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FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA

LA INHIBICIÓN DE LAS E3 UBIQUITIN-LIGASAS, A

TRAVÉS DE NF-кB Y p38, PREVIENE LA ATROFIA

MUSCULAR. UTILIDAD DE LA INDOMETACINA Y EL

ALOPURINOL

Presentado por:

Beatriz Ferrando Forés

Dirigida por:

Prof. D. José Viña Ribes

Prof. Dña. Mari Carmen Gómez Cabrera

Dra. Dña. Gloria Olaso González

Programa de Doctorado en Fisología. Valencia, 2014

FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA

Prof. D. José Viña Ribes, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Facultad de

Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.

Prof. Dña. Mari Carmen Gómez Cabrera, Profesora Titular del Departamento de

Fisiología de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.

Dra. Dña. Gloria Olaso González, Doctora en Químicas por la Universidad de

Valencia y Técnico Superior de Investigación en el Departamento de Fisiología de la

Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia.

CERTIFICAN:

Que Dña. Beatriz Ferrando Forés, Licenciada en Ciencias de la Actividad Física y

Deporte por la Universidad de Valencia, ha realizado bajo su dirección la presente tesis

titulada:

“LA INHIBICIÓN DE LAS E3 UBIQUITIN-LIGASAS, A TRAVÉS DE NF-кB Y

p38, PREVIENE LA ATROFIA MUSCULAR. UTILIDAD DE LA

INDOMETACINA Y EL ALOPURINOL”

Para la obtención del título de Doctora.

Y para que conste a los efectos oportunos, firman la presente certificación.

Valencia, a 4 de Abril de 2014.

Fdo. D. José Fdo. Dña. Mari. Carmen Fdo. Dña. Gloria

Viña Ribes Gómez Cabrera Olaso González

La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por:

- Beca de realización de contratos de personal investigador en formación del

Programa VALi+d. Concedida por la Generalitat Valenciana, Conselleria

d’Educació.

- Beca para estancias de becarios y contratados predoctorales en centros de

investigación en el extranjero (2012). Concedida por la Generalitat Valenciana,

Conselleria d’Educació.

No creía que fuese tan difícil escribir los agradecimientos de una tesis doctoral,

pero llegado el momento me he dado cuenta de que no hay palabras para agradecer a

todas aquellas personas que me han acompañado, a lo largo de estos años, a recorrer

este camino lleno de esfuerzo, trabajo, dedicación, ilusión y pasión.

Primero de todo, quiero agradecérselo a mis directores de tesis, los cuales me

han ayudado a llevar a cabo este trabajo y a los que agradezco, de todo corazón, la

formación tan valiosa que me han dado. Les doy las gracias por su trabajo, pero también

por haber confiado y creído en mí.

Al Dr. José Viña, me gustaría agradecerle la oportunidad que me brindó al

aceptarme para formar parte de su gran familia científica y por la confianza que ha

depositado en mí durante todos estos años. Sin duda, sus conocimientos y su

experiencia han sido la clave de esta tesis doctoral. Gracias, también, por recordarme

que en ciencia, como en la vida, debemos saber caminar antes de aprender a correr.

A la Dra. Mari Carmen Gómez, principalmente, me gustaría darte las

GRACIAS por recibirme aquel primer día en tu despacho, sin conocerme y sin que

hubiese terminado aún la licenciatura, en el que me diste un voto de confianza, me

presentaste al Dr. Viña y me mostraste este nuevo mundo de la investigación, del cual

ya me siento parte completamente. Eres todo un ejemplo para mí y para todas aquellas

personas que disfrutan “haciendo ciencia”, por toda la dedicación y vocación

investigadora que nos transmites día a día.

A la Dra. Gloria Olaso, por todo el apoyo y la ayuda que me has brindado

durante todos estos años. No pierdas nunca esa sonrisa con la que, pacientemente, nos

recibes cada vez que nos asomamos por los despachos en busca de los jefes.

A Consuelo Borrás, Chelo, porque siempre has tenido tiempo para mí cuando te

he necesitado, por enseñarme que siempre se le puede dar una vuelta de tuerca a un

resultado sea positivo o negativo y que siempre hay que buscar el por qué del mismo.

A Ana Lloret, por ser tan cercana a nosotros, porque siempre me has escuchado

y hablado con total sinceridad. Gracias por demostrarme que con tenacidad las cosas

terminan consiguiéndose.

A Juan Gambini, por estar siempre dispuesto a ayudarnos para solucionar

cualquier problema sobre protocolos. Me dijiste que te “enfadabas” porque cada año iba

cada vez menos a “molestarte” a tu despacho, pero en realidad sabes que siempre que lo

he necesitado he llamado a tu puerta y sé que siempre la has tenido abierta para darme

buenos consejos.

Al Dr. Miguel Cerdá y a la Dra. Concha López, por dejarme un huequecito de

bancada en vuestro laboratorio y por tratarme como a una más cada vez que subía a

analizar las muestras histológicas. Miguel, te estaré siempre agradecida no solo por todo

lo que me has enseñado de histología y morfología, sino por todas las conversaciones

sobre ciencia, por tener siempre la puerta de tu despacho abierta cuando lo he

necesitado y, sobre todo, por demostrarme que era capaz de hacer cosas que no creía

poder hacer.

A la Dra. Rosario Gil, desde el primer día que me viste por el pasillo de

Patología te interesaste por mi trabajo y durante estos años has seguido preocupándote

tanto por cómo iba mi tesis como por mí. ¡Eres una gran y bellísima persona!

A mis compañeros de laboratorio, con los que he compartido muchísimas horas

de bancada, risas y buen rollo en los últimos casi 5 años.

Empezando por el grupo Ejercicio:

Fréderic, tú me presentaste a mis compañeros de fatiga NF-κB y p38, con

paciencia me enseñaste a planificar experimentos, a leer y entender los protocolos y,

sobre todo, a ser precisa y rigurosa en mi trabajo. Sin duda, tuve una gran suerte de que

te cruzaras en mi camino, has sido un gran maestro y mejor persona. A Fabían, por

ocuparte de mí y enseñarme a manejarme en el laboratorio hasta la llegada de Fred. A

Vladimir y Rebeca, porque sin vosotros el laboratorio no hubiese sido lo mismo. A

Helios, vaya dos, a la par con el TFM y ahora con la tesis, ¡mucho ánimo! Ya mismo

iniciamos nuestra nueva etapa investigadora como postdocs. A Thomas, un gran

científico y mejor amigo, sé que llegarás tan lejos como te propongas. A Helena,

Andrea, Frederic S. gracias por estos últimos años en el lab, no perdáis nunca ese buen

rollo que tenéis y recordad que “yendo solos llegareis rápido, pero si lo hacéis en buena

compañía llegareis lejos”. Finalmente y, en especial, agradecerle a Carlos, un futuro

gran médico, todas las horas (muchas) y ayuda prestada en el montaje de jaulas,

suspensión de ratones y en la medición de las fibras (creo que sin ti me hubiese vuelto

loca con tanto azul y marrón). Sin olvidarme de toda las incidencias informáticas que

me has solucionado. Sé que lo sabes, pero no dudes nunca que aquí tienes una amiga

para lo que necesites.

Siguiendo con el grupo de Envejecimiento, agradecer todos esos buenos

momentos, tanto en el laboratorio como fuera de él, a Vicent, Mariya, Rubén, Khira,

Marta, Cristina, Lucía y Mar (nuestra mami, tanto para cuidarnos como para

regañarnos, cuando nos lo merecemos, pero siempre con cariño).

Y finalmente, al grupo de Alzheimer: Paloma, empápate de todos los

conocimientos de tus “compis” seguro que llegarás a buen puerto. Tanja me has

demostrado ser una gran compañera de trabajo y una gran amiga. Gracias, también, por

las múltiples ayudas con el inglés durante estos años. Esther, nuestra postdoc, te estaré

eternamente agradecida por compartir conmigo toda tu experiencia en el laboratorio y

por tus grandes y valiosísimos consejos tanto en lo experimental como en lo personal.

Durante estos años, para mí, te has convertido en un pilar dentro del laboratorio y una

amiga fuera de él, gracias de corazón.

A Consuelo porque, aunque nos hayas “abandonado” temporalmente, has

seguido formando parte de esta gran familia científica. Gracias por estar siempre

dispuesta a ayudarme en mis primeros años en el laboratorio, por tu ayuda con el GSH,

GSSG y MDA cuando para mí aún eran casi unos desconocidos. No sabes la alegría que

me da volver a verte por el laboratorio.

A Javier, nuestro eficaz técnico, siempre tan atento y dispuesto a solucionarnos

de la manera más eficiente cualquier problema.

A Marilyn, por tener tanta paciencia con todos nosotros, porque somos muy

cansinos y cada dos por tres estamos delante de tu mesa hablando más alto de la cuenta,

por no perder nunca la sonrisa al pedirnos amablemente que bajemos el volumen. Y sin

olvidarme de tu inestimable ayuda con el inglés, gracias.

A Mika, Elisa, Enrique, Ernesto, Ana, Sara, Analissa, Nuno y Graça, por

todos los momentos compartidos y porque vuestra estancia en Valencia ha dejado, sin

duda, una huella inolvidable en mí.

A los compañeros del CIBERER: Dr. Federico Pallardó, José Luis, Ana,

Gema, Isa, Marta y Santi.

A las chicas de Anatomía Patológica: Lisandra, Amparo, Maria, Beatriz y

Lara, porque durante estos años siempre que he necesitado un rayito de sol sabía que

podía subir a la 1E y con vosotras todos los nubarrones, experimentales o no,

desaparecían. En especial a Teresa, gracias por enseñarme la técnica de

inmunohistoquímica y por socorrerme las primeras veces que no me atrevía sola con la

“olla exprés”; aunque tu aportación más valiosa ha sido, sin duda, en el ámbito personal,

contigo podían desaparecer hasta las peores tormentas, gracias por estar siempre ahí.

A Jose Benavent, por tu paciencia al enseñarme a procesar las muestras para la

histología y por involucrarte tanto en mi trabajo, ingeniando nuevos métodos, para que

todo el trabajo saliese a la perfección (creo que si contamos las vueltas iniciales que les

dimos a esos sóleos para incluirlos en parafina nadie se lo cree).

Gran parte del tiempo invertido en esta tesis doctoral se ha realizado en el

animalario, gracias a las veterinarias Inma, por implicarte tanto en el estudio de las

ratas y estar siempre dispuesta a enseñarnos, y Ana, por estar presente y ayudarnos

tantísimo en todos los sacrificios. Agradecer también a todos los técnicos del animalario

Pili, Ana, Eli y Rafa, por ayudarme con los procedimientos con los animales día a día

durante estos años.

Al Dr. Luis Such y al Dr. Alberola, por todos los ánimos, ayuda y consejos que

me habéis brindado durante todos estos años y en especial en la recta final de la tesis.

Al Dr. Carlos Hermenegildo, por todos los consejos que me has ofrecido

durante estos años. A la Dra. Susana Novella, al Dr. Pascual Medina y la Dra. Gloria

Segarra todo un ejemplo de dedicación, y al resto del grupo L.In.C.E., en especial a

Carlos, Dani, Ana y Xavi, porque los experimentos en agosto fueron mucho más

llevaderos sabiendo que estábais al otro lado del pasillo y porque siempre se puede

contar con vosotros.

A Javier Miranda y Elena Monsalve, por despertar en mí esa pasión por la

Fisiología durante la Licenciatura. Javier, gracias por recomendarme acudir a Mari

Carmen cuando te dije que quería iniciarme en la investigación en fisiología, no podrías

haberme dado un mejor consejo, gracias.

A Gabriel Brizuela, porque nunca olvidaré mis inicios científicos en

biomecánica durante 5º de FCAFE. Gracias por abrirme los ojos y hacerme ver que la

fisiología me apasionaba tanto como la biomecánica. Sin lugar a dudas, tú eres el

“culpable” de que emprendiese este camino, me diste el empujón que necesitaba para

hablar con Javier y cinco años más tarde termino mi periodo predoctoral con la defensa

de esta tesis. Eres una gran persona, dispuesta a ayudar a todos los que te rodean y a

luchar por lo que crees, gracias por estar siempre ahí.

A las “secres” del departamento de Fisiología: Mari, Elena y Eva, por toda

vuestra ayuda y eficiencia con la burocracia, los papeles y demás procesos en los que os

he necesitado. Mari, al fin entregué todos los papeles, pasé todas las comisiones, pero

sabes que volveré a tu mesa a preguntarte por el siguiente paso.

A Inma Cerisuelo, por esos “buenos días” con los que me recibes al entrar en el

laboratorio (ya te dije cuanto eché de menos escucharlo durante mi estancia en Rennes),

por todas las conversaciones, ánimos y palabras de apoyo que me has dado durante

estos años. No pierdas nunca esa alegría, vitalidad y energía que nos transmites.

I would like to thank to the “Laboratoire Mouvement, Sport, Santé (MS2)” of

the University Rennes 2 for the kind treatment during my three months there. Specially,

I want to thank to Dra. Arlette Delamarche, it was a pleasure for me to have the

opportunity to work in your laboratory. Luz, for being so nice to me and treat me with

so much love from the first day I arrived to the laboratory. Amelie, by being aware of

me and making me feel part of the laboratory. In general, all the people that shared with

me my stay at Rennes, certainly your sweetie and attempts to teach me French during

the lunch time made more enjoyable my days in the laboratory.

Fred, you repeat acknowledgment, but this is dedicated to Elodie, and all your

friends for making me so nice my stay at Rennes, I'll never forget my debut in King

Ball.

To my training partners in Rennes, Lucy, Solène, Thibault, Jade, Marine, and

Geoffrey, thank you for making my stay wonderful. Thanks, specially, to Marc,

for all the help that you lent me, you are a great coach and a wonderful person

and France, a great friend, without you my stay at Rennes had not been the

same. Thanks for “opening me the doors of your home”. I will wait for you in

Spain.

A todos mis amigos, sin excluir a ninguno, pero en especial a Ana, Cris, Marta,

Silvia, Amaya, Clara, Daniela, Ester y Adrián (Pauni), porque a pesar de la distancia

siempre habéis estado a mi lado, gracias por vuestra infinita comprensión al no

dedicaros todo el tiempo que merecíais durante esta etapa.

A Fernando, simplemente por estar SIEMPRE ahí, no sabría sintetizar en una

frase todo lo que me has apoyado en todo, muchísimas gracias por todo lo que hemos

vivido a lo largo de tantos años.

A Gonzalo, no sé si eres consciente que siempre has estado a mi lado a la hora

de decidir qué camino tomar en mi carrera investigadora, gracias por escucharme

siempre.

A Joan, por ser tan bueno y cuidarme tanto, si diesen el premio al mejor

compañero de piso te lo llevabas de calle. Gracias, porque de tanto escucharme hablar

de mis ratones y sus tratamientos, el alopurinol, la xantina oxidasa, NF-кB y p38,

llegaron a formar parte de tu vocabulario. Gracias, también, por las incidencias

informáticas y las noches que te has peleado con mi Tablet.

A mi entrenador, José Peiró, por hacerme ver la ciencia desde otro punto de

vista, por su apoyo, comprensión y por aguantar más de una “oleada” al salir del

laboratorio. A Inma Huerta por quedarte conmigo en el gym cuando llegaba a horas

intempestivas a entrenar; a Javier Ginés y a mis compañeros de entrenamiento y

amigos de las pistas, porque de alguna forma u otra todos habéis acabado sufriendo mi

tesis (ganándome a pulso algún que otro apodo relacionado con mis animalitos, que

mejor no nombraré). Gracias por animarme siempre a seguir adelante.

Familia López-Grueso, Manoli, Manolo, Sergio y Bea, por preocuparos tanto

por mí, por apoyarme y darme tantos ánimos durante la realización de esta tesis. Y

sobre todo, por hacerme sentir como un miembro más de la familia. Gracias, de

corazón, por ese cariño andalú que me hacéis llegar desde Las Navas.

Gracies a la meua família, als meus tios: Mari Tere, Mª José i Miguel, per estar

sempre al meu costat recolzant-me en tot allò que faig, i en especial a la meua tia

Beatriz, mai oblidaré el dia que vaig decidir entrar en aquest laboratori, en una de les

nostres últimes converses en la que et contava il·lusionada i amb una mica de por tot el

que m’havien explicat que faria i tu m’animaves per a començar aquesta aventura, se

que estaries orgullosa. Als meus cosins: Miguel Angel, Núria, Leyre (gràcies per la

magnífica portada), a Isaac, Sara i els cosins polítics, gracies a tots per mostrar tant

d’interès en la meua tesis, a pesar de no saber ben be el que estava fent en tant de ratolí,

el vostre suport i els vostres ànims han fet possible aquesta tesis doctoral. A Kiara, la

nostra xiqueta, per perdonar-me no compartir més moments, en els teus primers mesos

de vida, durant la recta final de la tesis, t’ho recompensaré. Als meus iaios, pel vostre

carinyo i la vostra comprensió, per preocupar-vos sempre de com anava la tesis i com

estaven els ratolinets i les ratetes, per entendre que no pogués anar a Benicarló molts

caps de setmana que tenia experiments; gracies per ensenyar-me tantes coses, entre elles

que si tens passió per la feina que fas acaba per importar-te poc les hores de més que li

dediques.

A Raúl, mi Dr. Enreas, por demostrarme, desde mí llegada al laboratorio, que

eres un gran compañero de bancada y un gran amigo. Por contagiarme esa pasión por la

ciencia, la curiosidad y el afán de descubrir, saber y aprender que te caracterizan.

Gracias por acompañarme en este viaje en la montaña rusa denominada Tesis Doctoral,

por disfrutar conmigo de todas las alegrías y por secarme los “lagrimones” y animarme

a seguir en los malos momentos. Gracias por permitirme compartir tu vida con la mía.

Finalment, GRÀCIES, a la meua germana, Cristina (sempre seràs la meua

Enana), i als meus pares, Pepe i Eugenia, per creure en mi, per recolzar-me i donar-me

suport en tot allò que faig. Perquè sempre m’heu acompanyat i empentat cap endavant

en cadascuna de les aventures en les que m’he embarcat. Per animar-me i ajudar-me

sempre a lluitar pels meus somnis i per ensenyar-me que “voler es poder” i que tot

esforç te la seua recompensa. GRÀCIES PER SER ELS PILARS DE LA MEUA

VIDA.

Lo que caracteriza al hombre de ciencia no es

la posesión del conocimiento o de verdades

irrefutables, sino la búsqueda desinteresada e

incesante de la verdad.

(Karl Popper)

ÍNDICE GENERAL

Índice general

III

RESUMEN/ABSTRACT

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................. 1

1.1. Radicales libres ..................................................................................... 3

1.1.1. Génesis de radicales libres ..................................................... 3

1.1.1.1. Sistema hipoxantina/xantina oxidasa ............................. 5

1.2. Defensa antioxidante ............................................................................ 14

1.2.1. Antioxidantes enzimáticos ..................................................... 15

1.2.1.1. Superóxido dismutasa .................................................... 15

1.2.1.2. Catalasa .......................................................................... 16

1.2.2. Antioxidantes no enzimáticos ................................................ 17

1.2.2.1. Alopurinol ...................................................................... 17

1.2.2.2. Papel del alopurinol en la protección del músculo

esquelético .................................................................................. 21

1.3. Estrés oxidativo .................................................................................... 27

1.3.1. Estrés oxidativo y daño a biomoléculas ................................. 27

1.3.1.1. Daño oxidativo a lípidos ................................................ 27

1.3.1.2. Daño oxidativo a proteínas ............................................ 28

1.3.2.3. Daño oxidativo al DNA ................................................. 29

1.3.1.4. Daño oxidativo a glúcidos ............................................. 30

1.3.2. Indicadores de estrés oxidativo .............................................. 30

1.4. Atrofia muscular ................................................................................... 31

1.5. Atrofia muscular durante la inmovilización o inactividad muscular .... 34

1.5.1. Modelo de inducción de atrofia muscular en animales:

suspensión de miembros posteriores .............................................. 35

1.5.2. Vías de señalización comunes en la atrofia inducida por

inactividad muscular ....................................................................... 38

1.5.3. Inmovilización y estrés oxidativo .......................................... 43

Índice general

IV

1.5.3.1. Efecto de la inmovilización sobre el estrés

oxidativo en el músculo esquelético ........................................... 44

1.5.3.2. Producción y fuentes de radicales libres ........................ 46

1.5.3.3. Papel de la vía ERO/MAPKinasa p38 en el

músculo esquelético .................................................................... 48

1.5.3.4. Evolución de la defensa antioxidante

enzimática y no enzimática ........................................................ 49

1.5.4. Inmovilización y sistema ubiquitin-proteasoma:

Papel de las E3 ubiquitin-ligasas ..................................................... 50

1.5.5. Inmovilización y la vía molecular IGF-1/Akt ....................... 55

1.5.6. Descripción del factor de transcripción nuclear kappaB

(NF-кB) ............................................................................................ 57

1.5.6.1. Translocación de NF-кB al núcleo ................................. 58

1.5.6.2. Vías de activación de NF-кB ......................................... 60

1.5.6.3. Efecto de la inmovilización sobre NF-кB ...................... 64

1.6. Relación entre los 4 sistemas de regulación muscular durante la

inmovilización o suspensión ........................................................................ 66

1.6.1. Relación entre estrés oxidativo y la vía IGF/Akt .................. 66

1.6.2. Relación entre estrés oxidativo y NF-кB ............................... 67

1.6.3. Interacción entre las vías y su relación con el

sistema-ubiquitin-proteasoma durante la inmovilización

o suspensión. Resumen .................................................................... 69

1.7. Atrofia muscular durante la diabetes .................................................... 73

1.7.1. Tipos de diabetes mellitus ..................................................... 73

1.7.1.1. Diabetes tipo 1 ............................................................. 74

1.7.1.2. Diabetes tipo 2 ............................................................. 75

1.7.1.3. Diabetes gestacional .................................................... 75

1.7.2. Modelo experimental en la diabetes:

inducción química por estreptozotocina .......................................... 76

1.7.3. Estrés oxidativo y su papel en las complicaciones asociadas

a la diabetes ...................................................................................... 77

Índice general

V

1.7.4. Complicaciones músculoesqueléticas en la

Diabetes Mellitus ............................................................................. 78

1.7.5. Mecanismos moleculares implicados en la

atrofia muscular en la diabetes mellitus .......................................... 81

2. OBJETIVOS/AIMS ............................................................................... 85

3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................. 91

3.1. Materiales ............................................................................................. 93

3.1.1. Animales de experimentación ................................ 93

3.1.1.1. Ratas Wistar macho ..................................................... 94

3.1.1.2. Ratones wild-type y muscle IKKα

knockout hembra y macho ......................................... 96

3.1.1.3. Ratones wild-type C57BL/6J macho .............. 98

3.1.1.4. Ratas Wistar Ham macho .............................. 101

3.1.2. Aparatos .............................................................. 103

3.1.3. Material de laboratorio ......................................... 105

3.1.4. Reactivos ............................................................. 106

3.1.5. Kits de ensayo por inmunoabsorción ligado

a enzimas....................................................................... 110

3.2. Métodos ................................................................................................ 111

3.2.1. Modelo de suspensión de las extremidades

Posteriores para roedores, adaptación de

Morey-Holton y Globus .................................................. 111

3.2.2. Determinación de la actividad de la

Xantina Oxidasa ............................................................ 113

3.2.3. Determinación de MDA por HPLC ........................ 115

3.2.4. Extracción y separación de proteínas de la fracción

citosólica y nuclear del músculo esquelético ................... 118

3.2.5. Extracción de proteínas totales del músculo

esquelético .................................................................... 118

http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html

Índice general

VI

3.2.6. Método para determinar la concentración de

Proteínas ....................................................................... 119

3.2.6.1. Método de Lowry ........................................................ 119

3.2.6.2. Método de Bradford ..................................................... 121

3.2.7. Análisis por Western Blotting ............................................... 122

3.2.7.1 Separación electroforética de las proteínas ................... 123

3.2.7.2. Transferencia de las proteínas a la membrana ............. 123

3.2.7.3. Separación electroforética de las proteínas .................. 124

3.2.7.4. Anticuerpos primarios y secundarios........................... 124

3.2.7.5. Interpretación y cuantificación de los resultados......... 125

3.2.8. Proteínas carboniladas ........................................................... 125

3.2.9. Aislamiento de RNA de tejido músculo esquelético ............. 126

3.2.10. Cuantificación de la concentración de RNA........................ 129

3.2.11. Retrotranscripción-Amplificación del RNA

(RT-PCR) en tiempo real ................................................................. 130

3.2.11.1. Síntesis de cDNA: Retrotranscripción (RT) .............. 130

3.2.11.2. Amplificación cuantitativa del RNA

(RT-PCR en tiempo real) .......................................................... 132

3.2.12. Determinación de la concentración plasmática

de glucosa mediante el método de Trinder ...................................... 137

3.2.13. Determinación de la actividad de NF-кBp65 en

extractos nucleares de músculo sóleo .............................................. 139

3.2.14. Determinación de las concentraciones

plasmáticas de 6-keto prostaglandinas F1α ..................................... 143

3.2.15. Determinación de la concentración muscular de IL-6 ......... 147

3.2.16. Determinación de las concentraciones plasmáticas

de insulina ........................................................................................ 151

3.2.17. Determinación de las concentraciones plasmáticas

de fructosamina ................................................................................ 155

3.2.18. Inclusión de muestras para el estudio histológico ............... 158

3.2.19. Corte sobre bloque de parafina ............................................ 160

3.2.20. Estudio de la atrofia muscular:

Técnicas morfológicas e inmunohistoquímicas ............................... 161

3.2.20.1. Tinción de Reticulina de Gomori .............................. 161

Índice general

VII

3.2.20.2 Tinción de Hematoxilina-Eosina ................................ 163

3.2.20.3. Reacción del ácido periódico de Schiff (PAS) .......... 165

3.2.20.4. Estudio inmunohistoquímico ..................................... 167

3.2.21. Valoración de los resultados histológicos ............................ 170

3.3. Análisis estadístico de los resultados ................................................... 172

4. RESULTS ............................................................................................... 173

4.1. Study No. 1: Effect of 14 days of hindlimb unloading in skeletal

Muscle atrophy in male Wistar rats. Prevention by allopurinol .................. 175

4.1.1. Allopurinol prevents soleus muscle atrophy

after 14 days of hindlimb unloading in rats ..................................... 175

4.1.2. Hindlimb unloading increases plasma and

soleus muscle XO activity. Prevention by allopurinol .................... 179

4.1.3. Effect of unloading and allopurinol administration

on protein levels of soleus muscle antioxidant enzymes ................. 180


on plasma levels of MDA ................................................................ 181


on soleus muscle and plasma protein carbonylation ........................ 182

4.1.6. Effect of unloading and allopurinol treatment on

the activation of p38-MAPK ........................................................... 183


the activation of NF-кBp65 ............................................................. 184


the MAFbx and MuRF-1 mRNA levels in soleus muscle ............... 186

4.1.9. Summary ................................................................................ 187

4.2. Study No. 2: Effect of 14 days of hindlimb unloading in muscle

Atrophy in mIKKα KO and wild-type mice ................................................ 188

4.2.1 mIKKα deficient mice are protected from soleus

muscle atrophy after 14 days of hindlimb unloading ...................... 188

Índice general

VIII

4.2.2. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on the protein

levels of antioxidant enzymes in gastrocnemius muscle ................. 192

3.2.3. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in

plasma MDA levels ......................................................................... 193

4.2.4. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in

the activation of p38-MAPK ........................................................... 194

4.2.5. Effect of unloading and deficiency of mIKKα

on the activation of NF-кBp65 in skeletal muscle ........................... 195


in the activation of Akt in skeletal muscle ....................................... 196


on MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b levels in soleus muscle ................ 197

4.2.8. Summary ................................................................................ 199

4.3. Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb unloading in skeletal

muscle atrophyin male C57BL/6J mice.Prevention by allopurinol

and indomethacin ......................................................................................... 200

4.3.1. Allopurinol and indomethacin prevent soleus muscle

atrophy after 14 days of hindlimb unloading in mice ...................... 200

4.3.2. Hindlimb unloading induces plasma and liver

muscle XO activation. Prevention by allopurinol ............................ 204

4.3.3. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin

administration on protein levels of soleus muscle antioxidant

enzymes ........................................................................................... 205


administration on plasma MDA levels ............................................ 206

4.3.5. Hindlimb unloading activates plasma 6-keto prostaglandin

F1α. Prevention by allopurinol and indomethacin ........................... 207


administration on IL-6 levels in gastrocnemius muscle .................. 208


treatment on the activation of p38-MAPK ..................................... 209


treatment on the activation of NF-кBp65 ........................................ 210

Índice general

IX


treatment on the activation of Akt in skeletal muscle ...................... 212

4.3.10. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment

on the MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b levels in soleus muscle .......... 213

4.3.11. Summary .............................................................................. 215

4.4. Study No. 4: Effect of α-galacto-oligosaccharides (OGT) in skeletal

muscle atrophy induced by streptozotocin in rats ....................................... 216

4.4.1. Effect of streptozotocin-induced diabetes and OGT

administration on hematological parameters ................................... 216

4.4.2. OGT prevents soleus muscle atrophy in

streptozotocin-diabetic rats .............................................................. 217

4.4.3. Effect of T1DM and OGT administration on protein

levels of soleus muscle antioxidant enzymes .................................. 218

4.4.4. Effect of T1DM and OGT administration on the

activation of p38-MAPK ................................................................. 219

4.4.5. Effect of T1DM and OGT administration on the

expression of NF-кBp65 .................................................................. 220

4.4.6. Summary ................................................................................ 221

5. DISCUSSION ......................................................................................... 223

5.1. Justification of the study ....................................................................... 225

5.2. Limitations of the study ........................................................................ 225

5.3. Soleus muscle atrophy associated to 14 days of

hindlimb unloading protocol ....................................................................... 226

5.4. Oxidative stress is involved in muscle atrophy associated to

hindlimb unloading ...................................................................................... 229

Índice general

X

5.5. Redox sensitive signaling pathways involved in muscle

atrophy associated to hindlimb unloading ................................................... 233

5.6. Inflammatory parameters are involved in muscle atrophy

associated to hindlimb unloading ................................................................ 238

5.7. Soleus muscle atrophy associated STZ-induced diabetes type1. ......... 243

6. CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ................................................... 247

7. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................... 253

8. ANEXO ................................................................................................... 291

ÍNDICE DE FIGURAS

Índice de figuras

XIII

1. INTRODUCCIÓN

Figura 1.1. Formas reducidas y oxidadas de la XOR ................................. 6

Figura 1.2. Esquema de la degradación de las purinas ............................... 7

Figura 1.3. Esquema de la inhibición de la xantina oxidasa

por el alopurinol. ......................................................................................... 19

Figura 1.4. Vías por las que se producen ERO en el músculo

esquelético durante periodos de inactividad ................................................ 45

Figura 1.5. Vía de degradación de proteínas por el sistema

ubiquitin-proteasoma ................................................................................... 51

Figura 1.6. Vía molecular IGF-1/Akt ......................................................... 57

Figura 1.7. Vía canónica de activación de NF-кB ...................................... 61

Figura 1.8. Vía no canónica de activación de NF-кB ................................. 62

Figura 1.9. Vía atípica de activación de NF-кB ......................................... 63

Figura 1.10. Vías moleculares que modulan la hipertrofia y

la atrofia muscular. ...................................................................................... 72

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 3.1 Rata Wistar y Ratón C57BL/6J durante el protocolo

de suspensión ............................................................................................... 112

Figura 3.2. Esquema aislamiento de RNA de tejido músculo

Esquelético .................................................................................................. 126

Figura 3.3 Modelo de amplificación de PCR a tiempo real ....................... 134

Figura 3.4. Etapas del ELISA. .................................................................... 143

Figura 3.5. Etapas del ELISA ..................................................................... 151

Figura 3.6. Esquema de la inclusión en parafina de una muestra

de sóleo previamente fijada ......................................................................... 160

Figura 3.7. Esquema del montaje de la imagen del corte

transversal del sóleo completo ..................................................................... 170

Figura 3.8. Imágenes de la medición del tamaño de las fibras tipo I ......... 171


Índice de figuras

XIV

4. RESULTS

Figure 4.1. Reticulin staining, staining of periodic acid-Schiff and

quantitative analyses of the cross-sectional area and the minimum

diameter of type I fibers in the soleus muscle of rats .................................. 176-177

Figure 4.2. Soleus muscle to body mass ratio, western blot and

densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain

in soleus muscle of rats. .............................................................................. 178

Figure 4.3. Results of XO activity in plasma and soleus muscle of rats .... 179

Figure 4.4. Results of Cu,ZnSOD and Catalase in soleus muscle of rats ... 180

Figure 4.5. Results of MDA levels in plasma in rats .................................. 181

Figure 4.6. Results of soleus muscle carbonylated proteins of rats ............ 182

Figure 4.7. Results of cytosolic p-p38-MAPK in soleus muscle of rats..... 183

Figure 4.8. Results of cytosolic phosphorylation NF-кBp65 in soleus

muscle of rats .............................................................................................. 184

Figure 4.9. Results of nuclear translocation of NF-кBp65 and

relative NF-кBp65 activity in soleus muscle of rats .................................... 185

Figure 4.10. Results of MAFbx and MuRF1 mRNA levels in soleus

muscle of rats ............................................................................................... 186

Figure 4.11. Summary of the Study No. 1: Effect of allopurinol in the

cell signaling pathway involved in the muscle atrophy induced by 14

days of hindlimb unloading in male Wistar rats .......................................... 187

Figure 4.12. Hematoxylin and eosin staining, myosin staining

specific of slow myosin heavy chain and the quantitative analyses

of the cross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber

in the soleus of male mice ........................................................................... 189-190

Figure 4.13. Western blot and densitometric analysis of slow skeletal

muscle myosin heavy chain in gastrocnemius of male mice. ...................... 191

Figure 4.14. Results of MnSOD and Cu,ZnSOD in gastrocnemius

muscle of male mice .................................................................................... 192

Figure 4.15. Results of MDA levels in plasma of male and female mice .. 193

Figure 4.16. Results of cytosolic p38-MAPK in gastrocnemius

muscle of male mice. ................................................................................... 194

Índice de figuras

XV

Figure 4.17. Results of phosphorylation of NF-кBp65 in the

cytosolic fraction of gastrocnemius muscle of male mice ........................... 195

Figure 4.18. Results of cytosolic Akt in gastrocnemius muscle

of male mice ................................................................................................ 196

Figure 4.19. Results of MAFbx, MuRF1, and Cbl-b mRNA

levels in soleus muscle of male and female mice ........................................ 197-198

Figure 4.20. Summary of the Study No. 2: Effect of 14 days of

hindlimb unloading in wild-type and mIKKα KO mice ............................. 199

Figure 4.21.Hematoxylin and eosin staining, myosin staining

specificof slow myosin heavy chain and the quantitative analyses

of thecross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber

in soleus muscle of mice. ............................................................................. 201-202

Figure 4.22. Soleus muscle to body mass ratio in soleus muscle of mice.

And Western blot and densitometric analysis of slow skeletal muscle

myosin heavy chain in gastrocnemius of mice ........................................... 203

Figure 4.23. Results of XO activity in plasma and liver of mice ............... 204

Figure 4.24. Results of MnSOD and Cu,ZnSOD in soleus muscle

of mice ......................................................................................................... 205

Figure 4.25. Results of plasma MDA levels mice ...................................... 206

Figure 4.26. Results of 6-ketoPGC1α concentration in plasma of mice .... 207

Figure 4.27. Results of IL-6 concentration in gastrocnemius muscle

of mice ......................................................................................................... 208

Figure 4.28. Results of phosphorylated p38 in gastrocnemius muscle

of mice. ........................................................................................................ 209

Figure 4.29. Results of phosphorylated NF-кBp65 in gastrocnemius

of mice ......................................................................................................... 210

Figure 4.30. Results of relative NF-кBp65 activity in gastrocnemius

muscle of mice. ............................................................................................ 211

Figure 4.31. Results of phosphorylation Akt in gastrocnemius muscle

of mice ......................................................................................................... 212

Figure 4.32. Results of MAFbx, MuRF1, and Cbl-b mRNA levels in

soleus muscle of mice .................................................................................. 213-214

Figure 4.33. Summary of the Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb

unloading in male wild-type C57BL/6J mice .............................................. 215

Índice de figuras

XVI

Figure 4.34 Results of tibialis anterior and gastrocnemius muscle

weight ......................................................................................................... 217

Figure 4.35. Results of MnSOD and Cu,ZnSOD in tibialis anterior

Muscle ......................................................................................................... 218

Figure 4.36. Results of cytosolic phosphorylation p38 in tibialis

anterior muscle ............................................................................................ 219

Figure 4.37. Results of cytosolic phosphorylation NF-кBp65 in tibialis

anterior muscle .......................................................................................... 220

Figure 4.38. Summary of the Study nº 4: Effects of

α-galacto-oligosaccharides (OGT) in streptozotocin-diabetic rats .............. 221

5. DISCUSSION

Figure 5.1. Positive and negative regulation of

NF-кB by COX-2, roles of prostaglandins .................................................. 240

ÍNDICE DE TABLAS

Índice de tablas

XIX

1. INTRODUCCIÓN

Tabla 1.1. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno ................................ 4

Tabla 1.2. Tipos de SOD y localización celular mayoritaria....................... 16

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Tabla 3.1. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión

en ratas Wistar. Número de animales por grupo ......................................... 94


en ratones mIKKα KO. Número de animales por grupo ............................. 97


en ratones C57BL/6J Número de animales por grupo ................................. 99

Tabla 3.4. Diseño del estudio sobre el efecto de la diabetes

en ratas Wistar Ham. Número de animales por grupo ................................. 101

Tabla 3.5. Relación de anticuerpos ............................................................. 109

Tabla 3.6. Relación de anticuerpos primarios ............................................ 109

Tabla 3.7. Reactivos y volumen para la RT ............................................... 131

Tabla 3.8. Condiciones de los ciclos térmicos ............................................ 132

Tabla3.9. Secuencia de los primers utilizados en la RT-PCR .................... 135

Tabla 3.10. Volúmenes, por muestra, de la reacción. ................................. 135

Tabla 3.11. Condiciones del termociclador para la RT-PCR ..................... 136

Tabla 3.12. Volúmenes, para cada una de las condiciones

de la reacción. .............................................................................................. 138


de la reacción ............................................................................................... 142


de la reacción ............................................................................................... 146


de la reacción ............................................................................................... 150


de la reacción ............................................................................................... 154


de la reacción ............................................................................................... 158


Índice de tablas

XX

Tabla 3.18. Relación de anticuerpo primario.............................................. 168

4. RESULTS

Table 4.1. Fasting glucose, fasting insulin and fructosamin

concentrations in plasma. ............................................................................ 216

ABREVIATURAS

Abreviaturas

XXIII

NOMENCLATURA

ABREVIATURA

NOMENCLATURE

4-Hidroxinonenal 4-HNE 4-Hydroxynonenal

Angstrom Å Angstrom

Ácido araquidónico AA Arachidonic acid

Absorbancia Abs Absorbance

Acetato sódico AcONa Sodium acetate

Acetilcolinesterasa AChE Acetylcholinesterase

Adenosín-5´-difosfato ADP Adenosin-5’-diphosphate

Proteína kinasa B Akt (PKB) Protein Kinase B

4-hidroxipirazolo (3,4-d)

pirimidina. Alopurinol

4 hydroxy pyrazolo (3,4-d)

pyrimidine

Adenosín-5´-monofosfato AMP Adenosin-5’-monophosphate

Análisis de la varianza ANOVA Analysis of variance

Proteína activadora 1 AP-1 Activator protein 1

Persulfato de amonio APS Ammonium persulphate

Adenosín-5´-trifosfato ATP Adenosin-5’-triphosphate

Blanco B White

Proteína x asociada a Bcl-2 Bax Protein X associated to Bcl-2

Célula B del linfoma 2 Bcl-2 B-cell lymphoma 2.

Proteína del linfoma 3 de células

B codificadas Bcl-3

B-cell lymphoma 3-encoded

protein

Linfoma de células B-extra largas Bcl-xL B-cell lymphoma-extra large

Mediador de la muerte celular

que interactúa con Bcl-2 Bim

BCL-2-interacting mediator of

cell death

Máxima unión Bo Maximal binding

Boletín Oficial del Estado BOE Official Bulletin of the State

Albúmina de suero bovino BSA Bovine Serum Albumin

Kinasa dependiente de ciclina 2 CDK-2 Cyclin-dependent kinase 2

Creatin kinasa CK Creatin kinase

Proteinas Skp1-Cullin1-F-box Complejo SCF Skp1, Cullins, F-box proteins

Ciclooxigenasa-1 y -2 COX-1 and -2 Cyclooxygenase-1 and -2

Área de la sección transversal CSA Cross sectional area

Ciclo umbral Ct Thresold cycle

Cu/Zn Superóxido Dismutasa Cu,ZnSOD Cu/Zn Superoxide dismutase

Diaminobenzidina

tetrahidroclorhídrica DAB

diaminobenzidine

tetrahydrochloride

Radioabsorciometría de doble

energía DEXA

Dual energy x-ray

absorptiometry

Ácido desoxirribonucleico DNA Deoxyribonucleic acid

2,4-dinitrofenilhidracina DNPH 2,4-dinitrophenylhydrazine

Deoxinucleótidos dNTPs Deoxynucleotides

Desoxicolato DOC Deoxycholate

DL-Ditiotreitol DTT DL-Dithiothreitol

Enzima ubiquitina de activación E1 Ubiquitin-activating enzyme

Enzima ubiquitina transportador

o de conjugación E2 Ubiquitin-conjugating enzyme

Abreviaturas

XXIV

Enzima Ubiquitin-ligasa E3 Ubiquitin-ligase enzyme

Extensor largo de los dedos EDL Extensor digitorum longus

Ácido etilendiaminotetraacético EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

Inmunoensayo enzimático EIA Enzyme immunoassay

Factor de iniciación eucariota de

la elongación 3 subunidad F eIF3-F

Eukaryotic translation initiation

factor 3 subunit F

Ensayo por inmunoabsorción

ligado a enzimas ELISA

Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay

Electromiografía EMG Electromyography

Óxido nítrico sintasa endotelial eNOS Endothelial nitric oxide

synthase Kinasas activadas por señales

extracelulares 1 y 2. Erk1/2MAPK

Kinases activated by

extracellular signals 1 and 2.

Especies reactivas de nitrógeno ERN Reactive nitrogen species

Especies reactivas del oxígeno ERO Reactive oxygen species

Dinucléotido de flavinadenina FAD Flavin adenine dinucleotide

Administración de alimentos y

medicamentos FDA Food and Drug Administration

Superóxido dismutasas

dependientes de hierro FeSOD Iron superoxide dismutase

Factor de transcripción FoxO-1 FoxO-1 Forkhead box protein O1

Transportador de glucosa GLUT2 Glucose transporter type 4

Transportadora de glucosa tipo 4 GLUT4 Glucose transporter type 4

Glucosa Oxidasa GOD Glucose oxidase

Aspartato amino transferasa GOT Glutamic oxaloacetic

transaminase

Glutatión peroxidasa GPx Glutathione peroxidase

Glutatión reducido GSH Reduced Glutathione

Glutatión oxidado GSSG Oxidized glutathione

Cromatografía líquida de alta

resolución HPLC

High-performance liquid

chromatography

Enzima peroxidasa de rábano HRP Horseradish peroxidase enzyme

Hipoxantina HX Hipoxanthine

Proteína inhibidora de apoptosis IAP Inhibitor apoptosis protein

Insuficiencia cardiaca crónica ICC Chronic cardiac insufficiency

Diabetes mellitus insulino

dependiente IDDM

Insulin dependent diabetes

mellitus

Factor de crecimiento insulínico

tipo 1 IGF-1 Insulin-like growth factor-1

Receptor tirosina kinasa del

receptor IGFR

Insulin-like growth factor-

1receptor

Inmunoglobulina M IgM Immunoglobulin M

IкΒ kinasas IKK IкΒ kinase

Interleuquina- 1 IL-1 Interleukine-1



Óxido nítrico sintasa inducible iNOS Inducible nitric oxide synthase

Receptor de insulina tirosin

kinasa IRS Insulin receptor tyrosine kinase

http://circ.ahajournals.org/content/113/13/1708.full

http://circ.ahajournals.org/content/113/13/1708.full

Abreviaturas

XXV

Inhibidor de кB IкB кB inhibitor

Kinasa c-Jun N-terminal JNK c-Jun N-Terminal Kinase

JunD proto-oncogen JunD JunD proto-oncogene

Kilodalton kDa Kilodalton

Factor Krüppel KLF15 Krüppel-like factor

Lipopolisacárido LPS Lipopolysaccharide

Mili amperios mA Milliamperes

Atrogina-1 MAFbx Muscle atrophy F-Box

Proteinas kinasas activadas por

mitogenos. MAPK

Mitogen-activated protein

kinase

Creatin kinasa muscular MCK Muscle creatin kinase

Malondialdehído MDA Malondialdehyde

Cadena pesada de la miosina MHC Miosin heavy chain

Agua ultrapurificada Milli-Q Ultra-purified water

Cadena ligera de la miosina MLC Miosin light chain

Manganeso superóxido dismutasa MnSOD Manganese Superoxide

Dismutase

RNA mensajero mRNA Messenger RNA

Transcriptasa reversa

MultiScribeTM MsRT

MultiScribe TM Reverse

Transcriptase

Diana de la rapamicina en

mamíferos mTOR

Mammalian target of

rapamycin

Nuevo Gen Realmente

Interesante Finger-1 muscular MuRF-1

Muscle Really Interesting New

Gene Finger-1

Proteína de diferenciación

miogénica MyoD

Myogenic differentiation

protein

N-acetil-L-cisteína NAC N-acetyl-L-cysteine

Nicotinamida adenina

dinucleótido NAD+ Nicotine Adenine Dinucleotide

Nicotinamida adenína

dinucleótido NADH

Reduced Nicotine Adenine

Dinucleotide

Factor Nuclear kappa B NF-кB Nuclear factor kappa B

Diabetes mellitus no insulino

dependiente NIDDM

Noninsulin-dependent diabetes

mellitus

Kinasa inductor de NF-кB NIK NF-кB-inducing kinase

Secuencia de localización nuclear NLS Nuclear Localization Sequence

Óxido nítrico sintasa neuronal nNOS Neuronal nitric oxide synthase

Óxido nítrico sintasa NOS Nitric oxide synthase

Antinflamatorios no esteroideos NSAID Nonsteroidal anti-inflammatory

drugs

unión no específica NSB Non-specific binding

α-galacto-oligosaccharidos OGT α-galacto-oligosaccharide

Inhibidor de la kinasa

dependiente de ciclina 1A p21Cip1

Cyclin-dependent kinase

inhibitor 1A

Protein kinasa activada por

estrés. p38 MAPK

Stress mitogen-activated

protein kinase

Gel de poliacrilamida PAGE Polyacrylamide gel

4-aminoantipirina PAP 4-aminoantipyrine

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4654




Abreviaturas

XXVI

Ácido periódico de Schiff PAS Periodic acid Schiff

Tampón fosfato salino-Tween PBS-T Phosphate buffered saline-

Tween

Pirrolidina ditiocarbamato PDTC Pyrrolidine dithiocarbamate

Polifluoruro de vinildeno PDVF Polyvinylidene fluoride

Prostaglandinas PGs Prostaglandins

Fosfatidilinositol-3-kinasa PI3K Phosphoinositide 3-kinase

Acetato de forbol miristato PMA Phorbol myristate acetate

Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

2-amino-4-hidroxipteridina Pterina 2-amino-4-hydroxy-pteridine

Regulado en el desarrollo y en las

respuestas al daño del DNA 1 REDD1

Regulated in development and

DNA damage responses 1

Dominio de homología a Rel RHD Rel homology domain

Resonancia magnética nuclear RMN Nuclear magnetic resonance

Retrotranscripción RT Retrotranscription

Amplificación cuantitativa del

RNA RT-PCR

Reverse transcription

polymerase chain reaction

Desviación típica S.D. Standard deviation

Dodecilsulfato sódico SDS Sodium dodecyl sulfate

superóxido dismutasa SOD Superoxide dismutase

estreptozotocina STZ Streptozotocine

actividad total TA Total activity

dominio de transactivación

C-terminal TAD

C-terminal transactivation

domain

ácido tiobarbitúrico TBA Thio-barbituric acid

ácido tricloroacético TCA Trichloroacetic acid

factores de crecimiento

transformante β TGF-β Transforming growth factor β

Factor de crecimiento

transformante β TGF-β Transforming growth factor β

3,3´,5,5´-tetrametillbenzidina TMB 3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine

Factor de necrosis tumoral α TNF-α Tumour-necrosis factor-α

Receptor 1 de TNF TNFR1 TNF receptor-1

Unidades arbitrarias U.A. Arbitrary Units

Voltios V Volt

Volumen/volumen v/v Volume/volume

Virus de inmunodeficiencia

humana adquirida VIH

Human immunodeficiency

virus

Silvestre WT Wild-type

xantina deshidrogenasa XDH xanthine dehydrogenase

xantina oxidasa XO Xanthine oxidase

xantina oxidorreductasa XOR la xanthine oxidoreductase

RESUMEN/ABSTRACT

Resumen

XXIX

RESUMEN

La atrofia del músculo esquelético se produce como consecuencia de múltiples

enfermedades y condiciones crónicas. Así mismo, reduce las opciones de tratamiento y

los resultados clínicos positivos, comprometiendo la calidad de vida por un aumento de

la morbilidad y la mortalidad. La producción de unos niveles mínimos de fuerza

muscular es un requisito para la realización de actividades de la vida diaria tales como

levantarse de una silla o subir escaleras. Una persona joven sana es capaz de desarrollar

este tipo de actividades sin ninguna dificultad, sin embargo tras un periodo de

inactividad largo que implique una pérdida de masa muscular este tipo de actividades

conllevan una elevada dificultad.

Tanto factores sistémicos como locales pueden iniciar la atrofia muscular. Los

factores sistémicos incluyen el aumento de la miostatina y los glucocorticoides, o la

falta de las hormonas anabólicas como la insulina o el factor-1 de crecimiento similar a

la insulina. Los factores locales incluyen la inactividad muscular, el reposo en cama,

inmovilización de miembros, la denervación muscular, distrofias musculares y el

envejecimiento muscular.

El fenómeno de pérdida de masa muscular está relacionado con el estrés

oxidativo y la inflamación en varias condiciones: inmovilización de las extremidades,

suspensión de miembros posteriores, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y sepsis.

Diversos autores han sugerido que la administración de antioxidantes protege el

músculo esquelético durante la suspensión. Sin embargo, los mecanismos moleculares

implicados en esta protección siguen siendo un tema de debate.

El objetivo principal de esta tesis doctoral es determinar los mecanismos

moleculares implicados en la pérdida de masa muscular tras un modelo de suspensión

de miembros posteriores en roedores y su posible prevención con tratamientos

farmacológicos, tales como la indometacina y el alopurinol. Este objetivo está basado en

las evidencias previas, encontradas por nuestro grupo de investigación, de la

implicación de la enzima xantina oxidasa en la generación de radicales libres en la

atrofia muscular.

Resumen

XXX

Para llevarlo a cabo hemos estudiado la principal vía de señalización sensible a

estrés oxidativo activada por mitógenos, p38MAPK, y la cascada inflamatoria de NF-

кB en la atrofia del músculo esquelético. Además, estudiamos la expresión de tres

conocidas E3 ubiquitin-ligasas musculares implicadas en la proteólisis: MAFbx, MuRF-

1 y Cbl-b. La pérdida de masa muscular durante la inactividad muscular es causada

tanto por la apoptosis de mionúcleos como por un desequilibrio entre la degradación y

la síntesis de proteínas; por esta razón hemos analizado Akt, una proteína quinasa que

desempeña un papel clave en múltiples procesos celulares, tales como metabolismo de

la glucosa y la síntesis de proteínas musculares.

Para la consecución de los objetivos de esta tesis se han llevado a cabo tres

estudios consecutivos relacionados. En el primer estudio, ratas Wistar macho sometidas

durante 14 días a un protocolo de suspensión de miembros posteriores, con o sin

tratamiento con alopurinol, se compararon con los controles. En el segundo estudio, se

utilizaron ratones silvestres y deficientes en IKKα en el músculo esquelético. En este

estudio asignamos aleatoriamente los animales al grupo control o al suspendido de las

extremidades posteriores. Por último, en el tercer estudio, ratones macho C57BL/6J,

sometidos a un protocolo de suspensión de miembros posteriores, con o sin los

siguientes tratamientos: indometacina, alopurinol o indometacina más alopurinol, se

compararon con los controles que deambulan libremente.

