking from endonucleolytic cleavage
เมื่อระดับของ iron ในเซลลเพิ่มขึ้น เซลลจะลดการสราง transferrin receptor เพื่อลดการนํา iron เขาสูเซลล และเพิ่มการสราง ferritin เพื่อไปจับ free iron ทําใหลดระดับ free iron ที่อาจจะทําอันตรายกับเซลลได
เมื่อระดับของ iron ในเซลลเพิ่มขึ้น เซลลจะลดการสราง transferrin receptor เพื่อลดการนํา iron เขาสูเซลล และเพิ่มการสราง ferritin เพื่อไปจับ free iron ทําใหลดระดับ free iron ที่อาจจะทําอันตรายกับเซลลได
• contains an IRE at 5’ UTRFerritin mRNAFerritin mRNA
• binding of IRP with iron prevents it from bindng to IREs.
IRPFe • no stabilization of IRE
translation initiation
translation and level of ferritin
REGULATION OF GENE EXPRESSION
Transcriptional VS. Post-transcriptional control of gene expression
proteindegraded mRNA
Nucleus
cytosol
1. Gene
2. Transcription
3. RNA processing
4. RNA export
5. Translation
6. RNA stability
7. Post-translationalmodifications
-S-S-
active protein
REGULATION OF GENE EXPRESSION