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基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项课题(No. 2011ZX08003)收稿日期：2014-06-09 接受日期：2014-08-19

抗亚洲玉米螟、抗草甘膦转基因玉米的培育

孙越 1 刘秀霞 1 李丽莉 2 官赟赟 1 张举仁 1*

1山东大学生命科学学院，济南 250100；2山东省农业科学院植物保护研究所，济南 250100

*通讯作者，[email protected]

摘要 5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, epsps)是一个高抗草甘膦的基因，苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫蛋白基因(Bt基因)cry1AcM是一个能在单子叶植物中高效表达的抗亚洲玉米螟基因。为了获得具有抗虫、抗除草剂优良复合性状的转基因玉

米，本研究构建出质粒 pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1AcM-Tnos，通过农杆菌(Agrobacteriumtumefacien)介导的玉米(Zea mays)茎尖遗传转化法将目标基因转入玉米。通过分子检测、草甘膦抗性筛选和田间接种亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis (Guenée))试验筛选出转基因株系，在此基础上进行了转基因植株室内抗亚洲玉米螟试验和田间草甘膦抗性分析，并采用RT-PCR检测和Western blot方法确定了抗虫蛋白在转基因植株中稳定表达。从大量转基因株系中优选出6个遗传稳定且抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦的转基因玉米株系，这些株系的抗亚洲玉米螟、抗草甘膦特性完全满足大田应用的需求。综上所述，将改造后

的Bt抗虫基因cry1AcM和抗草甘膦基因epsps一同转入玉米，赋予两种玉米骨干自交系植株抗玉米螟、抗草甘膦特性，为我国抗亚洲玉米螟抗草甘膦转基因玉米的大面积推广培育出了优良自交系。

关键词 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因(epsps)，Bt cry1AcM基因，转基因玉米，抗亚洲玉米螟，抗草甘膦，稳定遗传

Breeding of Transgenic Maize with Resistance to the Asian Corn Borer(Ostrinia furnacalis) and Tolerance to GlyphosateSUN Yue1 LIU Xiu-Xia1 LI Li-Li2 GUAN Yun-Yun1 ZHANG Ju-Ren1*

1 School of Life Science, Shandong University, Jinan 250100, China; 2 Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural

Sciences, Jinan 250100, China

*Corressponding author, [email protected]

Abstract 5- enolpyruvyl- shikimate- 3- phosphate synthase ( epsps) is a new gene of high resistance toglyphosate and Bt cry1AcM as an insect-resistent gene can expresse at high level in monocotyledon. In order tobreed transgenic maize with stacking traits of insect-resistance and glyphosate-tolerance, the plant expressionvector pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1AcM-Tnos was constructed and then introduced into maize(Zea mays) inbred lines by Agrobacterium mediated shoot apical meristem transformation. After herbicidescreening, survived plants were confirmed by PCR, and the expression of cry1AcM gene in plants was detectedby RT- PCR and Western blot, respectively. The resistance of transgenic plants to Asian corn borer( Ostriniafurnacalis (Guenée)), was examined by indoor and field experiments. And the tolerance of transgenic plants toglyphosate was evaluated by the field trials. The analysis of transgenic maize resistances demonstrated that theplants were highly resistant to herbicide and the Asian corn borer. We obtained 6 transgenic maize lines withgenetic stability, highly Asiatic corn borer-resistance and glyphosate-tolerance, which achieved the criterion of

Online system: http://www.jabiotech.org农业生物技术学报

Journal of Agricultural Biotechnology2015, 23(1): 52~60

DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.01.006

虫害是制约我国玉米高产的重要因素，其中以

亚洲玉米螟分布最广，危害最重 (王振营等,2000)。杂草不仅与玉米植株争夺良好的生长环境，还增加了生产成本和病虫害传播机会，严重影

响玉米的产量和品质。传统防治措施主要是依靠

化学手段，但长期使用农药不仅增加了生产成本，

而且还污染环境。因此，培育抗虫、抗除草剂玉米

新品种对我国农业发展具有重要意义。利用基因

工程手段将杀虫、抗除草剂基因导入玉米，用于减

轻虫害和草害造成的危害，不失为一种理想有效的

途径。自1996年转基因玉米在美国商品化种植以来，其推广面积逐年增加，为社会带来巨大的环境

和经济效益，同时也推动了作物改良技术的迅速发

展。国外许多种业公司都开展了玉米转基因研

究。国外目前种植的转基因玉米基本上都是抗虫

和抗除草剂品种( Koziel et al., 1993; Sardana et al.,1996; Jansens et al., 1997; Howe1 et al., 2002; Hecket al., 2005)。在作物抗虫基因工程中应用的杀虫基因主要是修饰的来自苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)的杀虫蛋白基因(简称Bt基因)。首次将Bt基因转入烟草和番茄的成功实例发表于1987年 (Barton, Whiteley, 1987; Fischhoff et al., 1987;Vaeck et al., 1987) 。多年来人们在Bt基因的修饰与改造 (Michael et al., 1995; Fischhoff, Perlak,1996; Perlak et al., 1991; Perlak et al., 1990)、表达载体的构建(Cheng et al., 1998)、转化技术的应用(黄璐, 卫志明, 1999; 关淑艳等, 2005; McBride et al.,1995)、抗虫植物的培育等方面作了大量工作(王继磊等, 2010)，同时在转基因抗虫植物的研发方面也取得很大进展，获得了一系列转Bt基因作物，如棉花、水稻、玉米等，且抗虫谱也在不断扩大，不再局

