FISH GENETICSAND

BREEDING SCIENCE

水産育種ISSN 1343-7917

Volume 47　Number 2March 2018

水産育種研究会The Japanese Society of Fish Genetics and Breeding Science

Vol.47 No.2, March 2018　　

水産育種

FISH GENETICS AND BREEDING SCIENCE

平成30年 3月30日

水 産 育 種 研 究 会

水　産　育　種第47巻 2号

目　　次

追悼鈴木 亮 先生のご逝去を悼む　……………………………………………………………………………………………………………… 荒井克俊 …… 75

報文神流川における陸封アユの起源と遺伝的多様性　………………………………………………………………………………… 西塔正孝・新井肇・山口光太郎 …… 77ゼブラフィッシュと在来コイ科魚類の種間雑種出現の可能性の検討（英文）　………………………………………………………………… 荒木和男・正岡哲治・岡本裕之・名古屋博之 …… 83

会員通信第 2回ブリ類ワークショップ参加報告　………………………………………………………………………………………………… 尾崎照遵・野田勉 …… 91

水産育種研究会会則 ………………………………………………………………………………………………… 95水産育種投稿要領 …………………………………………………………………………………………………… 96

75

　鈴木亮先生は、愛知学芸大学を卒業後、名古屋大学の山本時男門下となり、多様な魚種間での種間交雑実験を行うとともに、タナゴ類を用いた受精生理の研究により理学博士の学位を得ました。水産研究所に職を得てからは、サケ科魚類の交雑育種、コイの選抜育種など産業研究を進展されるとともに、水産育種の拠点となる養殖研究所遺伝育種部の開設と整備に力を注がれました。そして、平成元（1989）年 9月に養殖研究所遺伝育種部長を退職後、同年10月に広島大学生物生産学部の教授に就任され、平成 6（1994）年 3月まで勤務されました。鈴木先生は、本「水産育種研究会」の萌芽となる「水産育種に関する研究協議会（昭和50（1975）年）」の立ち上げメンバーでもあり、平成 3－ 4年の間は本会の会長（代表幹事）を務められ、本会の発展に尽力されました。　私が広島大に採用されたのが平成元年11月で、広島（瀬戸内海）では性転換をする魚を材料としたいと思い描いていましたが、学部のある東広島市西条は海から遠く離れており、海産魚を飼育する環境にはありませんでした。そんな中で実験材料に「ドジョウ」を強く勧められたのは、すでに赴任先におられた鈴木先生でした。ドジョウの研究材料としての優秀性や利点はロシアの A. A. Neyfakh らの論文を読んでいたので理解していましたが、繁殖はもちろん、飼育の経験もありませんでした。早速、弟子入りして、ホルモン注射による人為催熟、ガラス板を使った人工受精、ワムシとミジンコによる仔稚魚育成技術を伝授していただき、卒業研究のみならず学部生の学生実験（水産増殖学実験）の材料にも利用しました。染色体標本の作製と観察を行う課題のとき、黒板に「ドジョウ二倍体の染色体数 2n=50」と板書すると、「自分の標本では100本の染色体が見えるが、標本作製が悪くてちぎれてしまったのか？」という

追 悼

鈴 木 亮 先生の

ご逝去を悼む

平成28年ご自宅にて

76

質問が受講学生より相次ぎました。顕微鏡をのぞいてみると、これらのドジョウは確かに100本の染色体をもっていました。これが自然四倍体ドジョウとの出会いで、それから現在までドジョウを主材料とした自然倍数体・クローン研究に付き合うことになりました。　ドジョウ研究へと導いてくださった大恩人が鈴木亮先生でしたが、平成30（2018）年 3月 2日11：50に、急性心不全により、旅立たれてしまいました。訃報に接したのは 3月中旬となり、すでに葬儀はご遺族によりすまされておりました。広島時代より周囲への気遣いが細やかな先生でしたので、この旅立ちはいかにも鈴木先生らしく思われます。遺影は平成28（2016）年10月27日に増養殖研究所の名古屋博之さん、正岡哲治さんとご自宅を訪ねた時のものです。この時は、お得意の釣りの話と昔話で大いに盛り上がり、楽しい時間を過ごすことができました。　心よりご冥福をお祈り申し上げます。

（北海道大学大学院水産科学研究科　荒井克俊）

77Fish Genetics and Breeding Science

－ 報　文 －

神流川における陸封アユの起源と遺伝的多様性

西塔正孝（女子栄養大）・新井肇（群馬水試）・山口光太郎（埼玉水研）

Origin and Genetic Variability of a Landlocked Kanna River Ayu(Plecoglossus altivelis altivelis) Population

Masataka SAITO1, Hajime ARAI2 and Kohtaroh YAMAGUCHI3

1 Laboratory of Food Science and Technology, Kagawa Nutrition University2 Gunma Prefectural Fisheries Experiment Station3 Saitama Fisheries Research Institute

AbstractTo elucidate the origin of a fi sh population and promote the development of sustainable fi sheries, we investigated

the genetic relationships, variability, and bottlenecks based on 12 microsatellites in a landlocked Kanna River ayu (Plecoglossus altivelis altivelis) population. The results of this study suggested that the origin of this population was a stocked Lake Biwa landlocked ayu population. In addition, stocking and artifi cial propagation showed genetic infl uence on this population. It is important to study whether the landlocked Kanna River ayu population has a genetic infl uence on a natural ayu population. Moreover, it is necessary to study the resources and genetic variability of other species in areas such as the Kanna River that is inhabited by a transplanted population.

In this study, we identifi ed a recent genetic bottleneck in the landlocked Kanna River ayu population. Therefore, we should pay attention to the fl uctuations in the amount of resources in the Kanna River landlocked ayu population.

(accepted December 15, 2017)

連絡先：〒347-0011　埼玉県加須市北小浜1060-1　埼玉県水産研究所　山口光太郎　　　　Tel: 0480-61-0458　　Fax: 0480-63-1012　　Email: yamaguchi.kotaro@pref.saitama.lg.jp

アユ Plecoglossus altivelis altivelis は、内水面漁業において重要魚種として知られ、遊漁の対象として人気が高い1）。一般的に、アユは、年魚で秋に産卵して仔魚は孵化後直ちに海に降り、冬を越した後に、春先に稚魚となって川を遡上するという両側回遊型の生活史をとる2）。一方、琵琶湖産アユ（以下「湖産アユ」または「湖産」とする）は、両側回遊型アユ（以下「海産アユ」または「海産」とする）が陸封されたものである3）。湖産アユは、内水面漁業関係者や遊漁者の間で放流効果と釣果についての評価が大変高く、長年にわたって全国の河川に放流が行われ4）、1999年ごろまで放流種苗の主体であった5）。また、従来アユが生息

しなかったダム湖などに放流され、その後自然繁殖するようになった事例も知られている6）。例えば、湖産アユが移植または放流されて定着した事例は、本栖湖（山梨県）や耶馬渓湖（大分県）などがある7）。6月になると各地の河川で、多くの遊漁者が解禁されたアユの友釣りを楽しむ。また、アユは、食用魚としても好まれ、塩焼きなどで食される。群馬県多野郡には、神流川が流れる（Fig. 1）。この地域の神流川に生息するアユは、1968年に完成した下久保ダムによって生じた神流湖に陸封されたものであるとされる7）。神流湖に陸封された神流川のアユ（以下「神流川のアユ」とする）は、美味しいと評判で、

水産育種47（2018）

78

流域の漁業協同組合や行政などは地域ブランド化を目指している。地域ブランド化を目指すにあたっては、消費者に対して食材の由来を詳細に説明できるようにしておく必要がある。神流川のアユは、1992年に実施されたアイソザイムによる調査の結果、放流された湖産アユに由来すると報告されている7）。しかし、この報告の後、神流川においても放流の主体は、他地域と同様に湖産アユから主に海産アユを基にした人工産アユにかわっている。このため、あらためてその由来について調査を行う必要がある。また、神流川のアユは、遊漁の対象などで活用されており、持続的な漁業生産をあげるために遺伝学的保全対策の検討が必要である。そこで、本研究では、12マイクロサテライト DNA マーカー座を使用し、神流湖のアユの由来や遺伝学的保全対策について検討を行った。

