ピーク分離がもたらす、特異性・選択性・定量性日 …...— you can also search...

UPLC/HDMSEを用いた次世代のリピドミクスUPLC/HDMSEを用いた次世代のリピドミクス-ピーク分離がもたらす、特異性・選択性・定量性-

日本ウォーターズ株式会社

第6回メタボロームシンポジウム

ランチョンセミナー12:30-13:30ランチョンセミナ 12:30 13:30

©2011 Nihon Waters K.K. 1

本日の内容本日の内容

Lipidomics 分析技術の現状

UPLC-ESI/MSE を用いた網羅的脂質バイオマーカー探索ワークフロー

— 試料の調製

包括的か高品質デタセトの取得— 包括的かつ高品質データセットの取得

— 脂質情報の抽出

— 脂質の同定脂質の同定

— 報告書の作成

イオンモビリティの活用：UPLC/HDMSE


Lipidomics 分析技術の現状p 分析技


Lipidomics とは? Lipidomics とは?

タンパク質タンパク質代謝物代謝物

http://www.lipidprofiles.com p // p p

(単離) (分析) (パスウェイ解析) (脂質-タンパク相互作用)



従来の脂質測定方法:


TLC (60-70s)— Silver nitrate TLC と silver-ion chromatography

G h t h (GC) Gas chromatography (GC)— 誘導体化や加水分解してフリーの脂肪酸にして測定

HPLC— プレまたはポストカラム誘導体化による UV あるいは蛍光検出

— ELSD

従来法の欠点: 誘導体化に時間がかかる

誘導体化反応に危険性を伴う（ジアゾメタンなど）

多く存在する類似分子の分離に限界がある


Lipidomics 分析技術の現状Lipidomics 分析技術の現状

Separation in Separation in m/z by MSESItime by LC Detector

Mass Analyze Quadrupole MS, TOFInfusion Intrasource

separation

(LC)-MSの利点: 誘導体化の必要が無い誘導体要

構造情報が得られる

高感度化 (nmol-pmol)?


多くの類似成分が含まれていても分離可能

高いスループット

UPLC-ESI/MSE を用いた

網羅的脂質バイオマーカー探索ワークフロー網羅質探


Waters Lipidomics バイオマーカー探索Waters Lipidomics バイオマカ探索

試料の調製

包括的かつ高品質データセットの取得高品質デタセットの取得

脂質情報の抽出

脂質の同定

報告書の作成



試料の調製



脂質の同定

報告書の作成


試料の調製試料の調製

抽出ホモジナイズ



試料の調製



脂質の同定

報告書の作成


Direct Infusion vs UPLCDirect Infusion vs. UPLC

試料の導入

— Direct infusion と Liquid Chromatography?

Direct infusion LC/UPLC

逆相系 UPLC を用いた複雑な脂質試料分析で、


高速・高再現性・堅牢性を示す事が可能か？

LC および MS 条件LC および MS 条件

LC conditions— LC System: Waters® ACQUITY UPLC

— Column: ACQUITY CSH C18, 1.7µm, 2.1 x 100 mm

— Column temp: 55 ºC

— Flow rate: 400 µL/min

— Injection volume: 5 µL

— Mobile phase A: ACN/H2O (60/40) in 10 mM Ammonium formate

M bil h B ACN/IPA (10/90) i 10 M A i f— Mobile phase B: ACN/IPA (10/90) in 10 mM Ammonium formate

— Gradient: 40-99% B in 18 min and 2 min 40% B equilibration

E MSE conditions — MS System: Waters SYNAPT G2

— Ionization: ESI positive and negative

— Capillary voltage: 2.0 kV (+Ve) and 1.0 kV (-Ve)

— Cone voltage: 30 V

— Trap CE Ramp 30-40 (+Ve) and Ramp 30-50 (-Ve)


— Acquisition range: 50-1200 m/z

Charged Surface Hybrid (CSH) TechnologyTechnology


UPLC/MSE 肝抽出試料UPLC/MS 肝抽出試料

2 測定, トータル ~40 分の測定で表示された全クラスの脂質が測定可能

PC, SM, PG, PE ChoE & TG

同じ情報を direct infusion で行う場合、30 分以上かかる

ChoE & TG

LysophospholipidsSM & DG

FFA

PC SM PG PI PS PEPC, SM, PG, PI, PS, PE


再現性0 1mg/mL 肝抽出試料0.1mg/mL 肝抽出試料

20測定の再現性


Direct infusion とスループットDirect infusion とスルプット

~30 min (PI)~30 min (PI)

55 i (DAG d TAG)~55 min (DAG and TAG)


Direct Infusion Vs UPLCDirect Infusion Vs. UPLC

試料の導入

— Direct infusion と Liquid Chromatography?

