次世代シーケンサー マイクロアレイ培養ヒトes...
TRANSCRIPT
times
次世代シーケンサー hArrマイクロアレイマイクロアレイをどのように使いこなすか
2011 年1月
times
内容
イントロダクション 次世代シーケンサの広がり マイクロアレイアプリケーションの広がり 幹細胞ゲノミクスを例として
使い分けのポイント vs RNA-seq（ 感度ダイナミックレンジ精度コストカスタム化
アジレント発現マイクロアレイの３つのラインナップ Gene Expression + lincRNA (長鎖non-codingアレイ) miRNAマイクロアレイ Gene Expression + Splicing variants (Exonアレイ)
Page 2
times
Microarrays achieved a rapid uptake then NGS核酸検出とシーケンス技術に関する論文の推移
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ldquoWhat would you do if you could sequence everythingrdquo Nature biotech Oct 2008
NGSMicroarray
Blotting
Footprinting
ChIP
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 4
aCGH
ChIP-on-chip CH3
ChIP-on-chip
SureSelect
miRNAlincRNA
Splicing variant
複数のアプリケーションにより一歩進んだ生物学的解釈を付与
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
Gene Expression
New
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサー使い分けの前提
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Oligo DNA Microarrayndash 既知のトランスクリプートムまたはゲノム配列からオリゴプローブを設計して搭載 rarr 例既知の遺伝子のプロファイリング
Re-sequencingndash 読み取られた塩基配列を既知のリファレンスゲノム配列にマッピング
rarr 例未知の転写産物の同定
hArr
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例幹細胞ゲノミクス研究分野
疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用
bull 脱分化のメカニズム解明遺伝子発現エピゲノム解析など（
bull 分化マーカの特定検出
bull 樹立したiPSの評価bull iPS-iPSiPS-ES間などの比較
ESiPS細胞の選別特性の評価
分化誘導の評価
bull 培養に由来するゲノム不安定性の確認
アジレント自動化システム
bull 細胞アッセイ
lincRNAmRNA
miRNA
ChIP
CH3
Splicing
or
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CGH
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
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ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
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転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
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培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
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次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
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幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
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hArr
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マイクロアレイアプリケーションの広がり
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遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
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なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
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次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
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1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
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cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
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ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
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times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
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他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
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３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
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Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
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The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
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times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
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times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
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times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
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times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
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times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