材料と方法供試魚　神流川のアユは、2015年の放流が行われ

る前である2015年 3月12日と 4月 9日にサビキ釣りと電気ショッカー（有限会社 フロンティアエレクトリック社製 FISH SHOCKER ⅢS）で25個体（平均体長5.8 cm、標準偏差±0.54 cm）を採捕した。また、神流川のアユは、湖産アユが起源とされている7）。このため、2016年に琵琶湖で採取された湖産アユ32個体（平均体長8.0 cm、標準偏差±0.51 cm）を使用した。

さらに、神流川には、主に海産アユを創始集団とする人工産のアユが放流されている。そこで、海産アユとして、広瀬川（宮城県）で2013年 5月～ 8月に採取した30個体を使用した（Fig. 1）。 なお、湖産および広瀬川標本群は、神流川標本群の起源を推定するための基準標本群として使用した。DNA 抽出のための試料として、各供試魚の尾鰭の一部を切除し、全 DNA 抽出を行うまで、－85℃または100%アルコールで固定して冷凍保存した。

集団分析　全 DNA の抽出は、SDS-phenol-chloroform 法8）か、PureLinkTM Genomic DNA Mini Kit（Invitrogen）を用いて行った。マイクロサテライト DNA 分析は、アユで開発された Pal-1、Pal-2、Pal-3、Pal-4、Pal-5、Pal-7 9）、PalAyu-42、PalAyu-194、PalAyu-19910）、Ple-27、Ple-39、Ple-10011）の12座を使用した。これらの12座は、Pal-1、Pal-3、Pal-5（Panel-A）、Pal-2、Pal-4、Pal-7（Panel-B）、PalAyu-42、PalAyu-194、PalAyu-199（Panel-C）、Ple-27、Ple-37、Ple-100（Panel-D）の各 3座ずつ、4つのマルチプレックス反応系で PCR 増幅を実施した。 各マーカー座の一方のプライマーは、FAM、HEX、NED のいずれかの蛍光色素で標識した。

PCR 増幅においては、Type-it microsatellite PCR kit（QIAGEN）を使用した。PCR は、各プライマー

Fig. 1. Geographical locations of the three ayu (Plecoglossus altivelis altivelis) populations analyzed in this study.

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を0.2 μM、Type-it Multiplex PCR Master Mixを終濃度 1×、全 DNA を20－30 ng で、合計6 μl として行った。PCR 反応は、95℃ 5 分間の後、28サイクルの95℃ 30秒間、57℃ 90秒間、72℃ 30秒間の後、反応の最後に60℃ 30分間で実施した。各 PCR 産物は、GS-400HD size standard（Applied Biosystems）を用いて ABI3730XL DNA Sequencer または ABI3500xL（いずれも Applied Biosystems）で泳動し、Peak Scanner（Applied Biosystems）または STRand12,13）でアリルサイズの決定を行った。マイクロサテライト DNA の変異性は、アリル数、

ヘテロ接合体率の観察値および期待値を算出して比較を行った。また、ハーディー・ワインベルグの法則からの逸脱および連鎖不平衡についても検討した。最近になっての小集団化の有無は、アリル数とアリルサイズレンジから M-ratio を算出して検討を行った14）。M-ratio による小集団化があったとする基準は、0.68以下であった場合とした14）。以上の分析には、Arlequin version 3.5を用いた15）。 さらに、小集団化の有無の検討は、BOTTLENECK ver1.2.02による Wilcoxon’s test を、TPM model（90% stepwise mutation model and a variance of 12 among multiple steps）で実施した16）。ハーディー・ワインベルグの法則からの逸脱と連鎖不平衡については、sequential Bonferroni 法で多重比較検定を行った17）。個体数に依存しないアリル数として、FSTAT version 2.9.3.218,19）を使用してアレリックリッチネス20）を求めた。帰属性分析は、WHICHRUN（version 3.2）21）により、マイクロサテライト DNA のアリル型情報に基づいて実施した。分析は、まず基準標本群として使用した湖産および広瀬川標本群の尤度を算出した。次に、基準標本群との対数尤度比に基づき、神流川標本群が湖産由来か海産由来かの判別を実施した。

結　　果今回使用した12マイクロサテライト DNA マーカー

座では、87個体全てにおいて PCR 増幅が可能であった。各標本群の平均アリル数、アレリックリッチネ

ス、ヘテロ接合体率（期待値）は、それぞれ8.1－11.8、9.6－11.1、0.690－0.728であった（Table 1）。ハーディー・ワインベルグの法則からの逸脱は、認められなかった。連鎖不平衡は、sequential Bonferroni 法による多重比較検定を行った結果、湖産標本群の Pal-3 と Pal-5 の間で認められた。Pair wise FST 値は、0.027～ 0.066で、すべての標本群間で有意差が認められた（Table 2）。Wilcoxon’s test では、いずれの標本群でも小集団化が認められなかった（全て P > 0.05）。一方、M-ratio の値は、神流川標本群が0.603、湖産標本群が0.678、広瀬川標本群が0.697と、神流川標本群と湖産標本群で小集団化が認められた（Fig. 2）。帰属性分析の結果、21個体（84.0%）が湖産アユ由来、

4個体（16.0%）が海産由来（主に海産アユに由来する人工産種苗由来）と判定された。帰属性分析の結果に基づいて散布図を作成したところ、神流川標本群の一部の個体は、湖産と海産の中間付近に位置する場合があった（Fig. 3）。

考　　察神流川のアユの由来　1992年に調査された神流川のアユの由来は、アイソザイムを用いて調査した結果、

Table 1. Average number of alleles per locus (NA), allelic richness independent of sample size (Ar), and observed and expected heterozygosity (Ho, He) of each sampled Plecoglossus altivelis altivelis pop-ulation, based on 12 microsatellite loci

Populations NA Ar HO HeKanna 8.1 9.6 0.663 0.690Lake Biwa 10.5 11.1 0.703 0.725Hirose 11.8 10.4 0.700 0.728

Table 2. Pairwise FST values (below the diagonal) and their statistical signifi cance (above the diagonal). ＊Signifi cant difference at p < 0.05 after sequential Bonferroni correction (Rice 1989)

Kanna Lake Biwa Hirose

Kanna ＊ ＊

Lake Biwa 0.027 ＊

Hirose 0.051 0.066

Fig. 2. M-ratios (95% C.I.) by population (M-crit. = 0.68). KN: Kanna population, BW: landlocked Lake Biwa population, HRS: Hirose population.

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放流された湖産アユであると報告されていた7）。そして、2016年に実施した本研究でも、84%の個体が湖産アユ由来と判定された。しかし、マイクロサテライト DNA のアリル型情報に基づいて作成した散布図における神流川標本群のうちの数個体は、湖産アユと海産アユの中間近くにプロットされた（Fig. 3）。これらの個体は、湖産と人工産の交雑個体である可能性が考えられる。神流川では、他の水域同様に、長期にわたり湖産アユの放流が行われてきた。例えば、1992年は、2,520 kg のアユが放流されているが、このうち80%以上が湖産アユであった7）。このため、神流川のアユは、放流された湖産アユが主体になってきたものと考えられる。一方、神流川に放流されたアユのうち、主に海産アユを創始集団とした人工産種苗の占める割合は、1992年では20%以下であったが7）、これ以降増加して2015年は100%であった。近年、神流川に放流されている人工産種苗は、主に群馬県産種苗の海海系と群海海系、福島県の養魚場産の 3系統である。海海系とは利根川河口堰で採捕したアユを親魚に用いて継代している系統で F10である。群海海系は群馬県水産試験場で長期継代している群馬系（琵琶湖、浜名湖、利根川で採捕したアユを交配させて1970年に作出した系統）と海海系を掛け合わせた系統で F8である。福島県産種苗は岩手系と称している系統で、由来は岩手県北上川のアユと岐阜県秋川のアユを交配した種苗である。本研究の結果は、従来湖産アユで構成されていた神流

