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FACULTAD DE QUÍMICADEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
CURSO DE BIOQUÍMICA(CLAVE 1508)
Licenciaturas de QFB y QA
Prof. Laura Carmona SalazarGrupo: 07
Semestre: 17-I
Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro
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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Modelo Michaelis-MentenMecanismos de inhibiciónRegulación enzimáticaRegulación enzimática
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S P
REACCIÓN QUÍMICA
EL EQUILIBRIO DEPENDE DEL G
Y LA VELOCIDAD DE LA ENERGÍA LIBREDE ACTIVACIÓN
EN UNA REACCIÓN CATALIZADA POR UN ENZIMA, ÉSTA MODIFICA LA VELOCIDAD
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CINÉTICA ENZIMÁTICA.- Disciplina que se encarga deestudiar el mecanismo de una reacción catalizadaenzimáticamente.
OBJETIVO.- Determinar la velocidad de la reacción yevaluar como se ve modificada ésta enrespuesta a cambios en los parámetrosexperimentales
VELOCIDAD= Cantidad de sustrato desaparecido oproducto formado por la enzima por unidad de tiempo
Por tanto sus unidades soncantidad de compuesto sobre unidad de tiempo:
moles mmoles
nmolesgramos
miligramosmgramos
hora
minuto
segundo
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E + S ES E + PS P
ESTADOPRE-ESTACIONARIO
1) ESTADO PRE-ESTACIONARIO = HAY EXCESO DE SUSTRATO Y AUMENTALA CONCENTRACIÓN DE ES(ES RÁPIDO, DURA MICROSEGUNDOS)
2) ESTADO ESTACIONARIO = LA CONCENTRACIÓN ENZIMA-SUSTRATOPERMANECE APROX. CONSTANTE
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RE
AC
CIÓ
NV
EL
OC
IDA
DD
EL
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EA
CC
IÓN
Concentración del sustrato
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MODELO DE Leonor MICHAELIS -Maud MENTEN
E + S [ES] E + Pk1
K-1
k2 1
Relaciona velocidad de la reacción con [S] y [E]
Vo = k2 [ES] 2Vo = k2 [ES]
Queremos saber cuánto ES se forma
Velocidad de formación de ES = k1 [E][S] 3
Velocidad de desaparición de ES = (k-1 + k2) [ES] 4
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En el estado estacionario, las velocidades de formación y desapariciónde [ES] son iguales, donde [ES] es constante, mientras que [Reactivos] y [Productos] cambian
k1 [E] [S] = (k2 + k3) [ES] 5
[ES] = [E] [S](k2 + k3)/k1
6
Definimos una nueva constante: (para el denominador)
Km = constante de Michaelis
Km = k2 + k3
k1
7
Sustituimos en 6
[ES] = [E] [S]Km
8
Km es independiente de la concentración del enzimay la de sustrato
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Asumiendo que ponemos un gran exceso de S con respecto a E, entonces [S]va a ser teóricamente la inicial o sea el total de [S].
Con respecto a [E], ésta se va a estar combinando con él. Va haber también E libre.
