full report tyrosinase ๠ภรภภารย๠à¸à¸¢ 2
TRANSCRIPT
i
โครงการยอยท
การศกษาจลนศสาตรของการยงยงเอนไซมไทรซเนสของสารฟลาโวนอยดท
สกดแยกไดจากแกนคร
Studies on the tyrosinase inhibition kinetics of some flavonoids isolated from
Dalbergia parviflora
ภายใตชดโครงการ : การศกษาฤทธยบยงของสารสกดจากแกนครตอการทางานของ
เอนไซมไทโรซเนสจากเหด
Studies on the inhibitory effects of Dalbergia parviflora extract on the activity of
mushroom tyrosinase
โดย
วรวฒน พรหมเดน
และ
เทพพร โลมารกษ
งานวจยนไดรบการสนบสนนจากสถาบนวจยและพฒนา
มหาวทยาลยราชภฏบรรมย
พ.ศ. 2559
(ลขสทธของมหาวทยาลยราชภฏบรรมย)
ii
โครงการยอยท 2
การศกษาจลนศสาตรของการยงยงเอนไซมไทรซเนสของสารฟลาโวนอยดท
สกดแยกไดจากแกนคร
Studies on the tyrosinase inhibition kinetics of some flavonoids isolated from
Dalbergia parviflora
ภายใตชดโครงการ : การศกษาฤทธยบยงของสารสกดจากแกนครตอการทางานของ
เอนไซมไทโรซเนสจากเหด
Studies on the inhibitory effects of Dalbergia parviflora extract on the activity of
mushroom tyrosinase
โดย
วรวฒน พรหมเดน
และ
เทพพร โลมารกษ
งานวจยนไดรบการสนบสนนจากสถาบนวจยและพฒนา
มหาวทยาลยราชภฏบรรมย
พ.ศ. 2559
(ลขสทธของมหาวทยาลยราชภฏบรรมย)
เลขทสญญา 72/2559
i
กตตกรรมประกาศ
โครงการวจยนไดรบทนจากงบประมาณเพอจดสรรทนอดหนนการวจยประจาป
งบประมาณ 2559 มหาวทยาลยราชภฏบรรมย
ii
บทคดยอ
สารฟลาโวนอยด 4 ชนดทสกดแยกไดจากแกนคร ไดแก Khrinone (5), Cajanin (9),
(3RS)-3-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21) และ (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy
pterocarpan (27) ไดนาไปศกษาจลศาสตรการยบยงเอนไซมโดยสงเกตผลดวยปฏกรยาการ
ยบยงกจกรรมจาเพาะของ o- diphenolase ผลการศกษาเผยใหเหนวากลไลการยบยงของ
สารประกอบ (5) (9) (21) และ (27) เปนแบบชนด uncompetitive non-competitive mixed และ
competitive ตามลาดบ การคนพบองคความรพนฐานนทาใหสามารถสรปไดวาสารสกดจากแกน
ครมศกยภาพทจะเปนแหลงของผลตภณฑธรรมชาตสาหรบการประยกตใชเปนสารตานปฏกรยา
การเกดสนาตาล (anti-browning) โดยผานกลไกการยบยงการเกดปฏกรยาออกซเดชนของ
สารประกอบฟนอลโดยเอนไซมไทโรซเนส
คาสาคญ : คร สกข ฟลาโวนอยด ตวยบยงเอนไซมไทโรซเนส จลนศาสตรของเอนไซม
iii
ABSTRACT
Four flavonoids isolated from Dalbergia parviflora, namely Khrinone (5), Cajanin
(9), (3RS)-3-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21) and (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy
pterocarpan (27) were further studied for their inhibition kinetics on the o- diphenolase
activity of the mushroom tyrosinase. The results showed that the inhibition of (5), (9), (21)
and (27) were uncompetitive, non-competitive, mixed and competitive inhibitors,
respectively. Based on these findings, it was concluded that D. parviflora heartwood
extract is a potential source of natural product which might be used as anti-browning
agents that can inhibit the enzymatic oxidation of phenols by tyrosinase.
Keywords: Dalbergia parviflora, flavonoid, tyrosinase inhibitor, Enzyme kinetics
iv
สารบญเรอง
หนา
กตตกรรมประกาศ………………………………….…………………………………………....(i)
บทคดยอ (ภาษาไทย)………….…………………………………………………....................(ii)
บทคดยอ (ภาษาองกฤษ)……..…………………… ………………………………………….(iii)
สารบญเรอง…..………………………………………...………………………………...…….(iv)
สารบญรปภาพ…..………………………………………...………………….…………….....(vi)
สารบญตาราง……..……………………………………….…………………………..…..…..(vii)
บทท 1
บทนา…………………………………….………………………………………………..….……1
ความสาคญและทมาของปญหาททากาวจย….………………………………………………..….1
วตถประสงคของโครงการวจย………………….………………...……………………...…………2
ขอบเขตของโครงการวจย……………………….…………………...…………….……………….2
กรอบแนวความคดของโครงการวจย……………….……………...………………..……………..4
บทท 2
ทฤษฎและการทบทวนวรรณกรรมทเกยวของ………………………………………………...5
เอนไซมไทโรซเนส ..…………………………………………………………………….…………..5
คร …………………………………………………………………………………………………..6
ฟลาโวนอยดและไอโซฟลาโวนอยด…………………………………………………….…………..6
ฤทธทางชวภาพของฟลาโวนอยด…………………………………………………….…………....8
จลนศาสตรของของเอนไซม…..………………………….……………………………………….. 8
v
สารบญเรอง (ตอ)
หนา
บทท 3
วธการดาเนนการวจย…..……………………………………………………………………….18
เครองมอวทยาศาสตร….………………………………………………………………………….18
สารเคม / สารสกด / เอนไซม ….………………………………………………………………….18
การเตรยมสารสกดหยาบจากแกนคร ……………………………………………………………. 4
การวเคราะหฤทธของสารสกดตอการยบยงเอนไซมไทโรซเนส …………………………..…….. 18
การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร…..………..20
บทท 4
ผลการวจย……………………………………………………………………………………….20
การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร ……….…..22
บทท 5
สรปและอภปรายผลการวจย………………………………………………………………..…28
บรรณานกรม…………………………………………………………………….......................30
ภาคผนวก……………………………………………………………………............................33
ประวตนกวจย…..…………………………………...……………………………......................34
vi
สารบญรปภาพ
หนา
ภาพท . แผนผงแสดงขอบเขตและขนตอนของงานวจย………………..………………………
ภาพท .1 โครงสรางทางเคมของฟลาโวนอยด……………………………..….…………………9
ภาพท .2 โครงสรางทางเคมของไอโซฟลาโวนอยด……………………..……….……………….7
ภาพท . กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม …………….………………….7
ภาพท . กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม (Michaelis-Menten
saturation curve).………………………………………………………………………………..10
ภาพท . Double reciprocal plot ระหวาง /vo (แกน Y) และ / [S] ………………………13
ภาพท 2.6 สมการรปแบบของการยบยงเอนไซมแบบผนกลบไมได ……………….………….14
ภาพท 2.7 สมการรปแบบและกลไกของการยบยงแบบ Competitive ………………….….….15
ภาพท 2.8 สมการรปแบบและกลไกของการยบยงเอนไซมแบบ Uncompetitive …………..….16
ภาพท 2.9 สมการรปแบบและกลไกของการยบยงเอนไซมแบบ Noncompetitive……….…….17
ภาพท 4.1 โครงสรางของสารฟลาโวนอยด 4 ชนดทศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซม……...22
ภาพท 4.2 Michaelis-Menten saturation curve และ Lineweaver-Burk Plot ของเอนไซม
ไทโรซเนสโดยไมมการเตมตวยบยง……………………………………………………………….23
ภาพท 4.3 Michaelis-Menten saturation curve และ Lineweaver-Burk Plot ของเอนไซม
ไทโรซเนสโดยมการเตมตวยบยง Khrinone B (5) ………………...…………………………….24
ภาพท 4.4 Michaelis-Menten saturation curve และ Lineweaver-Burk Plot ของเอนไซม
ไทโรซเนสโดยมการเตมตวยบยง Cajanin (9) …………………..……………………………….25
ภาพท 4.5 Michaelis-Menten saturation curve และ Lineweaver-Burk Plot ของเอนไซม
ไทโรซเนสโดยไมมการเตมตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21)………….….26
ภาพท 4.6 Michaelis-Menten saturation curve และ Lineweaver-Burk Plot ของเอนไซม
ไทโรซเนสโดยไมมการเตมตวยบยง 6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy
pterocarpan (27) ………………………………………………………….…………………….27
vii
สารบญตาราง
หนา
ตารางท . แสดงรายการและปรมาตรของสวนผสมในปฏกรยาการวดคาการยบยง