川のアユが、放流量が増加した人工産種苗の遺伝的影響を受けつつあることを示唆しているものと考えらえる。人工湖における移植されたアユの自然繁殖は、放流用種苗の生産およびそれらをストックするという面でも重要な意味を持っている6）。また、FAO の遺伝育種専門家会議は、魚類集団の移植や放流といった生産活動の積極的意義を認めている22）。神流川が流れる群馬県では、アユ資源のほとんどを稚魚放流事業により維持している。こうした中、再生産が行われている神流川の陸封アユは、群馬県の貴重な資源といえる7）。また、神流川のアユは、毎年 6月のアユ友釣り解禁日に多くの遊漁者が訪れる、重要な遊漁対象魚となっている。さらに、神流川で捕れる天然アユは美味しいと評価されていることから、地域ブランド化を目指す動きがある。このように、移植された神流川のアユは、地域で有効に活用されている。一方で、FAO の遺伝育種専門家会議は、魚類集団の移植や放流がもたらす問題点を指摘し、適切な対応の必要性を指摘している22）。移植された集団が引き起こす問題点としては、当該水域に生息していなかった種などが侵入すると、餌などの競合により、従来から生息していた生物集団の年齢構成や集団構造に変化を生じることなどが原因となり、遺伝的多様性の低下やその地域の種の構成に変化を引き起こす可能性がある。このため、移植が行われる前に、影響を受けると考えられる集団や種の遺伝的多様性や資源量調査をあらかじめ行っておくことが推奨されている22）。神流川では、事前に生息する生物の資源量調査などは行われていないが、今後、必要に応じてこれらの調査を実施し、その影響について注意を払うとよいと考えられる。また、同種であっても、当該水域に生息する集団とは異なる集団が放流された場合も、遺伝的影響について注意が必要であるとされる22）。例えば、従来、放流された湖産アユは、海水適応能力が低いことから海域に降下した際に生残することができず、天然のアユ集団に遺伝的影響を及ぼすことはないとされていた23）。しかし、東京湾に流入する河川を遡上する海産アユには、放流された湖産アユの遺伝的影響が及んでいる可能性が示唆されている24）。本研究の結果は、神流川のアユの多くが湖産に起源をもち、さらに湖産と人工産種苗の交雑個体が存在することを示唆している。アユは、一般的に母川回帰性を有しないとされる2）。したがって、このような神流川のアユ仔魚がダム下流に流出し、さらに海域に到達して海水中であっても生存することができた場合、 これらのアユが神流川のみでなく周辺の河川にも遡上し、天然のアユ集団に遺伝的な影響を及ぼす可能性がある。放流魚に由来する個体

Fig. 3. Assignment test using twelve microsatellite loci for three reference populations. Each axis indicates mi-nus the decimal logarithm of the likelihood distance using two reference populations, the landlocked (Lake Biwa landlocked population) and amphidro-mous (Hirose population) populations.

1.00E-26

1.00E-24

1.00E-22

1.00E-20

1.00E-18

1.00E-16

1.00E-14

1.00E-12

1.00E-101.

00E-

26

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1.00

E-10

Kanna Biwa Hirose

Likelihood for Lake Biwa landlocked population

Like

lihoo

d fo

r Hiro

se p

opul

atio

n

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は、天然集団に遺伝的攪乱を生じさせ、適応的な遺伝的特徴の消失を招く可能性がある25）。このため、神流川で自然繁殖しているアユが下久保ダムからどの程度まで下流に流出しているか、また他の河川に遡上しているかなどについても、明らかにする必要があると考えられる。

神流湖に陸封されたアユ における遺伝的多様性の保全　神流川標本群のアレリックリッチネスやヘテロ接合体率は、湖産標本群や広瀬川標本群と比較してやや低かった。また、神流川標本群の M-ratio の値は、0.603と低かった。湖産アユの M-ratio は、琵琶湖内20地点について調べた結果、やや低いことが報告されている26）。湖産アユの M-Ratio の値が低いのは、最近になっての小集団化というより、約100,000年前に陸封されて以降の最終氷期など環境変動の影響と考えられている26）。本研究でも、湖産アユ標本群の M-ratio の値は、0.678とやや低かった。しかし、湖産アユの遺伝的影響を比較的強く受けていると考えられる神流川標本群の M-Ratio の値は、湖産アユよりも低い値であり、最近になっての小集団化の影響が考えられる。一方で、Wilcoxon’s test では、いずれの標本群においても小集団化の影響は認められなかった。M-ratio は、小集団化前の集団が大きい場合や小集団化から回復傾向にあるなどの場合、BOTTLENECK16）よりも検出力が高くなるという報告がある27）。神流川標本群は、小集団化が発生し、これらのいずれかの状況にある可能性が考えられた。肱川（愛媛県）の上流部には、野村ダムで陸封されたアユ集団が生息することが知られている。野村ダムに陸封されたアユは、海産と湖産の交雑集団であるとされるが28）、移植に伴い遺伝的多

様性の低下が観察されている6）。人工湖などへ移植された集団は、親魚集団の大きさが小さいことから、もとの天然集団よりも遺伝的多様性が低下する場合があることが報告されている29）。神流川のアユにおける遺伝的多様性は、肱川と同様、移植に伴う親魚集団の大きさが小さいことにより低下した可能性がある。また、神流川に放流されている人工産種苗は、継代されたものである。人工産の種苗は、継代されると次第に遺伝的多様性の低下が生じることが知られている30）。遺伝的多様性が低下した種苗を放流した場合、天然集団に与える影響は明らかにされていない30）。しかし、これらの放流種苗の影響によって、神流湖で陸封されたアユの遺伝的多様性が低下した可能性も考えられる。遺伝的多様性が低下した場合、例えば、Sonoran Topminnow（Poeciliopsis occidentalis）では、繁殖力（雌の産卵数）や適応度（生残率）が低下したことが知られている31）。また、最近になっての小集団化によって遺伝的多様性が低下した集団では環境変動への対応力が失われるが、遺伝的多様性が高い集団は環境変動に対して速やかに適応することが知られている32）。今後は、神流湖に陸封されたアユの資源量の変動や、放流種苗の遺伝的多様性などに注意を払う必要があると考えられる。

謝　　辞本研究で使用した広瀬川のアユサンプルを提供して下さった東北大学大学院 中嶋正道准教授に厚く御礼を申し上げる。また、有益な助言をくださった査読者に感謝する。本研究は、平成27年度女子栄養大学栄養科学研究所奨励研究助成を受けて行われたものである。

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83水産育種47（2018）Fish Genetics and Breeding Science

Investigation of the Potential for Interspecific Hybridization between Zebrafish and Japanese Cyprinid Fish

Kazuo ARAKI＊, Tetsuji MASAOKA, Hiroyuki OKAMOTO and Hiroyuki NAGOYA

Research Center for Aquatic Breeding, National Research Institute of Aquaculture, Fisheries Research Agency

AbstractTransgenic zebrafi sh that express green or red fl uorescent proteins in their epidermis are sold as ornamental fi sh

in the United States and Taiwan and could potentially be transported to Japan and released into rivers or ponds, with a potential for hybridization with native species. To obtain basic biological information on zebrafi sh in Japanese envi-ronments, with regard to safety protocols for transgenic zebrafi sh, we examined whether three native cyprinid fi shes could hybridize with the zebrafi sh (Danio rerio). We chose Ka wabatamoroko (Hemigrammocypris rasborella), which belong to the same subfamily as the zebrafi sh, Tamoroko (Gnathopogon elongatus) and Oikawa (Zacco platypus), which belongs to a near subfamily. The progeny embryos of zebrafi sh and Hemigrammocypris or Gnathopogon developed to just after hatching. The progeny embryos of zebrafi sh and Zacco developed just to the midblastula transition stage. Using polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphisms in the 7th intron of the aromatase gene, we confi rmed that the progeny embryos were hybrids with zebrafi sh.

