생물전기화학시스템을 이용한 염화에틸렌의 생물학적 탈염소화의 다양한...

大韓環境工學會誌論文 - Original Paper 304~311. 2012

† Corresponding author E-mail: [email protected] Tel: 051-510-2465 Fax: 051-514-9574

생물전기화학시스템을 이용한 염화에틸렌의 생물학적 탈염소화

Biological Dechlorination of Chlorinated Ethylenes by Using Bioelectrochemical System

유재철․박영현․선지윤․홍성숙․조순자․이태호†

Jaecheul Yu․Younghyun Park․Jiyun Seon․Seongsuk Hong․Sunja Cho․Taeho Lee†

부산대학교 사회환경시스템공학부

School of Civil and Environmental Engineering, Pusan National University

(2012년 4월 17일 접수, 2012년 5월 29일 채택)

Abstract : Chlorinated ethylenes such as perchloroethylene (PCE) and trichloroethylene (TCE) are widely used as industrial solvents and degreasing agents. Because of improper handling, these highly toxic chlorinated ethylenes have been often detected from con-taminated soils and groundwater. Biological PCE dechlorination activities were tested in bacterial cultures inoculated with 10 diffe-rent environmental samples from sediments, sludges, soils, and groundwater. Of these, the sediment using culture (SE 2) was selected and used for establishing an efficient PCE dechlorinating enrichment culture since it showed the highest activity of dechlorination. The cathode chamber of bioelectrochemical system (BES) was inoculated with the enrichment culture and the system with a cathode polarized at -500 mV (Vs Ag/AgCl) was operated under fed-batch mode. PCE was dechlorinated to ethylene via TCE, cis-dichloroe-thylene, and vinyl chloride. Microbial community analysis with polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) showed that the microbial community in the enrichment culture was significantly changed during the bio-electroche-mical PCE dechlorination in the BES. The communities of suspended-growth bacteria and attached-growth bacteria on the cathode surface are also quite different from each other, indicating that there were some differences in their mechanisms receiving electrons from electrode for PCE dechlorination. Further detailed research to investigate electron transfer mechanism would make the bio- elctrochemical dechlorination technique greatly useful for bioremediation of soil and groundwater contaminated with chlorinated ethylenes.Key Words : Bioelectrochemical System, Chlorinated Ethylene, Dechlorination, Microbial Community

요약 : 산업용제로 널리 이용되고 있는 PCE (Perchloroethylene)나 TCE (Trichloroethylene)와 같은 염화에틸렌화합물은 안정된 세정력을 가지고 있어 널리 이용되고 있지만 무분별한 사용과 부주의한 취급으로 인해 최근 토양 및 지하수 오염지역이 늘어

나고 있다. 본 연구에서는 퇴적토, 슬러지, 토양, 지하수 등 다양한 지역에서 총 10개의 시료를 식종원으로 이용하여 생물학적 PCE 탈염소화 가능성을 평가하고, 가장 우수한 탈염소화 능력을 보인 낙동강 퇴적토 시료를 대상으로 PCE를 에틸렌까지 안정적으로 탈염소화 가능한 혼합미생물을 농화배양하였다. 농화배양된 탈염소화 미생물을 생물전기화학시스템(Bioelectrochemical System, BES)의 환원부에 식종하여 전극을 전자공급원으로 이용한 탈염소화 가능성을 평가한 결과, PCE가 TCE, cis-dichloro-ethylene, vinyl chloride를 거쳐 최종산물인 에틸렌으로 탈염소화됨을 확인할 수 있었다. Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE)를 이용한 미생물군집 분석결과, 농화배양액에서 구축된 탈염소 미생물 군집과 BES 환원전극부내 미생물 군집 구조는 다르게 나타났으며, 전기화학적 활성을 지닌 다양한 미생물이 존재함을 확인할 수 있었다. BES 환원전극부에서 부유성장하는 미생물과 전극에 생물막을 형성하는 미생물 군집구조에도 큰 차이가 있었으며, 이는 탈염소화 메커니즘의 차이에 기인하는 것으로 판단된다. 추가적인 연구를 통해서 자세한 생물전기화학적 탈염소화 메커니즘을 밝혀낸다면 생물전기화학적 탈염소화 기술은 염화에틸렌 오염 토양/지하수의 획기적인 생물정화기술로 자리잡게 될 것이다.주제어 : 미생물군집, 생물전기화학시스템, 염화에틸렌화합물, 탈염소

1. 서 론

퍼클로로에틸렌(Perchloroethylene; PCE)이나 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene; TCE)과 같은 염화에틸렌화합물은 섬유산업의 드라이클리닝 용제, 기기․금속생산업의 세정용제, 컴퓨터용 IC기반 세정용제, PVC생산을 위한 원료나 화학합성산업의 반응매개물 등으로 널리 사용되어 왔다. 하지만 자연계에서 쉽게 분해되지 않으며 발암 위험성을 지니고 있어