Direct infusion UPLC


LC/MSE すべてのプレカーサー及びプロダクトイオンに保持時間及び強度の情報を付加する保持時間及び強度の情報を付加する

検出されたすべてのピークのフラグメ

ントイオンを記録

プレカーサーイオンとフラグメントイオプレカサイオンとフラグメントイオ

ンの保持時間とピーク強度を記録


LC/MSE 測定例：変形性関節症患者血漿中の脂質バイオマーカー探索脂質バイオマカ探索


J. Proteome Res., 2010, 9 (5), pp 2377–2389

LC/MSE 測定例：変形性関節症患者血漿中の脂質バイオマーカー探索脂質バイオマカ探索

PC、ポジティブモード


J. Proteome Res., 2010, 9 (5), pp 2377–2389


試料の調製



脂質の同定

報告書の作成


MSE Data ViewerGeneral Layout and functionsGeneral Layout and functions

Filters for LE componentsTable and component

低および高エネルギースペクトルデータを保持時間で紐付け

Component Peaks displayed

view updated when filter(s) applied

as processed chromatogram(EMRT view)

Low Energy Data for selected component.Red is selected component blue Red is selected component, blue are components that have RT apex within window specified in ‘Association Param’ e.g, isotopes, in source frag, dimers etc.

LE and HE component tablesCan be sorted by clicked title of each column. Colours same as for

High Energy Data.Components from HE data that have same apex as selected LE component (within the RT window

ifi d)

Filters for HE componentsTable view updated when filter(s) applied

component Peak Display


specified)

MSE Data Viewer Product Ion Discovery - PIDProduct Ion Discovery PID

Clicking this icon shows all HE components regardless of RT. Clicking again returns HE components to RT aligned only


MSE Data Viewer Product Ion Discovery - PIDProduct Ion Discovery PID

共通のプロダクトイオンを持つピクを抽出

B l i HE

持つピークを抽出

By selecting a HE component (either from table or HE spectrum) you can perform Product Ion discovery type analysis

LE spectrum is replaced with component view (RT vs. Inten). LE components that RT align with the HE components below are shown. Here two LE components (311.08 and 215.04) have fragments with mass 156.0772±0.1 Da.

HE spectrum is replaced with component view (RT vs. Inten). Components within mass tolerence (Association Param) of selected fragment are shown. Similar to mass window in MassLynxChromatogram


Chromatogram

MSE Data Viewer Neutral Loss - NLNeutral Loss NL

Data can be investigated to look for neutral losses. User can specify any m/z loss of interest and mass tolerence.


MSE Data Viewer Neutral Loss - NLNeutral Loss NL

共通のニュートラルロスを持つピクを抽出持つピークを抽出

All data Component view is replaced with LE ions that have aligned HE components which correspond to specified NL.Here 6 LE components (472.32, 558.36, 576.37, 556.27, 281.15 and 152.07) show a NL of 18Da (H2O)

HE and LE spectra are shown for component selected.


MSE Data ViewerMS Data Viewer

更なる解析のためにテキストファイルをエクスポート可能（pkl、txt）



試料の調製



脂質の同定

報告書の作成


lipidomics 解析ソフトウエアLipid MAPSLipid MAPS

LipidMAPS (代謝物と代謝経路解析)p (代物代路解 )

Web ベースで、プリカーサーイオンサーチのみ

©2011 Nihon Waters K.K. 30http://www.lipidmaps.org

lipidomics 解析ソフトウエアLipid MAPSLipid MAPS

マニュアル解析

フラグメントイオンはトイオンは

考慮されない

多くの異性体が同定される

レポート形式が制限される


http://www.lipidmaps.org

制限される

lipidomics 解析ソフトウエアSimLipidSimLipid


SimLipidMSEに対応MS に対応


SimLipid FeaturesSimLipid Features

Robust Lipid Structure Database8 lipid categories 21905 lipid species— 8 lipid categories 、21905 lipid species

— Other database links ：KEGG, HMDBCEBI, PubChem Substance database, LIPIDBANK, and LIPIDAT

High Throughput MS Lipid Searchg g p p— searching lipid precursor ion against the known lipid structures— high resolution data

MS lipid search results include:— Experimental m/z, Theoretical m/z, Delta Mass, Intensity, Lipid Category,

Abbreviations, Ion Type, Lipid Structure, Lipid Information High throughput Lipid Structural Elucidation using MS/MS and

MSE data DataMS data Data High Throughput Isotopic Peak Correction of Lipid MS Data Mass Spectra Annotation with Identified Lipids Generate ReportGenerate Report

— The user can generate a comprehensive Database Search

— You can also search for a lipid structure of interest by lipid


abbreviation/common name, mass, chemical composition or lipid ID.


