2 michaelis menten 1s
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Equção michaelis menten para 1 substratoTRANSCRIPT
Enzimologia
Sumário• Reacção Enzimática a 1S, 1Complexo e 1 P
• Esquema Reaccional• Equações Gerais e Soluções Gerais• Estado Estacionário e Pré Estado Estacionário• Determinação de Velocidades Iniciais em condições óptimas• Construção de Curvas experimentais de vo em função de [S]o
• Equação de Michaelis Menten de vo = f ([So])
• Dedução da Equação - Hipóteses Restritivas • Análise da curva de vo = f ([So])• Definição dos Parâmetros Concentrados VM e KM• Significado físico de VM e KM• Determinação de VM e KM
• Comparação da actividade de várias enzimas• Valores de kcat, KM e kcat/KM para várias enzimas
Cinética Enzimática
Estuda a velocidade das reacções catalisadas por enzimas e a forma como esta varia com a concentração do substrato, condições do meio (T, pH…) e na presença de inibidores ou activadores.
Aspecto prático: No laboratório vamos medir velocidades da reacção em diferentes condições. Aspecto teórico: Vamos construir modelos matemáticos que se ajustam aos resultados experimentais. Estes modelos caracterizam-se por depender de parâmetros que têm um significado físico definido.
A informação obtida pode: • ser útil do ponto de vista experimental (aplicações práticas das enzimas). • fornecer pistas acerca dos mecanismos e dos aminoácidos envolvidos na catálise.
Como vou obter velocidades no laboratório?
• Medindo o aparecimento do produto em função do tempo
• Medindo o desaparecimento do substrato em função do tempo
dtPdv ][
=
dtSdv ][
−=
A velocidade da reacção (declive da tangente às curvas de evolução) diminui com o tempo até se atingir o equilíbrio: i) A reacção inversa torna-se cada vez
mais importante com a acumulação do produto.
No equilíbrio a velocidade de conversão de S em P iguala a velocidade de conversão de P em S e v=0.
i) A enzima torna-se instável no decurso da reacção; ii) O grau de saturação da enzima pelo substrato diminui à
medida que o substrato é consumido; iii) Os produtos da reacção inibem a enzima; iv) Qualquer combinação dos factores anteriores.
ò
velocidades iniciais, v0
Curvas de evolução temporal : concentração P vs tempo
S P
As curvas de evolução são, normalmente lineares até ≅ 20% de conversão de substrato em produto.
tempo
[P]
velocidade instantânea:
[ ]dtPdv =
Determinação experimental da velocidade inicial: v0 = (d[P]/dt)0
Determinam-se as tangentes na origem das curvas [P] vs tempo, para diferentes valores de concentração de substrato. A concentração total de enzima (ET) tem que ser constante.
equilíbrio[P]
tempo
v4
v3 v2
v1
[P] em função do tempo (exponencial)
Determinação experimental da velocidade inicial
[s1] [s2] [s3] [S4]
v1
v2
v3
v4
vo = f ([S]o) exibe saturação
vo em função de [substrato] (Hipérbole)
As reacções catalisadas por enzimas exibem uma cinética de saturação
Vo=f([S]) curva Hiperbólica Vo=f([S]) curva Sigmoidal
Enzima Michaeliana Modelo Michaelis-Menten
Enzima Alostérica Modelo concertado de MWC Modelo sequencial de Koshland
Concentração de substrato
Velo
cida
de d
a re
acçã
o
Concentração de substrato
Velo
cida
de d
a re
acçã
o
7
Esquema da Reacção Enzimática
1. Identificar Variáveis
2. Identificar Parâmetros
3. Definir Sistema de Equações
4. Definir as Condições Iniciais
5. Comparar as constantes de velocidade
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
k-2
Uma cinética de saturação implica a existência de um complexo enzima-substrato
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
k-2
1. Identificar Variáveis - as 4 Concentrações - unidades M: [S], [P], [E] e [ES]
2. Identificar Parâmetros - 4 constantes de velocidade - duas constantes de 1ª ordem k-1, e k2 (s-1) e duas constantes de 2ª ordem k1 e k-2 (M-1 s-1).