限于鳞翅目和鞘翅目昆虫 (Lise Jouanin et al.,1998)。抗除草剂一直是转基因作物的主导性状，而抗除草剂作物中 50%以上是抗草甘膦的品种。目前生产上普遍应用的抗草甘膦基因是孟山都公

司从根癌农杆菌CP4(Agrobacterium sp.CP4)中克隆出的CP4-epsps基因(Barry et al., 1992)，该基因已被广泛应用于转基因大豆、玉米、棉花和油菜等植物

的商业化生产。近年来随着抗虫抗除草剂复合性

状转基因玉米的应用，各类复合性状转基因玉米成

为市场主导。我国转基因抗虫玉米的研究工作以

对鳞翅目昆虫具有毒杀活性的基因为主，如

cry1Ab，cry1Ah，cry1Ie和 cry1Ac等(刘允军, 2004; 岳润清, 2011; 李圣彦, 2012; 杨召军, 2012; 王延锋,2010)。且以单一的抗虫性状为主，抗虫抗除草剂复合性状的转基因玉米较少。从转基因玉米市场

竞争力出发，获得具有优良复合性状并能稳定遗传

的玉米品种在目前尤为重要。

本研究所用的Bt基因 cry1AcM是根据Cry1Ac蛋白不同区域的活性分析，按照单子叶植物的编码

特征对 cry1Ac基因进行了密码子优化及基因编码框长度的改造，使其能在单子叶植物中高效表达

(赖锦盛, 2009)。5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因 (5- enolpyruvyl- shikimate- 3- phosphate syn-thase, epsps)是一个结构新颖，功能明确并高抗草甘膦的新基因，从草甘膦极度污染的土壤中分离的可

变盐单胞菌(Halomonas Variabilis)中克隆获得，该菌对草甘膦的耐受浓度高达 900 mmol/L(刘柱,2004)。本研究通过农杆菌介导法，将 cry1AcM和epsps基因同时转入玉米骨干自交系郑 58和昌 7-2中，得到转基因株系，并逐代进行除草剂筛选、分子

检测及抗虫性鉴定，从中筛选到抗虫抗除草剂效果

好且遗传稳定的玉米新种质，为抗虫抗除草剂转基

因玉米的培育创制了必要材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 转基因受体材料及亚洲玉米螟

转基因受体材料为玉米(Zea mays)骨干自交系郑

actual application. Among them lines Z1~Z3 came from elite inbred line Zheng58, and lines C1~C3 camefrom elite inbred line Chang7- 2. In summary, the introduction of cry1AcM and epsps genes into maize eliteinbred lines endued the Asiatic corn borer- resistance and glyphosate- tolerance of transgenic plants, whichcreated new corn transgenic lines with excellent complex traits. It is very useful for large-scale planting of theinsect-resistance and glyphosate-tolerance transgenic maize in China.Keywords 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene ( epsps), Bt cry1AcM gene, Transgenic maize,Asiatic corn borer-resistance, Glyphosate- tolerance, Genetic stablity


Breeding of Transgenic Maize with Resistance to the Asian Corn Borer (Ostrinia furnacalis) and Tolerance to Glyphosate 53

农业生物技术学报

Journal of Agricultural Biotechnology

58和昌7-2，亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis(Guenée))幼虫由山东农业科学院植物保护研究所提供。

1.1.2 菌株和质粒载体

农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌株

LBA4404携带Mini-Ti质粒 pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1AcM-Tnos。该质粒的 T-DNA区含有修饰的抗虫基因 cry1AcM(由中国农业大学赖锦盛教授提供)，位于玉米泛素启动子(Pubi)和Tnos终止子之间；来自可变盐单胞菌(Halomonasvariabilis)的 epsps基因由中国农业科学院生物技术所林敏研究员提供，该基因位于花椰菜花叶病毒

35S RNA的启动子(CaMV35S promoter)和Tnos终止子之间，该质粒由本课题组构建(图 1)。质粒构建过程如下：根据 epsps基因序列设计末端增加SpeⅠ酶切位点的 PCR引物，扩增出 epsps基因，质粒pCAMBIA1302用SpeⅠ酶切产生载体片段，重组得到pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos。再用NheⅠ和XbaⅠ双酶切重组载体，大片段自连后用HindⅢ酶切，产生载体片段，再将末端加有HindⅢ酶切位点的 Pubi 片段与载体片段连接 (pCAMBIA1300-P35S::als- Tnos- Pubi::MCS- Tnos)，得到 pCAM-BIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::MCS-Tnos。根据cry1AcM基因序列设计末端增加 SacⅠ酶切位点的PCR引物，扩增出 cry1AcM基因，用SacⅠ酶切载体pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::MCS-Tnos,然后将 cry1AcM基因插入到植物表达载体中。通过限制性内切酶鉴定，目的基因插入正确的质粒用