เอนไซมไทโรซเนส…………………………………………………..……………………………..19
ตารางท . แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) โดยไมมตวยบยง…….………………………………………………….….23
ตารางท . แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง Khrinone B (5) …………………..………………24
ตารางท . แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง Cajanin (9)……………………………………..…25
ตารางท . แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21) ….26
ตารางท .5 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) โดยมการเตมตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy
pterocarpan (27)…………………………………………………………………………..…….27
1
บทท 1
บทนา
ความสาคญและทมาของปญหา
จลศาสตรของเอนไซม (enzyme kinetics) คอ การศกษาอตราเรวของปฏกรยา (reaction
rate) และการเปลยนแปลงอตราเรวของปฏกรยาเมอมการเปลยนแปลงปจจยบางอยาง เพอทา
ความเขาใจกลไกการทางานของเอนไซมนนๆ ได การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมจงเปนแนว
ปฏบตสาหรบการศกษาเชงลงภายหลงจากการศกษาเบองตพนแลวพบวามสารใดออกฤทธยบยง
เอนไซมทกาลงศกษาอย ซงโครงการวจยนไดมงเนนศกษาสารฟลาโวนอยดทสกดแยกไดจากแกนคร
(Dalbergia parviflora) ทมผลตอการยบยงเอนไซมไทโรซเนส ซงใชเอนไซมไทโรซเนสจากเหด
(mushroom tyrosinase) เปนตวแทนในการศกษา จากการศกษาเบองตนพบสารสกดฟลาโวนอยด
บรสทธจากแกนครจานวน 4 ชนด มฤทธยบยงเอนไซมไดดมาก จงควรนามาศกษาจนลศาสตรการ
ยบยง เพอใหเกดองคความรทางวทยาศาสตรทสามารถอธบายกลไกการยบยงและขอมลทาง
จลนศาสตรทไดจะเปนประโยชนในการใชเปรยบเทยบความแตกตางของตวยบยงทศกษาและตว
ยบยงอนๆ ทมรายงานมากอน
เอนไซมไทโรซเนสมความสมพนธกบการสงเคราะหเมลานนซงทาใหเกดสผวและยง
เกยวของกบการเกดสนาตาลในอาหารจาพวกผกผลไมและอาหารทะเล ดงนการศกษาตวยบยง
เอนไซมไทโรซเนสจงมโอกาสพฒนาเปนผลตภณฑดานอาหารและเครองสาอาง ทงนมรายงานวา
สารพฤกษเคมกลมฟลาโวนอยดทสกดไดจากพชมคณสมบตในการยบยงเอนไซมไทโรซเนส และ
คณะผ วจยไดเคยรายงานการคนพบสารฟลาโวนอยดทสกดแยกไดจากแกนครและฤทธตานอนมล
อสระของสารฟลาโวนอยดดงกลาวมาแลว ดงนนหากทาการวจยศกษาถงคณสมบตการออกฤทธ
ทางชวภาพอนๆ จะเปนการสรางโอกาสในการพฒนาองคความรและพฒนานวตกรรมใหม
2
สารพฤกษเคมทเปนองคประกอบในแกนคร (Dalbergia parviflora) พบวามสารประกอบ
ฟลาโวนอยดมากกวา 60 ชนด ซงงานวจยตางๆ ไดกลาวถงฤทธทางชวภาพของฟลาโวนอยดไว
อยางหลากหลาย เชน ฤทธตานอนมลอสระ (Fernandez-Panchon et al., 2008; Prochazkova et
al., 2011) ฤทธตานมะเรง ฤทธตานการอกเสบ (Kim et al., 2004) ฤทธในการตานจลชพประเภท
แบคทเรย เชอรา และไวรส (Tereschuk et al., 1997; Tsao et al., 1982; Yao et al., 2004) และ
รวมถงฤทธการยบยงเอนไซมชนดตางๆ ในระบบชวภาพ (Kongkamnerd et al., 2012;
Kongkamnerd et al., 2011) การสงเสรมการวจยดานสมนไพรและสารออกฤทธทางชวภาพจะเปน
การสรางความพรอมทางดานการผลตยารกษาโรค เครองสาอาง อาหาร รวมถงยากาจดโรคพชและ
เปนแผนหนงของการพฒนานวตกรรมดานสมนไพรไทยใหมประสทธภาพและไดรบการยอมรบมาก
ขน ในทางเศรษฐกจจะนาไปสการลดการนาเขาของสารเคมหรอสารสงเคราะห รวมถงการสงเสรม
ใหมการอนรกษพชพนธสมนไพร และประชาสมพนธใหทราบถงคณคาของทรพยากรธรรมชาตใน
ทองถน
วตถประสงคของโครงการวจย
เพอศกษาจนศาสตรของการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของสารฟลาโวนอยดบางชนดทพบ
แนวโนมการยงยงเอนไซมไทโรซเนส และรายงานคาทางจลนศาสตรของเอนไซม
ขอบเขตของโครงการวจย
งานวจยนทาการศกษาวจยภายในหองปฏบตการเพอศกษาฤทธและกลไกการยบยง
เอนไซมไทโรซเนสของเหดในหลอดทดลอง โดยการใชเทคนคการตดตามอตราการเกดปฏกรยาและ
อตราการยบยงปฏกรยาดวยวธทางสเปกโตรโฟโตรเมตร โดยยงไมมการพฒนาสารสกดใหเปน
ผลตภณฑสาหรบการใชเปนยาหรออาหาร และการวจยนยงไมมการทดลองในมนษยหรอสตว
3
ภาพท 1.1 แผนผงแสดงขอบเขตและขนตอนของงานวจย
4
กรอบแนวความคดของโครงการวจย
แกนครเปนสมนไพรทมาจากภมปญญาทองถนของไทย โดยพบวามการใชเปนยา
บารงรางกายและยาสาหรบสตร และคณะผ วจยไดศกษาวจยทางวทยาศาสตรเกยวกบฤทธตาน
อนมลอสระและพบวามฤทธตานอนมลอสระสง จงเหนสมควรศกษาฤทธทางชวภาพอนๆ ใหรอบ
ดาน โครงการวจยนจงไดพฒนางานวจยเดมใหมการแตกแขนงการวจยออกไปในเชงลก โดยมง
ประเดนหลกไปทการศกษาฤทธการยบยงเอนไซมไทโรซเนส เพอยนยนผลการออกฤทธทางชวภาพ
ในระดบหลอดทดลองกอนการประเมนแนวทางพฒนาไปสผลตภณฑ ทงนการนาภมปญญาทองถน
มาตรวจสอบในระดบหองปฏบตการเพอเพมขอมลทางวทยาศาสตร จะทาใหสามารถพฒนาขนเปน
ผลตภณฑทองถนทซงเปนทยอมรบไดในอนาคต โดยเฉพาะอยางยงทเกยวของกบอาหาร สขภาพ
และความงาม และเปนการสรางโอกาสในการพฒนาเทคโนโลยและนวตกรรมทมาจากภมปญญา
ทองถนเพอกลบคนสทองถน อนจะนามาซงโอกาสในการสรางรายไดและความยงยน
5
บทท 2
ทฤษฎและการทบทวนวรรณกรรมทเกยวของ
เอนไซมไทโรซเนส (tyrosinase, EC 1.14.18.1) เปนเอนไซมในทจดอยในกลมออกซโดร
ดกเทส (oxidoreductase) มชออนๆ เชน monophenol monooxygenase, phenolase, phenol
oxidase, tyrosine-dopa oxidase หรอ monophenol oxidase เปนตน เอนไซมไทโรซเนสเปน
เอนไซมชนด copper-containing enzyme พบอยในสงมชวตทหลากหลาย เชน ในจลนทรย สตว
และพช เอนไซมไทโรซเนสพบวามหนาทสาคญใน 3 ประเดนคอ
1) ในสตวเลยงลกดวยนมเอนไซมไทโรซเนสจะมหนาทเกยวของกบกระบวนการสงเคราะห
รงควตถเมลานน (melanin) ทอยภายในเซลลเมลาโนไซต (melanocytes) โดยทาหนาทเรงปฏกรยา
ออกซเดชนกบสารตงตนทงแอล-ไทโรซน (L-tyrosine) และแอล-โดปา (L-dopa) รวมกบออกซเจน
ไดเปนสารประกอบโดปาโครม (dopachrome) หลงจากนนจะเกดปฏกรยาโพลเมอไรเซชนโดยไม
อาศยเอนไซมเปนตวเรง ไดผลตภณฑเปนเมลานนชนดตางๆ ซงจะถกสงตอเพอสะสมยงเซลลเคราต
โนไซต (keratinocyte) และทาใหเกดลกษณะการแสดงออกของสผว สผม สขน และสนยนตา
นยนตา
2) เอนไซมกลมนยงพบวาเกยวของกบการเกดสนาตาล (enzymatic browning reaction)
ของอาหารประเภทพชผกผลไม โดยปฏกรยาการเกดสนาตาลทเกยวกบเอนไซมนเปนปฏกรยา
ออกซเดชน (oxidation) จะเกดขนเมอเซลลของสงมชวตเกดการชา ฉก ขาด เมอถกกระแทก บด หน
หรอสบทาใหเอนไซม
3) ในสตวกลมแมลงและครสเตเซยนพบวาเอนไซมนจะถกเรยกวา polyphenoloxidase
(PPO) กลมฟนอลออกซเดสมบทบาทสาคญตอระบบภมค มกนของแมลงมหนาทชวยใน
กระบวนการปองกนตวและเจรญเตบโต
6
คร (Dalbergia parviflora Roxb.) มชอสามญคอ Blackwood และชอทองถนไดแก กระซก
ซก สร และ สกข เปนตน จดอยวงศ (family) Fabaceae วงศยอย (subfamily) Faboideae อาจม
การสบสนกบตนสกข (Dalbergia candenatensis) ซงเปนพรรณไมในวงศเดยวกน งานวจย
เกยวกบสารพฤกษเคม (phytochemical) จากแกนครพบวามสารฟลาโวนอยด (flavonoid) มากกวา
60 ชนด และพบวาหลายชนดมฤทธคลายฮอรโมนเอสโตรเอสโตรเจน (Promden et al., ;
Songsiang et al., ) นอกจากนสารฟลาโวนอยดยงมรายงานวาเปนสารพฤกษเคมทม
คณสมบตตานอนมลอสระ (antioxidant) (Chen et al., ; Croft, ; Rice-Evans et al.,
) คณะผ วจยไดทาการศกษาสารกลมไอโซฟลาโวนอยดทสกดไดจากแกนครโดยวธ DPPH วธ
ORAC และวธ xanthine/xanthine oxidase ซงพบวามสารหลายชนดทแสดงสมบตตานอนมลอสระ
ได อกทงยงไดรายงานถงความสมพนธของโครงสรางทางเคมและฤทธตานอนมลอสระ (Promden
et al., ) สารฟลาโวนอยดจากแกนครจงเปนเปาหมายทจะนามาศกษาฤทธทางชวภาพท
เกยวของกบการพฒนายา ผลตภณฑเสรมอาหาร และเครองสาอาง
ฟลาโวนอยด (Flavonoids) และไอโซฟลาโวนอยด (Isoflavonoids)
ในเชงโครงสรางทางเคมของฟลาโวนอยดซงเปนสารพฤกษเคมในธรรมชาตพบวาม