3. Definir Sistema de Equações: havendo 4 variáveis (incógnitas), são necessárias 4 equações independentes
4. Definir as Condições Iniciais: [S]=[S]o , [E ]=[ET] [ES]=[ P]=05. Comparar as constantes de velocidade - UNIDADES - transformar as
constantes de 2º ordem em constantes de pseudo 1º ordem s-1 k1 [S] e k-2 [P]6. Pode-se re-escrever o Esquema Reaccional – substituindo nas setas as
constantes de 2ª ordem pelas respectivas constantes de pseudo 1ª ordem (s-1 ) k1 [S] e k-2 [P]
k1 [S]
k-1ESE E
k- 2
k2
[P]
9
Cinética 1S - 1ES - 1 P - Equações Gerais
Sistema de 4 Equações Diferenciais
Equações de Conservação
Condições Iniciais:
[S]=[S]o , [E ]=[ET]
[ES]=[ P]=0
[S]o = [S]+[ES]+[P]
[ET] =[E]+[ES]
d [S]dt = – k 1 [E] [S] + k – 1 [ES]
d [P]dt = – k– 2 [P] [E] + k 2 [ES]
d [E]dt = – k 1 [S] + k– 2 [P] [E] + k –1 + k2 [ES]
d [ES]dt = k1 [S] + k – 2 [P] [E] – k–1 + k 2 [ES]
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
k-2
10
Equações Gerais
Condições Iniciais:
[ES]=[ P]=0Sistema de 4 Equações
[S]o = [S]+[ES]+[P]
[ET] =[E]+[ES] d [S]dt = – k 1 [E] [S] + k – 1 [ES]
d [P]dt = – k– 2 [P] [E] + k 2 [ES]
d [E]dt = – k 1 [S] + k– 2 [P] [E] + k –1 + k2 [ES]
d [ES]dt = k1 [S] + k – 2 [P] [E] – k–1 + k 2 [ES]
d [S]dt = – k 1 [E] [S] + k – 1 [ES]
d [P]dt = – k– 2 [P] [E] + k 2 [ES]
d [E]dt = – k 1 [S] + k– 2 [P] [E] + k –1 + k2 [ES]
d [ES]dt = k1 [S] + k – 2 [P] [E] – k–1 + k 2 [ES]
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
k-2
11
Soluções Gerais - Variação Temporal das Concentrações
E + S ES E + P
tempo
conc
entr
ação
d[ES]/dt≈0
d[E]/dt≈0
12
Soluções Gerais - Variação Temporal das Concentrações
tempo
conc
entr
ação
d[ES]/dt≈0
d[E]/dt≈0
Pré estado
estacionário [S]o >> [ET] d[ES]/dt ≈ 0
[ET] = [E]+[ES] d[E]/dt ≈ 0
Hipótese Estado Estacionário - Garantia Experimental se [S]o >> [ET] Duração do Pré Estado Estacionário é Mínima se [S]o >>>> [ET]
13
Soluções Gerais - Variação Temporal das Concentrações
Velocidade Instantânea - Tangente à curva em qualquer ponto = d[P]/dtVelocidade Inicial - Tangente à curva no instante inicial = (d[P]/dt)o
Pré Estado Estacionário Mínimo garante (d[P]/dt)o Máximo
e a determinação correcta da velocidade incial
Pré estado estacionário Pré estado estacionário
equilíbrio
tempo
conc
entr
ação v
velocidade instantânea
14
[P] = f(t) - Condições de Velocidade Inicial - vo = g([S]o)
[S] mM0 10 20
0.1
0.5
1
0 2.5 5 7.5 10
0
0.5
1
sec
Periodo de validade - velocidade inicialB
[P]
0 50 100 150 200
0
2.5
5
[P]
sec
Variação de [P] - [S]o=10, 7.5, 5, 2.5, 0.1A
vo voVM
Velocidades iniciais - (d[P]/dt)oC
Para simplificar a análise vamos considerar duas hipóteses restritivas:
1 – condição de velocidade inicial (vo) as velocidades são determinadas a partir da tangente na origem da curva [P] vs. tempo. Nestas condições pode-se desprezar a reacção de conversão de produto em ES porque a concentração de produto é muito baixa.
2 – Hipótese de estado estacionário ([So]>>>>ET) Se a concentração de substrato for muito superior à concentração de enzima, a concentração do intermediário ES é sempre muito baixa e pode considerar-se constante ao longo do tempo (d[ES]/dt = 0).
No laboratório é necessário garantir que as experiências são feitas nestas condições!