전 세계적으로 염화에틸렌화합물에 대한 규제가 실시되고

있다. 국내에서도 폐수배출기준과 먹는 물 수질기준을 통해

염화에틸렌화합물을 규제하고 있지만, 환경부의 조사결과에 의하면 2004년 이후로 염화에틸렌화합물에 의해 오염된 지하수의 수가 계속적으로 증가하고 있다고 한다. 또한, 2008년 지하수 수질측정 결과 기준치를 초과한 지하수 중 13%에 해당하는 44개 지점이 염화에틸렌 화합물에 의해 오염된 것으로 나타나 국내에서도 염화에틸렌화합물에 대한 지하수 오

염이 심각한 것으로 보고되었다.1)

염화에틸렌화합물에 의해 오염된 폐수 또는 지하수의 정

화기술로서 많은 물리화학적 방법들이 개발되어 왔으나, 현재로는 혐기성 미생물에 의한 환원적 탈염소화반응을 이용

305大韓環境工學會誌論文생물전기화학시스템을 이용한 염화에틸렌의 생물학적 탈염소화

대한환경공학회지 제34권 제5호 2012년 5월

하는 것이 가장 경제적인 정화방법의 하나로 고려되고 있다. 혐기성 상태에서 탈염소화미생물은 염화에틸렌화합물을 전

자수용체로 이용하는 환원반응에 의해 단계적으로 PCE, TCE, 시스-디클로로에틸렌(cis-dichloroethylene, cis-DCE), 비닐클로라이드(vinyl chloride, VC)를 거쳐 에틸렌(ethylene, ETH)까지 탈염소화 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 PCE의 완전한 탈염소화반응은 Dehalococcides spp.나 혼합미생물 군집에서만 확인할 수 있으며, 일반적인 경우에는 탈염소화가 진행될수록 생성된 중간대사물의 탈염소화 속도가

감소하여, cis-DCE 또는 VC를 축적하는 것으로 보고되어 있다.2,3)

탈염소화미생물들은 염화에틸렌화합물을 탈염소화하는 과

정에서 이들을 전자수용체로 이용하여 성장할 수 있으며, 메탄올, 락테이트, 아세테이트 등의 다양한 유기물들이 전자공여체로 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다.4) 그러나, 수소 또는 발효에 의해 수소를 방출하는 유기물을 전자수용체로

사용하여 염화에틸렌 화합물 오염 지하수를 생물학적으로

처리하고자 할 경우, 수소를 이용하는 황환원미생물, 메탄생성균, 아세트산 생성균들과 경쟁이 발생한다. 그리고 유기물의 다양한 발효산물은 지하수의 또 다른 오염물이 되며, 이들을 분해하는 미생물들의 과다한 성장을 초래하여 지하수

의 흐름을 방해하는 것으로 알려져 있다.5)

이러한 문제점들을 극복할 수 있는 방안으로 최근에는 전

극에서 발생되는 전자에 의해 전자매개체를 환원시키고 이

들을 인위적인 전자공여체로 사용함으로써 미생물의 혐기

성 호흡을 지원하는 방법이 소개되었다. 탈염소화 미생물인 Dehalococcides ethenogenes Strain 195는 화학적으로 환원된 methyl viologen (MV)을 인위적인 전자공여체로 사용하여 TCE를 환원할 수 있다고 보고되었다.4) 최근에는 Dehalo-coccides spp.를 포함하는 혼합미생물이 전극을 직접적인 전자공여체로 사용하여 TCE를 환원적으로 탈염소화 할 수 있다고 보고되었다.6) 생물전기화학적 PCE 탈염소화의 경우, Gregory et al7) 의해 Geobacter sp.가 전극을 전자공여체로 사용하여 PCE를 cis-DCE까지 탈염소화가능하다고 보고된 바 있다. 하지만, 생물전기화학시스템(Bioelectrochemical sys-tem, BES)내에서 전극을 전자공여체로 사용하여 PCE를 ETH 까지 탈염소화한 연구는 아직까지 보고되지 않았으며, 어떠한 미생물들이 전극을 전자공여체로 이용한 PCE의 탈염소화에 관여하는지도 조사되지 않았다.

본 연구에서는 다양한 환경시료를 대상으로 PCE 탈염소화 활성을 조사하고, 가장 높은 탈염소화 활성을 나타낸 시료를 식종원으로 사용하여, PCE에서 ETH까지 탈염소화 가능한 우수한 탈염소화 미생물을 농화배양 하였다. BES의 환원전극부에 구축한 탈염소화 미생물 농화배양액을 식종하고, 전극을 전자공여체로 활용하는 탈염소미생물에 의한 PCE의 탈염소화에 대해 평가하였다. 또한, Polymerase Chain Reaction- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) 기법을 사용하여 생물전기화학적 탈염소화에 관여하는 미생물군집

을 분석하였다.