โครงสรางหลกเปน C -C -C ประกอบกบการมหมแทนท (substitution group) ในตาแหนงตางๆ
ตามระบบการเรยกชอ IUPAC สามารถจดจาแนกฟลาโวนอยดไดดงน
1) ฟลาโวนอยด (flavonoid) หรอ ไบโอฟลาโวนอยด (bioflavonoid)
2) ไอโซฟลาโวนอยด (isoflavonoid) เกดจากโครงสรางของ 3-phenylchromen-4-one
3) นโอฟลาโวนอยด (neoflavonoid) เกดจากโครงสรางของ4-phenylcoumarine
ไอโซฟลาโวนอยดเปนสารประกอบในกลมฟลาโวนอยด มโครงสรางหลกมาจาก 3-
phenylchroman เปนสารประกอบทพบอยในสงมชวตอาณาจกรพช ความหลากของชนดของ
ไอโซฟลาโวนอยดขนอยกบจานวนและตาแหนงของหมแทนทบนวงแหวน และยงมความแตกตาง
หลากหลายของระดบออกซเดชนบนวงแหวน (Grotewold, 2006) ไอโซฟลาโวนอยดจงสามารถ
แบงเปนกลมยอยไดดงน
7
1. ไอโซฟลาแวน (isoflavan)
2. ไอโซฟลาโวน (isoflavone)
3. ไอโซฟลาวาโนน (isoflavanone)
ภาพท 2.1 โครงสรางทางเคมของฟลาโวนอยด (2-phenylbenzopyran) ไอโซฟลาโวนอยด (3-
benzopyran) และ นโอฟลาโวนอยด (4-benzopyran) แสดงการระบหมายเลขตาแหนงของหม
แทนทบนวงแหวน A B และ C
ภาพท 2.2 โครงสรางทางเคมของไอโซฟลาโวนอยด 3 ชนด คอ ไอโซฟลาแวน ไอโซฟลาโวน และไอ
โซฟลาวาโนน แสดงการระบหมายเลขตาแหนงของหมแทนทบนวงแหวน A B และ C
8
ฤทธทางชวภาพของฟลาโวนอยด
ในปจจบนนฟลาโวนอยดกาลงเปนทสนใจในวงการทศกษาเกยวกบสารตานอนมลอสระ
ซงฟลาโวนอยดเปนสารทมศกยภาพในการตานอนมลอสระทสงมาก (Devasagayam et al., 2004;
Nijveldt et al., 2001) สมบตในการตานอนมลอสระของสารฟลาโวนอยดพบวามความเกยวของกบ
ฤทธทางชวภาพอนๆ เชน การตานการอกเสบ (anti-inflammatory) (Kim et al., 2004) ยบยง
เอนไซมบางกลม เชน hydrolytic enzyme และ oxidative enzyme (Theos et al., 2005; Yang et
al., 2012)นอกจากนยงพบวาฟลาโวนอยดสามารถปองกนโรคหวใจและหลอดเลอด ยบยง
เซลลมะเรง และฟลาโวนอยดบางชนดอาจมศกยภาพทสามารถยบยงไวรส HIV ได (Yao et al.,
2004) ฤทธทางชวภาพทเกยวกบฤทธตานจลนทรยในสารประกอบฟลาโวนอยด ไดแก สารสกดจาก
ใบ Tagetes minuta ซงการใชเปนยาพนบานเพอรกษาโรคตดเชอในประเทศแถบอารเจนตนาซง
พบวามสารฟลาโวนอยดคอ quercetagetin- -arabinosyl-galactoside (Tereschuk et al., 1997)
สารสกดจาก Scutellaria baicalensis ซงเปนพชสมนไพรจนทใชรกษาโรคเยอหมฟนอกเสบและ
แผลตดเชอในชองปากพบวามสารฟลาโวน baicalein เปนสารออกฤทธหลก (Tsao et al., 1982)
มการศกษาถงฤทธของสารพฤกษเคมกลมฟลาโวนอยดทสามารถยบยงเอนไซมไทโรซเนส
ไดแก Glabrene และ Isoliquiritigenin ในรากชะเอม (Glycyrrhiza glabra L.)(Nerya et al., 2003)
Norartocarpetin จากเปลอกและรากของพชตระกลหมอน (Morus ihou) (Jeong et al., 2009; Ryu
et al., 2008) Taxifolin จากตนออนของพชจาพวกผกแพว (Polygonum hydropiper L.)(Miyazawa
and Tamura, 2007)
จลนศาสตรของของเอนไซม
ในป ค.ศ. วคเตอร เฮนร (Victor Henri, – ) ลโอนอร มเคลส (Leonor
Michaelis) และ มด เมนเทน (Maud Menten) ไดเสนอทฤษฎเอนไซมจลนศาสตร ซงยงคงใชกนอย
อยางแพรหลายในทกวนน ซงรจกกนในชอทเรยกวาจลนศาสตรของมเคลส-เมนเทน (Michaelis-
Menten kinetics) ซงหมายถงการศกษาปฏกรยาเคมทมเอนไซมเปนตวเรง ซงมการวดความเรว
การศกษาปจจยบางอยางทมผลกระทบตอความเรวการอธบายกลไกการเรงปฏกรยาและกลไกยบยง
เอนไซม
9
ความเรวของปฏกรยา (velocity)
เมอพจารณาสมการปฏกรยาทมตวเรงโดยทมซบสเตรตเพยงตวเดยวดงน
ปฏกรยาขนแรกเปนปฏกรยาทสามารถผนกลบไดโดยทโมเลกลเชงซอนของเอนไซมและซบสเตรต
(ES) จบกนดวยพนธะทไมใชพนธะโคเวเลนซ จากนนจงผนกลบเปนเอนไซม (E) และซบสเตรต (S)
ไดอยางรวดเรว สาหรบปฏกรยาในขนทสองมการเปลยนแปลงรปรางของโมเลกลเกดขนในโมเลกล
เชงซอน ES ทาใหไดผลตภณฑ (P) ซงจะแยกตวออกมาจากเอนไซมในทสด และเอนไซมยงคง
สามารถกลบมาจบกบซบสเตรตตวใหมได พรอมจะเรงปฏกรยาไดอก คา k+1 k-1 และ k2 คอ คาคงท
ของความเรว (rate constants) ของปฏกรยา ในการวดความเรวของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซมจะ
พบวาในชวงแรกของปฏกรยาความเขมขนของผลตภณฑทเกดขนจะแปรผนตรงกบเวลา แตหลงจาก
นนอตราการเพมของผลตภณฑจะลดลงและอาจหยดลง (ภาพท 2.3) ดวยเหตนในการศกษา
จลนศาสตรของเอนไซมจงตองวดความเรวของปฏกรยาในระหวางทกราฟของผลตภณฑและเวลายง
เปนเสนตรงอย ซงความชนของกราฟในระยะนหมายถงความเรวเรมตน (initial velocity, Vo)
(สกญญา สนทรส และวเชยร รมพณชยกจ. 2553 : 286)
ภาพท 2.3 กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม (progress curve) แสดงการ
เพมขนของผลตภณฑ [Product] กบ เวลา จะพบวาในระยะตนกราฟยงคงเปนเสนตรงและความชน
ของกราฟจะหมายถงคาความเรวเรมตน (Vo)
10
สมการของไมเคลส-เมนเทน (Michaelis-Menten equation)
เมอวาดกราฟระหวางความเรวเรมตนกบความเขมขนของซบสเตรตจะไดกราฟลกษณะเปน
ไฮเพอรโบลา (ภาพท 2.4) เปนทสงเกตวาเมอเพมความเขมขนของซบสเตรตในระยะเรมตน
ความเรวของปฏกรยาจะเพมขน แตเมอเพมความเขมขนของซบสเตรตระดบหนงจะไดความเรว
สงสด (Vmax) และหากเพมความเขมขนซบสเตรตตอไปอกความเรวของปฏกรยาจะคงทจะไมเพมขน
ทงนเนองมาจาก
1. ทความเขมขนของซบสเตรตมคาตา โมเลกลเอนไซมยงคงมบรเวณเรงทวางอยเปนจานวน
มาก ดงนนการเพมความเขมขนของซบสเตรตจะมผลทาใหความเรวเพมขนได
2. ทความเขมขนของซบสเตรตมคาสงมาก ความเรวของปฏกรยาจะไมขนกบความเขมขน
ของซบสเตรต เนองจากเอนไซมไมมบรเวณเรงทเหลอวาง และมซบสเตรตอสระเหลออยอกมาก
แมวาจะเพมซบสเตรตเขาไปอกกไมมทใหเขาจบบนเอนไซม อตราเรวกจงเกอบไมเพมขนใหสงเกตได
ภาพท 2.4 กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยาทเรงดวยเอนไซม (Michaelis-Menten saturation
curve) แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (vo) กบความเขมขนของซบสเตรต [S]
สามารถพจารณาความสมพนธของพารามเตอรทเกยวของกบจลนศาสตรของเอนไซมไดดงน
จากสมการ
11
จะไดวา ความเรวเรมตน vo มคาดงน
อยางไรกตาม ไมสามารถวดการเกดขนของ [ES] ไดโดยตรง แตทราบวาความเรวสงสด
(maximum velocity, Vmax) จะเกดขนเมอเอนไซมทงหมดอยในรป enzyme-substrate complex,
[ES] ดงนนความเขมขนรวมของเอนไซม [Etotal] จงเทากบ [E] + [ES] และสามารถเขยนสมการได
เปน
Vmax = k2[Etotal]
= k2 ([E]+[ES]) …………………….. (2)
นาสมการ (1) ตงแลวหารดวยสมการ (2) จะได
เมอ คาคงทการแตกตว (dissociation constant, Ks) มคา
หรอ
แทนคา [ES] ลงใน สมการ (2) จะได
ซงสมการ (3) คอ สมการของมเคลส-เมนเทน
12
ในป ค.ศ. จอรจ เอดเวรดบรกส (George Edward Briggs) และ จอหน เบอรดอน
แซนเดอรสน ฮอลเดน (John Burdon Sanderson Haldane) ไดเสนอแนวคดสภาวะคงท (steady
state concept) ของการเกด enzyme-substrate complex [ES] โดยกลาววาขณะทมการเรง
ปฏกรยาดวยเอนไซม ความเขมขนของ [ES] จะคงทเสมอ เนองจากการจบกนของเอนไซมและซบส
เตรตเกดขนอยางรวดเรวและผนกลบได จากนน ES จะสลายตวไดเปนผลตภณฑ (P) และเอนไซม
อสระ (E) ซงปฏกรยาขนตอนทสองนจะชากวามาก จงเปนขนกาหนดความเรวของปฏกรยา (rate-
limiting step)
จากสมการขางตนจะเหนวาปรมาณของ ES จะขนกบปรมาณของเอนไซมและซบสเตรต
ดงนนหากมปรมาณซบสเตรตมากเกนพอ ภายหลงจากท ES กลายเปนผลตภณฑแลว เอนไซมอสระ
จะจบกบซบสเตรตตวใหม ไดเปน ES จงทาให ES มคาคงท สภาวะนเรยกวาสภาวะคงท (steady
state)
ดงนน ความเรวของการสราง ES = k1 [E][S]
ความเรวของการสลาย ES = k-1[ES] + k2[ES]
ณ ทสภาวะคงท ความเรวของการสราง ES = ความเรวของการสลาย ES
ดงนน k1 [E][S] = (k-1 + k2) [ES]
หรอ
Km ในสมการ (4) เรยกวาคาคงทของมเคลส เมนเทน (Michaelis-Menten constant) เปนตวแปร