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
k-2
Modelo geral
Condição de velocidade inicial ([P] ≈ 0) e hipótese de estado estacionário (d[ES]/dt=0)
E + S ES E + Pk1
k-1
kcat
Hipóteses restritivas:
Modelo cinético de Michaelis-Menten
[S]o = [S] (porque [S]>>>>ET e [P] ≈ 0 )
ET = [E]+[ES]
Balanço de massas:
Equações simplificadas: d[P] dt = kcat [ES]
= k1 [E] [S] – (k-1 [ES] + kcat [ES]) = 0 d[ES] dt
Equações diferenciais: velocidade inicial
Dedução da equação de velocidade do modelo de Michaelis-Menten Objectivo: Expressar vo em função dos parâmetros do modelo (k1,k-1,kcat) e de quantidades conhecidas ([So] e ET).
E + S ES E + Pk1
k-1
kcat
Vamos utilizar a expressão da velocidade inicial, a hipótese do estado estacionário e as equações de balanço de massa da enzima e do substrato.
[ ] [ ]ESkdtPdv cat=⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛=0
0
0])[(]][[][11 =+−= − ESkkSEk
dtESd
cat
][][ ESEET +=
][][ 0 SS =
[ ]
[ ]01
SKEES
M
T
+=
Substituindo na expressão de vo
[ ][ ]0
00 SK
SEkvM
Tcat
+=
[ ][ ] ( )[ ]ESkkSEk cat+= −11
[ ] [ ]0SS =
[ ] [ ]ESEET +=
[ ] [ ]ESkdtPdv cat=⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛=0
0
E +S ES → E + P k1
k-1
kcat
[ ] [ ][ ]00
SKSEES
M
T
+=
[ ] [ ][ ]01
1 1Sk
kkESE cat+= −
[ ][ ]
[ ]ESSKESE M
T +=0
definindo
1
1
kkkK cat
M+
= −
KM
TcatM EkV =
VM
[ ][ ]00
0 SKSVv
M
M
+=Equação de Michaelis-Menten
KM constante de Michaelis-Menten VM velocidade máxima
Dedução da equação de velocidade do modelo de Michaelis-Menten
19
Modelo Michaelis Menten: Estado Estacionário vs Rápido Equilíbrio
[S]KS
ESE E + Pkcat
Rápido Equilíbrio
k1 [S]
k-1ESE E + P
kcat Estacionário
vo =
VM [So]KM + [So]
VM = k cat [ET]
�
KM = k−1+kcatk1
�
KM = k−1k1= KS
Estado estacionário vs. Rápido equilíbrio
Estado estacionário d[ES]/dt =0
Rápido equilíbrio
[ ][ ][ ] 1
1
kk
ESSEKS −==
E + S ES E + Pk1
k-1
kcat
E + S ES E + Pk1
k-1
kcatKS
Se k-1>>>kcat considera-se que a adição de substrato está em rápido equilíbrio e o modelo pode ser simplificado. Nestas condições [ES] está relacionada com as concentrações de enzima livre e substrato pela constante de dissociação KS.
A hipótese de rápido equilíbrio é mais restritiva do que a hipótese de estado estacionário. → Modelo com menos parâmetros. A hipótese de rápido equilíbrio não pode ser garantida na prática.
SM KkkK == −
1
1
1
1
kkkK cat
M+
= −
Estado estacionário Rápido equilíbrio k-1 >>> kcat
A hipótese de rápido equilíbrio é mais restritiva do que apenas estado estacionário, e permite maiores simplificações nos modelos cinéticos (substituem-se duas constantes de velocidade (k1, k-1) por uma constante de equilíbrio, KS). Nos modelos de inibição e pH vamos utilizar sempre a hipótese restritiva de rápido equilíbrio.
Estado estacionário vs. Rápido equilíbrio
TPC Deduzir a equação de Michaelis-Menten utilizando a hipótese restritiva de rápido equilíbrio. Chegar às expressões de VM e KM para o modelo:
E + S ES E + Pk1
k-1
kcatKS
em que KS=[E][S]/[ES] é a constante de dissociação do complexo ES e kcat é a constante de velocidade de formação do produto.
Representação gráfica da equação de Michaelis-Menten: hipérbole rectangular
v0 = VM [S]oKM + [S]o
Reacção de 1ª ordem
[So]<<KM vo=(VM/KM) [So]
KM unidades de concentraçãoVM unidades de velocidade
Reacção de ordem zero [So]>>KM vo=VM
assímptota
Variação de VM Variação de KM
KM é uma medida da afinidade entre a enzima e o substrato.Quanto maior KM menor afinidade.