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times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
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times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
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times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
内容
イントロダクション 次世代シーケンサの広がり マイクロアレイアプリケーションの広がり 幹細胞ゲノミクスを例として
使い分けのポイント vs RNA-seq（ 感度ダイナミックレンジ精度コストカスタム化
アジレント発現マイクロアレイの３つのラインナップ Gene Expression + lincRNA (長鎖non-codingアレイ) miRNAマイクロアレイ Gene Expression + Splicing variants (Exonアレイ)
Page 2
times
Microarrays achieved a rapid uptake then NGS核酸検出とシーケンス技術に関する論文の推移
Page 3
ldquoWhat would you do if you could sequence everythingrdquo Nature biotech Oct 2008
NGSMicroarray
Blotting
Footprinting
ChIP
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 4
aCGH
ChIP-on-chip CH3
ChIP-on-chip
SureSelect
miRNAlincRNA
Splicing variant
複数のアプリケーションにより一歩進んだ生物学的解釈を付与
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
Gene Expression
New
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサー使い分けの前提
Page 5
Oligo DNA Microarrayndash 既知のトランスクリプートムまたはゲノム配列からオリゴプローブを設計して搭載 rarr 例既知の遺伝子のプロファイリング
Re-sequencingndash 読み取られた塩基配列を既知のリファレンスゲノム配列にマッピング
rarr 例未知の転写産物の同定
hArr
times
例幹細胞ゲノミクス研究分野
疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用
bull 脱分化のメカニズム解明遺伝子発現エピゲノム解析など（
bull 分化マーカの特定検出
bull 樹立したiPSの評価bull iPS-iPSiPS-ES間などの比較
ESiPS細胞の選別特性の評価
分化誘導の評価
bull 培養に由来するゲノム不安定性の確認
アジレント自動化システム
bull 細胞アッセイ
lincRNAmRNA
miRNA
ChIP
CH3
Splicing
or
Page 6
CGH
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
Page 7
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
Microarrays achieved a rapid uptake then NGS核酸検出とシーケンス技術に関する論文の推移
Page 3
ldquoWhat would you do if you could sequence everythingrdquo Nature biotech Oct 2008
NGSMicroarray
Blotting
Footprinting
ChIP
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 4
aCGH
ChIP-on-chip CH3
ChIP-on-chip
SureSelect
miRNAlincRNA
Splicing variant
複数のアプリケーションにより一歩進んだ生物学的解釈を付与
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
Gene Expression
New
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサー使い分けの前提
Page 5
Oligo DNA Microarrayndash 既知のトランスクリプートムまたはゲノム配列からオリゴプローブを設計して搭載 rarr 例既知の遺伝子のプロファイリング
Re-sequencingndash 読み取られた塩基配列を既知のリファレンスゲノム配列にマッピング
rarr 例未知の転写産物の同定
hArr
times
例幹細胞ゲノミクス研究分野
疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用
bull 脱分化のメカニズム解明遺伝子発現エピゲノム解析など（
bull 分化マーカの特定検出
bull 樹立したiPSの評価bull iPS-iPSiPS-ES間などの比較
ESiPS細胞の選別特性の評価
分化誘導の評価
bull 培養に由来するゲノム不安定性の確認
アジレント自動化システム
bull 細胞アッセイ
lincRNAmRNA
miRNA
ChIP
CH3
Splicing
or
Page 6
CGH
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
Page 7
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 4
aCGH
ChIP-on-chip CH3
ChIP-on-chip
SureSelect
miRNAlincRNA
Splicing variant
複数のアプリケーションにより一歩進んだ生物学的解釈を付与
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
Gene Expression
New
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサー使い分けの前提
Page 5
Oligo DNA Microarrayndash 既知のトランスクリプートムまたはゲノム配列からオリゴプローブを設計して搭載 rarr 例既知の遺伝子のプロファイリング
Re-sequencingndash 読み取られた塩基配列を既知のリファレンスゲノム配列にマッピング
rarr 例未知の転写産物の同定
hArr
times
例幹細胞ゲノミクス研究分野
疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用
bull 脱分化のメカニズム解明遺伝子発現エピゲノム解析など（
bull 分化マーカの特定検出
bull 樹立したiPSの評価bull iPS-iPSiPS-ES間などの比較
ESiPS細胞の選別特性の評価
分化誘導の評価
bull 培養に由来するゲノム不安定性の確認
アジレント自動化システム
bull 細胞アッセイ
lincRNAmRNA
miRNA
ChIP
CH3
Splicing
or
Page 6
CGH
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
Page 7
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサー使い分けの前提
Page 5
Oligo DNA Microarrayndash 既知のトランスクリプートムまたはゲノム配列からオリゴプローブを設計して搭載 rarr 例既知の遺伝子のプロファイリング
Re-sequencingndash 読み取られた塩基配列を既知のリファレンスゲノム配列にマッピング
rarr 例未知の転写産物の同定
hArr
times
例幹細胞ゲノミクス研究分野
疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用
bull 脱分化のメカニズム解明遺伝子発現エピゲノム解析など（
bull 分化マーカの特定検出
bull 樹立したiPSの評価bull iPS-iPSiPS-ES間などの比較
ESiPS細胞の選別特性の評価
分化誘導の評価
bull 培養に由来するゲノム不安定性の確認
アジレント自動化システム
bull 細胞アッセイ
lincRNAmRNA
miRNA
ChIP
CH3
Splicing
or
Page 6
CGH
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