Nuestros resultados muestran que la suspensión de las extremidades posteriores

indujo una activación de la XO, un aumento del estrés oxidativo y de la inflamación,

tanto en el plasma como en el músculo esquelético. El estrés oxidativo activa las vías de

señalización p38 MAPK y NF-кB que conducen a la activación de las E3 ubiquitina

ligasas MAFbx y MuRF-1. La inhibición de la XO, con alopurinol, en ratas, y la

supresión IKKα en el músculo esquelético previene parcialmente la atrofia del músculo

sóleo. En relación a la vía de síntesis de proteínas, Akt, fue restaurada con el tratamiento

con alopurinol y parcialmente en los ratones KO mIKKα, por la inhibición de la E3

ubiquitin-ligasa Cbl-b.

El tratamiento que previno de forma más efectiva el proceso de atrofia muscular

fue la combinación de la indometacina más alopurinol. Esto está mediado por la

inhibición de la las vías p38-MAFbx y NF-кB-MuRF-1. Nuestros datos señalan un

beneficio potencial de la administración de indometacina junto con el alopurinol, para

Resumen

XXXI

astronautas, pacientes encamados durante periodos prolongados de inmovilización de

miembros, así como en la sarcopenia y la caquexia.

Por otro lado la atrofia del músculo esquelético es una de las complicaciones más

comunes en la diabetes. En este caso también existe un aumento de la degradación de

proteínas, así como una disminución de la síntesis de las mismas. Actualmente hay al

menos tres sistemas diferentes que han demostrado estar involucrados en la degradación

de proteínas: el sistema lisosomal, la activación de Ca2+ citosólico y el sistema ubiquitin

proteasoma. Un tema controvertido y que ha desatado mucho interés es el posible papel

de los radicales libres en la fisiopatología de la diabetes. Así pues, Oberley en 1988 ya

correlacionó el estrés oxidativo con la diabetes. La mayoría de los autores postulan el

papel del estrés oxidativo en el desarrollo de las complicaciones diabéticas debido al

daño tisular que producen los radicales libres. Sin embargo, existen algunos autores que

implican a los radicales libres no tan sólo en las complicaciones del diabético, sino

también en la misma etiología de la enfermedad. Esto se extrae a partir del estudio de

varios fármacos inductores de diabetes en animales de experimentación, como la

estreptozotocina y el aloxano, que destruyen selectivamente los islotes de Langerhans

pancreáticos por un mecanismo oxidante, y del hecho que su acción puede ser inhibida

por la administración de antioxidantes. No obstante, aunque se ha señalado

anteriormente que el estrés oxidativo juega un papel importante en la patología de la

diabetes y sus complicaciones, la información sobre el papel del estrés oxidativo en el

músculo esquelético en la diabetes y cómo prevenirla es muy limitada.

El objetivo de esta segunda parte de la tesis doctoral fue determinar los

mecanismos moleculares implicados en la pérdida de masa muscular en la diabetes

experimental inducida con estreptozotocina y su posible prevención con la

administración de α-galacto-oligosacáridos.

Para la consecución de los objetivos, se utilizaron ratas Wistar Ham macho

divididas en tres grupos experimentales: controles, ratas diabéticas (inducida por

estreptozotocina) y ratas diabéticas tratadas con α-galacto-oligosacáridos. Así mismo,

estudiamos el papel del estrés oxidativo asociado a la diabetes experimental inducida

con estreptozotocina sobre la masa músculo-esquelética en ratas. Así como el papel de

p38 y de NF-кB en la pérdida de masa muscular en un modelo de diabetes experimental.

Resumen

XXXII

Los resultados que obtuvimos de este estudio demuestran que el estrés oxidativo

asociado a la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas produce una pérdida

significativa de la masa muscular, debida, en parte, tanto a la fosforilación de p38 como

a la activación de NF-кB. El tratamiento con α-galacto-oligosacáridos previene el estrés

oxidativo y la fosforilación de p38 sin que se observe una prevención significativa en la

pérdida de masa muscular.

Abstract

XXXIII

ABSTRACT

Skeletal muscle atrophy is a debilitating consequence of multiple chronic

diseases and conditions. It reduces treatment options and positive clinical outcomes as

well as compromising quality of life and increasing morbidity and mortality. The

generation of critical levels of power are a prerequisite to perform simple tasks of daily

life, such as rising from a chair or climbing stairs. For a young healthy person these

activities can be performed easily, however after a prolonged period of forced inactivity

a loss of muscle mass occurs. Then simple tasks become increasingly difficult.

Both systemic and local factors can initiate muscle atrophy. Systemic factors

include increased myostatin and glucocorticoids; or a lack of anabolic hormones, such

as insulin or insulin-like growth factor-1. Local factors include muscle inactivity, bed

rest, limb immobilization, muscle denervation or muscular dystrophies, and muscle

ageing.

Recently it has been shown that muscle atrophy is linked to reactive oxygen

species production and an inflammation state when limbs are immobilized, during

hindlimb-unloading, in chronic obstructive pulmonary disease, and sepsis. Several

authors have suggested that administration of antioxidants protects skeletal muscle

during unloading. However, the molecular mechanisms involved in this protection

remain a topic of debate.

The major aim of this doctoral thesis was to determine the molecular

mechanisms involved in the loss of muscle mass induced by hindlimb unloading in

rodents and its possible prevention with drug treatments, such as indomethacin and

allopurinol. This objective is based on previous evidence found by our research group,

which shows the involvement of the xanthine oxidase enzyme in the generation of free

radicals in muscle atrophy.

For this purpose we have studied the main redox sensitive signaling p38

mitogen-activated protein kinase (MAPK) and the inflammatory cascade of NF-кB

involved in skeletal muscle atrophy. Furthermore we studied the expression of two well-

known muscle specific E3 ubiquitin ligases involved in proteolysis, MAFbx and MuRF-

Abstract

XXXIV

1. The loss of muscle mass during muscular inactivity is caused by both apoptosis of

myonuclei and by an imbalance between protein degradation and synthesis. For this

reason, we analysed Akt, a protein kinase that plays a key role in multiple cellular

processes, such as glucose metabolism and muscular protein synthesis, by inhibition of

the E3 ubiquitin-ligase Cbl-b.

To carry out the objectives of this thesis, we conducted three related consecutive

studies. In the first study, male Wistar rats conditioned by 14 days of hindlimb

unloading, with or without the allopurinol treatment, were compared with freely

ambulating controls. In the second study, were used female and male wild-type and

mIKKα KO mice randomly assigned to the control or hindlimb unloading groups.

Finally, in the third study, male C57BL/6J mice, conditioned by 14 days of hindlimb

unloading, with or without, indomethacin, allopurinol or indomethacin plus allopurinol

treatments, were compared with freely ambulating controls.

Our results show that the hindlimb unloading induced XO activation, increased

oxidative stress and inflammation, both in plasma and skeletal muscle. Oxidative stress

signaling activated p38 MAPK and NF-кB pathways that lead to activation of the E3

ubiquitin ligases MAFbx and MuRF-1. XO inhibition, by allopurinol, in rats, and the

suppression IKKα in skeletal muscle partially prevents the atrophy of the soleus muscle.

The protein synthesis pathway, Akt, was restored by treatment with allopurinol and

partly, in the KO mIKKα mice, by inhibiting the E3 ubiquitin ligase Cbl-b.

The most effective treatment to prevent the muscular atrophy process was the

combination of allopurinol plus indomethacin. This is mediated by inhibition of the p38

and NF-кB MAFbx-MuRF-1 pathways. Our data point out the potential benefit of

allopurinol and indomethacin administration for the bedridden, astronauts, limb

immobilization and sarcopenic and cachexia patients.

Furthermore skeletal muscle atrophy is one of the most common complications

in diabetes. In this case, there is also an increase in protein degradation and decreased in

its synthesis. Currently, there are at least three different systems which have proved to

be involved in protein degradation: the lysosomal system, activation of cytosolic Ca2+

and the ubiquitin proteasome system. A controversial topic that has triggered a lot of

interest is the possible role of free radicals in the pathophysiology of diabetes. Thus,

http://en.wikipedia.org/wiki/Serine/threonine-specific_protein_kinase

Abstract

XXXV

Oberley in 1988 correlated oxidative stress with diabetes. Most authors suggest the role

of oxidative stress in the development of diabetic complications due to tissue damage

produced by free radicals. However, some authors associate free radicals in not only

diabetic complications, but also in the etiology of diabetes itself. This is concluded from

a study of various drugs inducing diabetes in experimental animals, such as

streptozotocin and alloxan which selectively destroy pancreatic Langerhans islets by an

oxidative mechanism, and their action can be inhibited by the administration of

antioxidants. However, although it has previously been indicated that oxidative stress

plays an important role in the pathology of diabetes and its complications, the

information about the role of oxidative stress in skeletal muscle in diabetes, and how to

prevent it, is very limited.

To achieve our objectives, male Wistar Ham rats were randomly divided into

three groups as controls, diabetic rats (induced by streptozotocin) and diabetic rats

treated with α-galacto-oligosaccharides. Additionally, we studied the role of oxidative

stress associated with experimental diabetes induced by streptozotocin on skeletal

muscle mass in rats. We also studied the role of p38 and NF-кB in the loss of muscle

mass in a model of experimental diabetes.

The results obtained from this study show that oxidative stress associated with

streptozotocin-induced diabetes in rats produces a significant loss of muscle mass, due

in part to both the phosphorylation of p38 and activation of NF-кB. Treatment with α-

galacto-oligosaccharides prevents oxidative stress and phosphorylation of p38 but

significant prevention of loss of muscle mass was not observed.

INTRODUCCIÓN

Introducción

3

1.1. Radicales libres

Un radical libre es aquella especie química que contiene uno o más electrones

desapareados en su capa de valencia. Un compuesto se puede transformar en un radical

libre de diferentes formas: ganando un electrón, perdiendo un electrón o por fusión

homolítica simétrica de una unión covalente. La presencia de este tipo de electrones

hace que estas especies presenten una gran reactividad. Se caracterizan por su gran

poder oxidante y porque su vida media es normalmente muy corta, aunque varía según

el tipo de radical libre.

Estas moléculas son capaces de dañar estructuras esenciales para el desarrollo de

la vida, tales como (ácido desoxirribonucleico) DNA, proteínas, carbohidratos y lípidos

(Sies, 1983, Halliwell, 1985). Además, los radicales libres intervienen en procesos

fisiopatológicos como algunos cánceres, diabetes (Takada, 1982, Okamoto, 1985),

patologías cardiovasculares (Byers and Bowman, 1993), procesos reumáticos (Wolf SP,

1986), patologías gastroentéricas y afecciones broncopulmonares (Slade R, 1983), así

como en procesos neurodegenerativos como la Enfermedad de Alzheimer (Cross et al.,

1987). También están implicados en procesos fisiológicos como en el envejecimiento

(Harman, 1956) y el daño causado por el ejercicio físico (Davies et al., 1982a, Sastre et

al., 1992), entre otros.

1.1.1. Génesis de radicales libres

Los radicales libres pueden producirse a través de diversos procesos químicos

tanto dentro como fuera del organismo. Por lo que, atendiendo al origen de su

producción, podemos clasificarlos en radicales libres que proceden de fuentes

endógenas y exógenas (Freeman and Crapo, 1982).

En cuanto a las fuentes endógenas, la formación de cierta tasa de radicales libres

en las células es un proceso normal e inevitable (Slater, 1984) ya sea como producto de

desecho de una reacción química dada o como producto con una función bioquímica en

el organismo. Algunos ejemplos de estos procesos son: el transporte de electrones a lo

largo de la cadena respiratoria mitocondrial, la reacción de Fenton-Haber-Weiss, la

activación de los leucocitos, reacciones enzimáticas (como la catalizada por la xantina

Introducción

4

oxidasa), el metabolismo de los xenobióticos, los sistemas de transporte electrónico del

retículo endoplásmico, en los fagocitos activados y en microsomas o peroxisomas.

En los sistemas biológicos, los radicales libres son habitualmente moléculas de

oxígeno o moléculas formadas en parte por éste, lo cual hace que a este conjunto de

radicales libres se les denomine especies reactivas del oxígeno (ERO). Asimismo,

existen radicales libres nitrogenados o especies reactivas de nitrógeno (ERN) o radicales

libres centrados en otras moléculas, como el azufre (ver tabla 1.1).

Por otro lado, las fuentes exógenas más importantes en la generación de ERO

son: muchos agentes antineoplásicos como la adriamicina, bleomicina, daunorrubicina y

algunos antibióticos (Doroshow and Hochstein, 1982), la irradiación de los organismos

debido a las radiaciones electromagnéticas (rayos X y ) o debido a radiaciones de

partículas (electrones, protones, neutrones, deuterones y partículas y ) (Bielsky and

Gebieki, 1977) o los factores ambientales, como contaminantes aéreos fotoquímicos,

hiperoxia, pesticidas, humo del tabaco, solventes, anestésicos e hidrocarburos

aromáticos (Mason, 1982).

ESPECIE SÍMBOLO

Radical Superóxido O2•-

Radical hidroperóxido HO2

Peróxido de hidrógeno H2O2

Radical hidroxilo HO•

Radical alcóxido RO•

Radical peróxilo ROO•

Ozono O3

Óxido nítrico NO•

Dióxido de nitrógeno NO2

Anión peroxinitrito ONOO-

Tabla 1.1. Especies reactivas de oxígeno y nitrógeno.

Introducción

5

Dado que el sistema hipoxantina/xantina oxidasa es una fuente endógena de

radicales libres que juega un papel central en este trabajo, hemos creído conveniente

dedicarle más espacio que al resto, describiendo sus propiedades y características en

varios apartados.

1.1.1.1. Sistema hipoxantina/xantina oxidasa

La xantina oxidasa (XO) y la xantina deshidrogenasa (XDH) son formas

interconvertibles de la misma enzima, conocida como la xantina oxidorreductasa (XOR)

descrita originalmente como una aldehído oxidasa (Schardinger, 1902). Esta enzima

está ampliamente distribuida en diferentes especies de distinta complejidad, desde

organismos tan sencillos como las bacterias, hongos o insectos, hasta los mamíferos

más evolucionados como el hombre (Krenitsky et al., 1974, Parks, 1986), (Ichida et al.,

1993), (Glatigny and Scazzocchio, 1995). En los mamíferos se encuentra identificada

dentro de varios tejidos, incluyendo el hígado, intestino, pulmón, riñón, corazón, y

cerebro, así como el plasma. La función de la XOR, en las distintas especies, es

catalizar la hidroxilación de una amplia gama de sustratos como purinas, pirimidinas,

pterinas y aldehídos.

a) Estructura y formas de la xantina oxidorreductasa

La XOR es una molibdoflavoenzima compleja versátil, cuya forma activa de la

enzima es un homodímero de 290 kDa de peso molecular, donde cada uno de los

monómeros, de 145 kDa, actúa de forma independiente en la catálisis. Cada monómero

contiene 4 centros redox: un dominio intermedio con 1 molécula de dinucléotido de

flavinadenina (FAD) de 20 kDa, un dominio N-terminal, de 20 kDa, con 2 centros ferro-

sulfurados (Fe2-S2), un dominio C-terminal, de 85 kDa, que contiene 1 molécula de

molibdopterina con un átomo de molibdeno como cofactor y el sitio de unión al sustrato

(Bray, 1975, Hille and Massey, 1981).

La XOR posee en las distintas especies un peso molecular y una estructura

similar de los centros de oxidación-reducción (Hille and Nishino, 1995).

Introducción

6

La hidroxilación de la xantina se lleva a cabo en el centro de molibdopterina, la

disposición geométrica y los potenciales de oxidación-reducción de los grupos Fe/S y

del cofactor de molibdopterina indican que los electrones se transfieren desde el mismo

a los dos grupos Fe/S mediante un proceso termodinámicamente favorable. Como las

distancias entre los centros y el cofactor de molibdopterina son menores de 14 Å, el

mecanismo más probable por el que se transportan los electrones es el tunneling (Page

et al., 1999).

Como hemos comentado anteriormente existen dos formas funcionalmente

distintas de la XOR (Figura 1.1), ya que es sintetizada como xantina deshidrogenasa

(XDH, EC 1.1.1204) y se mantiene mayoritariamente como tal en la célula, pero puede

convertirse rápidamente en la forma oxidasa (XO, EC 1.1.3.22) de forma reversible o

irreversible mediante oxidación de los residuos sulfhidrilo o mediante proteólisis.

Ambas formas enzimáticas son el producto del mismo gen, tienen un tamaño

similar, el mismo número de subunidades y requieren los mismos cofactores (Hille and

Nishino, 1995). Además, las dos formas catalizan reacciones con un sustrato similar

pero, como veremos en el siguiente apartado, el aceptor de electrones durante la

reacción es distinto.

Figura 1.1. Formas reducidas y oxidadas de la XOR.

Introducción

7

b) Vías metabólicas en las que intervine

En 1963 Berne y Gerlach, independientemente, observaron en órganos aislados

que los productos de degradación de los nucleótidos de adenina se acumulaban durante

la hipoxia y uno de los productos liberados desde la célula era la hipoxantina (HX)

(Berne, 1963, Gerlach E, 1963). En los mamíferos, la enzima XOR cataliza la

hidroxilación de HX a xantina y esta a su vez para dar lugar a ácido úrico (Ver Figura

1.2).

Como hemos introducido en el apartado anterior, la XDH y la XO utilizan

distintos aceptores de electrones, ya que la XDH, que es la predominante en condiciones

fisiológicas, puede utilizar tanto el oxígeno como la nicotinamida adenina dinucleótido

(NAD+) como aceptor de electrones, aunque tiene preferencia por este último, para

producir NADH y urato. Además, puede ser transformada en XO, que es dependiente de

oxígeno, lo que origina radical O2• y/o H2O2 y urato (Parks and Granger, 1986).

Así pues, la XO se relaciona con diversos procesos patológicos y produce un

daño oxidativo a los tejidos y, en cambio, la XDH puede ser un importante componente

de la defensa del organismo contra el daño provocado por las ERO a través de la acción

del ácido úrico, descrito como un potente antioxidante (Becker, 1993). En tejidos sanos,

entre un 10 y un 30% de la actividad total de la enzima procede de la forma oxidasa

(Chambers et al., 1985).

Figura 1.2. Esquema de la degradación de las purinas.

Introducción

8

Esta enzima es la única del organismo capaz de sintetizar ácido úrico. En el ser

humano y los primates, hasta hace poco tiempo, se pensaba que éste era el último

escalón en la degradación de las purinas (ver figura 1.2), mientras que en otros

mamíferos la vía de degradación de éstas seguía a alantoína, ácido alantoico, ácido

glioxílico y finalmente ácido oxálico. La enzima responsable de que continúe esta

reacción es la uricasa, la cual no se expresa en el hombre y hace que la concentración de

ácido úrico en plasma sea 10 veces mayor que la concentración en las especies que sí la

expresan (Cutler, 1984).

Otra reacción que es catalizada por la XOR es la oxidación de NADH en

presencia de oxígeno produciendo O2•- (Nakamura, 1991). Esta actividad NADH se

considera que puede ser relevante en cuanto a la producción de ERO in vivo. Un hecho

que podría dar protagonismo a la actividad NADH oxidasa in vivo es el de que la

isquemia aumenta la concentración citosólica de NADH. Dicho aumento incrementa la

actividad de la NADH oxidasa de la XOR, lo cual podría aumentar la producción de

ERO por esta vía. Así mismo, la producción de O2•- por esta vía depende linealmente de

la concentración de oxígeno en un rango que va desde la del tejido isquémico a la del

tejido normóxico, no mostrando evidencia de saturación (Harris and Massey, 1997).

La XDH produce dos moléculas de O2•- y una de H2O2 por cada molécula de

NADH oxidada. La oxidación del NADH y su consiguiente producción de O2•- es

claramente más rápida por parte de la XDH que de la XO tanto en humanos como en

vacas (Sanders et al., 1997).

Por otra parte, se sabe que la enzima XOR cataliza la reducción de nitrato a

nitrito en condiciones anaeróbicas (Fridovich and Handler, 1962) y en la misma línea se

ha describió que la XO cataliza también la reducción del nitrito para la formación de

NO• en condiciones de hipoxia (Millar et al., 1997). Algunos estudios han visto que en

casos de isquemia en algunos tejidos, como el corazón, se produce óxido nítrico a través

de una vía diferente a la óxido nítrico sintasa (NOS), a partir de nitrito, sobretodo en

situación de acidosis (Samouilov et al., 1998).

Introducción

9

Tanto la xantina como el NADH pueden ceder electrones en la reacción, aunque

la xantina es la más eficiente. Cuando la xantina es el sustrato reductor el nitrito se une

al sitio molibdeno, mientras que cuando el reductor es el NADH se une al FAD, el cual

transfiere los electrones al sitio molibdeno, donde está el nitrito (Li et al., 2001).

Así como un exceso de NADH no tiene efecto inhibitorio en la reacción, un

exceso de xantina provoca la inhibición de la misma, probablemente por la unión de la

xantina al sitio molibdeno, bloqueando la unión del nitrito (Li et al., 2001).

Además, se ha demostrado que el pH ácido favorece la reacción, por lo que en

condiciones anaeróbicas o hipóxicas la enzima XO cataliza la formación de NO•, dando

lugar a dos moléculas de NO• por cada molécula de NADH, el cual cede dos electrones

que reducen cada uno una molécula de nitrito. En caso de ser la xantina el sustrato

reductor, por cada molécula de xantina oxidada se produce una molécula de NO•

(Godber et al., 2000), si bien otros autores refieren que son dos las moléculas de nitrito

reducidas por cada molécula de xantina oxidada (Li et al., 2001).

Tanto la XO como la XDH pueden formar NO•, siendo esta última 50 veces más

eficiente que la forma oxidasa (Godber et al., 2000), lo cual hay que considerar teniendo

en cuenta que in vivo la concentración intracelular de XDH es la forma predominante de

la XOR. Así, la formación de NO• por esta vía puede alcanzar los niveles que alcanza la

formación de NO• a través de la NOS. Si se tiene en cuenta que la NOS en condiciones

de hipoxia y acidosis se desnaturaliza, primero reversiblemente para luego hacerlo de

forma irreversible, la formación de NO• a través de la XOR puede tener gran

importancia. Inicialmente el NO• formado se acumularía durante el período isquémico,

provocando una vasodilatación compensatoria, mientras que en la fase de reperfusión,

éste podría reaccionar con el anión superóxido para formar peroxinitrito, el cual produce

nitración (nitrosilación) de proteínas y daño celular (Beckman et al., 1990).

Finalmente, podríamos destacar la importancia del efecto que adquiere la XO en

el estudio de los tejidos dañados por la acción de las especies reactivas del oxígeno,

pues si bien el radical O2•- es comparativamente inocuo por sí solo, su toxicidad se

incrementa mucho en presencia de hierro libre, ya sea por la formación de radical

hidroxilo (OH•), radicales ferrilos o radicales perferrilos. Ya que la liberación del hierro

de la ferritina, que puede ocurrir por 2 mecanismos: uno O2•- dependiente, responsable

Introducción

10

del 80% de esta separación, mientras que el otro es independiente de O2 (Harrison,

2002).

c) Distribución orgánica, celular y transporte de la enzima

Su actividad está ampliamente distribuida, aunque no tiene igual expresión en

todos los tejidos, puesto que los niveles más altos se encuentran en hígado e intestino.

Sin embargo, hay muchas diferencias entre especies ejemplificadas por el amplio rango

de niveles encontrados en sangre (Parks and Granger, 1986) y corazón (de Jong et al.,

1990, Werns and Lucchesi, 1990). Muchos autores han obtenido evidencias de la

localización tisular de la enzima mediante el empleo de técnicas inmunológicas usando

anticuerpos anti-XOR. De esta forma se han detectado XO humana en hepatocitos,

sobre todo en región periportal, y células de Kupffer en el hígado, en enterocitos y en

células Goblet del yeyuno y en la glándula mamaria (Linder et al., 1999). Además, la

enzima ha sido encontrada en el endotelio capilar del yeyuno, células endoteliales del

músculo esquelético y riñón, macrófagos y mastocitos (Hellsten-Westing, 1993). Así

como en las células epiteliales del tracto biliar, lo que sugiere secreción de XOR hacia

la bilis.

La localización subcelular de XOR también ha sido objeto de debate. Jarasch y

colaboradores informaron de que la enzima era citosólica y que se encontraba

exclusivamente en las células endoteliales de tejido bovino (Jarasch et al., 1981). Sin

embargo, estudios posteriores mostraron actividad enzimática de la XOR en los

peroxisomas de hepatocitos de rata (Angermüller et al., 1987, Dikov et al., 1988), pero

estos hallazgos fueron puestos en duda por Ichikawa, que concluyó que la enzima no se

asocia a ningún orgánulo intracelular y que está ubicada tanto en el citosol como en la

superficie externa de membrana celular (Ichikawa et al., 1992), con una concentración

mayor alrededor del núcleo, lo cual puede significar una localización estratégica para la

activación de factores de transcripción nucleares (como, por ejemplo, NF-кB) a través

de los radicales libres que produce la enzima (Rouquette et al., 1998).

Además, estos autores han demostrado la presencia de la XOR en la cara externa

de la membrana celular, en la que muestra una distribución polarizada, de forma que se

concentra en la superficie que tiene contacto con células vecinas; lo cual, podría

favorecer también la transmisión de señales entre células a través de los radicales libres

formados por la enzima.

Introducción

11

El conocimiento de la unión de la enzima a la superficie celular está respaldada

por la demostración, tanto de la enzima como de las consecuencias de su actividad, en

tejidos que originalmente presentan poca actividad XOR, de forma que tras aumentar la

liberación de esta enzima en otros órganos, éstos presentan un incremento de daño

producido por la XOR transportada a través de la sangre (Terada et al., 1992). Así pues,

la XOR liberada desde órganos isquémicos es capaz de producir efectos en órganos a

distancia, como el pulmón (Weinbroum, 1995).

Por otra parte, la unión de la XO a la superficie celular influye en las

propiedades catalíticas, en la capacidad de producir agentes oxidantes y en la estabilidad

de la propia XOR (Radi et al., 1997). La enzima sufre un proceso similar cuando es

liberada al plasma, lo que origina un cambio en sus propiedades. La XOR, antes de ser

liberada por las células, contiene cierta actividad XDH y al liberarse al plasma se

convierte inmediatamente en XO (Tan et al., 1993). Por lo tanto, tanto la liberación de

la enzima a la circulación como la subsiguiente unión a las células promueven la

producción de ERO.

Así mismo, además de circular por el plasma de forma libre, la enzima circula

también formando inmunocomplejos. De hecho, la actividad XO en plasma humano es

escasamente detectable en condiciones normales (Giler, 1975), esto se debe, en parte, a

que la XOR humana forma inmunocomplejos con los anticuerpos de inmunoglobulina

M (IgM), siendo el 3% de estos anti-XOR (Benboubetra et al., 1997).

d) Procesos en los que tiene una participación relevante

Hace unos 30 años, Granger y colaboradores se centraron en la importancia

fisiológica y patológica de la XOR, proponiendo la implicación de las ERO derivadas

de la XOR en las lesiones producidas durante la isquemia-reperfusión (Granger, 1981,

Granger, 1986.). Su hipótesis ayudó a estimular el estudio de la XOR como una fuente

de ERO, no sólo en muchos estados patológicos, sino también en la transducción de

señales en general.

Derivado de la capacidad de la forma oxidasa de la enzima para generar especies

reactivas del oxígeno, la XOR ha sido estudiada como mecanismo implicado en el daño

tisular en diversas formas de isquemia, lesiones vasculares y en la insuficiencia cardiaca

crónica, en el infarto de miocardio, la hipertensión, la aterosclerosis (Hellsten-Westing,

Introducción

12

1993, Jeroudi et al., 1994) y muchas otras patologías (White et al., 1996). A la vez que

se ha propuesto su actividad como un papel clave en la respuesta inflamatoria, ya que se

ha atribuido a las especies reactivas de oxígeno, derivadas de la XO, la capacidad de

actuar como mediadores inflamatorios de las vías de transducción de señal y la

expresión génica proinflamatoria (Bulkley, 1993, Bulkley, 1994, Meneshian and

Bulkley, 2002). La inducción de la síntesis de XOR en respuesta a citoquinas

inflamatorias liberadas en enfermedades que evolucionan con respuesta inflamatoria y

estrés oxidativo sugiere la posibilidad de monitorizar su evolución no solo en los

momentos iniciales, primeras 6-12 h, sino también en las etapas más avanzadas.

La isquemia-reperfusión se considera un importante factor en la regulación de la

enzima, habiéndose demostrado que ésta provoca un aumento de la actividad de la

XOR, así como, un aumento en los niveles mRNA (Hassoun et al., 1994, Terada et al.,

1997) y de la expresión de la proteína in vivo (Hassoun et al., 1998) e in vitro (Terada et

al., 1997).

Durante el proceso de isquemia los niveles celulares de adenosín-5´-trifosfato

(ATP) disminuyen, tanto por el descenso en su producción como por su rápida de

fosforilación a adenosín-5’-difosfato (ADP), el cual es degradado vía adenosina e

inosina a HX.

Debido a la depleción del ATP se produce una desregulación de los canales

dependientes del mismo y un aumento del Ca2+ intracelular. Como consecuencia de este

incremento, se produce la activación de las proteasas dependientes de Ca2+ responsables

de la conversión de la XDH en XO (Della Corte and Stirpe, 1968).

Durante la reperfusión, debido a la acumulación del sustrato y de la xantina

oxidasa en los tejidos isquémicos, se inicia una cascada de reacciones cuyo resultado es

un gran aumento en la formación de radicales libres.

En un principio se pensó que el único papel fisiológico para la XOR era su

participación en el catabolismo de las purinas. Sin embargo, se han estudiado otras

funciones de la enzima. En este sentido, se han sugerido varias hipótesis y entre ellas se

encuentran las que destacan su papel en la inmovilización del hierro (Biemond et al.,

1986) y en la regulación del tono vascular (Hong et al., 1989). Otra posibilidad es que la

XO funcione como mediador en los procesos inmunológicos debido a la capacidad del

Introducción

13

radical superóxido generado por la enzima para actuar como agente quimiotáctico

atrayendo los neutrófilos (Petrone et al., 1980, McCord, 1986).

Finalmente, se ha comprobado, también, que los neutrófilos en un cultivo de

células endoteliales son capaces de mediar la conversión de la XDH a XO vía contacto

celular (Phan et al., 1989).

Introducción

14

1.2. Defensa antioxidante

El organismo de los seres vivos ha evolucionado en presencia de sustancias

oxidantes, por lo que ha ido desarrollado una serie de mecanismos de defensa diseñados

para protegerse de estas sustancias tan reactivas denominadas radicales libres. Halliwell

en 1996, definió antioxidante como “cualquier sustancia que en bajas concentraciones,

comparada con el sustrato oxidable, disminuye significativamente o inhibe la oxidación

de este sustrato” (Sies, 1993, Halliwell and Gutteridge, 1995, Halliwell, 1996).

Los niveles de antioxidantes pueden inducirse frente a un estrés oxidativo y

pueden ser utilizados como marcadores de este estrés. Además, pueden actuar de las

siguientes formas:

Previniendo la formación de ERO

Interceptando el ataque de ERO

Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas

menos reactivas

Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de

ERO

Facilitando la reparación del daño causado por ERO y, por último

Manteniendo un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.

Bajo el punto de vista de la fisiología celular, los podemos dividir en

antioxidantes primarios, secundarios y terciarios.

Los antioxidantes primarios previenen la formación de nuevas especies de

radicales libres. Estos antioxidantes actúan por conversión de los radicales libres

existentes en moléculas menos dañinas, o impidiendo su formación desde otras

moléculas. Dentro de este grupo se incluye a la superóxido dismutasa (SOD), la

glutatión peroxidasa (GPx), la catalasa y las proteínas ligadoras de metales (ferritina y

ceruloplasmina) que limitan la disponibilidad de hierro necesario para la formación del

radical OH (Halliwell and Gutteridge, 1989).

Introducción

15

Los antioxidantes secundarios son protectores no enzimáticos o captadores de

radicales libres que intervienen cuando hay superproducción de radicales libres y los

sistemas enzimáticos están desbordados, previniendo así las reacciones en cadena. En

este grupo se incluyen el glutatión, la vitamina E, la vitamina C, el ácido úrico, la

bilirrubina y la albúmina (Halliwell and Gutteridge, 1990b).

Los antioxidantes terciarios son los que reparan biomoléculas dañadas por los

radicales libres. Entre ellos se encuentran los sistemas proteolíticos intracelulares, que

actúan degradando proteínas dañadas oxidativamente, evitando de este modo su

acumulación (Davies et al., 1987b, Pacifici and Davies, 1991). También podemos

destacar las enzimas reparadoras de DNA, la metionina sulfóxido reductasa y la

fosfolipasa A2 que corta los fosfolípidos oxidados de la membrana (Sevanian et al.,

1985).

Otra forma de clasificar los antioxidantes, muy utilizada en la literatura, es desde

un punto de vista bioquímico. Así, podríamos clasificarlos en antioxidantes enzimáticos

y antioxidantes no enzimáticos.

1.2.1. Antioxidantes enzimáticos

Los más utilizados son los que miden enzimas antioxidantes, como la SOD y la

catalasa, en los que nos hemos centrado en la presente tesis doctoral, sin embargo,

existen otros importantes como la GPx.

1.2.1.1. Superóxido dismutasa

Bajo este nombre se incluye a una familia de metaloproteínas ampliamente

distribuida en la naturaleza, presente en todas las células que utilizan en su metabolismo

el oxígeno, e incluso en algunas bacterias anaeróbicas estrictas y facultativas (Hassan

and Fridovich, 1977).

Su actividad fue descrita por primera vez por McCord y Fridovich en 1969

(McCord and Fridovich, 1969). La SOD constituye la primera defensa natural contra el

radical superóxido, ya que lo transforma en peróxido de hidrógeno, constituyendo el

primer medio natural de defensa (McCord, 1974, McCord et al., 1974).

Introducción

16

Hay descritas cuatro formas diferentes de superóxido dismutasas (Fridovich,

1974) según el grupo prostético metálico ligado al enzima (tabla 1.2). En los mamíferos

coexisten dos de ellas: una enzima mitocondrial, dependiente de manganeso (MnSOD)

y una enzima citosólica, dependiente de cobre y zinc (Cu,ZnSOD).

Cabe destacar que el radical superóxido es inestable en medio acuoso y dismuta

espontáneamente formando H2O2. Sin embargo, la velocidad de dismutación espontánea

no enzimática es relativamente baja (a pH fisiológico, está alrededor 2x105 M-1s-1). La

catálisis de la reacción de dismutación, llevada a cabo por la enzima SOD, incrementa

esta velocidad del orden de 10.000 veces.

ENZIMA GRUPO PROSTÉTICO LOCALIZACIÓN

CELULAR

Cu,ZnSOD Cu, Zn Citosol y Núcleo

MnSOD Mn Matriz mitocondrial

y Citosol

MnSOD Mn Bacterias

FeSOD Fe Bacterias

Tabla 1.2. Tipos de SOD y localización celular mayoritaria

1.2.1.2. Catalasa

La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos, cuya función

es la descomposición del H2O2, dando lugar a agua y oxígeno (Chance et al., 1979), tal

y como se muestra en la siguiente reacción:

También es capaz de catalizar ciertas reacciones de peroxidación en presencia de

H2O2, actuando sobre algunos alcoholes, aldehídos y ácidos orgánicos como sustratos

(Chance et al., 1979).

SOD O2

- + O2- + 2H+ H2O2 + O2

H2O2 + AH2 2 H2O + A Catalasa

2 H2O2 Catalasa 2 H2O + O2

http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3geno

http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno

Introducción

17

El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos

organismos vivos y tiene, entre otras, una función protectora contra microorganismos

patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse

rápidamente en compuestos menos peligrosos.

La catalasa se distribuye en toda la célula, aunque se encuentra en grandes

concentraciones en los peroxisomas (Tolbert and Essner, 1981) y en las mitocondrias

(Halliwell, 1989). Posteriormente, se demostró cierta actividad de esta enzima en el

citosol (Rodriguez et al., 2000). Además, al igual que la SOD y la GPx, la catalasa

abunda más en los músculos lentos (compuesto por fibras tipo II y metabolismo

oxidativo) que en los rápidos (compuesto por tipo I y metabolismo glucolítico) (Powers,

1994).

1.2.2. Antioxidantes no enzimáticos

Entre los diversos antioxidantes no enzimáticos encontramos el glutatión, el

ácido úrico, la melatonina, el ácido α-lipoico, los carotenoides, los flavonoides,

oligoelementos como el zinc y el selenio, coenzimas y cofactores como el ácido fólico,

proteínas como la albúmina y vitaminas B1, B2, B6, B12, C y E, entre otros. En este

apartado del trabajo vamos a comentar con más detalle el alopurinol por su importancia

en nuestro estudio.

1.2.2.1. Alopurinol

El alopurinol, [1H-pirazolo (3,4-d) pirimidina-4-ol] fue uno de los mayores

hallazgos del programa de descubrimiento de fármacos de Burroughs Wellcome, que

comenzó en 1940 y culminó con la obtención del Premio Nobel de Fisiología y

Medicina de Gertrude B. Elion y George H. Hitchings, compartido con el científico

británico James W. Black, de "descubrimientos de los principios importantes para los

tratamientos farmacológicos".

El alopurinol es un análogo estructural de la base púrica natural HX, cuyo peso

molecular es 136.11 kDa y que actúa como un inhibidor de la XO, la enzima

responsable de la conversión de HX a xantina y de xantina a ácido úrico, el producto

http://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

http://es.wikipedia.org/wiki/Celula

Introducción

18

final de catabolismo de las purinas (ver apartado 1.1.1.1 b). Por tanto, se puede

considerar que actúa sobre el catabolismo de las purinas sin modificar su biosíntesis. La

inhibición de la enzima XO por este fármaco es efectiva tanto in vivo como in vitro

(Elion et al., 1966). Además, ninguno de los compuestos inhibidores de la XO

posteriores superaba su eficacia y su tolerancia in vivo, por lo que en 1966 fue aprobado

por la Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de la gota y sigue

siendo uno de los pilares en el tratamiento de la hiperuricemia primaria y secundaria. El

alopurinol inhibe la XO formando un complejo reversible con el molibdeno e

interfiriendo así en la interacción de las purinas con la enzima, de forma que no puede

realizarse la oxidación de éstas (Massey et al., 1989). El paso previo a la inhibición es la

metabolización del alopurinol a oxipurinol (aloxantina) para la posterior unión de ésta al

sitio activo de la XO (Massey et al., 1989). A bajas concentraciones el alopurinol es un

sustrato y un inhibidor competitivo de la enzima; en concentraciones más altas se

convierte en un inhibidor no competitivo. El oxipurinol es un inhibidor no competitivo

de la enzima y la formación de este compuesto, junto con su larga persistencia en los

tejidos, es responsable de gran parte de la actividad farmacológica del alopurinol.

Como resultado de la inhibición de la enzima, las concentraciones séricas de HX

y xantina, en pacientes que reciben alopurinol para el tratamiento de la hiperuricemia,

están en el rango de 0.3 a 0.4 mg/dl, siendo los niveles normales, aproximadamente, de

0.15 mg/dl. Cuando los niveles de urato descienden por debajo de 2 mg/dl, por altas

dosis de alopurinol, se les asocia niveles máximos de purinas de 0.9 mg/dl. La

eliminación renal de la HX y xantina es, al menos, 10 veces mayor que la del ácido

úrico, siendo muy poco frecuente la cristaluria por xantinas.

Introducción

19

XO

XO

Aloxantina Alopurinol

Hipoxantina Xantina Ácido Úrico

XO

NH

NNH

N

O

NH

NH

NH

N

O

O

NH

NH

NH

HN

O

O

O

N

NNH

HN

O

NH

NNH

HN

O

O

Figura 1.3. Esquema de la inhibición de la xantina oxidasa por el alopurinol

La acción del alopurinol difiere de otros agentes uricosúricos que disminuyen los

niveles de ácido úrico en suero aumentando su excreción urinaria, éste reduce ambos, el

ácido úrico en suero y en orina, inhibiendo su formación (Elion, 1989).

En cuanto a la farmacocinética, el alopurinol se absorbe rápidamente por el

tracto intestinal en un 90% aproximadamente, alcanzando concentraciones plasmáticas

máximas entre los 30 y 60 minutos tras su administración oral. En cambio, el oxipurinol

tiene una biodisponibilidad menor y sus niveles plasmáticos presentan un pico a las 3

horas. El alopurinol tiene una vida media relativamente corta en el plasma (2-3 horas),

mientras que la vida media del oxipurinol es mucho más larga (entre 14 y 30 horas)

debido a la reabsorción renal (Pea, 2005). Alrededor de un 20% del alopurinol ingerido

se elimina por las heces. La inhibición de la XO tras una sola dosis, de 300 mg diaria, es

eficaz durante un periodo de unas 24 horas (Murrell and Rapeport, 1986).

Las reacciones adversas más frecuentes en el tratamiento con alopurinol son

molestias gastrointestinales, reacciones de hiperensibilidad y erupciones en la piel,

aunque su incidencia es menor al 1%. Estos efectos generalmente ocurren en personas

con una deficiencia en la función renal, a los cuales no se reduce la dosis de alopurinol.

El alopurinol puede aumentar los efectos de la ciclofosfamida e inhibe el metabolismo

de los anticoagulantes orales y el probenecid. También se han observado algunos casos

O2 -

H2O

2

O2 -

H2O

2

Introducción

20

de hepatotoxicidad reversible en los pacientes que tomaban alopurinol. Los síntomas de

la toxicidad del alopurinol incluyen fiebre, sarpullidos, vasculitis, eosinofilia y el

empeoramiento de la función renal, lo que puede conducir a un desenlace fatal,

especialmente en pacientes ancianos con insuficiencia renal que toman diuréticos

tiazídicos (Pea, 2005, Rott and Agudelo, 2003, Terkeltaub, 2003, Bieber and

Terkeltaub, 2004, Schlesinger, 2004).

El alopurinol y el oxipurinol son eliminados por los riñones; por lo tanto, los

cambios en la función renal tienen un efecto profundo en la dosificación. Al reducir la

concentración de ácido úrico en plasma por debajo de su límite de solubilidad, el

alopurinol facilita la disolución de tofos (cristales de ácido úrico en los tejidos,

generalmente alrededor de las articulaciones) y previene el desarrollo y la progresión de

la artritis gotosa crónica (Pea, 2005, Rott and Agudelo, 2003, Terkeltaub, 2003, Bieber

and Terkeltaub, 2004, Schlesinger, 2004). La formación de cálculos de ácido úrico

desaparece gradualmente con la terapia, lo que impide el desarrollo de la nefropatía.

Además de la gota y la hiperuricemia, existen numerosas aplicaciones

terapéuticas potenciales, tanto para el alopurinol como para el oxipurinol.

En el apartado 1.1.1.1.d hemos comentado que la XO juega un papel importante

en distintos tejidos en situaciones de isquemia-reperfusión (como en el miocardio,

hígado, riñón, pulmón, y otros órganos), en el síndrome de lisis tumoral, durante shock

circulatorio, en enfermedades vasculares (como la hipertensión, la hipercolesterolemia,

la aterosclerosis y la diabetes), en enfermedades inflamatorias (como la colitis, artritis

reumatoide, neumonía, pancreatitis, nefritis, peritonitis y dermatitis, entre otras), en el

síndrome de dificultad respiratoria aguda, en la enfermedad pulmonar obstructiva

crónica, en la insuficiencia cardiaca crónica, etc. El alopurinol y su metabolito el

oxipurinol activo mostraron efectos beneficiosos en el tratamiento de estas condiciones,

tanto en modelos experimentales animales y en ensayos clínicos humanos a pequeña

escala (citado en (Pacher et al., 2006)).

Cabe destacar la acción antioxidante del alopurinol, puesto que neutraliza

directamente los radicales libres derivados del sistema hipoxantina/xantina oxidasa,

previniendo los efectos del estrés oxidativo producido por estas especias reactivas. Los

estudios en animales muestran que en dosis de hasta 50 mg/kg de alopurinol se

comporta como un captador de radicales libres con propiedades antioxidantes

Introducción

21

intrínsecas (George and Struthers, 2009). Así como también se ha demostrado su

eficacia en su acción antiinflamatoria, no como agente intiinflamatorio, aunque existen

controversias en si lo es en sí mismo o por inhibir la acción proinflamatoria de la

xantina oxidasa (Pacher et al., 2006).

1.2.2.2. Papel del alopurinol en la protección del músculo esquelético

a) Papel del alopurinol en el daño muscular asociado al ejercicio agotador

En 1954 se publicó el primer trabajo en el que se demostró la presencia de ERO

en el músculo esquelético mediante resonancias magnéticas nucleares (RMN)

(Commoner et al., 1954). Sin embargo, su importancia biológica no fue evidente hasta

años más tarde cuando se identificó la relación entre la función muscular y la biología

de las ERO. En 1978 se asoció el ejercicio físico con el aumento de la peroxidación

lipídica (Dillard et al., 1978). Dos años más tarde Koren y colaboradores mostraron que

las ERO aumentan en el músculo esquelético como consecuencia de la contracción

muscular (Koren et al., 1980). En el año 1982, el grupo de Lester Packer publicó el que

se considera el trabajo más influyente en el área y en el que demuestran que el

contenido de ERO aumenta entre 2 y 3 veces en los músculos de animales ejercitados

hasta el agotamiento y que éstos se relacionan con la fatiga muscular (Davies et al.,

1982a).

El interés en la posibilidad de que las ERO pudiesen estar implicadas en el daño

muscular que ocurre tras el ejercicio físico agotador se gestó con la observación de que

la miopatía asociada a la deficiencia de vitamina E en animales se precipitaba por

ejercicio físico (Allen et al., 1975). En el año 1982 se relacionaron por primera vez las

ERO producidas durante el ejercicio agotador con el daño tisular en animales de

experimentación (Davies et al., 1982b). Un año más tarde se demostró que la deficiencia

de vitamina E provoca una reducción significativa de la resistencia aeróbica

(Quintanilha and Packer, 1983) y que ésta a su vez potencia el daño muscular que se

produce en condiciones de estrés en estudios tanto in vivo como in vitro (Jackson et al.,

1983, Jackson, 1987).

Introducción

22

Son muchos los trabajos más recientes en los que se han relacionado las ERO

producidas durante la contracción muscular de elevada intensidad con el daño muscular

(Zerba et al., 1990, McArdle et al., 1999). Estas evidencias han fundamentado el uso de

antioxidantes (la vitamina C y E han sido de las más utilizadas) en la prevención del

daño muscular asociado al ejercicio (McGinley et al., 2009).

En concreto, en nuestro grupo de investigación hemos utilizado el alopurinol en

diversos modelos animales y humanos para prevenir el daño muscular asociado al

ejercicio físico. En los estudios iniciales comprobamos que la administración de

alopurinol disminuía la oxidación de glutatión, la peroxidación lipídica, así como los

aumentos en los niveles de enzimas de daño muscular, creatin kinasa (CK) y aspartato

amino transferasa (GOT), tanto en humanos como en animales de experimentación

ejercitados hasta el agotamiento (Viña et al., 2000a, Viña et al., 2000b). En estudios

posteriores realizados con ciclistas profesionales y con maratonianos, confirmamos la

prevención del daño muscular asociado al ejercicio con la administración de 300 mg de

alopurinol durante la competición (Gómez-Cabrera et al., 2003, Gomez-Cabrera et al.,

2006). Otros grupos de investigación han encontrado un efecto protector de la

administración de alopurinol, sobre el daño muscular, en otras especialidades deportivas

tales como participantes en la Copa América (Barrios et al., 2011).

Así mismo, nuestro grupo ha evidenciado que el estrés oxidativo asociado al

ejercicio físico hasta el agotamiento activa vías de señalización como las MAPKinasas y

la cascada inflamatoria de NF-кB en el músculo esquelético, las cuales son inhibidas

con la administración de alopurinol previamente a la realización de este tipo de ejercicio

(Gomez-Cabrera et al., 2005). Estos resultados han sido parcialmente corroborados

recientemente (Wadley et al., 2013).

Al observar que la administración de alopurinol tiene un efecto positivo en la

prevención del daño muscular, su uso se ha extendido a otras condiciones en las que el

daño o atrofia muscular se encuentra mediado por estrés oxidativo, como las que se

describen a continuación.

b) Papel del alopurinol en el tratamiento de la sarcopenia primaria y

secundaria

La sarcopenia es un síndrome geriátrico caracterizado por una pérdida

progresiva y generalizada de la fuerza y de la masa muscular esquelética que se

Introducción

23

acompaña con un aumento del riesgo de eventos adversos tales como la discapacidad,

baja calidad de vida y la muerte (Cruz-Jentoft et al., 2010, Rosenberg, 1989). La

sarcopenia puede ser clasificada como primaria (relacionada con la edad) cuando no

existe una evidente causa que la explique que no sea el envejecimiento per se. Se

clasifica como secundaria cuando una o más causas son las responsables. En este

sentido la sarcopenia secundaria puede estar relacionada con una baja actividad física

(estilo de vida sedentario, inmovilización, condiciones de gravedad 0), con patologías

(fallo orgánico avanzado, enfermedades inflamatorias o endocrinas) o con aspectos

nutricionales (inadecuada ingesta de proteínas, mala absorción, desórdenes

gastrointestinales) (Cruz-Jentoft et al., 2010).

Uso del alopurinol en la sarcopenia primaria

Como veremos a continuación, el proceso de envejecimiento está asociado con

la reducción de la masa muscular, la fuerza máxima y con el descenso en la capacidad

del sistema neuromuscular para producir fuerza explosiva. Entre los factores implicados

en la pérdida de funcionalidad del músculo esquelético podemos destacar: alteraciones

en la síntesis y degradación de proteínas, inflamación, alteraciones hormonales y

disfunción mitocondrial (Cruz-Jentoft et al., 2011). La mayor parte de estas alteraciones

se relacionan con el estrés oxidativo (Sies, 1985, Sies and Cadenas, 1985).

Diversos grupos de investigación, incluyendo el nuestro (Aranda et al., 2007),

han observado un aumento de la actividad XO en los músculos de animales viejos

(Lambertucci et al. 2007; Hofer et al. 2008; Ryan et al. 2011a). Estos estudios han

relacionado este aumento de la actividad XO, con el estrés oxidativo, el descenso de la

masa muscular (Hofer et al. 2008), de la máxima velocidad aeróbica (Lambertucci et al.

2007), así como de la fuerza muscular (Ryan et al. 2011a).

En esta misma línea, recientemente, en un estudio realizado en personas mayores

se examinó la asociación entre el uso de alopurinol y los resultados funcionales en el

test de Barthel después de la rehabilitación en 3,593 pacientes ingresados, de los cuales

un 3% (102 pacientes) eran tratados con alopurinol. Los resultados mostraron

puntuaciones en el Barthel más altas en el grupo tratado con alopurinol (4.7 puntos)

frente al no tratado (3.6 puntos), lo que sugiere que los pacientes tratados eran más

independientes y tenían mayor funcionalidad a la hora de desempeñar tareas de la vida

Introducción

24

cotidiana (Beveridge et al., 2013). Estos resultados sugieren que el uso de alopurinol se

asocia con un mayor grado de mejora en la función, medida por el índice de Barthel

durante la rehabilitación en una población de pacientes viejos.

Uso del alopurinol en la sarcopenia secundaria

En relación a la sarcopenia secundaria existen evidencias de que el tratamiento

con alopurinol puede mejorarla. El primer estudio en el que se administró alopurinol

como agente anticancerígeno se demostró que su uso inducía drásticamente la apoptosis

en células de cáncer de próstata en humanos (Yasuda et al., 2008). Posteriormente, se ha

usado para disminuir los altos niveles de ácido úrico producidos por ciertos

medicamentos usados durante el tratamiento del cáncer. Recientemente, se ha empezado

a administrar alopurinol para el tratamiento de la caquexia asociada al cáncer. Springer

y colaboradores demostraron, mediante la inducción de una cachexia experimental por

inyección de células cancerosas de hepatoma en animales de experimentación, que la

inhibición de la actividad de la XO redujo significativamente los niveles de estrés

oxidativo y de la actividad del sistema ubiquitin proteasoma. Ello derivó en la

conservación de la masa muscular y, por tanto, en la reducción de la caquexia en los

animales que desarrollaron tumores tratados con alopurinol u oxipurinol frente a los no

tratados (Springer et al., 2012, Springer et al., 2013).

Como hemos comentado anteriormente, la atrofia muscular puede ocurrir en

ausencia de enfermedad durante periodos prolongados de actividad muscular reducida

(Booth, 1982), como estilos de vida sedentarios, sujetos encamados, la inmovilización

de miembros, la descarga del diafragma a través de la ventilación mecánica, o los vuelos

espaciales (Powers et al., 2005, Cruz-Jentoft et al., 2010). En estas condiciones también

se ha demostrado la relevancia del estrés oxidativo en la pérdida de masa muscular y, en

concreto, el papel de la XO. En 1998 Kondo midió la actividad de la XO en el músculo

sóleo de ratas inmovilizadas durante 12 días. En este estudio se comprobó que la XO

aumentaba 2.3 veces en los soleos inmovilizados, los cuales mostraron un descenso del

51% de su peso respecto a los músculos controles. También midieron parámetros de

estrés oxidativo y la actividad de las enzimas antioxidantes, cuyas modificaciones

concordaban con la activación de la XO (Kondo et al., 1993c). Posteriormente,

Matuszczak y colaboradores demostraron la eficacia del alopurinol en la prevención del

Introducción

25

daño muscular durante la suspensión de las extremidades posteriores en ratones.