สาคญในการศกษาจลนศาสตรของเอนไซม มหนวยเปนโมลาร (Molar)
จากสมการ (4) จะไดวา
แทนคา [ES] ลงใน สมการ (2) จะได
13
เรยกสมการ (5) วา Briggs-Haldane equation ซงคลายกบสมการ (3) แตปจจบนสมการ
ทงสอง มกถกเรยกรวมไปวาเปน สมการมเคลส-เมนเทน (Michaelis-Menten equation)
เมอเขยนกราฟระหวาง ความเรว vo กบ [S] จะไดกราฟดงรปท 2.4
เพอใหการหาคาพารามเตอรตาง ๆ สะดวกยงขน ฮานส ไลนวเวอร (Hans Lineweaver)
และดน เบรก (Dean Burk) ไดแปลงสมการมเคลส-เมนเทน (สมการ ) ใหเปนสวนกลบ ไดดงน
สมการ ( ) เรยกวา สมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) และเมอเขยน
กราฟระหวาง /vo เปนแกน Y และ / [S] เปนแกน X จะไดกราฟเสนตรงดงภาพท 2.5
เรยกวา กราฟไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk plot) ซงจะทาใหสามารถหาคา Km และ
Vmax เปนไปไดอยางถกตองแมนยากวาการใชกราฟตามภาพท 2.4
ภาพท 2.5 Double reciprocal plot ระหวาง 1/vo (แกน Y) และ 1 / [S] (แกน X) ตามสมการไลนว
เวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) จะไดจดตดแกน Y เปน 1/ Vmax, จดตดแกน Xเปน -1/Km
และความชนคอ Km/ Vmax
14
ตวยบยงเอนไซม (enzyme inhibitor)
ตวยบยงเอนไซมคอโมเลกลทสามารถจบกบเอนไซมและทาใหเอนไซมเรงปฏกรยาไดลดลง ซง
หลกการนนามาประยกตใชเปนยาปฏชวนะและยารกษาโรคทเกยวของกบเอนไซม ในระบบเมแทบอ
ลซม การทางานของตวยบยงเอนไซมสามารถจาแนกเปน ประเภทคอ ยบยงแบบถาวรหรอผนกลบ
ไมได (irreversible inhibition) และยบยงแบบผนกลบได (reversible inhibition) (สกญญา สนทรส
และวเชยร รมพณชยกจ. 2553 : 296)
การยบยงแบบถาวรหรอผนกลบไมได (irreversible inhibition)
การยบยงแบบผนกลบไมไดหรอการยบยงอยางถาวรเกดจากการเตมสารทเมอจบกบเอนไซม
แลวเกดพนธะโคเวเลนซ ซงมความคงตวมากและเปนการทาลายหมฟงกชนทจาเปนสาหรบการเรง
ปฏกรยาของเอนไซมไปอยางถาวรโดยไมสามารถเกดปฏกรยาผนกลบได
ภาพท 2.6 สมการรปแบบของการยบยงเอนไซมแบบผนกลบไมได
การยบยงแบบผนกลบได (reversible inhibition)
การยบยงแบบผนกลบไดนนสามารถแยกเอาตวยบยงออกจากเอนไซมหรอทาใหตวยบยงเจอ
จางลงเพอทาใหเอนไซมกลบมประสทธภาพเหมอนเดมไดลกษณะการยบยงแบบผนกลบไดแบงเปน
3 แบบคอ
1. การยบยงแบบแขงขน (competitive inhibition)
การยบยงชนดนจะมตวยบยง (I) ทมลกษณะโครงสรางคลายกบซบสเตรตมาก จงสามารถ
เขาจบกบบรเวณเรง (active site) บนเอนไซมอสระ (E) โดยทตวยบยงจะไมสามารถจบกบ ES ได
การยบยงแบบแขงขนนสามารถผนกลบได (reversible) เนองจากตวยบยงและซบสเตรต พยายาม
แขงขนเพอแยงเขาจบกบบรเวณเรงของเอนไซม หากตวใดมความเขมขนมากกวากจะมโอกาสเขา
จบไดดกวา การยบยงชนดนสามารถแกไขไดโดยการเพมความเขมขนซบสเตรต
15
ภาพท 2.7 (ก) สมการรปแบบของการยบยงแบบแขงขน (ข) ภาพจาลองการการยบยงแบบแขงขน
(ค) ผลของตวยบยงแบบแขงขนแสดงดวยกราฟของ Lineweaver-Burk เมอแปรคาความเขมขนของ
ตวยงยงจากทไมมตวยบยง (α = ) และเมอเพมความเขมขนเพมขนเปน α = , …ผลลพธทาง
จลนศาสตรของเอนไซมทมตวยบยงแบบแขงขนคอ คา Km เพมขน ในขณะท Vmax คงท
ทมาของภาพ : (Cox และ Nelson. 2008 : 201-202)
(ก) (ข)
(ค)
16
2. การยบยงแบบไมแขงขนแบบ Uncompetitive ตวยบยงชนดนจะจบเฉพาะ
สารประกอบเชงซอนของเอนไซมซบสเตรต (ES) อยางแบบผนกลบไดเกดเปน ESI ซงไมสามารถเกด
เปนผลตภณฑได ตวยบยงจะไมสามารถจบกบเอนไซมอสระได การจบของซบสเตรตกบเอนไซม
อาจทาใหเอนไซมเกดการเปลยนโครงรปไปจนทาใหตวยบยงจบดวยได ตวยบยงชนดนจะไมแขงขน
กบซบสเตรตในการเขาจบกบบรเวณเรง ดงนนจงไมสามารถแกไขผลการยบยงทเกดขนโดยการเพม
ความเขมขนของซบสเตรต รปแบบของการยบยงเขยนไดดงน
ภาพท 2.8 (ก) สมการรปแบบของการยบยงแบบ Uncompetitive (ข) ภาพจาลองการยบยงแบบ
Uncompetitive ( ค ) ผ ล ข อง ตว ยบ ย ง แ บ บ Uncompetitive แ ส ด ง ด ว ยก รา ฟ ข อ ง
Lineweaver-Burk เมอแปรคาความเขมขนของตวยบยงจากทไมมตวยบยง (α’ = ) และเมอเพม
ความเขมขนเพมขนเปน α’ =1.5, 2… ผลลพธทางจลนศาสตรของเอนไซมทมตวยบยงแบบ
Uncompetitive คอ ทงคา Km และ Vmax ลดลง ทมาของภาพ : (Cox และ Nelson. 2008 : 201-202)
(ก) (ข)
(ค)
17
3. การยบยงแบบไมแขงขนแบบ Noncompetitive เปนการยบยงโดยตว ยบยงเขาจบ
บรเวณทไมใชบรเวณเรง ซงสามารถเขาจบไดทงกบ E หรอ ES ตวยบยงจะทาใหโครงสรางของ
เอนไซมเปลยนไป ทาใหหมเรง (catalytic group) ไมสามารถทางานไดตามปกตหรอไมอยใน
ตาแหนงทเหมาะสมในการเรงปฏกรยา จงเปลยนซบสเตรตใหเปนผลตภณฑไดนอยลงหรอไมไดเลย
ถาการจบกนของซบสเตรตหรอตวยบยงเปนอสระตอกน (KI = K´I) จะเรยกวาการยบยงแบบ pure
noncompetitive inhibition แตถาการเขาจบของซบสเตรตมผลตอการเขาจบของตวยบยง หรอ การ
เขาจบของตวยบยงมผลตอการเขาจบของซบสเตรต (KI ‡ K´ I) จะทาใหมลกษณะคลายการ
แขงขน จงเรยกการยบยงแบบนวา การยบยงแบบผสม (mixed inhibition)
ภาพท 2.9 (ก) สมการรปแบบของการยบยงแบบ Noncompetitive (ข) ภาพจาลองการยบยงแบบ
Noncompetitive (ค) ผลของตวยบยงแบบ pure noncompetitive แสดงดวยกราฟของ
Lineweaver-Burk เมอแปรคาความเขมขนของตวยงยง ผลลพธทางจลนศาสตรของเอนไซมทมตว
ยบยงแบบ pure noncompetitive คอ ทงคา Km คงท และ Vmax ลดลง และ (ง) ผลของตวยบยงแบบ
ผสม (mixed) คอ คา Km เพมขน ในขณะท Vmax ลดลง ทมาของภาพ : (Cox และ Nelson. 2008 : 201-202)
(ก) (ข)
(ค) (ง)
18
บทท 3
วธการดาเนนการวจย
เครองมอวทยาศาสตร
1. เครองชงทศนยม 4 ตาแหนง
2. สเปกโตรโฟโตมเตอรแบบ microplate reader (Visible)
3. ปเปต และ มลตชลเนลปเปตขนาดตางๆ
4. จานหลมขนาด 96 ชอง (96 well plate)
สารเคม / สารสกด / เอนไซม
1. DMSO
2. Methanol
3. Sodium dihydrogen phosphate / Sodium hydrogen phosphate
4. Mushroom tyrosinase lyophilized powder (CAS Number 9002-10-2)
(T3824, Sigma-Aldrich)
5. Dalbergia parviflora extract
6. Flavonoids (isolated from Dalbergia parviflora)
การวเคราะหฤทธของสารสกดตอการยบยงเอนไซมไทโรซเนส
1. เตรยมสารละลายสารสกดหยาบ หรอ สารละลายสารฟลาโวนอยดบรสทธทความเขมขน
5 mg/mL โดยใชตวทาละลายคอ 50% (v/v) DMSO
2. เตรยมสารละลาย 2.5 mM L-DOPA ใน 20 mM phosphate buffer (PB) pH 6.8
3. เตรยมสารละลายเอนไซมไทโรซเนส (Mushroom tyrosinase, E.C. . . . , Sigma)
ความเขมขน 100 Unit/mL ใน 20 mM phosphate buffer (PB) pH 6.8
4. เตรยมปฏกรยาในจานหลมขนาด 96 หลม (ตารางท 3.1) ซงประกอบไปดวย 20 mM
phosphate buffer (PB) pH 6.8 จานวน 140 µL สารสกดตวอยางทตองการทดสอบทความเขมขน
ตางๆ จานวน 20 µL สารละลายเอนไซมไทโรซเนส 100 Unit/mLจานวน 20 µL จากนนนาไปบมท
19
อณหภม °C เปนเวลา 10 นาท แลวจงเตม . mM L-DOPA จานวน 20 µL เพอเรมตนปฏกรยา
และนาไปบมทอณหภม °C เปนเวลา 20 นาท นาสารละลายผสมปฏกรยาไปวดคาการดดกลน
แสงทความยาวคลน nm พรอมกบทาการทดลองชดควบคมโดยใชสารละลาย 50% DMSO
จานวน 20 µL แทนการใชสารละลายสารสกด
5. คานวณรอยละการยบยงเอนไซมไทโรซเนส (% inhibition) จากสตรตอไปน
% inhibition = {[(∆Ac - ∆AB) - (∆AS - ∆AB)] / (∆Ac - ∆AB)}× 100
เมอ ∆AC = ผลตางของคาการดดกลนแสงท 475 นาโนเมตร ทเวลา 10 นาท และ 0 นาท
ของการทดลองกลมควบคม (control)
เมอ ∆AB = ผลตางของคาการดดกลนแสงท 475 นาโนเมตร ทเวลา 10 นาท และ 0 นาท
ของการทดลองกลม Blank
∆AS = ผลตางของคาการดดกลนแสงท 475นาโนเมตร ทเวลา 10 นาท และ 0 ของการ
ทดลองกลมทใชสารสกด (Blank)
คา IC50 (concentration providing 50% inhibition) สามารถคานวณไดจากการวาดกราฟ
ของรอยละการยบยง (%inhibition) กบคาความเขมขนของสารสกดแลวสรางสมการความสมพนธ