Page 7
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
例幹細胞ゲノミクス研究分野
疾患モデルとして創薬スクリーニング等への応用
bull 脱分化のメカニズム解明遺伝子発現エピゲノム解析など（
bull 分化マーカの特定検出
bull 樹立したiPSの評価bull iPS-iPSiPS-ES間などの比較
ESiPS細胞の選別特性の評価
分化誘導の評価
bull 培養に由来するゲノム不安定性の確認
アジレント自動化システム
bull 細胞アッセイ
lincRNAmRNA
miRNA
ChIP
CH3
Splicing
or
Page 6
CGH
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
Page 7
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
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times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
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times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
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times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
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times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
Global gene expression analysisによりES細胞マーカと細胞間の発現Similarityを確認
温度感受性センダイウイルスベクターを用いてOCT34 SOX2 KLF4 c-MYC導入末梢血由来のヒト終末分化循環T細胞から導入因子挿入の無いiPS細胞を樹立
Cell Stem Cell (2010) 7 11-14Agilent 遺伝子発現マイクロアレイ使用
ldquoTiPS Cellsrdquo T cell derived iPSCs
Page 7
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
ES細胞の分化時 self-renewal silencingに関わるmiRNA
Drosha
let-7c (体細胞に広く発現) はES細胞のself-renewal の silencingに関与
通常のES細胞では他のmiRNAがself-renewal
をsilenceするlet-7の働きを抑制しているlet-7を抑えることにより体細胞の脱分化の効率化を上げ得る
Chen C et al Mamm Genome (2007) 18316ndash327 Collin Melton C et al Nature (2010) 463
Tissue embryoid bodies (EB) ES のmiRNA発現プロファイル
-Myc +Myc
Page 8
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
転写制御因子からのアプローチPolycomb タンパク質によるHuman ES 細胞の制御機構
Polycomb group protein の複合体 PRC
H3K27のメチル化を誘導（
構成要素EED SUZ12 etc
ES細胞多分化能維持に関わる転写制御因子growthself-renewal 関連遺伝子上流域およびldquodevelopmental regulatorsrdquo上流域に結合
SUZ12
ldquodevelopmental regulatorsrdquo 上流域に結合し発現抑制に関与
H3K27me3
SUZ12 EED
Agilent ChIP-on-chip マイクロアレイ使用
developmental
regulators
Growth
Self-renewal
Cell 2006 Apr 21125(2)301-13 Lee TI et al
Page 9
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
培養ヒト ES 細胞karyotypeでは検出できなかった構造変化をCGHマイクロアレイで検出
Agilent CGHマイクロアレイ使用Amplification 08Mb
Neural Differentiation
Variant of hES cell line
(morphological differences)
NormalhES cell line
Page 10
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分け
Page 11
幹細胞ゲノミクスの例 マイクロアレイ 次世代シーケンサ
新型の幹細胞を樹立rarr 従来の幹細胞と比較
既知のmRNA発現量の全体像を比較
（特殊な用途未知のmRNAncRNAの発現量
の違いを比較）
幹細胞の自己再生と分化に関わるncRNAを探索
既知のncRNA(miRNAlincRNA)の発現
量変化を分化の段階に応じて多点で解析
（特殊な用途未知のncRNAの発現量の違い
を比較）
転写因子の結合やヒストン修飾を網羅的に評価
既知遺伝子のプロモータ領域でChIP-on-chip
ゲノム全体に対してChIP-seq
培養細胞のゲノムの安定性を調べる（ゲノム品質管理）
CGHアレイでreference DNAと比較
（非常に特殊な用途リファレンスDNAの
配列決定）
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
マイクロアレイhArr次世代シーケンサーどのように使い分けるか
Microarray ndash Steady state or slow decline
マイクロアレイがお決まりの分析法として使われ続けるためには次世代シーケンサに劣らぬデータ精度（感度再現性正確性）分析コストデータ取得やデータ解析の容易さなどが鍵
Page 12
hArr
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
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times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
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Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
マイクロアレイアプリケーションの広がり
Page 13
遺伝子発現の変化
エピゲノムメチル化（による制御
ncRNAやSplicingによる制御
配列情報の変化の影響
転写因子やポリメラーゼとの関連
クロマチンによる発現制御
ゲノムのコピー数変化
mRNA
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
なぜ高感度5 logのシグナルレンジが重要なのか
bull次世代シーケンサを利用した発現解析のダイナミックレンジは5 log
全遺伝子の発現を捉えるには5logは必須
Ali et al Nature Method 5 621-628 2008
bullシグナル伝達転写関連遺伝子なども発現が変動する
ケモカイン受容体や細胞間シグナル関連遺伝子Auxin関連遺伝子
低発現遺伝子をきちんと検出する必要がある
Ogawa et al The Journal of urology 1831206-1212 2010
Hoshi et al PNAS 106 6416-6421 2009
Page 14
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
次世代シーケンサ時代に必要とされるマイクロアレイとはアジレント次世代高感度DNAマイクロアレイ
１感度と測定精度がシーケンサと
同等である
gt5 logのダイナミックレンジ
RT-PCRとの高い相関
２容易なカスタムアレイ作成のため
のフレキシビリティ
３マイクロアレイの新規活用法
－オリゴライブラリ合成
(SureSelect)
アジレントDNAマイクロアレイ
基盤テクノロジー
インクジェットによる
in situ オリゴ合成
際立って高いオリゴ合成収率
特異性とTmを考慮した
プローブ設計
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