于农杆菌转化。

1.2 实验方法

1.2.1 转化植株的获得

采用农杆菌菌株LBA4404介导的玉米茎尖遗传转化法转化玉米骨干自交系郑 58和昌 7-2。玉米遗传转化方法如下：以玉米种子萌发产生的无菌

小苗为材料，剥去芽鞘或子叶及幼叶，裸露出茎尖

为转化受体。携带转化质粒的根瘤农杆菌

LBA4404在含有抗生素的YEP培养基震荡培养生长至对数期，收集菌液，用含100 mg/L乙酰丁香酮的MS培养液调整菌液浓度为OD6000.4，将裸露的无菌苗茎尖放入农杆菌菌液中在 0.5 MPa下浸泡10 min；用灭菌滤纸吸去茎尖的多余菌液后，将植株插入到固体培养基中，黑暗条件下培养(22 ℃)2~4 d，然后在光照下培养(22~25 ℃)2~3 d。将转化后的小苗移栽到花盆中，覆盖蛭石，浇灌营养液，待植

株长出3~4片新叶后喷洒选择剂草甘膦，筛选出抗性植株。

转化小苗经草甘膦筛选后移栽抗性植株，通

过自交结实获得T1代。对T1代植株进行草甘膦抗

性和PCR检测，对阳性植株套袋自交，获得转基因株系。

1.2.2 epsps和 cry1AcM基因的PCR检测

采用CTAB法提取玉米基因组DNA。PCR扩增转基因 epsps和 cry1AcM，扩增片段长度分别为981和518 bp。epsps和 cry1AcM基因的特异引物序列分别为：

P35S-F：5'-TGACGCACAATCCCACTATCC-3'；epsps-R：5'-CTTCGCGCTCATTCTCTAA T-3'。sBT1-F：5'-CCCTGTTCCCTAACTACGAC-3'；sBT1-R：5'-GTTCTGTGGTGGAATCTCG-3'。

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5 µL，Mg2+

(25 mmol/L)1.5 µL，上下游引物 (10 μmol/L)各 0.5μL，dNTP(10 mmol/L each) 0.5 μL，Taq DNA聚合酶 (5 U/μL) 0.125 μL，DNA 模板 1 μL，SterileddH2O 18.375 µL，共计 25 μL。PCR程序为 95 ℃5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环35次；72℃ 7 min。

1.2.3 epsps和 cry1AcM基因的RT-PCR检测

图1 质粒pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1AcM-Tnos的T-DNA区

Figure 1 T-DNA region of plasmid pCAMBIA1302-P35S::epsps-Tnos-Pubi::cry1AcM-TnosTnos：农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子；epsps：5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因；P35S：花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子；cry1AcM：改造的Bt基因；Pubi：玉米泛素启动子Tnos: The terminator of nopaline synthase gene from Agrobacterium; epsps: 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase gene;P35S: the 35S RNA promoter from Cauliflower mosaic virus; cry1AcM: Modified Bt gene; Pubi: Maize polyubiquitin-1 promoter

54

用Trizol试剂提取玉米叶片总RNA。使用反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit，购自Ta-kara公司)将RNA反转录成 cDNA。以稀释 10倍的 cDNA为模板进行 PCR扩增。玉米内源基因Actin和外源基因 epsps、cry1AcM的半定量引物序列分别为：

Actin-F：5'-ATCACCATTGGGTCAGAAAGG-3'；Actin-R：5'-GTGCTGAGAGAAGCCAAAATAGAG-3'。RT-cry1AcMF：5'-CATCAGGGCTCCAA TGTTCTC-3'；RT-cry1AcMR：5'-GGATGGGCACCTCGATGTAAC-3'。RT-epspF：5'-GGAGTGGAGCATACGGTTGTC-3'；RT-epspR：5'-GGCTACATTGGCACAG TCATC-3'。

RT-PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5 μL，Mg2 +(25 mmol/L)2.0 μL，上下游引物 (10 μmol/L)各 0.5 μL，dNTP(10 mmol/L each)0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.125 μL，cDNA模板 1 μL，SterileddH2O补足 25 μL。RT-PCR程序为 95 ℃ 5 min；95℃ 20 s，54℃ 20 s，72℃ 20 s，35个循环；72 ℃5 min。

1.2.4 Western blot检测转基因植株Bt蛋白的表达

将提取的植物蛋白进行SDS-PAGE分离(10%分离胶，5%浓缩胶)，然后通过半干法进行蛋白转膜，再与抗体结合(一抗 1∶500，二抗 1∶30 000)，最后用NBT-BCIP法显色。Bt(cry1Ac)多克隆抗体购自美国Abraxis公司。Bt(cry1Ac)标准蛋白购自美国Envirologix公司。