Aunque, en este estudio, la inhibición de la XO no disminuyó la atrofia causada por la

inmovilización, sí que previno la pérdida de la fuerza muscular (Matuszczak et al.,

2004).

Así mismo, existe una relación entre la insuficiencia cardiaca crónica (ICC) y la

insuficiencia respiratoria con el agotamiento muscular. Se ha demostrado que pacientes

con insuficiencia respiratoria, insuficiencia cardiaca o una combinación de ambas,

tenían significativamente menos fuerza tanto en los músculos esqueléticos como en los

respiratorios. Sin embargo, la fuerza y la resistencia no parecen ser afectados de la

misma forma en estos músculos (Hamilton et al., 1995). Se postula que esta disfunción

de la musculatura se debe a cambios estructurales y funcionales en la vasculatura

periférica, que provocan una disminución de la perfusión del músculo esquelético en

reposo, durante el ejercicio físico y en el envejecimiento (Wahren et al., 1974, Beere et

al., 1999, Dinenno et al., 2001, Lawrenson et al., 2003, Poole et al., 2003, Proctor et al.,

2003).

Otros estudios han relacionado la actividad de la XO con el aumento del estrés

oxidativo en la ICC, lo que condujo a usar el alopurinol para prevenir o paliar el daño

cardiovascular con resultados muy positivos. En uno de estos estudios sobre ICC

inducida, el alopurinol indujo una disminución en el consumo de oxígeno del miocardio

y un aumento en la contractilidad cardíaca, así como en la eficiencia mecánica en

reposo (Ekelund et al., 1999).

Por lo que un tema que ha tenido un gran auge recientemente es la posibilidad

que el tratamiento con alopurinol restablezca la disminución energética que se

desarrolla en pacientes con fallo cardiaco crónico.

Estos estudios buscan disminuir, con la administración de alopurinol, el estrés

oxidativo (producción de peróxido de hidrógeno) ocasionado por la actividad de la XO,

que reduce la sensibilidad del calcio, lo que limita la contracción del miocardio (Ukai et

al., 2001). Sin embargo, Ukay observó que el alopurinol no tiene efectos sobre la

función contráctil del ventrículo izquierdo o en su capacidad de respuesta β-adrenérgica

en animales en situación basal. Aunque estos mismos autores observaron que, en

animales con fallo inducido, en la frecuencia cardiaca, el alopurinol sí disminuye la

disfunción contráctil del ventrículo izquierdo, mejora la capacidad de respuesta β-

adrenérgica y mejora su respuesta sistólica y diastólica al ejercicio.

Introducción

26

Así mismo, la administración de alopurinol mejora la función endotelial vascular

en personas mayores y en pacientes con ICC (Kao et al., 2011, George et al., 2006,

Doehner et al., 2002), por un menor estrés oxidativo a nivel muscular y vascular

(George et al., 2006, George and Struthers, 2009), con lo que se podría repercutir

positivamente en la perfusión músculoesquelética (Wray et al., 2009). Además, el

alopurinol aumenta la eficiencia energética muscular, por una mejor disponibilidad del

ATP y su hidrólisis, como se ha visto en varios estudios que analizan la actividad de la

enzima CK, especialmente la isoforma miofibrilar cardiaca (Hou et al., 2006, Ekelund et

al., 1999). Esto se debe a que dicha enzima se ve especialmente afectada por los ERO,

por lo que al inhibir la XO, como fuente generadora de estrés oxidativo, con el

alopurinol se consigue incrementar la síntesis de ATP a través de la PC y ADP por

acción de la CK (Cappola et al., 2001, Hou et al., 2006, Naumova et al., 2006).

Introducción

27

1.3. Estrés oxidativo

Todas las células aeróbicas están expuestas al daño de estos radicales libres.

Cuando la capacidad de los mecanismos antioxidantes se ve superada por las agresiones

oxidativas se da la situación denominada “estrés oxidativo” que, en mayor o menor

grado, puede llegar a producir lesiones celulares reversibles o irreversibles. Por tanto,

podemos definir el estrés oxidativo como una alteración del equilibrio entre las especies

prooxidantes y las antioxidantes, a favor de las primeras (Sies and Cadenas, 1985, Sies,

1985).

Así pues, el estrés oxidativo puede originarse por un exceso de sustancias pro-

oxidantes, una deficiencia de agentes oxidantes, o por ambos factores a la vez. En estas

circunstancias, está indicado proteger al organismo incrementando su capacidad

antioxidante, es decir, aumentando la capacidad defensiva de la célula mediante la

administración de antioxidantes, ya sea en forma de fármacos, o como complementos

dietéticos (Ames, 1983).

1.3.1. Estrés oxidativo y daño a biomoléculas

El estrés oxidativo, debido a la dificultad existente para detectar directamente los

radicales libres, se puede conocer mediante la medición de los productos de las

reacciones oxidativas (daño oxidativo a lípidos, oxidación del DNA, oxidación de

proteínas, daño oxidativo a glúcidos).

1.3.1.1. Daño oxidativo a lípidos

De los principales tipos de biomoléculas, los lípidos y, sobre todo, los ácidos

grasos poliinsaturados, son los más susceptibles de ser atacados por radicales libres

(Cheeseman and Slater, 1993), siendo el HO, ROO, RO y el alquílico (R) los

principales generadores de daño oxidativo a lípidos.

El proceso de ataque oxidativo a lípidos, denominado peroxidación lipídica,

comienza cuando un radical libre ataca a un carbono de la cadena alifática de un ácido

graso, se desprende un átomo de hidrógeno y se forma un radical alquílico (Krinsky,

Introducción

28

1994, Halliwell, 1994). Esta reacción se produce preferentemente en los carbonos

contiguos a enlaces dobles de los ácidos grasos poliinsaturados, ya que los radicales

formados se pueden estabilizar por resonancia con el enlace doble. Los radicales

peróxido pueden reaccionar con cadenas laterales de otros ácidos grasos

poliinsaturados, con lo que se propaga la reacción en cadena radicalaria (Halliwell,

1994).

De esta manera, un sólo ataque por un radical libre da lugar a la formación de un

gran número de productos de oxidación, sobre todo aldehídos como malondialdehído

(MDA) y 4-hidroxinonenal (4-HNE), e hidrocarburos de cadena corta como etano y

pentano (Cheeseman and Slater, 1993, Freeman and Crapo, 1982, Halliwell, 1991,

Halliwell, 1994). Muchos de los aldehídos formados reaccionan rápidamente con los

componentes celulares causando mutaciones en el DNA y produciendo daños

estructurales y funcionales al reaccionar con proteínas (Krinsky, 1994). La peroxidación

lipídica se considera un factor muy importante en el envejecimiento de células aeróbicas

(Lippman, 1985). El daño oxidativo a los lípidos de membrana constituye, muy

probablemente, un factor importante en la disminución de la fluidez de las membranas

(Shigenaga et al., 1994).

1.3.1.2. Daño oxidativo a proteínas

Todos los aminoácidos presentes en las proteínas tienen residuos susceptibles de

ser atacados por los radicales libres, sobre todo por el radical hidroxilo (Stadman,

1992). Dentro de los aminoácidos la tirosina, la fenilalanina, el triptófano, la histidina,

la metionina y la cisteína son los que más procesos oxidativos sufren (Davies et al.,

1987a). Esta oxidación puede dar lugar a un cambio conformacional de la proteína y,

por tanto, a una pérdida o modificación de su función biológica.

En los procesos de daño oxidativo a proteínas, algunos aminoácidos como lisina,

prolina y arginina, se oxidan dando lugar a grupos carbonilo, de modo que el contenido

en carbonilos de las proteínas se puede emplear como un indicador de daño oxidativo a

las mismas (Stadman, 1992). Otros aminoácidos como histidina, cisteína y metionina,

también sufren daño oxidativo, pero no forman derivados de tipo carbonilo (Stadman,

1992). Este daño oxidativo suele ser irreversible y puede conducir a la desnaturalización

de la proteína (Dean et al., 1993).

Introducción

29

1.3.1.3. Daño oxidativo al DNA

El DNA también es susceptible al daño oxidativo en todos sus componentes,

puesto que el oxígeno es capaz de adicionarse a las bases o al azúcar del DNA

formándose radical peroxil.

Podemos encontrar más de veinte subproductos tras un ataque oxidativo al

DNA. Entre ellos, la oxidación de la 2-desoxiguanosina a 8-hidroxi 2-desoxiguanosina

es una de las lesiones más frecuentes y reviste gran importancia por su alto efecto

mutagénico, ya que durante la replicación producirá transversiones de purinas (Kasai

and Nishimura, 1984, Shibutani et al., 1992).

El daño oxidativo asociado a proteínas y al DNA no debe ser considerado de

manera independiente. La acumulación de formas inactivas de enzimas reparadoras

puede aumentar la acumulación de daño oxidativo en el DNA, por lo que se pueden

potenciar uno a otro. Cuando la replicación del DNA dañado tiene lugar antes de la

reparación o cuando un DNA dañado se repara de manera incorrecta, tiene lugar una

mutación (Breen and Murphy, 1995, Halliwell and Auroma, 1991). Por ello, las lesiones

oxidativas al DNA parecen estar implicadas no sólo en el envejecimiento celular, sino

también en la patogénesis de las enfermedades asociadas a la edad avanzada.

El DNA mitocondrial sufre mucho más daño oxidativo que el nuclear (Richter et

al., 1988), ya que presenta ciertos rasgos que le hacen especialmente susceptible de ser

atacado por agentes oxidantes: carece de histonas que puedan recibir el ataque en su

lugar (Donald and Johns, 1995); el sistema de reparación es menos efectivo (Suter and

Richter, 1999, Shen et al., 1995) y, por último, se encuentra muy cerca de la cadena de

transporte mitocondrial, uno de los sistemas principales de producción de especies

reactivas del oxígeno (Giulivi and Davies, 1993). Otro factor distintivo del DNA

mitocondrial es que no posee intrones, de manera que la modificación de cualquier base

afecta usualmente a una zona de DNA codificante (Ames et al., 1993, Linnane et al.,

1989) y su repercusión suele ser, por tanto, más importante.

Introducción

30

1.3.1.4. Daño oxidativo a glúcidos

Los glúcidos reaccionan con facilidad con el HO•. Los monosacáridos y

disacáridos resisten la acción de los radicales libres de oxígeno. La glucosa constituye

un captador del radical superóxido, al retenerlo e impedir su acción sobre otras

moléculas. La manosa y el manitol son eliminadores del radical hidroxilo. Por ello, se

ha observado que diversos polisacáridos actúan como agentes protectores celulares

(Albertini et al., 1996).

El daño oxidativo a los glúcidos reviste importancia cuando se trata de

polisacáridos de función estructural, ya que los polisacáridos son despolimerizados por

los radicales libres (Borel et al., 1988) dando lugar a procesos degenerativos. Un caso

especial es el del ácido hialurónico cuya función estructural reside en mantener la

viscosidad del fluido sinovial. Se ha observado que la SOD es capaz de proteger frente a

la despolimerización del ácido hialurónico en el líquido sinovial (McCord, 1974). Los

proteoglicanos están sujetos a rotura oxidativa de forma similar (Greenwald and Moy,

1980).

1.3.2. Indicadores de estrés oxidativo

Dada la importancia del daño que el estrés oxidativo puede producir en las

células y en el organismo, en los últimos años se ha intentado encontrar índices que nos

permitan medirlo. Entre los indicadores propuestos, uno de los más relevantes es el

cociente glutatión oxidado/glutatión reducido (GSSG/GSH) característico de estrés

oxidativo, de modo que un aumento en la concentración de glutatión oxidado produce

una alteración del estado redox celular (Sies, 1986).

Además, como indicadores de daño oxidativo a lípidos, el MDA y el 4-HNE son

los más empleados, aunque también se pueden considerar los niveles de pentano y de

etano. Por otro lado, la 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina es un indicador de daño oxidativo

al DNA y los grupos carbonilo y la 2-oxohistidina se utilizan como marcadores de daño

oxidativo en proteínas (Hageman et al., 1992), etc.

Introducción

31

1.4. Atrofia muscular

El músculo esquelético es un tejido que compone aproximadamente el 40-45%

del peso corporal. Los músculos varían en forma y tamaño y cumplen diversas

funciones como el control postural, la producción de movimiento, o el favorecimiento

del retorno venoso. Así mismo, el músculo esquelético juega un papel central en todo el

organismo por su identificación como órgano secretor, puesto que las citoquinas

producidas, expresadas y liberadas por las fibras musculares pueden tener efectos

autocrinos, paracrinos o endocrinos, pasando a denominarse mioquinas, las cuales

también pueden ejercer sus efectos dentro del propio músculo (Pedersen and Febbraio,

2012). Otro ejemplo de que el músculo esquelético se comunica con otros órganos,

como el tejido adiposo, hígado, páncreas, huesos y cerebro, es que sirve como depósito

de aminoácidos, jugando un papel central en el metabolismo de las proteínas de todo el

organismo en ausencia de absorción de aminoácidos en el intestino y por proporcionar

precursores de la gluconeogénesis hepática (Wolfe, 2006).

Al igual que otros tejidos, el músculo esquelético mantiene su masa y la

funcionalidad mediante el equilibrio de la velocidad de síntesis y la degradación

muscular. Sin embargo, la alteración de este intrincado equilibrio origina caquexia y

atrofia muscular como miopatías y distrofias, que no sólo afectan negativamente a los

músculos esqueléticos, sino que también promueven el catabolismo corporal. En varias

enfermedades crónicas, como el cáncer, la pérdida de masa muscular sostenida

finalmente culmina en insuficiencia respiratoria, morbilidad, e incluso, mortalidad, sin

intervenciones terapéuticas disponibles.

El músculo esquelético puede sufrir una rápida y profunda atrofia en respuesta a

diversas condiciones medioambientales o patológicas. La atrofia muscular está presente

en numerosas patologías tales como el cáncer, la sepsis, la uremia, y la diabetes

(Hasselgren and Fischer, 1997, Jagoe and Goldberg, 2001). Por otra parte, la atrofia

muscular también puede ocurrir en la ausencia de la enfermedad durante periodos

prolongados de actividad muscular reducida (Booth, 1982), como estilos de vida

sedentarios, o el descenso de la actividad física que provoca una disminución de la masa

muscular que, a su vez, conlleva una disminución del volumen y fuerza de la misma

Introducción

32

(Powers et al., 2005). De hecho, está bien establecido que situaciones de desuso o

inactividad muscular, como lo son el descanso prolongado en cama (sujetos

encamados), la inmovilización de miembros, la descarga del diafragma a través de la

ventilación mecánica, o en los vuelos espaciales pueden producir atrofia muscular en los

seres humanos.

Esto mismo ocurre en enfermedades relacionadas con la caquexia, una condición

caracterizada por la pérdida de peso pronunciado, debilidad muscular, anemia,

resistencia a la insulina y la fatiga extrema en personas que no están tratando

activamente de perder peso. Este síndrome de la enfermedad está estrechamente

asociado con el cáncer y otras enfermedades infecciosas como la tuberculosis, el sida y

algunos desórdenes autoinmunes como la diabetes tipo 1, elevados niveles de TNF-α,

factor de necrosis tumoral, en sangre. A diferencia de la inanición simple, donde la

pérdida de peso se deriva principalmente de la disminución de las reservas de grasa pero

el contenido de proteína del músculo esquelético se conserva, en la caquexia se produce

perdida tanto de masa grasa como magra (Morley et al., 2006).

Así mismo, un tema con una elevada relevancia socio-económica y muy

investigado en la actualidad es la sarcopenia senil (Rosenberg, 1997), ya que el

envejecimiento es uno de los factores que mejor explican la reducción de la fuerza y

masa muscular con la edad. La rápida pérdida de masa muscular tiene serias

implicaciones para la calidad de vida e independencia de las personas mayores, ya que

en la vida cotidiana se requieren unos niveles mínimos de fuerza para realizar cualquier

acción como subir escaleras o sentarse en una silla. En este caso, el efecto en el músculo

esquelético es similar al de los casos descritos anteriormente en individuos jóvenes.

El proceso de envejecimiento está asociado no sólo con la reducción de la fuerza

máxima, sino también con el descenso en la capacidad del sistema neuromuscular para

producir la fuerza explosiva. Esta disminución es incluso más drástica que la observada

en la producción de fuerza máxima para el mismo grupo muscular y llega a ser

aproximadamente de un 3.5% de pérdida al año entre los 65 y 84 años (Young and

Skelton, 1994).

http://es.wikipedia.org/wiki/Tuberculosis

http://es.wikipedia.org/wiki/Sida

http://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_autoinmune

Introducción

33

La sarcopenia senil engloba multitud de factores que contribuyen a las

alteraciones musculares asociadas a la edad: pérdida de motoneuronas, alteración

hormonal, efectos inflamatorios y alteraciones en la ingesta calórica (proteica) (Doherty,

2003).

Por otra parte, con el envejecimiento se observa una mayor disminución de la

proporción del área ocupada por las fibras musculares de contracción rápida (% área II/I

y % área fibras tipo II) en comparación con las que ocupan las fibras musculares de

contracción lenta (tipo I) (Orlander et al., 1978).

Otro factor que conlleva atrofia y disminución de la masa muscular es la

denervación muscular, ya que cuando un músculo pierde su inervación deja de recibir

las señales necesarias para mantener el tamaño muscular normal.

El mismo efecto observamos en los procesos de atrofia por suspensión de

miembros posteriores en animales, pacientes encamados, o microgravedad durante

vuelos espaciales. Al ser el objetivo principal de esta tesis, la comprensión de los

mecanismos moleculares que regulan la pérdida de masa muscular en estas condiciones

de inmovilización, desuso e inactividad muscular, dichos procesos se describen con más

detenimiento en puntos subsiguientes.

Introducción

34

1.5. Atrofia muscular durante la inmovilización o inactividad

muscular

Durante los vuelos espaciales los músculos más afectados son los posturales

puesto que mantienen nuestro cuerpo en posición vertical en un entorno de gravedad.

Hay estudios que demuestran que después de un vuelo espacial de 2 semanas la masa

muscular se ve disminuida hasta un 20% (Williams et al., 2009). Biopsias musculares

efectuadas a astronautas tras un vuelo espacial indican un cambio fenotípico de las

fibras tipo I a fibras tipo II (Nisoli et al., 2003), con lo que podemos afirmar que en este

tipo de musculatura se experimenta una mayor pérdida de fibras lentas (Nisoli et al.,

2003, Buckey, 2006).

En concordancia con la atrofia, los músculos también pierden fuerza, ya que

durante un vuelo espacial de seis meses de duración se puede llegar a producir una

pérdida de un 50% de la fuerza explosiva (Buckey, 2006).

Otras investigaciones centradas en la inmovilización y la atrofia muscular

asociada estudian casos de sujetos sanos encamados, con una de sus extremidades

inferiores en suspensión. Estos estudios evidencian una disminución del 4.7 ± 0.9% en

la masa magra del cuádriceps en comparación con el basal, en un periodo de 14 días,

determinada por análisis de radioabsorciometría de doble energía (DEXA). En otros

estudios en los que se ha aumentado el tiempo de inmovilización a 20 y 23 días

observaron una reducción del 10% en el área de la sección transversal (CSA) de los

músculos flexores de la rodilla (isquiotibiales) (Funato et al., 1997), de los extensores

(cuádriceps) (Funato et al., 1997, Kawakami et al., 2000), así como, en los flexores

plantares y el sóleo (Seynnes et al., 2008) medido mediante RMN Finalmente, en

sujetos encamados durante 28 días se ha observado una pérdida de 0.4 ± 0.1 kg de masa

muscular (Paddon-Jones et al., 2004).

Se sabe que el tipo de fibras que predomina en el músculo esquelético

condiciona su mayor o menor grado de atrofia, ya que se ha observado, después de 6

semanas de reposo en cama, una disminución de diámetro de las fibras de tipo I, sin

observar cambios en las fibras de tipo IIa o IIx (Berg et al., 1997, Ferretti, 1997). Por

Introducción

35

otro lado, se ha descrito que la reducción de la masa muscular durante vuelos espaciales

se debe principalmente a la atrofia de las fibras tipo I y IIa (Allen et al., 1996, Fitts et

al., 2000, Baldwin and Haddad, 2001). Así mismo, Borina observó que, tras 5 semanas

de encamación, una disminución del 31% en el diámetro de las fibras de tipo I y sólo el

21% de las fibras de tipo IIa (Borina et al., 2010).

Así mismo, otros estudios muestran una gran reducción en la fuerza muscular,

medida con distintos métodos.

Con tan solo dos semanas de inmovilización se ha comprobado la fuerza

isométrica se reduce en un 27 ± 3% en comparación con los datos basales obtenidos

previos a la inmovilización (Jones et al., 2004).

Mediante el uso de un dinamómetro especial aplicable a los movimientos el

grupo de Funato comprobó que la disminución de la masa muscular iba asociada a la

atenuación de la potencia muscular, considerablemente mayor en las extremidades

inferiores (-19.8 y -43.6% para la flexión y extensión de la rodilla) que en las

superiores, donde las diferencias no fueron significativas (aproximadamente -5% para

flexión y extensión del codo). La fuerza isométrica máxima también se vio reducida en

los músculos flexores y extensores de rodilla en un -18.9 y -26.8% respectivamente,

resultando en una disminución en la tensión específica (-12.3 a aproximadamente -

22.1%). Concluyendo que los potenciales de excitación neuronal para generar la tensión

muscular máxima o potencia también pueden estar influidos por la ingravidez (Funato

et al., 1997).

Seynnes y sus colaboradores encontraron una disminución de un 16% en la

actividad eléctrica (EMG) producida por los sóleos después de 23 días de

inmovilización, además de una disminución de 36% en la rigidez del tendón, que se

correlacionan con los cambios en la eficacia neuromuscular en cuanto al

aprovechamiento máximo de la fuerza de los tendones (Seynnes et al., 2008).

1.5.1. Modelo de inducción de atrofia muscular en animales: suspensión de

miembros posteriores

Debido a la dificultad de la investigación acerca de los mecanismos responsables

de la atrofia muscular por inmovilización en los seres humanos, se han desarrollado

Introducción

36

modelos animales para mimetizar las distintas condiciones en las que se produce la

atrofia muscular por inactividad.

Los primeros estudios utilizaban la inmovilización mediante férulas de yeso,

estos estudios encontraron una considerable pérdida de masa muscular durante los

periodos de inactividad muscular. En sus estudios, Kondo utilizó esta técnica e

inmovilizó los tobillos de las ratas en posición extendida durante 7 días (Kondo et al.,

1991, Kondo et al., 1993a, Kondo et al., 1993b).

Sin embargo, actualmente el modelo más utilizado, en ratas, para crear una

posición de inactividad es el protocolo no invasivo de suspensión de miembros

posteriores de Morey-Holton y Globus (Morey-Holton and Globus, 2002). En este

protocolo el periodo de inmovilización suele ser de 14 días, lo que produce una atrofia,

aproximadamente, del 50 % en el músculo sóleo (Servais et al., 2007, Oishi et al., 2008)

y aproximadamente de un 25 % en el gastrocnemio (Hofer et al., 2008). Así mismo, Siu,

tras 14 días de suspensión, obtuvo una disminución de masa muscular del 12% en ratas

jóvenes (Siu et al., 2008). No obstante, otros autores lo han utilizado durante periodos

de tiempo más prolongados, como Lawler que mantuvo a las ratas suspendidas de las

extremidades posteriores durante 28 días (Lawler et al., 2003).

Posteriormente se ha propuesto un modelo de inmovilización en ratones basado

en la inmovilización de la pata en una posición flexionada con una argolla durante 14

días, en el cual se ha observado una atrofia del 33% en el tibial anterior y de un 12 % en

el gastrocnemio (Caron et al., 2009).

A pesar de utilizar distintos protocolos de inmovilización y duración de los

mismos, todos estos estudios confirmaron una disminución de la masa muscular,

medida en el peso del músculo, al compararlos con los músculos de sus

correspondientes grupos control.

Estos estudios muestran resultados en los que la atrofia muscular es mucho más

significativa en músculos de contracción lenta, es decir, en los que predominan las

fibras de tipo I (como es el caso del sóleo) frente a los obtenidos en músculos rápidos,

compuestos por fibras tipo II (gastrocnemio).

Introducción

37

En estudios en los que se examinó la pérdida de masa muscular en diferentes

tipos de músculos observaron que la inmovilización en animales inducía un 50% de

atrofia en los músculos en los que predominan las fibras de contracción lenta, es decir

las de tipo I, y entre un 15 y 20% en los músculos en los que predominan las fibras tipo

II (Thomason and Booth, 1990b). Posteriormente, Desplanches llevó a cabo un estudio

usando el protocolo de suspensión de miembros posteriores, en el que halló una gran

pérdida de masa muscular en dos músculos antigravitatorios lentos como son el sóleo y

el aductor largo, conocidos ambos por mostrar tanto la atrofia como la transición de

fibras de tipo lento a rápido después de la suspensión (Desplanches et al., 2004,

Thomason and Booth, 1990b).

Así mismo, se ha demostrado que con la inmovilización de las extremidades esta

atrofia muscular se produce tanto por una disminución en la síntesis de proteína

muscular y como a un aumento en la degradación proteica (Booth and Seider, 1979,

Thomason et al., 1989). La tasa de síntesis de proteínas disminuye rápidamente al inicio

de la descarga muscular. Esta disminución en la síntesis de proteína muscular alcanza

un nuevo nivel de estado estacionario a las 48 horas (Thomason et al., 1989). Además,

la disminución de la síntesis de proteínas es seguida por un gran y rápido aumento de la

proteólisis, por lo que ambos procesos son los que conducen en última instancia a la

atrofia muscular.

Estos procesos de proteólisis y reducción de síntesis proteica durante la

suspensión de miembros posteriores derivan en una disminución del peso y de la masa

muscular. Reid y sus colaboradores observaron una disminución del 44% en el peso de

los soleos y de un 38% en el CSA del mismo en un periodo de 12 días de suspensión de

miembros posteriores en ratones (Matuszczak et al., 2004). Estos resultados coinciden

con otros estudios realizados en ratas, en los que 14 días de suspensión produjeron una

disminución del 34 y 24% en la masa del sóleo y del músculo plantar, siendo la pérdida

del 47 y 24% si se aumentaba el tiempo de suspensión a 28 días (Miller et al., 2001).

Aunque la técnica para evaluar la fuerza máxima es diferente de los utilizados en

los seres humanos, el modelo de suspensión de miembros posteriores en roedores parece

tener efectos más drásticos que los modelos de inactividad utilizados en los seres

humanos. De hecho, Pottle y Gosselin observaron una disminución del 30% en la fuerza

máxima desarrollada por el músculo sóleo de ratas después de 7 días de inactividad. Así

Introducción

38

mismo, se observó que 10 días de suspensión (Pottle and Gosselin, 2000) producen una

disminución similar en el músculo sóleo de los ratones, pero sin cambiar la fuerza

máxima desarrollada el gastrocnemio (Wenke et al., 2010). Cuando el período de

suspensión se extiende a dos semanas, la reducción se hace más significativa,

pudiéndose obtener una reducción de la fuerza máxima alrededor de 50-60% en el

músculo sóleo de ratas (Riley et al., 2005).

1.5.2. Vías de señalización comunes en la atrofia inducida por inactividad

muscular

Como se ha comentado anteriormente, la atrofia del músculo esquelético se

caracteriza por una disminución en el contenido de proteína, diámetro de la fibra, la

producción de fuerza y la resistencia a la fatiga. Los diferentes tipos de condiciones que

producen atrofia implican diferentes tipos de factores desencadenantes moleculares y

vías de señalización para la pérdida de masa muscular. En este apartado de tesis nos

centraremos en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en gran

parte de las situaciones en las que se produce una atrofia muscular. Se finalizará con la

descripción de aquellos mecanismos concretos de atrofia por desuso o inactividad

muscular (suspensión de miembros posteriores en animales, pacientes encamados, o

microgravedad durante vuelos espaciales).

Miostatina: Proteína perteneciente a la familia de los factores de crecimiento

transformante beta (TGF-β), conocida como reguladora negativa del crecimiento

muscular (Lee, 2004). Similares a otros miembros de la familia TGF-β, la miostatina se

secreta como una proteína precursora que se escinde para generar un ligando maduro

que transmite las señales a través de un receptor de tipo II para la activación de factores

de transcripción Smad (Dominique, 2006).

Se ha observado que ratones knockout de esta proteína produce músculos

marcadamente agrandados como resultado de la hipertrofia y la hiperplasia (Grobet et

al., 2003). Así mismo, la activación sistémica de este regulador conduce a la pérdida de

masa muscular en ratones (Zimmers TA, 2002).

Introducción

39

Estudios de Se- Jin Lee y sus colaboradores han demostrado que los músculos de

los ratones knockout de miostatina pesan alrededor de 100-200 % más que sus ratones

controles, exhibiendo tanto hipertrofia de la fibra como hiperplasia, mientras que la

sobreexpresión de la miostatina sistémica causa hasta 50% de pérdida de la masa

muscular esquelética, provocando caquexia severa (Lee, 2004). Además, el tratamiento

de células musculares cultivadas con miostatina recombinante produce una pérdida de

proteínas y una reducción de la tasa de síntesis de las mismas (Jackman and Kandarian,

2004). Posteriormente, se demostró que la miostatina modula estos efectos en los

músculos a través de varios mecanismos. Durante la diferenciación miogénica, la

miostatina puede inhibir la proliferación mediante la modulación de los niveles de

CDK-2 (kinasa dependiente de ciclina 2) y p21Cip1 (Inhibidor de la kinasa dependiente

de ciclina 1A), además de poder reprimir la diferenciación terminal por la regulación

negativa de MyoD, proteína de diferenciación miogénica (Langley, 2002).

Por otra parte, la expresión de miostatina se incrementa en algunas condiciones

crónicas como en pacientes infectados con virus de la inmunodeficiencia humana

adquirida (VIH) (Gonzalez-Cadavid et al., 1998), el envejecimiento o la osteoartritis.

Además, también se ha observado su incremento en otros tipos de atrofia muscular

como la inducida durante la suspensión de miembros posteriores y la exposición a la

microgravedad (Carlson CJ, 1999, Lalani R, 2000, Ma et al., 2003). O, incluso, en una

condición de caquexia inducida en ratones inyectados con células CHO, las cuales

expresaron altos niveles de miostatina. En este estudio se demostró que la miostatina

puede actuar sobre MyoD pero, además, también tiene la capacidad de inducir la

expresión Forkhead box protein O1 (FoxO-1) que conduce a la producción

concomitante de la ubiquitin-ligasa Muscle atrophy F-Box (MAFbx, también conocida

como atrogina-1) que aumenta la actividad proteasomal (Ghosh et al., 1998). De hecho,

los tratamientos con miostatina inactivan la vía IGF1-PI3K-Akt y activa FoxO1, lo que

permite el aumento de expresión de MAFbx. Esta diafonía entre las dos vías no requiere

la activación de NF-кB, cuya inhibición no impide la regulación positiva de MAFbx

(McFarlane, 2006).

Todo ello que indica que la miostatina puede contribuir a la atrofia de tipo

caquexia. Es importante destacar, sin embargo, que los ratones con hipertrofia muscular

debido a la supresión del gen de miostatina desarrollan una atrofia muscular igual o

Introducción

40

mayor que los ratones de wild-type en respuesta a la suspensión de miembros

posteriores (McMahon et al., 2003). Este hallazgo indica que la atrofia inducida por

suspensión no sólo requiere la expresión de miostatina, si no que actúan otras vías de

señalización conjuntamente.

Glucocorticoides: Los niveles de glucocorticoides se incrementan en muchas

condiciones patológicas asociadas con la pérdida de músculo, además el glucocorticoide

sintético dexametasona es ampliamente utilizado para inducir la proteólisis muscular, ya

sea in vivo (Hasselgren, 1999) o en un cultivo celular (Thompson MG, 1999). En el

músculo esquelético, los glucocorticoides disminuyen la tasa de síntesis de proteínas y

aumentan la tasa de degradación de las mismas (Goldberg et al., 1980, Mayer et al.,

1976, Tomas FM, 1979).

Concretamente, el tratamiento con glucocorticoides induce la expresión de

MAFbx y Muscle RING Finger-1 (MuRF-1) promoviendo la pérdida de masa muscular

en cultivo celular e in vivo (Bodine, 2001, Clarke, 2007, Sacheck, 2004, Sandri, 2004,

Schakman, 2008). Por el contrario, la adrenalectomía, o el tratamiento con un

antagonista de receptor de glucocorticoides, atenúa la pérdida de músculo en algunas

enfermedades (Schakman, 2008, Menconi, 2007). Los mecanismos de la atrofia

muscular mediados por glucocorticoides es la siguiente: una vez en el núcleo, el

receptor de glucocorticoides activa la expresión de dos genes diana, que codifica el gen

Regulated in development and DNA damage responses 1 (REDD1) y Krüppel-like

factor 15 (KLF15) (Shimizu, 2011). REDD1 inhibe la actividad de mammalian target of

rapamycin (mTOR). KLF15 participa en el catabolismo muscular a través de la

regulación transcripcional de FoxO1, MAFbx y MuRF-1. Por otra parte, KLF15 afecta

negativamente a través de la regulación positiva de mTOR.

Así mismo, se sabe que tanto la atrofia por inactividad muscular como la

caquexia llevan asociado un incremento de los niveles de glucocorticoides circulantes,

así como, un aumento en la capacidad de unión de los corticosteroides durante la

inactividad muscular. (Jackman and Kandarian, 2004).

Sin embargo, cuando los animales adrenalectomizados se sometieron a

suspensión de miembros posteriores, con o sin tratamiento de cortisol, igualmente

sufrieron atrofia muscular (Jaspers and Tischler, 1986). En este mismo sentido es

importante destacar que el tratamiento con un inhibidor de los glucocorticoides, RU-

Introducción

41

38486, en ratas suspendidas, no inhibió la atrofia por inactividad muscular (Tischler,

1994). Por lo tanto, los glucocorticoides no parecen ser necesarios para la atrofia por

inactividad muscular. En el caso de caquexia, los glucocorticoides parecen ser un factor

que contribuye a la pérdida de masa muscular, en parte porque las ratas tratadas con

RU-38486 demostraron una reducción de la proteólisis, aunque la pérdida de proteínas

no era completamente atenuada (Hall-Angerås, 1990, Zamir, 1993).

TNF-α y otras citoquinas: Existe una amplia literatura sobre el papel de las

citoquinas en la caquexia que demuestra que TNF-α y otras citoquinas como la IL-1 se

incrementan en estas condiciones. La administración de TNF-α pueden inducir

caquexia, y el bloqueo de TNF-α en ratas, ya sea en cáncer o sepsis, evita la pérdida de

masa muscular. El tratamiento único con TNF-α también conduce a la degradación

creciente de proteínas en células musculares en cultivo (Jackman and Kandarian, 2004).

Así mismo, TNF-α y las citoquinas pro-inflamatorias también causan resistencia

a la insulina y la supresión de la vía IGF1-Akt (de Alvaro, 2004, Dogra et al., 2007,

Hirosumi et al., 2002). Por lo tanto, la fosforilación de Akt siempre debe ser explorada

cuando se perturba la vía NF-кB, ya que la inhibición de Akt puede contribuir

sustancialmente a la atrofia muscular.

Así mismo, hay estudios en los que no se encontraron diferencia en los niveles

de proteína de TNF-α los niveles de proteína en los músculos, de los miembros

posteriores, suspendidos (Hunter RB, 2002). Por lo tanto, las citoquinas son factores

desencadenantes clave en la pérdida de masa muscular en la caquexia, pero se sabe que

en periodos de inactividad muscular es un tema que presenta muchas controversias. Una

razón probable de que las citoquinas están involucradas con la caquexia, pero no

parecen estar implicados en la atrofia por desuso es que este último es un fenómeno

local mientras que el primero implica desencadenantes sistémicos (Jackman and

Kandarian, 2004).

Por otra parte, se sabe que varios sistemas proteolíticos contribuyen a la

degradación de las proteínas musculares. Las proteasas más investigadas en el músculo

esquelético son las proteasas lisosomales, proteasas activadas por el Ca2+ (es decir,

calpaínas) y el sistema ubiquitin-proteasoma.

Introducción

42

Aunque las proteasas lisosomales se activan en el músculo esquelético sometido

a una atrofia por inmovilización, la importancia de estas proteasas parece limitada

(Furuno and Goldberg, 1986, Hasselgren et al., 2002, Purintrapiban et al., 2003). Por el

contrario, existe una fuerte evidencia que indica que tanto la calpaína como el sistema

ubiquitin-proteasoma juegan un papel fundamental en el desajuste proteico muscular

durante la atrofia muscular (Furuno and Goldberg, 1986, Ikemoto et al., 2001,

Purintrapiban et al., 2003). Por otra parte, nuevas evidencias revelan que otra proteasa,

la caspasa-3, puede contribuir también en distintas formas de atrofia muscular (Du et al.,

2004).

Calpaínas: Las calpaínas (calpaínas I y II) son proteasas cisteínicas

dependientes de Ca2+ que se activan en el músculo esquelético durante periodos de

inactividad (Goll et al., 2003). Aunque las calpaínas no degradan directamente la actina

y la miosina, liberan las proteínas del sarcómero mediante la ruptura de las proteínas del

citoesqueleto (titina, nebulina) encargadas de sostener los elementos contráctiles.

La actividad de la calpaína está regulada por varios factores, incluyendo los

niveles citosólicos de calcio y la concentración de la calpastatina inhibidora de la

calpaína endógena (Goll et al., 2003). Por lo tanto, la actividad de la calpaína aumenta

mediante cualquier factor que eleve las concentraciones de calcio citosólico y/o

disminuya los niveles de calpastatina (Goll et al., 2003). En este sentido, se conoce que

la inactividad muscular está asociada con la sobrecarga de calcio y la activación de

calpaína (Kourie, 1998). Aunque el mecanismo responsable de esta sobrecarga de calcio

producida por la inactividad todavía se desconoce, se ha argumentado que el estrés

oxidativo podría jugar un papel relevante en el trastorno iónico celular (Kondo et al.,

1994). Una explicación biológica para esta teoría es que la formación de aldehídos

reactivos mediada por la oxidación (4-hydroxy-2, 3-trans-nonenal) reduce la actividad

de Ca2+ ATPasa en la membrana plasmática (Sommerburg et al., 1998). Por ello, se

deduce que una disminución en la actividad de Ca2+ ATPasa en la membrana, inducida

por el estrés oxidativo, retrasaría la eliminación de Ca2+ de las células y promovería su

acumulación intracelular. Sin embargo, se desconoce todavía si este mecanismo es el

único responsable de la sobrecarga de calcio en el músculo debida a la inactividad.

Introducción

43

La caspasa-3: Numerosas vías de señalización pueden desencadenar la

activación de un grupo de proteasas denominado caspasas (Primeau et al.,

2002). Colectivamente, las caspasas son endoproteasas que degradan las proteínas y, en

algunos casos, causan la muerte celular programada (apoptosis). En la célula, las

caspasas se expresan como precursores inactivos, procaspasas y la activación de las

caspasas puede dar lugar a acontecimientos que conducen a la degradación de proteínas

y la apoptosis.

La vía mitocondrial de activación de la caspasa-3 es compleja y puede ser

iniciada por numerosas señales de interacción, incluyendo las ERO (Leeuwenburgh,

2003). Estas últimas pueden conducir a la liberación mitocondrial de citocromo C,

resultando en la activación de la caspasa-9 y la posterior activación de la caspasa-3

(Leeuwenburgh, 2003).

Hemos descrito distintas vías de señalización que actúan en diversas condiciones

en las que se induce una atrofia muscular, pero que no se han visto implicadas durante

la inactividad muscular. Por ello, a continuación vamos a centrarnos en aquellas vías

moleculares implicadas concretamente en la atrofia muscular por inmovilización o

suspensión de miembros posteriores como lo son el estrés oxidativo, la actividad del

sistema ubiquitin-proteasoma, la supresión de la vía IGF/Akt y la inflamación inducida

por la vía molecular del factor de trascripción nuclear NF-кB. Puesto que, la alteración

de estas vías induce una atrofia más acentuada en los músculos de contracción lenta, es

decir, los que están compuestos en su mayoría por fibras tipo I, también denominadas

fibras rojas por su elevado contenido de mioglobina, más que en los de contracción

rápida o tipo II.

1.5.3. Inmovilización y estrés oxidativo

En este apartado encontraremos un breve resumen del papel que el estrés

oxidativo juega en la atrofia muscular por inactividad. El enfoque planteado presenta

primero un listado de conceptos bien definidos con referencia a importantes vías

proteolíticas que conducen a la atrofia muscular por inmovilización.

Introducción

44

A continuación se exponen las posibles fuentes oxidantes implicadas en el estrés

oxidativo vinculado a la atrofia muscular y se comenta como afecta todo ello a la

actividad de las enzimas antioxidantes.

1.5.3.1. Efecto de la inmovilización sobre el estrés oxidativo en el músculo

esquelético

El aumento de actividad de las ERO y el estrés oxidativo están estrechamente

asociados con la pérdida de masa muscular en diversos estados catabólicos que incluyen

el cáncer (Tisdale, 2000), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Clanton et al.,

1999), la insuficiencia cardiaca congestiva (Anker and Rauchhaus, 1999), la sarcopenia

senil (Spiers et al., 2000), y la inmovilización (Kondo et al., 1991).

Se puede tender a pensar que la producción de ERO es mínima en periodos de

inactividad muscular y que el daño oxidativo no está presente. Sin embargo, cada vez

hay más pruebas que implican al estrés oxidativo como un importante regulador de las

vías que conducen a la atrofia muscular durante estos periodos.

Muchos estudios han ratificado que se produce un daño oxidativo y un deterioro

muscular durante los períodos de inactividad física (Kondo et al., 1993b, Kondo et al.,

1994, Lawler et al., 2003, Servais et al., 2007), como ocurre en los largos periodos de

inmovilización, durante una lesión muscular, largos reposos en cama, exposiciones a

vuelos espaciales, denervación muscular o en el proceso de envejecimiento (Booth and

Zwetsloot, 2010). Estas situaciones se caracterizan por desencadenar un elevado estrés

oxidativo.

La atrofia por suspensión, como veremos en puntos posteriores, actúa en la

regulación positiva de Cu,ZnSOD y resulta perjudicial debido a una concomitante

disminución de la catalasa, glutatión peroxidasa, y, posiblemente, de MnSOD, sistemas

que normalmente actúan para contrarrestar el aumento de las ERO.

El tratamiento de las células musculares con H2O2 conduce al aumento de la

degradación de las proteínas, disminución de la expresión de miosina, y el aumento de

la expresión de los componentes de la vía proteolítica ubiquitin-proteasoma (Jackman

and Kandarian, 2004). Se sugiere que dichos componentes son objetivos

transcripcionales de la señalización de ERO en miotubos cultivados. Por otra parte, se

Introducción

45

ha observado que las EROs inducen a la activación de la vías de señalización NF-кB,

asociada a la pérdida de proteínas (Li and Reid, 2000). Por lo tanto, parece posible que

el aumento de las ERO pueda desencadenar la vía de señalización NF-кB, como

veremos en apartados posteriores.

En la actualidad, no se sabe con exactitud que vías de producción de radicales

libres son las responsables de este daño oxidativo. Sin embargo, parece lógico que el

estrés oxidativo en el músculo esquelético inactivo pueda deberse a la interacción de al

menos cinco vías diferentes de producción de oxidantes (Kondo et al., 1991): 1) la

generación de ERO por la vía de la XO, 2) la producción de NO a través de NOS, 3) la

formación de ERO por el aumento de los niveles celulares de hierro reactivo, 4) la

NADPH oxidasa, y 5) la producción mitocondrial de radicales superóxido (Ver figura

1.4.).

Figura 1.4. Vías por las que se producen ERO en el músculo esquelético durante

periodos de inactividad. Extraído de (Powers et al., 2005)

Otras publicaciones demuestran que la atrofia muscular inducida por la

inmovilización aumenta los niveles de ácido tiobarbitúrico (TBARS) y la peroxidación

de lípidos, a la vez que disminuye el ratio GSH/GSSG (Kondo et al., 1993c, Sen, 1992).

Introducción

46

1.5.3.2. Producción y fuentes de radicales libres

A continuación, comentaremos brevemente las posibles fuentes oxidantes

implicadas en la atrofia muscular:

Óxido nítrico: La producción endógena de NO- a través de las NOS puede dar

lugar a la formación de varias ERN, incluyendo el ONOO-.

La producción de ONOO- y otras ERN está relacionada con el daño celular

debido a la peroxidación de lípidos y al aumento de la nitrosilación de

proteínas. Existen tres isoformas de ERN (Stamler and Meissner, 2001):

1) ERN inducible (iNOS), que es independiente de calcio.

2) ERN endotelial (eNOS), que se activa por el calcio.

3) ERN neuronal (nNOS), que es también activada por el calcio. Ambos, nNOS

y eNOS, se expresan en el músculo esquelético (Kobzik et al., 1994).

Por otra parte, además de por la activación de calcio, la actividad de NOS

también se ve influida por la fosforilación de proteínas de choque térmico. La evidencia

indica que la actividad de NOS es mayor en el músculo esquelético inmovilizado,

resultando una mayor producción de NO- (Kondo et al., 1991).

Hierro reactivo: Los metales de transición como el hierro y el cobre pueden

participar en las reacciones químicas que producen ERO (Halliwell B, 1999). Por

ejemplo, en la presencia de Fe2+, el H2O2 se convierte en el radical hidroxilo altamente

reactivo (OH-) a través de la reacción Fenton:

Fe2+ + H2O2 Complejos intermedios Fe3+ + HO• + HO-

Además, los catalizadores metálicos pueden también contribuir a la formación

de radicales hidroxilo a través de la reacción Haber-Weiss:

O2•- + H2O2 O2 + HO• + HO-

En las células sanas, el hierro está estrechamente ligado a la proteína ferritina de

fijación de hierro. El hierro unido a la ferritina normalmente no participa en las

reacciones de Fenton o de Haber-Weiss. Sin embargo, la liberación de hierro desde la

Introducción

47

ferritina o hemo-proteínas puede dar lugar a la formación de compuestos de hierro de

bajo peso molecular (es decir, hierro reactivo) que son capaces de participar en las ya

citadas reacciones de producción de radicales.

En este sentido, tanto el H2O2 como los radicales superóxido, han demostrado

promover la liberación de hierro de la ferritina, de la misma manera que la hemo-

oxigenasa-1 es capaz de liberar hierro unido a hemo-proteínas (Halliwell B, 1999). En

cualquier caso, un aumento de los niveles celulares de hierro reactivo es un

contribuyente potencial al daño celular oxidativo. En referencia al estrés oxidativo

mediado por el hierro en el músculo esquelético, la inmovilización del sóleo de las ratas

ha demostrado facilitar el aumento de los niveles de hierro muscular (Kondo et al.,

1992a, Kondo et al., 1992b). Este aumento de hierro en el músculo se asoció con la

elevada peroxidación de lípidos en el músculo inmovilizado. La administración

sistémica de un quelante del hierro disminuyó el estrés oxidativo asociado con la

inmovilización del músculo (Kondo et al., 1992b).

NAD(P)H-oxidasa: Una nueva evidencia indica que una NAD(P)H oxidasa no-

fagocítica y no-mitocondrial se encuentran en el músculo esquelético tanto de humanos

como de roedores. Las NAD(P)H oxidasas son enzimas asociadas a la membrana que

catalizan la reducción de oxígeno molecular utilizando NADH o NAD(P)H como

donadores de electrones. Numerosos factores pueden aumentar la actividad de

NAD(P)H-oxidasa en las células, incluyendo la vía C-ERK1/2 proteín-kinasa. La

inactividad del músculo esquelético tiene como resultado un aumento de la

concentración de calcio intracelular, por lo que parece evidente que la actividad de

NAD(P)H oxidasa aumentaría, resultando una elevada producción de superóxido. Sin

embargo, en la actualidad no está claro si la inactividad del músculo esquelético tiene

como resultado un aumento de la NAD(P)H oxidasa (Javesghani et al., 2002).

Producción mitocondrial de ERO: Está perfectamente detallado que el

transporte de electrones a lo largo de la cadena de transporte resulta en la formación de

radicales superóxido. De hecho, se estima que en niveles fisiológicos de oxígeno, 0.15%

del total de oxígeno reducido en las mitocondrias podría formar radicales superóxido

(St-Pierre et al., 2002). Por lo tanto, la posible implicación de la mitocondria en la

producción de radicales en el músculo por inmovilización ha sido ampliamente

estudiada.

Introducción

48

Xantina oxidasa: Ya se ha descrito anteriormente de forma extensa y precisa

como la XO se relaciona con diversos procesos patológicos y produce un daño

oxidativo a los tejidos, ya que su acumulación inicia una cascada de reacciones cuyo

resultado es un gran aumento en la formación de radicales libres (ver apartado 1.1.1.1).

Por lo que solo recordaremos que la XO se produce en las células a través de la

oxidación de sulfidrilos o de la proteólisis de XDH mediante las proteasas activadas por

el calcio (calpaína) (Hellsten et al., 1997). En presencia de oxígeno y sustratos purina

(HX, xantina), la XO cataliza la formación de radicales superóxido y ácido úrico. El

radical superóxido puede suponer la formación de otras especies reactivas más

dañinas. Por ejemplo, la producción de superóxido mediante la vía de la XO puede

reaccionar con el NO- para formar el altamente reactivo y biológicamente dañino,

ONOO- (Halliwell B, 1999). Kondo y colaboradores señalaron la XO como la principal

fuente de producción de ROS en los músculos atrofiados (Kondo et al. 1993a). Así

mismo Matuszczak observó que la administración de alopurinol en ratones tenía efectos

protectores durante la suspensión de las extremidades posteriores (Matuszczak et al.

2004).

1.5.3.3. Papel de la vía ERO/MAPKinasa p38 en el músculo esquelético

Este aumento de la actividad de las ERO dentro de las fibras del músculo

esquelético activa los factores de transcripción sensibles a redox y de proteínas kinasas,

incluyendo NF-кB, AP-1, MAPKinasa p38, ERK1/2, y JNK (Garg and Aggarwal,

2002).

La MAPK p38 ha sido identificada como una posible mediadora de la

señalización del catabolismo en el músculo esquelético (Tracey, 2002). Ya que se ha

demostrado su implicación en distintas situaciones de atrofia muscular. Por ejemplo, se

observó un aumento de la fosforilación de p38 en los músculos atróficos de pacientes

tetrapléjicos con miopatía aguda y en los músculos de personas con atrofia muscular

neurogénica (Di Giovanni et al., 2004). Así mismo, con un protocolo de suspensión de

miembros posteriores, durante 10 días, observaron un aumento de 128 % en la

fosforilación de p38 al mismo tiempo que se redujo el contenido de p38 total en el

músculo sóleo de las ratas inmovilizados (Childs et al., 2003).

Introducción

49

Otras condiciones caquéxicas en el que se ha demostrado la fosforilación de p38

en el músculo esquelético incluyen la diabetes tipo 2 (Koistinen et al., 2003) y el

proceso de envejecimiento (Williamson et al., 2003).

El papel en la regulación del catabolismo muscular por parte de p38 viene con su

relación con la ubiquin-ligasa MAFbx. Ya que se ha demostrado que la inducción de la

fosforilación de p38, aumenta la expresión de MAFbx en el músculo esquelético (Li et

al., 2005). En este mismo estudio se demuestra que la inhibición de p38 inactiva la

expresión de MAFbx, dejando en manifiesto la relación p38/MAFbx (Li et al., 2005).

1.5.3.4. Evolución de la defensa antioxidante enzimática y no enzimática

Otro punto a tener en cuenta es la modificación de las actividades enzimáticas

antioxidantes inducidas por la inmovilización.

En la actualidad se han publicado diversos estudios en los que se han evaluado

los cambios de las enzimas antioxidantes en el tejido muscular de animales en respuesta

a la suspensión de miembros posteriores. Algunos estudios han demostrado que la

suspensión de miembros posteriores causa un ligero descenso en la actividad de la

MnSOD (Lawler et al., 2003), mientras que la actividad de la Cu,ZnSOD aumenta

significativamente (Lawler et al., 2003, Kondo et al., 1993b, Servais et al., 2007). Por el

contrario, la catalasa y la GPx, enzimas antioxidantes que eliminan los peróxidos, se

reducen de manera significativa (Lawler et al., 2003).