アジレントマイクロアレイ上には高品質なロングオリゴプローブ60mer（が搭載されている
高精度インクジェットプリンティングにより
長鎖ロングオリゴを直接ガラス基板に合成
bull 高い合成収率 995以上（
bull 高感度高品質高精度
bull スポット抜けがない
bull 高いフレキシビリティ
bull 低シグナルのデータまで正確に検出
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
Oligo Length (mer)
Fra
ctio
n F
ull
Len
gth
(
)
98 cycle yield no depurination
995 cycle yield no depurination
98 cycle yield with depurination
995 cycle yield with depurination
Agilent
Competition
Nucleic Acids Res (2010)
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
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times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
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times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
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times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
44K
19K
G1
アジレントのマイクロアレイフォーマット高密度化とマルチパック化
ScannerC version
Page 17
1M
400K
180K
60K
G3
244K
105K
G2
15K
44K
DNA RNA
CGHCNVCyto
ChIP-on-chipMethylation
GeneExpression
AlternativeSplicing
EmergingApplications(SureSelect)
超長鎖オリゴの新規活用法
オリゴライブラリ
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
プローブ設計の流れヒトマウスラット
Genome sequence
ldquoGene Binrdquo
Transcript Sequences
AB
CTranscript Sequences
D
Consensus Sequences
12
Consensus Sequences3
Refseq Ensembl GenBank mRNA
UniGene RIKEN(mouse)
1
2
3
CandidateProbes
3 コンセンサス配列ごとに3個の候補プローブを作成
4 プローブの検証実験
1 公的データベースからの配列情報をゲノムにアラインしldquoGene Binrdquoを決定
2 各ldquoGene Binrdquoのコンセンサス配列を決定
5最適なプローブを選択
Page 18
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
timesPage 19
生物種 フォーマット
哺乳類鳥類
イヌ Canine 4x44K
イヌ (V2) Canine 4x44K
ウシ Bovine 4x44K
サルRhesusMonkey
4x44K
ブタ (V2) Porcine 4x44K
ウサギ O cuniculus 4x44K
イヌ (V2) C familiaris 4x44K
ウマ E caballus 4x44K
ヒツジ O aries 8x15K
チキン Gallus gallus 4x44K
その他
イネいもち菌 (V2) Magnaporthe 4x44K
酵母 Scerevisiae 8x15K
酵母 Scerevisiae 4x44K
線虫 (V1) C Elegans 4x44K
線虫 (V2) C Elegans 4x44K
大腸菌 E Coli 8x15K
ハマダラ蚊 A gambiae 4x44K
ショウジョウバエ (V2) Drosophila 4x44K
生物種 フォーマット
植物
イネ O Sativa 4x44K
大麦 Barley 4x44K
小麦 Wheat 4x44K
シロイヌナズナ (V3) Arabidopsis 4x44K
シロイヌナズナ (V4) Arabidopsis 4x44K
タバコ N tabacum 4x44K
ダイズ Soybean 4x44K
トウモロコシ Maize 4x44K
トマト Tomato 4x44K
セイヨウアブラナBrassicanapus
4x44K
ワタGossypiumhirsutum
4x44K
タルウマゴヤシMedicagotruncatula
4x44K
両生類魚類
アフリカツメガエルXenopusLaevis
4x44K
ゼブラフィッシュ (V1) Zebrafish 4x44K
ゼブラフィッシュ (V2) Zebrafish 4x44K
タイヨウサケ S Salar 4x44K
cDNAライブラリのシーケンス結果を元にカスタムアレイの作成も可能設計料は無償（
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
ログイン
カスタムマイクロアレイデザイン料無償 １枚から作れる画期的なカスタムアレイ 「eArray」
プローブ選択 フォーマットの選択 アレイの注文
アジレントが設計したプローブを無料で利用可能
１枚からオーダー可能
Probe database
-Gene Expression
-CGH
-ChIP-on-chip
-miRNA
Probe Design
(遺伝子発現のみ)
105K 105
K
244K
44K44K44K44K
15K 15K 15K 15K
15K 15K 15K 15K
ユーザー登録無料
（ご利用約款への同意が必要です）
ご利用可能アプリケーションGene Expression CGH ChIP-on-chip miRNA
1M
400K 400K
180K180K180K180K
60K 60K 60K 60K
60K 60K 60K 60K
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
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times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
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times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
遺伝子発現プローブ設計の流れ事前にプローブ設計の元となるターゲットファイルFASTA形式のトランスクリプト配列リストまたはGenBankのAccessionIDリスト（を1つ用意します
eArrayが行うステップ
設計可不可の判断マスキング プローブの設計 相同性のチェック
プローブの報告
ターゲット配列のインプット(配列あるいはGeneBank ID)
配列のクラスタリング
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
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スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
timesPage 22
遺伝子発現用プローブの設計アルゴリズム
インプットされたターゲット配列
times完全一致の配列は片方からしか設計されません
設計可不可の判断
times
times times
ターゲット配列のクラスタリング95以上相同的な配列は同一情報由来の配列とみなし同じクラスターに分けられます
クラスター1クラスター2
クラスター3その他クラスター分けなし（
クラスター2
その他クラスター分けなし（
相同性のチェッククラスター内は相同性チェックが行われません同じ配列のプローブが設計されてもクロスハイブリコールは出ません（
クラスター1
クラスター3
プローブの設計
クラスター3
ターゲット配列から指定の条件でプローブが設計されますクラスター内では同一プローブが設計されることがあります
クラスター1 クラスター2
その他クラスター分けなし（
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
Page 23
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