2. 실험재료 및 방법

2.1. 다양한 환경시료의 PCE 탈염소화 활성 조사

다양한 환경시료의 PCE 탈염소화 활성을 조사하고, 우수한 탈염소화 미생물을 농화 배양하기 위하여 퇴적토, 슬러지, 토양, 오염지하수 등 다양한 지역에서 총 10개의 시료를 채취하였다(Table 1). 퇴적토는 각기 다른 지역의 낙동강 퇴적토(SE1, SE2)와 부산대학교내 계곡의 퇴적토(SE3)를 사용하였다. 슬러지는 부산시 수영 하수처리장의 호기조 반송슬러지(AS1) 및 혐기조 소화슬러지(AS2)와 실험실 규모의 A2O 공정 반송 슬러지(AS3)를 채취하여 사용하였다. 토양은 주유소 주변(SO1), 폐정비소 지역(SO2)에서 채취하였으며, 각각 지하 10 cm 깊이의 토양을 채취하였다. 지하수는 염화에틸렌 오염지역으로 알려진 강원도 2개 지역의 지하수(GW1, GW2)를 채취하여 사용하였다.

다양한 환경에서 채취한 식종원의 탈염소화 활성을 비교

하기 위하여, 멸균된 50 mL 용량의 회분식 유리 배양용기에 멸균한 혐기성 액상 배지 29 mL를 주입한 후, 여러 지역에서 수집한 시료별로 토양 및 퇴적토의 경우에는 1 g, 슬러지 및 지하수는 1 mL씩 각각 첨가하였다(Fig. 1). 실험에 사용된

Table 1. Inoculum source sites for PCE dechlorination activity test

Name Characteristics Site

SE1 Sediment Nakdong river - Dunjeo island

SE2 Sediment Nakdong river - Deadong floodgate

SE3 Sediment Stream in Pusan National University

AS1 SludgeAnaerobic digestion tank(Busan S sewage treatment plant)

AS2 SludgeReturn sludge to aeration tank(Busan S sewage treatment plant)

AS3 Sludge Anoxic tank of Lab-scale A2O Process

SO1 Soil Gasoline stand

SO2 Soil Car maintenance shop

GW1 Groundwater Gangwon province contaminated site

GW2 Groundwater Gangwon province contaminated site

Fig. 1. Schematic diagram of PCE dechlorination activity test using bacterial cultures with various inoculum sources.

306 大韓環境工學會誌論文유재철․박영현․선지윤․홍성숙․조순자․이태호

Journal of KSEE Vol.34, No.5 May, 2012

배양배지의 조성은 다음과 같다; KH2PO4 7.0 g/L, K2HPO4 2.0 g/L, MgSO4․7H2O 0.1 g/L, 효모추출물 1.0 g/L, 피루브산(pyruvate) 4.0 g/L, 구연산(citrate) 0.5 g/L, resazurin 100 µL/L. 배지의 구성성분 가운데 피루브산과 구연산은 탄소원 및 전자공여체로 공급하였으며, resazurin은 혐기성 상태를 판별하는 지시약으로 사용하였다. 배양배지의 pH는 2.0 N NaOH를 사용하여 pH 7로 조정하였다. 배양용기의 내부는 99.9%의 질소 가스를 10분간 주입하여 치환함으로써 혐기성 상태를 조성하였으며, 배양용기는 테플론 재질의 고무마개와 알루미늄 뚜껑으로 밀폐하였다. PCE는 미량 액상 실린지를 이용하여 최종농도 80 µm(약 15 mg/L)이 되도록 주입하였으며, 35℃ 배양기 내에서 정치 배양하며 3~5일 간격으로 PCE의 농도를 측정하였다.

2.2. 탈염소화 미생물 농화배양

탈염소화 활성을 평가한 후 가장 우수한 탈염소화 능력을

나타낸 시료(SE-2)의 배양액 1 mL를 새로운 배지 29 mL에 옮기고, PCE의 최종농도가 80 µm(약 15 mg/L)이 되도록 주입하여 상기 배양과정을 수차례 반복하였다. PCE의 탈염소화 활성이 안정화 되었을 때(즉, 주입한 PCE를 1주일 이내에 분해), 배양액 전량을 5 L 용량의 배양배지를 함유한 원통형 유리 대형배양용기에 옮기고 주입한 PCE의 분해를 확인하였다. 그리고, 배양액의 2/3을 약 1주 간격으로 새로운 배지로 교체하는 PCE 탈염소화 미생물의 농화배양을 수행하였다. 대형배양용기 또한 35℃를 유기하였으며, 3일 간격으로 PCE의 농도를 측정하였다. 이후 모든 실험은 대형 농화배양기에서 배양액의 일부를 필요한 양만큼 분취하여 수행하였다.

2.3. 생물전기화학시스템 및 운전조건

대형배양기에서 농화배양한 탈염소화 미생물을 BES의 환원전극부에 주입하고, 전위를 공급하여 생물전기화학적인 PCE 탈염소화 가능성을 평가하였다. BES는 산화전극부와 환원전극부에 기체 및 액체 시료 채취를 위한 가지관이 부착

된 H 형태를 사용하였으며, 산화 및 환원전극부의 부피는 각각 330 mL이었다(Fig. 2). 흑연직물(graphite felt)을 산화전극(3 × 4 cm)과 환원전극(3 × 4 cm)으로 사용하였으며, 분리막

Fig. 2. A photograph of bioelectrochemical system used in this study.