（accepted January 24, 2018）

IntroductionThe zebrafish Danio rerio (Cypriniformes;

Rasborinae) is a tropical freshwater fish of Indian or-igin and lives in sandy rivers with gentle flow1). It is a popular aquarium fish, frequently sold under the trade name zebra danio, as well as an important vertebrate model organism for laboratory research in genetics and embryology2, 3). Genetic screens in D. rerio have identified mutations that define the roles of hundreds of essential vertebrate genes4). Genetic maps can link mutant phenotypes with gene sequences by providing candidate genes for mutations and poly-morphic genetic markers useful in positional cloning projects5, 6). Many new technologies have been devel-oped to investigate gene functions and developmen-tal mechanisms of zebrafish organs7, 8). Through the construction of single-cell resolution fate maps of the zebrafish blastula, gastrula, and late-stage embry-os, as well as the use of in vivo imaging, enhanced green fluorescent protein (EGFP) or red fluorescent

＊Corresponding author: Kazuo Araki, 224 Hiruda, Tamaki-cho, Watarai, Mie 519-0423, Japan. Tel.: +81-596-58-6411　　E-mail: arakin@affrc.go.jp

protein (DsRed) reporter gene, constructed with purpose gene promoter, were integrated into the genome of fertilized zebrafish eggs; thereafter, these transgenic zebrafish embryos expressed these genes from purpose gene promoter9, 10).

Recently, American and Taiwanese private compa-nies (i.e. Yorktown Technologies and Taikong Corp.) have produced transgenic zebrafish as an ornamen-tal fluorescent fish, respectively named GloFish10)

and TK-2. These transgenic zebrafish express DsRed or EGFP controlled with myosin light-chain or actin gene promoter in the muscle. GloFish or TK-2 that are accidentally or intentionally released may po-tentially reproduce in the wild11-13). Cortemeglia et al.14) reported that at least 13 of 68 GloFish survived at temperatures as low as 7.5°C, though none sur-vived 4-days exposure to 4°C following a cold front. Thus, there is a potential risk should ornamental fish wholesalers apply to import GloFish or TK-2 into Japan, if released fish are able to hybridize with

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Japanese native species. To obtain basic biological data on zebrafish in Japanese waters, we first looked at which nativ e cyprinid fishes might be biologically compatible with zebrafish, since no previous reports have covered this topic. Second, we used DNA mark-ers to confirm whether the progeny of these species were a hybrid15, 16).

As mentioned, zebrafish Danio rerio (Hamilton 1822) belong to the cyprinid subfamily Rasborinae17). Zebrafish have been crossed with other Danio spe-cies in the laboratory, and the hybrid progeny’s pig-mentation patterns often resemble that of the zebraf-ish, because zebrafish pigment alleles are frequently dominant to those of other species18, 19).

We examined whether this zebrafish could pro-duce progeny with the Japanese cyprinids known as Kawabatamoroko (Hemigrammocypris ras-borella Fowler (1910), Tamoroko (Gnathopogon elongatus [Temminck & Schlegel 1846]) or Oik awa (Zacco platypus [Temminck & Schlegel 1846]). Hemigrammocypris belong to the subfam-ily Rasborinae, as do zebrafish of genus Danio, Gnathopogon and Zacco belongs to the near subfam-ily. These small-sized fishes all inhabit sandy rivers with a gentle flow. We found that the progeny embry-os of the zebrafish and H. rasborella or G. elongatus developed abnormally and died just after hatching, and those of the zebrafish and Z. platypus devel-oped only to the midblastula transition stage. We confirmed that the progeny embryos were hybrids between the zebrafish and the three native cyprinids, by polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) in the 7th intron of the aromatase gene.

Materials and MethodsFish culture and fertilization

We cultured zebrafish of the AB line in the aquaculture system at Japan’s National Research Institute of Aquaculture’s Inland Station, using a wa-ter temperature of 26°C and photoperiod of 14:10 h (light:dark). We acquired stock of Hemigrammocypris rasborella and Gnathopogon elongatus from the aquarium of the Lake Biwa Museum and cultured these fish in the aquaculture system at ambient tem-peratures; we captured Zacco platypus from rivers in Watarai District and cultured them in the same

system at ambient temperatures. All fish were fed Hikari Crest Guppy (Kyorin Corp.) twice per day.

To acquire unfertilized zebrafish eggs, we gently rubbed the belly of females to squeeze eggs onto plastic wrap (Saran™ wrap). We squeezed semen from males of H. rasborella, G. elongatus and Z. platy-pus each into 1 ml of artificial seminal plasma (5 mM NaCl, 82.4 mM KCl, 2.0 mM CaCl, 0.8 mM MgCl, 20 mM NaHCO, 20 mM TAPS-NaOH; pH 8.0)20)

kept on ice, and then used the semen to fertilize the zebrafish eggs which had been transferred from the plastic wrap to a 9 cm plastic dish; fresh water was added 1 minute after inducing fertilization.

To induce maturity in females of H. rasborella, G. elongatus and Z. platypus, we injected gonadotropin (10 unit/g) into the fish’s abdominal cavity 14 hours before artificial spawning. We likewise squeezed eggs from these fishes onto the plastic wrap by rub-bing their bellies gently. Meanwhile, we extracted the testis from a mature male and minced this into 1 ml of the seminal plasma kept on ice, to acquire sperm for fertilizing the zebrafish eggs that had been collected on the plastic wrap and transferred to a 9 cm plastic dish; fresh water was added 1 minute after induced fertilization.

Artificially fertilized eggs were cultured at room temperature (~25°C) and observed twice per day un-der a stereomicroscope (Leica, MZ FLIII) to check the viability, survival rate at the eyed stage, and de-velopmental pattern.

PCR-RFLP analysisProcedures for total DNA extraction from ethanol-

preserved embryos, and PCR amplification followed by RFLP analysis are described elsewhere16). Primer sequences for amplifying the mtDNA segments con-taining the 16S rRNA genes were as follows: (16S AR-L) 5ʹ-CGCCTGGTTGATTAAAAACATTGCTGC-3ʹ, and (16S BR-H) 5ʹ-CCGGTTTGAACTCAGATCACGTA-3ʹ21). The PCR was carried out in 20-μl volumes. Reactions contained approximately 20-50 ng extracted DNA, 2 μl of 10× PCR reaction buffer (Takara Corp.), 2.5 mmol dNTP (Takara Bio Inc.), 10 pmol of each primer, 0.5 U Ex Taq DNA polymerase (Takara Bio Inc.) and distilled water. The PCR amplification program contained 40 cycles, proceeded by a dena-turation step at 94°C for 5 min, and completed with

85

an extended elongation step at 72°C for 7 min. The three different temperatures and durations (for DNA denaturation, primer annealing and primer elonga-tion) of the cycles in the first program were: 94°C for 30 sec, 55°C for 30 sec, and 72°C for 60 sec, kept at 4°C after amplification.

Without further purification, the amplified frag-ments were digested using the restriction enzymes Xsp I, TspEI or Hae III (Takara Bio Inc.), electro-phoresed on a 1.5% agarose gel, and stained with ethidium bromide for photographing. Since pre-liminary analysis indicated that two endonucleases (Xsp I and TspEI) revealed relatively high restriction fragment length polymorphism in the amplified frag-ments of native cyprinids in Japan and in zebrafish16), these two endonucleases were applied to all samples.

Masaoka et al.22) designed the primer set sequence for amplifying the segment containing the 7th intron of the aromatase gene in zebrafish (Danio rerio), Hemigrammocypris rasborella, Gnathopogon elongatus and Zacco platypus; the nucleotide sequences are as follows: 5ʹ-AGAGCTGCAGGATGAAATGG-3ʹ (Zebra Aromaex7F) and 5ʹ-CTATCTGAGACTGTATCTCC-3ʹ (Zebra Aromaex8R). PCR reactions were performed in total volumes of 20 μl, comprised of 10-50 ng ex-tracted DNA, 10 pM of each primer, 2.5 mM dNTP, 2 μl of 10× PCR reaction buffer, 0.5 U Ex Taq DNA polymerase, and distilled water. The PCR amplifica-tions were carried out in a program to perform a dena-turation step at 95°C for 5 min, followed by 40 cycles

consisting of 30 sec at 94°C, 30 sec at 55°C, and 1 min at 72°C. The final extension step was 7 min at 72°C.