เชงเสนเพอเทยบกลบเปนคาความเขมขนของสารสกดททาใหมการยบยงเอนไซมไทโรซเนสไดท
รอยละ 50
ตารางท 3.1 แสดงรายการและปรมาตรของสวนผสมในปฏกรยาการวดคาการยบยง
เอนไซมไทโรซเนส
ปฏกรยา
Phosphate
Buffer
pH 6.8
สาร
สกด
50%
DMSO
100 Unit/mL
Mushroom
tyrosinase
2.5 mM
L-DOPA
Total
volume
(µL) (µL) (µL) (µL) (µL) (µL)
C (control) 140 - 20 20 20 200
S (Sample) 140 20 - 20 20 200
B (Blank) 160 20 - 20 - 200
Final conc. - Various* 5% 10 U/Rx 0.25 mM
*สารสกดทาการแปรผนความเขมขนระดบตางๆ (0-1000 µM หรอ 0-1000 µg/mL)
20
การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร
สารฟลาโวนอยดบรสทธทแสดงฤทธยบยงเอนไซมไทโรซเนสไดสงจะถกคดเลอกมาศกษา
จลนศาสตรการยบยงเอนไซมโดยใชหลกของไลนวเวอร และเบรก (Lineweaver and Burk double-
reciprocal plot)(Lineweaver and Burk, 1934) ซงจะทาการวดอตราเรวเรมตนของปฏกรยา (V0)
ทมและไมมตวยบยง โดยแปรผนความเขนขนซบสเตรต L-DOPA ทความเขมขน , . , . ,
. และ . mM โดยทาการทดลองในลกษณะเดยวกบการวเคราะหฤทธของสารสกดตอการ
ยบยงเอนไซมไทโรซเนสทในจานหลมไมโคเพลทแตจะวดอตราเรวเรมตนของปฏกรยาซงจะตองอาน
คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 475 นาโนเมตรททกๆ 30 วนาท เปนเวลา 10 นาท และทาการ
วเคราะหผลดวยโปรแกรม GraphPad Prism software (version . ) เพอรายงานคาทาง
จลนศาสตรของเอนไซมและวเคราะหชนดของกลไกการยบยง
21
บทท 4
ผลการวจย
การศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยสารฟลาโวนอยดจากแกนคร
สารสกดบรสทธจานวน 4 ชนดไดแก Khrinone B ( ) Cajanin ( ) ( RS)- '-hydroxy- -
methyoxy vestitol ( ) และ ( aR, aR)- , -dihydroxy- -methoxy pterocarpan ( ) (ภาพท
. ) ทพบวามฤทธยบยงเอนไซมไทโรซเนสสง โดยมคา IC ตากวา 100 µM ไดถกนามาศกษา
จลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสโดยใชความสมพนธจากสมการของ Michaelis-Menten
และการวาดกราฟแบบ Lineweaver-Burk ซงแสดงถงชนดของการยบยง (type of inhibition) ของ
สารประกอบ , , และ ทงนในสภาวะทไมมตวยบยงเอนไซมคาอตราเรวสงสด (Vmax) ของ
การเกด dopachrome โดยเอนไซมนคอ . 5 ΔA /min โดยคานวนหาจากกราฟของ
Lineweaver-Burk ทพจารณาจดตดแกน Y และคา Km ตอ L-DOPA คอ . ± . µM โดย
คานวนหาจากกราฟของ Lineweaver-Burk ทพจารณาจดตดแกน X แสดงดงตารางท 4.1 และภาพ
ท 4.2
พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ Khrinone B ( ) ระบวาเปนการ
ยบยงชนด uncompetitive inhibitor ตอเอนไซมไทโรซเนส ตางๆ (ตารางท 4.2 และภาพท 4.3) โดย
มคาคงทการยบยง (Ki) เปน . ± . µM ซงลกษณะของการยบยงชนด uncompetitive inhibitor
ตวยบยงจะเขาจบกบ enzyme-substrate complex และลดอตรการเกดผลตภณฑ ทงน enzyme-
inhibitor-substrate complex (EIS) ยงคงเกดปฏกรยาผนกลบไดและยงสามารถเกดผลตภณฑได
จงเปนเหตใหคา Km และ Vmax ลดลง
พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ Cajanin ( ) เผยวาเปนการ
ยบยงชนด non-competitive inhibitor ตอเอนไซมไทโรซเนส (ตารางท 4.3 และภาพท 4.4) ซง
ลกษณะของการยบยงชนด non-competitive inhibitor ตวยบยงและซบสเตรตจะสามารถเขาจบกบ
เอนไซมไดตลอดเวลาโดยมตาแหนงจบคนละตาแหนงกน เมอทงตวยบยงและซบสเตรต เขาจบกบ
เอนไซมแลวจะเกดเปน enzyme-substrate-inhibitor complex (ESI) ทซงไมสามารถเกดเปน
ผลตภณฑตอไปได แตสามารถผนกลบไปเปน enzyme-substrate complex (ES) หรอ enzyme-
inhibitor complex (EI) ดงนนจงพบวาคา Vmax ลดลง โดยไมมผลตอคา Km คาคงทการยบยง (Ki)
ของการเขาจบระหวางตวยบยงกบเอนไซม และระหวางซบสเตรตกบเอนไซมจงเทากน และจากการ
ทดลองนมคาเปน . ± . µM
22
พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy
vestitol (21) แสดงใหเหนวาเปนการยบยงชนด mixed inhibition (ตารางท 4.4 และภาพท 4.5) ม
คาคงทการยบยง (Ki) เปน . ± . µM การยบยงแบบผสมนตวยบยงจะสามารถจบกบเอนไซม
ทตาแหนงเดยวกบซบสเตรต คา Km อาจคงทหรอมการเปลยนแปลงกไดแตคา Vmax ทสงเกตไดจะ
ลดลง
พฤตกรรมทางจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนสของ ( aR, aR)- , -dihydroxy- -
methoxy pterocarpan ( ) พบวาเปนการยบยงชนด competitive inhibition (ตารางท 4.5 และ
ภาพท 4.6) มคาคงทการยบยง (Ki) เปน . ± . µM กลไกการยบบงชนด competitive inhibition
ตวยบยงจะรบกวนการเขาจบของซบสเตรตบนตาแหนงจบของเอนไซม เปนเหตใหคา Km เพมสงขน
โดยไมผลกระทบตอคา Vmax
ภาพท 4.1 โครงสรางของสารฟลาโวนอยด 4 ชนดทนามาศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซม
ไทโรซเนสจากเหด
23
ตารางท 4.1 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) โดยไมมตวยบยง
Subsrate (L-Dopa)
(mM) ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)
0.0625 0.00429
0.125 0.00771
0.25 0.01203
0.5 0.01564
1 0.01903
ภาพท 4.2 (ก) กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยา (Michaelis-Menten saturation curve) ทเรง
ดวยเอนไซมไทโรซเนส แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (Vo) กบความเขมขนของ
ซบสเตรต [L-Dopa] โดยไมมการเตมตวยบยง (ข) Double reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอร
เบรก (Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน X คอ -1/Km และความชน
คอ Km/ Vmax
ก
ข
24
ตารางท 4.2 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง Khrinone B ( )
Subsrate (L-Dopa)
(mM)
ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)
ความเขมขนของตวยบยง Khrinone B ( )
0 µM 18.196 µM 27.21 µM 54.62 µM 109.24µM
0.0625 0.004440 0.004340001 0.004079999 0.003670 0.003400
0.1250 0.007400 0.007390 0.006610001 0.005760 0.005170
0.2500 0.012130 0.010490 0.010210 0.008339998 0.007220
0.5000 0.01648536 0.013890 0.013300 0.010990 0.009150
1.0000 0.02051593 0.017420 0.016490 0.012980 0.010470
ภาพท 4.3 (ก) กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยา (Michaelis-Menten saturation curve) ทเรง
ดวยเอนไซมไทโรซเนส แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (Vo) กบความเขมขนของ
ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง Khrinone B ( ) (ข) Double
reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax
จดตดแกน X คอ -1/Km และความชนคอ Km/ Vmax
ก
ข
25
ตารางท4.3 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง Cajanin (9)
Subsrate (L-Dopa)
(mM)
ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)
ความเขมขนของตวยบยง Cajanin (9)
0 µM 24.97 µM 37.44 µM 74.88 µM 149.77 µM
0.0625 0.00429 0.00306 0.00259 0.00201 0.0016
0.1250 0.00771 0.00430 0.00423 0.00333 0.0028
0.2500 0.01203 0.00820 0.00772 0.00640 0.00417
0.5000 0.01564 0.01085 0.00932 0.00719 0.00583
1.0000 0.01903 0.01441 0.01223 0.00930 0.00748
ภาพท 4.4 (ก) กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยา (Michaelis-Menten saturation curve) ทเรง
ดวยเอนไซมไทโรซเนส แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (Vo) กบความเขมขนของ
ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง Cajanin (9) (ข) Double reciprocal
plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน
X คอ -1/Km และความชนคอ Km/ Vmax
ก
ข
26
ตารางท 4.4 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21)
Subsrate (L-Dopa)
(mM)
ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)
ความเขมขนของตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy vestitol (21)
0 µM 25.26 µM 51.11 µM 102.20 µM 204.40 µM
0.0625 0.00429 0.002860 0.002460 0.002060 0.0017
0.1250 0.00771 0.004800 0.003910 0.003489 0.00312
0.2500 0.01203 0.008240 0.007570 0.006260 0.00521
0.5000 0.01564 0.012130 0.009160 0.008970 0.00741
1.0000 0.01903 0.014641 0.012690 0.011690 0.0099
ภาพท 4.5 (ก) กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยา (Michaelis-Menten saturation curve) ทเรง
ดวยเอนไซมไทโรซเนส แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (Vo) กบความเขมขนของ
ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง (3RS)-3'-hydroxy-8-methyoxy
vestitol (21) (ข) Double reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก (Lineweaver-Burk
equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน X คอ -1/Km และความชนคอ Km/ Vmax
ก
ข
27
ตารางท 4.5 แสดงอตราเรวเรมตนของปฏกรยาเอนไซมไทโรซเนสทมการแปรผนความเขมขนของ
สารตงตน (L-Dopa) และตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy pterocarpan (27)
Subsrate (L-Dopa)
(mM)
ความเรวเรมตน (Vo) (∆A475 / min)
ความเขมขนของตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-methoxy pterocarpan
(27)
0 µM 1.64 µM 3.28 µM 6.55 µM
0.0625 0.00521823 0.004218 0.003412 0.002774
0.1250 0.00844834 0.007110 0.005890 0.004934
0.2500 0.01124181 0.009700 0.008860 0.007430
0.5000 0.01622181 0.014300 0.012510 0.011170
1.0000 0.02068944 0.019100 0.019035 0.017230
ภาพท 4.6 (ก) กราฟแสดงจลนศาตรของปฏกรยา (Michaelis-Menten saturation curve) ทเรง
ดวยเอนไซมไทโรซเนส แสดงความสมพนธระหวางความเรวเรมตน (Vo) กบความเขมขนของ
ซบสเตรต [L-Dopa] ทมการแปรผนความเขมขนของตวยบยง (6aR,11aR)-3,8-dihydroxy-9-
methoxy pterocarpan (27) (ข) Double reciprocal plot ตามสมการไลนวเวอรเบรก
(Lineweaver-Burk equation) จดตดแกน Y คอ 1/ Vmax จดตดแกน X คอ -1/Km และความชนคอ
Km/ Vmax
ก
ข
28
บทท 5
สรปและอภปรายผลการวจย
จากตวอยางสารสกดฟลาโวนอยดบรสทธจานวน 11 ชนดทสกจากแกนคร พบวามสาร 4
ชนดทใหคา IC50 ตากวา 100 µM ซงไดแก Khrinone B ( ) Cajanin ( ) ( RS)- '-hydroxy- -
methyoxy vestitol ( ) และ ( aR, aR)- , -dihydroxy- -methoxy pterocarpan ( ) ซงได
นามาศกษาจลนศาสตรการยบยงเอนไซมไทโรซเนส เพอรายงานผลการวเคราะหชนดของการยบยง
และคาคงทการยบยง (Ki) ซงคา Ki จะแตกตางจากคา IC50 โดยทคา Ki จะมประโยชนในการบงบอก
ถงศกยภาพของความเปนตวยบยงของสารแตละชนด ในขณะทคา IC50 จะใชปรยบเทยบผลการ
ทดลองทกระทาในสภาวะเดยวกน เนองจากคา IC50 อาจแปรผนไปเมอเปลยนแปลงสภาวะการ
ทดลองบางอยางเชน ความเขมขนซบสเตรต ความเขมขนเอนไซม อณหภมและระยะเวลาการบม
ปฏกรยา นอกจากนงานวจยนยงไดทดลองใชกรดโคจกเปนชดการทดลองควบคมผลบวกซงไดผล
การวเคราะหทางจลนศาสตรการยบยงเปนการยบยงแบบผสม (mixed inhibition) มคา Ki เปน
7.5 ± 1.0 µM เมอเปรยบเทยบกบสารประกอบ ( aR, aR)- , -dxiihydroxy- -methoxy
pterocarpan ( ) ทมคา Ki เปน 6.4 ± 0.9 µM แสดงใหเหนวาสารประกอบ 27 มประสทธภาพการ
ยบยงเทยบเทากบกรดโคจก ในขณะทสารประกอบออกซเรสเวอราทรอลไดเคยมรานงานการวจย
กอนหนานวาใหผลการยบยงเปนชนด non-competitive ตอเอนไซมไทโรซเนส และมคา Ki เปน .
µM (Alam et al., 2009)
การศกษาตวยบยงของเอนไซม ทาใหทราบกลไกการออกฤทธของสารเคมตาง ๆ ตอระบบ
ชวภาพและยงเปนเครองมอทดในการศกษากลไกการทางานของเอนไซมในรายละเอยด การยบยง
ของสารฟลาโวนอยดแตละชนดทสกดแยกไดจากแกนครพบวา มการยบยงแบบแขงขน
(competitive) และ การยบยงแบบไมแขงขน (non-competitive และ uncompetitive) การยบยง
แบบแขงขนตวยบยงจะเขาจบบนโมเลกลของเอนไซมบรเวณเดยวกบสารตงตน ในขณะทการยบยง
แบบไมแขงขนตวยบยงจะเขาจบกนคนละบรเวณกบสารตงตน ซงการยบยงแบบไมแขงขนมกจะเปน
ความสามารถในการเปลยนโครงรปของเอนไซมหรอกระทบตอจลนศาสตรของเอนไซม
29
การยบยงแบบแขงขน (competitive inhibition) ทพบในกรณของ ( aR, aR)- , -
dihydroxy- -methoxy pterocarpan ( ) อาจสนนษฐานไดวาการยบยงลกษณะนตวยบยงมหม
ฟงกชนบางตาแหนงคลายกบซบสเตรต (S) จงสามารถแยงเขาจบกบบรเวณเรง (active site) บน
เอนไซมได การยบยงแบบแขงขนนสามารถผนกลบได (reversible) เพราะวาตวยบยงและสารตงตน
พยายามแขงขนแยงกนเขาจบกบบรเวณเรงของเอนไซม หากตวใดมความเขมขนมากกวา กจะเขา
จบไดดกวา และการยบยงแบบนเปนการยบยงแบบยอนกลบได โดยการกาจดตวยบยงออกไปจาก
สารละลาย หรอโดยการเพมความเขมขนของสารตงตน สารตงตนทมจานวนความเขมขนสงกวาจะ
เขาแยงจบทบรเวณเรง ทาใหตวยบยงหลดออกไปจากบรเวณเรง
การยบยงแบบไมแขงขนแบบ pure noncompetitive inhibition ทพบในกรณของ Cajanin
( ) เปนการยบยงโดยตวยบยงเขาจบททไมใชบรเวณเรง โดยเขาจบไดทงกบสารเชงซอนเอนไซม-
สารตงตน (ES complex) และเอนไซมอสระ (E) หรอกลาวอกอยางหนงวาตวยบยงชนดน สามารถ
เขาจบกบเอนไซมได โดยไมสนใจวามสารตงตนจบอยกบเอนไซมหรอไม นอกจากนตวยบยงแบบน
ไมรบกวนการจบของสารตงตนทบรเวณเรง แตจะทาใหโครงสรางของเอนไซมเปลยนไป ทาให
catalytic group ของเอนไซมไมสามารถทางานไดตามปกต จงเปลยนสารตงตนใหเปนผลตภณฑได
นอยลงหรอเปลยนไมไดเลย ในขณะท ( RS)- '-hydroxy- -methyoxy vestitol ( ) สามารถเขา
จบไดกบทงเอนไซมอสระ (E) หรอ ES complex ไดเชนเดยวกน แตเมอภายหลงจากทตวยบยงเขา
จบแลว มผลทาใหเกดการเปลยนแปลงของเอนไซมทาให affinity ของเอนไซมตอซบสเตรต
เปลยนแปลงไป ซงอาจจะทาใหสารเชงซอนเอนไซม-ตวยบยง (EI complex) จบกบซบสเตรตไดมาก
ขนหรอลดลงจากเดม ดงนนจงไดเรยกตวยบยงนใหมเปน mixed type inhibitor
การยบยงแบบไมแขงขนแบบท uncompetitive inhibition ทพบในกรณของ Khrinone B
( ) เปนการยบยงโดยตวยบยงเขาจบเฉพาะกบสารประกอบเชงซอนเอนไซม-สารตงตน (ES
complex) แตไมจบกบเอนไซมอสระ (E) ผลของการจบของตวยบยงทาใหเอนไซมเสยโครงรปไป ทา
ใหความสามารถในการเปลยนสารตงตนใหเปนผลตภณฑลดลงหรอหมดไป อยางไรกตาม เมอนาไป
วเคราะหตามสมการของไมเคลส-เมนเทน และเขยนกราฟตามสมการลายวฟเวอรเบอรก พบวาทง
คาคงทของไมเคลส (Km) และคาความเรวสงสด (Vmax) กลบลดลง
30
บรรณานกรม
สกญญา สนทรส และวเชยร รมพณชยกจ. (2553). ชวโมเลกล. พมพครงท 3. กรงเทพฯ :
สานกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย.
Alam, N., Shim, M. J., Lee, M. W., Shin, P. G., Yoo, Y. B., Lee, T. S., 2009. Vegetative
Growth and Phylogenetic Relationship of Commercially Cultivated Strains of Pleurotus
eryngii based on ITS sequence and RAPD. Mycobiology 37, 258-266.
Chen, Z. Y., Chan, P. T., Ho, K. Y., Fung, K. P., Wang, J., 1996. Antioxidant activity of
natural flavonoids is governed by number and location of their aromatic hydroxyl
groups. Chem Phys Lipids 79, 157-163.
Croft, K. D., 1998. The chemistry and biological effects of flavonoids and phenolic acids.
Ann N Y Acad Sci 854, 435-442.