(3 × 4 cm)은 양이온교환막(Nafion 117, dupont Co., USA)을 사용하였다.

농화배양된 미생물 300 mL를 분취하고 잔류하는 탄소원과 탈염소화 산물의 영향을 없애고자 100 mM의 인산완충액으로 3회 세척하였다. 세척한 미생물균체를 원심분리(4,000 rpm 10분)로 회수한 후, 탄소원과 효모추출액을 제외한 배양배지에 다시 부유시켜, BES의 환원전극부에 주입하였다. BES의 산화전극부에도 농화배양에 이용된 배지에서 유기탄소원과 효모추출액을 제외하고 NaHCO3 50 mM를 무기탄소원으로 첨가한 액상배지를 300 mL 주입하였다. 전원공급장치(ITECH Triple Output DC Power Supply)를 사용하여 환원전극부에 약 -500 mV (Ag/AgCl)의 전위를 공급하였으며, PCE를 최종농도 80 µM이 되도록 주입하여 탈염소화 과정을 관찰하였다. 실험은 회분식으로 3회 반복 수행되었으며, 대조군으로써 탈염소화 미생물 농화배양액을 주입하지 않은 BES를 함께 운전하였다.

2.4. 가스크로마토그래피 분석 조건

반응기 내의 염화에틸렌 화합물은 유리 주사기(gastight syringe)를 이용하여 반응기 내부 가스 300 µL를 취하여 FID (Flame Ionization Detector) 검출기가 설치된 가스크로마토그래피(M600D, YoungLin Instrument Co. Ltd., Korea)를 이용하여 분석하였다. 주입구(Injector), 검출기(Detector), 온도는 각각 260℃, 290℃으로 설정하였으며, 오븐(Oven) 온도는 40℃에서 2분간 머무른 후, 승온률 10℃/분으로 설정하여 60℃에서 2.5분 머무르고, 승온률 15℃/분으로 설정하여 130℃에서 3분간 머무르게 설정하였다. 운반 가스는 헬륨(99.99%)가스를, 점화 가스는 공기와 수소를 사용하였다. 각각의 염소계 지방족 화합물들은 N.N-dimethylformamide 용액에 정량 농도만큼 임의 지정하여 가스크로마토그래피에

의해 검출된 체류시간(retention time)과 peak area에 따라 표준을 정하였다.

2.5. 분자생물학적 분석 방법

각 환경시료를 식종원으로 사용하여 3회에 걸쳐 PCE 탈염소화 활성을 평가한 미생물배양액을 대상으로 PCE를 ETH까지 완전히 탈염소화하는 미생물로 알려진 Dehalococcoides sp.의 존재여부를 확인하였다. 우선 각 환경시료의 배양액 1 mL를 분취하여 PowerSoilTM DNA extraction kit (MoBio Labs, Carlsbad, CA, USA)로 DNA를 추출하여 정제하였으며, 정제된 DNA로부터 진정세균의 16S rRNA 염기서열을 증폭하기 위하여 Eub 8F/1392R primer를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 실시하였다.8,9) PCR 산물은 1% agarose gel에 전기영동 후 ethidium bromide (0.5 mg/L) 로 염색하여 확인하였으며, PCR 정제 키트(Solgent Co., Ko-rea)를 사용하여 정제하였다. 두 번째 단계로서, 증폭된 진정세균의 16S rRNA 염기서열을 template로 사용하고 Dehal-ococcoides sp.의 16S rRNA 부분 염기서열을 증폭시키기



Table 2. PCR primers used in this study

Primer Target Sequence (5' - 3') References

Eub 8F Eubacteria AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG Weisburg et al13)

Eub 1392R Eubacteria ACG GGC GGT GTG TAC AAG Nishimura et al14)

Eub 341F (GC)* 16S rRNA gene (V3 region) CCT ACG GGA GGC AGC AG Muyzer et al15)

Eub 518R 16S rRNA gene (V3 region) ATT ACC GCG GCT GCT GG Muyzer et al15)

Deh F Dehalococcoides spp. AAG GCG GTT TTC TAG GTT GTC AC Loffler et al16)

Deh R Dehalococcoides spp. CGT TTC GCG GGG CAG TCT Loffler et al16)

* The GC was attached to Eub 341F primer for DGGE; GC : 5'- CGC CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GC - 3'

Table 3. PCR conditions used in this study

Primer PCR condition

Eub 8F/1392R9 min 95℃, followed 30 cycle of 1 min at 95℃, 1 min 53℃, 2 min 72℃ followed by a 10 min final extension at 72℃

Eub 341F (GC)*/518R

9 min 95℃, followed 35 cycle of 1 min at 95℃, 1 min 55℃, 2 min 72℃ followed by a 10 min final extension at 72℃

Deh F/R9 min 93℃, followed 30 cycle of 1 min at 92℃, 1 min 55℃, 2 min 72℃ followed by a 10 min final extension at 72℃

* GC clamp: 5'- CGC CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GC - 3'

위한 Def F/R primer를 이용하여, nested PCR을 실시하였다. 사용한 primer의 염기서열과 PCR 조건은 Table 2, 3에 정리하였다. PCR산물의 확인과 정제는 상기 방법과 동일하였다.