1.2.5 除草剂筛选

待转基因植株长至三叶期，喷洒1.05 kg/hm2的草

甘膦溶液(用有效成分 41%的农达配制)，均匀喷洒至植株叶片布满水珠为宜。半月后将除草剂抗性

植株移栽到大田。

1.2.6 转基因植株草甘膦抗性的田间测定

将转基因玉米种子播于大田，待植株长到5~6叶期进行草甘膦喷洒试验，以转基因受体自交系的

同龄植株为对照。喷洒0.84 kg/hm2(草甘膦商业应用或田间标准剂量)的草甘膦溶液，10 d后统计玉米植株受害情况。

1.2.7 转基因植株的田间抗亚洲玉米螟鉴定

将转基因玉米种于大田，每株系重复3次。当植株生长到6~8片叶时，将亚洲玉米螟初孵幼虫接于玉米心叶中，每株接虫30~40头。接虫后保持田

间高湿度，两周后调查食叶级别。同时种植转基因

受体自交系为对照。抗虫性标准采用国际玉米螟

协作组制定的 9级分级标准，逐株调查食叶级别，以各株值的平均值作为供鉴定品系的食叶级别，并

根据评价标准确定其抗螟性级别(何康来,王振营,2000)。1~3级：虫孔针刺状；4~6级：虫孔火柴头大小；7~9级：虫孔大于火柴头。抗性级别分类: 1.00~2.09级(高抗)，2.10~ 4.09级(抗虫)，4.10~6.09级(中抗)，6.10~8.09级(感虫)，8.1~9.0级(高感)。1.2.8 转基因玉米室内抗虫性鉴定

将转基因玉米种于塑料盆中，每盆种 10~12粒。待玉米植株长至 4~5叶时接虫。每株接初孵玉米螟幼虫 20头，同时种植转基因受体自交系作对照。置于光照培养室中饲养。一周后统计玉米

心叶的虫害级别。抗虫性判断标准同上。

转基因玉米苞叶和籽粒的抗虫性鉴定：在玉米

灌浆期去田间取材，分别用苞叶、籽粒饲喂玉米螟，

选取非转基因玉米为对照。将待测的苞叶及籽粒

分别置于 24孔板中，每处理接初孵玉米螟幼虫 15头，每个株系3次重复。每天检查玉米螟存活和取食情况，并根据取食量等及时更换来源相同的组

织，喂食两周期间统计玉米螟死亡率。

2 结果与分析

2.1 转基因玉米植株的分子鉴定

2.1.1 PCR检测

对除草剂筛选后存活的植株进行 epsps和cry1AcM基因的PCR检测(图2)，并将PCR检测阳性的植株移栽到大田进行人工自交授粉。经过 4代自交、逐代检测，部分株系的转基因达到纯合。

2.1.2 RT-PCR和Western blot检测

为了分析 cry1AcM和 epsps基因在转基因植株中的转录情况和Bt蛋白的表达水平，分别采用RT-PCR和Western blot对转基因植株进行检测，结果如图 3所示。在以郑 58为受体的 3个转基因株系(Z1~Z3)和以昌 7- 2 为受体的 3 个转基因株系(C1~C3)中，cry1AcM 和 epsps 基因转录正常 (图3A)。Western blot显示阳性对照(cry1Ac标准蛋白)和转基因植株都有目的条带，而未转化植株和空白

则无目的带(图3B)。这表明，cry1AcM基因在玉米中成功表达，cry1Ac标准蛋白大小约为60 kD。





2.2 转基因玉米植株的除草剂抗性筛选及田间鉴定

用除草剂水溶液喷洒筛选转基因植株，未转化

的对照植株喷洒草甘膦溶液 7~10 d后出现枯萎坏死。转化植株在喷洒除草剂后，一些个体变化同对

照植株相似，另一些个体则持续生长，变化不明显，

如图 4A。对T0~T4代玉米逐代进行除草剂抗性筛

选，直至转基因株系纯合为止。对田间6叶期玉米植株喷洒草甘膦10 d后，未转化植株的叶片变黄干枯，植株整体萎蔫，逐渐死亡，而转基因植株仍能正

常生长，没有表现出明显的受害症状(图4B)。

2.3 转基因玉米的抗虫性鉴定

通过对田间及室内玉米螟接虫试验结果分析，

转 cry1AcM基因玉米植株对玉米螟具有明显的抗性。在田间测试中大多数高抗植株仅在接虫的叶

片上有少量小孔，未出现进一步危害的迹象，这表

明玉米螟幼虫在最初取食时即死亡或逃离。而在

感虫植株上，虫孔大且密，叶片被咬食严重，甚至茎

秆也被咬断，与抗虫植株形成鲜明的对比(图 5A)。在室内人工大量接虫且严格控制实验条件一致的

情况下，对照植株的叶片已被咬成网状，或被蚕食

的难以挺立(图 5B)，呈干枯卷曲状(图 5C)，而转基因植株未受害。在室内喂食转基因玉米籽粒和苞

叶的实验中，转基因植株饲喂的玉米螟死亡率显著

高于未转基因的，存活的幼虫体重、体长明显小于

取食未转基因玉米的幼虫。在饲喂期间，随着时间

延长，饲喂转基因植株的玉米螟死亡率上升快，而

喂食非转基因玉米的玉米螟死亡率上升较缓(图6)。通过对转基因玉米的田间及室内玉米螟抗性测定，选育出6个对玉米螟具有显著抗性的转基因株系(Z1~Z3，C1~C3)(表 1)。这些转基因株系分别来自不同的独立转化体，与非转基因对照自交系相

