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Ringvorlesung BFluoreszenz und Anwendung in Molekularer Biotechnologie
Ruprecht-Karls-Universität HeidelbergInstitut für Pharmazie and Molekular Biotechnologie
Abteilung: Chemie - Nachwuchsgruppe Chemische Biologie AK Wombacher
• Technologien zur Proteinmarkierung• Fluoreszenzmikroskopie• Mikroskopietechniken
Inhalt:
R.Y. Tsien Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509
Fluoreszenzmikroskopie mit Fluoreszierenden Proteinen
Nobelpreis 2008:Osamu ShimomuraMartin ChalfieRoger Tsien
N.C. Shaner, G.H. Patterson, M.W. Davidson. J. Cell Sci. 2007, 120, 4247G.H. Patterson, R.N. Day, D. Piston. J. Cell Sci. 2001, 114, 837
Farbspektrum der Fluoreszenzeproteine
Farbspektrum der Fluoreszenzeproteine
Nachteile der FPs:• Groesse• Oligomerization• Breite Emissions Spektren• Geringe Anzahl von Photonen
N.C. Shaner, G.H. Patterson, M.W. Davidson. J. Cell Sci. 2007, 120, 4247G.H. Patterson, R.N. Day, D. Piston. J. Cell Sci. 2001, 114, 837
Chemical Tags – SNAP-tag
• O-6-Alkylguanin-alkyltransferase (AGT)• Aufgabe: DNA Defekte an Guanosin reparieren • Überträgt dabei Alkylrest auf ein Cystein Rest im aktiven Zentrum • Mutante des WT akzeptiert auch andere Substrate
Keppler, A. et al. (2004) PNAS, 101, 9955-9959
1) Grow cells/Transfectw/plasmid DNA
2) Incubate w/ligand-dyeconjugate, wash cells
3) Fluorescent microscopic imaging
FPOI-
eDHFR
B C DAMLCK Protein Nukleus (NLS) Zellmembran MRLC Protein Mitochondrien
E
Proteinmarkierung unter Verwendung von E.coli Dihydrofolatreduktase
L. W. Miller, Y. Cai, M.P. Sheetz, V.W. Cornish. Nat. Methods 2005, 2, 255
1. Generation: Methotrexat 2. Generation: Trimethoprim
Griffin, Tsien (1998) Science 281:269 Specific Covalent Labeling of Recombinant Protein Molecules Inside Live Cells
Chemical Tags – FlAsH-tagFluorescein Arsenical Helix binder, bis-EDT adduct FlAsH-EDT
ReAsH(„rote variante“)
2
Nachteile: unspezifisches Binden an Cysteine
Fluoreszenzmikroskopie
Charge-coupled device (Nobelpreis Physik 2009)
• Auflichtfluoreszenzmikroskopie(Epifluoreszenzmikroskopie)
• Durchlichtmikroskopie
Fluoreszenzmikroskopie – konfokale Fluoreszenzmikroskopie CLSM (confocal laser scanning microscopie)
Probe muss rasterartig „Punkt für Punkt“„abgescannt“ werden – benötigt Zeit
Pinhole ist konfokal zum Fokuspunkt
Hohe Lichtintensität
Fokuspunkt ist konfokal zum Pinhole
Z-scan-movie z
Konfokales Prinzip:
Lichtquelle:
Detektor:
Vorteile:
Nachteile:
Vergleich der Fluoreszenzmikroskopieverfahren
TIRF Mikroskopie – Total internal reflection microscopy
Prism TIRF: Objektiv TIRF:
Axelrod D., Total internal reflection fluorescence at biological surfaces, in Noninvasive techniques in cell biology, Wiley-Liss, New York, New York (1990).Steyer J. and Almers, W., Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells, Nature: 388, 474 (1997).
FRAP- Fluorescence recovery after photobleaching
Methode aus der Mikrobiologie und Biophysik, die zur Messung derDiffusionsgeschwindigkeiten in Zellen und dünnen Flüssigkeitsfilmen dient. Sie kann z. B. zum Nachweis der Fluidität von Biomembranen verwendet werden