한편, BES 환원전극부에 존재하는 미생물군집을 관찰하기 위하여, 운전종료 후 부유성장 미생물과 부착성장 미생물을 각각 채취하였다. 채취된 시료의 DNA는 PowerSoilTM DNA extraction kit (MoBio Labs, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출하였으며, 추출된 DNA로부터 진정세균의 16S rRNA 부분염기서열을 증폭하기 위한 Eub 8F/1392R primer 를 사용하여 1차 PCR을 실시하였다. 이후, DGGE를 위해서, GC clamp가 부착된 Eub 341F와 Eub 518R을 사용하여, nes-ted-PCR을 실시하였다. 각 primer의 염기서열과 primer 종류에 따른 PCR 조건은 Table 2와 3에 정리하였다. 위에서 설명한 방법으로 PCR 산물을 확인하고 정제 후, PCR산물 40 ng/mL를 DGGE에 사용하였다.

30~60%(변성제 농도 100%는 7 M Urea와 40% forma-mide)의 농도구배가 있는 acyrlamide gel을 제조하여 사용하여 DGGE를 실시하였다. PCR 산물을 겔에 주입한 후 D-code system (model 475 Gradient delivery system, Bio-Rad lavo-ratories, Inc., USA)를 이용해서 20 V에서 15분간, 200 V에서 6시간 동안 60℃에서 전기영동을 수행하였다.8,9) DGGE 밴드는 UV trans illuminator (UVitec gel documentation sys-tem, Cambridge, UK)를 이용해서 확인하였다. 그리고 Finger-printing Informatix II (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA)를 이용해 각 밴드의 명도를 확인하였으며, SPSS 14.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용해서 주성분분석(Principle Com-ponents Analysis; PCA)분석을 실시하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 다양한 환경시료의 PCE 탈염소화 활성 평가

퇴적토, 슬러지, 토양, 오염지하수 등 다양한 환경시료에 존재하는 미생물에 의한 PCE 탈염소화 활성을 평가한 결과, 배양 60일 이후에는 모든 환경시료에서 PCE가 검출되지 않았다. 따라서 일반적인 자연환경에 탈염소화 미생물이 널리 존재하는 것으로 판단된다. 총 3회에 걸쳐 PCE 탈염소화 실험을 회분식으로 반복한 결과, 식종원의 종류에 따라서 탈염소화 속도에 차이가 났다(Table 4). 전체적인 분해 경향을 살펴보면, 하천퇴적토와 혐기성슬러지를 식종원으로 이용한 경우에 상대적으로 빠른 PCE의 탈염소화가 진행되었으며, 토양과 지하수를 식종원으로 이용한 경우에는 상대적으로

탈염소화 진행속도가 느린 것을 관측할 수 있었다. 결과적으로 낙동강 퇴적토(SE2)를 식종원으로 사용하였을 경우에 3회에 걸친 회분식 배양기간 동안, 10일 이내에 주입한 PCE 80% 이상의 탈염소화가 진행되는 것을 관찰할 수 있었으며, 가장 우수한 탈염소화 활성을 나타내었다.

일반적으로 PCE의 생물학적 탈염소화반응은 cis-DCE에서 멈추는 경우가 많고, ETH까지 완전히 탈염소화되는 경우는 드물다고 한다. 그리고 ETH까지의 완전 탈염소화는 주로 Dehalococcoides sp.를 함유한 미생물군집에서 확인되는 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 실험에서 평가한 환경시료들의 완전 탈염소화 가능성의 지표로 삼고자, 3회에 걸쳐

Table 4. PCE dechlorination activities of bacterial cultures ino-culated with various environmental samples

NamePCE dechlorination activity*

1st 2nd 3rd

SE1 ++ ++ ++

SE2 +++ +++ +++

SE3 + + +

AS1 +++ ++ ++

AS2 ++ ++ ++

AS3 + + +

SO1 + + +

SO2 + + +

GW1 + + +

GW2 + + +

* Dechlorination of PCE (80 µM) within 15 days (+++), 15-30 days (++), and more than 30 days (+)



Fig. 3. PCR products of 16S rRNA gene fragment of Dehalo-coccoides sp. with Deh primer set amplified from total DNA of bacterial cultures inoculated with various envi-ronmental samples.