比，抗虫性差异达到极显著水平。

3 讨论

大量的研究表明，Bt基因经修饰改造后其抗虫效果显著提高，与其他抗虫基因相比，在同等表达

量之下，Bt类基因产物的抗虫能力最强(Schuler etal., 1998)。cry1AcM基因是以对鳞翅目昆虫有很强的毒性的 cry1Ac基因为基础进行改造，使该基因能够在玉米中高效表达(赖锦盛, 2009)。同时，本研究选用玉米高效启动子启动该基因，提高了外源基

因在植株体内的表达水平，获得了在田间和室内对

亚洲玉米螟抗性鉴定中均表现优异的抗虫株系。

图3 T4代转基因玉米植株的RT-PCR和Western blot检测Figure 3 RT- PCR and Western blotting detection of T4

generation transgenic plantsA：转基因植株RT-PCR检测结果；B：转基因植株 cry1Ac蛋白Western blot检测结果。-：空白对照；CK1：郑 58对照植株；CK2：昌7-2对照植株；Z1~Z3：郑58转基因植株；C1~C3：昌7-2转基因植株；CK：对照植株；M：蛋白markerA: RT-PCR detection of transgenic plants; B: Western blottingdetection of transgenic plants. - : Blank control; CK1, CK2:Non- transgenic plants; Z1~Z3, C1~C3: Transgenic plants;CK：Non-transgenic plants；M：Protein marker

- Z1 Z1 Z3 CK1 C1 C2 C3 CK2

- CK Z1 Z2 Z3 C1 C2 C3 M +

Actin

cry1AcM

epsps A

B70kD

A

- CK1CK2 1 2 3 4 5 6 + M 7 8

20001000750500250

bp

图2 部分T4代转基因玉米植株的PCR检测Figure 2 PCR detection of T4 generation transgenic plantsA：crylAcM基因扩增结果；B：epsps基因扩增结果。-：空白对照；CK1和CK2：未转基因植株；1~9：转基因植株；M：DL2000DNA marker；+：阳性对照A: The amplification results of crylAcM gene; B:The amplification results of epsps gene. - : Blank control; CK1 and CK2: Non-transgenic plants; 1~9: Transgenic plants; M:DL2000 DNA marker; +: Positive control

1 2 3 4 5 + M 6 7 8 9 CK1 CK2

B

20001000750500250

bp

56

本研究为了确定转 cry1Ac基因玉米中Bt杀虫蛋白能否有效地控制亚洲玉米螟对果穗及籽粒的危害，

取灌浆期玉米籽粒和苞叶分别饲喂亚洲玉米螟，喂

食转基因玉米籽粒或苞叶的亚洲玉米螟死亡率显

著高于对照组，即转基因玉米能有效减轻亚洲玉米

螟对玉米果穗及籽粒的危害，能在不使用杀虫剂的

条件下明显改善玉米品质。大田试验也支持该结

论。在抗虫性鉴定试验中发现，本研究的不同转基

因玉米株系在抗虫性上有明显差异，这可能是由于

不同株系中杀虫蛋白表达量不同。从RT-PCR法对转基因 cry1AcM表达半定量的检测结果中也可发现，各株系的表达量有明显差异。

抗草甘膦基因作为目的基因和筛选标记基因

都得到了广泛应用。在国内外许多报道中，抗除草

剂基因被作为选择标记基因 (Howe1 et al., 2002;Zhou et al., 1995; Hu et al., 2003)，从而有效提高转基因植株获得的效率。由于新的草甘膦抗性基因的

发掘难度很大，已有草甘膦抗性基因的突变或优化

受到关注，相应的转基因植物也层出不穷(Heck etal., 2005; Castle et al., 2004; 赫福霞, 2008; 余桂容等, 2010;余桂容等, 2013)。迄今为止，成功用于商业化的抗草甘膦转基因作物的基因主要是CP4-epsps基因。本研究中所用的epsps基因是一个我国拥有自主知识产权的抗草甘膦基因，其与相关的美国专利所涉

及的22种微生物EPSP合酶的相似性在46%以下。本研究选用P35S启动子来提高其表达。通过系列浓度比较试验，确定了在玉米三叶期喷洒1.05 kg/hm2

的草甘膦是筛选转基因植株的较为理想的剂量，在此

浓度下转基因植株表现出明显高于未转基因自交系

的草甘膦抗性。在田间除草剂抗性试验中，本研究在

玉米六叶期喷洒0.84 kg/hm2的草甘膦溶液，转基因

株系也表现出了很好的抗性，达到实际生产中的应用

水平。

近年来各类复合性状转基因玉米种植面积逐

年攀升，2013年复合性状转基因玉米种植比例已超过转基因玉米种植面积的7成，说明复合性状转基因玉米在市场中已占据主导地位。目前国外已商

品化的复合型玉米品种多数是通过杂交方式获得，

如MON802、MON88017、DAS-06275-8、CBH-351等。该方法虽简便易行，但由于基因不连锁，后代

中容易发生性状分离，加大了纯合体筛选难度。相

比之下，多基因共转化法比较容易获得稳定的后

代，不同目的基因之间一般完全连锁，筛选简单，而


Breeding of Transgenic Maize with Resistance to the Asian Corn Borer (Ostrinia furnacalis) and Tolerance to Glyphosate