Significado físico dos parâmetros VM e KM
VM depende da concentração da enzima. Corresponde a vo quando toda a enzima está saturada com substrato, i.e. quando [S]>>>KM.
KM 5KM 10KM2KM [So]
vo
VM
1
1
kkkK cat
M+
= −TcatM EkV =
VM
0.5VM
0.1 VM
vo
KM [So]
0.2 VM
1. Ajuste directo da hipérbole recorrendo a regressões não-lineares → vamos utilizar o solver do Excel
[S] (µM)
Velo
cida
de (n
M m
in-1
)
Determinação experimental de VM e KM
26
Equação de Michaelis Menten - Determinação de VM e KM
v0 = VM [S]o
KM + [S]oLinearizações
Lineweaver Burk
Eadie Hofstee
Hanes Woolf S o
vo= KM
VM+ 1
VMS o
vo = – KM
vo
S o+ VM
1v0
= KM
VM
1S o
+ 1VM
-1KM
vo1
1[S]
1VM
declive = KM
VM
A - Lineweaver Burk
1v 0
=K M
VM
1S o
+ 1V M
VM
VMKM
vo
vo[S]
declive = -K M
B - Eadie Hofstee
v o = – K M
v oS o
+ VM
Determinação experimental de VM e KM
Linearizações da equação de Michaelis-Menten
slope slope
-K M[S]
KMVM
declive = 1VM
C - Hanes Woolf
S o
v o=K M
VM
+ 1VM
S o
VM
K M
v2
v1
[S]1[S]2
K*M
V*M
[S]3
v3
D - Cornish Bowden
VM = vo +voS o
K M
[S]vo
Método directo Linearização de
29
Equação de Michaelis Menten - Determinação de VM e KM
Método Estatístico
v0 = VM [S]o
KM + [S]o
22 220 002
0 02 20 0 0
020 0 0
[ ] [ ]ˆ
[ ] [ ] [ ]
M
v vvS S
Vv v vvS S S
⎛ ⎞⋅ − ⎜ ⎟
⎝ ⎠=⋅ − ⋅
∑ ∑ ∑
∑ ∑ ∑ ∑
220 00 0
0 02 20 0 0
020 0 0
[ ] [ ]ˆ
[ ] [ ] [ ]
M
v vv vS SKv v vvS S S
⋅ − ⋅=
⋅ − ⋅
∑ ∑ ∑ ∑
∑ ∑ ∑ ∑
Cálculo do parâmetro VM
Cálculo do parâmetro KM
30
Equação de Michaelis Menten - Determinação de VM e KM
( )2
4 2 0exp 2
022 2
20 002
0 0
ˆ[ ]ˆ
[ ] [ ]
M
M
vVSV
v vvS S
σσ
⋅ ⋅=
⎛ ⎞⋅ − ⎜ ⎟
⎝ ⎠
∑
∑ ∑ ∑
( )2 2
2 2 2 20 0exp 0 2
0 022 2
20 002
0 0
ˆ ˆ ˆ2[ ] [ ]ˆ
[ ] [ ]
M M M
M
v vV v K KS S
Kv vvS S
σσ
⎛ ⎞⋅ ⋅ + + ⋅⎜ ⎟
⎝ ⎠=⎛ ⎞
⋅ − ⎜ ⎟⎝ ⎠
∑ ∑ ∑
∑ ∑ ∑
v0 = VM [S]o
KM + [S]o
Erro do parâmetro VM
Erro do parâmetro KM
KM está relacionado com a formação de ES, KM elevado → fraca afinidade entre E e Skcat está relacionado com a velocidade de catálise, kcat elevado → reacção mais rápida
kcat
enzima substrato
Enzima
KM µM
Valores de KM e kcat para várias enzimas
E + S ES E + Pk1
k-1
kcat
Enzimas cataliticamente perfeitas: kcat/KM aproxima-se do limite da difusão: 108 – 109 s-1M-1
111
1
1kk
kkk
kkk
kKk
cat
cat
cat
cat
M
cat <+
=+
=−−
O limite de kcat/KM é o valor de k1. Este valor não pode ser superior ao da constante de velocidade do encontro da enzima com o substrato que é controlado pela difusão. < 1