Without further purification, the amplified frag-ments were digested using restriction enzymes Hsp92 II or Dra I (Takara Bio Inc.) in the case of H. rasborella and G. elongatus, or HinfI, MboI or XspI in the case of Z. platypus, and then electrophoresed on a 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide for photographing. Since preliminary anal-yses indicated that two endonucleases (Hsp92 II and Dra I ) showed relatively high restriction fragment length polymorphism in the amplified fragments of native cyprinids in Japan as well as in zebrafish22), these two endonucleases were applied to all samples.

ResultsDevelopment of hybrid embryos between zebrafish and native cyprinids in Japan

We fertilized the sperm of zebrafish (Danio re-rio), Hemigrammocypris rasborella or Gnathopogon elongatus with unfertilized eggs of these species. In all cases, fertilization was about 90% (Table 1). The hybrid embryos between zebrafish and H. rasborella or between zebrafish and G. elongatus developed to just after hatching in both combinations of sexes. However, these hybrid embryos displayed poor vas-culature development around the yolk and they died just after hatching; since the embryos could not ab-sorb nutrition from the yolk (Fig. 1).

Next, we fertilized the sperm of zebrafish with the

Table 1. The survival rate of hybrid embryos between zebrafish (Danio rerio), Hemigrammocypris rasborella and Gnathopogon elongatus.

Cross Fertility Optic vesicle formation stageThe survival rate before

hatchingThe survival rate

after hatching

Zebrafish♀ × Zebrafish♂ 99.80% 91.20% 91.20% 88.10%Hemi.rasb.♀ × Zebrafish♂ 92% 61% 13.80% 2.10%Zebrafish♀ × Hemi.rasb.♂ 82.30% 49.80% 11.40% 1.90%Hemi.rasb.♀ × Hemi.rasb.♂ 98.10% 76% 71.60% 52.30%Gnath.elong.♀ × Zebrafish♂ 96.10% 68.50% 20.70% 1.70%Zebrafish♀ × Gnath.elong.♂ 89.30% 58.10% 14.90% 1.20%Gnath.elong.♀ × Gnath.elong.♂ 96.70% 70.60% 68.40% 55.10%

Table 2. The survival rate of hybrid embryos between zebrafi sh (Danio rerio) and Zacco platypus

Cross Fertility 32 cells stage Midblastula transition stage Somite formation stage

Zebrafi sh♀ × Zebrafi sh♂ 100.00% 93.20% 91.00% 91.00%Zebrafi sh♀ × Zacco p.♂ 98% 67% 13.80% 0.00%Zacco p.♀ × Zebrafi sh♂ 99.10% 82.00% 61.00% 0.00%Zacco p.♀ × Zacco p.♂ 98.00% 91% 86.00% 83.00%

86

unfertilized eggs of Zacco platypus, and fertilization exceeded 98% in both sexes combined (Table 2). These hybrid embryos were capable of developing to 50% epiboly, but almost all died during the midblas-tula transition stage, in both sexes combined (Fig. 2). At midblastula transition, the cell cycle changed from early embryonic fast cell cycles to somatic cell cycles23).

Polymorphism analysis The developmental pattern of hybrid embryos be-

tween zebrafish and H. rasborella, zebrafish and G. elongatus, or zebrafish and Z. platypus were similar to that of gynogenetic or andro genic haploid embryos. Thus, using DNA markers identifying these fish spe-cies, we set out to demonstrate whether the embryos were hybrids or cases of gynogenetic or androgenic haploid embryos. Masaoka et al.16) found that mtD-NA segments containing the 16S rRNA gene show polymorphism in females of these cyprinid species and have different restriction sites which could generate a species-specific restriction profile of the native Japanese cyprinids. Hence, we could identify the species of the female parent using PCR-RFLP of mtDNA segments containing the 16S rRNA genes. We found that the female parents were zebrafish

Fig. 1. The embryos of zebrafish (Danio rerio), Hemigrammocypris rasborella, Gnathopogon elongatus, a hybrid of zebrafish and H. rasborella, and a hybrid of zebrafish and G. elongatus just after hatching.

　　　 Zebra = zebrafish Danio rerio, Hemi. = Hemigrammocypris rasborella, and Gnatho. Gnathopogon elongatus. The hybrid embryos of zebrafish and Hemigrammocypris rasborella, and those of zebrafish and Gnathopogon elongatus, displayed abnormal vasculature and gastrointestinal tracts and they died just after hatching.

Fig. 2. Developmental stages of the embryos of Zacco platypus and the hybrid embryos of zeb rafish and Z. platypus.

　　　 The hybrid embryos of zebrafish and Z. platypus died during midblastula transition.

87

when zebrafish eggs were artificially inseminated with sperm from males of H. rasborella or G. elonga-tus, and that female parents were H. rasborella or G. elongatus when the eggs of these females were artifi-cially inseminated with the sperm of zebrafish males (Fig. 3). Masaoka et al.16, 22) found that regions of the aromatase gene 7th intron in cyprinid species are variable, often containing a deletion or insertion, and have different restriction sites which can generate a species-specific restriction profile. Using PCR-RFLP of the aromatase gene, we determined that these six progenies were hybrids between zebrafish and H. rasborella, or zebrafish and G. elongatus (Fig. 4).

The embryos created by attempting artificial hy-bridization between zebrafish and Z. platypus devel-oped only as far as midblastula transition and then died. Thus, we investigated whether these embryos were true hybrids between zebrafish and Z. platypus

or a cases of gynogenetic or androgenic haploid em-bryos. Using PCR-RFLP of the aromatase gene, we determined that these embryos were indeed hybrids (Fig. 5).

Discussion We investigated whether transgenic zebrafish

can produce viable offspring with other species of cyprinids that are native to Japan. We attempted artificial fertilization of zebrafish (Danio rerio) with Hemigrammocypris rasborella, Gnathopogon elonga-tus and Zacco platypus because these are common cyprinids in Japanese rivers with a sandy bottom and gentle flow, similar to the habitat of zebrafish in Indian rivers.

The hybrid embryos of zebrafish and H. ras-borella or G. elongatus developed incomplete vas-culature around the yolk, thus the embryos were not able to absorb nutrition from the yolk and they

Fig. 3. The electrophoretic profile of the PCR-RFLP of mitochondrial 16S rRNA gene and the aromatase gene of hybrid zebrafish and Hemigrammocypris rasborella.

　　　 A, B: PCR-RFLP of mitochondrial 16S rRNA gene; C, D: PCR-RFLP of the aromatase gene shows the XspI, TspE1, Hsp92II and DraI enzyme restriction sites.

　　　 M: 100-bp ladder DNA marker and 500 bp shows a 500-bp length DNA fragment. Lane 1 is zebrafish. Lane 2 is Hemigrammocypris rasborella. Lanes 3-5 are hybrid embryos between a zebrafish female and a H. rasborella male. Lanes 6-7 are hybrid embry-os between a H. rasborella female and a zebrafish male. Lane 8 is H. rasborella.

Fig. 4. The electrophoretic profile of the PCR-RFLP of mi-tochondrial 16S rRNA gene and the aromatase gene of a hybrid zebrafish and Gnathopogon elongatus.

　　　 A, B: PCR-RFLP of mitochondrial 16S rRNA gene; C, D: PCR-RFLP of the aromatase gene shows the XspI, TspE1, Hsp92II and DraI enzyme restriction sites.

　　　 M: 100-bp ladder DNA marker and 500 bp shows a 500-bp length DNA fragment. Lane 1 is zebrafish. Lane 2 is Gnathopogon elongatus. Lanes 3-5 are hybrid embryos of a zebrafish female and a G. elon-gatus male. Lanes 6-8 are hybrid embryos between a G. elongatus female and a zebrafish male.