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Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
各遺伝子プロファイリング手法の特徴
他社従来の発現マイクロアレイ
新アジレント発現マイクロアレイ
次世代シーケンサデジタル遺伝子発現
遺伝子の網羅性 中～高 高 高
新規の遺伝子 事前に配列情報が必要 前情報必要なし
データ量 KB MB TB
スタートTotal RNA量
50 ng ~ 10 ng ~(真核生物)
1 μg ~
実験時間 2~3 日 15 日 1 週間以上
操作の簡便性 やや煩雑 簡便 煩雑
感度 低 高 高
ダイナミックレンジ 3 log10 5 log10 5 log10
コスト 約 35 万円
サンプル約 100 万円サンプル(必要な読取り深度による)
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
2010年
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times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
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times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
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times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
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Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
アジレント次世代遺伝子発現アレイ低発現から高発現まで検出
bull ５ケタ超にわたる
ダイナミックレンジ
bull 低発現領域をノイズ
と区別して検出
MCF7の遺伝子発現レベルと関連するGeneOntologyカテゴリー TOP5
代謝や生合成関連
転写制御関連
シグナル伝達関連
Page 24
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
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times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
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times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
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times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
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times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
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times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
他社アレイデータとの比較Agilent vs Company N
Agilent 4x44KMAQC A Sample
Company N 12x135KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
-5
0
5
10
15R = 099725 ng
R = 096310 microg
R = 099310 ng
Agilent 8x60KMAQC A Sample
-5 0 5 10 15
-5
0
5
10
15
Agilent data Log2 75th percentile-normalized signalsNimblegen data Log2 quantile normalized signals
アジレント遺伝子発現アレイデータはより少ないtotal RNA量から広いダイナミックレンジのデータを取得可能
Page 25
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
Page 26
Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
３種類の発現マイクロアレイ製品ヒトマウスおよびラット
1 遺伝子発現マイクロアレイ
2 miRNAマイクロアレイ 8x15K 8x60K
3 Exonマイクロアレイ 2x400K 4x180K
mRNAの発現解析 4x44KmRNA+lincRNAの発現解析 8x60K
miRNAの発現解析スプライシングバリアントの検出
スプライシングバリアントの検出
lincRNAはヒトおよびマウスに対応
2010年
New
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Coming soon
Myoblast
(筋芽細胞)
T0 Myotube
(筋管細胞)
T24
Liu Y et al Nucleic Acids Res (2010)
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
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times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
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times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
遺伝子発現マイクロアレイ(8x60K)ヒトマウスラット製品ラインナップ
-より新しい公的データベースに基づきプローブを再設計
(Whole Genome遺伝子発現アレイ4x44k v2のプローブをすべて含みます)
-最少10ngのtotal RNAからスタート可能(推奨25ng以上)
-今話題のlincRNAを搭載(HumanおよびMouse)型番 製品名 参照データベース デザイン内容
G4851ASurePrint G3 Human 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets27958lincRNA7419snoRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4852ASurePrint G3 Mouse 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (April 2009)mRNA from UCSC (April 2009)
Entrezgene targets34017lincRNA4623snoRNA scRNA rRNA miscRNA snRNA pseudo対応プローブ搭載
G4853ASurePrint G3 Rat 遺伝子発現マイクロアレイキット 8times60K
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (October 2008)mRNA from UCSC (January 2009)
Entrez gene targets26930miscRNA pseudo対応プローブ搭載
60K2010
Page 27
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
The Alternative strategyto discover lincRNAs
Ab initio reconstruction approach from RNA-seq data and an unannotated reference genome sequence
Developed a method called ldquoScripturerdquo began with gapped alignments of reads across splice junctions
bull There has been important recent progress including efficient gapped aligners (for example TopHat) that can map short reads that span splice junctions