PCE 탈염소화 활성을 평가한 각 환경시료의 미생물배양액을 대상으로 Dehalococcoides sp.의 존재를 확인하였다. 각 환경시료의 배양액에서 추출한 미생물 DNA를 대상으로 De-halococcoides sp.의 16S rRNA 부분염기서열에 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과, 퇴적물시료, 슬러지시료, 토양시료에서 PCR산물이 확인되었다(Fig. 3). 이는 우리나라의 일반적인 자연환경에 Dehalococcoides sp.가 널리 존재하다는 것을 의미하며, 이들 환경시료를 식종원으로 이용한다면, PCE를 ETH까지 완전히 탈염소화할 수 있는 미생물을 농화배양할 수 있을 것으로 판단되었다. 그 중에서 PCE의 탈염소화 속도가 가장 빠르고 안정적인 탈염소화 반응을 보이면서, PCR증폭된 Dehalococcoides sp.의 16S rRNA 부분염기서열의 band 강도가 비교적 강했던 낙동강 퇴적토(SE2)의 미생물배양액을 PCE 탈염소화 미생물 농화배양을 위한 식종원으로 선정하였다.

3.2. PCE 탈염소화 미생물 농화배양

우수한 PCE 탈염소화 활성이 나타낸 낙동강 퇴적토(SE2) 를 선택하여 30 mL 용량의 배양배지에서 수차례 계대배양을 실시한 결과, 1주일 이내에 주입한 80 mmol/L의 PCE를 안정적으로 탈염소화하는 미생물군집을 성공적으로 농화배

양할 수 있었다(Fig. 4). 주입한 PCE는 TCE를 거쳐 cis-DCE 를 축적하는 경향을 나타내었으며, cis-DCE는 느린 속도로 VC와 ETH로 전환되는 경향을 보였다. 구축된 탈염소화 미

Fig. 4. Time course of PCE dechlorination by the enrichment culture from the sediment sample (SE2).

생물 농화배양액을 5 L 용량의 대형배양기에 옮겨 지속적으로 계대배양 한 결과, PCE 탈염소화 속도가 점차적으로 증가하여 최종적으로 약 3일 이내에 주입한 80 mmol/L의 PCE 탈염소화가 가능하였으며, ETH의 축적을 확인할 수 있었다. 이는 지속적인 계대배양을 통해 PCE 탈염소화 관련 미생물 군집이 점차적으로 우점화한 결과로 보이며, 첨가한 탄소원을 전자공여체로 바로 이용하거나 다른 종속영

양미생물들이 탄소원을 분해하는 과정에서 발생하는 수소

등을 전자공여체로 사용한 것으로 생각되었다. 또한, 직접적인 탄소원을 첨가하지 않은 배지에서도 느린 속도의 PCE 탈염소화가 확인되었는데, 이는 효모추출액을 종속영양미생물들이 이용하는 과정에서 생산된 수소가 PCE 탈염소화의 전자공여체로 작용하였을 것으로 추측되었다. 탄소원과 효모추출액을 모두 제외한 배지를 이용한 추가적인 실험에서

는 PCE 탈염소화가 일어나지 않았다. 만약 구축한 탈염소화 미생물배양액을 PCE에 오염된 토양이나 지하수의 복원에 적용하고 탄소원과 전자공여체로서 유기물을 공급한다면, 종속영양미생물의 우선적 성장을 유발하여 오염복원의 효율

을 떨어뜨리고, 공정의 막힘 현상 등의 문제를 초래할 것이다. 따라서 탈염소화 미생물배양액을 적용한 오염복원에 전극을 직접적인 전자공여체로 이용하거나, 전극에서 발생하는 수소를 전자공여체로 이용할 수 있다면, 위와 같은 문제점을 해결할 수 있을 것이다.

3.3. 생물전기화학적 탈염소화

구축된 탈염소화 미생물 농화배양액을 BES 환원전극부에 식종하여, 환원전극을 전자공여체로 사용하고 PCE를 전자수용체로 사용하는 BES에서의 탈염소화가능성을 평가하였다. 운전결과, 탄소원이 없는 조건에서 전극을 전자공여체로 사용하여, PCE가 TCE, cis-DCE, VC를 거쳐 ETH로 분해되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5(b)). 구축된 농화배양액보다 PCE 환원속도가 조금 빨라졌지만, 여전히 cis-DCE로 축적되는 경향을 보였으며 ETH까지의 전체적인 탈염소화는 느리게 진행되었다. 대조군으로 사용된 탈염소화 농화배양액이 주입되지 않은 BES에서는 탈염소화가 진행되지 않은 것으로 보아 전기화학적인 즉, 비생물학적인 PCE 탈염소화는 발생하지 않은 것으로 판단된다(Fig. 5(a)). 이는 앞선 농화배양실험에서 탄소원과 효모추출액을 제외한 배양배

지에서는 PCE의 탈염소화반응이 관찰되지 않았기 때문에 환원전극부에 식종된 미생물들은 전극을 전자공여체로 이용

하여 탈염소화를 수행한 것으로 판단된다. BES에서는 전극에서 전자를 직접 공급받거나 전극에서 발생하는 수소를 이

용하여 탈염소화를 수행하기 때문에 탄소원을 공급한 농화

배양단계 보다 동등하거나 조금 빠른 속도로 PCE를 탈염소화 할 수 있었던 것으로 보인다.