Girten y sus colaboradores describieron una disminución en la actividad de la

catalasa y la forma total de SOD después de 14 días de suspensión. Sin embargo, no se

encontraron modificaciones en el Cu,Zn-citosólico y las isoformas Mn-mitocondriales

de SOD, la GPx no se midió (Girten et al., 1989).

Por el contrario Kondo et al. (Kondo et al., 1993b, Kondo et al., 1993c)

informaron de una respuesta más compleja tras ocho días de inmovilización. La GPx y

la catalasa no se modificaron, mientras que la isoforma Cu,ZnSOD se incrementó un

41%.

Introducción

50

Por ello, podemos deducir que la respuesta de todo el espectro de enzimas

antioxidantes a la inmovilización muscular no ha sido completamente definida. Ya que,

como hemos observado, existen pocos estudios y con respuestas muy dispares sobre los

efectos de la suspensión de miembros posteriores en la capacidad de los antioxidantes

no enzimáticos. Es muy probable que uno de los motivos sean las diferencias existentes

entre los distintos modelos de suspensión utilizados.

1.5.4. Inmovilización y sistema ubiquitin-proteasoma: Papel de las E3

ubiquitin-ligasas

El proteosoma es un complejo enzimático multicatalítico de gran tamaño

presente en la cara citosólica de la membrana plasmática y en el núcleo. Es uno de los

medios que emplean las células para controlar la función de las proteínas modulando el

balance entre síntesis y degradación de las mismas. El proteasoma es el sistema más

importante de degradación de proteínas en el músculo esquelético, así como en la

mayoría de los tejidos (Rock et al., 1994), ya que se estima que es el responsable de la

degradación del 80-90% de las proteínas celulares incluyendo reguladores del ciclo

celular, factores de transcripción, proteínas anormales o dañadas, oncogenes y genes

supresores de tumores, (Ciechanover and Schwartz, 1998).

La ubiquitinación de proteínas es un mecanismo de etiquetado, como lo son la

fosforilación o la glicosilación. Para que una proteína sea degradada por el proteasoma

tiene que ser marcada por unión covalente de una cadena de poliubiquitina, que requiere

la actividad de tres clases de enzimas (Pickart and Cohen, 2004, Glickman and

Ciechanover, 2002).

La primera enzima que actúa es la enzima ubiquitina de activación (E1) que, en

un proceso que requiere gasto de ATP, activa una ubiquitina formando un enlace

tioéster entre su cisteína del sitio activo y el extremo C-terminal de la ubiquitina. Para

que la activación sea completa E1 tiene que unirse de forma no covalente a una segunda

molécula de ubiquitina. Esta ubiquitina activada es transferida, desde la enzima E1, a

otra cisteína localizada en el centro activo de las enzimas transportadoras o de

conjugación de ubiquitina, denominadas E2, pasando el enlace tioester a estas últimas.

La enzima E2 transfiere la molécula de ubiquitina a la E3, la enzima clave en este

Introducción

51

sistema, que posee su propia actividad catalítica y es responsable de la transferencia

final de la ubiquitina a un sustrato formando un enlace isopéptídico entre la proteína

diana y la ubiquitina.

Finalmente las proteínas ubiquitinadas sufren degradación en el proteasoma 26S.

Una cadena de cinco moléculas de ubiquitinas unidas al sustrato de proteína que va a ser

degradada es suficiente para que el complejo sea reconocido por el proteasoma 26S.

El proteasoma 26S está formado por los extremos 19S que escinden la cadena de

ubiquitinación y utilizan ATPasas para que la proteína se alinee y sea inyectado en el

centro del proteasoma que corresponde al núcleo 20S, compuesto de cuatro

subunidades, donde se digiere el sustrato y se degrada a pequeños péptidos. Los

péptidos son degradados a aminoácidos (entre 3 y 25 residuos de aminoácidos) por

peptidasas en el citoplasma o utilizados en la presentación de antígenos (Reid, 2005).

Figura 1.5. Vía de degradación de proteínas por el sistema ubiquitin-proteasoma.

Adaptado de (Lecker et al., 2006)

Se sabe que el sistema de ubiquitin-proteasoma degrada las principales proteínas

contráctiles del músculo esquelético y juega un papel importante en la pérdida de masa

muscular.

El genoma humano codifica más de 650 ubiquitin ligasas (Lee and Goldberg,

2011), que están implicadas en la regulación precisa de diferentes procesos celulares.

Las distintas E3 ubiquitin-ligasas existentes ofrecen una especificidad y selectividad a la

hora de marcar ciertos grupos de proteínas, es decir, las E3 ubiquitin-ligasas que marcan

las proteínas para ser degradadas varían entre los distintos tipos de tejidos.

Introducción

52

Concretamente, estudios experimentales en los que los animales fueron

sometidos a suspensión de miembros posteriores y en sujetos encamados o en situación

de ingravidez muestran un aumento en la expresión de mRNA de las E3 ubiquitin-

ligasas, de las subunidades de proteasoma 20S (Taillandier et al., 1996, Urso et al.,

2006), así como, un incremento de proteínas ubiquitinadas (Ikemoto et al., 2001), lo que

demuestra la contribución significativa del sistema ubiquitin-proteasoma en la atrofia

muscular inducida por suspensión.

Entre las E3 ubiquitin-ligasas conocidas, sólo unas pocas son especificas del

músculo esquelético y se expresan comúnmente en, al menos, 13 condiciones que

inducen atrofia muscular, como la caquexia cancerosa y reumatoide, sepsis, diabetes,

sarcopenia, inmovilización, denervación, virus VIH, fallo renal, etc. (Foletta et al.,

2011). Los estudios pioneros para identificar las ubiquitin-ligasas implicadas en la

atrofia muscular fueron realizadas por estudios independientes de expresión génica de

Alfred L. Goldberg y David J. Glass (Bodine et al., 2001a, Gomes et al., 2001). Estos

estudios permitieron identificar las E3 ubiquitin-ligasas que se expresan comúnmente en

todos estos procesos de pérdida o atrofia de masa muscular, a las que denominaros

atrogenes (Sacheck et al., 2007).

Dos de estas E3 ubiquitin-ligasas especificas del músculo esquelético son,

MAFbx, también conocida como atrogina-1, y un nuevo gen denominado MuRF-1. La

capacidad de las E3 ubiquitin-ligasas de reconocer su sustrato depende de la secuencia

de aminoácidos y/o dominios estructurales y fosforilados específicos. MAFbx está

constituída por un dominio F-box, que caracteriza una clase de proteínas que cumplen

función de E3 ubiquitin-ligasas, llamadas complejo SCF (proteína Skp1, proteína Cal,

proteína Ring Fingers y proteína F-Box) (Sandri, 2008, Glickman and Ciechanover,

2002). En cambio, la familia de proteínas MuRF-1 contiene un dominio Zn2+ unido a un

dominio RING en su extremo NH2-terminal.

Entre los sustratos que son marcados por MAFbx se incluyen el factor de

iniciación de la elongación 3 subunidad 5 (eIF3-F) y los factores reguladores

miogénicos MyoD y miogenina, por lo que su degradación afecta a la traducción de

proteínas y, por lo tanto, la síntesis de las mismas, además de la diferenciación de

mioblastos, (Lagirand-Cantaloube et al., 2008, Li et al., 2004, Tintignac et al., 2005). El

aumento de la expresión de eIF3-F está relacionado con la hipertrofia del músculo

Introducción

53

esquelético, en contra la disminución de sus niveles deriva en atrofia muscular

(Lagirand-Cantaloube et al., 2008). La interacción de MAFbx y MyoD se produce en el

núcleo. La sobreexpresión de los MAFbx y la subsiguiente poliubiquitination de MyoD

produce una inhibición de la diferenciación y formación de los miotubos en el músculo

esquelético (Lagirand-Cantaloube et al., 2009). Además, se ha observado que en

animales knockdown de MAFbx se revierte la proteólisis de MyoD inhibiéndose la

atrofia muscular (Lagirand-Cantaloube et al., 2009). Estos resultados confirmaron que

MyoD es un sustrato regulado por MAFbx. De la misma forma, MAFbx regula la

expresión de miogenina en los procesos de atrofia muscular inducida por dexametasona

(Jogo et al., 2009). Estos estudios demuestran que estos factores de transcripción

miogénica son una diana de la E3 ubiquitin-ligasa MAFbx, sugiriendo su implicación en

la regulación de la diferenciación de mioblastos.

En cambio MuRF-1 está implicado en la degradación de proteínas estructurales,

ya que marca proteínas como la troponina I, la titina (Centner et al., 2001) o la cadena

pesada de la miosina (MHC) después de un tratamiento con dexametasona. Además,

MuRF-1 ubiquitina la miosina unida a la proteína C y la cadena ligera de la miosina 1 y

2 (MLC1 y MLC2) en condiciones de denervación y ayuno (Cohen et al., 2009). Estos

dos últimos estudios identificaron estas proteínas in vivo utilizando ratones transgénicos

knockout de MuRF-1, mientras que otros estudios de ubiquitinación in vitro han

confirmado la depleción selectiva de cadenas pesadas de miosina (Fielitz et al., 2007),

así como, una forma oxidada de la creatin kinasa (Zhao et al., 2007). Así mismo,

también se ha descrito la relación de la E3 ubiquitin-ligasa MuRF-1 con varias proteínas

asociadas con la producción de glucosa y el metabolismo del glucógeno (Hirner et al.,

2008).

Estos estudios sugieren que distintas vías metabólicas pueden activar la

sobreexpresión de MAFbx y MuRF-1, y que estas E3 ubiquitin-ligasas actúan por

separado sobre diferentes proteínas. La activación de MAFbx está más relacionado con

la inhibición de la síntesis proteica y el crecimiento muscular, mientras que la activación

de MuRF-1 induce el aumento de la degradación de proteínas, probablemente afectando

al metabolismo muscular.

Introducción

54

Por otro lado, hay que destacar que aunque estas E3 ubiquitin-ligasas actúan en

distintas situaciones en las que se induce una atrofia muscular, no actúan de igual

manera en todas ellas. Del mismo modo, se han utilizado distintos y numerosos

inhibidores para bloquear la expresión de MAFbx y/o MuRF-1, y en consecuencia,

paliar la atrofia del músculo esquelético, observándose que ningún inhibidor es eficaz

para todos los procesos de atrofia.

En relación a la sobreexpresión de las E3 ubiquitin-ligasas, MAFbx y MuRF-1,

en periodos de inmovilización hay que destacar aumentos en sus niveles de mRNA en la

suspensión de miembros posteriores en ratas (Lomonosova et al., 2012, Lomonosova et

al., 2011, Kline et al., 2007, Krawiec et al., 2005, Servais et al., 2007, Nordquist et al.,

2007) y ratones (Okamoto et al., 2011, Caron et al., 2009, Caron et al., 2011), así como

en personas encamadas o en situaciones de ingravidez (Chen et al., 2007, Gustafsson et

al., 2010, Jones et al., 2004, Sakuma et al., 2009, Salanova et al., 2008).

A lo largo de este apartado se ha detallado la importancia de MAFbx y MuRF-1

en distintas situaciones que inducen atrofia muscular, entre estas condiciones se

encuentran las de desuso muscular, es decir, la inmovilización, los vuelos espaciales,

largos periodos de reposo en cama y, el modelo de experimentación en animales, la

suspensión. No obstante, se ha descrito una nueva E3 ubiquitin-ligasa sugerida como la

principal responsable de la atrofia muscular inducida por suspensión o microgravedad.

Cbl-b es otra ubiquitin-ligasa con un dominio RING, descrita como un regulador

negativo del receptor tirosin kinasa (IRS), que a su vez media la activación del factor de

crecimiento insulínico tipo 1, también conocido como somatomedina C, o IGF-1

(insulin-like growth factor-1) (Keane et al., 1995, Latres et al., 2005).

Como veremos a continuación la supresión IGF-1 inhibe la síntesis de proteínas

en el músculo esquelético inactivando vía PI3K/Akt. Teniendo en cuenta que los

estudios realizados demuestran que la suspensión de miembros posteriores induce un

aumento en la expresión de la E3 ubiquitin-ligasa Cbl-b, regulando negativamente la

activación de IGF-1 en el sistema músculo esquelético, estos datos demuestran que la

atrofia muscular inducida por la suspensión de miembros posteriores es producida, en

parte, por la activación de Cbl-b que inhibe la síntesis de proteínas en el músculo

esquelético (Nakao et al., 2009).

Introducción

55

1.5.5. Inmovilización y la vía molecular IGF-1/Akt

Como hemos descrito al inicio del apartado de atrofia muscular, el músculo

esquelético mantiene su masa y la funcionalidad mediante el equilibrio de la velocidad

de síntesis y la degradación muscular, por ello, la pérdida de masa muscular en distintas

situaciones de atrofia no sólo se induce por la activación de las vías de señalización

proteolíticas, si no que las vías relacionadas en la síntesis proteica también se ven

implicadas.

Una de las vías que participa activamente en el proceso de aumento de la masa

muscular, denominada hipertrofia, es la que se inicia con la activación de IGF-1, que

resulta en la iniciación de la síntesis de proteínas (Bodine et al., 2001b, Rommel et al.,

2001). La activación de la vía se inicia con IGF-1 que activa el receptor IGFR, una

tirosina kinasa del receptor. Posteriormente, el IGFR recluta el sustrato receptor de

insulina (IRS-1), lo que activa dos vías de señalización: la vía de Ras-Raf-MEK-ERK y

de la vía PI3K-Akt (Moelling et al., 2002).

Hay estudios que confirman que la expresión de IGF-1 es suficiente para inducir

la hipertrofia en cultivos de células musculares (Vandenburgh et al., 1991). Sin embargo

otros estudios demuestran que para que hay una inducción de la hipertrofia vía IGF-1 es

necesario la actividad de fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K), una kinasa de lípidos que

mediante una serie de fosforilaciones termina activando Akt, también conocida como

proteína kinasa B (PKB), mediante la fosforilación de su serina 473, que induce la

síntesis de proteínas, la transcripción génica y la proliferación celular, a la vez que

bloquea la apoptosis (Matsui et al., 2003).

Finalmente, la activación de PI3K/Akt puede derivar en la activación de mTOR

y p70S6K, que parecen tener una importante función en distintas señales y rutas de

crecimiento y síntesis de proteínas (Hara et al., 1998).

Como hemos comentado, durante la hipertrofia del músculo esquelético se

produce la fosforilación de Akt, a la vez que aumenta la cantidad relativa de proteína en

el músculo (Bodine et al., 2001b). La importancia de la activación de esta proteína, para

la hipertrofia muscular, queda demostrada en estudios que muestran que el bloqueo de

Akt a través de un regulador negativo de la proteína inhíbe la hipertrofia mediada por

IGF-1 in vitro (Rommel et al., 2001). Otros estudios muestran como la activación de

Introducción

56

Akt es suficiente para inducir hipertrofia en las células musculares, sugiriendo que se

requiere la expresión de Akt para que la vía IGF-1/PI3K induzca la hipertrofia del

músculo (Rommel et al., 2001, Takahashi et al., 2002).

Por otro lado, se ha demostrado que la vía IGF-1/Akt no sólo aumenta la síntesis

de proteínas si no que media en la atrofia muscular previniendo la inducción de las E3

ubiquitin-ligasas, puesto que la fosforilación de la serina 473 de Akt bloquea la

translocación de la familia de factores de transcripción FoxO al núcleo impidiendo la

regulación de genes inductores de atrofia muscular como MAFbx (Sandri et al., 2004,

Stitt et al., 2004).

Durante la suspensión de miembros posteriores en roedores se ha observado una

desregularización de la vía IGF/Akt viéndose disminuida la expresión de IGF-1 desde

los primeros días, mientras que la activación de Akt se vio reducida en estados más

avanzados de la inmovilización (Nakao et al., 2009, Han et al., 2007).

Introducción

57

Figura 1.6. Vía molecular IGF-1/Akt

1.5.6. Descripción del factor de transcripción nuclear kappaB (NF- кB)

NF- кB fue descrito por primera vez en 1986 por Sen y Baltimor como un factor

que regulaba la formación de la variedad kappa de la cadena ligera de la

inmunoglobulina en células B (Sen and Baltimore, 1986). Actualmente, se sabe que NF-

кB es un factor de transcripción nuclear dimérico de expresión ubicua implicado en la

regulación de diversos procesos celulares (citado en (Karin and Lin, 2002)). NF-кB

comprende toda una familia de factores de transcripción eucarióticos que incluyen

proteínas conservadas desde la Drosophila melanogaster hasta humanos (Morisato and

Anderson, 1995). En los mamíferos la familia NF-кB/Rel consta de cinco miembros:

P65 (también denominado Rel A), Rel B, c-Rel, que contienen un dominio de

Introducción

58

transactivación C-terminal (TAD), P50 (cuyo precursor es p105) y P52 (cuyo precursor

es p100), que contienen un dominio de repetición de anquirinas en su extremo C-

terminal en lugar del dominio TAD y por lo tanto no pueden activar la expresión del

gen diana como un homodímero (Napetschnig and Wu, 2013).

Estas cinco subunidades se encuentran unidas de dos en dos formando tanto

homodímeros como heterodímeros, exceptuando a la subunidad RelB que sólo forma

heterodímeros, siendo los más frecuentes P50/P65 (citado en (Ghosh and Karin, 2002)).

Referente a su estructura todos los miembros de la familia NF-кB presentan un

dominio N-terminal común llamado RHD (Rel homology domain). Este dominio está

formado por aproximadamente 300 aminoácidos y es el responsable de la dimerización

entre los distintos miembros de la familia NF-кB (Hoffmann et al., 2006), de la

asociación con el inhibidor IкB y de la unión con los motivos кB del DNA. Además,

este dominio es donde se encuentran las secuencias de localización nuclear llamada

NLS (Nuclear Localization Sequence) (Baeuerle and Henkel, 1994).

En situación basal estas formas se mantienen en las células inactivas por una

proteína inhibidora a la que se encuentran unidas en el citoplasma, IкB, del que existen

diversas isoformas, siendo la principal IкBα. Pero dado que la composición de los

dímeros de NF-кB pueden variar dependiendo del tipo celular y que responde a una

gran cantidad de estímulos inductores de distinta índole, hacen que activen una multitud

de genes implicados en diversos procesos celulares tales como la regulación de la

respuesta inmune, la apoptosis, la inflamación, la proliferación, la diferenciación, la

migración, la adhesión celular, la angiogénesis, oncogénesis y el desarrollo, entre otros

(Lawrence and Fong, 2010, Li and Stark, 2002, Pahl, 1999). De hecho, se considera a

NF-кB como un mediador central en la respuesta inmune humana además de un

regulador de la respuesta al estrés.

1.5.6.1. Translocación de NF-кB al núcleo

Como hemos comentado NF-кB se encuentra retenido en el citoplasma por IкB.

En mamíferos se han descrito seis isoformas de esta proteína inhibidora IкB: IкBα,

IкBβ, IкBε, IкBγ, IкBδ, y Bcl-3 (B-cell lymphoma 3-encoded protein). Todas ellas

tienen una estructura tridimensional y se distinguen por el número de repeticiones de los

Introducción

59

dominios de anquirina responsables de la interacción con el dímero de NF-кB

(Baeuerle, 1998). Siendo IкBα e IкBβ las isoformas más comunes, puesto que se

encuentran prácticamente en todos los tipos celulares y que, por ello, regulan la mayor

parte de los efectos de NF-кB.

El proceso de separación de IкB requiere su fosforilación. Una vez fosforilado,

IкBα se poliubiquitiniza en los residuos de lisina 21 y 22, degradándose en el

proteosoma 26S (Chen et al., 1995, DiDonato et al., 1996, Hayden and Ghosh, 2004,

Scherer et al., 1995). Sin embargo, IкBα también puede separarse de NF-кB al ser

fosforilado en el residuo de tirosina 42 (Bui et al., 2001, Gallagher et al., 2007, Takada

et al., 2003). Esta fosforilación induce la activación de NF-кB, pero no implica una

degradación de IкBα en el proteasoma, por lo que no implica la disminución de los

niveles del inhibidor (Imbert et al., 1996).

La fosforilación de las proteínas de la familia IкB requiere la activación

catalítica de unas serina-treonina kinasas llamadas IкΒ kinasas (IKKs). El complejo

IKK está compuesto por tres subunidades, dos de ellas catalíticas, con actividad kinasa,

que son IKKα (que fosforila los residuos S32 y S36 de IкB) e IKKβ (que fosforila los

residuos S23 y S19 de IкB-β) y una reguladora, conocida como el modulador esencial

(NEMO/IKKγ) sin actividad kinasa, pero necesaria para la formación del complejo.

Estas moléculas se activan por diversos agentes, como factores de crecimiento,

citoquinas inflamatorias, como el TNF-α, EROs y productos virales, que fosforilan dos

residuos de serina que se encuentran en el loop de activación (las Ser 177 y 181 para

IKKβ, y las Ser 176 y 180 para IKKα) (Schomer-Miller et al., 2006).

Las IKKs tienen diferente distribución celular, mientras IKKβ se encuentra

solamente en el citosol, IKKα, gracias a su secuencia NLS en el dominio kinasa, puede

localizarse tanto en el citosol como en el núcleo (Yamamoto et al., 2003, Scotto

d'Abusco et al., 2010). IKKα, en el núcleo, puede unirse a un promotor asociado al sitio

кB, lo que conlleva al aumento de la transcripción de los genes dependientes de кB.

Una vez liberado NF-кB de su inhibidor, IкB, se translocan al núcleo los

dímeros y se unen a los motivos кB (GGGRNNYYCC), donde R representa bases

púricas, Y representa bases pirimidínicas, N representa cualquier base, así mismo, G y

C representan guanina y citosina) dentro de los promotores de los genes diana regulando

su transcripción mediante la unión de co-activadores o co-represores (Magnani et al.,

Introducción

60

2000).

La activación de NF-кB como ya se ha dicho anteriormente viene determinada

por muchos estímulos, pero el más conocido es la acción del TNF-α. En este caso la

activación de NF- кB, se encarga de inhibir la señal apoptótica mediada por éste. En

ausencia de NF-кB, TNF-α es capaz de activar la cascada de proteasas específicas de la

apoptosis (caspasas).

1.5.6.2. Vías de activación de NF-кB

Vía canónica o clásica de activación de NF-кB: Es la forma más común de

activación. Se inicia en respuesta a citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1, la

deprivación de glucosa o el estrés oxidativo (citado en (Hayden and Ghosh, 2004)). Su

activación depende de la fosforilación en los residuos Ser181 y Ser180, de las kinasas

IKKα e IKKβ respectivamente. Como se ha comentado anteriormente, el complejo IKK

activo fosforila IкBα en las Ser32 y Ser36 marcándolas para su poliubiquitinación y

posterior degradación en el proteasoma 26S. Por otro lado, la activación de IKKα e

IKKβ provoca la fosforilación de p105, el cual, tras un procesamiento proteolítico da

lugar a la forma madura p50 (citado en (Perkins, 2007)). Una vez liberado de su

inhibidor, la NLS de p65 queda expuesta, se transloca al núcleo y se une al DNA,

activando la expresión de determinados genes diana como Bcl-2, Bcl-xL, Bax, IAPs,

Bim, MnSOD, IкBα. (Karin and Ben-Neriah, 2000).

Introducción

61

Figura 1.7. Vía canónica de activación de NF-кB

Vía no canónica de activación de NF-кB: Esta vía se caracteriza por ser

independiente de IкB. En este caso se produce la activación de homodímeros IKKα a

través de una kinasa llamada NIK (NF-кB-inducing kinase) (citado en (Häcker and

Karin, 2006, Scheidereit, 2006, Sun, 2011). A su vez, IKKα fosforila los residuos

específicos de serina del extremo C-terminal de las repeticiones de anquirina

(Scheidereit, 2006) de p100 que hace que sea reconocido por el proteasoma y lo degrade

parcialmente, dejando RelB intacto (Amir et al., 2004, Vallabhapurapu and Karin,

2009). Finalmente, el heterodímero p52/RelB se transloca al activando la regulación

transcripcional de diferentes genes como ciclooxigenasa-2 (Cox-2), ciclina D, MnSOD

y Bcl-xL (Holley et al., 2010, Jacque et al., 2005, Zhang et al., 2007b).

Introducción

62

Figura 1.8. Vía no canónica de activación de NF-кB

Vía atípica de activación de NF-кB: La activación de esta vía no está clara, se

sabe que es independiente de IKK y se activa por la fosforilación de IкBα en su Tyr42 y

con la posterior activación de p65/p50 (Bender et al., 1998, Kato et al., 2003). Una vez

fosforilado, IкBα se separa del heterodímero p65/p50, permitiendo que el complejo NF-

кB entre en el núcleo y active la expresión de diversos genes como Bcl-3 y Bcl-xL (Bui

et al., 2001).

Introducción

63

Figura 1.9. Vía atípica de activación de NF-кB

Tal y como hemos visto, la regulación de la NF-кB se produce a través de la

actividad de los componentes básicos de la señalización de NF-кB: la kinasa IкB (IKK),

las proteínas IкB.

No obstante, NF-кB también puede regularse mediante múltiples modificaciones

post-traduccionales directamente a través de sus subunidades. Estas modificaciones

reguladoras, que incluyen la fosforilación, ubiquitinación, acetilación, sumoilación y

nitrosilación, pueden variar dependiendo de la naturaleza del estímulo inductor de NF-

кB. Estas modificaciones pueden tener consecuencias diferentes, e incluso éstas

consecuencias pueden ser antagonistas funcionales dependiendo del contexto (Perkins,

2006).

A modo de ejemplo, podríamos resaltar que puede producirse la fosforilación de

distintas serinas de p65 por parte de la vía ERK/MAPKinasas en respuesta a varios

estímulos como, por ejemplo, TNF-α (Vermeulen et al., 2003). Así mismo, se sabe que

la MAPK p38 puede regular la actividad transcripcional de NF-кB, no sólo a través de

la fosforilación sino a través de la acetilación de p65 (Saha et al., 2007).

Introducción

64

1.5.6.3. Efecto de la inmovilización sobre NF- кB

El papel de la NF-кB en la atrofia del músculo esquelético está ganando cada

vez un mayor interés principalmente porque NF-кB se activa en respuesta a numerosas

moléculas inflamatorias que causan la pérdida de la masa muscular (deDuve and

Baudhuin, 1966, Reid and Li, 2001b). Se han descrito distintos estudios que demuestran

la importancia de la vía de NF-кB en el músculo esquelético en situaciones de desuso

muscular, inmovilización o denervación, así como en enfermedades sistémicas como el

cáncer, la insuficiencia cardíaca crónica y la lesión pulmonar aguda séptica (Jackman et

al., 2013). La atrofia muscular debido a la mayoría de estos factores desencadenantes se

asocia con la expresión de la actividad transcripcional de NF-кB.

Con el fin de determinar el rol de la vía de NF-кB en la atrofia, se han sobre

expresado o eliminado (knockout) las formas de estas proteínas y luego han evaluado el

efecto sobre la progresión de la atrofia.

Concretamente, en el modelo de atrofia de suspensión de miembros posteriores o

inmovilización la actividad de NF-кB aumenta en el sóleo entre 4 a 10 veces, pero la

supresión de IKKα, IKKβ o IкBα inhibe el aumento de dicha actividad (Van Gammeren

et al., 2009, Senf et al., 2008, Judge et al., 2007). Demostrando que cada una de estas

kinasas son suficientes para producir una atrofia significativa en las fibras musculares

de rata y ratón y que la supresión de cualquiera de las dos, IKKα o IKKβ, previene en

un 50 % la atrofia en el músculo sóleo de ratas sometidas a suspensión de miembros

posteriores (Van Gammeren et al., 2009).

En otro estudio Hunter y colaboradores proporcionaron datos que demuestran

que la suspensión de miembros posteriores en ratas desencadena atrofia muscular por la

activación de la vía no canónica de NF-кB que requiere la activación de IKKα (Hunter

et al., 2002).

Por otro lado, Bar-Shai comparó un grupo de ratas jóvenes (6 meses de edad)

con ratas viejas. En ellas comprobó que en ambos grupos se inducía el factor de

transcripción NF-кB durante la suspensión de miembros posteriores y que no había

diferencias en la cinética y el patrón de activación de NF-кB entre los dos grupos. Sin

embargo, observó que NF-кB podía inducirse por distintas vías durante la

inmovilización, siendo la vía no canónica de NF-кB la primera que se activaba.

Introducción

65

Seguidamente, la vía canónica de activación de NF-кB (complejo p65/p50 con la

degradación IкBα) era la predominante durante el periodo de inmovilización. Siendo la

activación de esta vía más prominente en los músculos de los animales viejos en

comparación con los jóvenes (Bar-Shai et al., 2008).

Hay que resaltar que, aunque se ha sugerido la activación de esta vía de

transducción de señales como posible causa de la distrofia muscular, los mecanismos

musculares que conducen a un incremento de la expresión de estas moléculas en la

distrofia muscular siguen siendo desconocidos.

Sin embargo, hay pruebas que apoyan tres mecanismos posibles:

1) La activación de NF-кB podría aumentar la actividad del ubiquitin-

proteasoma (Reid and Li, 2001b, Llovera et al., 1997).

2) Podría conducir a un aumento de la expresión de varias moléculas

inflamatorias como la IL-1β, TNF-α, moléculas de adhesión celular y la matriz

metaloproteinasa-9, que podría, directa o indirectamente, promover la pérdida de masa

muscular (Reid and Li, 2001b, Senftleben et al., 2001).

3) Se ha demostrado que interfiere en el proceso de diferenciación del músculo

esquelético necesario para la reparación de tejidos dañados (Guttridge et al., 2000,

Mares-Perlman et al., 2000).

Introducción

66

1.6. Relación entre los 4 sistemas de regulación muscular durante

la inmovilización o suspensión

1.6.1. Relación entre estrés oxidativo y la vía IGF/Akt

Como hemos comentado en el apartado 1.5.5. la vía de señalización IGF1/Akt

juega un papel importante en la regulación del crecimiento del músculo esquelético.

De manera similar a otras vías, el estrés oxidativo puede regular positiva o

negativamente la señalización de IGF-1 (Papaconstantinou, 2009). Bajos niveles de

ERO endógenas puede inducir la fosforilación en los residuos de tirosina específicos del

receptor de insulina, facilitando de este modo la señalización de IGF-1. De hecho, la

cadena de IRβ contiene múltiples sitios para la fosforilación de tirosina que son

objetivos sensibles de las ERO, tales como H2O2 (Bashan et al., 2009). En este sentido,

las ERO pueden participar en la activación de los efectos metabólicos, de forma similar

a la insulina, mediante la estimulación del transporte de glucosa en el músculo

esquelético durante el ejercicio (Coderre et al., 1995, Lund et al., 1995), ya que

estimulan la contracción del músculo esquelético y el transporte de glucosa hasta 50

veces más durante el ejercicio máximo en los seres humanos (Katz et al., 1986). Por lo

tanto, la vía propuesta en la que las ERO median la estimulación del transporte de

glucosa está relacionada con la contracción del músculo esquelético, que aumenta la

producción de aniones superóxido a través de la respiración mitocondrial. El anión

superóxido se convierte rápidamente en H2O2 por la SOD, dando lugar a la activación

directa de la MAPK transportadora de glucosa 4 (GLUT4) que se transloca a la

membrana plasmática e induce un aumento en el transporte de glucosa (Katz, 2007).

Por el contrario, altos niveles de ERO inhiben la cascada de señalización

IGF/Akt. Así mismo, esta regulación negativa de IGF-1 induce cascadas de señalización

relacionadas con la resistencia a la insulina y sus secuelas patológicas (Bashan et al.,

2009).

En el caso anterior se ha visto que bajas concentraciones de H2O2 inducen la

captación de glucosa en el músculo, por el contrario, otros estudios demostraron que en

altas concentraciones de importancia toxicológica, el H2O2 regula negativamente los

Introducción

67

niveles de mRNA de IGF-1 en la diferenciación de mioblastos C2C12 (Handayaningsih

et al., 2011, Sestili et al., 2009). Concretamente, Sestili observó que el estrés oxidativo

disminuyó significativamente los niveles de expresión de mRNA de IGF-1 (Sestili et

al., 2009) y que los antioxidantes solubles celulares, como la creatina, impiden la

inhibición de esta vía, por parte de las ERO. Además, se sabe que la creatina induce la

hipertrofia en la diferenciación de mioblastos a través de la vía de IGF-1 (Louis et al.,

2004).

Estos resultados sugieren que, aunque las ERO pueden activar la vía de

señalización de IGF-1, también hay una regulación negativa de IGF-1 cuando los

niveles de ERO adquieren unos valores tóxicos (Barbieri and Sestili, 2012). Por lo

tanto, podemos decir que las ERO regulan la acción de IGF-1 a través de una variedad

de mecanismos y que los efectos dependen, probablemente, de la concentración de las

ERO.

De este modo, las ERO juegan un papel crucial en la regulación y en la

señalización de IGF-1 y su efecto en las células musculares. Sin embargo, se necesitan

estudios adicionales para comprender mejor la importancia fisiológica de estas

interacciones.

1.6.2. Relación entre estrés oxidativo y NF-кB

A lo largo de este apartado se ha sugerido el estrés oxidativo y el aumento

anormal del nivel de moléculas pro-inflamatorias como el TNF-α y IL-1β, como los

principales mecanismos desencadenantes de las distintas vías moleculares que conducen

a una pérdida de masa muscular por inmovilización. A continuación, vamos a tratar de

explicar su relación e interacción que desencadenan la pérdida de masa muscular.

Hay estudios que demuestran que el estrés oxidativo aumenta los niveles de

TNF-α lo que implica un aumento de la pérdida del contenido de proteínas musculares

(Reid and Li, 2001b). El TNF-α activa al factor de transcripción nuclear NF-кB, que,

como ya hemos visto anteriormente, aumenta la proteólisis en el músculo esquelético

(Llovera et al., 1997).

En este sentido, Reid propone que el TNF-α puede actuar directamente sobre las

células musculares para estimular la pérdida de proteínas, acción mediada por NF-кB.

Introducción

68

Los pasos intermedios en la señalización de TNF-α/NF-кB incluyen la

estimulación del receptor tipo 1 de TNF-α (TNFR1) y un aumento de las ERO a través

de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. Como ya se ha descrito, NF-кB

aumenta la actividad de las E3 ubiquitin-ligasas, que acelera la degradación regulada de

proteínas musculares y promueve la debilidad muscular (Reid and Li, 2001b).

En los últimos años, se ha avanzado mucho en la comprensión de cómo se activa

NF-кB mediante citoquinas inflamatorias, con el objetivo de explorar los posibles

mecanismos que conducen a la regulación de NF-кB mediante el estrés oxidativo.

La evidencia de que el nivel de ERO puede ser capaz de regular la vía de NF-кB

se comprobó al exponer distintos tipos de células a H2O2. En ciertos tipos de células,

como las células T, miotubos L6, MCF-7 de mama humana y células pre-B3 y 70Z, el

H2O2 ha demostrado ser un eficaz activador de la vía de NF-кB (Sen and Packer, 1996,

Schreck et al., 1991, Manna et al., 1998).

Otras vías de investigación sugieren que el estrés oxidativo es un intermediario

común y crítico de diferentes señales para activar NF-кB. Esta conclusión está basada

principalmente en la inhibición de la activación de NF-кB por una variedad de

antioxidantes y por la sobreexpresión de enzimas antioxidantes (Schreck et al., 1992).

En diversos estudios se han utilizado estas enzimas para bloquear la activación

de NF-кB, aunque en muchos casos el grado de inhibición parece variar dependiendo

del tipo de célula y del estímulo (Schreck et al., 1992, Suzuki et al., 1994). Por ejemplo,

se ha demostrado que el antioxidante pirrolidinaditiocarbamato (PDTC) tiene un efecto

inhibidor sobre TNF-α, IL-1, acetato de forbol miristato (PMA), lipopolisacarido (LPS),

análogos de aminoácidos y péptidos β-amiloide en células Jurkat T, células HeLa,

70Z/3 de las células y neuronas primarias. Sin embargo, se destaca la sensibilidad a

PDTC descrita en células endoteliales transformadas durante la activación de NF-кB

mediante TNF-α, ya que dicha sensibilidad no se percibe en células endoteliales

primarias (Bowie, 1997).

Introducción

69

En este sentido, se podría considerar la N-acetil-L-cisteína (NAC) como un

inhibidor para la activación de NF-кB inducida por TNF-α en células Jurkat y HeLa,

aunque en ningún caso inhibiría la activación provocada por el ácido ocadaico en las

células Jurkat (Suzuki et al., 1994).

Otro posible mecanismo inhibidor de la activación de NF-кB por TNF-α, LPS,

PMA, y H2O2 es la sobreexpresión de MnSOD o GPx. Este mismo mecanismo ha

demostrado inhibir la actividad de la AP-1, la activación de JNK y la apoptosis inducida

por TNF-α. Por último, la participación del estrés oxidativo como mecanismo de

inhibición se deriva de evidentes niveles elevados de ERO en la señalización de NF-кB

en respuesta al TNF-α, IL-1, PMA, LPS, luz ultravioleta y radiaciones ionizantes

(Schreck et al., 1992).

1.6.3. Interacción entre las vías y su relación con el sistema-ubiquitin-

proteasoma durante la inmovilización o suspensión. Resumen

En los apartados anteriores hemos observado que durante la inactividad

muscular se ven implicadas distintas fuentes de radicales libres que producen un

aumento de las ERO en el músculo esquelético, así como una disminución de las

enzimas antioxidantes, lo que produce el aumento del estrés oxidativo en el músculo

esquelético, que induce atrofia de la masa muscular (ver apartado 1.5.3.1).

El estrés oxidativo está relacionado con la regulación de las vías de IGF-1/Akt y

NF-кB, que a su vez regulan tanto la síntesis como la degradación de proteínas en el

músculo esquelético a través de diferentes vías que describiremos a continuación (ver

figura 1.10).

Durante la suspensión de miembros posteriores, la activación de Akt se

encuentra disminuida (Nakao et al., 2009), pudiendo ser, en parte, por los elevados

niveles de estrés oxidativo o por la actividad de la E3 ubiquitin-ligasa Cbl-b, ya que

Cbl-b regula negativamente la vía de señalización de IGF-1/Akt en el músculo

esquelético en condiciones de suspensión de miembros posteriores en roedores. Nakao y

sus colaboradores observaron que la expresión de Cbl-b produce una degradación del

receptor de insulina IRS-1, que deriva en la pérdida de masa muscular; por el contrario

Introducción

70

el restablecimiento de la vía de IGF-1, por la supresión de Cbl-b, mantenía la masa

muscular (Nakao et al., 2009) (Ver Figura 1.10).

En el músculo esquelético Akt induce la síntesis de proteínas, la transcripción

génica y la proliferación celular, vía mTOR y p70S6K (Apartado 1.5.5.) y, además,

bloquea la apoptosis (Matsui et al., 2003).

Por otro lado, Akt inhibe la degradación de proteínas por impedir la activación

de los factores de transcripción de la familia FoxO (Manning and Cantley, 2007). El

bloqueo de FoxO, mediante la activación de Akt, inhibe la sobreexpresión de las E3

ubiquitin-ligasas MAFbx y MuRF-1 (Lee et al., 2004, Sandri et al., 2004, Stitt et al.,

2004) (Ver Figura 1.10).

La familia FoxO en el músculo esquelético se compone de tres isoformas:

FoxO1, FoxO3 y FoxO4. Akt fosforila proteínas FoxO promoviendo su exportación

desde el núcleo al citoplasma. En distintos modelos de atrofia muscular, la reducción de

la actividad de Akt disminuyó los niveles de FoxO fosforilado en el citoplasma y

provocó un significativo aumento de FoxO en el núcleo (citado en (Calnan and Brunet,

2008)).

Se sabe que la translocación y la actividad de los miembros de FoxO regulan la

sobreexpresión de MAFbx y MuRF-1. Además, FoxO3 es suficiente para promover la

expresión de MAFbx y la atrofia muscular en los músculos esqueléticos in vivo (Sandri

et al., 2004). Así mismo, se ha observado en ratones transgénicos que sobreexpresan

FoxO1 que la masa muscular estaba notablemente reducida, lo que produjo una atrofia

de las fibras musculares (Kamei et al., 2004, Southgate et al., 2007). Por el contrario, la

reducción de la expresión de RNA de FoxO inhibe la expresión de MAFbx durante la

atrofia y la pérdida de masa muscular (Liu et al., 2007, Sandri, 2004).

Por otro lado, se ha demostrado que la ubiquitin-ligasa MuRF-1 puede activarse

por la sobreexpresión del factor de transcripción NF-кB, que se activa por ciertas

citoquinas circulantes con carácter caquéctico, como el TNF-α (Cai et al., 2004, Dogra

et al., 2007, Ladner et al., 2003) (Ver Figura 1.10).

Cai y colaboradores demostraron que la activación de MuRF-1 requiere la

implicación de la vía IKKβ/NF-кB y que es suficiente para inducir la atrofia muscular,

ya que la sobreexpresión de NF-кB en ratones transgénicos, que sobreexpresaban IKKβ,

Introducción

71

provocó un aumento significativo en la expresión de MuRF-1 (Cai et al., 2004). Estos

resultados fueron confirmados por Mourkioti y colaboradores que mediante la supresión

de IKKβ, en ratones knockout, impedían específicamente el aumento de la expresión

muscular de MuRF-1 durante la inducción de atrofia por denervación (Mourkioti et al.,

2006). Estos dos estudios sugieren que la activación de NF-кB está implicada en la

atrofia muscular, induciendo el aumento de la expresión de la ubiquitin-ligasa MuRF-1

en el tejido muscular (Cai et al., 2004, (Mourkioti et al., 2006).

Así mismo, se sabe que la vía de señalización de Akt-FoxO interactúa con el

sistema de IKK-NF-кB durante el desarrollo de la atrofia muscular (Reed et al., 2011).

Ya que IKK puede bloquear la activación de AKT, inhibiendo la síntesis de proteínas e

impidiendo que inhiba la activación de FoxO, que, como hemos visto anteriormente,

activa las E3 ubiquitin-ligasas MAFbx y MuRF-1 (Ver Figura 1.10). Esto fue

comprobado por Mourkioti en sus ratones knockout de IKKβ, en los que además de

observar la prevención de la atrofia muscular descubrió una hiperfosforilación de Akt

(Mourkioti et al., 2006). Otro estudio realizado en dos modelos transgénicos de ratones

knockout de IKKα e IKKβ, observaron que cuando se inhibe cualquiera de las dos

subunidades se altera la fosforilación de Akt (Reed et al., 2011).

Estos resultados ponen de manifiesto la relevancia de la diafonía entre las dos

vías, y que se necesitan más estudios para dilucidar las contribuciones respectivas de las

vías IKK/NF-кB y Akt/FoxO en la atrofia muscular.

Por otra parte, la activación de la ubiquitin-ligasa MAFbx se induce de manera

independiente de la vía de NF-кB (Cai et al., 2004). Sin embargo, MAFbx sí parece

estar regulada por la MAPK p38. Como hemos comentado en el apartado 1.5.5.3,

MAPK p38 es una potente kinasa reguladora del catabalismo muscular durante la

inmovilización muscular. Se ha demostrado que la inducción de la fosforilación de p38,

mediada por estrés oxidativo, aumenta la expresión de MAFbx (Li et al., 2005) (Ver

Figura 1.10). Sin embargo los mecanismos por los cuales se regulan no parecen ser

claros, postulando Li y sus colaboradores que podría ser a través de FoxO. En este

mismo estudio se demuestra que la inhibición de p38 inactiva la expresión de MAFbx,

dejando en manifiesto la relación p38/MAFbx (Li et al., 2005).

Introducción

72

Así mismo, de forma indirecta p38 puede regular la activación de MuRF-1 ya

que puede activar directamente la activación transcripcional de NF-кB forforilando

directamente p65, con su consecuente translocación al núcleo (Ver Figura 1.10).

La activación de NF-кB es dependiente de la actividad de la MAPK p38 durante

la diferenciación miogénica de mioblastos en el músculo esquelético sin la implicación

de IкB (Baeza-Raja and Muñoz-Cánoves, 2004, Ji et al., 2010). Además, se ha

postulado que esta activación de debe a la fosforilación en la Ser 276 de NF-кB por

parte de p38 (Ji et al., 2010).

Figura 1.10. Vías moleculares que modulan la hipertrofia y la atrofia muscular.

Introducción

73

1.7. Atrofia muscular durante la diabetes

La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica crónica, caracterizada por

una deficiencia en la secreción o acción de la insulina, una de las hormonas

responsables de regular la concentración de glucosa en sangre. Por ello, uno de los

síntomas que determina la diabetes es la elevación de la concentración de glucosa

circulante, es decir, la hiperglucemia, lo que origina una intolerancia a la glucosa.

Desde el punto de vista diagnóstico, se considera que un paciente presenta

diabetes si el valor de la glucosa plasmática en ayuno nocturno es mayor de 7.0 mmol/L

(126 mg/dl) y/o cuando presenta concentraciones de glucosa plasmática por encima de

11.0 mmol/L (200 mg/dL) 2 horas después de ingerir 75 g de glucosa en 375 mL de

agua (Diagnosis and Mellitus, 2003, Genuth et al., 2003).

Otros síntomas que presenta la diabetes incluyen polidipsia, polifagia, poliuria,

visión borrosa y caquexia (Citado en (Giovanni Mantovani, 2007)). El retardo de

crecimiento y mayor susceptibilidad a ciertas infecciones puede también acompañar a la

hiperglucemia crónica. Las consecuencias agudas con riesgo vital de una diabetes no

controlada, son hiperglucemia con cetoacidosis o un síndrome hiperosmolar no

cetósico.

La diabetes es la enfermedad endocrina más frecuente y con un alto índice de

prevalencia, siendo una de las primeras causas de morbilidad y mortalidad a nivel

mundial. Esto hace que la diabetes mellitus sea una enfermedad con un gran interés

socioeconómico.

1.7.1. Tipos de diabetes mellitus

Hemos comentado que la diabetes se desarrolla cuando el páncreas presenta una

insuficiencia en la producción de insulina o cuando el organismo es incapaz de

utilizarla. Teniendo en cuenta estas dos posibles causas, podemos distinguir tres tipos

distintos de diabetes: la diabetes tipo 1, la tipo 2 y la diabetes gestacional. La gran

mayoría de las personas con diabetes corresponden a dos categorías etiopatogénicas,

Introducción

74

diabetes tipo 1 o tipo 2; siendo la de tipo 2 la categoría de mayor prevalencia, cuya

causa es la combinación de la resistencia a la acción de la insulina y una respuesta

secretoria compensatoria de insulina inadecuada. En la diabetes tipo 1, en cambio, la

causa es una deficiencia absoluta de secreción de insulina. Finalmente, la diabetes

gestacional comienza o se detecta durante el embarazo y puede derivar en diabetes tipo

2.

1.7.1.1. Diabetes tipo 1:

La diabetes tipo 1 resulta de la destrucción autoinmune del 90% de las células β,

productoras de insulina, de los islotes de Langerhans en el páncreas (Alberti and

Zimmet, 1998). Por lo que estas células no producen insulina o lo hacen en cantidad

insuficiente, provocando una insuficiencia absoluta de insulina. Una vez iniciado el

proceso de destrucción no puede detenerse, además, las personas que no tienen diabetes

poseen un mecanismo de anti-apoptosis y regeneración de células β que en las personas

diabéticas está inactivo.

La insulina es una hormona anabólica y anticatabólica, por lo que su deficiencia

induce un menor consumo periférico de glucosa, un estado de excesiva gluconeogénesis

renal y hepática, un incremento de la proteólisis en el músculo y de la lipolisis. Para las

personas con diabetes tipo 1 la insulina es vital para evitar la cetoacidosis, derivada del

aumento de la lipólisis a partir de ácidos grasos libres, el coma o la muerte, debiendo

administrarse insulina diariamente, con el fin de controlar los niveles de glucosa en

sangre.

La enfermedad puede desencadenarse a cualquier edad, siendo más incidente en

niños o adolescentes (Fajans and Bell, 2011, Onkamo et al., 1999, Patterson et al.,

2009), cuya prevalencia va en aumento, mientras que en edades adultas aumenta más

lentamente, se mantiene o disminuye según los estudios analizados (Feltbower et al.,

2003, Harjutsalo et al., 2008). Entre las causas que pueden desencadenar la diabetes tipo

1 encontramos la predisposición genética, que suele ser la base sobre la que actúan otros

factores como los ambientales (Ma and Chan, 2009) (anticuerpos virales, hábitos

alimentarios, como la deficiencia de la vitamina D (Grant, 2008), la obesidad infantil

(Fourlanos et al., 2008), la exposición temprana a proteínas de la leche de vaca (Cavallo

et al., 1996), el estrés, crecimiento acelerado en la pubertad, exposición limitada a

Introducción

75

microorganismos en la infancia (Wills-Karp et al., 2001) y la contaminación)

desencadenando, finalmente, una respuesta inmunitaria en las células β.

1.7.1.2. Diabetes tipo 2

La diabetes tipo 2 se caracteriza por resistencia a la acción de la insulina y una

deficiencia relativa de la insulina, pudiendo ser cualquiera de las dos la característica

predominante (Alberti and Zimmet, 1998)

La resistencia a la insulina significa que para mantener los valores normales de

glucemia es necesaria una secreción incrementada de insulina para intentar

compensarla, ya que puede ser debida a una disfunción de los receptores de la insulina.

A pesar de que, últimamente, se diagnostica más frecuentemente en edades

tempranas (niños y adolescentes), la diabetes mellitus tipo 2 se desarrolla más

lentamente y, principalmente, en adultos y ancianos, pudiendo ser tratada inicialmente

con dieta y antidiabéticos orales (Fajans and Bell, 2011).

El factor exógeno más importante en la diabetes tipo 2 es, a menudo, el resultado

del exceso de peso corporal y la inactividad física en personas genéticamente

predispuestas (Poulsen et al., 1999). Los individuos con este tipo de diabetes no

necesitan insulina exógena, ya que el tratamiento de los pacientes va dirigido a la

reducción de peso mediante dieta, seguido de tratamiento con antidiabéticos, sólo en

caso de no conseguir controlar la hiperglucemia sería necesaria el uso de insulina.

1.7.1.3. Diabetes gestacional

La diabetes mellitus gestacional es una intolerancia a la glucosa que comienza o

se detecta durante el embarazo y puede persistir tras el mismo. Se produce por el efecto

contrainsular del lactógeno placentario, hormona que incrementa la resistencia a la

insulina. Suele producirse en mujeres susceptibles por factores genéticos latentes o

exógenos (antecedentes de diabetes mellitus 2 en la familia, obesidad abdominal,

síndrome de ovario poliquístico o mayor edad gestacional).

Introducción

76

1.7.2. Modelo experimental en la diabetes: inducción química por

estreptozotocina

Existen distintos modelos experimentales que permiten investigar los

mecanismos moleculares implicados en las complicaciones diabéticas. Entre ellos

encontramos el uso de animales que padecen diabetes de forma espontánea,

modificaciones genéticas, la cirugía, ya en 1889, Von Mering y Minkowski indujeron

diabetes experimental en perros mediante la extirpación quirúrgica del páncreas (Von

Mering JV, 1889), el uso de virus o productos químicos.

El uso de agentes químicos para producir diabetes, permite realizar estudios

detallados de los eventos bioquímicos y morfológicos que ocurren durante y después de

la inducción de un estado diabético. Existen varias clases de agentes químicos. Un

primer grupo son sustancias con citotoxicidad específica que destruyen a las células β

del páncreas y causan un estado de deficiencia primaria de insulina. Seguidamente,

tenemos los agentes que actúan sobre las células β pero no las destruyen y un tercer

grupo que incrementa los requerimientos endógenos de insulina, debilitan al páncreas y

como consecuencia se produce la diabetes. Los agentes más utilizados son la aloxano y

la estreptozotocina. Estos compuestos en dosis diabetogénicas actúan específicamente

sobre las células β (Kadota, 1950).

La estreptozotocina (STZ) (2-deoxy-2-[3-(methyl1-3-nitrosoureido)-D-

glucopiranosa] es una sustancia relativamente selectiva para las células β que, en ciertas

especies, causa diabetes permanentemente. La fijación a la membrana, a semejanza con

la aloxano, es el primer evento en el proceso patológico. Algunas evidencias indican

que la toxicidad de la estreptozotocina esta medida por el reconocimiento específico de

algunos receptores sobre la célula β (Rakieten et al., 1963). Se cree que provoca un

descenso en los niveles del dinucleótido de nicotinamida y NAD, ya que puede

disminuir tanto su síntesis como incrementar su hidrólisis y su función es proteger a los

animales contra la citotoxicidad provocada, en este caso, por la STZ.