A B

C

图5 转基因玉米植株抗虫性鉴定

Figure 5 Evaluation of transgenic plants resistant to theAsian corn borerA：转基因玉米植株田间抗虫性鉴定；B：室内接虫实验效果；C：室内接虫实验单株放大；左：对照植株；右：转基因高抗植株A: Field evaluation of transgenic plants resistant to the Asiancorn borer; B: Evaluation of transgenic plants resistant to theAsian corn borer indoor; C: Partial enlarged details; Left: Non-transgenic control; Right: Transgenic plants with insect resistance

1 2 3 4

A

B

图4 转基因玉米植株的除草剂抗性测定

Figure 4 Herbicide resistance test of transgenic plantsA：除草剂筛选结果。1和 2：转基因抗性株系；3：转基因不抗株系；4：非转基因对照；B：草甘膦田间抗性实验鉴定。左：转基因植株；右：不抗的对照株系

A: Herbicide tolerance test of transgenic plants. 1 and 2: Trans-genic plants with herbicide tolerance; 3: Transgenic plantswith non- herbicide- tolerance; 4: The non- transgenic control;B: Field herbicide tolerance test of transgenic plants. Left:Transgenic plants with herbicide tolerance; Right: The non-transgenic control

57



且可以利用不同启动子和顺式元件的组合，灵活调

控各个目的基因的表达。近几年，国内在复合性状

玉米的研究上也多采用这种聚合方法，袁英等

(2006)、郝福霞(2008)、杨召军等(2012)均利用基因枪法将多基因载体导入玉米愈伤组织中，获得了抗

虫、抗除草剂转基因玉米。本研究采用农杆菌介导

的遗传转化法将 cry1AcM和 epsps基因一同导入玉米骨干自交系郑58和昌7-2，获得了具有抗亚洲玉米螟、抗除草剂草甘膦性状的优良转基因玉米。

4 结论

本研究筛选出了以两种骨干自交系为背景的复

合性状(抗亚洲玉米螟、抗草甘膦)转基因玉米。转

基因玉米的抗虫性完全满足田间应用的需求，转基

因玉米抗除草剂草甘膦特性也达到应用水平，创制

出了具有很好应用前景的转基因性状叠加玉米自交

系。这种叠加性状使转基因玉米杂交种在生产上更

具竞争力，具有很好的应用价值和发展前景。

参考文献

关淑艳,张健华,柴晓杰,等 . 2005. 花粉管通道法将淀粉分

支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究[J].玉

米科学, 13(4): 13-15.(Guan S Y, Zhang J H, Chai X J, et

al. 2005. Research on transforming expression vector of

starch branch enzyme gene to maize inbred lines by us-

ing pollen tube pathway[J]. Journal of Maize Sciences,

CK1

CK2

Z1Z2Z3

C1C2C3

3 7 12

**

**

**

***

****

** **

**

**

**********

死亡率

/%M

orta

lity

20

40

60

80

100

0

t/d B

CK1

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Z1Z2Z3

C1C2C3

t/d3 7 12

**

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死亡率

/%M

orta

lity

A

20

40

60

80

100

0

图6 转基因玉米苞叶和籽粒饲喂玉米螟试验

Figure 6 Bioassays of transgenic corn kernels and husks to the Asian corn borerA：饲喂玉米籽粒的玉米螟死亡率；B：饲喂玉米苞叶的玉米螟死亡率。CK1：郑58对照植株；CK2：昌7-2对照植株；Z1~Z3：郑58转基因植株；C1~C3：昌7-2转基因植株；*和**分别表示与对照相比差异显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)；下同A: The mortality of Asian corn borer fed with transgenic maize kernels; B: The mortality of Asian corn borer fed with transgenicmaize husks. CK1: Z58，non-transgenic control; CK2: C72，non-transgenic control; Z1~Z3: cry1AcM transgenic plants derivedfrom inbred line Z58; C1~C3: cry1AcM transgenic plants derived from inbred line C72；* and ** indicate significant difference(P＜0.05) and extremely significant difference(P＜0.01) compared with CK1 and CK2, respectively; The same below

株系号

Line No.

Z1Z2Z3CK1C1C2C3CK2

食叶级别

Leaf-feeding scale1.13±0.35**1.50±0.82**1.31±0.85**6.12±1.201.50±0.84**1.18±0.40**1.91±0.83**6.33±0.98

抗虫级别

Resistant grade高抗HR高抗HR高抗HR感S高抗HR高抗HR高抗HR感S

食叶级别

Leaf-feeding scale1.88±0.99**2.07±0.80**1.50±0.76**7.07±1.101.60±0.84**2.08±0.90**1.93±0.92**6.77±1.09

抗虫级别

Resistant grade高抗HR高抗HR高抗HR感S高抗HR高抗HR高抗HR感S

田间Field 室内 Indoor

表1 转Bt基因玉米田间及室内抗虫性鉴定结果Table 1 Evaluation of transgenic maize resistance to the Asian corn borer in field and indoor conditions

表内数据为各株系植株的食叶级别的平均值±标准差；田间：n=30，室内：n=10Values are the means ± SD of plants from each transgenic line; HR: High resistance; S: Susceptibility; Field: n=30, Indoor: n=10

58

13(4): 13-15.)赫福霞 . 2008.抗虫耐草甘膦多价转基因玉米的研究[D].博

士学位论文, 东北农业大学,导师:黄大昉 . pp.49-50.(Hao F X. 2008. Research on the insect-resistant/glypho-sate- tolerant mutiple gene transformation in maize[D].Dissertation for Ph.D., Northeast Agricultural University,Supervisor: Huang D F. pp.49-50.)