bull A posteriori approach ie ldquoK4-K36 domainrdquo required stringent criteria eg well separation from the nearest gene locus
Page 28
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
8x60Kフォーマット発現アレイの特別コンテンツlincRNA を追加 (ヒトマウス)
large intervening non-coding RNA
bull 200 nt以上多くは1 kb ～ 10 kb
bull 遺伝子間に存在
bull mRNAと同様に
－RNA polymerase IIにより転写される
－5rsquoキャッピングポリA付加される
bull 哺乳類によく保存されているrarr機能の保持
volume 27 number 4 April 2009 nature biotechnology
GuttmanM etal Nature 458 223-227 (2009)
Low Input Quick Amp kit使用可能mRNAと同時検出
Page 29
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
lincRNAも5logにわたって検出
bull サンプルマウスES細胞
bull lincRNAも5logにわたり高い再現性で検出
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
2アレイで検出されたプローブ
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
All Biological Probesr = 0997
n = 34599
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
pli
cate
3
Five
Lo
gs L
ine
ar D
ynam
ic R
ange
Log2 mES Replicate 1
Log 2
mES
Re
plic
ate
3
lincRNA Probes Onlyr = 0995n = 8947
緑lincRNA対応のプローブ
G3
Mouse
8x60K
Page 30
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
組織特異的に発現するlincRNA
bull 6種のマウスcell lineを使用
bull 2つのlincRNAが脳特異的に発現する遺伝子と同じ挙動を示す
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
lincRNA-1
Brain-Specific mRNA
lincRNA-2
8x60K Microarray Data Visualized with GeneSpring GX 110
Log 2
Mic
roar
ray
Sign
als
qPCR Data lincRNA-1 lincRNA-2
lincRNA-1 lincRNA-2
Brain-SpecificmRNA
Unpublished data courtesy of Guttman et al
G3
Mouse
8x60K
Page 31
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
エピジェネティックな発現制御に関わるlincRNA
bullHOX CのアンチセンスにコードbullPRC2と相互作用し乳がんの転移に関与bullHOTAIRの発現と乳がんの転移予後に相関がみられる
HOTAIR
lincRNA-RoR(lincRNA-ST8SLA3)
GuttmanM etal Nature 464 1071-1076 (2010)
Nature genetics 421113ndash1117(2010)
bullP53を介しiPSの再プログラム化に関与bullOCT4NANOGSOX2によって転写制御
Page 32
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
miRNAマイクロアレイヒトマウスラット製品ラインナップ
miRBaseに登録のあるヒトマウスラット以外の生物もeArrayでカスタムアレイ作成可能
miRBaseの
バージョン160 150 140 120 101 91
miRBase mature
miRNA数1223 1100 904 866 733 470
マイクロアレイComing Soon
8times60K予定（
8times15K
Rel140
(029297)
8times15K
Rel120
(021827)
8times15K
Rel101
(019118)
8times15K Rel91
(016436)
miRBase mature
miRNA数1055 717 710 627 579
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029152)
8times15K
Rel140
(029298)
8times15K
Rel120
(21828)
8times15K
Rel101
(019119)
miRBase mature
miRNA数680 387 388 350 351
マイクロアレイ Coming Soon
8times15K
Rel150
(029200)
8times15K
Rel101
(019159)
Human
Mouse
Rat
Page 33
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
アジレントmiRNA アレイ 独自のプローブデザインmature なmiRNA を選択的に検出
独自の足付きヘアピン付きのプローブデザインによりmature なmiRNA を選択的に検出
Page 34
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
Page 35
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
体液 (血清血漿 etc ) 中の miRNA プロファイリング例マーカーとしての miRNA の可能性PLoS One 20094(5)e5532 Epub 2009 May 14Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patientsTanaka M Oikawa K Takanashi M Kudo M Ohyashiki J Ohyashiki K Kuroda MDepartment of Pathology Tokyo Medical University Tokyo Japan
Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17106(11)4402-7 Epub 2009 Feb 25Circulating microRNAs potential biomarkers for drug-induced liver injuryWang K Zhang S Marzolf B Troisch P Brightman A Hu Z Hood LE Galas DJInstitute for Systems Biology 1441 North 34th Street Seattle WA 98103 USA
Urol Oncol 2009 Apr 16 [Epub ahead of print]A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancerHanke M Hoefig K Merz H Feller AC Kausch I Jocham D Warnecke JM Sczakiel GKompetenzzentrum fuumlr Drug Design und Target Monitoring Luumlbeck Germany Institut fuumlr MolekulareMedizin UK S-H and Universitaumlt zu Luumlbeck Luumlbeck Germany
Silence 2010 Mar 11(1)7microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milkKosaka N Izumi H Sekine K Ochiya TSection for Studies on Metastasis National Cancer Center Research Institute Tokyo Japan
血漿
血清
尿
母乳