[E] = [Etotal] - [ES] 9
Sustituyendo para [E] en 8
[ES] = ([Etotal] - [ES] ) [S]Km
10Km
[ES] = [Et] [S] / Km1 + [S] / Km
11
[ES] = [Et] [S]______ [S] + Km
12 Vo = k2 [ES]
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V = k2 [Et] [S]__ [S] + Km
13
Ya que la velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando los sitios de la enzima están saturados con sustratos, o sea cuando [S] >> Km, y entonces
[S]____ [S] + Km
Se aproxima a 1[S] + Km
entonces
Vmax = k2 [Et] 14
sustituyendo 14 en 13
V = Vmax ___[S] ___[S] + Km
Km = [S] a la cual la velocidad de la reacción tienela mitad de su valor máximo
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RE
AC
CIÓ
N
V = Vmax ___[S] ___[S] + Km
VE
LO
CID
AD
DE
LA
RE
AC
CIÓ
N
Concentración del sustrato
[S] + Km
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GRÁFICA DE DOBLES RECÍPROCOS O DE LINEWEAVER-BURK(TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN)
Vo = Vmax ___[S] ___[S] + Km
INVERSO 1 = Km + [S]Vo Vmax [S]
1 = Km + [S]Vo Vmax [S] Vmax [S]
Pendiente
1 = Km + 1Vo Vmax [S] Vmax
Ecuación de Lineweaver-Burk
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Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax
obtenemos,
Vmax = v + (Km v)/[S]
max
1
maxmax
11vV
SV
Km
Vv
GRÁFICA DE EADIE-HOFSTEE(TRANSFORMACIÓN DE LA ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN)
Vmax = v + (Km v)/[S]
y reordenando
y = b - m x
Esta representación se conoce como representación de Eadie-Hofstee
Sv
KmVv max
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v Vmax
Vmax/Km
m = -Km
a
La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:- pendiente = -Km
- corte en el eje v = Vmax- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
v/[S]
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SIGNIFICADO DE LA KM Y VMAX
La KM es un valor de concentración que resulta muy útilpara asegurar una catálisis efectiva.Puede ser considerada como una medida de la afinidad deun enzima por su sustrato
La V es la máxima velocidad que se alcanza cuandoLa VMAX es la máxima velocidad que se alcanza cuandoen el medio de reacción todos los enzimas tienen los sitiosactivos ocupados
KcatEs una constante de velocidad que describe la velocidad
limitante de cualquier reacción en condiciones de saturación
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Kcat = NÚMERO DE RECAMBIO
Equivale a expresar el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo en una sola molécula de enzima cuando esta se encuentra saturada
Kcat= Vmax / [E]t= Número de recambio en el sitio catalítico por seg
Kcat/ Km= Medida de la eficiencia catalítica si [S]<<<KmEn esta condición, la velocidad de la enzima está sólocontrolada por la difusión de S al sitio catalítico
Algunos enzimas tienen una kcat/Km en el intervalo 108-109 M-1seg-1, es decir transforman al sustrato apenas llega
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La actividad específica es la velocidad de una enzima expresada en términos de la cantidad de enzima que produce esa velocidad
Unidades de velocidad
Unidades de cantidad de enzima
La actividad de una enzima se puede expresar en términos de la velocidad por la cantidad de la enzima
Actividad específica
Actividad específica = mmoles / min / mgmmoles / min / mg
nmoles / min / mg
mg (de producto) / min / mg
mg (de producto) / min / mg
velocidad cantidad de enzima
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LOS ENZIMAS PUEDEN SER INHIBIDOS
Los inhibidores enzimáticos son agentes moleculares queInterfieren en la catálisis, haciendo más lentas odeteniendo las reacciones.
Pueden ser reversibles o irreversiblesPueden ser reversibles o irreversibles
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INHIBIDORES COMPETITIVOS
INHIBIDORES ACOMPETITIVOS
INHIBIDORES MIXTOS