Devasagayam, T. P., Tilak, J. C., Boloor, K. K., Sane, K. S., Ghaskadbi, S. S., Lele, R.
D., 2004. Free radicals and antioxidants in human health: current status and future
prospects. J Assoc Physicians India 52, 794-804.
Fernandez-Panchon, M. S., Villano, D., Troncoso, A. M., Garcia-Parrilla, M. C., 2008.
Antioxidant activity of phenolic compounds: from in vitro results to in vivo evidence.
Crit Rev Food Sci Nutr 48, 649-671.
Grotewold, E., 2006. The Science of Flavonoids. Springer, Ohio, USA.
Jeong, S. H., Ryu, Y. B., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Baek, Y. S., Kang, J. E., Lee,
W. S., Park, K. H., 2009. Tyrosinase inhibitory polyphenols from roots of Morus ihou.
J Agric Food Chem 57, 1195-1203.
Kim, H. P., Son, K. H., Chang, H. W., Kang, S. S., 2004. Anti-inflammatory plant
flavonoids and cellular action mechanisms. J Pharmacol Sci 96, 229-245.
Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Capua, I., Beneduce, L., Gallotta,
A., Pengo, P., Fassina, G., Miertus, S., De-Eknamkul, W., 2012. A screening assay
for neuraminidase inhibitors using neuraminidases N1 and N3 from a baculovirus
expression system. J Enzyme Inhib Med Chem 27, 5-11.
31
Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Capua, I., Beneduce, L., Gallotta,
A., Pengo, P., Fassina, G., Monthakantirat, O., Umehara, K., De-Eknamkul, W.,
Miertus, S., 2011. The quenching effect of flavonoids on 4-methylumbelliferone, a
potential pitfall in fluorimetric neuraminidase inhibition assays. J Biomol Screen 16,
755-764.
Lineweaver, H., Burk, D., 1934. The Determination of Enzyme Dissociation Constants.
Journal of the American Chemical Society 56, 658–666.
Miyazawa, M., Tamura, N., 2007. Inhibitory compound of tyrosinase activity from the
sprout of Polygonum hydropiper L. (Benitade). Biol Pharm Bull 30, 595-597.
Nerya, O., Vaya, J., Musa, R., Izrael, S., Ben-Arie, R., Tamir, S., 2003. Glabrene and
isoliquiritigenin as tyrosinase inhibitors from licorice roots. J Agric Food Chem 51,
1201-1207.
Nijveldt, R. J., van Nood, E., van Hoorn, D. E., Boelens, P. G., van Norren, K., van
Leeuwen, P. A., 2001. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and
potential applications. Am J Clin Nutr 74, 418-425.
Prochazkova, D., Bousova, I., Wilhelmova, N., 2011. Antioxidant and prooxidant
properties of flavonoids. Fitoterapia. 82, 513-523
Promden, W., Monthakantirat, O., Umehara, K., Noguchi, H., De-Eknamkul, W., 2014.
Structure and antioxidant activity relationships of isoflavonoids from Dalbergia
parviflora. Molecules 19, 2226-2237.
Rice-Evans, C. A., Miller, N. J., Paganga, G., 1996. Structure-antioxidant activity
relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 20, 933-956.
Ryu, Y. B., Ha, T. J., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Gal, S. W., Park, K. H., 2008.
Inhibitory effects on mushroom tyrosinase by flavones from the stem barks of Morus
ihou (S.) Koidz. J Enzyme Inhib Med Chem 23, 922-930.
Songsiang, U., Wanich, S., Pitchuanchom, S., Netsopa, S., Uanporn, K., Yenjai, C., 2009.
Bioactive constituents from the stems of Dalbergia parviflora. Fitoterapia 80, 427-431.
Tereschuk, M. L., Riera, M. V., Castro, G. R., Abdala, L. R., 1997. Antimicrobial activity of
flavonoids from leaves of Tagetes minuta. J Ethnopharmacol 56, 227-232.
32
Theos, A. C., Tenza, D., Martina, J. A., Hurbain, I., Peden, A. A., Sviderskaya, E. V.,
Stewart, A., Robinson, M. S., Bennett, D. C., Cutler, D. F., Bonifacino, J. S., Marks,
M. S., Raposo, G., 2005. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase
sorting from endosomes to melanosomes. Mol Biol Cell 16, 5356-5372.
Tsao, T. F., Newman, M. G., Kwok, Y. Y., Horikoshi, A. K., 1982. Effect of Chinese and
western antimicrobial agents on selected oral bacteria. J Dent Res 61, 1103-1106.
Yang, H. L., Chen, S. C., Senthil Kumar, K. J., Yu, K. N., Lee Chao, P. D., Tsai, S. Y.,
Hou, Y. C., Hseu, Y. C., 2012. Antioxidant and anti-inflammatory potential of
hesperetin metabolites obtained from hesperetin-administered rat serum: an ex vivo
approach. J Agric Food Chem 60, 522-532.
Yao, L. H., Jiang, Y. M., Shi, J., Tomas-Barberan, F. A., Datta, N., Singanusong, R.,
Chen, S. S., 2004. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods Hum Nutr
59, 113-122.
33
ภาคผนวก
34
ประวตนกวจย
1. นายวรวฒน พรมเดน (Worrawat Promden, Ph.D)
เลขหมายบตรประจาตวประชาชน 3311100069820
ตาแหนงปจจบน ผชวยศาสตราจารย
หนวยงานทสงกดและสถานทอยทตดตอไดสะดวก
สาขาวทยาศาสตรทวไป คณะครศาสตร มหาวทยาลยราชภฏบรรมย เลขท ถ.จระ
ต.ในเมอง อ.เมอง จ.บรรมย
หมายเลขโทรศพทเคลอนท 089-424-2324
ไปรษณยอเลกทรอนกส (e-mail) [email protected]
ประวตการศกษา
ปทจบการศกษา ชอสถานศกษา ไดรบปรญญา/สาขา
พ.ศ. 2547 จฬาลงกรณมหาวทยาลย วทยาศาสตรบณฑต (วท.บ) สาขาชวเคม
พ.ศ. 2550 มหาวทยาลยรามคาแหง ศลปศาสตรบณฑต (ศศ.บ) สาขาปรชญา
พ.ศ. 2551 จฬาลงกรณมหาวทยาลย วทยาศาสตรดษฎบณฑต (วท.ด) สาขาชวเคม
สาขาวชาการทมความชานาญพเศษ
อณชววทยาและพนธวศกรรมในแบคทเรย ผลตภณฑธรรมชาตและสารตานอนมลอสระ
ประสบการณทเกยวของกบการบรหารงานวจย
พ.ศ. 2553-2555 ผประสานงานหลก หนวยปฏบตงานวจยผลตภณฑธรรมชาตและ
เทคโนโลยชวภาพ คณะเภสชศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย
การเผยแพรผลงานวจย Publications (5 ปยอนหลง)
งานวจยตพมพในวารสารวชาการ
1. Worrawat Promden, Alisa S. Vangnai, Piamsook Pongsawasdi, Osao Adachi, Kazunobu
Matsushita & Hirohide Toyama. Disruption of quinoprotein ethanol dehydrogenase gene
35
and adjacent genes in Pseudomonas putida HK5. FEMS Microbiology Letters, 280 (2),
203-209, March 2008.
2. Worrawat Promden, Alisa S. Vangnai, Hirohide Toyama, Kazunobu Matsushita, and
Piamsook Pongsawasdi. Analysis of promoter activities of the genes encoding three
quinoprotein alcohol dehydrogenases of Pseudomonas putida HK5. Microbiology, 155,
594-603, February 2009.
3. Fuminori Fukaya, Worrawat Promden, Takashi Hibino, Yoshito Tanaka, Tatsunosuke
Nakamura, and Teruhiro Takabe. An Mrp-like cluster in the halotolerant cyanobacterium
Aphanothece halophytica functions as a Na+/H+ antiporter. Applied and Environmental
Microbiology, 75, 6626-6629, October 2009.
4. Nana Yamada, Worrawat Promden, Koji Yamane, Hideto Tamagake, Takashi Hibino,
Yoshito Tanaka, and Teruhiro Takabe. Preferential accumulation of betaine uncoupled to
choline monooxygenase in young leaves of Sugar beet -Importance of long distance
translocation of betaine under normal and salt-stressed conditions. Journal of Plant
Physiology, 116(18), 2058-2070, December 2009.
5. Alisa S. Vangnai, Worawat Promden, Wanchai De-Eknamkul, Kazunobu Matsushita,
and Hirohide Toyama. Molecular characterization and heterologous expression of quinate
dehydrogenase gene from Gluconobacter oxydans IFO3244. Biochemistry (Moscow),
75(4), 452-459, May 2010.
6. Kanteera Soontharapirakkul, Worrawat Promden, Nana Yamada, Hakuto Kageyama,
Aran Incharoensakdi, Atsuko Iwamoto-Kihara, and Teruhiro Takabe. Halotolerant
cyanobacterium Aphanothece halophytica contains a Na+-dependent F1F0-ATP synthase
with potential role in salt tolerance. Journal of Biological Chemistry, 286(12), 10169–
10176, March, 2011.
36
7. Nana Yamada, Suriyan Cha-Um, Hakuto Kageyama, Worrawat Promden, Yoshito
Tanaka, Chalermpol Kirdmanee and Teruhiro Takabe. Isolation and characterization of
proline/betaine transporter gene from oil palm. Tree Physiology 31, 462–468, April, 2011.
8. Pithi Chanvorachote, Sudjit Luanpitpong, Preedakorn Chunhacha, Worrawat Promden,
Virote Sriuranpong, Expression of CA125 and cisplatin susceptibility of pleural effusion-
derived human lung cancer cells from a Thai patient. Oncology Letters, 252-256, May,
2012.
9. Worrawat Promden, Orawan Monthakantirat, Kaoru Umehara, Hiroshi Noguchi and
Wanchai De-Eknamkul. Structure and Antioxidant Activity Relationships of Isoflavonoids
from Dalbergia parviflora. Molecules, 19, pp. 2226-2237. February, 2014.
10. Siriluk Sintupachee, Worrawat Promden, Nattaya Ngamrojanavanich, Worapan
Sitthithaworn,Wanchai De-Eknamkul. Functional expression of a putative geraniol 8-
hydroxylase by reconstitution of bacterially expressed plant CYP76F45 and
NADPHcytochrome P450 reductase CPR I from Croton stellatopilosus Ohba.
Phytochemistry, 118, pp. 204–215. October,2015.