88

died soon after hatching. In Japan, H. rasborella is taxonomically the closest species to the non-native zebrafish. The hybrid embryos of zebrafish and Z. platypus died during the midblastula transition stage. Embryonic cells divide every 40 min in ze-brafish and every 90 min in Z. platypus. Moreover, at midblastula transition stage, the cell cycle changed from early embryonic fast cell cycles to somatic cell

cycles23). We assumed that these embryos showed abnormal cell division because of the incomplete DNA replication of Z. platypus and abnormal devel-opment. Nevertheless, we considered whether these artificial hybridization experiments had sufficiently demonstrated that zebrafish may not produce viable offspring with the native cyprinids.

Although zebrafish of disparate populations are not grossly dissimilar morphologically1), other spe-cies in the speciose subfamily Rasborinae differ dra-matically in size, shape and other traits24). Indeed, the subfamily Danioninae includes taxa traditionally placed in the Rasborinae (whose monophyly has been questioned), such as the danio zebrafish, which attains 4-5 cm, but also Danio dangila, which attains ~13 cm, and some of the world’s smallest vertebrates, such as species of Danionella and Paedocypris, which mature in a larval-like form at only 1-1.5 cm25-27). Although D. rerio has been successfully crossed with other Danio species in the laboratory, this zebrafish is not known to hybridize with other Danio species natively. Compared with the zebrafish, the body sizes of mature fish of almost all Japanese cyprinid species are relatively large. Future research is needed to establish for certain whether zebrafish can naturally hybridize with some species of Japanese cyprinid.

AcknowledgmentsThis study was supported by a grant from the

Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan (Research Project for Genomics for Agricultural Innovation, GAM-1 Assessment/Management-108). Cynthia Kulongowski (MSc), from Edanz Group (www.edanzediting.com/ac), edit-ed a draft of this manuscript.

Fig. 5. The electrophoretic profile of the PCR-RFLP of mi-tochondrial 16S rRNA gene and the aromatase gene of a hybrid zebrafish and Zacco platypus.

　　　 A: PCR-RFLP of mitochondrial 16S rRNA gene; B: PCR-RFLP of the aromatase gene shows the HaeIII, XspI, HinfI and MboI enzyme restriction sites.

　　　 M: 100-bp ladder DNA marker and 500 bp shows a 500-bp length DNA fragment. Lane 1 is zebrafish. Lanes 2-4 are hybrid embryos between a zebrafish female and a Z. platypus male. Lanes 5-7 are hybrid embryos between a Z. platypus female and a zebraf-ish male. Lane 8 is Z. platypus.

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ゼブラフィッシュと在来コイ科魚類の種間雑種出現の可能性の検討

荒木和男・正岡哲治・岡本裕之・名古屋博之（水研機構増養殖研・育種研究センター）

EGFPや DsRedを表皮や筋肉で発現する遺伝子組換えゼブラフィッシュが米国や台湾で市販されており、日本にも輸入され、川や池に放流され、在来種と交雑する可能性も考えられる。そこで、日本の遺伝子組換えゼブラフィッシュの規制に必要なゼブラフィッシュの生物情報を得るため、ゼブラフィッシュと在来コイ科魚類との交雑の可能性について検討した。ゼブラフィッシュと同様 Danio （Rasborinae）亜科に属するカワバタモロコ（Hemigrammocypris rasborella）、及び近縁亜科に属するオイカワ（Zacco platypus）、タモロコ（Gnathopogon elongatus）とゼブラフィッシュとの人為交配試験を行った。ゼブラフィッシュとカワバタモロコ又はタモロコの人工交配で得た胚はふ化直後まで生残した。一方、ゼブラフィッシュとオイカワの人工交配で得た胚は中胚葉誘導期で発生を止めた。PCR-RFLPにより得られた胚の種判別を行った結果、いずれの胚もゼブラフィッシュとの雑種であることが証明された。

91Fish Genetics and Breeding Science

－ 会員通信 －

第 2回ブリ類ワークショップ参加報告

尾崎照遵（増養殖研）・野田勉（西水研）

2nd Seriola Genomics Workshop

Akiyuki OZAKI and Tsutomu NODA

Fisheries Research and Education Agency

平成30年 1月11-12日、場所： アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ・ラホーヤ、南西水産研究センター

（11-12 January 2018 Location: Southwest Fisheries Science Center, La Jolla, CA）

連絡先： 〒519－0423　三重県度会郡玉城町昼田224－1　国立研究開発法人 水産研究・教育機構　　　　増養殖研究所 育種研究センター ゲノム育種グループ 　尾崎照遵　　　　Tel : 0596－58－6411（代表）　　Fax : 0596－58－6413　　E-mail: aozaki@affrc.go.jp

米国カリフォルニア州サンディエゴ・ラホーヤにある南西水産研究センターにて開催された第 2回ブリ類ゲノムワークショップに参加したので、その概要について報告する。本会議は、急速に発展しつつあるブリ類養殖に関する現状と問題点について、各国また各対象種における最新の情勢や今後の展望等に関する情報を共有するとともに、得られたデータのシェアや国際的な共同研究による研究推進の可能性について議論することが趣旨である。前回の第一回会議はゲノム情報についての共有を中心に話あったが、今回は飼料・餌料、繁殖制御、育種計画など研究分野の対象範囲が広がった。

水産育種47（2018）

写真 1　ブリ類ゲノムワークショップ参加者の集合写真

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2日間の会議中、まずはブリ類に関する育種、繁殖制御、飼料研究及び養殖産業との関わり方について中心に活発な議論がなされた。参加者は、ブリ類研究及び養殖に携わっている主要な 5か国であるアメリカ合衆国、日本、チリ、メキシコ、オーストラリアに加え、カナダ、ドイツ、ブラジルの 3か国も加わり、国の機関あるいは大学に所属する研究者や養殖生産企業を含めた合計48名となり、それぞれの国からの関心の高さが伺え、前回の1.5倍規模のワークショップになった（写真 1）。またこの会議の発足のきっかけをつくった UJNR 会議（天然資源の開発利用に関する日米会議 U.S.-Japan Cooperative Program in Natural Resources）水産増養殖部会のアメリカ側の部会長のであるマイク・ラスト氏の参加もあり、今回のセリオラワークショップ会議の発展する様子を非常に喜んでおられた（写真 2）。まずは前提として、ブリ類といっても研究対象種は国により様々で、日本はブリ（Seriola quinqueradiata）、カンパチ（Seriola dumerili）、ヒラマサ（Seriola aureovittata）の三種、アメリカ合衆国とメキシコはカルフォルニアヒラマサ（Seriola dorsalis）とヒレナガカンパチ （Seriola rivoliana）の二種、チリとオーストラリアは南半球ヒラマサ（Seriola lalandi）の一種を研究対象としている、また今回初めて参加したドイツは地中海で行われているカンパチ（Seriola dumerili）が研究対象ということであった。今回発表演題数は合計19題と前回の14題から増加し、それぞれの国における研究の進展状況と、今後の方向性、研究を進めるうえでボトルネックとなる事項、及び必要となる機会等が示された。またこの会議の中での日本の存在感は前回と同様に大きく、所有するゲノム情報の精度、計画交配技術の練度や、ハダムシ抵抗性等、魚病耐性に関する育種研究の進展度は他国の関心を集めており、現状では他国の指針になりうるデータと経験値を有していることが参加者に広く認識された。ただし飼料開発に至っては他国の進展度の方が早く、低魚粉飼料やまた腸内フローラの解析など挑戦的な研究も進めている。加えて、低魚粉飼料の原料となる大豆タンパクやコーングルテンなどの材料は、アメリカなどでは自国で大量に生産されており、輸入の必要はほとんど無い、一方、日本は魚粉に加え、大豆タンパクなどの代替原料も輸入が多い。さらに、世界の魚粉の価格変動の影響を受けて低魚粉飼料の必要性の議論が浮き沈みする日本は大きな後れを取っているように感じた。ゲノム情報に関しては、前回の議論から各国が粛々と各国の対象魚種でゲノムアセンブリの作業を進めており、米国はクオリティーに差があるもののカルフォルニアヒラマサとヒレナガカンパチのゲノム情報を揃えてきている。但しこの点に関しては、今後は技術的な改善が見込まれていることもあり、大きな問題にはならないと認識している。アンドリュー・セブリン氏が構築したゲノムブラウザのプラットフォームは二国間双方の合意がなければお互いのデータを見ることができないシステムになっており、この機能により情報の流出・転用することはできなくなっている、その点もこのコンソーシアムの中で秘密が守られる仕組みになっている（図 1）。これによりブリ類のゲノム情報を一元化し、それぞれの研究対象となるブリ類のシーケンス情報の信頼性を高