試料の調製



脂質の同定

報告書の作成


SimLipid多彩な報告書式多彩な報告書式


Waters Lipidomics バイオマーカー探索のまとめまとめ

UPLC-MSE データの測定

複数の試料を比較比較?Yes

MALDI データの測定

精密質量保持時間ドリト時間

No多変量解析（PCA）

報告分布（イメージング）

m/z , RT のリストをアウトプット

精密質量、保持時間、ドリフト時間、同位体パターン、プロダクトイオンから

成分を同定

マーカー候補を

インポート

報告

更なる MSE

フラグメントイオン解析

報告構造. スペクトルの注釈,

クロマトグラム etc.

自動 TAP 分析

自動 MS/MSUPLC-TQ データ測定


報告相対定量

自動 TAP 分析

De novo

既知化合物のターゲット定量(Quanpedia)

イオンモビリティの活用

UPLC/HDMSE/


IMSの基礎装置のタイプ装置のタイプ

IMS分類

— Drift-time mobility spectrometry（DTIMS）b)T wave IMS(TWIMS)a)Conventional DTIMS*1

Driving Field E

b)T-wave IMS(TWIMS)a)Conventional DTIMS*1

— Differential-mobility spectrometry（DMS）

*1:Clemmer et al [1997]

c)FAIMS*2


*1:Clemmer et al. [1997] *2:http://www.faims.com/index.htm

SYNAPT G2-S GeometrySYNAPT G2 S Geometry

1.Trap T-Waveにイオンを蓄積

4.Transfer T-WaveでIMST-waveから出てきたイオンをにイオンを蓄積

2.IMS T-Waveにイオンを放出

3.IMS T-WaveでMobility分離(同時にTrapにイオンを蓄積)

TOFに輸送


蓄積)

イオンモビリティによる分離低分子ペプチド脂質低分子、ペプチド、脂質


Biochim Biophys Acta. 2011 Jun 24. [Epub ahead of print]Lipid analysis and lipidomics by structurally selective ion mobility-mass spectrometry.Kliman M, May JC, McLean JA.

イオンモビリティによる分離脂質脂質


Biochim Biophys Acta. 2011 Jun 24. [Epub ahead of print]Lipid analysis and lipidomics by structurally selective ion mobility-mass spectrometry.Kliman M, May JC, McLean JA.

イオンモビリティによる分離/脂質フォスファチジルコリン飽和及び不飽和脂肪酸飽和及び不飽和脂肪酸

(a)Plot of drift time of saturated ( )phosphatidylcholine (PC) cations in a traveling wave ion mobility spectrometer vs ion mass

(b) Plot of drift time of PC cations (b) Plot of drift time of PC cations spanning the mass range of 700-800 Da in a traveling wave ion mobility spectrometer vs ion massy p

MD simulated structures

©2011 Nihon Waters K.K. 45Anal. Chem. 2009, 81, 8289–8297

LCとイオンモビリティで脂質を分離UPLC/HDMSE UPLC/HDMS

Ion mobility


LCとイオンモビリティで脂質を分離UPLC/HDMSE UPLC/HDMS

すべての検出されたピークに対して、保持時間、ドリフトタイム、プレカーサーとプロ

ダクトイオンのピーク強度、精密質量のm/zが記録される

これらの情報をすべて用いることにより、詳細で確実な脂質の同定が可能になる

さらにイオンモビリテ分離は強度が低いイオンのスペクトルの質を向上させるさらにイオンモビリティ分離は、強度が低いイオンのスペクトルの質を向上させる

Processed, RT ONLYLow Energy Spectrum

Processed, RT & DTLow Energy Spectrum

Processed, RT ONLYElevated Energy

SpectrumProcessed, RT & DTElevated Energy

Spectrum


本日のまとめ本日のまとめ


— ESI/MSが主流になっており、Direct InfusionとLC/MSの手法

UPLC-ESI/MSE を用いた網羅的脂質バイオマーカー探索ワークフロー

UPLCを用いることにより網羅的な脂質の測定が I f i と同等の速度で可能— UPLCを用いることにより、網羅的な脂質の測定が、Infusionと同等の速度で可能

— UPLC/MSE法は、網羅的に同定情報と定量情報を記録できる

— MSE Data Viewerにより、ピーク及びスペクトル抽出、PID（共通のプロダクト）及MS Data Viewerにより、ピク及びスペクトル抽出、PID（共通のプロダクト）及

びNL（ニュートラルロス）解析

— SimLipidは、MSEデータをもとに脂質を同定

イオンモビリティの活用：UPLC/HDMSE

— 構造に由来する衝突断面積を測定し、イオンを分離

— より詳細で高感度な測定が可能に— より詳細で、高感度な測定が可能に


Waters および ACQUITY UPLC、UPLC、SYNAPT、HDMSは、Waters Corporation の登録商標です。

CSH および The Science of What’s Possible は Waters Corporation の商標です。

その他すべての登録商標はそれぞれの所有者に帰属します。


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