La STZ (se sintetiza por el Streptomycetes achromogenes), y se utiliza para

inducir la diabetes mellitus tipo 1 (insulino-dependiente-IDDM) como la tipo 2 (no

insulinodependiente, NIDDM), según el momento de la inyección, la dosis empleada o

su frecuencia de inyección. Una dosis intravenosa de STZ (de 49 a 60 mg/kg) en ratas

Introducción

77

adultas puede inducir diabetes tipo 1 (Ganda et al., 1976), pero es posible utilizar dosis

mayores. La STZ también puede administrarse por vía intraperitoneal en una dosis

similar o mayor cuando se inyectan 50 mg/kg de STZ por vía intravenosa en ratas, 2

semanas después, la glucosa sanguínea alcanza valores de 15 mmol/L, pudiendo

considerar entonces, que la rata presenta diabetes. La STZ altera primero la oxidación

de la glucosa para ser captada por las células, para después disminuir la biosíntesis y

secreción de insulina. Las células β del páncreas captan la STZ a través del

transportador de glucosa GLUT2, por lo que, cuando se reduce la expresión de este

transportador, se previene la acción diabetogénica de la STZ. Este fármaco ocasiona

cambios intracelulares en las células beta, fragmentación y alcalinización del DNA e

incluso puede producir la muerte (Elsner et al., 2000).

A pesar de que la administración de estreptozotocina causa en el animal de

experimentación un estado similar al visto en pacientes con diabetes tipo 1

(hiperglucemia, polidipsia, polifagia, poliuria, así como la mayoría de las

complicaciones asociadas a la diabetes como son las cardiomiopatías, neuropatías,

disfunciones coronarias, alteraciones hepáticas, traqueales, del tejido conectivo, etc.), al

igual que otros modelos, los efectos nunca serán exactamente al iguales a los de la

enfermedad humana. Además, en algunos animales la hiperglucemia puede revertir

espontáneamente al cabo de unas semanas.

1.7.3. Estrés oxidativo y su papel en las complicaciones asociadas a la

diabetes

Con el tiempo, la diabetes puede aumentar el riesgo de problemas relacionados

con la salud como retinopatía, fallo renal, neuropatía, amputación de miembros

inferiores, neuropatía diabética que causa síntomas gastrointestinales, genitourinarios y

cardiovasculares (DeCoster, 2001). Aunque la diabetes no se puede curar, la

enfermedad puede ser controlada por las estrategias no farmacológicas y

farmacológicas, donde las mejoras en el control glucémico son factores importantes en

el retraso de la aparición y progresión de las complicaciones relacionadas con la

diabetes (DCCT-Research-Group, 1993, UKPDS-Group., 1998). Además, la

hipertensión y las alteraciones en el metabolismo lipoproteico son hallazgos frecuentes

en las personas con diabetes.

Introducción

78

El estrés oxidativo contribuye al desarrollo y progresión de la diabetes y sus

complicaciones (Ceriello, 2000, Baynes, 1991). Ya que la diabetes suele ir acompañada

de un deterioro en las defensas antioxidantes (Halliwell and Gutteridge, 1990a,

McLennan et al., 1991) y una mayor producción de radicales libres (Baynes and Thorpe,

1999, Young et al., 1995). Estos niveles excesivamente altos de radicales libres son los

que producen daño a las proteínas celulares, lípidos de membrana y ácidos nucleicos, y,

finalmente, la muerte celular.

Se han estudiado distintos mecanismos para explicar la formación de estas ERO.

Estos mecanismos incluyen la oxidación de la glucosa, la glicación no enzimática de

proteínas y la degradación oxidativa posterior de las proteínas glicosiladas, alteraciones

de la vía del sorbitol, alteraciones de los sistemas antioxidantes, daño tisular producido

por procesos de isquemia reperfusión, procesos inflamatorios y alteraciones del

metabolismo. Baynes y colaboradores en 1991 postularon que el estrés oxidativo es el

nexo de unión de todas las vías propuestas en la patogénesis de las complicaciones de la

diabetes (Baynes, 1991).

Sin embargo, existen algunos autores que implican a los radicales libres no tan

sólo en las complicaciones del diabético, sino también en la misma etiología de la

diabetes (Wolff, 1993). Esto se extrae a partir del estudio de varios fármacos inductores

de diabetes en animales de experimentación, como la estreptozotocina y el aloxano, que

destruyen selectivamente los islotes de Langerhans pancreáticos por un mecanismo

oxidante, y su acción puede ser inhibida por la administración de antioxidantes (ver

apartado 1.8.2) (Wolff, 1993, Oberley, 1988).

1.7.4. Complicaciones músculoesqueléticas en la Diabetes Mellitus

La insulina una de las principales hormonas anabólicas y anticatabólicas en el

ser humano. Los principales efectos metabólicos de la insulina afectan al músculo, al

tejido adiposo y al hígado (Zierath et al., 2000)

En el músculo esquelético, la insulina estimula la captación de glucosa, que se

dirige hacia la síntesis de glucógeno. La insulina también facilita la captación

transcelular de ácidos grasos no esterificados en el músculo esquelético, en el hígado y

en el tejido adiposo, estimulando la síntesis de triglicéridos en estos tejidos. Además, la

insulina estimula la captación y el transporte de aminoácidos en el músculo y su

Introducción

79

incorporación a proteínas (síntesis proteica). Por lo que, al existir en la diabetes una

falta de esta hormona en pacientes con diabetes mellitus, disminuye la síntesis de

proteínas y la protección frente al catabolismo de las mismas.

Como comentamos en el apartado de atrofia muscular (ver punto 1.4), la

diabetes mellitus es una de las diversas patologías en las que se produce pérdida de

masa muscular. Estas complicaciones músculoesqueléticas suelen ser más frecuentes en

pacientes con diabetes tipo 1, pero también se observan en pacientes con diabetes tipo 2.

Al igual que en el modelo de inmovilización, la atrofia muscular en la diabetes

se caracteriza por un aumento en la degradación de proteínas musculares y una

disminución en la producción de las mismas (Smith et al., 1989).

Esto ha sido confirmado en estudios en los que la inducción de diabetes,

mediante la administración de estreptozotocina a animales de experimentación, produce

una disminución en el tamaño de los músculos en comparación con los de las ratas del

grupo control, a las que se les inyectaba una sustancia vehículo (Price et al., 1996).

Posteriormente, se confirmó que los músculos gastrocnemios de las ratas

insulinodependientes mostraron una pérdida, significativa, del 20% de su peso,

producida por una mayor tasa global en la degradación de proteínas (+40%) comparado

con los animales del grupo control, sin que hubiesen diferencias en la ingesta

alimentaria (Lecker et al., 2004).

Además, se sabe que esta pérdida de masa muscular no es específica para ningún

tipo de fibra, debido a que tanto el músculo extensor largo de los dedos (EDL) y el

sóleo (músculos de fibras de tipo I), como el gastrocnemio (compuesto

mayoritariamente de fibras tipo II) disminuyen en tamaño en ratas diabéticas. Sin

embargo, sí se observó un menor contenido de proteínas musculares (normalizado con

el contenido de DNA) en los EDL y el sóleo de las ratas diabéticas en comparación con

los valores del grupo control (Price et al., 1996).

En un estudio clínico realizado con 2675 pacientes entre 70 y 79 años, se

comparó la pérdida de masa grasa y muscular entre aquellos pacientes que presentaban

una diabetes tipo 2 respecto a los no diabéticos. Para ello se midió el CSA del muslo

mediante tomografía computarizada al inicio del estudio y a los 6 años. Los resultados

Introducción

80

mostraron que la pérdida de masa muscular era dos veces mayor en las mujeres mayores

con diabetes frente a las no diabéticas. Estos resultados siguieron siendo significativos

después de realizar los pertinentes ajustes según la edad, sexo, raza, el índice de masa

corporal basal, el cambio de peso intencionado y el cambio de peso con el tiempo. Por

otro lado, se observó que la masa grasa aumento en ambos grupos (Park et al., 2009).

Otro estudio calculó la pérdida de masa muscular en referencia al índice de

músculo esquelético (relación de la masa muscular esquelética estimada al peso

corporal total expresada como un porcentaje) y el índice de masa muscular (la relación

de la masa del músculo esquelético al cuadrado de la altura del cuerpo en kilogramos

por metro cuadrado). Este estudio, realizado en pacientes diabéticos tipo 1 y tipo 2,

indistintamente, demostró que ambos índices disminuían considerablemente con el

desarrollo de la diabetes, además, se evidenció que la pérdida de masa muscular estaba

directamente asociada con el desarrollo de resistencia a la insulina y que la protección

frente al desarrollo de la resistencia a la insulina aumentaba la masa muscular, incluso

por encima de los niveles medios (Srikanthan and Karlamangla, 2011).

Otros estudios han ido más allá y han demostrado que en varones jóvenes

diagnosticados con diabetes tipo 1 existe una reducción de tamaño de la fibra muscular,

antes de recibir tratamiento con insulina (Jakobsen and Reske-Nielsen, 1986). Además,

otro grupo de pacientes, diagnosticados en una fase temprana de la diabetes, hallaron

una atrofia en las fibras musculares, producida por la interrupción de las líneas Z, así

como, otras anormalidades morfológicas en la mitocondria (Reske-Nielsen et al., 1977).

Tal y como vimos en la atrofia muscular por inmovilización, la pérdida de masa

muscular en la diabetes, también, va acompañada con una pérdida en la capacidad de

generación de fuerza muscular. Park midió en personas mayores, entre 70 y 79 años,

con o sin diabetes tipo 2 o sin patología, la fuerza de presión o agarre del tren superior

mediante un dinamómetro isométrico y la fuerza de los músculos extensores de la

rodilla con un dinamómetro isocinético. Sus resultados muestran que los hombres con

diabetes tipo 2 diagnosticada tenían menor fuerza muscular en comparación con los no

diabéticos (Park et al., 2006, Park et al., 2007).

Introducción

81

Estos estudios coinciden con otros realizados en pacientes con diabetes tipo 1, en

los que se observaron que tenían una disminución del 21 % en la fuerza de los músculos

dorsales y flexores plantares del tobillo, así mismo, encontraron una disminución del

16% en los extensores de la rodilla y un 17% en los extensores de la misma. En cuanto a

la fuerza en la musculatura flexo-extensora de la muñeca no encontraron diferencias

(Andersen et al., 1997, Andersen et al., 1996).

1.7.5. Mecanismos moleculares implicados en la atrofia muscular en la

diabetes mellitus

Los efectos de la diabetes tipo 1 en el metabolismo de proteínas parecen estar

claros, en donde la privación de la insulina provoca un profundo incremento en el

catabolismo, especialmente en el músculo esquelético (Karakelides et al., 2007),

producido por la falta de la hormona que impide la captación y el transporte de

aminoácidos en el músculo y su incorporación a proteínas (síntesis proteica) (Charlton

and Nair, 1998). Sin embargo los mecanismos en la diabetes tipo 2 no parecen estar tan

claros (Denne et al., 1995, Pereira et al., 2008).

Ya hemos descrito anteriormente (ver apartado 1.5.4) que el sistema ubiquitin-

proteasoma es uno de los mecanismos más importantes en la regulación de la

degradación de proteínas. Así mismo, se ha demostrado que la insulina e IGF-1 son

claves para las vías de síntesis de proteínas, por la activación de la cascada IGF/Akt., así

como, por reducir la actividad del proteasoma, por inhibición de la expresión de las

ubiquitin-ligasas (Tisdale, 2005). Ya que, como veremos a continuación la degradación

de proteínas musculares en la diabetes es debida, en parte, por el aumento de la

actividad del proteasoma (Merforth et al., 1999). Así mismo, se ha observado que IGF-1

inhibe la activación de NF-кB inducida por TNF-α, mecanismo por el cual podría

atenuar la activación de la vía ubiquitin-proteasoma (Vallée et al., 2003).

Por otro lado, la hiperglucemia está asociada con niveles elevados de factores

proinflamatorios, citoquinas, el aumento de la producción de radicales libres, y por lo

general un estado inflamatorio crónico en pacientes diabéticos (citado en (Engström et

al., 2003), por lo que la degradación de proteínas musculares en la diabetes podría estar

regulada por estas distintas vías moleculares.

Introducción

82

Como hemos visto, se ha sugerido al estrés oxidativo como un regulador clave

de la señalización celular que conduce a un aumento de la proteolisis y la atrofia

muscular. Aunque se sabe que el estrés oxidativo juega un papel importante en la

patología y complicaciones de la diabetes (Atalay M., 2002, Kennedy and Lyons, 1997)

y que, además, está implicado en pérdida de masa muscular en distintas situaciones de

atrofia (ver apartado 1.5.3), los conocimientos actuales sobre el papel del estrés

oxidativo a perder el músculo esquelético en la diabetes es muy limitado.

La hiperglucemia provoca un desequilibrio prooxidante / antioxidante, ya que

induce un descenso de los niveles de antioxidantes frente a un aumento de los radicales

libres. En lo que se refiere al metabolismo del músculo esquelético, se ha demostrado

que el estrés oxidativo afecta a la expresión de los genes implicados en la síntesis de

proteínas (Li et al., 1998) y que los radicales libres, como H2O2, in vitro inhiben la

expresión de proteínas musculares en la miogénesis (Zhou et al., 2001). Por otra parte,

se ha observado que la administración de antioxidantes evitan la pérdida de miosina en

el músculo esquelético (Zhou et al., 2001).

En ratas con diabetes tipo 1 inducida por STZ observaron en el músculo

gastrocnemio un aumento de los compuestos prooxidantes, como el GSSG, frente a una

reducción de los antioxidantes como el GSH y la superóxido dismutasa (Brocca et al.,

2008). Además, se ha demostrado que los radicales libres, como el H2O2, afectan a la

expresión de genes sensibles a procesos redox implicados en la diferenciación

miogénica (Guttridge et al., 1999) en cultivo celular en ratas diabéticas (Aragno et al.,

2004) producido por una concomitante disminución en los genes asociados con el

crecimiento muscular (Jund, MyoD, miogenina, MCK, MhcIIB, MLC1-3) (Aragno et

al., 2004).

Russell demostró, en otro estudio, que la hiperglucemia puede causar la

degradación de proteínas y suprimir la síntesis de proteínas en miotubos in vitro por la

activación de las caspasas -3/-8 y la fosforilación de p38. (Russell et al., 2009). La

relación entre la diabetes, el aumento de la fosforilación de p38 y la degradación de

proteínas en el músculo esquelético se observó posteriormente en pacientes diabéticos

tipo 2 (Koistinen et al., 2003).

Introducción

83

Por otro lado, se sabe que la activación de la vía MAPK p38, inducida por la

resistencia a la insulina, está asociada con la inflamación y el aumento de los niveles de

citoquinas inflamatorias tales como el TNF-α (de Alvaro, 2004, Lim et al., 2006).

En concreto, la inflamación inducida por la hiperglucemia parece requerir la

activación NF-кB (Frost and Lang, 2008, Hunter RB, 2002), cuya vía canónica de

activación implica TNF-α (ver apartado 1.6.1), por lo que se ha postulado que la

producción de ERO es el mecanismo mediante el cual TNF-α podría dañar los músculos

esqueléticos y regular la expresión génica a través de la activación de factores de

transcripción redox-sensibles como el NF-кB (Reid and Li, 2001a).

Se ha observado el aumento de la activación de NF-кB en la patología de la

diabetes en diversos tejidos tales como el endotelial, el endotelio de la retina y las

células β pancreáticas cuando se exponen a condiciones hiperglucémicas (Melloul,

2008, Ortis et al., 2008, Yerneni et al., 1999). El primer estudio que caracterizó la

activación de NF-кB inducido por la diabetes y la composición de las proteínas

musculares se realizó en ratas (Frier et al., 2008). Frier asoció la atrofia del músculo

esquelético en la diabetes inducida por STZ con atrofia del músculo esquelético, ya que

las ratas tratadas con STZ mostraron mayor contenido de NF-кBp65 en el músculo

esquelético y una en concomitante reducción de la masa muscular (Frier et al., 2008).

Recientemente, Kelleher y colaboradores observaron que la STZ incrementó el

contenido de p65 de una manera específica de músculo, pero que este aumento no está

asociado con la fosforilación de IKK ni la degradación IкB, demostrando que NF-кB

p65 podía ser activado por otra vía no clásica en la diabetes mellitus (Kelleher et al.,

2010).

Así mismo, el sistema ubiquitin-proteasoma parece estar notablemente

influenciado por el estrés oxidativo (Fernandes et al., 2008, Zhang et al., 2008), ya que,

tanto el estrés oxidativo como NF-кB, contribuyen a la miopatía diabética por la

regulación positiva de las ubiquitin-ligasas MAFbx y MuRF-1, en ratas diabéticas por

STZ (Marfella et al., 2006).

Introducción

84

Finalmente, visto que la pérdida de la masa muscular en la diabetes implicada, el

estrés oxidativo y la activación de las vías de IGF/Akt, TNF-α/NF-кB y p38. No es de

extrañar, por su relación ya descrita (ver figura 1.10, apartado 1.6.3), que el sistema

ubiquitin proteasoma tenga un rol importante en la atrofia muscular en la patología de la

diabetes, lo cual fue demostrado por Marfella y sus colaboradores al observar que en la

diabetes tanto el estrés oxidativo como NF-кB regulan por medio de las E3 ubiquitin-

ligasas la hipertrofia y la atrofia muscular, modulando su masa (Marfella et al., 2006).

OBJETIVOS/AIMS

Objetivos

87

El OBJETIVO GENERAL de esta tesis doctoral es estudiar los mecanismos

moleculares implicados en la pérdida de masa muscular tras un modelo de suspensión

de miembros posteriores en roedores, y su posible prevención con tratamientos

farmacológicos tales como la indometacina y el alopurinol.

Los OBJETIVOS CONCRETOS son:

1. Estudiar el papel de los radicales libres derivados de la XO, así como de la

inflamación, en la pérdida de masa muscular tras un protocolo de suspensión

de miembros posteriores. Para ello trataremos con alopurinol, indometacina o

alopurinol junto con indometacina a roedores sometidos a un protocolo de

suspensión.

2. Estudiar el efecto de la suspensión de miembros posteriores y de los distintos

tratamientos propuestos sobre la masa muscular, el área de sección transversal

y los cambios histológicos y morfológicos en las fibras musculares.

3. Estudiar la implicación de la vía de señalización sensible a estrés oxidativo

(p38 MAPKinasa-MAFbx) e inflamatoria (NF-кB-MuRF1-MHCI) en la

pérdida de masa muscular inducida por suspensión de miembros posteriores,

así como el efecto de los distintos tipos de tratamientos propuestos.

4. Estudiar la implicación de Akt y Cbl-b en la pérdida de masa muscular

inducida por suspensión de miembros posteriores así como el efecto de los

distintos tipos de tratamientos propuestos.

5. Estudiar el efecto de la deleción específica de IKKα, en músculo esquelético,

en la pérdida de masa muscular inducida por suspensión de miembros

posteriores en ratones.

Objetivos

88

Respecto a los experimentos realizados durante mi estancia predoctoral, el

OBJETIVO GENERAL de dicho estudio fue determinar los mecanismos moleculares

implicados en la pérdida de masa muscular en la diabetes experimental inducida con

estreptozotocina y su posible prevención con la administración de α-galacto-

oligosacaridos.

Los OBJETIVOS CONCRETOS fueron:

6. Estudiar el papel del estrés oxidativo asociado a la diabetes experimental

inducida con estreptozotocina sobre la masa músculo-esquelética en ratas.

7. Estudiar el papel de p38 y de NF-кB en la pérdida de masa muscular en un

modelo de diabetes experimental.

8. Estudiar el efecto de la administración de α-galacto-oligosacáridos en la

prevención de la atrofia muscular en dicho modelo.

Aims

89

The OVERALL AIM of this doctoral thesis is to study the molecular

mechanisms involved in the loss of muscle mass induced by hindlimb unloading and its

possible prevention with drug treatments.

The SPECIFIC AIMS are:

1. To study the role of free radicals derived from XO, as well as the

inflammation in the loss of muscle mass after a hindlimb unloading protocol.

In order to do this we will administrer allopurinol, indomethacin or

allopurinol plus indomethacin to rodents subjected to a hindlimb unloading

protocol.

2. To study the effect of hindlimb unloading and the proposed treatments on

muscle mass, cross-sectional area, and the histological and morphological

changes in muscle fibers.

3. To study the involvement of the p38 MAPKinase-MAFbx signaling pathway,

which is sensitive to oxidative stress, and the inflammatory NF-кB-MuRF1-

MHCI pathway in unloading-induced loss of muscle mass as well as the

effect of the different proposed treatments.

4. To study the involvement of Akt and Cbl-b in muscle mass loss induced by

hindlimb unloading, as well as the effect of the different proposed treatments.

5. To study the effect of the specific deletion of IKKα in skeletal muscle in

muscle wasting induced in hindlimb unloaded mice

Aims

90

Regarding the work during my predoctoral stay, the GENERAL AIM of our

study was to determine the molecular mechanisms involved in muscle wasting in

streptozotocin-induced experimental diabetes and its possible prevention by α-galacto-

oligosaccharides administration.

The SPECIFIC AIMS were:

6. To study the role of oxidative stress associated with experimental

streptozotocin-induced diabetes on skeletal muscle mass in rats.

7. To study the role of p38 and NF-кB in the loss of muscle mass in a model of

experimental diabetes.

8. To study the effect of the administration of α-galacto-oligosaccharides in the

prevention of muscle atrophy in this model.

MATERIALES

Y

MÉTODOS

Materiales y Métodos

93

3.1. MATERIALES

3.1.1. Animales de experimentación

Todos los protocolos experimentales realizados en las Facultades de Farmacia y

Medicina de la Universidad de Valencia, que describimos en este apartado, fueron

realizados de acuerdo con lo establecido en el Real Decreto 1201/2005, de 10 de

octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines

científicos (BOE 21 de octubre de 2005). El Comité de Ética en Investigación de la

Universidad de Valencia aprobó el procedimiento experimental llevado a cabo en la

presente tesis doctoral.

Así mismo, los protocolos experimentales realizados en el "Laboratoire

Mouvement, Sport, Santé" de la Universidad Rennes 2, Francia, fueron realizados de

acuerdo con lo establecido en el decreto 2001-486, de 6 de junio 2001, sobre protección

de los animales utilizados para experimentaciones científicas (BOE 6 de junio 2001). El

Comité Rennais de Ética para la experimentación animal aprobó el procedimiento

experimental llevado a cabo en la presente tesis doctoral.


94

3.1.1.1. Ratas Wistar macho

En el primer estudio que se realizó en la presente tesis doctoral se utilizaron

ratas de 3 meses de edad y de 340 ±40 g de peso. Los animales se mantuvieron en el

animalario de la Facultad de Farmacia, bajo condiciones constantes de temperatura (23

± 1ºC), humedad relativa (60%) y ciclos de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y

la comida fue siempre libre, siendo la dieta pienso estándar comercializado por

PANLAB S.L. cuyo valor calórico es de 3100 kcal/Kg.

a) Estudio nº1: Efecto de 14 días de suspensión en ratas Wistar macho.

Efecto del tratamiento con alopurinol

Los animales fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos experimentales

(Ver Tabla 3.1).

Grupo control.

Grupo control tratado con alopurinol. El alopurinol fue suministrado durante

14 días por vía oral, disuelto en el agua que bebían los animales, a una dosis

de 50 mg/kg de peso/día.

Grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no invasivo de

Morey-Holton y Globus (2002).

Grupo suspendido (Morey-Holton and Globus, 2002) tratado con alopurinol.

La suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el tratamiento con

alopurinol (dosis de 50 mg/kg de peso/día).

A los animales se les controló diariamente la ingesta de agua, ajustando la

concentración de alopurinol a la cantidad de agua que consumían.

Control Agua 9

Control Alopurinol 9

Suspendido Agua 7

Suspendido Alopurinol 7

Tabla 3.1. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión en ratas Wistar.

Número de animales por grupo.


95

b) Sacrificio de los animales. Extracción y conservación de muestras

Transcurridos los 14 días de suspensión de los miembros posteriores, los

animales fueron anestesiados con una inyección de Pentobarbital sódico (50 mg/kg de

peso). Posteriormente se procedió a la apertura de la cavidad abdominal accediéndose a

la vena cava inferior mediante una jeringa de 5 mL, para obtener la sangre.

Parte de la sangre se depositó en un tubo seco a temperatura ambiente,

transcurridos aproximadamente 30 minutos (necesarios para que se active la formación

de un coágulo) se centrifugó a 2000x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El

resto de la sangre se depositó en tubos con heparina o ácido etilendiaminotetraacético

(EDTA), seguidamente se centrifugaron a temperatura ambiente a 1500x rpm, durante

15 minutos. El suero y el plasma se recogieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC

para posteriormente realizar la medición fluorimétrica de la XO, el análisis de MDA por

HPLC y estrés oxidativo por Western Blotting.

Los tejidos recogidos fueron:

Músculo sóleo.

Músculo gastrocnemio.

Músculo tibial anterior.

Músculo Extensor largo de los dedos (EDL).

Todos ellos, una vez recogidos fueron pesados, colocados en un tubo Eppendorf

y sumergidos en nitrógeno líquido, posteriormente se conservaron a una temperatura de

-80°C.

En el caso de los sóleos, el derecho se dividió en dos porciones, la primera

porción se destinó a medir en extracto citosólico la fosforilación de la MAP Kinasa p38,

la vía de NF-кB y estrés oxidativo mediante Western Blotting, y en extracto nuclear la

activación y expresión de NF-кBp65 mediante kit ELISA y Western Blotting

respectivamente; la segunda porción se depositó con trizol para medir RNA mensajero

(mRNA). En cuanto al sóleo de la pata izquierda, se fijó en formol al 4% para realizar

los estudios histológicos.


96

3.1.1.2. Ratones wild-type y muscle IKKα knockout hembra y

macho

El segundo estudio fue realizado con animales hembras y machos de 3 meses de

edad: 18 wild-type (WT) y 26 ratones que carecen de IKKα en el músculo esquelético

(mIKKα KO) de 21 ± 2.5 g de peso las hembras y 29 ± 2.5 g los machos. Los ratones se

recibieron desde el laboratorio de la Dra. Melek Canan Arkan de la Technical

University of Munich.

Tras estabularlos se mantuvieron en el animalario de la Facultad de Medicina,

bajo condiciones constantes de temperatura (23 ± 1ºC), humedad relativa (60%) y ciclos

de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y la comida fue siempre libre, siendo la

dieta pienso estándar comercializado por PANLAB S.L. cuyo valor calórico es de 3100

kcal/Kg.

a) Estudio Nº 2: Efecto de 14 días de suspensión en ratones WT y

mIKKα KO

Los animales, de cada grupo, fueron divididos aleatoriamente en dos grupos

experimentales (Ver Tabla 3.2).

Hembras WT grupo control.

Hembras mIKKα KO grupo control.

Hembras WT grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no

invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).

Hembras mIKKα KO grupo suspendido durante 14 días siguiendo el

protocolo no invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).

Machos WT grupo control.

Machos mIKKα KO grupo control.

Machos WT grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no

invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).

Machos mIKKα KO grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo

no invasivo de Morey-Holton y Globus (2002).


97

Hembras WT grupo control 5

Hembras mIKKα KO grupo control 5

Hembras WT grupo suspendido 7

Hembras mIKKα KO grupo suspendido 7

Machos WT grupo control 4

Machos mIKKα KO grupo control 4

Machos WT grupo suspendido 6

Machos mIKKα KO grupo suspendido 6

Tabla 3.2. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión en ratones mIKKα KO.


b) Sacrificio de los animales. Extracción y conservación de muestras


animales fueron anestesiados con un vaporizador de isoflurano. Posteriormente se

procedió a la apertura de la cavidad abdominal accediéndose a la vena cava inferior

mediante una jeringa de 2.5 mL para obtener la sangre.

Parte de la sangre se depositó en tubos de Heparina y EDTA. Posteriormente se

centrifugaron a temperatura ambiente a 1500x rpm, durante 15 minutos. El plasma se

recogió en alícuotas y fue almacenado a -20ºC para posteriormente realizar el análisis de

MDA por HPLC y estrés oxidativo por Western Blotting.



Músculo sóleo.

Los órganos recogidos fueron:

Corazón.

Pulmones.

Hígado.

Riñones.

Cerebro (hipocampo, cerebelo, corteza).


98



-80°C.

En el caso de los sóleos, el derecho se destinó a medir mRNA. En cuanto al

sóleo de la pata izquierda, se depositó en formol al 4% para realizar los estudios

histológicos.

Los gastrocnemios se destinaron a medir en extracto citosólico la fosforilación

de la MAP Kinasa p38, la vía de NF-KappaB y el estrés oxidativo mediante Western

Blotting.

3.1.1.3. Ratones wild-type C57BL/6J macho

El tercer estudio fue realizado con animales de 3 meses de edad y de alrededor

de 31 ± 4 g de peso. Los ratones se mantuvieron en el animalario de la Facultad de

Medicina, bajo condiciones constantes de temperatura (23 ± 1ºC), humedad relativa

(60%) y ciclos de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y la comida fue siempre

libre, siendo la dieta pienso estándar comercializado por PANLAB S.L. cuyo valor

calórico es de 3100 kcal/Kg.

a) Estudio Nº3: Efecto de 14 días de suspensión en ratones C57BL/6J

macho. Efecto del tratamiento con alopurinol e indometacina

Los animales fueron divididos aleatoriamente en ocho grupos experimentales

(Ver Tabla 3.3).

Grupo control.

Grupo control tratado con indometacina. La indometacina fue administrada

durante 14 días por vía oral, disuelta en el agua que bebían los animales a una

dosis de 0.6 mg/kg de peso/día.

Grupo control tratado con alopurinol. El alopurinol fue suministrado durante

14 días por vía oral, disuelto en el agua que bebían los animales, a una dosis

de 50 mg/kg de peso/día.

Grupo control tratado con indometacina y alopurinol, a dosis idénticas que los

grupos anteriores.




99

Grupo suspendido durante 14 días siguiendo el protocolo no invasivo de

Morey-Holton y Globus (2002).

Grupo suspendido (Morey-Holton y Globus, 2002), tratado con indometacina.

La suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el tratamiento con

indometacina (0.6 mg/kg de peso/día).

Grupo suspendido (Morey-Holton y Globus, 2002), tratado con alopurinol. La

suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el tratamiento con

alopurinol (dosis de 50 mg/kg de peso/día).

Grupo suspendido (Morey-Holton y Globus, 2002), tratado con alopurinol e

indometacina. La suspensión tuvo una duración de 14 días al igual que el

tratamiento con indometacina y alopurinol (dosis idénticas que los grupos

anteriores).

A los animales se les controló diariamente la ingesta de agua, ajustando la

concentración de alopurinol e indometacina a la cantidad de agua que consumían.

Control Agua 12

Control Indometacina 12

Control Alopurinol 12

Control Indometacina + Alopurinol 12

Suspendido Agua 12

Suspendido Indometacina 12

Suspendido Alopurinol 12

Suspendido Indometacina + Alopurinol 12

Tabla 3.3. Diseño del estudio sobre el efecto de la suspensión en ratones C57BL/6J.

Número de animales por grupo

b) Sacrificio de los animales, extracción y conservación de muestras


animales fueron anestesiados con un vaporizador de isoflurano. Posteriormente se



100

procedió a la apertura de la cavidad abdominal accediéndose a la vena cava inferior

mediante una jeringa de 2.5 mL para obtener la sangre.

Parte de la sangre se depositó en tubos de Heparina y EDTA. Posteriormente se

centrifugaron a temperatura ambiente a 1500x rpm, durante 15 minutos. El plasma se

recogió en alícuotas y fue almacenado a -20ºC para, posteriormente, realizar la

medición fluorimétrica de la XO, el análisis de MDA por HPLC, la medición

espectrofotométrica de parámetros inflamatorios (kit ELISA) y estrés oxidativo por

Western Blotting.


Músculo sóleo.


Los órganos recogidos fueron:

Corazón.

Pulmones.

Hígado.

Riñones.

Cerebro (hipocampo, cerebelo, corteza).



-80°C.

Siete animales de cada grupo se destinaron para medir el mRNA en el sóleo

derecho, mientras que el de la pata izquierda se depositó en formol al 4% para realizar

los estudios histológicos.

En los sóleos de los cinco ratones restantes se midió en extracto total de los

músculos sóleos la fosforilación de la MAP Kinasa p38, NF-кBp65 y estrés oxidativo

mediante Western Blotting. Los gastrocnemios de los ratones se destinaron a la

medición de la activación de NF-кBp65 en extracto nuclea mediante kit de ELISA.


101

3.1.1.4. Ratas Wistar Ham macho

Este estudio se llevó a cabo durante mi estancia en el laboratorio “Mouvement,

Sport, Santé” EA1274” de la universidad de Rennes 2, Francia. Se utilizaron ratas

macho de la cepa Wistar Ham (Herlan Laboratory) de 2 meses de edad, y de 313 ± 40 g

de peso. Las ratas se mantuvieron en el animalario del IFR 140 de la Universidad

Rennes 1 bajo condiciones constantes de temperatura (23 ± 1ºC), humedad relativa

(60%) y ciclos de luz /oscuridad (12/12h). El acceso al agua y la comida fueron siempre

libre, siendo la dieta libre de soja comercializada por HERSTELLER cuyo valor

calórico es de 3100 kcal/Kg.

a) Estudio Nº4: Estudio de la diabetes experimental inducida con

estreptozotocina en ratas Wistar Ham macho. Efecto del tratamiento con α-

galacto-oligosaccharidos (OGT)

Los animales fueron divididos aleatoriamente en tres grupos experimentales (Ver Tabla

3.4).

Grupo control (Ratas sanas).

Grupo Diabético.

Grupo Diabético suplementado, durante ocho semanas, con α-galacto-

oligosacárido (20mg/kg de peso/día de OGT), proporcionado por la compañía

Triballat.

Grupo control 9

Grupo Diabético (STZ) 8

Grupo Diabético (STZ) + OGT 8

Tabla 3.4. Diseño del estudio sobre el efecto de la diabetes en ratas Wistar Ham



102

b) Diabetización de las ratas

La inducción de la diabetes se realizó después de una semana de familiarización

de los animales. La diabetización se indujo por una única inyección intraperitoneal de

estreptozotocina (STZ) (45 mg/kg de peso del animal disuelto en tampón citrato sódico

0.1 M a pH 4.5) de acuerdo con la técnica ya validada en el laboratorio M2S de Rennes

(Le Douairon et al., 2010). El método se basa en la destrucción selectiva de los islotes

de Langerhans ya que un tratamiento con estreptozotocina produce daños irreversibles

en su morfología y permeabilidad (Oztürk et al., 1996). Esta dosis indujo a las ratas una

hiperglucemia crónica y diabetes. Al grupo control se le administró como vehículo un

máximo de 800 µL de tampón citrato sódico 0.1 M a pH 4.5.

A los 5-7 días de la administración de estreptozotocina las ratas presentaban un

cuadro clínico propio de la diabetes, con poliuria, polidipsia y pérdida de peso. Se

comprobó este cuadro con parámetros bioquímicos como la medida de la glucosuria,

con tiras reactivas múltiples. Todos los animales que presentaron una glucosuria

superior a 250 mg/dL se incluyeron en el grupo de ratas diabéticas y en el grupo de ratas

tratadas con OGT.

c) Sacrificio de los animales. Extracción y conservación de muestras

Transcurridas 8 semanas desde la inducción de la diabetes, periodo de

suplementación, se mantuvieron a los animales en ayunas durante 24 horas antes de su

sacrificio. Los animales fueron anestesiados con una inyección de ketamina (90 mg/kg)

y xilacina (6 mg/kg).

Se extrajo una muestra de sangre del seno retro-orbital. La sangre se recogió en

tubos de EDTA al 5% (30 μL/2 mL de sangre) y se centrifugó a 1400x g durante 10

minutos a 4°C. El plasma se almacenó en alícuotas a -80°C para el posterior análisis de

las concentraciones de glucosa mediante el método de Trinder (Trinder, 1969) (una

variante del método de la glucosa oxidasa), y las concentraciones de insulina y

fructosamina por el método de ELISA.


103


Músculo sóleo.


Músculo tibial anterior.



-80°C.

En el caso de los músculos, el tibial anterior, se destinó a medir en extracto

citosólico la fosforilación de la MAP Kinasa p38, TNF-α, NF-KappaB y estrés

oxidativo mediante Western Blotting.

3.1.2. Aparatos

Agitador magnético: Marca Stuart, modelo Hotplate Stirrer SB162-3.

Artisan(TM) Link Pro for Special Stains Diagnostics: Marca Dako.

Autoclave: Marca SELECTA, microclave.

Autoclave o SAS: Marca SELECTA, modelo Autester-G.

Balanza de precisión: Marca SARTORIUS, modelo TECATOR 6110.

Balanza: Marca SARTORIUS (Portable), modelo PT 1200.

Baño termostatizado: Marca Stuart, modelo SBH130D.

Campana de flujo laminar vertical: Marca CRUMA S.A., modelo 1100-

GA.

Campana de flujo laminar vertical: Marca BURDINOLA, modelo OR-ST

1200.

Campana DNA/RNA UV- Cleaner: Marca Biosan, modelo UVC/T-M-AR.

Centrífuga a baja velocidad: De la firma SORVALL, modelo GLC-1.

Centrifuga refigerada a alta velocidad: Marca HERAEUS, modelo

Sepatech Biofuge 17 RS.

Centro de inclusión de tejidos: Marca Leica, modelo EG 1150H.


104

Cromatografía líquida de alta eficacia: Modelo LC, Shimadzu.

- Autoinyector SHIMADZU, modelo SIL-10AD vp

- Bomba marca SHIMADZU, modelo LC-10 AD.

- Columna TEKNOLROMA de fase reversa, modelo Spherisorb C18 cuya

dimensiones son 15 x 0.46 cm y de un tamaño de partícula de 5 μm.

- Controlador del equipo CBM-10 A.

- Detector UV SHIMADZU, modelo SPD-10 AV.

- Ordenador IBM XT modelo 486 con el programa de integración

CLASSLC10.

Equipo de anestesia o sedación: Marca CIBERTEC con vaporizador de

Isoflorano.

Espectrofotómetro termostatizado: Marca CECIL, modelo CE 3021 Serie

3000.

Fluorímetro: Marca Perkin Elmer, Modelo LS 50B.

Fuentes de alimentación para la electroforesis: Marca SIGMA, modelo PS

250-2, y marca BIORAD, modelo 200/2.0 PowerSupply.

Homogenizador: Marca Ika-Werk, modelo Janke y Kunkel, RW 20 DZM.

Lava-biberones: Modelo Lancer, casa comercial Matachana.

Lavador automático de placas ELISA (HYDROFLEX, TECAN).

Lava-racks: ModeloDynajet New SMITH, Pacific Rack Washer. Se utiliza

detergente alcalino.

Microcentrífuga a baja velocidad: Marca Sigma, modelo 1-14.

Microscopio óptico: Marca Leica, modelo DMD 108.

Microtomo: Marca Leica, modelo RM 2245.

Nanodrop: Marca Thermo Scientific, modelo 2000.

pH-metro: Marca CRISON, modelo GLP 21, con un electrodo Inglod

incorporado.

Placa fría: Leica EG1150 C.

Procesador de tejidos al vacío: Marca Leica ASP 300s.

Refrigerador con congelador: Marca LG

Rotador: Mini-rocker Shaker MR-1 de Biosan.


105

Sistema de Análisis de Imágenes: Marca FUJIFILM, modelo LAS-1000

plus.

Sistema de Análisis de Imágenes: Marca Health Care, modelo Image Quant

Las 4000 H.C.

Sistema de detección de secuencias: MARCA Applied Biosystems (Foster

City, CA), ABI PRISM 7900HT Fast Real-Time PCR System.

Sistema de purificación de agua: Marca MILLIPORE, modelos Milli-Q y

Milli-RO.

Termociclador: Marca Biorad, modelo iCyder Iqtm Multi-Color. Real-Time

PCR Detection System

Termociclador: Marca Eppendorf. Modelo Vapo. Protect. Mastercycler pro-

S.

Ultracongelador -80°C: REVCO Ultima II

Vórtex: Mezclador de control de velocidad variable entre 200 y 2500x rpm.

Marca Stuart. Modelo SA8.

3.1.3. Material de laboratorio

Cubetas de electroforesis: Marca BIORAD, modelo Mini-PROTEAN 3

Cell.

Cubetas de electrotransferencia: Marca BIORAD, modelo Mini Trans-Blot

Cell.

Diverso material de vidrio, plástico y/o polipropileno (tubos, botes, pipetas,

cubreobjetos, probetas, etc.).

Gradillas.

Guantes de látex.

Jeringuillas estériles de un solo uso.

Juego de extracción de sangre (compresor, agujas, vacutainer).

Material Quirúrgico: Marca LAWTON, modelo HIBC-CODE.

Micropipetas semiautomaticas de 1000, 200 y 10 μL (Thermo Scientific).

Micropipeta multicanal de 50, 300 μL (Thermo Scientific).

Pinzas.

Pipetas Pasteur.


106

Placas Petri.

Portaobjetos con Poly-L-lisina.

Tubos Eppendorf de 1.5 mL.

Tubos de extracción de sangre con Heparina y EDTA.

3.1.4. Reactivos

a) Reactivos de uso común.

Ácido acético glacial.

Ácido clorhídrico.

Ácido sulfuroso.

AcONa: acetato sódico.

Acrilamida-Bisacrilamida.

Agua ultrapurificada (Milli-Q).

Albúmina de suero bovino (BSA).

Alcohol clorhídrico.

Alcohol etílico.

Alcohol metílico.

Alopurinol.

Alumbre de potasio o amónico.

Alumbre férrico.

Amoniaco.

APS: persulfato de amonio.

Azul de Coomassie.

Bicarbonato de sodio.

Bradford.

Desoxicolato de sodio (C24H39NaO4).

Diaminobenzidinatetrahidroclorhídrica (DAB).

Diluyente de anticuerpo primario: DAKO AntibodyDiluentEnvision.

Dinitrofenilhidrazona (DNP-hidrazona).

DNPH: 2,4-dinitrofenilhidracina.


107

DNP-hidrazona: dinitrofenilhidrazona.

DTT: DL-Ditiotreitol (C4H10O2S2).

EDTA: ácido etilendiaminatetracético.

Eosina Amarillenta.

Epitroperetrievalsolution (10x) con detergente, Dako.

Folin-Ciocalteau.

Formaldehído.

Fucsina.

Glicina.

H2O2: Peróxido de hidrógeno.

Hematoxilina de Harris.

Hidróxido potásico.

Indometacina.

Inhibidor de proteasas.

Isoflo®, Veterinaria Esteve.

Isoxantopterina.

K3PO4: Fosfato de Potasio Tribásico.

KH2PO4:Fosfato monopotasico.

Lowry.

Luminol.

Membrana de Nitrocelulosa.

Membrana de PDVF.

Mercaptoetanol.

Metabisulfato sódico anhidro.

Metabisulfito potásico.

Metabisulfito sódico.

Na2HPO4: Fosfato disódico.

Na4P2O7: Pirofosfato de sodio.

NaCl: Cloruro sódico.

NaF: Floruro sódico.

NaOH: Hidróxido de sodio.

AgNO3: Nitrato de plata.


108

Nonidet-P40 (Sigma).

Ortovanadato de sodio.

Óxido rojo de mercurio.

Papel de filtro.

Parafina.

Permanganato potásico.

Plata amoniacal.

PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo.

Poly-L-lisina.

Pterina (2-amino-4-hidroxipteridina).

Sacarosa.

SDS: Dodecilsulfato sódico (C12H25NaO4S).

Sigmacote, Sigma.

TBA: Ácido tiobarbitúrico.

TEMED.

Tris.

Tween.

Xilol.

b) Tampones de uso común

El pH de los tampones y las soluciones utilizadas en este trabajo estuvo siempre

comprendido entre 7.2 y 7.4, rango que no afecta a la viabilidad ni a la función celular.

El agua utilizada fue siempre agua ultrapurificada (Milli-Q). La composición de los

distintos tampones se encuentra detallada en cada uno de los métodos en los que han

sido utilizados, los cuales se describen en los apartados posteriores.


109

c) Anticuerpos utilizados en la técnicaWestern Blotting

Anticuerpo Peso Molecular Dilución Casa Comercial

MnSOD 25kDa 1:5000 AssayDesing

Cu,ZnSOD 28 kDa 1:5000 AssayDesing

Catalasa 61kDa 1:5000 Sigma

α-actina 42kDa 1:700 Sigma

P38 43 kDa 1:1000 CellSignaling

p-P38 43 kDa 1:1000 CellSignaling

NF-кBp65 65 kDa 1:1000 CellSignaling

p-NF-кBp65 80 kDa 1:1000 CellSignaling

TNF-α 17 kDa 1:1000 Santa Cruz

MHC I 220 kDa 1:10000 Millipore

AKT 60 kDa 1:1000 CellSignaling

p-AKT 60 kDa 1:1000 CellSignaling

Secundario Anti-rabbit 1:2500 CellSignaling

Secundario Anti-mouse 1:2000 Calbiochem

Secundario Anti-goat 1:2000 Santa Cruz

Tabla 3.5. Relación de anticuerpos

d) Anticuerpos utilizados en la técnica inmuno-histológica

Anticuerpo Dilución Casa Comercial

MHC I 1/4000 Sigma

Secundario universal

biotinilado Dako

Estreptavidina conjugada

con peroxidasa Dako

Tabla 3.6. Relación de anticuerpos primarios


110

3.1.5. Kits de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

Para el análisis de las concentraciones plasmáticas de 6-keto prostaglandinas

F1α, Glucosa, Fructosamina e insulina, así como de las concentraciones de la citoquina

IL-6 y la actividad de NF-кBp65 en el músculo esquelético se utilizaron distintos kits

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) los cuales se detallan en el apartado de

métodos, al igual que los reactivos utilizados en cada uno de ellos.

Las referencias de los distintos kits son las siguientes:

Activación de NF-кBp65: TransAM™ NF-кBp65; Active Motif (Ref. 40096).

Determinación de 6-keto prostaglandinas F1α: Cayman Chemical 6-keto

Prostaglandin F1α EIA Kit (Item Number 515211).

Determinación IL-6: RayBio, Mouse IL-6 ELISA (Cat#: ELM-IL6-001C).

Determinación de la Fructosamina: a MyBioSource, Rat fructosamine ELISA

kit Ref. MBS704663

Determinación de la insulina: SPI-Bio rat insulin enzyme immunoassay kit

(catalogue #A05105).


111

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Modelo de suspensión de las extremidades

posteriores para roedores, adaptación de Morey-Holton y

Globus

Para la inmovilización de los animales se adaptó el protocolo de suspensión de

las extremidades posteriores para roedores de Morey-Holton y Globus, 2002 (Morey-

Holton and Globus, 2002). Este protocolo fue aprobado por la NASA y el Comité de

Cuidado de Animales para la simulación del vuelo espacial.

El material necesario para la suspensión de las extremidades posteriores de los

animales fue el siguiente: 1) un tubo inmovilizador, 2) cinta adhesiva, esparadrapo o

similar, 3) anillas de acero inoxidable, 4) quitavueltas o artefacto similar (utilizamos el

de los artículos de pesca acorde al peso del animal), 5) filamento de alambre, 6)

Alcohol, 7) una jaula para suspender a los animales, y 8) un cajón con viruta que se

situó debajo de la jaula para recoger la orina.

Antes de iniciar la suspensión de los miembros se prepararon las tiras adhesivas

y los filamentos de alambre. El ancho de las tiras adhesivas se ajustó a la anchura de la

cola de los animales, y su longitud fue la necesaria para cubrir alrededor de dos tercios

de la longitud de la cola, teniendo en cuenta que al colocarla enrollada debía

superponerse sobre la mitad del ancho de la tira anterior, ya que además la cola es

crítica para la termorregulación en los roedores.

El procedimiento mediante el cual se llevó a cabo la suspensión fue el siguiente:

la rata o el ratón se colocó dentro del tubo de inmovilización con la ayuda de una

segunda persona que ayudó a mantenerla dentro del mismo. Se podría haber anestesiado

a los animales, pero se desestimó la opción porque la anestesia puede comprometer la

capacidad de los animales para adaptarse a la suspensión.

Se limpió la cola con alcohol, eliminando cualquier posible resto de piel sucia o

muerta. La cinta adhesiva, previamente cortada y preparada, se pegó al inicio la cola, en

la base, justo debajo de la línea del pelo. La cinta adhesiva se presionó ligeramente


112

sobre la cola para que se adhiriese a lo largo de la superficie de la misma, y se fue

enrollando dando la vuelta a la cola, superponiendo la mitad de la segunda vuelta sobre

la anterior. La cinta debía estar lo suficientemente apretada para que no se desprendiese

de la cola, pero a la vez no debía alterar la circulación normal de la misma. Una vez

desplegadas dos vueltas de cinta adhesiva, se coloca la anilla entre la tira y la cola y se

termina de desplegar una tercera vuelta, dejando colocada y pegada la anilla junto a la

cola de la rata.

El siguiente paso fue anclar la pieza giratoria que colgaba del dispositivo de

suspensión en la parte superior de la jaula. Esta pieza permitía que los animales se

desplazasen sobre un eje x-y y rotar 360° de tal manera que tuviesen acceso a todas las

áreas de la jaula, al agua y a la comida. El dispositivo de suspensión, ubicado en la parte

superior de la jaula, se debe poder deslizar a lo largo de las dos barras paralelas de la

jaula. El sistema giratorio fue diseñado para impartir la mínima resistencia con la

intención de que el animal pudiera moverse fácilmente y sin esfuerzo, usando sus

extremidades anteriores. El cuerpo de los animales tenía un ángulo de 30° desde el suelo

de la jaula, lo que permitía que sus miembros posteriores no tocasen la reja del suelo.

Además se comprobó, extendiendo manualmente las extremidades posteriores, que las

uñas de las patas no tocasen la reja o las paredes de la jaula. El ángulo y la altura de las

ratas revisado y ajustado diariamente.

Figura 3.1 Rata Wistar y Ratón C57BL/6J durante el protocolo de suspensión.

Los animales eran inspeccionados dos veces al día por la veterinaria y por

nosotros mismos para asegurar su salud.

Durante las inspecciones se observaron los siguientes aspectos: el estado de la

cola, color de la misma y si se aflojaba la cinta adhesiva, el aspecto general así como la



113

actividad del animal. Durante los primeros días de la suspensión, pudimos observar

porfirina alrededor de la nariz y los ojos en el grupo de las ratas suspendidas, que

comenzó a desaparecer al tercer o cuarto día de suspensión.

3.2.2. Determinación de la actividad de la Xantina Oxidasa

Se siguió el método fluorimétrico descrito por Beckman y cols. (1989). Este

método está basado en la monitorización fluorimétrica de la formación de

isoxantopterina a partir de pterina (Beckman et al., 1989).

a) Reactivos

Tampón fosfato 50 mM., EDTA 0.1 mM., pH 7.4.

Pterina (2-amino-4-hidroxipteridina) 1 mM. Se pesan entre 3 y 4 mg. de

pterina y se resuspenden inicialmente en 100 µM. de NaOH 1 M. Una vez

disuelta se le añade el agua necesaria para alcanzar una concentración de

1mM. Esta solución es estable durante 1 ó 2 días a temperatura ambiente.

Isoxantopterina 1 mM. Se pesan entre 3 y 4 mg. de isoxantopterina y se

resuspenden inicialmente en 100 µM. de NaOH 1 M. Una vez disuelta se le

añade el agua necesaria para alcanzar una concentración de 1 mM. A partir de

esta solución se diluye hasta alcanzar una concentración de 10 µM. La

concentración exacta de isoxantopterina se determina

espectrofotométricamente a 336 nm., debiendo encontrarse entre 8 y 13 µM.

Esta solución se ha de preparar y valorar diariamente.

Alopurinol 1 mM en agua Milli-Q. Esta solución se realiza directamente a 1

mM. Para conseguir una perfecta disolución es necesario prepararla en

agitación y calentándose. Una vez disuelta se separan alícuotas que se pueden

conservar congeladas.


114

b) Procedimiento

La variación de la fluorescencia generada por la formación de isoxantopterina se

mide a 345 nm. de excitación y 390 nm. de emisión. Todo el proceso se realiza con el

fluorímetro termostatizado a 37ºC.

Añadimos en una cubeta de cuarzo de 25 µL de muestra y tampón fosfato 50

mM., EDTA 0.1 mM., pH 7.4, hasta un volumen final de 2 mL, este valor constituye el

blanco. Posteriormente se añaden 20 µL de una solución de pterina 1 mM y se sigue la

emisión de fluorescencia durante 2 minutos. El cambio de fluorescencia, nos indica la

actividad de la xantina oxidasa. Añadimos 20 µL más de una solución de alopurinol 1

mM y se sigue la emisión de fluorescencia durante un minuto. No debe variar la

fluorescencia, pues el alopurinol inhibe la xantina oxidasa. A continuación realizamos

una medida puntual de la fluorescencia antes y después de añadir 20 μL de

isoxantopterina, cuya concentración se ha determinado previamente. De esta manera

obtendremos el incremento de fluorescencia debido a la isoxantopterina. Este

procedimiento se utiliza como patrón interno en la determinación.

c) Cálculos

La unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que cataliza la

formación de 1 μM de isoxantopterina por minuto. En el plasma la expresamos en

unidades por litro de plasma.