写真 2　 発表の様子を聞く水産増養殖部会のアメリカ部会長であるマイク・ラスト氏 （写真中央）

図１　 アンドリュー氏が開発したブリ類研究に必要な情報を抽出、提供できるブラウザ　　　https://www.serioladb.org/

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め、魚種毎に SNP 情報を分かり易く示したり、自分たちの研究に必要な情報を簡単に抽出したり、または新たに得られたデータを提供したりできるようなデータベース環境が実現できる。各国の研究対象種で蓄積されているゲノムや発現遺伝子等の情報をアイオワ大学に集約し、ブリ類で共通する SNP 情報と、それぞれの対象種に固有の情報を整理した後、大規模な SNP カスタムチップアレイ等を作成し、価格単価を下げ 1個体あたりの単価を20＄当たりにすることを目標としている（米国農務省のアメリカナマズ研究の場合、現在のコストは約50＄）。これまでの我々のデータからブリ類の SNP 情報はある程度の種特異性が高いことが示唆されており、ブリ類で共通する SNP をどれだけ集めて、クオリティーの高い共通 SNP チップアレイを作製するためには、それぞれの魚種のゲノムアセンブリデータの質とリシーケンスデータの数に依存するため、各国の積極的な協力が必要になる。共同研究のメリットとしては、SNP チップアレイの単価を抑えるが最も重要なことであり、今後ゲノミックセレクションが主流になる育種研究にとっては非常に重要なポイントとなるであろう。現状では各国の代表が日本のゲノム、育種研究を尊重し、日本側のアイデアの多くが土台となって進められている状況にある。また経済形質の表現型調査に関して、ハダムシ耐性についても海外各国が日本の事例を手本に、それぞれ研究が始まっていることも我々の影響力が強く出ていることが伺えた。総合討論の際にはこのセリオラワークショップを総説として論文化することの話し合いが持たれた。各国、もしくは各分野で担当を割り振り、それぞれの国を代表とする窓口担当者に人選をお願いすることになった、各項目立てと割り振りは NOAA の本会議のジョン・ハイデ、キャサリン・パーセル担当者と UJNR 責任者であるマイク・ラスト氏に一任することになった（写真 3）。ここにおいても日本のプレゼンスは高く、発言と存在感を示すことができた。またサンプル提供のお願いもあり、これら日本側のサンプル提供の条件として、プロセスを UJNR 増養殖会議の窓口を有効に活用することをお願いした。今回は総合討論以外にも、ジョージア大学から家畜育種研究者の鶴田省吾氏とダニエラ・ラロンソ氏にも議論に参加いただき、米国農務省でニジマス、及びアメリカナマズで行っている ssGBLUP 法によるゲノミックセレクションの講義も行われて、これら国際共同で行う研究の成果の将来についての指針・議論がなされた。今回の会議で特徴的な点としては、前回はゲノム研究が中心に議論されていたことが、飼料研究、繁殖制御研究面での要素が加わり、さらには研究要素の強い内容の会議にも関わらず、米国のカンパチ・ファーム社、ブルーオーシャン社、日本のマルハニチロ社と世界の養殖産業界の大手の参加者があったことである。海外での養殖研究の進め方の特徴として、養殖産業のための研究の方向性と価値を、産業界にも広く理解してもらうとともに、産業界からの要望に十分に耳を傾けることを重要視しているようである。ブリ類養殖における課題は、今後の養殖産業全体の発展を考えた場合、現在の養殖技術の問題点の解決に対して、サケ・マスのようにやさしくもなく、ウナギ・マグロのように難し過ぎではなく「ちょうどよい難易度の課題」が設定されていることに尽きるといえる。またブリ類に限って情報を隠したとしても、今回のドイツの研究者の発表でカンパチのインプラントによる成熟制御の話題にもあったが、クロマグロなどほかの魚種で開発した技術が転用され応用がなされており、それは前回でも感じられたことではあるが、本会議に参加した国々が協調して共同研究を進める準備ができており、仮に日本がこのコミュニティーでの情報を開示しなかったとしたとしても日本以外の国で発展することになる。米国現地での養殖の状況としては、米国で実際に産業種として成立しているのはヒレナガカンパチであるが、ハワイ沖の養殖利用海面には制限があり、今後の増産は米国資本でメキシコのカリフォルニア湾内に生産の拠点を移していることは前回報告した。

写真 3　 総合討論の際、それぞれの役割分担と協調について意見する関係研究者

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日本では、国が主導して進めた技術開発後の移転や、支援先を民間企業に直接繋げる状況が作りにくく、海外の養殖産業に遅れをとってしまっている。ヒラマサ・カンパチにおいてはヨーロッパ市場に対し、需要に追い付いていない状況が続いており、地中海沿岸諸国ではカンパチ、オーストラリアではヒラマサの増産を図っている、研究や技術開発とは別に、ブリ類の輸出に関しての流通網を、国内においても複数の国内商社企業との協力体制を早い段階で構築し、海外での販売事業戦略に着手準備しておく必要がある。そうでなければ輸出を期待していたはずの海外での輸出先のブリ養殖産業市場を、海外の企業に流通網を抑えられてしまう。

全体を通じての所感二年前は問題提起が中心に終わった会議であったが、そこで行われた議論がそれぞれの国に持ち帰られて、それぞれ国のそれぞれの研究分野で特定の方向性を持って進めていることを認識した。今回はゲノム、育種に限らず、繁殖生理や飼料についての議論も進められたので、さらに二年後には、それらの分野でも明確な指針をもって計画が進んでいくであろう。この今後20年の世界の海産養殖魚の研究・養殖産業の中心はブリ類になることは間違いなく、消費者の志向という問題を考えずとも、海面温度から効率的海域の利用を考慮すれば、寒流利用の大西洋サケと暖流利用のブリ類が世界を二分する海産養殖対象魚となる。その中で日本のこれまでの研究により得られた成果に対し、我々の参加を好意的に抱いてくれており、今後の国際コミュニティーへの協力を期待されている。

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水産育種研究会会則

1 ．名　称本会は、水産育種研究会と称する。

2 ．目　的本会は、水産生物の遺伝と育種に関する学術研究・情報の交流と普及を図り、その実践の促進に資すること目的とする。

3 ．事　業本会は、その目的を達するために次の事業を行う。　 1 ）研究集会、講演会などの開催　 2 ）会誌『水産育種』の刊行　 3 ）その他

4 ．会　員本会の趣旨に賛同する次のものを会員とする。　 1 ）普通会員（個人）　 2 ）団体会員（団体、機関）　 3 ）名誉会員入会を希望する者は、所定の入会申込書の提出・会費の納入等の手続きを行うものとする。名誉会員は本会の発展に特に功績のあった個人会員のうち、会員の推薦を受け、幹事会の承認を得て総会の同意を得た者とする。

5 ．会　費会員は前納とし、年額、普通会員は3,000円、団体会員は10,000円とする。日本国外で会誌等の受領を希望する場合、会費は20％増とする。

6 ．役員等本会に次の役員等を置く。　 1 ）会長：本会は会長 1 名を置く。会長は本会を代表し、会務を統べる。　　　会長の選出は総会において行う。任期は 2 年とし、再任は妨げないが、連続 2 期までとする　 2 ）幹事：本会は庶務幹事 2 名、会計幹事 1 名、編集幹事若干名を置く。　　　幹事は会長の指名による。　　　任期は 2 年とし、再任を妨げない。

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水産育種　投稿要領（平成24年 3月改訂）

掲載報文および著者：報文の投稿者は本研究会の会員に限る。会員以外の共著者を含むことは差し支えない。なお、投稿論文の内容は、ほかの刊行物に発表されていないものに限る。