기존 연구에서 전극에서 발생되는 전자에 의해 전자매개

체인 MV를 환원시키고 이들을 인위적인 전자공여체로 사용하여 TCE (15 µmol/L)를 탈염소화 가능하다고 보고된 바 있다.5) 또한 Aulente et al6)은 전자매개체를 주입하지 않은



Fig. 5. Bioelectrochemical dechlorination in BES without (A) and with (B) the dechlorinating enrichment culture.

Fig. 6. DGGE profile based on 16S rRNA gene fragments (a) and principle component analysis (PCA) based on DGGE band position and intensities in enrichment culture and BES (b). SE: the sediment enrichment culture SE2, BES-S: suspended-growth bac-teria in cathode chamber, BES-A: attached-growth bacteria on the surface of cathode electrode, and M: marker in (a).

조건에서도 전극을 전자공여체로 이용하는 탈염소화 미생

물에 의하여 TCE (50 µmol/L)가 cis-DCE, VC를 거쳐 ETH으로 환원된다고 보고하였다. 한편, Gregory et al7)에 의해 Geobacter sp.가 전극을 전자공여체로 사용하여 PCE를 cis- DCE까지 탈염소화가능하다고 보고된 바 있지만, 생물전기화학반응기내에서 전극을 전자공여체로 사용하여 PCE를 ETH 까지 탈염소화한 연구는 아직까지 보고되지 않았다.

3.4. 생물전기화학반응기내 미생물 군집 구조 본 실험에서 구축한 PCE 탈염소화 미생물배양액에 Geo-

bacter sp.와 유사한 미생물이 존재하는지 그리고 어떠한 미생물들이 전극을 전자공여체로 이용한 PCE의 탈염소화에 관여하는지를 알아보기 위하여 PCR-DGGE를 수행하였다. 탈염소화 농화배양액과 BES 환원전극부내 부유 및 부착 미생물 군집을 분석한 결과, 농화배양액의 미생물군집은 BES 에서 환원전극을 이용하여 PCE를 탈염소화하는 동안 크게 변화한 것을 알 수 있었으며, 환원전극부내 부유성장 미생물과 부착성장 미생물의 군집도 확연하게 다른 것을 확인할

수 있었다(Fig. 6). 농화배양액의 미생물군집에서는 피루브산과 구연산을 탄소원 및 전자공여체로 사용하여 PCE를 탈

염소화하는 미생물뿐만 아니라 이들 탄소원을 이용하는 다

른 종속영양미생물들과 종속영양미생물이 생산해내는 수소

와 같은 부산물을 이용하여 성장하는 미생물 등으로 인해

복잡한 군집이 형성되었을 것으로 판단된다. 그러나 BES에서는 환원전극 또는 전극에서 발생하는 수소를 전자공여체

로 이용하고 탄산염을 탄소원으로 이용하는 독립영양미생물

들을 중심으로 하는 미생물군집으로 변화하였을 것이다. 또한 전극표면의 생물막에서는 전극에서 발생하는 전자를 직

접 이용하거나 전극표면에서 발생하는 수소를 전자공여체로

이용 가능한 미생물군집이 형성되었을 것이며, 배양액에는 스스로 전자매개체를 생성함으로써 전극으로부터 전자매개

체를 통하여 운반된 전자를 전자공여체로 이용하는 미생물

들이 부유미생물군집을 형성하였을 것으로 판단된다.DGGE 밴드의 염기서열 분석결과를 Table 5에 나타내었다.

밴드 BES-1은 부유성장 미생물 군집에서 가장 선명하게 관찰되었으며, 혐기성 소화슬러지에서 관찰되는 uncultured Acinetobacter sp.와 유사한 것으로 나타났다. Acinetobacter sp.는 산소를 전자수용체로 사용하는 BES의 환원전극에서 검출된 바 있으며, 특히, Acinetobacter calcoaceticus는 py-rroloquinoline quinone을 전자매개체로 사용하거나 자가생산



Table 5. Taxonomic identification of 16s rRNA gene sequences of extracted bands from the DGGE profile shown in Fig. 6

Bandname

Taxonomic group Closet 16S rRNA gene sequence Accession No. Similarity(%) Source Ref

BES-1 Gammaproteobacteria uncultured Acinetobacter sp. EF593051 94 predigester slurry Unpublished

BES-2 Bacteroidetesuncultured Bacteroidetes

bacteriumEU887995 97

PCB-dechlorinating enrichment culture

Maymo-Gatell et al3)

BES-3 Deltaproteobacteriauncultured delta proteobacterium

FM206230 98chlorinated ethenes contaminated

groundwaterImfeld et al.17)

BES-4 Firmicutes Clostridium-like species U27711 98 a phenol-degrading consortium Li et al.18)

BES-5 Betaproteobacteria Thiobacillus sp. E4IPC-4826 DQ133429 98 karstic aquifer Unpublished

BES-6 Environmental samples uncultured bacterium HM149204 98 Moving anodes from MFC to MEA Unpublished