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アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
Page 37
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
Page 38
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
Page 43
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
アジレントExon array新登場ヒトマウスラット製品ラインナップ
VeryNEW
400K
180K
bull4x180Kおよびより網羅性の高い2x400Kフォーマット
bullHuman MouseおよびRat対応
bull各Exonあたり1プローブを設計
bull遺伝子発現アレイと共通プローブも搭載
bullランダムプライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて逆転写
Human Mouse Rat
bullRefseq Build 363bullEnsembl Release 52bullUnigene Build 216 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 37bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 176 (April 2009)bullmRNA from UCSC (April 2009)
bullRefseq Build 362bullEnsembl Release 55bullUnigene Build 177 (October 2008)bullmRNA from UCSC (January 2009)
プローブ設計時の参照データベース
Page 36
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Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
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4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
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4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
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RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
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アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
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Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
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times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
Exon マイクロアレイのコンテンツヒトマウスラット製品ラインナップ
SpeciesArray
FormatGenes
TargetedExons Probes
Probes from 8x60K
Databases Used for Design
Human
4x180K 20411 174458 19128 (56) Refseq Build 363 RSNM only
2x400K 27696 233164 26873 (78)
Refseq Build 363Ensembl Release 52Unigene Build 216 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)
Mouse
4x180K 23215 165984 19203 (49) Refseq Build 37 RSNM only
2x400K 33795 235714 31608 (80)
Refseq Build 37Ensembl Release 55Unigene Build 176 (Apr 2009)GenBank mRNA (Apr 2009)RIKEN 3
Rat
4x180K 20483 160141 23444 (50) Refseq Build 362 RSNM only
2x400K 26276 214270 31948 (72)
Refseq Build 362Ensembl Release 55Unigene Build 177 (Oct 2008)GenBank mRNA (Jan 2009)
RSNMRefseqでAccsession IDがNMで始まる遺伝子
2x400Kは4x180Kに比べより多くの遺伝子エクソンをカバー
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times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
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times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
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times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
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times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
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times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
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スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
ng
Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
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Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
アジレントExonアレイ実験フロー
Total RNA
抽出
bullLIQA WT kit
1回の増幅でラベル化
cRNAを調製
totalRNA最低必要量
25ng推奨50ng以上（
NanoDropで濃度純度測定
バイオアナライザ
でRNA品質RIN（を
チェック
ラベル化ハイブリダイ
ゼーションアレイ洗浄 スキャン数値化
約6時間 17時間65 約5分1枚15分全自動
bullAgilentハイブリダイ
ゼーションキット
bullハイブリチャンバ
bullガスケットスライド
初めてでも失敗なく
確実にハイブリダイ
ゼーション
bullAgilent GEmiRNAWash buffer set
洗浄液の調製
必要なし
8枚のスライドグラス
を同時に洗浄可能
bullAgilent スキャナ
bullFeature Extraction
全自動スキャン
全自動数値化
QCレポートを自動作成
真核生物用1色法および2色法に対応しています
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times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
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times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
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times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