原稿の送付：投稿論文は Word，Excel，Powerpoint 等のソフトで作成し、E-mail で添付文書として投稿する事が望ましい。図表等容量が大きく（2MB 超）電子メイルで送付する事が困難な場合、あるいは特殊なソフトで作成した図表は、審査用図表として PDF ファイルとして提出する。また従来の郵送による方法でも論文投稿は可能とする。

投稿論文の審査：投稿論文の審査は編集委員が責任を持って担当する。訂正のある場合は、著者に連絡し訂正を求める。著者は必要な修正を行った後に、修正原稿とともに訂正箇所を明示した箇所一覧を別ファイルとして提出する。最終原稿の提出は添付ファイルとして編集事務局に電子メイルで送付する。容量の大きい図表は CD、DVD 等のデジタルメディアで、修正論文ファイルとともに編集事務局に郵送する。

原稿：和文原稿は A4 版の400字詰めの横書きの原稿用紙を用いる（鉛筆書きは不可）。ワープロを使用する場合は A4 版に横書きで行間をあけ、1 ページ30行程度とする。

　　　原稿には必ず頁番号をつける。Word であれば、「書式」タブ中の「文書のレイアウト－その他」で行番号も入れることが望ましい。

　　　英文原稿は、厚手の A4 版上質紙を用い、 1 頁24行程度の 2 段送りとしてワープロで作成する。表題・著者名：表題、著者名、所属は下記の要領で和文および英文で書く。　　和文原稿の場合；

海産 2 枚貝類の種間における遺伝的距離尾庭きよ子・木島明博（東北大・農）

Genetic Distance between Species in Marine BivalvesKiyoko ONIWA and Akihiro KIJIMA

Faculty of Agriculture, Tohoku University

　　英文原稿の場合；Genetic Distance between Species in Marine Bivalves（海産 2 枚貝類の種間における遺伝的距離）

Kiyoko ONIWA and Akihiro KIJIMAFaculty of Agriculture, Tohoku University（尾庭きよ子・木島明博，東北大・農）＊

　　　　＊可能ならば日本語の氏名・所属を記入　 　なお、連絡先の住所を和文または英文で代表者 1 名の郵便番号、住所（番地まで）、所属機関名、氏名の順に本文第 1 頁の欄外に記載する。

Abstract：本文と別葉にし、英文原稿の記載要領に準じて作成する。Abstract には、表題、著者名（Full name）を記載し、できるだけ簡潔な英文で200語程度（ 1 枚以内）にまとめる。図表および文献などの引用はしない。

本文の体裁：和文原 稿の場合；本文の記載は原則として、緒言、材料と方法、結果、考察、（謝辞）、要約、文献の

順に従い、見出しは左端にゴシックで記載する。ただし、緒言の見出しはつけない。小見出しをつける場合はゴシックとし、文章は 1 字空けて追い込みにする。なお、要約は和文400字程度で作成し、図表および文献などの引用はしない。

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英文原 稿の場合；本文の記載は原則として、「Introduction」，「Material(s) and Method(s)」，「Result(s)」，「Discussion」，（「Acknowledgment」），「Reference」の順に従うものとする。小見出しをつける場合はイタリックとし、行を変えて文章を始める。英文原稿の場合にも400字程度の和文要旨を作成する。和文要旨にも表題、著者氏名、所属を記載する。

図表：原則として図表は A4 版で作成する。和文原稿の場合、図表タイトルは英文または和文で書く。図のタイトルは別紙にまとめて図の番号を明記して書き、表のタイトルは表の上に書く。図および表はオフセット印刷をするので鮮明に濃く書き、墨入れをする。また、図には番号と著者名を記入しておく。表は Word, Excel 等の汎用性の高いソフトで作成する。図表の挿入位置は本文原稿中の右の欄外に赤字で指定する。

文献：本文中の関連箇所に引用順に上つきで“Brown1)”のようにつけ、文章での引用の場合は「・・・とされる2－5）。」のようにつける。文献の項には下記に示したように作成する。例； 5） Taniguchi, N., A. Kijima and J. Fukai (1987) High heterozygosity at gynogenetic diploids of ayu

Plecoglossus altivelis. Nippon Suisan Gakkaishi, 53: 717－720.6） 藤尾芳久・松岡栄一・小林正裕（1991）貝類の成長に及ぼす遺伝的要因．水産育種，16：29

－32．7） Brown, W. M. (1983) Evolution of animal mitochondrial DNA, pp.62－88, in Evolution of Genes

and Proteins, eds. by M. Nei and R. K. Koehn, Sinauer, Sunderland Mass.8） 藤尾芳久・木島明博（1987）「水産育種の基礎」水産増養殖叢書，36，日本水産資源保護協会，東京，pp. 100．

著者数が多数に上る場合（概ね 4名以上）、最初の 3名を記載し、カッコ書きで全体の著者数を記載する。例； 6） Malausa, T., A. Gilles, E. Meglécz, et al. (20 co-authors) (2011) High throughput microsatellites

isolation with 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing. Molecular Ecology Resources, 11: 638－644.（共著者数20名の場合、表記した 3名を含めた共著者数を記載する）

各著者の報文における貢献度の記載を希望する場合は別葉とし、その旨を記述する。

印刷の費用：本研究会が負担する別刷の印刷費は50部までとし、それ以上の部数（50部単位）を希望する場合は、これに要する費用を著者負担とする。カラー写真の印刷に要した費用については著者負担とする（ 1頁→ 3万円，2頁→ 5万円，3頁→ 6万円）。また、英文原稿の場合の英文校閲にかかる費用は著者負担とする。PDF ファイルを希望する場合はその旨を編集委員へ申し出る。

原稿の送付先：〒514-8507　　　　　　　三重県津市栗真町屋町1577　　　　　　　三重大学大学院生物資源学研究科　　　　　　　古丸　明　宛　　　　　　　E-mail：suisanikusyu＠ml.affrc.go.jp

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水産育種研究会組織

会　　長　　　　　　奥澤公一

庶務幹事　　　　　　尾崎照遵、岡本裕之

会計幹事　　　　　　名古屋博之

編集幹事　　　　　　荒井克俊、阿部周一、池田実、奥村誠一、菊池潔、木島明博、

　　　　　　　　　　古丸明（主任）、坂本崇、関伸吾、高木基裕、中山一郎、中嶋正道、

　　　　　　　　　　西田睦、野村和晴、吉崎悟朗

国際学会担当幹事　　谷口順彦、和田克彦

総括幹事　　　　　　藤尾芳久、山崎文雄

会計監査　　　　　　河村功一

水産育種　第47巻2号

2018年（平成30年）3月30日印刷2018年（平成30年）3月30日発行

編集者 古丸　明代表者兼発行者 奥澤公一発行所及び著作権者 水産育種研究会〒519-0423 三重県度会郡玉城町昼田224-1国立研究開発法人水産研究・教育機構増養殖研究所玉城庁舎TEL 0596-58-6411　FAX 0596-58-6413印刷所： ㈲西村謄写堂〒780－0901 高知市上町１丁目6－4TEL 088－822－0492　FAX 088－825－1888

ISSN 1343-7917Vol.47 No.2, March 2018　　

水産育種

FISH GENETICS AND BREEDING SCIENCE

FISH GENETICS AND BREEDING SCIENCEVolume 47 Number 2, March 2018

CONTENTS

A Memorial Writing to Dr. Ryo Suzuki K. ARAI　75

Originals Origin and Genetic Variability of a Landlocked Kanna River Ayu (Plecoglossus altivelis altivelis) Population M. SAITO, H. ARAI and K. YAMAGUCHI　77

Investigation of the Potential for Interspecific Hybridization between Zebrafish and Japanese Cyprinid Fish K. ARAKI, T. MASAOKA, H. OKAMOTO and H. NAGOYA　83

Topic2nd Seriola Genomics Workshop A. OZAKI and T. NODA　91

The Regulations 95Instruction for Authors 96

表紙目次75-76追悼77-8283-9091-94会員通信95-98会則他奥付裏表紙