Para calcular la actividad de la XO se realiza el siguiente cálculo:

Siendo:

F/min. la variación de fluorescencia observada por minuto tras añadir la

pterina.

Isoxantopterinala concentración de isoxantopterina.


115

Fisoxantopterina es el incremento inmediato de fluorescencia que se

produce tras añadir la isoxantoptrina.

V final: el volumen de la cubeta una vez añadida la disolución de pterina

(2.02 ml.).

V muestra: es el volumen de muestra añadido (0.025 ml.).

3.2.3. Determinación de MDA por HPLC

a) Reactivos

Tampón de AcONa 2 M pH 3.5 + TBA 0.2%.Se guarda protegido de la luz a

4ºC.

Tampón KH2PO4 50mM pH 6.8. Guardado a 4ºC.

Tampón KH2PO4 50 mM pH 3.5. Guardado a 4ºC.

b) Procedimiento

1. A 500 μL de tampón AcONa 2 M pH 3.5 + TBA 0.2% se le añadieron 20 μL

de muestra de plasma o patrón.

2. Las muestras se incubaron durante 60 minutos a una temperatura de 95ºC. En

esta etapa se produjo la hidrólisis de los lipoperóxidos y la consiguiente

liberación de moléculas de malondialdehído (MDA) que se conjugan con 2

moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA); por lo tanto, estrictamente se

denomina el aducto MDA – TBA2 como índice de peroxidación lipídica.

3. Después de la incubación las muestras se guardaron en hielo.

4. Se añadió 500 μL del tampón KH2PO4 50 mM pH 6.8 a cada muestra y se

agitó.

5. Las muestras fueron centrifugadas durante 5 minutos a 13000x rpm a 4ºC.

6. Se tomaron 200 μL de sobrenadante y fueron añadidos 200 μL de tampón

KH2PO4 50 mM pH 3.5 y se agitó.

7. Fueron tomados 200-300 μL de sobrenadante y se colocaron en un vial para

realizar el análisis por HPLC.


116

En las muestras hemolizadas se retiró la hemoglobina, ya hubiese interferido en

el análisis; para ello antes de preparar las muestras se realizó el siguiente procedimiento:

1. Se tomaron unos 100 μL (50 μL) de plasma y se añadió 100 μL (50 μL) de

una solución formada por dos partes de cloroformo y una de isopropanol.

2. Se pasó por el vórtex durante 2 minutos y se dejó reposar unos 5 minutos;

posteriormente se centrifugó durante 10 minutos a 10000x rpm a 4ºC.

3. Se recogieron 75 μL (35.5 μL) del sobrenadante y se añadieron 75 μL (35.5

μL) de la solución formada por cloroformo e isopropanol.

4. Se pasó por el vórtex durante 2 minutos y dejó reposar unos 5 minutos;

después se centrifugó durante 10 minutos a 10000x rpm a 4ºC.

5. Del sobrenadante cogimos 20 μL y los añadimos a 500 μL de tampón AcONa

2 M pH 3.5 + TBA 0.2%, siguiendo, de este modo, el protocolo descrito (ver

protocolo).

c) Preparación de las fases móviles

Preparación de la fase A:

La composición de la fase A era la siguiente: KH2PO4 50 mM pH 6.8 /

acetonitrilo (83/17). Para prepararla se procedió del siguiente modo:

1. Se pesaron 13.6 g de KH2PO4 y disolvieron en unos 1800 mL de agua.

2. Ajustamos el de esta disolución hasta 6.8 con KOH 1M o, en su lugar,

disoluciones de KOH de distinta concentración (≈ 14.5 mL KOH 20%).

3. Cuando el pH estuvo ajustado a 6.8 ajustamos el volumen con agua hasta

2000 mL.

4. A esos 2 litros de disolución se le añadieron 410 mL de acetonitrilo. Esta

solución debía homogenizarse bien.

5. Una vez preparada la fase móvil fue necesario filtrarla y desgasificarla. Para

ello, se podía utilizar helio o el baño de ultrasonidos. En ambos casos el

tratamiento de desgasificación debía durar unos 20 minutos.


117

Preparación de la fase B:

Esta fase estaba constituida por una mezcla de acetonitrilo/agua (70/30). Para

prepararla, a 1400 mL de acetonitilo debieron añadírsele 600 mL de agua,

homogenizarla y desgasificarla como en el caso anterior.

Preparación de la fase C:

Para prepararla a 1000 mL de agua debieron añadirse unos 200 µL de

acetonitrilo; después de homogenizar la solución se desgasificó. La fase C no siempre

es necesaria llevarla a cabo, se utiliza únicamente para lavar el sistema cuando este iba

a estar varios días sin utilizarse.

Las fases se colocaron finamente en las botellas de vidrio topacio que

usualmente utilizamos para tal fin.

d) Preparación de los patrones

1. Preparamos una madre de MDA-bis (410 µL/500 mL de agua Milli-Q).

2. Hicimos una disolución ½ de la madre, así obtuvimos 5mM de MDA-bis.

3. Se prepararon los patrones:

A. 50 nmol/mL (se diluyó 1/100 5 mM de MDA).

B. 25 nmol/mL (se diluyó ½ 50 nmol/mL).

C. 12.5 nmol/mL (se diluyó ½ 25 nmol/mL).

D. 5 nmol/mL (se diluyó 1/5 25 nmol/mL).

E. 2.5 nmol/mL (se diluyó ½ 5 nmol/mL).

F. 1.25 nmol/mL (se diluyó ½ 2.5 nmol/mL).

G. Blanco (25 µL de agua + 500 µL de tampón AcOH 2M pH 3.5 + TBA

0.2%).

e) Condiciones cromatográficas

Flujo: 1.2 mL/min.

Detección: detección mediante detector uv-vis a 532 nm.

Columna: C-18 Spherisorb de 15 cm y 5 µm de diámetro de partícula.


118

3.2.4. Extracción y separación de proteínas de la fracción

citosólica y nuclear del músculo esquelético

Los fragmentos de tejido muscular extraído de los animales fueron tratados y

preparados para analizarse mediante la técnica Western Blotting. Para ello se tuvieron

que extraer fracciones nucleares y citosólicas siguiendo el protocolo modificado de

Dignam y sus colaboradores (Dignam et al., 1983) detallado a continuación:

Los fragmentos de tejido muscular (40-50 mg) se homogeneizaron en 100

μL/mg en una solución amortiguadora de lisis 1% Nonidet-P40, 50 mM NaCl, 10 mM

Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, sacarosa 0.25 M, 30 mM de pirofosfato de sodio, 100 de

sodio microM ortovanadato, 50 mM NaF, 0.25% de sodio Desoxicolato, 5 μL de

inhibidor de proteasas por mL de tampón, 100 μM de ortovanadato de sodio.

Las muestras se centrifugaron a 1500x g durante 10 minutos a 4°C. El

sobrenadante, la fracción citosólica, fue recogido y congelado a -80°C hasta su análisis.

Seguidamente se resuspendió el pellet nuclear con 400 μL del siguiente tampón:

10 mM TRIS (pH 7.5), 0.25 M Sacarosa, 400 mM NaCl, 5 mM EDTA, 30 mM

Pirofosfato Sódico, 1% Nonidet P-40, 0.25 % Sodiumdeoxicolato, 5 μL x mL de

tampón de inhibidores de proteasas, 100 μM Ortovanadato de Sodio.

Después se vortearon durante 15 segundos y se sonicaron un total de 4 veces

durante 15 segundos en hielo y se dejó reposar en hielo 30 minutos. Pasado este tiempo

se centrifugó durante 15 minutos a 14000x rpm a 4°C, se recogió el sobrenadante,

fracción nuclear, y se congeló a -80°C, hasta su análisis.

3.2.5. Extracción de proteínas totales del músculo esquelético

Debido a la escasez de la muestra, en el caso de los sóleos de los ratones

analizados por Western Blotting los músculos enteros fueron tratados y preparados para

extraer proteínas totales siguiendo el siguiente protocolo:

Los fragmentos de tejido muscular se homogeneizaron en una solución

amortiguadora de lisis Tris 10 mM pH 7.5, 0.25 M Sacarosa, 50 mM NaCl, 5mM

EDTA, 30 mM Pirofosfato Sódico, 1% Nonidet-P40, 100 µM Ortovanadato de sodio,

50 mM Fluoruro de sodio, 0.25% sodio desoxicolato, 5 µL por mL de tampón del


119

cocktail de inhibidores de proteasas, en una proporción de 200 µL de tampón por cada

20 mg de tejido congelado.

Posteriormente los homogenados se sonicaron 5 segundos en hielo, a baja

intensidad, y se dejaron reposar 30 minutos en hielo para facilitar la ruptura tisular.

Pasado este tiempo, se centrifugaron 12 minutos a 12000x g a 4ºC, se recogió el

sobrenadante y se congeló a -80°C hasta su análisis.

3.2.6. Método para determinar la concentración de proteínas

3.2.6.1. Método de Lowry

a) Fundamento

En algunas técnicas utilizadas los resultados se expresan en función de la

cantidad de proteína, proceso necesario, a su vez, para conocer la cantidad exacta que se

carga en las electroforesis SDS-PAGE. Para la cuantificación de las proteínas de las

muestras se ha utilizado el método de Lowry (Peterson, 1977, Lowry et al., 1951). El

reactivo de Lowry contiene dodecilsulfato sódico, que facilita la disolución de las

proteínas parcialmente insolubles, y tartrato cúprico alcalino, que se une a las proteínas.

Por su parte el reactivo de Folin contiene fenol, que al interaccionar con el tartrato da

lugar a un compuesto de color azul.

El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de

las proteínas. A la muestra se añaden los reactivos mencionados previamente, que

forman un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad del color

proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

b) Preparación de los reactivos

Agua Milli-Q

Reactivo de Lowry: se prepara añadiendo 40 mL de agua Milli-Q a la botella

del reactivo comercial LowryReagent, Powder de la casa Sigma-Aldrich, en

polvo (0.15% Deoxycholate (DOC), ácido tricloroacético (TCA)).

Reactivo Folin-Ciocalteau (18 mL) se encuentra en botella de vidrio ámbar

previstas para la solución de trabajo. A este reactivo se le añaden 90 mL de

agua Milli-Q.


120

Homogenado de tejido (muestra problema)

Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA), con a las

concentraciones de 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.125, 0.78125, 0.396, 0.195

mg/mL además del blanco, con agua Milli-Q.

c) Procedimiento

Se añadió en cada Eppendorf 10 µL de muestra o patrón + 490 µL de H2O Milli-

Q + 500 µL de Lowry. A continuación se incubó durante 20 minutos en una situación

de total oscuridad. Posteriormente se añadieron 250 µL de Folin y se dejaron las

muestras a oscuras durante 30 minutos más. Finalmente medimos en el

espectofotómetro a 660 nm con microcubetas para espectofotómetro.

Hay que tener en cuenta que, debido a la gran cantidad de proteínas que

contienen los diferentes tejidos, se deberá realizar previamente diluciones de las

muestras. En el caso de las muestras citosólicas se utilizó una dilución 1/5, en el caso de

las muestras del extracto nuclear la dilución fue ½ y 1/6 en las de plasma.

d) Cálculos

Los cálculos consistieron en realizar una recta patrón de concentración de

proteínas realizada con BSA e interpolar en esa recta los valores de absorbancia

obtenidos de las muestras tratadas igual que la recta patrón, para así hallar la

concentración de proteínas de la muestra.

Abs = Abs muestra – Abs blanco


121

3.2.6.2. Método de Bradford

a) Fundamento

Se utiliza el “Bradford Reagent” de la firma BIO-RAD siguiendo el protocolo de

Bradford (Bradford, 1976), este reactivo contiene ácido fosfórico, metanol y también

azul de Comassie.

El método está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant

blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas en muestras

complejas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente

arginina) y aromáticos. La interacción proteína-colorante es estabilizada por

interacciones iónicas y sobre todo por interacciones hidrofóbicas.

Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de

absorción del colorante desde 465 nm (en condiciones ácidas) a 595 nm (cuando se

desprotona al unirse a una proteína), por lo que el cambio en la absorbancia a 595 nm es

proporcional a la concentración de proteína en la muestra.

b) Reactivos

Agua milli-Q.

Bradford Reagent (BIO-RAD).

BSA: Para realizar la recta patrón, idéntica a la descrita en el apartado del

método de Lowry.

c) Protocolo

Se realiza una recta patrón de BSA, para posteriormente interpolar nuestras

muestras de concentración desconocida. Para ello, hay que preparar una serie de

Eppendorfs que contengan las siguientes concentraciones de albumina (BSA): 50, 25,

12.5, 6, 3, 1.5, 0.75, 0.37, 0.19 mg/mL.

- Una vez tengamos nuestra recta patrón, esta se trata como otra muestra más.

- Preparamos las solución Bradford al 20% (dilución 1/5 con agua Milli-Q)

teniéndose en cuenta que necesitamos 1mL x muestra.


122

- Poner 1 mL de la solución Bradford en cada cubeta (Medir todos los blancos a

595 nm).

- Añadir 2 μL de muestra en las cubetas y dejar en oscuridad 15 minutos.

- Medir absorbancia a 595 nm. Y relativizar cada muestra con su blanco.

Al igual que en el método Lowry, se deberá realizar previamente diluciones de

las muestras. En el caso de las muestras citosólicas se utilizó una dilución 1/5, en el caso

de las muestras del extracto nuclear la dilución fue ½ y 1/6 en las de plasma.

d) Cálculos

La absorbancia de la muestra llamada “blanco” debe restarse a las muestras

problema y a los patrones.

ΔAbs = Abs muestra o patrón – Abs blanco

El resultado se expresa en una gráfica de absorbancia en función de la

concentración de nuestros patrones. Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se

obtiene una línea recta que pasa cerca del origen.

Una vez obtenida las absorbancias de todas nuestras muestras. Se realiza una

recta de regresión lineal con los datos de la recta patrón para interpolar en esta los datos

de las muestras de las que desconocemos su concentración.

3.2.7. Análisis por Western Blotting

La técnica del Western Blotting fue descrita por primera vez por Harry Towbin

en 1979 (Towbin H. Staehelin T., 1979). El término blotting hace referencia a la

transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su

posterior detección en la superficie de la misma.

La identificación de proteínas se basa en la especificidad de la unión antígeno-

anticuerpo. Esta unión permite la detección de una única proteína dentro de una muestra

compleja proveniente, en este caso, de un extracto proteico de músculo esquelético o

plasma.


123

3.2.7.1. Separación electroforética de las proteínas

La separación de las proteínas mediante una electroforesis en gel de

poliacrilamida (PAGE) previa, seguida de una transferencia a una membrana de

nitrocelulosa, en las que las proteínas quedan retenidas y expuestas para facilitar el

reconocimiento por el anticuerpo.

Para ello, tras medir la concentración de proteínas de las muestras

homogeneizadas, por los métodos descritos anteriormente, se calcula el volumen de

muestra que hay que poner para que en el pocillo haya entre 30 y 60 μg de proteínas. El

doble de dicho volumen se diluyó 1:1 con “SDS Sample Buffer”, tampón de carga con

mercaptoetanol (para romper los enlaces disulfuro) y un detergente SDS (dodecyl

sulfate) para cargar negativamente las proteínas. Posteriormente las proteínas de la

muestra se desnaturalizaron calentándolas a 95oC durante 5 minutos (para romper los

enlaces de hidrógeno).

Una vez tratadas las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida de 1.5

mm, el espesor del gel varía según el porcentaje de acrilamida añadida y depende del

peso molecular de las proteínas que se quieran estudiar. Por ejemplo, para la

preparación del “Running Gel” al 12% es necesario disolver los reactivos en el siguiente

orden: Agua, Tris 1.5M pH 8.8, Acrilamida-Bisacrilamida al 40%, SDS al 10%, Tris-

TEMED, APS al 10%. Y para la preparación del “Stacking Gel” al 4.5%: Agua, Tris 0.5

M pH 6.3, Acrilamida-Bisacrilamida al 40%, SDS al 10%, Tris-TEMED y APS al 10%.

Se colocó en una cubeta horizontal (BIO RAD Mini-PROTEAN Tetra cell) y se

aplicó un voltaje constante de 100 V durante 2 horas en tampón Tris-Glicina (25 mM

Tris, 200 mM Glicina, 0,1% SDS, pH 8.3).

3.2.7.2. Transferencia de las proteínas a la membrana

Una vez separadas las proteínas, se procedió a la transferencia de éstas desde el

gel de poliacrilamiada a una membrana de nitrocelulosa (Schelider&Schuel, USA) en

condiciones de humedad y sometiendo al soporte de transferencia a un amperaje

constante de 240 mA durante 1 hora y 30 minutos a 4ºC en un tampón de transferencia

(25 mM Tris, 192 mM Glicina pH 8.3, metanol 20%).


124

Tras la transferencia el gel se tiñe con azul de Coomassie (1.25 g coomassie R-

250, 250 mL etanol, 50 mL ácido acético y 200 mL de agua; luego se destiñe con 500

mL, 200 mL de ácido acético y 1200 mL de agua).

3.2.7.3. Separación electroforética de las proteínas

La membrana se sumerge en tampón de bloqueo con leche desnatada en polvo o

BSA al 5% p/v en TBS-TWEEN (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6, Tween 0.1%)

durante mínimo 1 hora. Así se consigue bloquear los sitios de unión de la membrana y

reducir la posterior unión inespecífica de anticuerpos a las proteínas.

3.2.7.4. Anticuerpos primarios y secundarios

Los anticuerpos primarios utilizados, que aparecen en la tabla del apartado 3.1.3,

fueron diluidos con leche o BSA al 5% en TBS-TWEEN, se dejaron incubando

overnight en la cámara fría (4ºC). Tras la incubación con el anticuerpo primario, se

realizan 3 lavados de 5 minutos con TBS-TWEEN para eliminar el exceso de anticuerpo

que haya podido quedar en la membrana y se incuba con el anticuerpo secundario anti-

mouse 1:2000 para y anti-rabbit 1:2500 según lo requiera cada anticuerpo que están

conjugados con la enzima peroxidasa de rábano (HRP), proteína que cataliza la

oxidación de los sustratos por el peróxido de hidrógeno. Se incuban las membranas

durante 60 minutos a temperatura ambiente y agitación constante.

Finalmente se hacen 3 lavados con TBS-TWEEN de 5 minutos.

En último lugar añadimos el sustrato (luminol: ECL Western Blot Detection

Reagents, GE Healthcare, UK), 1 mL/membrana y se revelan las membranas mediante

un digitalizador de imagen (Fujifilm LAS-100) que recoge la señal de

quimioluminiscencia emitida en el transcurso de la reacción en el software Image

Reader Las-1000 Pro v2.3 acoplado a una cámara oscura Intelligent Dark Box II

(Fujifilm).


125

3.2.7.5. Interpretación y cuantificación de los resultados

La cuantificación relativa de la expresión de proteínas mediante un programa de

densitometría digital (Image Gauge versión 4.0. Fujifilm).

Los valores de las proteínas estudiadas se expresaron en función de los valores

de expresión de α-actina en los extractos citosólicos, mientras que en los nucleares se

realizó en función de la tinción de la membrana en rojo ponceau.

3.2.8. Proteínas carboniladas

Los fragmentos de tejido muscular (40-50 mg) se homogeneizaron en 100 μL /

mg en un músculo solución amortiguadora de lisis (tampón fosfato 50 mM, 0.1 mM

EDTA, pH 7.4, 0.5 M de sacarosa, DTT 1 mM, PMSF 1 mM). Las muestras se

centrifugaron a 12.000x g durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante fue recogido y

congelado a -20°C hasta su análisis. Las muestras de plasma recogidas durante el

sacrificio no se hayan sometidas a ningún tratamiento previo al análisis. Los grupos

carbonilo presentes en los extractos citosólicos o plasma se derivatizaron con 2.4-

dinitrofenilhidrazona (DNP-hidrazona) por reacción, con 2.4-dinitrofenilhidracina

(DNPH).

a) Derivatización de las muestras.

1. Se añaden 10 µL de 1X DNPH a cada muestra.

2. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

3. Se añade 7.5 μL de la solución de neutralización.

4. Se añade 1-1.5 μL de 2-mercaptoetanol (5%v/v).

La determinación de los grupos carbonilo en proteínas se lleva a cabo por

Western Blotting, técnica descrita anteriormente, utilizando un anticuerpo primario

específico para el DNP-hidrazona (anti-dinitrofenilhidrazona, IntergenCompany).


126

b) Procedimiento

Una vez obtenida la membrana, tras la transferencia, se realiza una incubación

de BSA al 1% en PBS-TWEEN (7.20 g NaCl, 0.44 g K3PO4, 1.54 g Na2HPO4,

0.1%Tween por litro de agua Milli-Q). Se realizan 3 lavados de 5 minutos con 10 mL

de PBS-T. Se incuban las membranas durante 60 minutos con el anticuerpo primario en

una dilución 1:150 en BSA al 1% PBS-T. Posteriormente, se realizan 3 lavados de 5

minutos con 10 mL de PBS-T y se incuban de nuevo, 60 minutos, las membranas, con

el anticuerpo secundario proporcionado por el kit llamado 2º Antibody stock (dilución

1:300 en BSA al 1%/PBS-T). Finalmente, se realizan 3 lavados de 5 minutos con 10 mL

de PBS-T.

3.2.9. Aislamiento de RNA de tejido músculo esquelético

El aislamiento de RNA a partir de tejido de músculo esquelético de rata y ratón

se realizó con el RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit de Qiagen.

El protocolo del kit integra pasos de digestión con proteinasa K y DNasa libre de

RNasas durante el aislamiento de RNA para descomponer las proteínas y el DNA

genómico. Esto, junto a la utilización de una membrana de sílice en las columnas de

RNeasy spin proporciona una capacidad de unión de 100 μg RNA.

Figura 3.2. Esquema aislamiento de RNA de tejido músculo esquelético


127

a) Procedimiento

Todo el proceso se realiza en un área estéril dedicada para extracción de RNA

y con material estéril, únicamente destinado al trabajo con RNA.

Para la extracción usaremos el KIT de Qiagen RNeasy Fibrous tissue Mini

KIT #74704 con múltiples modificaciones del protocolo de este Kit que

hemos optimizado en nuestro laboratorio.

Partiremos de un fragmento congelado de músculo de 10-20 mg de peso.

b) Reactivos

Tampón RLT: Contiene tiocianato de guanidina.

Tampón RW1: Contiene etanol y una pequeña cantidad de tiocianato de

guanidina.

Tampoón RPE.

Agua libre de RNasas.

DNasa I: contiene deoxinibonucleico.

Proteinasa K.

Set DNasa libre de RNasas:

- DNasa libre de RNasas (lipofilizada).

- Tampón RDD.

- Agua libre de RNasas.

Previamente:

Reconstituir RPE con etanol puro (44 mL etanol)

Resuspender la DNasa con 550 µL de agua libre de RNasas del Kit. Para ello

se pincha la tapa del bote de la DNAsa y se introduce el agua con una

jeringuilla. Disolverlo dando vueltas al bote lentamente.

En Eppendorfs libres de RNasas, hacer alícuotas de la DNasa reconstituida

teniendo en cuenta que para cada muestra usaremos 10 µL. Guardar a -20oC.

Cada vez que usamos el Kit:

Preparamos el RLT que vamos a usar: dilución 10 µL/1 mL (10 µL de β-

mercaptoetanol / 990 µL de RLT).

El β-mercaptoetanol inhibe las RNAasas, evita que se oxide la muestra ya que

es un agente reductor.


128

a) Homogenización del tejido muscular

1. Pesar entre10-15 mg de músculo (pesar en frio sin descongelar).

2. Añadimos 300 µL de RLT con β-mercaptoetanol.

3. Homogeneizar a potencia máxima (Tissue Terror) subiendo y bajando el

émbolo entre 10 y 15 veces. Se homogeiniza sin hielo.

4. Dejamos los homogenados a temperatura ambiente 1 minuto.

b) Aplicación del Kit para extraer RNA

5. Añadimos a cada homogenado 590 µL de agua libre de RNasas del Kit, ya

que el RLT es tan fuerte que podría afectar a la proteinasa K.

6. Se le añade 10 µL de proteinasa K.

7. Resuspendemos 10 veces pipeteando.

8. Lo dejamos en el baño seco a 55oC 1 hora, cada 10 minutos lo agitamos 10

veces. (La proteinasa K actúa degradándolo todo excepto el RNA).

9. Mientras preparamos 50 mL de etanol puro.

10. Atemperar durante 1 minuto a temperatura ambiente.

11. Centrifugamos: 3 minutos a 13.000x rpm a 22oC.

12. Recogemos el sobrenadante (evitando el contacto con el pellet) y lo

transferimos a un tubo Eppendorf. Desechamos el pellet.

13. Diluimos el sobrenadante añadiendo al mismo 600 µL de Etanol puro y lo

movemos lentamente para mezclarlo.

14. Cogemos los tubos de 2 mL + columna rosa y rotulamos.

15. Echamos en la columna 700 µL del sobrenadante. No tocar el filtro de la

columna. Este proceso se realizará en dos tandas de 700 µL.

16. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22oC. El RNA queda retenido

en la columna y tiramos lo que queda en el tubo de 2 mL. Repetir la segunda

tanda.

17. Añadimos 350 µL de RW1 en el centro de la columna.

18. Preparamos la DNasa para cada muestra: 70 µL de buffer RDD (a 4oC)+10µL

de DNasa (a -20oC). La dejamos preparada para evitar que se seque la

columna después del centrifugarlo).

19. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22oC.


129

20. Ponemos 80 µL de la DNasa preparada para cada muestra. Añadirlo en el

centro de la columna, pero sin llegar a tocar la membrana.

21. Dejamos que actúe la DNasa durante 15 minutos a temperatura ambiente.

22. Añadimos 350 µL de RW1 encima de la DNasa, para darle otro lavado.


24. Añadimos 500 µL RPE, también para lavar.


26. Añadimos 500 µL RPE, también para lavar.

27. Centrifugamos: 30 segundos a 13.000x rpm a 22o C.

28. Pasamos la columna a otro tubo y hacemos un centrifugado en seco: 2

minutos a 13.000x rpm a 22oC.

29. Elusión: ponemos la columna en un Eppendorf rotulado y echamos 30 µL de

agua libre de RNasas, dejando que actúe 10 minutos. Evitar que se queden

gotas de agua en el escalón previo a la columna.

30. Centrifugamos: 1 minuto a 13.000x rpm a 22oC.

31. Mientras se centrifuga cogemos una cajita con hielo.

32. Recogemos el tubo con los 30 µL. en caso de tener una muestra limitante (10

mg) es importante volver a eludir de nuevo con otros 20 µL de agua libre de

RNasas. El RNA diluido se deja sin alicuotar para emergencias.

33. Alicuotar el RNA en tubos Eppendorf estériles. Dejar en hielo.

3.2.10. Cuantificación de la concentración de RNA

Utilizamos el Thermo Scientific NanoDrop 2000, un espectrofotómetro de

amplio espectro (220-270 nm) micro volumen, que permite la retención de volúmenes

de muestras tan pequeñas como 0.5 mL con alta precisión y reproducibilidad mediante

métodos de tensión superficial.

Inicialmente se determina el blanco con agua libre de nucleasas y posteriormente

se introduce 1 µL de la muestra. Los cálculos de la concentración de RNA los realiza el

software automáticamente midiendo la absorbancia a 260nm. Posteriormente la mide a

280 nm para calcular la pureza del RNA realizando el cociente entre ambas

absorbancias: 260/280 nm, de forma que valores comprendidos entre 1.8 y 2.0 indican

que se obtuvo un RNA de buena calidad.

Las medidas se pueden exportar directamente a un ordenador en formato Excel.


130

3.2.11. Retrotranscripción-Amplificación del RNA (RT-PCR) en

tiempo real

En la actualidad, existen varios métodos de determinación de la expresión del

mRNA, como el Northern Blotting, la hibridación in situ, los ensayos basados en la

protección frente a las RNAsas, arrays de DNA complementario (cDNA) y

retrotranscripción-amplificación (RT-PCR) del mRNA.

Nosotros empleamos la RT-PCR para determinar la expresión del mRNA, que

consta básicamente de dos pasos:

3.2.11.1. Síntesis de cDNA: Retrotranscripción (RT)

Consiste en la obtención de una copia de DNA (cDNA) a partir de un RNA

mensajero (mRNA), el proceso inverso de la transcripción. Para ello son necesarias unas

DNA polimerasas particulares, llamadas transcriptasas inversas o retrotranscriptasas.

Las enzimas utilizadas proceden de algunos retrovirus, virus que presentan RNA como

genoma, en vez de DNA. Para poder expresar sus proteínas, han de pasar la información

a DNA.

La transcriptasa inversa utilizada en esta tesis es MultiScribe™ Reverse

Transcriptase (Applied Biosystems). Para la obtención del cDNA se llevó a cabo una

transcripción reversa usando el High-Capacity cDNA Transcription kits for 200 and

1000 Reactions (Applied Biosystems) y las condiciones recomendadas por el fabricante.

a) Reactivos

- 10X RT Buffer: específico del enzima, le permite ser activa y llevar a cabo su

función.

- 25X dNTPs (100 mM): solución de desoxinucleótidos trifosfato necesarios para

la síntesis de cDNA.

- 10X RT Random Primers: puntos de anclaje que servirán a la retrotranscriptasa

para iniciar la síntesis.

- Enzima MultiScribe TM Reverse Transcriptase (MsRT): reconoce el RNA

molde y tiene la actividad DNA polimerasa.


131

- Inhibidor de RNAsas.

- Agua libre de RNAsas.

b) Procedimiento

- Preparar, sobre hielo, el 2X RT Master Mix con los reactivos y sus cantidades

indicadas a continuación. Preparar de forma proporcional al número de muestras

que se tengan, teniendo en cuenta que el volumen final será de 10 μL por

muestra.

Volumen por muestra

10X Buffer 2 µL

25X dNTPsMix (100 mM) 0.8 µL

10X RandomPrimers 2 µL

Enzima MultiScibe Transcriptasa Inversa 1 µL

Inhibidor de RNAasas 1 µL

Agua libre de nucleasas 3.2 µL

Volumen final 10 µL

Tabla 3.7. Reactivos y volumen para la RT

1. Mezclar suavemente y dejar sobre hielo.

2. Preparar la reacción de la retrotranscipción.

- Pipetear 10 µL de 2X RT Master Mix en cada pocillo que vayamos a usar

de la placa de 96 pocillos.

- Añadir 10 µL de RNA (entre 1 y 3 µg/μL) y mezclar suavemente.

3. Sellar la placa para que no se contamine.

4. Centrifugar la placa para eliminar las posibles burbujas de aire que puedan

quedar en los pocillos.


132

5. Llevar al termociclador, el perfil de temperaturas será:

25ºC ..................................... 10 min.

37ºC ..................................... 120 min.

85ºC ..................................... 5 min.

4ºC ....................................... ∞

Tabla 3.8. Condiciones de los ciclos térmicos

3.2.11.2. Amplificación cuantitativa del RNA (RT-PCR en

tiempo real)

Una vez sintetizado el cDNA (mediante la RT) lo amplificamos por medio de la

reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés,

Polymerase Chain Reaction, técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary

Mullis (Mullis K, 1986), que permite amplificar de forma selectiva secuencias

específicas de DNA.

Basada en la PCR, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo

real (RT-PCR) permitió posteriormente la cuantificación de ácidos nucleicos con gran

exactitud y fiabilidad.

El método de PCR está basado en la síntesis de una hebra complementaria de

DNA, utilizando una cadena simple como molde. La PCR utiliza dos fragmentos cortos

de DNA (oligonucleótidos) como primers de la síntesis. Estos primers se unen

específicamente a secuencias que flanquean la región a amplificar, uno en cada una de

las cadenas del DNA.

Los requerimientos de la reacción son deoxinucleótidos (dNTPs) que

proporcionan tanto la energía como las unidades de la síntesis, una polimerasa de DNA,

primers, el DNA molde y un tampón que contenga magnesio.


133

El proceso básico se desarrolla en tres pasos que se repiten sucesivas veces,

según el gen a amplificar:

- Desnaturalización: separación de las cadenas complementarias del DNA.

- Unión o annealing: unión de los primers específicos a sus secuencias

complementarias. La temperatura de unión es característica de cada pareja de

primers.

- Extensión: síntesis de la hebra complementaria a partir del primer respectivo.

La repetición de este ciclo un determinado número de veces produce un aumento

exponencial de la cantidad de la región diana del DNA, que viene dado por la expresión

2n (siendo n el número de ciclos) hasta que se llega a un punto en que disminuye la

eficiencia de la enzima, y la reacción deja de ser exponencial.

a) Fundamento RT-PCR

La RT-PCR se basa en la detección y cuantificación simultánea de la

fluorescencia emitida por los productos de PCR que se acumulan durante el proceso de

amplificación. Es decir, permite ver y analizar a tiempo real la amplificación del DNA

molde.

Es actualmente el método más sensible y exacto para la detección de niveles de

mRNA, tanto en células como en tejido.

La sustancia fluorescente utilizada en nuestros experimentos es SYBR Green, el

cual se une preferentemente al DNA de doble cadena recién sintetizado en cada ciclo y

emite una fluorescencia proporcional a la concentración de DNA. La fluorescencia de

cada tubo se mide en cada ciclo, y la señal aparece claramente a partir de un número

determinado de ciclos, dependiendo de la concentración de partida. La señal es medible

por espectrofotómetro cuando sobrepasa el valor de detección límite del aparato, es

decir, cuando sobrepasa el ruido de fondo. A partir de este momento se dobla de ciclo

en ciclo.

En el caso de la PCR cuantitativa, el parámetro de medida de la expresión de un

determinado gen no es la fluorescencia, sino el ciclo en el que la amplificación

comienza a ser exponencial. Este ciclo se denomina ciclo umbral (thresold cycle, Ct),


134

pues es a partir del cual la amplificación empieza a ser realmente apreciable. De este

modo, los valores de ciclo umbral decrecerán linealmente conforme aumenta la cantidad

de cDNA de partida, puesto que cuanto más copias de mRNA de partida del gen

estudiado haya más cDNA se obtendrá en la retrotranscripción, y antes comenzará la

amplificación a ser exponencial.

Figura 3.3 Modelo de amplificación de PCR a tiempo real

Así pues, realizando una curva estándar de cantidades de mRNA de partida

conocidas, este método permite la cuantificación relativa de la expresión de un gen en

función de la expresión de un gen de expresión constitutiva, es decir, que no varía según

diferentes condiciones. La cuantificación absoluta supone el conocimiento del número

exacto de copias de mRNA de partida empleado para la realización de la curva estándar.

Otro método para determinar la expresión a partir de las curvas de amplificación

obtenidas consiste en la comparación de Ct. Como hemos señalado, cuanto más mRNA

de partida hay, menor es el Ct. obtenido. Este método se asemeja al método de la curva

estándar, pero utiliza fórmulas aritméticas cuya resolución conduce a la cuantificación

relativa de la expresión de un determinado gen.

b) Primers:

Los primers, u oligonucleótidos, utilizados para la amplificación de fragmentos

específicos de los genes se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific GmbH (Ulm,

Alemania). Los primers específicos usados en nuestros experimentos se muestran en la

tabla3.9.


135

Primers sentido Primers antisentido

Rata

MAFbx 5’- GCCTGAACTACGATGTTGCAG - 3’ 3’- GCTGGTCTTCAAGAACTTTC - 5’

MuRF1 5’- AGGTGCCTACTTGCTCCTTGT - 3’ 3’ - GCTGTTTCCACAAGCTTGGTC - 5’

Cyclophilin 5’- GTGGCAAGTCCATCTACGGAG - 3’ 3’- CCACAGTCGGAGATGGTGATC-5’

Ratón

MAFbx 5’ - GCAAACACTGCCACATTCTCTC - 3’ 5’ - CTTGAGGGGAAAGTGAGACG - 3’

MuRF1 5’ - ACCTGCTGGTGGAAAACATC - 3’ 3’ – CTTCGTGTTCCTTGCACATC -5’

Cbl-b 5’-GAGCCTCGCAGGACTATGAC-3’ 5’-CTGGCCACTTCCACGTTATT-3’

Cyclophilin 5’- AGCATGTGGTCTTTGGGAAGGTG -3’ 3’ – CTTCTTGCTGGTCTTGCCATTCC – 5’

Tabla3.9. Secuencia de los primers utilizados en la RT-PCR

c) Procedimiento

La PCR en tiempo real se realizó con el sistema de detección 7900HT Fast Real-

Time PCR System (Applied Biosystems), por duplicado en un volumen total de

reacción de 20 μL y con los pertinentes controles negativos (uno sin cDNA y otro sin

enzima Transcriptasa) con el kit Maxima™ SYBR green/ROX qPCR Master Mix

(Fermentas, Madrid, España).

Ajustamos los volúmenes de la reacción inicialmente propuestos por el kit (25

µL) a un volumen final de 20 µL, puesto que nuestro sistema lo recomienda.

Maxima SYBER Green/ROX qPCR Master Mix (2X) .......................... 10 µL

Primer sentido ......................................................................................... 0.3 µM

Primer antisentido ................................................................................... 0.3 µM

DNA molde ............................................................................................ 1 µL (≤500 ng)

Agua libre de RNAasas ........................................................................... Hasta 20 µL

Tabla 3.10. Volúmenes, por muestra, de la reacción.

d) Condiciones de amplificación

Usamos el diseño general de la placa, en el software SDS2.4 en un monitor

conectado al sistema de detección 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied

Biosystems) y programamos el termociclador con perfil térmico característico de los

primers usados. Al final de cada reacción, se realizó un análisis de la curva de fusión

para confirmar que sólo los productos específicos fueron amplificados.


136

El protocolo de ciclado térmico fue el mostrado en la tabla 3.9.

Paso Tiempo Temperatura Nº de ciclos

Desnaturalización

inicial 10 minutos 95ºC 1

Desnaturalización 10 segundos 95ºC 40ciclos

Unión/Extensión 60 segundos 60ºC

Curva de fusión 15 segundos 95ºC

1 15 segundos 60ºC

Tabla 3.11. Condiciones del termociclador para la RT-PCR

e) Cálculos

El ciclo umbral (Ct) se convirtió en una expresión génica relativa mediante el

uso de una curva estándar construida de muestras agrupadas. Para cada muestra, la

expresión del gen diana se normalizó con el contenido de mRNA de ciclofilina.

La fórmula logarítmica utilizada para transformar los valores de Ct tanto para los

genes estudiados y el control endógeno fue:

𝐸𝑥𝑝𝑜 =(𝐶𝑡 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜)

𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

Para que las eficiencias sean similares, las pendientes de ambas rectas deben ser

similares, puesto que la eficiencia de la reacción de amplificación viene dada por la

siguiente ecuación:

Eficiencia = [10(-1/pendiente)] – 1

Para una pendiente de –3.322 obtenemos una eficiencia del 100%, lo cual

significa que el aumento de un ciclo de amplificación durante la fase exponencial de la

reacción supone exactamente la duplicación del material amplificado. Una reacción de

amplificación debe tener una eficiencia lo más cercana al 100% para estar optimizada.


137

3.2.12. Determinación de la concentración plasmática de glucosa

mediante el método de Trinder

La cuantificación de glucosa se llevó a cabo empleando un kit enzimático de la

casa comercial Biolabo®, que utiliza el método de la glucosa oxidasa modificada por

Trinder (Trinder, 1969) para medir su concentración plasmática.

Este método está basado en la capacidad de la Glucosa Oxidasa (GOD) para

catalizar la oxidación de la glucosa a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno (H2O2).

Glucosa + O2

+ H2O Ac. Glucónico + H

2O

2

El peróxido de hidrógeno liberado, en presencia de Peroxidasa (POD), reacciona

con el cloro-4-fenol y 4-Amino-antipirina (PAP), por la reacción de Trinder, para

formar un complejo de quinoneimina roja, que absorbe entre a 500 nm.

H2O

2 + PAP + Fenol Quinona+ 4 H

2O

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa

presente en la muestra; es, por tanto, un método colorimétrico.

a) Reactivos

Vial R1: Reactivo de trabajo

Tampón fosfato ...................................... 150 mmol/L

Glucosa oxidasa (GOD) ..................... ≥20 000 UI/L

Peroxidasa (POD)................................ ≥1000 UI/L

4-Amino-antipirina (PAP) .................. 0.8 mmol/L

Cloro-4-fenol ....................................... 2 mmol/L

Vial R2: Estándar

Glucosa ................................................ 100 mg/dL (5.6 mmol/L)

b) Muestras

Las muestras utilizadas fueron de plasma recogidas en tubos de EDTA.

GO

D

POD


138

c) Procedimiento

El primer paso para las determinaciones de glucosa fue pipetear en tubos

eppendorf marcados como: blanco, estándar y muestras 10 μL de agua Milli-Q, 10 μL

de estándar de glucosa y 10 μL de cada una de las muestras de plasma respectivamente,

posteriormente se les añadió a cada uno de los tubos 1 mL del reactivo. La mezcla

resultante se vorteó y se incubó durante 10 minutos en un bloque de baño seco a 37ºC.

La absorbancia de la mezcla resultante se leyó en el espectrofotómetro a 500 nm

(ver tabla 3.12).

Blanco Estándar Muestra

Reactivo 1 mL 1 mL 1 mL

Agua Milli-Q 10 μL - -

Estándar - 10 μL

Muestra - - 10 μL

Incubar 10 minutos a 37ºC ó 20 monitos a temperatura ambiente

Leer las absorbancias a 500 nm contra el blanco del reactivo

La coloración es estable 15-20 minutos a 37ºC, y luego decrece lentamente

Tabla 3.12. Volúmenes, para cada una de las condiciones, de la reacción.

d) Cálculos

Los valores de glucosa se obtuvieron por comparación de absorbancias con el

estándar de glucosa de 100 mg/dL, según la siguiente fórmula:

Resultado = x concentración del estándar

Previamente se realizó el promedio de las lecturas duplicadas para cada

estándar y la muestra y se restó la media de la densidad óptica estándar cero.

Abs (Muestra)

Abs (Estándar)


139

3.2.13. Determinación de la actividad de NF-кBp65 en extractos

nucleares de músculo sóleo.

a) Fundamento del ELISA

La unión de NF-кB al ADN se determinó por un kit de ELISA (TransAM,

Active Motif). Esta técnica es una alternativa a la técnica de retardo en gel. Tiene la

ventaja de ser más sensible y no requieren el uso de radioisótopos. El kit contiene una

placa de 96 pocillos revestida con oligonucleótidos que contienen la secuencia de

consenso de NF-кBp65. La forma activa de NF-кB de cada una de las muestras

introducidas en cada pocillo se une específicamente a este oligonucleótido.

Seguidamente se añade un anticuerpo primario para reconocer el apítopo de NF-кB p65

sólo cuando está unido al ADN. Posteriormente se añade un anticuerpo secundario

marcado con HRP que proporciona una señal quimioluminiscente medible y

proporcional a la actividad de NF-кBp65.

b) Reactivos o componentes del kit

- Placa de ensayo de 96 pocillos.

- Anticuerpo NF-кBp65.

- Anticuerpo de HRP conjugado anti-conejo.

- Oligonucleótido wild-type AM20.

- Oligonucleótido mutado AM20.

- Control positivo de extracto nuclear.

- Dithiothreitol (DTT) (1M).

- Coctel inhibidor de proteasas.

- DNA de esperma de arenque.

- Tampón de lisado.


140

- Tampón de lavado concentrado (20x).

- Tampón de unión AM3.

- Tampón de unión de los anticuerpos AM2.

- Solución de revelado.

- Tampón de reacción.

- Reactivo quimioluminiscente.

- Solución de parada.

- Sellador de placas.

c) Protocolo de homogeneización

El protocolo para realizar los homogenados y separar los extractos nucleares

utilizados en este análisis se han detallado anteriormente en el apartado 3.2.4.

d) Procedimiento

Antes de iniciar el protocolo se debe reconstituir los diferentes tampones:

1.- El tampón de lisis (22.5 µL / pocillo).

- 0.11 µL de DTT.

- 0.23 µL de cóctel inhibidor proteasas.

- 22.2 µL de tampón de lisis AM2.

2.- Tampón de unión (33.8 µL / pocillo).

- 0.07 µL de DTT.

- 0.34 µL de ADN de esperma de arenque.

- 33.4 µL de tampón de unión AM3.

3.- Tampón de lavado 1X (2.025 mL / pocillo).

- 2.025 ml de agua Milli-Q.

- 225 µL de tampón de lavado 10X.


141

4.-Tampón de unión de los anticuerpos 1X (175 µL / pocillo).

- 202.5 µL de agua Milli-Q.

- 22.5 µL de tampón de unión de los anticuerpos 10X.

- 50 µL de anticuerpo primario o secundario.

5.-Solución quimioluminiscente (56.2 µL / pocillo).

- 37,5 µL de tampón de reacción.

- 18.7 µL reactivo quimioluminiscente.

6.- Realizar una recta patrón de rango entre 0.5 y 0 ng / µL de NF-кB p65 a

partir de una solución de 100 ng / µL, realizando as diluciones pertinentes para

obtener: 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312, 0.0156 y 0.008 ng / µL con el tampón

de lisis.

Siguiendo las instrucciones del fabricante se realizaron los pasos descritos a

continuación (Tabla 3.13).

El primer paso fue la unión a la secuencia consenso de NF-кB, para ello se

añadió a cada pocillo 30 µL de tampón de unión, posteriormente se añadieron 20 µL de

la recta patrón en los pocillos correspondientes y 20 µL de tampón de lisis en los

pocillos que marcan el blanco. Así mismo, en los pocillos correspondientes a las

muestras se añadió 20 mg del extracto nuclear en una solución de 20 µL (Ver tabla

3.13).

Se cubrió la placa con un sellador de placas y se incubó durante una hora a

temperatura ambiente sobre una plataforma giratoria a 100x rpm. Finalizado el periodo

de incubación se procedió a lavar 3 veces con 200 µL de tampón de lavado en el lavador

automático de placas ELISA (Hydroflex, TECAN).

Seguidamente se procedió a la fijación de los anticuerpos primario y secundario.

Se añadieron 100 µL de tampón que contenía el anticuerpo primario y se incubó 1 hora

a temperatura ambiente sin agitación. Después se realizaron 3 lavados con 200 µL de

tampón de lavado.

Posteriormente se añadieron 100 µL de tampón que contenía el anticuerpo

secundario conjugado con HRP y se incubó 1 hora a temperatura ambiente sin

agitación. Durante este paso preparamos la solución quimioluminiscente, para


142

mantenerla a temperatura ambiente hasta el revelado. Pasada la hora de incubación se

realizaron 4 lavados con 200 µL de tampón de lavado.

Y finalmente, se realizó el revelado añadiendo 100 µL de solución

quimioluminiscente a cada pocillo y se incubaron durante 3 minutos. Finalmente se

añadieron 100 µL de solución de parado y se leyó la absorbancia a una longitud

longitud de onda de 450 nm en el lector de placas Spectra Max plus 284 (Molecular

Devices) acoplado a un ordenador con el software SoftMax Pro 4.3 LS (Molecular

Devices).

PROTOCOLO DEL INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO

Blanco Control positivo Muestra/Estándar

Tampón de unión 30 µL 30 µL 30 µL

Tampón de lisis 20 µL - -

Muestra/estándar - - 20 µL

Control positivo - 20 µL -

Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 1 hora

Tampón de lavado Lavar la placa 3 veces con 200 μL

Anticuerpo

primario 100 μL 100 μL 100 μL

Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 1 hora

Lavar la placa 3 veces con 200 μL

HRP conjugado 100 μL 100 μL 100 μL

Incubar la placa a temperatura ambiente 1 hora


Solución

quimioluminiscente 100 μL 100 μL 100 μL

Incubar la placa a temperatura ambiente 3 minutos

Solución de parada 100 μL 100 μL 100 μL

Leer la placa a una longitud de onda de 450 nm



143

d) Cálculos

Los datos obtenidos tras la lectura en el Microplate Spectrophotometer se

determinaron interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones

conocidas. Los valores se expresaron como pg/mg de proteína. Previamente se realizó el

promedio de las lecturas duplicadas para cada estándar y la muestra y se restó la media

de la densidad óptica estándar cero.

3.2.14. Determinación de las concentraciones plasmáticas de 6-

keto prostaglandinas F1α


La técnica del ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) se basa en el

uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados

resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. El kit de la marca

comercial Cayman Chemical está basado en un ELISA competitivo, donde el

componente marcado es el antígeno. En este caso el antígeno marcado con una enzima

queda insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) cuando se une al anticuerpo.

La reacción antígeno anticuerpo es fácilmente revelada mediante la adición del

substrato específico cuya reacción con la enzima producirá un color observable y

cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro. El principio del ensayo se

resume en la figura 3.4.

Figura 3.4. Etapas del ELISA.


144

La enzima utilizada en el ensayo es la acetilcolinesterasa (AChE). Los ensayos

están basados en la competición entre el antígeno de la muestra y el antígeno conjugado

con la AChE (antígeno-tracer). Como la concentración del antígeno-tracer es constante,

y la del antígeno de la muestra varía, la densidad óptica medida será inversamente

proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra, ya que a mayor

concentración de antígeno en la muestra será menor la cantidad de antígeno-tracer con

AChE que se una al anticuerpo.

Absorbancia ∝[antígeno-tracer unido] ∝[1/antígeno]

Donde el antígeno en este caso es 6-keto PGF1α

La bioquímica de la AChE se basa en la hidrólisis de la acetilcolina a tiocolina,

la cual por una reacción no enzimática convierte el ácido 5.5-ditiobis-2-nitrobenzoico en

ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, compuesto que presenta una fuerte absorbancia a 410 nm.

La determinación de PGl2 fue realizada siguiendo las instrucciones del kit de

enzimo-inmunoensayo 6-ketoProstaglandin F1α EIA Kit (Cayman Chemical).


- Placa de Elisa con anticuerpo anti-conejo y bloqueados con proteína.

- Antisuero 6-keto Prostaglandin F1α EIA.

- 6-keto Prostaglandin F1α AChE Tracer.

- 6-keto Prostaglandin F1α EIA estándar.

- Tampón EIA concentrado (10x).


- Polisorbato 20.

- Ellman’s Reagent.

- Marcador EIA tracer.

- Marcador antisuero EIA.


145

c) Procedimiento


1.- Para la preparación del Tampón EIA concentrado (10x) disolver el vial en 90

mL de agua Milli-Q.

2.- El tampón de lavado concentrado (400x) se diluyó en 2 L de agua Milli-Q y 1

mL de polisorbato 20.

3.- Reconstituir el vial de 6-ketoProstaglandin F1α EIA estándar (100 ng/mL)

con el Tampón EIA ya reconstituido y, a partir de este, preparar la curva patrón

con concentraciones (pg/mL) que indica el kit (1000 pg/mL, 400 pg/mL, 160

pg/mL, 64 pg/mL, 25.6 pg/mL, 10.2 pg/mL, 4.1 pg/mL y 1.6 pg/mL).

4.- Reconstituir el 6-ketoProstaglandin F1α AChE Tracer con 6 mL de Tampón

EIA ya reconstituido.

5.- Reconstituir el Antisuero 6-ketoProstaglandin F1α EIA con 6 mL de Tampón

EIA ya reconstituido.

Las muestras utilizadas fueron de plasma recogido en tubos de EDTA, cada una

ellas se midió por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante, por lo que se

realizaron los pasos descritos a continuación (Tabla 3.14).

Se añadió a cada pocillo: 50 µL de antisuero, 50 µL de antígeno-tracer y 50 µL

de muestra con el antígeno problema o con la curva de calibrado con concentraciones de

antígeno conocidas (6-ketoProstaglandin F1α EIA estándar). Paralelamente se reservó

una fila de pocillos para realizar los blancos correspondientes, así mismo se añadió 100

µL y 50 µL de tampón EIA a los pocillos de unión no específica (NSB) y de máxima

unión (Bo) respectivamente

Una vez completada la placa se incubó durante 18 horas a 4ºC.


146

Antes de proceder al lavado de la placa hay que reconstituir el Ellman’s

Reagent, compuesto por la acetilcolina y el ácido 5.5-ditiobis-2-nitrobenzoico, con 20

mL de agua Milli-Q (hay que tener en cuenta que hay que usarlo el mismo día en que se

reconstituye y que hay que protegerlo de la luz cuando no se esté utilizando).

Una vez reconstituido el último reactivo, se lavó la placa 5 veces con el tampón

de lavado en el lavador automático de placas ELISA (Hydroflex, TECAN).