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スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
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Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
Low Input Quick Amp WT labeling kit
微量スタートが好評なLIQA(Low Input Quick Amp Labeling kit)がExonアレイにも対応
VeryNEW
マイクロアレイフォーマット 最低必要total RNA量
8x60K 8x15K 4x180K 4x44K 2x105K 2x400K
25ng（推奨50ng以上）
1x244K 1x1M 100ng
bullトランスクリプト全体を逆転写できるようWTプライマーを使用
bull遺伝子発現アレイ使用時とほとんど変わらない操作でラベル化可能
bull1色法および2色法に対応
bull最少25ngのtotal RNAからラベル化可能
Page 39
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
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スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
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g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
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0K
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Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
アジレントExonアレイデータ解析GeneSpring GX 115
遺伝子レベルの発現差解析統計処理Fold change
Exonレベルでのフィルター活用Splicing indexExonレベルでのt-test p-value
既知のトランスクリプト
エクソン上に配置されたプローブ
マイクロアレイデータのプロット
Splicing Index
corrected p-values
バリアントが検出された領域
Page 40
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
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スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
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K 5
0 n
gLo
g R
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AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
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0K
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Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
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Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
発現差スプライスバリアント
検出された遺伝子発現差がスプライシングの違いであることがある遺伝子発現アレイは3rsquo端側の身にプローブが搭載されている)
Evidence
ProbeID
Intensity
Splice index
P-value
Page 41
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
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スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
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SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
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K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
50
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Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
Page 44
Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
3rsquo側の解析だけでは把握できないスプライスバリアントが見えてくる
遺伝子発現が変わっていなくてもエクソンレベルで変わっていることがある
Page 42
スプライスバリアントがある遺伝子の遺伝子レベルのプロット
2サンプル間で発現差がない遺伝子
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
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AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
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Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
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Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
SurePrint G3 Exon マイクロアレイEx
on
2x4
00
K 5
0 n
gLo
g R
atio
AB
TaqManLog Ratio AB
RNA-Seq 1 mgLog Ratio AB
Exo
n 2
x40
0K
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Log
Rat
io A
B
R = 0862M = 0832N = 83647
R = 0949M = 0968N = 654
qRT-PCRやRNA-Seqとも高い相関をもつ
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次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
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Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能
times
次世代シーケンサとマイクロアレイの用途使い分けまとめ
遺伝子発現転写因子と
ゲノムの結合ゲノムの安定性
微細構造変化
次世代シーケンサ新規転写産物探索（eg non-coding
fusion gene）
限定されたサンプルを用いてゲノム全体の mapping
代表ゲノムエピ配列特定領域の
変異探索
高感度アジレントマイクロアレイ
既知のmRNAに加えnon-codingのプロファイリング
簡便で精度よくsplicingを検出
数多くのサンプルを用いて特定領域のマッピング（eg プロモータ
領域 CGIs）
数多くのサンプルを用いてゲノム全体の微細構造変化を評価（ゲノム品質管理分子
karyotype aCGH）
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Microarrays are still stable practical and feasible which is very
useful for most biological researchers
新しいアジレント遺伝子発現マイクロアレイシステムは少ないサンプル量簡便な実験低コストで広いダイナミックの遺伝子プロファイリングが可能