黄璐,卫志明 . 1999.农杆菌介导的玉米遗传转化[J].实验生物学报, 32(4): 381-387.(Huang L, Wei Z M. 1999. Agro⁃bacterium tumefaciens mediated maize transformation[J].Acta Biologiae Experimentalis Sinica, 32(4): 381-387.)

何康来，王振营 . 2000.玉米抗螟性鉴定方法与评价标准[J].沈阳农业大学学报, 31(5): 439-443.(He K L, Wang Z Y.2000. Methodologies and criterions for evaluating maizeresistance to Asian maize borer[J]. Journal of ShenyangAgricultural University, 31(5): 439-443.)

赖锦盛,董永彬,宋伟彬,等 . 2009.人工合成用于转基因抗虫植物的Bt杀虫基因 . 中国, 200910082840.6[P]. (LaiJ S, Dong Y B, Song W B, et al. 2009. Artificial synthe-sized Bt insecticidal gene for transgenic anti- insectplants. China, 200910082840.6[P]. )

李圣彦, 郎志宏, 朱莉, 等 . 2012. 利用密码子优化提高 BtcrylAh基因在转基因玉米 (Zea mays L.)中的表达[J].中国农业科技导报, 13(6): 20-26. (Li S Y, Lang Z H, ZhuL, et al. 2012. Improvement of Bt crylAh gene expressionin transgenic maize (Zea mays L.) through codon optimi-zation[J]. China Agricultural Science and Technology, 13(6): 20-26.)

刘允军 . 2004.人工改造的 cryl Ac, crylIe基因在大肠杆菌、转基因烟草和玉米中的表达[D].博士学位论文,中国农业大学,导师:王国英 . pp.54-71.(Liu Y J. 2004. Expres-sion of the modified cryIAc, cryIAe genes in E.coli trans-gepic tobacco plants and transgenic maize plants[D]. Dis-sertation for Ph.D., China Agricultural University, Super-visor: Wang Y G. pp.54-71.)

刘柱 . 2004. 可变盐单胞菌中草甘膦抗性EPSP合酶新基因克隆,大肠杆菌表达及其抗性机制的研究[D].博士学位论文, 四川大学, 导师: 杨志荣 . pp.19- 72.(Liu Z.2004. Cloning a nove1 5- enolpyruvylshikimate- 3-phos-phate synthase gene conferring increased glyphosate tol-erance from Halomonas variabilis and its expression inEscherichia coli and its glyphosate- tolerant mechanism[D]. Dissertation for Ph.D., Sichuan University, Supervi-sor: Yang Z R. pp.19-72.)

王振营，鲁新，何康来，等 . 2000.中国亚洲玉米螟的研究历史、现状和展望[J]．沈阳农业大学学报, 31(5) : 402-412．(Wang Z Y, Lu X, He K L, et al.. 2000. Review of

history, present situation and prospect of the Asian maizeborer research in China[J]. Journal of Shenyang Agricul-tural University, 31(5) : 402-412.)

王延锋 . 2010. 转Bt基因抗虫玉米田间试验与遗传稳定性分析[D].博士学位论文,东北农业大学,导师:赵奎军 .pp.43-62.(Wang Y F. 2010. Field trials and genetic stabil-ity analysis of insect- resistant transgenic Bt maize[D].Dissertation for Ph.D., Northeast Agricultural University,Supervisor: Zhao K J. pp.43-62.)

王继磊，刘迪秋,丁元明,等 . 2010. Bt转基因抗虫植物研究进展[J]. 生物学杂志, 27(4):75-78.(Wang J L, Liu D Q,Ding Y M, et al. 2010. Research advances in Bt transgen-ic anti-insect plants[J]. Journal of biology, 27(4): 75-78.)

杨召军,郎志宏,张杰,等 . 2012. 转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究[J]. 中国农业科技导报, 14(4): 39-45. (Yang Z J, Lang Z H, Zhang J, et al., 2012. Studieson insect- resistant transgenic maize (Zea mays L. ) har-boring Bt cry1Ah and cry1Ie genes[J]. China AgriculturalScience and Technology, 14(4): 39-45.)

余桂容,杜文平,宋军,等 . 2010.通过玉米茎尖转化耐草甘膦基因 2mG2-epsps及抗性鉴定[J]. 西南农业学报, 23(005): 1403-1408. (Yu G R, Du W P, Song J, et al. 2010.Transformation of tolerant- gyphosate 2mG2- epsps geneby maize shoot tip and identification of resistance[J].Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 23(005): 1403-1408.)