บทความวชาการ
วรวฒน พรหมเดน. (2556). ชวเคมของเอนไซมแอลกอฮอลดไฮโดรจเนสในแบคทเรย. วารสาร
วจย มข., 18(6), หนา 1003-1020.
ประวตการไดรบทน
1. พ.ศ. 2548-2550 : ทน โครงการปรญญาเอกกาญจนาภเษก รนท 8 สานกงานกองทนสนบสนน
การวจย (สกว.)
2. พ.ศ. 2551-2552 : ทนนกวจย สถาบนวจยมหาวทยาลยเมโจ (Meijo University) เมองนาโกยา
ประเทศญป น
37
3. พ.ศ. 2553-2554 : ทนนกวจยหลงปรญญากองทนเอกรชดาภเษกสมโภช บณฑตวทยาลย
จฬาลงกรณมหาวทยาลย
4. พ.ศ. 2557: ทนสนบสนนโครงการวจย ประจาปงบประมาณ 2557 โดยสานกบรหารโครงการ
สงเสรมการวจยในอดมศกษาและพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต
5. พ.ศ. 2558: ทนสนบสนนโครงการวจย ประจาปงบประมาณ 2558 โดยสานกบรหารโครงการ
สงเสรมการวจยในอดมศกษาและพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต
6. พ.ศ. 2559: ทนสนบสนนโครงการวจย ประจาปงบประมาณ 2559 โดยสานกบรหารโครงการ
สงเสรมการวจยในอดมศกษาและพฒนามหาวทยาลยวจยแหงชาต
38
. นายเทพพร โลมารกษ (Tepporn Lomarak, Ph.D)
เลขหมายบตรประจาตวประชาชน
ตาแหนงปจจบน อาจารย (พนกงานมหาวทยาลย)
หนวยงานทสงกด สาขาวทยาศาสตรทวไป คณะครศาสตร มหาวทยาลยราชภฏบรรมย
เลขท ถ.จระ ต.ในเมอง อ.เมอง จ.บรรมย
สถานทอยทตดตอไดสะดวก สาขาวทยาศาสตรทวไป คณะครศาสตร มหาวทยาลยราช
ภฏบรรมย เลขท ถ.จระ ต.ในเมอง อ.เมอง จ.บรรมย
หมายเลขโทรศพทเคลอนท
ไปรษณยอเลกทรอนกส (e-mail) [email protected]
ประวตการศกษา
การศกษา ระดบการศกษา สถานศกษา
การศกษาดษฎบณฑต (วทยาศาสตรศกษา) มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ
ประกาศนยบตรบณฑต สาขาวชาชพคร มหาวทยาลยขอนแกน
วทยาศาสตรบณฑต สาขาเคม มหาวทยาลยอบลราชธาน
สาขาวชาการทมความชานาญพเศษ (แตกตางจากวฒการศกษา) : การวจยทางดานการสอน
วทยาศาสตรการใชสอออนไลนสาหรบการสอนวทยาศาสตร และการนเทศนกศกษาฝกประสบกาณ
วชาชพคร
ผลงานวจย:
. Enhancing High School Students' Conceptual Understanding of Chemical Bonding by
Using Learning Units Incorporated with Information Processing Theory
. A Development of High School Chemical Bonding Learning Units Incorporated with
Information Processing Theory
39
ปรญญาการศกษาดษฎบณฑต (วทยาศาสตรศกษา)
ประธานกรรมการทปรกษา: ผชวยศาสตราจารย ดร. จนดา แตมบรรจง
กรรมการทปรกษา: รองศาสตราจารย ดร. สมสรร วงษอยนอย
ดร. ปรชาญ เดชศร
แหลงตพมพ: วารสารศรนครนทรวโรฒวจยและพฒนา (สาขามนษยศาสตรและสงคมศาสตร)
มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ ปท ฉบบท มกราคม-มถนายน พ.ศ.
Alam, N., Shi m, M. J., Lee, M. W., Shin, P . G., Yo o, Y. B., Lee, T. S., 2009. Vegetative Growth and Phylogenetic Relatio nshi p o f Com mercially Cultivated Strains o f Pleur otus eryngii ba sed o n ITS seq uen ce and RAPD. My cobi ology 37, 258-2 66. Chen, Z. Y., Cha n, P. T., Ho , K. Y., Fung, K. P., Wang, J., 1996. A ntioxi dant activity of natural flavonoi ds is govern ed by num ber and lo cation of their aromatic hydroxyl group s. Chem P hys Lipi ds 79, 1 57-163. Croft, K. D ., 1998 . The che mistry and biol ogical effe cts o f flavo noid s and phenolic aci ds. An n N Y Acad Sci 854, 435-4 42. Devasagayam, T. P., Tilak, J. C., B oloor, K. K., Sane, K. S., Ghaskadbi, S. S., Lele, R. D., 20 04. Free radical s and anti oxidants in h uma n health: curre nt status and future pros pects. J Ass oc P hysicians India 5 2, 794-80 4. Fernandez -Panchon, M. S., Villano, D., Tronco so, A. M., Gar cia-Parrilla, M. C ., 2008. Antioxi dant activity of phen olic c om pou nd s: fro m in vitro res ults to in vivo eviden ce. Crit Rev Fo od Sci Nutr 48, 649 -671. Grotewold, E., 2 006. T he Scien ce o f Flavonoi ds. Springer, Ohi o, USA. Jeong, S. H., Ryu, Y. B., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Baek, Y. S., Kang, J. E., Lee, W. S., Park, K. H., 200 9. Tyrosinase inhi bitory polyphenols fro m root s of M orus ihou. J Agric Food C hem 57, 11 95-1203. Kim, H. P. , Son, K. H., Cha ng, H. W., Kang, S. S., 2004 . Anti-in flammatory plant flavonoi ds an d cellular action mechanisms. J Pharmacol Sci 96, 229-245. Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Ca pua, I., Benedu ce, L., Gallotta, A., Pengo, P., Fassina, G., Miertus, S., De-Eknamkul, W., 2 012. A screening assay for neuraminidas e inhibit ors usi ng neura minida ses N 1 and N 3 fro m a ba culoviru s expressio n system. J Enzyme I nhi b Med Che m 27, 5-1 1. Kongkamnerd, J., Milani, A., Cattoli, G., Terregino, C., Ca pua, I., Benedu ce, L., Gallotta, A., Pengo, P., Fassina, G., Mo nthakantirat, O., U mehara, K ., De-Eknamkul, W., Miertus, S., 2 011. Th e que nc hing effect of flavon oids o n 4-methylum bellifero ne, a p otential pitfall in fl uori metric neuramini dase inhibition assays. J Biom ol Scree n 16, 75 5-7 64. Lineweaver, H., Burk, D., 19 34. The Deter mination o f Enzyme Diss ociation Co nstants. Jour nal o f the Ameri can C hemi cal Society 56, 658–666. Miyazawa, M., Tamura, N., 2007 . Inhi bitory co mp ound o f tyrosinase a ctivity from the s prout o f Polyg onu m hydropi per L. (Benita de). Biol P harm B ull 30, 59 5-5 97. Nerya, O., Vaya, J., Musa, R., I zrael, S., Ben -Arie, R. , Tamir, S., 200 3. Glabre ne and isoliquiritigeni n as tyrosinase inhibitor s fro m licorice roots. J Agric Food Chem 51, 1201-1207. Nijveldt, R. J., van No od, E., van Hoorn, D. E., B oelens, P. G., van N orren, K., van Leeuwen, P . A., 2001. Flavon oids: a review of probable me chani sms of action an d potential applications. Am J Clin Nutr 74, 418 -425. Proc hazkova, D., Bous ova, I., Wilhelmova, N., 201 1. Antioxi dant an d prooxidant prop erties of flavon oids. Fitoterapia. Prom den, W., Mo nthakantirat, O., U mehara, K ., Nog uchi, H., De-Eknamkul, W., 20 14. Structure a nd antio xida nt activity relationships of isoflavo noid s from Dalbergia parviflor a. Molecules 1 9, 222 6-2 237. Rice-Evans, C. A., Miller, N. J., Paganga, G., 1996. Struct ure-a ntioxi dant activity relationship s of flavon oids and p henoli c acids. Free Ra dic Bi ol Med 20, 933 -956. Ryu, Y. B., Ha , T. J., Curtis-Long, M. J., Ryu, H. W., Gal, S. W., Park, K . H., 200 8. Inhi bitory effects on mushroom tyrosinas e by flavo nes fr om th e stem barks of Morus ihou (S.) Koidz. J Enzyme Inhi b Med C he m 23, 922-9 30. Songsiang, U., Wani ch, S., Pitc huan ch om , S., Netso pa, S., Uan porn, K., Yenjai, C., 200 9. Bioa ctive co nstituents from the stems of Dalbergia parviflora. Fitoterapia 80, 427 -431. Teresch uk, M. L., Riera, M. V., Castro, G. R., Ab dala, L. R., 199 7. Antimi crobial activity of flavon oids fr om leave s of T agetes mi nuta. J Ethnopharmacol 56, 22 7-2 32. Theos, A. C ., Tenza, D ., Martina, J. A., Hurbain, I., Pede n, A. A., Sviderskaya, E. V., Stewart, A., Robins on, M. S., B ennett, D. C., Cutler, D. F., Boni faci no, J. S., Marks, M. S., Ra pos o, G., 20 05. Fun ction s of a daptor pr otein (A P)-3 and AP -1 in tyrosinase s orting from endos om es to melanoso mes. Mol Biol C ell 16, 5356-5372. Tsao, T. F., New man, M. G ., Kwok, Y. Y., H orikoshi, A. K. , 1982. Effect o f Chi nese a nd western a ntimicr obial agents on sele cted oral bacteria. J Dent Re s 61, 1103-1106. Yang, H. L., Chen, S. C., Senthil K umar, K . J., Yu, K. N., Lee Chao, P. D., Tsai, S. Y., Hou, Y. C., Hseu, Y. C., 20 12. Antio xidant and anti-i nfla mmatory p otential o f hes peretin m etabolites obtained fro m hes peretin -ad ministere d rat serum : an ex vivo ap proa ch. J Agric Foo d Che m 60, 522 -532. Yao, L. H., J iang, Y. M., Shi, J ., To mas -Bar beran, F. A., Datta, N., Singan usong, R., Che n, S. S., 2004. Flavon oids i n fo od an d their health bene fits. Plant Fo ods Hum Nutr 59, 113-1 22.