Posteriormente se añadieron 200 µL de Ellman’s Reagent a todos los pocillos, 5 µL de

Tracer a los pocillos de actividad total (TA) y se dejó incubar la placa 90 minutos en

oscuridad en un agitador orbital.

Finalmente se midió la absorbancia de la placa a λ= 420 nm en el lector de

placas Spectra Max plus 284 (Molecular Devices) acoplado a un ordenador con el

software SoftMax Pro 4.3 LS (Molecular Devices).


Blanco NSB Bo Muestra/Estándar TA

Tampón EIA - 100 µL 50 µL - -

Muestra/Estándar - - - 50 µL -

Tracer - 50 µL 50 µL 50 µL -

Antisuero - - 50 µL 50 µL -

Incubar la placa a 4oC, durante 18horas


Ellman’s Reagent 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL

Tracer - - - - 5 µL

Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 90 min.




147

d) Cálculos


determinaron interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones

conocidas. Los valores se expresarom como pg/mg de proteína. Previamente se realizó

el promedio de las lecturas duplicadas para cada estándar y la muestra y se restó la

media de la densidad óptica estándar cero.

3.2.15. Determinación de la concentración muscular de IL-6


El kit RayBio ratón IL-6 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) se

basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los

conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Este

inmunoensayo, concretamente, se usa para la determinación cuantitativa de IL-6 en

tejidos homogenados de ratón. Se emplea un anticuerpo específico para IL-6 de ratón

que recubre cada uno de los 96 pocillos de la placa. La IL-6 presente en los patrones o

recta estándar y las muestras se une al anticuerpo inmovilizado del fondo de los

pocillos. Posteriormente se añade el anticuerpo biotinilado de ratón, seguido de la

estreptavidina conjugada con HRP. Finalmente la reacción antígeno anticuerpo se revela

añadiendo una solución de sustrato TMB y se desarrolla el color cuya reacción

producirá un color observable y cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro a

450 nm.


- Placa de Elisa de 96 pocillos con anticuerpo anti-ratón de IL-6.


- 2 viales de IL-6 recombinante estándar de ratón.

- Tampón diluyente para las muestras (5x).

- Tampón diluyente del ensayo (5x).

- Anticuerpo biotinilado anti-ratón.


148

- Anticuerpo de estreptavidina conjugado con HRP (200x).

- Reactivo de sustrato TMB: 12 ml de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en

solución tamponada.

- Solución de parada 8 ml de ácido sulfúrico 0,2 M.

- Tampón de homogenado.

c) Protocolo de homogeneización

El protocolo para homogeneizar los músculos gastrocnemios y obtener los

extractos de proteínas totales utilizados en este análisis se han detallado anteriormente

en el apartado 3.2.5.

d) Procedimiento


1.- El tampón de lavado concentrado (20x) se diluyó 20 mL con agua Milli-Q

hasta obtener 400 mL.

2.- El tampón de dilución de las muestras y el tampón de dilución del ensayo se

diluyeron 5 veces con agua Milli-Q.

3.- Reconstituir el vial de IL-6 recombinante estándar agregando 640 μL de

tampón de dilución de muestras 1x para obtener una concentración de 50 ng/mL de IL-

6. Posteriormente se añadieron 8 μL de IL-6 reconstituida a 658.8 μL de tampón de

dilución de muestras en un epperdorf, obteniendo una concentración de 600 pg/mL

como punto de partida de los estándares de IL-6. Finalmente se prepararó la recta patrón

con concentraciones (pg/mL) que indica el kit (200 pg/mL, 66.7 pg/mL, 22.2 pg/mL,

7.4 pg/mL 2.5 pg/mL, 0.82 pg/mL y 0 pg/mL) diluyendo en tampón de dilución de

muestras.


149

4.-Reconstituir el anticuerpo biotinilado con 100 μl del diluyente de ensayo 1x,

para obtener una solución concentrada. El anticuerpo biotinilado concentrado se diluyó

80 veces con el tampón de dilución de ensayo 1x justo antes de ser utilizado en el

procedimiento del ensayo.

5.- La estreptavidina conjugada con HRP fue diluida 200 veces con tampón de

dilución de ensayo 1x.

Siguiendo con las instrucciones del fabricante se dejaron todos los reactivos y

las muestras a temperatura ambiente y se realizó el procedimiento descrito a

continuación (tabla 3.15). Inicialmente se añadió a cada pocillo correspondiente 100 µL

de muestra (usando aproximadamente 250 µg/mL de proteínas totales) o de curva

estándar, se cubrió la placa y se incubó durante 2 horas y media a temperatura ambiente

en un agitador orbital.

Finalizado el tiempo de incubación, se lavó la placa 4 veces con 300 µL de

tampón de lavado en el lavador automático de placas ELISA (Hydroflex, TECAN).

Posteriormente se añadieron 100 µL de anticuerpo biotinilados en todos los pocillos. Y

se volvió a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital.

Después, se realizaron 4 lavados como la vez anterior.

Seguidamente se añadieron 100 µL de estreptavidina conjugada con HRP y se

dejó incubar durante 45 minutos en un agitador orbital. Se volvió a realizar otro lavado

y se añadió 100 µL de reactivo de sustrato TMB y se incubó 30 minutos a en oscuridad

en un agitador orbital.

Finalmente se agregaron 50 µL de la solución de parada y se midió la

absorbancia de la placa a λ= 450 nm en el lector de placas Spectra Max plus 284

(Molecular Devices) acoplado a un ordenador con el software SoftMax Pro 4.3 LS

(Molecular Devices).


150


Muestra/Estándar Blanco

Muestra/Estándar 100 µL -

Tampón diluyente

para muestras - 100 µL

Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 2.5

horas.


Anticuerpo

Biotinilado 100 µL 100 µL

Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente 1 hora.


Estreptavidina

conjugada con HRP 100 µL 100 µL



TMB 100 µL 100 µL


Solución de parada 50 µL 50 µL



d) Cálculos


determinan interpolando la recta patrón o curva estándar realizada de concentraciones

conocidas. Los valores se relativizaron con la concentración de proteínas de los

extractos totales del musculo y se expresan como µg/mg proteína. Previamente se

realizó el promedio de las lecturas duplicadas para cada estándar y la muestra y se restó

la media de la densidad óptica estándar cero.


151

3.2.16. Determinación de las concentraciones plasmáticas de

insulina


Este inmunoensayo enzimático (EIA), de la marca SPI-Bio, se basa en la

competencia entre la insulina de rata no marcada y la acetilcolinesterasa (AChE)

vinculada a la insulina de rata (trazador).

El complejo anti-suero de cobaya-rata insulina (insulina libre o trazador) se

une al anticuerpo de cabra anti-cobaya que está unido a la placa.

La placa se lava a continuación y el reactivo de Ellman (sustrato enzimático

para la AChE y el cromógeno) se añade a los pocillos.

El trazador AChE actúa sobre el reactivo de Ellman para formar un

compuesto de color amarillo. La intensidad del color, que se determina por

espectrofotometría, es proporcional a la cantidad de trazador unido a la placa y es

inversamente proporcional a la cantidad de insulina de rata presente en el pocillo

durante la incubación inmunológica. El principio del ensayo se resume en la figura 3.5.

Figura 3.5. Etapas del ELISA


152


- Una placa de 96 pocillos de microtitulación, pre-recubiertos con IgG de cabra

anti-cobaya, listo para ser utilizado después de la descongelación.

- Un vial de trazador de insulina de rata, liofilizado.

- Dos viales de estándar de insulina de rata, liofilizados.

- Un vial de antisuero de insulina de rata, liofilizado.

- Un vial de tampón de EIA, liofilizado.

- Un vial de tampón de lavado concentrado, líquido.

- Un vial de Tween 20, líquido.

- Dos viales de muestra de control de calidad, liofilizados.

- Dos viales de reactivo de Ellman, liofilizados.

- Una hoja de cubierta.

c) Procedimiento


1.- EIA búfer: Reconstituir un vial con 50 mL de agua Milli-Q y mezclar por

inversión.

2.- Estándar insulina de rata: Reconstituir el vial con 1 mL de agua Milli-Q.

Mezclar bien mediante inversión suave. La concentración de la primera muestra

estándar es 10 ng / mL. Preparar siete tubos eppendorf (para las siete diluciones

del estándar) y añadir 500 µL de tampón EIA en cada tubo. Realizar las

diluciones pertinentes para obtener las concentraciones de la recta estándar

siguientes: 10 (S1), 5 (S2), 2.5 (S3), 1.25 (S4), 0.63 (S5), 0.31 (S6), 0.16 (S7) y

0.08 ng / mL (S8).


153

3.- Control de Calidad: Reconstituir un vial con 1 mL de agua Milli-Q. Mezclar

por inversión suave.

4.-Trazador de insulina de rata-AChE: Reconstituir un vial con 5 mL de tampón

de EIA. Mezclar mediante inversión suave.

5.- Antisuero de insulina de rata: Reconstituir un vial con 5 mL de tampón de

EIA. Mezclar mediante inversión suave.

6.-El tampón de lavado: Diluir 1 mL de solución de lavado concentrado a 400

mL con agua Milli-Q. Añadir 200µL de Tween 20 (Utilizar un agitador

magnético para mezclar los contenidos).

7.- Reactivo de Ellman: Cinco minutos antes de su uso, reconstituir con 50 mL

de agua Milli-Q. El contenido del tubo debe mezclarse ser completamente.

Mantener en oscuridad.

Las muestras utilizadas fueron de plasma recogido en tubos de EDTA, cada una

ellas se midió por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante, por lo que se

realizaron los pasos descritos a continuación (Tabla 3.16).

El primer paso fue enjuagar cada pocillo cinco veces con el tampón de lavado

(300 µl / pocillo). Justo antes de la distribución de reactivos y muestras, se eliminó el

tampón de los pocillos invirtiendo la placa y sacudiendo las últimas gotas.

Seguidamente, y después de que los reactivos habiesen alcanzado la temperatura

ambiente, se procedió a distribuir los reactivos y las muestras en la placa. La primera

columna de dejó vacía para el blanco del reactivo de Ellman.

Se depositaron 100 µL de EIA buffer en los pocillos de unión no específica

(NSB) y 50 µL en los de máxima unión (Bo).

Seguidamente se dispensaron 50 µL de cada una de las ocho diluciones de la

curva estándar (S1 a S8) en los pocillos correspondientes. El siguiente paso fue pipetear

50 µL de los controles de calidad y de las muestras en sus pocillos.


154

Finalmente de dispensaron 50 µL de trazador AChE de rata en todos los

pocillos, excepto en los pocillos del blanco (B) y 50 µL de antisuero de insulina de rata

en todos los pocillos, excepto en los pocillos del B y NSB.

Una vez distribuidos los anticuerpos en la placa se cubrió y se incubó durante 18

horas a 4°C.

Pasado el tiempo de incubación se reconstituyó el tampón de lavado y el reactivo

de Ellman y se vació la placa y se procedió a realizar 5 lavados con 300 µL/pocillo de

tampón de lavado.

Rápidamente se dispensaron 200 µL de reactivo de Ellman a los 96 pocillos y se

incubó la placa en oscuridad a temperatura ambiente en un agitador orbital.

La placa se leyó a 405 y 414 nm, cuando la máxima unión en los pocillos (Bo)

alcanzó una absorbancia de 0.2-0.8 unidades.


Blanco NSB Bo Muestra/Estándar

Tampón EIA - 100 µL 50 µL -

Muestra/Estándar - - - 50 µL

Trazador - 50 µL 50 µL 50 µL

Antisuero - - 50 µL 50 µL

Incubar la placa a 4oC, durante 18horas


Tampón de Ellman 200 µL 200 µL 200 µL 200 µL

Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente

en oscuridad.

Leer la placa a una longitud de onda de entre 405 y 414 nm


d) Cálculos



conocidas.


155

3.2.17. Determinación de las concentraciones plasmáticas de

fructosamina


Para la determinación cuantitativa de la concentración de fructosamina en

plasma de las ratas diabéticas se utilizó el kit de la casa comercial MyBioSource anti-

fructosamina.

Este ensayo emplea la técnica de inmunoensayo enzimático cuantitativo. El kit

contiene una placa de 96 pocillos revestida con el anticuerpo específico para la

fructosamina; en los que se pipetearán las muestras y los estándares, momento en el que

la fructosamina presente en las muestras y patrones se unirán al anticuerpo inmovilizado

de la placa.

Después de la eliminación de las sustancias no unidas, se añade un anticuerpo

específico conjugado con biotina a los pocillos. Después del lavado, se añadió avidina

conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) a los pocillos.

Después de un lavado para eliminar cualquier reactivo de avidina-enzima no unido, se

añade una solución de sustrato a los pocillos y se desarrolla el color en proporción a la

cantidad de fructosamina unida en el paso inicial. El desarrollo del color se detiene y se

mide la intensidad del color.

El rango de detección del kit es entre 31,25 nmol/mL - 2000 nmol/mL.


- Placa de ensayo.

- Estándar (secado por congelación).

- Biotina-anticuerpo (100 x concentrado).

- HRP-avidina (100 x concentrado).

- Diluyente de biotina-anticuerpo.

- Diluyente de avidina-HRP.

- Diluyente de Muestra.


156

- Tampón de lavado (25 x concentrado).

- Sustrato TMB.

- Solución de parada.

c) Procedimiento


1.- Anticuerpo de Biotina (1x): Centrifugar el vial antes de abrirlo.

El anticuerpo de Biotina requiere una dilución de 100 veces. Por lo que se

añadió 10 μL de anticuerpo de biotina a 990 µL de diluyente de anticuerpo de

biotina.

2.- HRP- Avidina (1x): Centrifugar el vial antes de abrirlo.

La avidina-HRP requiere una dilución de 100 veces. Ser añadió 10 μL de

avidina-HRP a 990 µL de diluyente de avidina - HRP.

3. Buffer de lavado (1x): Atemperar a temperatura ambiente y mezclar

suavemente hasta que los cristales se han disuelto completamente. Diluir 20 mL

de Buffer de Lavado Concentrado (25x) en agua Milli-Q para preparar 500 mL

de tampón de lavado (1x).

4. -Estándar: Centrifugar el vial estándar en 6000 – 10000x rpm durante 30

segundos. Reconstituir el estándar con 1.0 mL de disolvente de muestras. Esta

reconstitución produce una solución madre de 2.000 nmol / mL. Mezclar durante

un mínimo de 15 minutos con agitación suave antes de hacer diluciones.

Pipetear 250 µL de diluyente de la muestra en cada tubo (S0 -S6). Utilizar la

solución madre para producir una serie de diluciones ½, para obtener las

concentraciones de 2000, 1000, 500, 250, 125,62.5, 31.25 nmol/mL. El diluyente

de muestra sirve como el patrón cero (0 nmol / mL).


157

Las muestras utilizadas fueron de plasma recogido en tubos de EDTA. Para el

ensayo se realizó una dilución de las mismas de 1/5 con el diluyente de muestras. Cada

una de las muestras se midió por duplicado siguiendo las instrucciones del fabricante,

por lo que se realizaron los pasos descritos a continuación (Tabla 3.17).

Antes de iniciar el ensayo hay que dejar todos reactivos y muestras a

temperatura ambiente, así como centrifugar la muestra de nuevo después de la

descongelación antes del ensayo.

El primer paso realizado fue añadir 100 μL del estándar y la muestra por pocillo.

Se cubrió la placa y se incubó durante 2 horas a 37°C. Pasado el tiempo de incubación

se eliminó el líquido de los pocillos, sin proceder a lavarlos.

Seguidamente se añadió 100 μL de anticuerpo de biotina (1x) a cada pocillo. Se

volvió a cubrir la placa y se incubó durante 1 hora a 37°C.

Se volvió a aspirar cada uno de los pocillos, se realizaron 3 lavados con 200 μL

de tampón de lavado y se dejó reposar la placa durante 2 minutos.

El siguiente paso fue añadir 100 μL de avidina-HRP (1x) a cada pocillo. Se

volvió a cubrir la placa y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación se

realizaron 5 lavados con 200 μL de tampón de lavado y se añadieron 90 μL de sustrato

TMB a cada pocillo. Y se volvió a incubar durante 15-30 minutos a 37°C en oscuridad.

Finalmenre se añadieron 50 μL de solución de parada a cada pocillo, se mezcló

bien y se determinó la densidad óptica de cada pocillo pasados 5 minutos, utilizando un

lector de microplacas ajustado a 450 nm. Después se volvió a medir a 540 nm y se

restaron estas lecturas a las de 450 nm para corregir las imperfecciones ópticas en la

placa, ya que las lecturas realizadas directamente a 450 nm sin corrección pueden ser

mayores y menos precisas.


158


Muestra/Estándar

Muestra/Estándar 200 µL

Desechar el líquido de cada uno de los pocillos

Anticuerpo Biotina(1x) 100 µL

Tampón de lavado Lavar la placa 3 veces con 200 µL

Avidina-HRP(1x) 100 µL


Incubar la placa 1 hora a 37ºC

Sustrato TMB 90 µL

Incubar la placa 15-30 min. A 37ºC en oscuridad

Solución de parada 50 µL

Esperar 5 minutos




d) Cálculos



conocidas. Previamente se realizó el promedio de las lecturas duplicadas para cada

estándar y la muestra y se restó la media de la densidad óptica estándar cero.

3.2.18. Inclusión de muestras para el estudio histológico

El análisis histológico se realizó sobre muestras de tejido de músculo esquelético

fijadas, por inmersión, en formaldehído al 4 % para mantener las estructuras celulares y

moleculares.

Tras la fijación se procedió a incluir el músculo sóleo en parafina para

posteriormente obtener secciones. La parafina es una mezcla de hidrocarburos

saturados, sólida a temperatura ambiente y con un punto de fusión entre en torno a los


159

60°C, según su composición. La parafina no es miscible con agua, mientras que todos

los tejidos están formados principalmente por agua. Esto implica que para que la

parafina líquida pudiese penetrar completamente en el tejido el agua del músculo fue

sustituida por un solvente orgánico mediante la deshidratación del sóleo en etanol, de

gradación creciente hasta etanol de 100°. Posteriormente se procedió al aclaramiento,

donde se transfirió al xilol, miscible tanto con el etanol de 100° como con la parafina.

Por último se procedió a la inclusión del sóleo, al músculo se le realizaron tres

pases por parafina licuada para favorecer una buena impregnación. Tras el

embebimiento completo de la muestra se vertió parafina líquida en un molde, se

introdujo el sóleo en posición vertical para, que a la hora de cortar, poder obtener cortes

transversales del músculo, y se dejó solidificar mediante enfriamiento lento a

temperatura ambiente sobre una plataforma a unos 10º-15ºC.


160

El protocolo de inclusión en parafina fue el siguiente:

Figura 3.6. Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de sóleo previamente fijada.

Parafina líquida en molde Encastramiento del sóleo en vertical y enfriamiento

Estufa a 60ºC


161

3.2.19. Corte sobre bloque de parafina

Posteriormente se desbastaron los bloques y se dejaron en hielo para ser cortados

secciones de 5 micras en un microtomo de rotación. Para facilitar el estiramiento de las

secciones histológicas se colocaron sobre agua con etanol y finalmente por un baño de

agua caliente a 50ºC, gracias a las fuerzas de tensión superficial que se generan en la

lámina de parafina y el tejido al hacerla flotar sobre el líquido. Finalmente se colocaron

sobre portaobjetos con Poly-L-lisina.

Una vez montados los cortes sobre portaobjetos, y antes de iniciar su proceso de

coloración, las preparaciones son secadas meticulosamente para evitar su

desprendimiento. La desecación se realizó dejando las muestras en una estufa a 37ºC,

hasta el día siguiente.

3.2.20. Estudio de la atrofia muscular: Técnicas morfológicas e

inmunohistoquímicas

Para el estudio del tamaño del área de la sección transversal del sóleo de rata y

ratón se realizaron técnicas convencionales de morfología: Reticulina de Gomori y

Hematoxilina-Eosina, respectivamente; para el estudio del tamaño de las fibras tipo II

en rata se realizó la reacción del ácido periódico de Schiff (PAS); para el estudio del

tamaño de las fibras tipo I en ratón se realizó un estudio inmunohistoquímico utilizando

la técnica de la Avidina-biotina-peroxidasa con un anticuerpo primario de cadena

pesada de miosina de las fibras tipo I.

3.2.20.1. Tinción de Reticulina de Gomori

a) Fundamento

Se trata de una técnica de impregnación argéntica en dos tiempos que utiliza

como base fuerte el hidróxido potásico y como agente reductor el formol. Antes de la

impregnación se realiza una oxidación con permanganato potásico al 1% seguida de

blanqueamiento con metabisulfito potásico al 2% y un mordentaje con alumbre férrico

al 2%.


162

Se utilizan cortes en parafina, congelación o en celoidina.

b) Reactivos

- Solución acuosa de permanganato potásico al 1%.

- Solución acuosa de metabilsufato potásico al 2%.

- Solución acuosa de alumbre férrico al 2% preparada antes de usar.

- Complejo de plata amoniacal diluido, durante tiempo limitado, en un

volumen igual de agua destilada. Se toman 10 mL de una solución de nitrato

de plata al 10%, se añaden 2 mL de hidróxido potásico al 10%; el

precipitado que se forma se disuelve con amoníaco concentrado, después se

añade nitrato de plata hasta que empiece a formarse de nuevo el precipitado;

diluir con agua a partes iguales.

- Formol al 10%.

- Solución acuosa de hiposulfito al 2%.

c) Procedimiento

1. Desparafinar, no colodionar, hidratar.

2. Oxidar durante 1 ó 2 minutos con el permanganato potásico.

3. Lavar con agua corriente.

4. Blanquear con metabisulfito.

5. Lavar con abundante agua corriente.

6. Tratar con una solución de alumbre férrico durante 1 minuto.

7. Lavar con agua corriente durante 5 minutos.

8. Lavar dos veces con agua destilada.

9. Tratar durante un minuto con el complejo argéntico.

10. Lavar con agua destilada, como máximo 10 segundos.

11. Reducir con formol.

12. Lavar con agua corriente.


163

13. Pasar rápidamente por la solución de hiposulfito.

14. Lavar con abundante agua corriente.

15. Deshidratar y montar.

d) Resultados

- Fibras reticulares .......................................................... Negro

- Fibras colágenas ............................................................ Amarillento

Observaciones: El caso de un viraje con el oro, como el método Ramón y Cajal,

las fibras colágenas muestran una tonalidad más purpúrea.

Hay que resaltar que el resultado óptimo de este método depende del lavado que

precede a la reducción por el formol, debiendo determinarse empíricamente la duración

de este lavado.

3.2.20.2. Tinción de Hematoxilina-Eosina

a) Fundamento

Esta técnica tiñe en conjunto los tejidos, en concreto de matices rosados y rojos

que provoca la coloración de la eosina sobre el citoplasma y el tejido conjuntivo, a lo

que se une la excelente definición nuclear originada por la hematoxilina de teñidos de

tonos morados.

b) Reactivos

Hematoxilina de Harris

- Hematoxilina (cristalizada) ................................................. 1 g

- Etanol absoluto .................................................................... 10 mL

Disolver calentando suavemente:

- Alumbre de potasio o amónico ............................................ 20 g

- Agua Milli-Q ........................................................................ 200 mL


164

Disolver en caliente. Añadir la solución de hematoxilina y llevar a ebullición.

Cuando comienza a hervir se añade:

- Óxido rojo de mercurio ....................................................... 0.5 g

Dejar disolver el óxido removiendo lentamente hasta que la solución adquiera color

púrpura.

Sumergir inmediatamente en agua fría. Cuando la solución se haya enfriado, filtrar

y añadir:

- Ácido acético glacial ........................................................... 10 mL

Observaciones: Filtrar de nuevo antes de usarla. Almacenar en frasco opaco bien

cerrado.

Eosina

Disolver:

- Eosina Amarillenta .............................................................. 1 g

- Agua .................................................................................... 100 mL

Añadir:

- Ácido acético glacial ........................................................... 1 mL

Observaciones: Está comprobado que el empleo de agua corriente provoca una

coloración más profunda de las estructuras eosinófilas. En este caso debe añadirse a

la solución de eosina algunas gotas de formaldehído puro para garantizar la

conservación.

- Alcohol clorhídrico al 0.5 %

- Bicarbonato de sodio o de litio al 1%

- Agua acética

c) Procedimiento

1. Desparafinar e hidratar las secciones

2. (3 pases de 5 minutos por xiloles y 4 pases de 5 minutos por alcoholes)

3. Teñir con hematoxilina de 3 a 5 minutos


165

4. Lavar en agua corriente y diferenciar con alcohol clorhídrico al 0.5%

5. Neutralizar con Bicarbonato de sodio o carbonato de litio al 1%

6. Lavar abundantemente con agua corriente durante 5 minutos.

7. Lavar con agua Milli-Q y teñir con eosina durante 2-3 minutos.

8. Lavar en agua acética al 1%, lavar con agua Milli-Q.

9. Deshidratar en 3 pases de 5 minutos en alcoholes, aclarar con 3 pases de 5

minutos en xiloles

10. Cubrir con entelan.

d) Resultados

- Núcleos ................................................................................ Azul/negro

- Eritrocitos ............................................................................ Naranja a rosa

- Restantes estructuras ............................................................ Rosado a rojo

3.2.20.3. Reacción del ácido periódico de Schiff (PAS) (Hotchkiss,

McManus y Lille, 1948)

a) Fundamento

Esta tinción sirve para demostrar la presencia de glucógeno en las células, por

ello la utilizamos para teñir y medir las fibras tipo II caracterizadas por ser más

dependientes de la glucolisis anaerobia como fuente de energía que las de tipo I; por lo

que poseen una mayor actividad de las enzimas glucolíticas.

La técnica consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido periódico para

incrementar el número de los grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presentes en ellos,

de forma que puedan ser demostrado posteriormente mediante el reactivo de Schiff. Los

hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados en una

proporción aproximada de uno por molécula de monosacárido. Precisamente por ello es

necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos grupos, que sólo pueden ser

detectados por el reactivo de Schiff si se encuentran situados en carbonos contiguos y

delimitados por grupos alcohólicos o amino.


166

Para los grupos aldehídos que aparecen en posición 1.2 glicol estas condiciones

se cumplen exclusivamente tras la oxidación de los correspondientes radicales

hidroxilos.

El agente oxidante es generalmente el ácido periódico, aunque en alguna

variante puede utilizarse el ácido crómico.

Reactivo de Schiff:

Se obtiene a partir de la fucsina básica la cual es tratada con ácido sulfuroso, que

hace desaparecer un doble enlace existente en el centro de la molécula, lo que origina

que se trasmute a una sustancia incolora ácido sulfofucsínico o reactivo de Schiff.

Cuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehídicos contiguos

flanqueados por los correspondientes radicales OH, aparece de nuevo el doble enlace

(grupo cromóforo) y, con él, la coloración rojo fucsia característica.

Mediante estudios de espectrofotometría se ha podido concluir que, para un

correcto desarrollo de la reacción, es necesario que ambos grupos aldehídos se

encuentren a una distancia cifrada entre 1 y 1.1 nm, similar a la que separa a los dos

radicales bencénicos de la fucsina.

b) Reactivos

- Ácido periódico .................................................................... al 0.5%

- Reactivo de Shiff

Puede adquirirse comercialmente o fabricarse según el procedimiento:

- Fuscina básica ................................................ 1 g

- Agua Milli-Q ................................................... 200 mL

Llevar hasta ebullición el agua Milli-Q y añadir la fucsina. Disolver y enfriar a

50ºC, filtrar y añadir:

- Metabisulfato sódico anhidro ............................................... 1 g

Dejar en reposo 24 horas (la solución debe tomar un color rosa pálido) y filtrar

a través de carbón activado, lo cual debe decolorarla.

Almacenar en refrigerador.


167

- Baño de ácido sulfuroso

- Ácido clorhídrico 1N ...................................... 5 mL

- Metabisulfito sódico 10% ............................... 6 mL

- AguaMilli-Q .................................................... 100 mL

- Hematoxilina de Harris.

c) Procedimiento

1. Desparafinar e hidratar

2. Ácido periódico al 0.5%, 5 minutos

3. Lavado en agua Milli-Q.

4. Reactivo de Shiff, de 15 a 30 minutos.

5. Aclarar en tres cambios de baño sulfuroso, 2 minutos en cada uno.

6. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.

7. Hematoxilina da Harris, de 30 a 60 segundos.

8. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.

9. Deshidratar, aclarar y montar.

d) Resultados

- Núcleos ............................................................................. Azul

- Material PAS positivo ....................................................... Magenta (fucsina)

3.2.20.4. Estudio inmunohistoquímico

Las técnicas inmunohistoquímicas son técnicas de inmunolocalización que

utilizan una enzima como trazador del marcaje. Por este motivo, el lugar de la reacción

antígeno-anticuerpo se visualiza añadiendo al final de la reacción el sustrato de la

enzima más una sustancia denominada cromógeno. El producto originado al actuar la

enzima sobre el sustrato interacciona a su vez sobre el cromógeno y da lugar a un

precipitado insoluble y coloreado, al igual que ocurre en todas las reacciones

histoenzimológicas. Como trazadores pueden emplearse distintos tipos de enzimas.


168

En esta tesis en las secciones incluidas en parafina se realizó el estudio

inmunohistoquímico empleando la técnica de la Avidina-biotina-peroxidasa (ABC), con

algunas modificaciones. El anticuerpo utilizado ha sido de la cadena pesada de miosina

de las fibras tipo I (Tabla 3.18.).

Anticuerpo Dilución Tampón Pretratamiento Casa comercial

MHC I 1/4000 Citrato 1/10 Autoclave SIGMA

Tabla 3.18. Relación de anticuerpo primario.

a) Fundamento

La técnica de la Avidina-biotina-peroxidasa se trata de una serie de

procedimientos técnicos muy sensibles que utilizan anticuerpo marcados y se basan en

la gran afinidad que entre sí poseen las moléculas de biotina y las de avidina, de forma

que se genera un fuerte enlace no inmune.

Aunque tanto la avidina como la biotina pueden unirse a anticuerpos o

moléculas enzimáticas, es la biotina la que normalmente se conjuga con los primeros.

En todos los métodos inmunoenzimáticos que utilizan el procedimiento de

avidina y biotina para poner de manifiesto una reacción antígeno-anticuerpo, es posible

realizar el marcaje con biotina del anticuerpo primario (técnica directa) o, lo que es

mucho más habitual, del anticuerpo secundario (técnica indirecta).

La fase no inmunológica del proceso puede implicar:

a) Realizar una unión del anticuerpo biotinilado con avidina sin marcar para

ligar a continuación el complejo con una enzima también biotinilada (método puente

avidina-biotina).

b) Aplicar un complejo de avidina y trazador enzimático biotinilado que

contenga lugares de unión libres en la avidina para que se produzca la fijación sobre el

anticuerpo primario o secundario biotinilado (método de complejo avidina-biotina o

ABC, el cual ha sido utilizado en la presente tesis).

En todas las variantes puede unirse un gran número de moléculas de biotina a un

anticuerpo único, por lo que la proporción trazador/anticuerpo es muy elevada; esto

hace que la sensibilidad de este tipo de métodos sea muy alta y permite que el

anticuerpo primario pueda emplearse muy diluido.


169

b) El protocolo

1. Calentar los cortes en estufa (60ºC)

2. Desparafinar con xilol (3 pasos de 10 minutos)

3. Hidratar con alcoholes graduales (90º, 80º, 70º, 5 minutos cada pase).

Lavar con agua Milli-Q

4. Tratar con autoclave para producir el desenmascaramiento antigénico, en

tampón citrato (1/10) (Epitrope retrieval solution 10X) 3 minutos a 1.5 atm.

Dejar enfriar las muestras entre 20 y 40 minutos, por inmersión de la cubeta

en agua fría.

Lavar con agua Milli-Q.

5. Inhibir de la actividad peroxidasa endógena (metanol + H2O2 3%) 20

minutos en oscuridad.


6. Cerclar las preparaciones con sigmacote rodeando el corte, para la

retención de líquidos.

7. Cubrir los cortes con el anticuerpo primario diluido en diluyente

comercializado (DAKO Antibody Diluent Envision). Incubación una hora.

Lavar con agua Milli-Q

8. Cubrir los cortes con anticuerpo secundario universal biotinilado.

Incubación 20 minutos.


9. Cubrir los cortes con estreptavidina conjugada con peroxidasa, que tiene

avidez con la biotina. Incubación 20 minutos.


10. Revelar con diaminobenzidina tetrahidroclorhídrica (DAB) entre 1 y 5

minutos.

Lavar en agua Milli-Q.

11. Contrastar con hematoxilina de Harris, 30 segundos.


170

12. Lavar en agua corriente.

13. Deshidratar con alcoholes graduales (70º, 80º, 90º, pases de 5 minutos) y

xiloles (3 pases de 5 minutos)

14. Montar los cubreobjetos con entelan.

3.2.21. Valoración de los resultados histológicos

Los tejidos procesados se observaron en el fotomicroscopio óptico, LEICA

DMD 108. Para la medición del área transversal del sóleo en las muestras de rata se

capturaron imágenes al 4x (fotografías de 2048 x 1536 pixeles), en cambio para su

medición en las muestras de ratón solamente se requirió una fotografía.

Para medir el diámetro menor de las fibras tipo I en los sóleos de ratón se

capturó un barrido ordenado de imágenes al 20x de todo el corte transversal del sóleo

(fotografías de 2048 x 1536 pixeles).

Todas las fotografías se montaron con la función photomerge del programa

Adobe Photoshop, obteniendo una única imagen de 22-38 Megapixeles a 20x del corte

transversal del sóleo (ver figura 3.7.).

Figura 3.7. Esquema del montaje de la imagen del corte transversal del sóleo completo.


171

Finalmente el programa utilizado para cuantificar los resultados histológicos fue

el software Image Pro.Plus.6 de Media Cybernetics.

Figura 3.8. Imágenes de la medición del tamaño de las fibras tipo I.


172

3.3 Análisis estadístico de los resultados

Los resultados se expresan mediante la media aritmética y la desviación estándar

de la media (S.D.) del número de ensayos o determinaciones en cada experimento. La

normalidad de la distribución de las variables se analizó mediante el test de Normalidad.

Para la comparación de los distintos grupos experimentales se aplicó el método

de análisis de la varianza, mediante el test ANOVA de uno o dos factores. Cuando se

encontró un efecto en la interacción, la prueba post hoc Bonferroni’s fue realizada para

determinar donde se encontraban las diferencias significativas.

Los datos que no cumplieron con la distribución normal fueron analizados con la

prueba no paramétrica de un ANOVA de un factor de Rangos y las comparaciones se

realizaron con la prueba post hoc Fisher LSD o Turkey para identificar diferencias

significativas.

Los niveles de alfa para la significación estadística fueron p<0.05. Se utilizó el

programa Sigma Stat 3.5 para los análisis estadísticos.

RESULTS

Results

175

The results obtained during the development of this thesis are presented below

divided into four parts, which coincide with the experiments and the different groups of

animals described in the Materials and Methods section.

After each section it has been included a summary, in order to get an overview

and stand out the physiological relevance of the results presented.

4.1. Study No. 1: Effect of 14 days of hindlimb unloading in

skeletal muscle atrophy in male Wistar rats. Prevention by allopurinol.

As it has been described in the materials and methods sections, the experimental

groups used in the next study and their respective abbreviations are:

Control with water: CW

Control with allopurinol: CA

Hindlimb unloading with water: UW

Hindlimb unloading with allopurinol: UA

4.1.1. Allopurinol prevents soleus muscle atrophy after 14 days of hindlimb

unloading in rats.

We used different methods to determine the role of XO in the hindlimb

unloading-induced soleus muscle atrophy.

Hindlimb suspension for 14 days caused a significant decrease in the cross

sectional area of soleus muscle. Administration of allopurinol significantly prevented

this decrement (Figure 4.1, panels A and B).

In the same way, we found a significant decrease in the minimum diameter of

the type I muscle fibers. Allopurinol partially prevented this reduction in the size of the

individual myofibers (Figure 4.1, panels C and D).

Results

176

A

B

CW CA

UA UW

Results

177

Figure 4.1. (A) Reticulin staining (Original magnification, 4x. Scale bar, 1 mm). (C) Staining of periodic

acid-Schiff (type II fibers were deeply stained, while type I were lightly stained. Original magnification,

20x. Scale bar, 100.00 µm). Panel B and D represent the quantitative analyses of the cross-sectional area

and the minimum diameter of type I fibers in the soleus muscle of the different experimental groups: CW

(n = 3), CA (n = 3), UW (n = 3), and UA (n = 3). A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s

comparisons were used to identify statistically significant differences.

C

D

Results

178

Moreover, soleus muscle to body mass ratio was significantly reduced after 14

days of unloading (-49%, p<0.001). This muscle atrophy was reduced to only 30% in

the allopurinol treated animals (p<0.01 vs unloaded group with water). Allopurinol did

not affect soleus muscle mass in the control group (Figure 4.2, panel A). We further

tested the effect of inhibiting XO in the maintenance of muscle integrity by determining

the protein content of an important component of the sarcomere, the slow MHC protein.

Figure 4.2, panel B, shows that after unloading there was a significant decrease in the

protein content of MHC in soleus muscle. In this case we did not find a prevention after

treatment with allopurinol.

Figure 4.2. (A) Soleus muscle to body mass ratio. Values are mean (±SD) in CW (n = 9), CA (n = 9),

UW (n = 7), and UA (n = 7). (B) Western blot and densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin

heavy chain in soleus muscle of CW (n = 3), CA (n = 3), UW (n = 3), and UA (n = 3) groups in rats. A

two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant

differences.

A

B

Results

179

4.1.2. Hindlimb unloading increases plasma and soleus muscle XO activity.

Prevention by allopurinol.

Rat plasma (Figure 4.3A) and soleus muscle (Figure 4.3B) XO activity increased

significantly after 2 weeks of hindlimb unloading. As expected, treatment with

allopurinol completely inhibited XO activation both in plasma and in skeletal muscle.

Figure 4.3. Mean (±SD) results of XO activity in plasma (A) and soleus muscle (B) of CW (n=9), CA

(n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


A

Results

180

4.1.3. Effect of unloading and allopurinol administration on protein levels of

soleus muscle antioxidant enzymes.

Hindlimb unloading increased the protein levels of the cytosolic Cu,ZnSOD

(+43.9%) in the soleus muscle of the rats (Figure 4.4A). Catalase protein levels were

also elevated (+39%, p<0.01) in the soleus muscle of the unloaded animals (Figure

4.4B). Treatment with allopurinol did not prevent the unloading-induced increase of

these antioxidant enzymes.

Figure 4.4. Mean (±SD) results of Cu,ZnSOD (A) and Catalase (B) in soleus muscle of CW (n=9), CA

(n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


Results

181

4.1.4. Effect of unloading and allopurinol administration on plasma levels of

MDA.

Having established that there is a difference in the induction of the antioxidant

enzymes in the various groups studied, we determined whether these differences were

also translated into differences in oxidative damage to biomolecules such as lipids.

To assess oxidative damage in our study, we determined lipid peroxidation

levels (like MDA). Plasma MDA levels were determined by using the HPLC technique.

Figure 4.5 shows significant differences between the control and unloaded with water

groups. The increment in plasma peroxidation is partially inhibited in the unloaded with

allopurinol group. Surprisingly control with allopurinol treatment showed statistically

significant increased MDA levels.

Figure 4.5. Mean (±SD) results of MDA levels in plasma of CW (n=9), CA (n=9), UW (n=7), and UA

(n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify

statistically significant differences.

Results

182

4.1.5. Effect of unloading and allopurinol administration on soleus muscle

and plasma protein carbonylation.

In this case, we wanted to measure other oxidative damage to biomolecules such

as proteins.

As shown in Figure 4.6, hindlimb unloading caused a significant increase in

skeletal muscle carbonylation of proteins. A protein(s) with a molecular weight of 65

kDa was significantly carbonylated in the muscle of unloaded rats (Figure 4.6A). We

also determined plasma protein carbonylation in our animals. Figure 4.6B shows a

significant increase in the carbonylation of low-molecular weight proteins (less than 50

kDa) in the samples of the unloaded animals that received water. A trend for allopurinol

prevention of protein oxidation was found although it did not reach statistical

significance either in the soleus or in plasma samples.

Figure 4.6. Mean (±SD) results of soleus muscle carbonylated proteins (A) of CW (n=9), CA (n=9), UW

(n=7), and UA (n=7) groups in rats. Panel B represents carbonylation of low-molecular weight protein

(less than 50 kDa) in plasma of the same animals. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


65kDa

50kDa

B

Ponceau

Results

183

4.1.6. Effect of unloading and allopurinol treatment on the activation of

p38-MAPK

We tested whether XO-derived ROS were involved in the activation of p38-

MAPK in soleus muscle. We found that phosphorylation of p38-MAPKinase increases

in the soleus muscle of the unloaded animals (Figure 4.7). Allopurinol treatment

completely prevented the p38 phosphorylation. Total p38 protein levels were unaltered

in the different experimental groups.

Figure 4.7. Mean (±SD) results of cytosolic p-p38-MAPK in soleus muscle of CW (n=9), CA (n=9), UW

(n=7), and UA (n=7) groups in rats. Activation levels were expressed as the ratio between phosphorylated

and total protein content. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to

identify statistically significant differences.

Results

184

4.1.7. Effect of unloading and allopurinol treatment on the activation of NF-

кB p65

We wanted to see if the XO-derived ROS induced the activation of the

inflammatory transcription factor NF-кB. We found that the phosphorylation NF-кBp65

was increased (+352%, p<0.001) in the cytosolic fractions of the soleus in the unloaded

animals. Allopurinol administration decreased by 178% this activation (Figure 4.8).

Figure 4.8. Mean (±SD) results of cytosolic phosphorylation NF-кBp65 in soleus muscle of CW (n=9),

CA (n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


Results

185

In view of this result we measured the p65 protein levels in the nuclear fraction

of the soleus muscle; we observed that both NF-кBp65 protein content and NF-кB

activity (determined by ELISA) were increased after 14 days of hindlimb unloading

(Figure 4.9A and 4.9B, respectively). Allopurinol treatment reduced NF-кB activity

without a concomitant prevention of p65 nuclear translocation. We also found a striking

significant increase in the p65 nuclear protein levels in the control animals treated with

allopurinol.

Figure 4.9. Mean (±SD) results of nuclear translocation of NF-кBp65 (A) and relative NF-кBp65 activity

(B) in soleus muscle of CW (n=9), CA (n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor

ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.

The content of α-actin, a housekeeping protein marker in muscle, was not altered

in the various treatment groups of rats (data not shown).

A

B

Results

186

4.1.8. Effect of unloading and allopurinol treatment on the MAFbx and

MuRF-1 mRNA levels in soleus muscle

Finally to identify the mechanism by which allopurinol prevents the loss of

muscle mass after hindlimb unloading we determined the expression, in soleus muscle,

of two well-known muscle specific E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx and MuRF-1

(Foletta et al., 2011). As shown in Figure 4.10A we found a very significant increase in

MAFbx mRNA expression in the soleus muscle of the unloaded animals and a

significant prevention after treatment with allopurinol. Regarding MuRF-1, our results

show that hindlimb unloading induced its expression in the soleus muscle. However,

although a tendency was found (p=0.086), we found no prevention after allopurinol

treatment.

Figure 4.10. Mean (±SD) results of MAFbx (A) and MuRF1 (B) mRNA levels in soleus muscle of CW

(n=9), CA (n=9), UW (n=7), and UA (n=7) groups in rats. A two-factor ANOVA and post hoc

Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.

Results

187

4.1.9. Summary

Collectively, as summarized in figure 4.11, our data suggest that XO-induced

oxidative stress is involved in the activation of the p38 MAPK-MAFbx pathway in

unloading-induced skeletal muscle atrophy. We have found that allopurinol treatment

completely prevents the activation of XO but partially prevents the protein

carbonylation, and the loss of muscle mass in soleus muscle, during unloading. Two of

the main oxidative-stress signaling cascades, NF-кB and p38-MAPK, are activated after

14 days of hindlimb unloading. This activation lead to the increase in the mRNA

expression of the proteolytic E3 ubiquitin ligase MAFbx, and MuRF1, in soleus muscle.

Allopurinol treatment significantly prevents the activation of the p38 MAPK-MAFbx

pathway. However, we have found that NF-кB, but not MuRF-1, was inhibited with the

allopurinol treatment (red arrow).

Figure 4.11. Summary of the Study No. 1: Effect of allopurinol in the cell signaling pathway involved in

the muscle atrophy induced by 14 days of hindlimb unloading in male Wistar rats. Allopurinol prevents

the loss of muscle mass during hindlimb unloading via inhibition of p38-MAPK and the E3 ubiquitin

ligase Atrogin1/MAFbx.

Results

188


muscle atrophy in mIKKα KO and wild-type mice.

After the paradoxical results obtained in the first study, where NF-кB, but not

MuRF-1, was inhibited with the allopurinol treatment, we decided to analyze

specifically the role of NF-кB during hindlimb unloading. Therefore, in this new study

we changed the experimental animals from rats to mice, since these can be genetically

engineered. We used, wild-type and an IKKα muscle-specific knockout mice, one of

two of the upstream proteins that regulate NF-кB-dependent transactivation during

atrophy.

As it has been described in the Materials and Methods section of the Thesis, the

experimental groups used in the following study and their respective abbreviations are:

Control wild-type mice: C-WT

Hindlimb Unloading wild-type mice: U-WT

Control mIKKα KO: C-KO

Hindlimb Unloading mIKKα KO: U-KO

4.2.1. mIKKα deficient mice are protected from soleus muscle atrophy after

14 days of hindlimb unloading.

We measured the cross sectional area of soleus muscle after a protocol of

hindlimb suspension for 14 days. We found a significant decrease in the cross sectional

area (-46%, p<0.001) (Figure 4.12, panels A and B) and a in the minimum diameter of

type I fibers (-65%, p<0.05) (Figure 4.12, panels C and D) in the soleus muscle of the

wild-type mice. However, in deficient mIKKα mice this effect was partially inhibited by

51% (p<0.05) and 15% (p<0.05) respectively.

Results

189

A

Results

190

Figure 4.12. (A) Hematoxylin and eosin staining (Original magnification, 4x. Scale bar, 100.00 µm). (C)

Myosin staining specific of slow myosin heavy chain (type I fibers were deeply stained, while type II

were lightly stained). (Original magnification 20x. Scale bar, 100.00 µm). Panel B and D represent the

quantitative analyses of the cross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber in the soleus in

different groups: C-WT (n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) of male mice. A two-factor

ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.

C

D

Results

191

We determined the maintenance of muscle integrity by measuring the protein

content of the slow MHC (Figure 4.13). We found that, after unloading, there was a

significant decrease in the MHC in the gastrocnemius muscle of the WT animals. In this

case, we found a significant prevention of this decrement in the mIKK KO group.

Figure 4.13. Western blot and densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain in

gastrocnemius of C-WT (n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice. A two-

factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant

differences.

Results

192

4.2.2. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on the protein levels of

antioxidant enzymes in gastrocnemius muscle.

The cytosolic protein levels of MnSOD were decreased (-31%, p<0.01) in the

gastrocnemius muscle of the unloaded animals (Figure 4.14A). MnSOD levels were

restored in the mIKKα KO mice. Figure 4.14B shows that the suspension did not induce

changes in the levels of Cu,ZnSOD.

Figure 4.14. Mean (±SD) results of MnSOD (A) and Cu,ZnSOD (B) in gastrocnemius muscle of C-WT

(n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice. A two-factor ANOVA and post

hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.

A

Results

193

3.2.3. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in plasma MDA levels

Having established that there is a difference in oxidative stress in the various

groups studied, we determined whether these differences were also translated into

differences in oxidative damage to biomolecules such as lipids. To assess oxidative

damage in our study, we determined lipid peroxidation levels (MDA). Figure 4.15

shows an increase, without significant differences, between the control and unloaded

wild-type groups, nevertheless we found a significant difference in the MDA levels

between the wild-type and the mIKK KO unloaded groups.

Figure 4.15. Mean (±SD) results of MDA levels in plasma of C-WT (n=9), U-WT (n=9), C-KO (n=13),

and U-KO (n =13) groups in male and female mice. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s

comparisons were used to identify statistically significant differences

Results

194

4.2.4. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in the activation of p38-

MAPK

We tested whether IKKα is involved in the activation of p38-MAPK in

gastrocnemius muscle. We observed that phosphorylation of p38-MAPKinase only

increased a 12% in the cytosolic fractions of the gastrocnemius muscle in the unloaded

WT animals. However, these increments did not reach statistical significance (Figure

4.16). mIKKα KO animals showed a decrease in the phosphorylation of p38 compared

with the control and unloaded WT mice. Total p38 protein levels were unaltered in the

different experimental groups.

Figure 4.16. Mean (±SD) results of cytosolic p38-MAPK in gastrocnemius muscle of C-WT (n=4), U-

WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice. Activation levels were expressed as the

ratio between phosphorylated and total protein content. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


Results

195

4.2.5. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on the activation of NF-

кBp65 in skeletal muscle

We wanted to determine whether the suppression of IKKα, but not IKKβ,

inhibited the activation of the downstream transcription factor NF-кBp65. We found

that the phosphorylation NF-кBp65 was increased (+67%, p<0.05) in the cytosolic

fractions of gastrocnemius muscle in the unloaded WT mice but not in mIKKα KO ones

(Figure 4.17).

Figure 4.17. Mean (±SD) results of phosphorylation of NF-кBp65 in the cytosolic fraction of

gastrocnemius muscle of C-WT (n=4), U-WT (n=4), C-KO (n=6), and U-KO (n =6) groups in male mice.

Activation levels were expressed as the ratio between phosphorylated and total protein content. A two-

factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant

differences.

Results

196

4.2.6. Effect of unloading and deficiency of mIKKα in the activation of Akt

in skeletal muscle

The cytosolic protein levels of phosphorylated Akt were decreased (-38%,

p<0.05) in the gastrocnemius muscle of the unloaded animals (Figure 4.18). We found

that Akt phosphorylation was not affected by unloading in the mIKKα KO mice.

Figure 4.18. Mean (±SD) results of cytosolic Akt in gastrocnemius muscle of C-WT (n=4), U-WT (n=4),

C-KO (n=6), and U-KO (n=6) groups in male mice. Activation levels were expressed as the ratio between

phosphorylated and total protein content. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons

were used to identify statistically significant differences.

The content of α-actin, a housekeeping protein marker in muscle, was not altered

in the different treatment groups (data not shown).

Results

197

4.2.7. Effect of unloading and deficiency of mIKKα on MAFbx, MuRF-1,

and Cbl-b levels in soleus muscle

Finally, to identify the mechanism by which the deficiency of mIKKα prevents

the loss of muscle mass after hindlimb unloading, we determined the expression, in

soleus muscle, of two well-known muscle specific E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx

and MuRF-1 (Foletta et al., 2011) which act as key mediators of proteolysis in muscle

atrophy and loss of muscle function.

Figure 4.19A shows a trend to increase in MAFbx mRNA expression (p=0.053)

in unloaded wild-type mice, this increase was significant in the unloaded mIKKα KO

mice. On the other hand, we found a significant increase in MuRF1 mRNA expression

in the soleus muscle of the unloaded animals and a prevention in the mIKK KO

unloaded mice (Figure 4.19B).

We measured the expression of Cbl-b, another RING-type ubiquitin ligase

required for the loss of muscle mass in response to unloading in vivo. Figure 4.19C

shows that Cbl-b mRNA expression is increased in the soleus of the unloaded WT

animals. This activation is significantly prevented in the mIKK KO unloaded group.

Results

198

Figure 4.19. Mean (±SD) results of MAFbx (A), MuRF1 (B), and Cbl-b (C) mRNA levels in soleus

muscle of C-WT (n=9), U-WT (n=9), C-KO (n=13), and U-KO (n =13) groups in male and female mice.

A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically

significant differences.

C

Results

199

4.2.8. Summary

Collectively, as summarized in figure 4.20, our data suggest that IKKα is

involved in the activation of the NF-кB-MuRF1 pathway in muscle atrophy induced by

hindlimg unloading. We have found that the deletion of mIKKα, during unloading,

partially prevents the decrease in the myosin content. We measured two of the main

oxidative-stress signalling pathways, NF-кB and p38-MAPK; only the first one was

activated after 14 days of hindlimb unloading; p38-MAPK was not significantly

activated.

This activation led to the increase in the mRNA expression of the proteolytic E3

ubiquitin ligase MAFbx, and MuRF1, in soleus muscle. Deletion of mIKKα

significantly prevents the activation of the NF-кB-MuRF-1 pathway but not MAFbx

one (red arrow).

On the other hand, we can see that unloading induces the expression of the

ubiquitin ligase Cbl-b in skeletal muscle. Cbl-b induces impaired protein synthesis,

resulting in inhibition of Akt phosphorylation, leading to muscle atrophy.