余桂容,刘艳, 杜文平,等 . 2013.农杆菌介导的转双价基因耐草甘膦玉米研究[J].分子植物育种, 11(3): 339-344.(Yu G R, Liu Y, Du W P, et al. 2013. Studies on the Agro⁃bacterium mediaed transformation of the bivalent geneconferring glyphosate tolerance into maize lines. Molecu-lar Plant Breeding, 11(3): 339-344.)

袁英,李启云,孔祥梅,等 . 2006. 转双价抗虫基因Bt-pta玉米植株的获得[J].中国农学通报, 22(10): 131-134. (Yu-an Y, Li Q Y, Kong X M. 2006. Synchronous expressionof pta and Cry1A(a) gene in maize[J]. Chinese Agricultur-al Science Bulletin, 22(10): 131-134.)

岳润清, 李新海, 翁建峰, 等 . 2011. 编码杀虫蛋白基因Cry1Ab-Ma其表达载体及应用: 中国, CN102094030A[P].(Yue R Q, Li X H, Weng J F, et al., 2011. Pesticidalprotein encoding gene Cry1Ab-Ma and expression vectorand application thereof. China, CN102094030A[P].)

Barton KA, Whiteley H, Yang N S. 1987. Yang, Bacillusthuringiensis-endotoxin expressed in transgenic nicotianatabacum provides resistance to lepidopteran insects[J].Plant Physiology, 85(4): 1103-1109.)

Barry G, Kishore G, Padgette S. et al. 1992. Inhibitors of ami-





no acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosatetolerance to crop plants[J]. Amino Acids, 7: 139-145.)

Castle L A, Siehl D L, Gorton R, et al. 2004. Discovery anddirected evolution of a glyphosate tolerance gene[J]. Sci-ence, 304(5674): 1151-1154.)

Cheng X, Sardana R, Kaplan H, et al. 1998. Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) andcryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer andyellow stem borer[J]. Proceedings of the National Acade-my of Sciences of the USA, 95: 2767-2772.

Fischhoff D A, Bowdish K S, Perlak F J. 1987. Insect toleranttransgenic tomato plants[J]. Nature Biotechnology, 5(8):807-813.

Fischhoff DA, Perlak F J. 1996. Synthetic plant genes. US,No. 5500365[P]. 1996-03-19.

Howe1 A R, Gasser C S, Brown S M, et al. 2002. Glyphosateas a selective agent for the production of fertile transgen-ic maize (Zea mays L.) plants[J]. Molecular Breeding,10: 153-164.

Hu T, Metz S, Chay C, et al. 2003. Agrobacterium- mediatedlarge scale transformation of wheat (Triticum aestivumL.) using glyphosate selection[J]. Plant Cell Reports, 21:1010-1019.

Jansens S., et al. 1997. Transgenic corn expressing a Cry9Cinsecticidal protein from Bacillus thuringiensis protectedfrom European corn borer damage[J]. Crop Science, 37(5): 1616-1624.

Jouanin L, Bonade´-Bottino M, Girard C.et al., 1998.Transgen-ic plants for insect resistance[J]. Plant Science, 131: 1-11.

Heck G R, Armstrong C L, Astwood J D, et al. 2005. Develop-ment and characterization of a CP4 EPSPS- based,glyphosate- tolerant corn event[J]. Crop Science, 45(1):329-339.

Krattiger A F. 1997. Insect resistance in crops: A case study ofBacillus thuringiensis (Bt) and its transfer to developingcountries[J]. ISAAA Briefs No. 2. ISAAA: Ithaca, NY.pp. 42.

Koziel M. G, Beland G L, Bowman G, et al. 1993. Field per-formance of elite transgenic maize plants expressing aninsecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis[J]. Nature Biotechnology, 11(2): 194-200.

McBride K E, Svab Z, Schaaf D J, et al. 1995. Amplificationof a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an ex-traordinary level of an insecticidal protein in tobacco[J].Bio/technology, 13: 362-365.

Michael J A, Thomas A R, Donald J M, et al. 1995. Syntheticinsecticidal crystal protein gene. US, No. 5380831[P].

Perlak F J, Deaton R W, Armstrong T A, et al. 1990. Insect re-sistant cotton plants[J]. Bio/Technology, 8: 939-943.

Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A, et al. 1991. Modification ofthe coding sequence enhances plant expressing of insectcontrol protein genes[J]. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA, 88: 3324-3328.

Sardana R, Dukiandjiev S, Giband M, et al. 1996. Construc-tion and rapid testing of synthetic and modified toxingene sequences CryIA (b&c) by expression in maize en-dosperm culture[J]. Plant Cell Reports, 15(9): 677-681.

Schuler T H, Poppy G M, Kerry B R, et al. 1998. Insect-resis-tant transgenic plants[J]. Trends in Biotechnology, 16(4):168-175.

Vaeck M, Reynaerts A, Höfte H, et al. 1987. Transgenicplants protected from insect attack[J]. Nature, 328: 33-37.

Zhou H, Arrowsmith J W, Fromm M E, et al. 1995. Glypho-sate-tolerant cp4 and gox genes as a selectable marker inwheat transformation[J]. Plant Cell Reports, 15: 159-163.

(责任编辑王雅兰)

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