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Ki o constante de inhibiciónLa Ki es la constante de equilibrio de fijación de un inhibidor a una enzima
Es otra de las constantes cinéticasSu cálculo depende del tipo de inhibición de que se trate y por tanto del inhibidor y de la enzima
1/V
1/S
INHIBICIÓN COMPETITIVA
INHIBICIÓN MIXTA
INHIBICIÓN ACOMPETITIVA
1/S
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REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
* ALOSTERISMO
*REGULACIÓN COVALENTEa) FOSFORILACIÓN
b) PROTEÓLISIS
MODIFICACIONESSOBRE LA ENZIMA
EXISTENTE
Mecanismos fisiológicos para aumentar o disminuir la actividad enzimática
ISOENZIMAS
a) EXPRESIÓN DEL GENE
b) SÍNTESIS DE LA PROTEÍNA
EN EL RIBOSOMA
MODIFICACIONESPARA CAMBIAR
LA CANTIDAD DEENZIMA
* SÍNTESIS
* DEGRADACIÓN DIFERENTES MECANISMOS
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ALOSTERISMO (CAMBIA DE FORMA)
UN ENZIMA ALOSTÉRICA SE DISTINGUE POR SURESPUESTA A LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO YPOR SU SUSCEPTIBILIDADDE REGULACIÓN POR OTRAS MOLÉCULAS
SE CARACTERIZAN POR TENER MÚLTIPLESCENTROS FUNCIONALES(CENTROS ACTIVOS)YCENTROS REGULADORES(CENTROS ALOSTÉRICOS)
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Ligando o efector o regulador alostérico
SITIO CATALITICO
ENZIMA
SITIO REGULADOR
SUSTRATO
ENZIMA ALOSTÉRICA
alostérico
LA UNIÓN DEL REGULADOR INDUCE CAMBIOS CONFORMACIONALES
QUE SE TRANSMITEN AL SITIO ACTIVO
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Ligando o efector o regulador alostérico
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAALOSTERISMO
SITIO CATALITICO
ENZIMA
Sitio Regulador
SUSTRATO
+ o -alostérico
Ligando o Regulador oEfector alostérico(específico)
Actividad enzimática
Actividad enzimática
+
- Sitio alostérico(es específico)
Sitio alostérico(es específico)
+ o -
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Ligando o efector o regulador alostérico
SITIO CATALITICO
ENZIMA
SITIO REGULADOR
SUSTRATO
ENZIMA ALOSTÉRICA
alostérico
LA ACTIVIDAD DE UN CENTROFUNCIONAL AFECTA A LOS DEMÁS
POR TANTO PRESENTANCOOPERATIVIDAD
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LOS ENZIMAS REGULADOS ALOSTÉRICAMENTE NO SIGUEN LA CINÉTICADE MICHAELIS-MENTEN
VE
LO
CID
AD
Conforme se le une su sustrato está en estado “relajado”
LA TRANSICIÓN DE T a R POR LA UNIÓN DE SU SUSTRATO,
TAMBIÉN AUMENTA LA ACTIVIDAD
VE
LO
CID
AD
SUSTRATO
Sin sustrato el enzima esta en estado “tenso”
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TRANSICIÓN DEL ESTADO T AL R EN LA HEMOGLOBINA
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Ligando o efector o regulador alostérico
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAALOSTERISMO
SITIO CATALITICO
ENZIMA
Sitio Regulador
SUSTRATO
+ o -alostérico
Ligando o Regulador oEfector alostérico(específico)
Actividad enzimática
Actividad enzimática
+
- Sitio alostérico(es específico)
Sitio alostérico(es específico)
+ o -
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EFECTOR UNIÓN A LA ENZIMA INDUCCIÓN DEALOSTÉRICO (SITIO ALOSTÉRICO) CAMBIO+ ó - CONFORMACIONAL
TRANSMISIÓN A TRAVÉSDE LA ENZIMA HASTAEL SITIO CATALÍTICO
Eventos en la transición alostérica
EXPRESIÓN DE MODIFICACIÓN + ó - CAMBIO EN LALA ACTIVIDAD DE LA AFINIDAD POR ESTRUCTURA DEL DE LA ENZIMA EL PRODUCTO, CAM- SITIO CATALÍTICO.(CATÁLISIS) BIO REACTIVIDADES
DE RESIDUOS CRÍTICOS EN LA CATÁLISIS.
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ENZIMA ENZIMA
SUSTRATOINHIBIDOR
COMPETITIVO
ENZIMA
INHIBIDOR
NO COMPETITIVO
REGULACIÓN ENZIMÁTICA
SITIO CATALITICO
ENZIMASitio Regulador
SUSTRATO
-
INHIBIDORALOSTÉRICO
ALOSTERISMO: forma de regulación de la actividad de una enzima
* Las enzimas alostéricas NO siguen el comportamiento Michaeliano (hiperbólico). Su cinética de velocidad vs. [S] es sigmoidal.
* Estas enzimas tienen más de un sitio de unión para el sustrato o para otro efector.