BES-7 Firmicutes Clostridium bifermemtans HQ013322 99 deep soil Unpublished

BES-8 Environmental samples uncultured bacterium DCE29 AJ249260 99dechlorinating enrichment mixed

cultureUnpublished

전자매개체를 사용하여 BES의 환원전극으로부터 전자를 받을 수 있다고 보고되었다.10,11)

밴드 BES-3은 농화배양액에서 가장 선명하게 관찰되었으며, 선명도는 감소하였지만 BES의 부유 및 부착성장 미생물 군집에 계속 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 염기서열분석결과 밴드 BES-3은 염화에틸렌 화합물로 오염된 지하수에서 관찰되는 uncultured Deltaproteobacteria와 유사한 종으로 나타났으며, 탈염소화 눙력이 있는 미생물 종으로 사료된다. 밴드 BES-8은 부유성장 미생물 군집에서만 관찰되었으며, 탈염소화 혼합미생물에 관찰되는 uncultured bac-terium DCE29 유사한 것으로 나타났다. 밴드 BES-5는 농화배양액에서 가장 선명하게 관찰되었지만, BES 환원전극의 부착미생물 군집에서만 관찰되었으며, Thiobacillus sp.와 유사한 종으로 관찰되었다. 밴드 BES-2, BES-4, BES-6은 부착미생물 군집에서 가장 선명하게 관찰되었다. 염기서열 분석결과, 밴드 BES-2는 염소계 유기화합물 폴리염화비페닐(poly chlorinated biphenyl, PCB)을 분해할 수 있는 종으로 알려진 uncultured Bacteroidetes bacterium과 유사한 것으로 나타났으며, 밴드 BES-4는 폐놀 분해 미생물 군집에서 관찰되는 Clostridium-like species와, 밴드 BES-6은 BES의 산화전극부에서 관찰되는 uncultured bacterium과 유사한 것으로 나타났다. 그리고 밴드 BES-7은 생물전기화학적 탈염소화과정에서만 관찰되었는데, 특히 부착성장 미생물 군집에서 가장 선명하게 관찰되었으며, Clostridium bifermentans 유사한 것으로 나타났다. Clostridium sp.은 대표적인 그람양성균으로서 일부 Clostridium sp.은 전기화학활성이 있다고 이미 보고되었다.12)

미생물군집 해석을 통해서, 다양한 미생물이 BES에서 전극을 전자공급원으로 이용하는 탈염소화에 관련되어 있음을

확인하였다. BES에서 미생물들은 전극을 직접 전자공여체로 이용하거나 전극에서 발생하는 수소를 전자공여체로 이

용하고, 염화에틸렌 화합물을 전자수용체로 이용하여 탈염소화를 수행하는 것으로 추정되며(Fig. 7), 향후 보다 명확한 탈염소화 메커니즘을 밝히기 위한 추가적인 연구가 필요

하다.

Fig 7. A schematic diagram of the mechanisms in bioelectro-chemical system (BES) with a cathode polarized at -500 mV (vs. Ag/AgCl).

4. 결 론

본 연구에서는 BES에서 전극을 전자공여체로 이용하는 탈염소화 미생물을 이용한 PCE 탈염소화 가능성을 평가하고, 분자생물학적 기법을 이용하여 미생물 군집 변화를 관찰한

결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.

1) 다양한 퇴적토, 슬러지, 토양, 지하수를 식종원으로 한 혐기성 미생물배양액을 이용하여 탈염소화 활성을 평가한

결과, 모든 식종원에서 PCE 탈염소화 활성을 확인할 수 있었다. 특히 낙동강 퇴적토(SE2)의 배양액이 가장 안정적이고 우수한 탈염소화 활성을 나타내었다.

2) 생물전기화학적 PCE 탈염소화 실험결과, 전자매개체 없이도 환원전극을 전자공여체로 이용하는 탈염소화 미생물

군집에 의해 PCE가 TCE, cis-DCE, VC를 거쳐 ETH로 환원되는 것을 확인할 수 있었다.

3) 탄소원을 전자공여체로 이용하는 탈염소화 농화배양액의 미생물군집은 생물전기화학적 탈염소화 과정에 그 군집

이 크게 변화하였으며, BES에서 부유성장하는 미생물과 전



극에 생물막을 형성하는 미생물 군집구조에도 큰 차이가 있

었다. 4) 탈염소화 메커니즘에 따라서 부착 및 부유 미생물군집

구조에서 차이가 나는 것으로 판단되며, 추가적인 연구를 통해서 자세한 생물전기화학적 탈염소화 메커니즘을 밝혀낸다

면 생물전기화학적 탈염소화 기술은 염화에틸렌 오염 토양/지하수의 획기적인 생물정화기술로 적용될 수 있을 것으로

기대된다.

사 사

이 논문은 2010년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단(No. 2010-0021578)의 지원을 받아 수행된 연구임.

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생물전기화학시스템을 이용한 염화에틸렌의 생물학적 탈염소화의 다양한...

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