* Este segundo sitio no es catalítico, pero al ser ocupado, “transmite” su efecto al sitio catalítico, el cual aumenta o disminuye su afinidad por el sustrato (SITIO ALOSTÉRICO)
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El producto de la catálisis, al alcanzar ciertas concentraciones,
se une a la enzima, inhibiéndola (interaccionando en el sitio alostérico,
no en el sitio activo)
REGULACIÓN POR PRODUCTO
A + B CE
-
TIPOS DE REGULACIÓN ALOSTÉRICA
A + B C
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REGULACIÓN POR FEEDBACK (RETROALIMENTACIÓN )
Sustrato A Sustrato B Sustrato C Sustrato D Sustrato E
Enz A Enz B Enz C Enz D
Es una inhibición alostérica que se presenta para regular vías metabólicas
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REGULACIÓN POR MODIFICACION COVALENTE :
La actividad de la enzima se regula, ya sea + o – por la adición o
substracción de un grupo químico o de una parte de la molécula
de enzima.
Pi (FOSFORILASA O CINASA)FORMA INACTIVA
a) Fosforilación (regulación reversible) :
ENZIMA
DEFOSFORILADAFOSFOENZIMA O
ENZIMA FOSFORILADAPi (FOSFATASA)FORMA ACTIVA
FORMA INACTIVA
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ALGUNOS TIPOS DE MODIFICACIONES COVALENTES
MODIFICACIÓN EJEMPLO DE PROTEÍNA
MODIFICADA
Fosforilación Piruvato cinasa
Acetilación Histonas
Miristilación Src
ADP-ribosilación RNA polimerasa
Farnesilación Ras
-Carboxilación Trombina
Sulfatación Fibrinógeno
Ubiquitinación Ciclina
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CINASA o
FOSFORILASA
Pi
Pi
Pi
ENZIMADEFOSFORILADA
ENZIMA FOSFORILADA
Sitio de fosforilación
ATP ADP+ Pi
Las cinasas o fosforilasas toman el Pi del ATP, al que hidrolizan en ADP+Pi y este Pi es transferido a la enzima que es sustrato de la cinasa
ACTIVA INACTIVAPi
FOSFATASA
El Pi se esterifica a un grupo hidroxilo de la proteína, por lo que los aminoácidos que se fosforilan en una proteína son la SERINA, TREONINA y TIROSINAEl Pi queda unido de una manera covalente a la enzima, pero esta fosforilación puede ser reversible gracias a una FOSFATASA
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REGULACIÓN COVALENTE
b) PROTEÓLISIS (REGULACIÓN IRREVERSIBLE)
ZIMÓGENOS. Proteínas inactivas que tiene un tamaño mayor
al de la enzima madura y que son procesados hasta la forma madura, que es más pequeña
NH2
COO-
NH2
COOH
proteasa
COO-+ NH2
COOHPRECURSOR
(INACTIVO) FORMA MADURA
(ACTIVA)O PROTEÍNA INMADURA
ZIMÓGENO
PROCESAMIENTO
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ISOFORMAS O ISOENZIMAS O ISOZIMAS
•Son variaciones estructurales de una misma enzima
•Las isoformas pueden ser de un 70-98 % idénticas entre sí
•Las isoformas de una misma enzima catalizan la misma reacción, perocon ligeras variaciones en la velocidad, la Km, el pH óptimo, sensibilidad a inhibidores, a reguladores alostéricos, etc.
• Esas pequeñas diferencias no son suficientes para que la reacción que • Esas pequeñas diferencias no son suficientes para que la reacción que catalizan sea diferente
•Por eso, las isoenzimas son otras formas de expresar una actividad enzimática regulada
•La isoforma que exista en un tejido o en un momento de desarrollo particulares es justamente la que se necesita ahí por sus características particulares de cinética o de regulación
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Una isoforma puede ser específica de un tejido o de una edad del tejido, porque despliega justamente la actividad que demanda este tejido
Así, el organismo modula una misma actividad Así, el organismo modula una misma actividad enzimática en diferentes tejidos, expresando diferentes formas de la enzima