Figure 4.20. Summary of the Study No. 2: Effect of 14 days of hindlimb unloading in wild-type and

mIKKα KO mice. Deficiency of mIKKα prevents the loss of muscle mass during hindlimb unloading via

inhibition of NF-кB p65 and the E3 ubiquitin ligases MuRF-1 and Cbl-b.

Results

200


skeletal muscle atrophy in male C57BL/6J mice. Prevention by

allopurinol and indomethacin.

After demonstrating that independent inhibition of XO, and the inflammatory

pathway of NF-кBp65 have positive effects on the maintenance of muscle mass during

periods of suspension, we decided to test whether inhibition of these two pathways

together produced a synergistic effect in preventing muscle atrophy. We treated the

mice with allopurinol, used in the first study, and with indomethacin, a non-steroidal

anti-inflammatory drug.

As it has been described in the Materials and Methods section, the experimental

groups used in the following study and their respective abbreviations are:

Control with water: CW

Control with indomethacin: CI

Control with allopurinol: CA

Control with indomethacin and allopurinol: CIA

Hindlimb unloading with water: UW

Hindlimb unloading with indomethacin: UI

Hindlimb unloading with allopurinol: UA

Hindlimb unloading with indomethacin plus allopurinol: UIA

4.3.1. Allopurinol and indomethacin prevent soleus muscle atrophy after 14

days of hindlimb unloading in mice.

We used different methods to determine the role of XO and inflammatory

parameters in the hindlimb unloading-induced soleus muscle atrophy.

The hindlimb unloading for 14 days caused a significant decrease in the cross

sectional area of soleus muscle (-41%; p<0.001). This muscle atrophy was reduced to

only 10% in the allopurinol plus indomethacin treated animals (p<0.01 vs unloaded

group with water (Figure 4.21, panels A and B)).

In the same way, we found a significant decrease of the minimum diameter of

the type I muscle fibers. Indomethacin plus allopurinol treatment partially prevented

this reduction in the size of the individual myofibers (Figure 4.21, panels C and D).

Results

201

A

B

Results

202

Figure 4.21. (A) Hematoxylin and eosin staining (Original magnification, 4x. Scale bar, 100.00 µm). (C)

Myosin staining specific of slow myosin heavy chain (type I fibers were deeply stained, while type II

were lightly stained). (Original magnification 20x. Scale bar, 100.00 µm). Panel B and D represent

quantitative analyses of the cross-sectional area and the minimum diameter of type I fiber in soleus

muscle of the different groups: CW (n=7), CI (n=7), CA (n=7), CIA (n=7), UW (n=7), UI (n=7), UA

(n=7) and UIA (n=7). A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to

identify statistically significant differences.

D

C

Results

203

Moreover, soleus muscle to body mass ratio was significantly reduced after 14

days of unloading (-34%, p<0.001). In this case we found only a partial prevention after

the treatments (Figure 22A). We further tested the maintenance of muscle integrity by

determining the protein content of an important component of the sarcomere, the slow

MHC protein. Figure 4.22, panel B, shows that after unloading there was a significant

decrease in the protein content of MHC in soleus muscle. Administration of allopurinol,

and the combined treatment (allopurinol with indomethacin), significantly prevented

this decrement.

Figure 4.22. (A) Soleus muscle to body mass ratio in soleus muscle of CW (n=7), CI (n=7), CA (n=7),

CIA (n=7), UW (n=7), UI (n=7), UA (n=7) and UIA (n=7) groups in mice. A two-factor ANOVA and

post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences. (B) Western blot and

densitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain in gastrocnemius of CW (n=5), UW

(n=5), UI (n=5), UA (n=5) and UIA (n=5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc


A

B

Results

204

4.3.2. Hindlimb unloading induces plasma and liver muscle XO activation.

Prevention by allopurinol.

Mice plasma (Figure 4.23A) and liver (Figure 4.23B) XO activity increased

significantly after 2 weeks of hindlimb unloading. As expected, treatment with

allopurinol completely inhibited XO activation both in plasma and liver.

Figure 4.23. Mean (±SD) results of XO activity in plasma (A) and liver (B) of CW (n=3), CA (n=3), UW

(n=3) and UA (n=3) groups in mice. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were

used to identify statistically significant differences.

A

B

Results

205

4.3.3. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin administration

on protein levels of soleus muscle antioxidant enzymes.

As shown in Figure 4.24, hindlimb unloading caused a trend to decrease the

protein levels of the MnSOD in the soleus muscle (only -10%), but not in the groups

unloaded treated with allopurinol and indomethacin with allopurinol. Figure 4.24B

shows that the unloading does not produce changes in the levels of Cu,ZnSOD.

Figure 4.24. Mean (±SD) results of MnSOD (A) and Cu,ZnSOD (B) in soleus muscle of CW (n=5), UW

(n=5), UA (n=5), and UIA (n =5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


B

A

Results

206


on plasma MDA levels.

To assess oxidative damage in our study, we determined lipid peroxidation

levels (MDA) in plasma. Figure 4.25 shows statistically significant differences between

the control and unloaded with water groups, this increase in plasma peroxidation is

partially inhibited in allopurinol treated groups. Only the treatment that combined

allopurinol with indomethacin had a significant inhibition in the MDA increments

induced by hindlimb unloading.

Figure 4.25. Mean (±SD) results of plasma MDA levels of CW (n=7), CI (n=7), CA (n=3), CIA (n=7),

UW (n=7), UI (n=7), UA (n=3) and UIA (n=7) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc


Results

207

4.3.5. Hindlimb unloading activates plasma 6-keto prostaglandin F1α.

Prevention by allopurinol and indomethacin.

We tested whether muscular inactivity induced an increase in the concentration

of 6-keto prostaglandin F1α. Our results show that it was elevated significantly after 2

weeks of hindlimb unloading. Treatment with allopurinol and allopurinol plus

indomethacin completely prevented this increase but not the indomethacin

administration alone (Figure 4.26).

Figure 4.26. Mean (±SD) results of 6-ketoPGF1α concentration in plasma of CW (n=7), CI (n=7), CA

(n=3), CIA (n=7), UW (n=7), UI (n=7), UA (n=3) and UIA (n=7) groups in mice. A two-factor ANOVA

and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically significant differences.

Results

208


on IL-6 levels in gastrocnemius muscle.

Muscle concentration of IL-6 was decreased during 14 days of hindlimb

unloading. Both, allopurinol treatment and the combined treatment, indomethacin with

allopurinol, inhibited significantly this increament while indomethacin administration

alone only partially prevented it (Figure 4.27).

Figure 4.27. Mean (±SD) results of IL-6 concentration in gastrocnemius muscle of CW (n=7), UW (n=7),

UI (n=7), UA (n=3) and UIA (n=7) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


Results

209

4.3.7. Effect of unloading and allopurinol with indomethacin treatment on

the activation of p38-MAPK

When we wanted to see the effect of the treatments in the activation of p38-

MAPK in gastrocnemius muscle we found that it did not take place during the hindlimb

unloading in any group. We can see in the Figure 4.28 that phosphorylation and total

p38 protein levels are unaltered in the different experimental groups.

Figure 4.28. Mean (±SD) results of phosphorylated p38 in gastrocnemius muscle of CW (n=5), UW

(n=5), UA (n=5) and UIA (n=5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


Results

210


the activation of NF-кBp65

We demonstrated in the previous studies that hindlimb unloading induced the

activation of the inflammatory transcription factor NF-кBp65, in this case we wanted to

see if the administration of indomethacin with allopurinol inhibits this activation. We

found a trend to increase in the phosphorylation NF-кBp65 (+79%) in gastrocnemius of

the unloaded animals. Allopurinol plus indomethacin administration decreased this

activation (Figure 4.29).

Figure 4.29. Mean (±SD) results of phosphorylated NF-кBp65 in gastrocnemius of CW (n=5), UW

(n=5), UI (n=5), UA (n=5) and UIA (n=5) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc


Results

211

In view of this result we measured p65 subunit in the nuclear fraction of

gastrocnemius muscle; we observed that NF-кBp65 activity was increased after 14 days

of hindlimb unloading (+44%), (Figure 4.30). The treatments reduced partially NF-

кBp65 activity.

Figure 4.30. Mean (±SD) results of relative NF-кB p65 activity in gastrocnemius muscle of CW (n=6),

UW (n=6), UI (n=6) UA (n=5) and UIA (n=6) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc


Results

212


the activation of Akt in skeletal muscle

The cytosolic protein levels of phosphorylated Akt was not significantly

decreased (-36%) in the gastrocnemius muscle of the unloaded animals (Figure 4.31).

We observed that Akt phosphorylation significantly increased in unloaded with

allopurinol treated mice (+93%, p<0.001). Indomethacin administration had no effect on

Akt activation after the declines by the unloading. While the indomethacin plus

allopurinol treatment partially restored Akt levels after hindlimb unloading protocol.

Figure 4.31. Mean (±SD) results of phosphorylation Akt in gastrocnemius muscle of CW (n=6), UW

(n=6), UA (n=6) and UIA (n=6) groups in mice. A one-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s


Results

213


the MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b levels in soleus muscle

To finally identify the mechanism by which allopurinol prevents the loss of

muscle mass after hindlimb unloading we determined the expression, in soleus muscle,

of two well-known muscle specific E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx and MuRF-1

(Foletta et al., 2011) which act as key mediators of proteolysis in muscle atrophic and

loss of muscle function. As shown in Figure 4.32 we found a very significant increase in

both MAFbx (Panel A) and MuRF1 (Panel B) mRNA expression in the soleus muscle

of the unloaded animals. Regarding the prevention of increase mRNA expression only

the treatment of indomethacin with allopurinol had a significant effect.

At last, we measured the expression of Cbl-b, another RING-type ubiquitin

ligase required for the loss of muscle mass in response to unloading in vivo. In the

Figure 4.32C, we can see that Cbl-b mRNA expression is increased of soleus of the

unloaded animals. Allopurinol administration partially prevents this increase, while

indomethacin with allopurinol administration has a greater effect on the prevention of

Cbl-b mRNA expression during hindlimb unloading (Figure 4.32, panel C).

A

Results

214

Figure 4.32. Mean (±SD) results of MAFbx (A), MuRF1 (B), and Cbl-b mRNA levels in soleus muscle

of CW (n=6), CI (n=6), CA (n=6), CIA (n=6), UW (n=6), UI (n=6), UA (n=6) and UIA (n=6) groups in

mice. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify statistically

significant differences.

B

C

Results

215

4.3.11. Summary

Collectively, as summarized in figure 4.33, our data suggest that XO-induced

oxidative stress and inflammatory parameters are involved in unloaded muscle atrophy.

We have found that allopurinol with indomethacin treatment, during unloading,

completely prevents the activation of XO and inflammatory pathways, restoring anti-

inflammatory parameters, the myosin content, and partially prevents the loss of muscle

mass in soleus muscle. We measured two of the main oxidative-stress signalling

pathways, NF-кB and p38-MAPK; strangely only the first was activated after 14 days of

hindlimb unloading; p38-MAPK was not significantly activated.

On the other hand, we can see that unloading induces ubiquitin ligase Cbl-b in

skeletal muscle. Cbl-b induces impaired protein synthesis leading to muscle atrophy.

Nevertheless we found increased the mRNA expression of the proteolytic E3

ubiquitin ligase MAFbx, MuRF-1, and Cbl-b in soleus muscle. Indomethacin with

allopurinol treatment significantly prevents the activation of the p38 MAPK-MAFbx

and NF-кB-MuRF-1 pathways and Cbl-b mRNA expression.

Figure 4.33. Summary of the Study No. 3: Effect of 14 days of hindlimb unloading in male wild-type

C57BL/6J mice. Prevention by allopurinol and indomethacin. Allopurinol and indomethacin prevent the

loss of muscle mass during hindlimb unloading via inhibition of the E3 ubiquitin ligases

Atrogin1/MAFbx, MuRF-1 and Cbl-b.

Results

216

4.4. Study No. 4: Effect of α-galacto-oligosaccharides (OGT) in

skeletal muscle atrophy induced by streptozotocin in rats.

4.4.1. Effect of streptozotocin-induced diabetes and OGT administration on

hematological parameters.

We wanted to verify the induction of type 1 diabetes mellitus (T1DM) to the rats

by the streptozotocin injection. We found that relative to the control group, STZ rats

exhibited hyperglycemia, insulin deficiency and a trend to raise plasma fructosamin

level, a marker of glycated proteins (Table 4.1). We found that the treatment with OGT

decreased significantly only the plasma fructosamin values.

Control STZ-treated STZ-treated + OGT

Fasting glucose (mmol/L) 1.91±0.56 6.98±0.81* 7.10±0.72#

Fasting insulin (mU/L) 0.88±0.46 0.10±0.07* 0.07±0.03#

Fructosamin (µg/L) 181±30 341±145* 119±97$

Table 4.1. Mean (±SD) results of fasting glucose, fasting insulin and fructosamin concentrations in

plasma of control rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor

ANOVA and post hoc Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences;

*: p<0.05 vs control group (trends for fructosamin: p=0.12), #: p<0.05 vs control group, $: p<0.05 vs

STZ-Treated group.

Results

217

4.4.2. OGT prevents skeletal muscle atrophy in streptozotocin-diabetic rats

We wanted to observe the effect of streptozotocin-induced T1DM in muscle

atrophy.

In the Figure 4.34 (Panel A) we can see that relative to the control group, STZ

rats exhibited skeletal muscle atrophy, determined by measuring tibialis anterior and

gastrocnemius muscle weight. However, the OGT supplementation partially prevented

the decrease in skeletal muscle mass.

Figure 4.34 Mean (±SD) results of (A) tibialis anterior and (B) gastrocnemius muscle weight of control

rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor ANOVA and post

hoc Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences.

A

B

Results

218

4.4.3. Effect of T1DM and OGT administration on protein levels of skeletal

muscle antioxidant enzymes.

T1DM decreased significantly the protein levels of the cytosolic MnSOD in the

tibialis anterior of the rats (-38.5%; p<0.01) (Figure 4.35A). Treatment with OGT

partially prevented the diabetes-induced decrease by 25.5%. Figure 4.35B shows that

T1DM did not produce changes in the levels of Cu,ZnSOD.

Figure 4.35. Mean (±SD) results of MnSOD (A) and Cu,ZnSOD (B) in tibialis anterior muscle of control

rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor ANOVA and post


A

B

Results

219

4.4.4. Effect of T1DM and OGT administration on the activation of p38-

MAPK

We found a significant increase in the phosphorylation of p38-MAPKinase in

the tibialis anterior muscle of the unloaded animals. Allopurinol treatment completely

prevented the p38 phosporylation. Total p38 protein levels were unaltered in the

different experimental groups.

Figure 4.36. Mean (±SD) results of cytosolic phosphorylation p38 in tibialis anterior muscle of control

rats (n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). Activation levels were

expressed as the ratio between phosphorylated and total protein content. A one-factor ANOVA and post


Results

220

4.4.5. Effect of T1DM and OGT administration on the expression of NF-

кBp65

We wanted to determine whether the induction of diabetes induced the activation

of the inflammatory pathway of NF-кBp65, and the possible effect of OGT

administration. We found that the NF-кBp65 content had a trend to increase (+38.7%;

p=0.08) in the cytosolic fractions of tibialis anterior of the diabetic animals. Treatment

with OGT did not prevent this increment (only -15.4%).

Figure 4.37. Mean (±SD) results of cytosolic NF-кBp65 content in tibialis anterior muscle of control rats

(n = 9), STZ-diabetic rats (n = 8), STZ-diabetic rats with OGT (n=8). A one-factor ANOVA and post hoc

Fisher LSD comparisons were used to identify statistically significant differences.

Results

221

4.4.6. Summary

Collectively, as summarized in figure 4.38, our data suggest that oxidative stress

is involved in STZ-induced muscle atrophy. We have found that GOT treatment

completely prevents the activation of p38, partially prevents the decrease of antioxidant

enzyme, but has no effect on the loss of muscle mass in tibialis anterior and

gastrocnemius muscles.

Figure 4.38. Summary of the Study nº 4: Effects of α-galacto-oligosaccharides (OGT) in streptozotocin-

diabetic rats. OGT treatment prevents p38 activation and oxidative stress in STZ-induced diabetes but the

loss of muscle mass is not prevented.

DISCUSSION

Discussion

225

5.1. Justification of the study

The generation of critical levels of power are a prerequisite to perform simple

tasks of daily living, such as rising from a chair or climbing stairs. For a young healthy

person these activities can be performed easily, however after a prolonged period of

forced inactivity (such as during the recovery of a sport injury, cast immobilization or

bed rest period after an operation) and in chronic diseases (such as diabetes) a loss of

muscle mass occurs. Then, simple tasks become increasingly difficult. In these situations

the loss of muscle mass has serious implications for independent living, quality of life,

and undoubtedly for the recovery for the sport practice.

Recently it has been shown that muscle atrophy may be triggered by ROS and

antioxidant treatments partially inhibit the weakness caused by limb immobilization.

This study is justified because there is great scientific and social interest to

determine which behaviours can lead to the maintenance of the muscle mass in young

immobilized and diabetic subjects. We expect that the results we have obtained in this

doctoral thesis can be used in both theoretical (to foster the knowledge of the atrophic

process) and practical applications, in the field of rehabilitation, Sport Sciences, and

Performance.

5.2. Limitations of the study

Although there are several different aspects that we try to cover in this

investigation, we are also aware of the limitations presented.

One limitation of our study is that muscle atrophy induced in our model should

be extrapolated to conditions such as of bed rest, weightlessness and space flight, and

not to the cast immobilization, although the molecular mechanisms involved are similar

(Powers et al., 2005).

Another limitation that we encountered on the model used is that the most

atrophied muscle is the soleus, which gives us a small amount of sample for the

experiments.

Regarding the limitations of the study in relation to the pharmacologic

treatments, we are aware that despite the allopurinol and indomethacin dose was

adjusted daily according to water consumption and rodents' weight, we have not

administrated to every animal the exact dose that we initially estimated.

Discussion

226

Furthermore due to our experience with the use of allopurinol to inhibit XO in

various studies, we knew a priori that the dose used in this study was not going to cause

any toxic effect in the rodents (Gomez-Cabrera et al., 2005, Gomez-Cabrera et al., 2008,

Romagnoli et al., 2010). However, it has been described previously that a low dose of

indomethacin could inhibit cancer cachexia, whereas a high dose might be toxic in

different organs, lead to gastrointestinal haemorrhage and, elevated mortality in mice

and rats (Gelin et al., 1991, Zhou et al., 2003, Egan et al., 2004, Granado et al., 2007).

Therefore, we decided to use a low indomethacin dose to inhibit the NF-кB pathway and

the muscle atrophy described in other models. However, this dose (0.6mg/kg/day)

proved to be toxic in our model and led to renal failure in mice that took it. Recently the

administration of allopurinol has been described as an important anti-inflammatory in

many diseases, including renal failure (Goicoechea et al., 2010, Thurston et al., 2013,

Bhasin et al., 2014). In fact, we have found that administration of allopurinol and its

combination with indomethacin prevented renal fairlure in mice.

5.3. Soleus muscle atrophy associated to 14 days of hindlimb

unloading protocol.

A growing body of experimental data attributes to oxidative stress and

inflammation the loss of muscle mass in both human and animal models during muscle

immobilization. In our study, young rats and mice were submitted to hindlimb

unloading during 14 days to induce skeletal muscle atrophy. Four different strategies

were tested to prevent the loss of muscle mass: allopurinol (inhibitor of XO),

indomethacin (anti-inflammatory, inhibitor of NF-кB), indomethacin plus allopurinol

administration, and a mIKKα knockout mice model.

It has been reported that type I muscle fibers atrophy is more severe than other

fiber types during hindlimb unloading (Jaspers and Tischler, 1984, Thomason and

Booth, 1990a, Talmadge et al., 1996). It is well known that the soleus muscle is mainly

composed of type I muscle fibers. This is the reason why we focused the analysis in

soleus muscle.

After unloading we found a significant decrease in the cross sectional area of the

antigravitatory soleus muscle in rats (Figure 4.1; panels A and B) and mice (Figure 4.12

and 4.21; panels A and B). Thus, we studied the minimum diameter of the individual

Discussion

227

type I myofibers and, we observed a significant decrement in their size after hindlimb

suspension (Figures 4.1, 4.12 and 4.21, Panels C and D). Our results are in agreement

with those reported by different research groups both in rats (Zhang et al., 2007a,

Boonyarom et al., 2009, Zhang et al., 2010) and in mice (Matuszczak et al., 2004),

confirming the histochemical observation that the area of muscle mass and the diameter

of type I fibers, are decreased after 14 days of hindlimb unloading.

In the first study, the treatment with allopurinol significantly prevented skeletal

muscle atrophy after hindlimb unloading in rats. We found a significant prevention

(+43%) in the decrement of the CSA and in the diameter of type I fibers (+18%) (Figure

4.1).

In the second study we used muscle deficient IKKα mice to further examine the

role of IKKα/NF-кB in unloading-induced muscle atrophy. We found that the muscle

specific suppression of IKKα prevents (+50%) the reduction in the CSA and the

decrement in type I fibers diameter (+15%) during hindlimb unloading (Figure 4.12).

These results are in agreement with previous studies, using DNA injection and

electroporation experiments, showing that both IKKα and IKKβ are necessary and

sufficient to induce muscle atrophy (Van Gammeren et al., 2009).

Finally, we confirmed in the third study, with mice, that allopurinol partially

prevented CSA and type I fibers reduction in soleus muscle after hindlimb unloading (-

41% and -24% respectively) (Figure 4.21), confirming the beneficial effects of

allopurinol administration in both rats and mice. We found a partial prevention with the

indomethacin treatment in the CSA, but the effect of the indomethacin administration

was less effective than allopurinol (+6%). However, the major protection was found

with indomethacin plus allopurinol treatment that prevented in 30% and 10% the CSA

and type I myofibers decrement respectively (Figure 4.21).

We also confirmed the atrophy weighing the soleus muscles in all the

experimental groups. The relative muscle weights evidently decreased in the soleus

muscles after the unloading protocol both in rats (-49%) and mice (-34%) (Figures 4.2

and 4.22, panel A). In the first study, we found an approximately 20% prevention in the

unloading-induced rat’s soleus muscle atrophy under allopurinol treatment measured by

Discussion

228

the weight of soleus muscle. Matuszczak et al. published that administration of

allopurinol had protective effects during hindlimb unloading (Matuszczak et al., 2004).

However, as in our case with the same doses, allopurinol did not prevent the loss of

soleus weight in mice. In the rat’s study we can consider that the higher dose of

allopurinol used in rats could explain the differences between mice and rats results.

Although in the study done by Matuszczak et al. in mice, as in our studies in rats and

mice the allopurinol dose was 50 mg/kg. If we take into account the differences in the

surface area between rats and mice, the amount of allopurinol results in 300 mg/m2 in

our rat study. While the administered dose in mice corresponds to 150 mg/m2 of

allopurinol. Body surface area has been recommended as the main basis for drug

dosage, because the rate of metabolism or redistribution of a drug is proportional to the

metabolic rate, which reflects heat losses that are generally proportional to the surface

area (Lack and Stuart-Taylor, 1997).

In the third study we have shown that neither allopurinol nor indomethacin alone

prevent the fall in the soleus muscle weight after 14 days of unloading. However,

coadministration of indomethacin plus allopurinol had a significant effect in preventing

the loss of soleus muscle weight in mice (Figure 4.22 panel A). Anti-inflammatories

have been previously used in different situations of muscle wasting, as cancer cachexia

or sepsis (Hitt et al., 2005, McCarthy et al., 2004, Ruff and Secrist, 1984, Zhou et al.,

2003), and they have been effective even when administered at low doses. Muscle

atrophy, resulting from loss of contractile proteins, is one well-recognized cause of such

functional impairment. We tested the effect of our treatments in the maintenance of

muscle integrity by determining the protein content of an important component of the

sarcomere, the slow MHC protein. It has been suggested that of the myofibrillar

proteins implicated in mediating muscle atrophy and the wasting state, MHC is a

preferred substrate that can be inhibited at the RNA level or degraded through a

ubiquitin associated proteolytic process (Acharyya et al., 2004). We found that after

unloading there was a dramatic decrease in the protein content of MHC in rats (Figure

4.2, Panel B) In this case, we found only a partial prevention after treatment with

allopurinol.

In mice, we observed a similar decrement in the MHC content which was

completely restored in mIKKα KO mice (Figure 4.13). With the treatments with

Discussion

229

allopurinol and indomethacin plus allopurinol in the third study we observed a

restoration of this MHC content loss (4.22, panel B).

As a summary, in this doctoral thesis we have shown that two different

treatments, allopurinol and indomethacin, partially prevent skeletal muscle atrophy in

rodents after 14 days of hindlimb unloading. We have found a synergistic benefit with

the coadministration of indomethacin plus allopurinol in the preservation of muscle

mass after hindlimb unloading, proving that more than one pathway is involved in the

muscle atrophy during this condition.

5.4. Oxidative stress is involved in muscle atrophy associated to

hindlimb unloading.

Historically, it was believed that ROS production is low in noncontracting

skeletal muscle and oxidative injury is not present (Powers et al., 2005). However,

numerous studies have demonstrated that oxidative injury occurs during periods of

disuse in locomotor skeletal muscles (Kondo et al., 1992a, Kondo et al., 1992b, Kondo

et al., 1993b, Kondo et al., 1993c, Kondo et al., 1994, Lawler et al., 2003) and in the

unloaded diaphragm during prolonged mechanical ventilation (Shanely et al., 2002,

Zergeroglu et al., 2003).

The source(s) of ROS production in the unloading models is still a subject of

debate. Kondo et al. described several potential sources of ROS involved in oxidative

stress-induced muscle atrophy during muscular inactivity (Kondo et al., 1991) (see

section 1.5.3.1). Based on this study different strategies have been developed to prevent

disuse muscle atrophy by the administration of exogenous antioxidants. Interestingly,

rodents supplemented with vitamin E (Appell et al. 1997; Servais et al. 2007), Bowman-

Birk inhibitor concentrate (soy protein with antioxidant properties) (Arbogast et al.

2007), aminoguanidine (Chowdhury et al., 2009), resveratrol (Jackson et al. 2010),

diferuloylmethane (curcumin), cysteine (Ikemoto et al., 2002), and N-acetylcysteine

(NAC) (Farid et al., 2005) (three non-specific antioxidants) during a period of hindlimb

unloading, exhibit less oxidative damage and muscle atrophy, suggesting that ROS

contribute to the inactivity-related skeletal muscle atrophy.

Discussion

230

In their pioneer work, Kondo and co-workers in 1991 described that XO is one

of the sources of free radicals acting on skeletal muscle during inactivity periods

(Kondo et al., 1991). Two years later this group confirmed that to XO is the main source

of ROS production in the atrophied muscles (Kondo et al. 1993a). Matuszczak and co-

workers found that administration of allopurinol in mice had protective effects during

hindlimb unloading (Matuszczak et al. 2004). In this study a substantial prevention in

the contractile dysfunction in soleus muscles was reported. More recently the group of

Powers showed that XO is involved in mechanical ventilation-induced oxidative injury

and contractile dysfunction in the diaphragm (Whidden et al., 2009). Respiratory

muscle weakness produced by mechanical ventilation occurs due to diaphragmatic

contractile dysfunction and atrophy and is directly linked to oxidative stress (Betters et

al., 2004).

However, the molecular mechanisms involved in the XO-mediated skeletal

muscle atrophy are not well understood. We have previously reported that inhibition of

XO with allopurinol prevents exercise-induced oxidative stress in skeletal muscle by

inhibiting the MAPK–NF-кB signalling pathways (Gomez-Cabrera et al. 2003; Gomez-

Cabrera et al. 2005). Thus, our aim was to determine the mechanism by which XO-

derived ROS cause unloading induced muscle atrophy and its possible prevention by

allopurinol and/ or indomethacin.

We found a significant increase in plasma and soleus muscle XO activity

associated to hindlimb unloading that was prevented completely by allopurinol in rats

(Figure 4.3). The same effect was observed in the mice’s study, where plasma and liver

XO activity was increased during hindlimb unloading and completely prevented with

allopurinol (Figure 4.23). These results are important, because they confirm that

treatment with allopurinol was effective.

The term oxidative stress was first defined in 1985 as “a disturbance in the pro-

oxidant-antioxidant balance in favor of the former” (Sies and Cadenas, 1985, Sies,

1985.). For this reason we measured the expression of the antioxidant enzymes. In the

first study we observed that unloading significantly increased activity of CuZnSOD in

soleus muscle of rats. Allopurinol administration did not modulate the skeletal muscle

antioxidant levels (Figure 4.4, panel A).

Discussion

231

These data agree with that obtained by Kondo (Kondo et al., 1993b) and later

confirmed by Lawler (2003) who, using a 28 days hindlimb unloading protocol,

observed a large increase, of CuZnSOD (+71.2%), in rat soleus. Nevertheless, Girten

described a reduction in the antioxidant enzyme activity for total SOD following 14

days of hindlimb unloading (Girten et al., 1989). In our second and third study in mice

we did not find differences in the expression of this protein after the unloading.

We also measured the expression of catalase. It increased significantly during

the unloading protocol, but allopurinol treatment had no effect on its expression (Figure

4.4, panel B). Servais and co-workers found similar data since in their study catalase

underwent a significant increase in the group of rats suspended that vitamin E failed to

prevent (Servais et al., 2007).

In the second study in mice we observed that the skeletal muscle levels of

MnSOD were significantly decreased in the unloading group. Their protein levels were

restored in gastrocnemius muscle in mIKKα KO mice (Figure 4.14, panel A). Contrary

to what we got in rats, that unloading did not induce changes in CuZnSOD expression

levels (Figure 4.14 and 4.24, panels B).

In the third study we found a trend to decrease MnSOD, restored with

allopurinol and indomethacin plus allopurinol treatments (Figure 4.24, panel A).

Regarding CuZnSOD we obtained similar results, the levels of this enzyme were not

changed after unloading (Figure 4.24, panel B).

According with our results, studies in which the unloading was maintained for

28 days, the authors found a small decrease in the activity of MnSOD in the

immobilized soleus (Lawler et al., 2003) or no changes in the expression of CuZnSOD

after hindlimb suspension for 14 days (Chen et al., 2008).

Furthermore there are limited and controversial data in the literature concerning

antioxidant enzymes and skeletal muscle disuse. With these data we can only suggest

that the muscle is adapting to oxidative stress.

In this PhD thesis we have evaluated systemic and muscular oxidative damage.

We determine the MDA levels in plasma by using HPLC. MDA measurement with this

method is very specific and sensitive, and distinguishes between malondialdehyde and

Discussion

232

other aldehydes which can react with TBA (thiobarbituric acid) (Bermejo et al., 1997).

For this reason we chose this parameter to study lipid peroxidation in our model.

In the rat study MDA in plasma was significantly increased after unloading (See

figure 4.5) and this was not prevented by allopurinol. Surprisingly, in this case, we

found that allopurinol treatment in the control group showed statistically increased

MDA levels. This could have occurred due to administration of oral antioxidants in

conditions without an additional oxidative damage (i.e. increased XO activity). This

could be counterproductive in this case because of an inhibition of the formation of uric

acid, a potent antioxidant (Becker, 1993).

In the second study we only found a trend to increase in the MDA levels in the

wild type unloaded mice group, without significant differences with the control wild

type group. However, we found a significant difference in the MDA levels between the

wild type and the mIKK KO unloaded groups (See Figure 4.15).

In the third study, lipid peroxidation was significantly increased in the unloaded

with water group compared with its control. Neither indomethacin nor allopurinol

prevented the MDA increments during unloading. However, the combination of

indomethacin plus allopurinol induced a significant inhibition of the MDA increments

induced by hindlimb unloading (See Figure 4.25).

Regarding to protein carbonylation we found a significant increase in the plasma

and soleus protein oxidation in the unloaded animals (See Figure 4.6) in the rat study.

This was not prevented by allopurinol.

Our MDA data in soleus are in accordance with the results previously observed

(Lawler et al., 2003) in which muscle atrophy increases the lipid peroxidation and

protein oxidation. Interestingly, the level of lipid peroxidation was studied in soleus,

gastrocnemius, tibialis anterior, and EDL muscle and was found to be linearly related to

the percentage of muscle atrophy (Desaphy et al., 2010). These data suggest the

existence of a correlation between an indirect index of ROS production and muscle

atrophy. However, it may be that lipid and protein damage might follow muscle atrophy

or occur in parallel, and holding a proportion.

Discussion

233

The failure of allopurinol to completely blunt the oxidative stress in skeletal

muscle using different unloading models has been previously reported (Matuszczak et

al., 2004, Whidden et al., 2009). In this PhD thesis we demonstrate that the oral co-

administration of an anti-inflammatory, indomethacin, with an XO inhibitor,

allopurinol, can prevent significantly plasma lipid peroxidation when compared to the

unloaded group that drink water and water with indomethacin or allopurinol alone.

These results suggest that lipid peroxidation induced by hindlimb unloading is mediated

by several different pathways.

5.5. Redox sensitive signaling pathways involved in muscle

atrophy associated to hindlimb unloading.

Generally, the activation of NF-кB, activator protein-1 (AP-1), p53, Foxo, and

p38 MAPK pathways lead to skeletal muscle atrophy (Guttridge, 2004). On the other

hand, activation of PI3K/Akt pathway that occurs in response loading and growth

factors such as insulin and IGF prevents the loss of skeletal muscle mass (McKinnell

and Rudnicki, 2004).

p38 is a stress-activated protein kinase that responds to a variety of stimuli,

including oxidative stress and TNF-α (Obata et al., 2000). MAPKs are important in the

cellular mechanisms of the atrophic process, and p38MAPK has been identified as a

potential regulator of muscle catabolism (Tracey, 2002, Li et al., 2005, Powers et al.,

2005). Thus, we determined the phosphorylation of p38 MAPK in the cytosol of the

soleus muscle samples. In our first study with rats, we found a significant increase of p-

p38 in the soleus of the unloaded animals that was prevented by allopurinol

administration (Figure 4.7). Our results are consistent with those reported by Childs et

al. (Childs et al., 2003) which found a 128% increase of p38 phosphorylation after 10

days of hindlimb immobilization in rats. This was associated with a 38% decrease in

soleus muscle mass over the same period. One year later Di Giovanni found that p38

phosphorylation was elevated in atrophic muscles of patients with acute quadriplegic

myopathy and with neurogenic muscle atrophy (Di Giovanni et al., 2004). Other

procatabolic conditions in which constitutive phosphorylation of skeletal muscle p38

has been shown to be elevated include Type 2 diabetes (Koistinen et al., 2003) and

Discussion

234

aging (Williamson et al., 2003). Our results suggest that XO-derived ROS increased p38

MAPK phosphorylation contributing, in part, to the loss of muscle mass.

Paradoxically, when we measured the phosphorylation of p38 in the soleus of

WT and mIKK KO mice (second and third study) we did not find an increase in p-p38

after 14 days of hindlimb unloading (Figures 4.16 and 4.28). Other authors have

reported differences in the activation of cell signaling pathways between mice and rats.

For instance Hunter and co-workers did not find differences in the activation of p38 in

mice soleus muscle after 7 days of suspension (Hunter et al., 2002). This result raises

the question of whether there is a problem with animal models in research, that we will

discus at the end of the document.

A very relevant link between oxidative stress and muscle disuse atrophy

involves the redox regulation of the NF-кB family of transcriptional activators, that is

pivotal for various cellular processes ranging from inflammation to proliferation and

apoptosis (Hayden and Ghosh, 2004). Since this discovery, genetic and pharmacological

studies have provided accumulating evidence about the role of NF-кB in primary

muscle diseases (Peterson and Guttridge, 2008, Li et al., 2008, Bakkar and Guttridge,

2010, Peterson et al., 2011, Jackman et al., 2013).

Li and colleagues described the importance of the activation of NF-кB in muscle

atrophy pointing to 1) its ability to activate the ubiquitin-proteasome pathway, 2)

inductotion of inflammatory molecules, 3) interference with the differentiation process

required for regeneration of skeletal muscle, 4) blocking of myogenic differentiation

process (Li et al., 2008).

For these reasons, we tested whether XO-derived ROS were involved in the

activation of NF-кB signalling pathway in soleus muscle.

In the first study in rats, we found that both cytosolic p65 protein content (NF-

кB subunit) and NF-кB nuclear activity increased after 14 days of hindlimb unloading

(Figure 4.8 and Figure 4.9B, respectively). Allopurinol treatment partially reduced NF-

кB activity without concomitant prevention of p65 nuclear translocation (Figure 4.9A).

We also found a striking significant increase of p65 nuclear protein levels in control

animals treated with allopurinol.

Discussion

235

Although we found a clear activation of the NF-кB pathway in the soleus muscle

in the unloaded rats, treatment with allopurinol only partially prevented the cytosolic

phosphorylation and the nuclear activity of NF-кBp65. However, the translocation to

the nucleus of the p65 subunit was not prevented by treatment with allopurinol.

Sizemore et al. demonstrated that the α and β IKK subunits have distinct roles in the

regulation of the p65-p50 heterodimer. Whereas IKKβ is required for both NF-кB

translocation and p65 phosphorylation, IKKα is required solely for the phosphorylation

and activation of the p65 subunit, for this reason we decided to analyze specifically the

role of IKKα and NF-кB during hindlimb unloading (Sizemore et al., 2002).

In the second study with the mIKKα KO mice we measured the phosphorylation

of the p65 subunit and, we found that NF-кBp65 phosphorylation increases during

hindlimb unloading in the wild type group. However, in the mIKKα KO mice, this

activation was prevented (Figure 4.17).

In the third study we decided to use a specific inhibitor of NF-кB in combination

with allopurinol to mimic pharmacologically the study number two. Many authors show

that indomethacin can inhibit the loss of muscle mass by modulating the expression and

activity of NF-кB (Ruff and Secrist, 1984, Zhou et al., 2003, Hitt et al., 2005, Lin et al.,

2010). The inhibitory effects of indomethacin on NF-кB activation may be one of this

mechanisms with antiinflammatory actions (Hu et al., 2001). We have demonstrated

that hindlimb unloading can activate NF-кB signalling pathway in mice skeletal muscle.

We have found a tendency to increase in the cytosolic content of p-p65 subunit after 14

days of hindlimb unloading. We consider that this effect is not statistically significantly

because it was determined in gastrocnemius muscle (composed mostly by fibers type II)

which is known to be less atrophied during suspension than the postural soleus muscle.

We found a slight effect on the inhibition of NF-кB by indomethacin, probably due to

the low dose administered (0.6mg/kg body weight / day) orally (See figure 4.29). These

results coincide with those described previously by Zhou et al. who observed that the

very low dose of indomethacin induced only a partial decrease in the activation of NF-

кB, delaying muscle atrophy in cancer cachexia (Zhou et al., 2003).

The administration of allopurinol had the same effect that we found in the first

study with rats, a partial inhibition of p-p65. However, the administration of

Discussion

236

indomethacin plus allopurinol inhibited completely the cytosolic phosphorylation of

NF-кBp65 (See figure 4.29), suggesting that may coexist two different activation

pathways of NF-кB in the unloading atrophy model. When we measured the nuclear

activation of NF-кB we found that the three treatments partially prevented it after

hindlimb unloading, without a synergistic effect in the administration of allopurinol plus

indomethacin (see figure 4.30).

We have described previously that the Akt/mTOR pathway is up-regulated

during hypertrophy and down-regulated during muscle atrophy. Muscle unloading

might cause Akt decline or inactivation. Akt activates downstream targets to mediate

protein synthesis, but muscle disuse reduces Akt activation below control levels

(Bodine, 2001). Confirming the results previously reported by other studies (Kachaeva

and Shenkman, 2012, Lomonosova et al., 2012), after hindlimb suspension we found a

significant decrease in skeletal muscle Akt activation in mice (See figures 4.18 and

4.31).

Regarding the second study, we have to point out that both IKKα and IKKβ can

inhibit the phosphorylation of Akt (Reed et al., 2011). Our results show that during the

hindlimb unloading mIKKα KO mice partially maintain basal levels of p-Akt, restoring

the inhibited protein synthesis in wild type mice during unloading (Figure 4.18).

In the third study, our results show that treatment with indomethacin does not

restore the decrease in p-Akt during unloading. This result can be understood

considering previously published data reporting that phosphorylation of Akt is

diminished by indomethacin treatment in vitro (Niu et al., 2012, Zheng et al., 2014). We

can also observe that treatment with allopurinol significantly increased p-Akt during the

hindlimb unloading. Previously it has been shown that allopurinol enhanced the effects

of NAC in restoring phosphorylation of Akt in diabetic rats (Wang et al., 2011). Finally,

the administration of indomethacin plus allopurinol restores basal levels of p-Akt,

without the significant increase observed in the unloaded group treated with allopurinol

alone, probably due to the inhibitory effect of indomethacin on the activation of Akt.

To identify the mechanism by which the treatments prevent the loss of muscle

mass after hindlimb unloading through the activation of p38 and NF-кB and the

inhibition of IGF / Akt pathways, we determined the expression of two well know

Discussion

237

targets genes of these pathways: MAFbx and MuRF-1. They have been previously

described as muscle specific E3 ubiquitin ligases involved in several in vivo models of

skeletal muscle atrophy, including fasting, diabetes, cancer, renal failure, hindlimb

suspension, immobilization, denervation, sepsis, and lipopolysaccharide administration

(Bodine et al., 2001a, Dehoux et al., 2003).

It was described previously that the activation of ubiquitin ligases MuRF1 and

MAFbx in skeletal muscle were mediated by p38 and NF-кB, respectively (Cai et al.,

2004, Glass, 2005, Li et al., 2005). On the other hand, it is known that, under muscle

wasting conditions, such as disuse, diabetes and fasting, Akt is necessary to inhibit

upregulation of the atrophy markers MuRF1 and MAFbx, via inhibition of Foxo (Lee et

al., 2004, Sandri et al., 2004, Stitt et al., 2004).

In the first study we found that hindlimb unloading induced the expression of

MAFbx and MuRF-1 in soleus muscle (Figures 4.10, panels A and B). Increments of

MAFbx and MuRF 1 are associated with immobilization-induced increases of

proteasome dependent proteolysis. Treatments such as vitamin E (Servais et al., 2007)

and resistance exercise (Haddad et al., 2006) blunt the induction of the atrogenes

following unloading. In our case, allopurinol treatment only prevented the

overexpression of p38/MAFbx pathway, without preventing MuRF-1 activation (Derbre

et al., 2012). These data suggest the MAFbx and MuRF-1 genes are the downstream

targets of p38 MAPK and NF-кB signaling and, that we need other treatments to inhibit

NF-кB/MuRF-1 pathway and have a more effective prevention of muscle atrophy.

In the second study, we found that hindlimb unloading induced the expression of

MAFbx and MuRF-1 in mice soleus muscle (Figure 4.19, panels A and B). As

expected, a significant prevention in the activation of the IKKα/NF-кB/MuRF-1patway

was found in the mIKKα KO animals.

Several studies indicate that decreased IGF-1/PI3K/Akt signaling pathway

increases the expression of MAFbx and MuRF-1, resulting in muscle atrophy.

Moreover, it has been recently found by Nakao et al that a new ubiquitin-ligase, Cbl-b,

has a role in the downregulation of IGF-1/Akt signaling in skeletal muscle under

unloading conditions (Nakao et al., 2009). Thus, we measured Cbl-b expression and we

Discussion

238

found that Cbl-b mRNA expression is increased in the soleus of the unloaded wild type

animals but this increment is partially prevented in the mIKK KO unloaded group

(Figure 4.19, panel C). Our study does not identify the mechanism by which the lack of

IKKα decreases Cbl-b mRNA levels. The Cbl-b was described as a gene highly

sensitive to mechanical stress (unloading) (Nikawa et al., 2004, Ogawa et al., 2006). We

observed previously that our mIKKα KO mice were more protected against oxidative

stress induced during the suspension as they kept the levels of the antioxidant enzyme

MnSOD and had less oxidative damage to lipids (lower levels of MDA) compared to

unloaded wild type mice. This is why we hypothesize that this safeguard that had the

mIKKα KO mice versus the wild-type would cause the decreased expression of Cbl-b.

Finally, in the third study our results showed that unloaded mice had high

MAFbx, MuRF-1 and Cbl-b mRNA levels. Treatment with indomethacin and

allopurinol did not significantly prevent these increments (Figure 4.32). However, the

coadministration of indomethacin plus allopurinol had a synergistic effect between the

two treatments, and it was able to reduce significantly the mRNA expression of the

three ubiquitin-ligases, MAFbx, MuRF-1 and Cbl-b, decreasing muscle protein

unloaded-breakdown.

5.6. Inflammatory parameters are involved in muscle atrophy

associated to hindlimb unloading.

Numerous studies have demonstrated that inflammatory cytokines can cause

atrophic changes in cultured myotubes, and in vivo studies have demonstrated that

activation of inflammatory signaling pathways are fundamental for the atrophy process

(Zamir et al., 1994, Acharyya et al., 2004, Doyle et al., 2011). However, the catabolic

effects of inflammation in vivo do not depend exclusively on direct cytokine action on

skeletal muscle (Braun et al., 2011).

The transcription factor NF-кB is the central mediator of inflammatory

responses and immune function. NF-кB is a mediator of the cytokine TNF-α which

plays an important role in skeletal muscle atrophy. In addition, NF-кB has been shown

to control the induced transcription of the cyclooxygenase-2 (COX-2) gene (Schmedtje

et al., 1997, Jobin et al., 1998). Cyclooxygenase-1 and -2 (COX-1 and COX-2) catalyze

Discussion

239

the conversion of arachidonic acid (AA) and O2 to generate prostaglandins (PGs).

Whereas COX-1 is constitutively expressed, COX-2 is inducible expressed in most

mammalian cells. COX-2 plays a major role in inflammatory processes, and its

expression has been correlated with several diseases associated with inflammation

(Eberhart et al., 1994, Dubois et al., 1998).

As mentioned previously (Dumais et al., 1998, Straus et al., 2000), NF-кB can

up-regulate COX-2 expression. Additionally, recent evidence indicates that COX-2

activity may also affect NF-кB. NF-кB transactivation is increased by PGE2, resulting

in an overexpression of inflammatory genes, such as IL-8. When there are more

cyclopentenone prostaglandins than PGE2, the first ones inhibit the IKK

phosphorylation and consequently the NF-кB activation.

Finally, the inflammation is reduced by a negative feedback cycle reducing NF-

кB activity by decreased COX-2 gene expression (Figure 5.1).

Figure 5.1. Positive and negative regulation of NF-кB by COX-2, roles of prostaglandins.

Adapted of (Poligone and Baldwin, 2001)

Discussion

240

Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) inhibit COX-2 expression and

reduce prostaglandin synthesis too (Aeberhard et al., 1995). It is known that some anti-

inflammatory agents (e.g. salicylates, dexamethasone, indomethacin) can diminish

muscle inflammation by inhibiting NF-кB via COX-2 suppression (Pizza et al., 1998).

In our study we used the indomethacin administration as an anti-inflammatory

agent. To verify that the effect of indomethacin in NF-кB inhibition had successfully

occurred, we measured the plasmatic prostaglandin levels (See figure 4.26). We found

that plasmatic prostaglandin levels were elevated significantly after 2 weeks of hindlimb

unloading. Treatment with allopurinol and indomethacin plus allopurinol completely

inhibited this increase but not the indomethacin administration alone (Figure 4.26). This

was an unexpected result that could be explain if we take into account that the

indomethacin treatment possibly induced certain level of renal toxicity. We observed

intracellular edema and signs of inflammation in the renal cortex in the indomethacin

treated animals. Regarding the results obtained on the effect of the allopurinol

administration on the prostaglandin levels it is important to mention that allopurinol

prevents kidney diseases (Siu et al., 2006, Goicoechea et al., 2010, Thurston et al.,

2013, Bose et al., 2014). Moreover we would like to point out that administration of

allopurinol has been highlighted as an important anti-inflammatory in many diseases,

including renal failure (Goicoechea et al., 2010, Thurston et al., 2013, Bhasin et al.,

2014). Therefore, we can see that both the administration of allopurinol and its

combination with indomethacin reduces prostaglandin synthesis by inhibiting COX-2.

This suggests that NF-кB activation may be decreased through the COX-2 inhibition

(Egan et al., 2004, Granado et al., 2007).

During the last decade, skeletal muscle has been identified as a both endocrine

and paracrine organ secreting the cytokines called miokines. IL-6 is a pleiotropic

cytokine associated with the control and coordination of immune responses (Serrano et

al., 2008) and it is mainly produced by the adipose tissue and skeletal muscle (Glund

and Krook, 2008). A conventional view has attributed an inflammatory role to IL-6, by

mediating the activation of anti-inflammatory pathways on target cells. High plasma

concentrations of IL-6 have been found in pathological conditions such as sarcopenia in

the elderly, cachexia, and insulin resistance (Kern et al., 2001, Baltgalvis et al., 2008).

Chronic IL-6 administration directly to skeletal muscle induces atrophy (Haddad et al.,

Discussion

241

2005). Transgenic mice over-expressing IL-6 at high levels in all tissues and in the

system also demonstrate muscle atrophy (Tsujinaka et al., 1995). However, this role of

IL-6 has been recently questioned. In the last years a growing body of experimental data

indicates the involvement of IL-6 as an anti-inflammatory molecule that plays an

important role in the regulation of muscle cells. Notably, the beneficial function of local

and transiently produced IL-6 is opposed to the known muscle-wasting effect of infused

IL-6 or high systemic levels of IL-6 in cachexic conditions (Haddad et al., 2005,

Tisdale, 2005). IL-6 is also a muscle mitogen that can activate cell proliferation in

skeletal muscle (Cantini et al., 1995), including satellite cells (Hawke and Garry, 2001).

Years ago it was confirmed that both human primary myoblasts and murine

C2C12 myogenic cells produce IL-6. (Bartoccioni et al., 1994, De Rossi et al., 2000).

Later it was shown that IL-6 increased in response to hypertrophic stimulus such as

contracting muscle fibers (i.e. during exercise (Pedersen and Fischer, 2007)) and

workload (Jonsdottir et al., 2000, Keller et al., 2001, Carson et al., 2002, Penkowa et al.,

2003, Hiscock et al., 2004) inducing satellite cell activation and stimulating an increase

in muscle mass. Subsequently it has been shown that IL-6 induces satellite cell

proliferation (Kurosaka and Machida, 2013). Other studies have shown that IL-6

regulates muscle growth, as the IL-6 deficient knockout mice muscle decreases the

growth of muscle fibers (Serrano et al., 2008, Washington et al., 2011). Additionally the

deficiency of IL-6 causes problems in the proliferation and migration of satellite cells,

causing the same effect in myoblasts, precluding subsequent myonuclear accumulation

in the existing myofibers (Serrano et al., 2008).

It has been shown that muscle IL-6 expression is increased during recovery from

disuse atrophy (Childs et al., 2003). After induction of muscle atrophy by hindlimb

unloading for 10 days in wild type and IL-6 knockout mice, Washington et al. used four

different periods of recovery (0, 1, 7, 14 days). Their results showed the same atrophy in

both groups after 10 days of unloading. However, mice lacking IL-6 had attenuated

recovery in the gastrocnemius muscle mass. This was related to the initial suppression

of muscle IGF-1 expression and associated Akt/mTOR activation and to the STAT3

(Serrano et al., 2008).

Taking this background into account to find a marked inflammation (measured

at the level of prostaglandins) we decided to measure the muscle IL-6 levels in our mice

following 14 days of unloading and the effect of the different treatments.

Discussion

242

Our results agree with those obtained in studies describing the IL-6 as an anti-

inflammatory miokine. We found that soleus muscle concentration of IL-6 was

decreased during 14 days of hindlimb unloading. Both, allopurinol treatment and the

combined treatment, indomethacin plus allopurinol, inhibited significantly this increase,

while indomethacin administration alone prevented it only partially (Figure 4.27).

We are aware of the discrepancies in the results found between the rat and

mouse models. Apart from all the comments on this regard that we have included in

"limitations of the study", we consider that we should open a debate to highlight the

existing problem that the scientific community have with the experimental models

(Jelnes et al., 2007, Byrnes et al., 2010). Several researchers believe that the results

from animal experiments cannot be applied to humans because of the biological

differences between the species and because the results in animal experiments often

depend on the type of animal model (Croce, 1999, Sandercock and Roberts, 2002,

Macleod M, 2005). For instance, it has been shown that genomic responses in mouse

models poorly mimic human inflammatory diseases (Seok et al., 2013). Therefore we

consider that it is convenient to perform human clinical trials before extrapolating the

data obtained in this doctoral thesis to humans.

Discussion

243

5.7. Skeltal muscle atrophy associated to STZ-induced type 1

diabetes.

Oligosaccharides are regarded as prebiotics (Gibson and Roberfroid, 1995,

Gibson, 2010). Prebiotics are defined as “non-digestible dietary ingredients that

beneficially affect the host by selectively stimulating the growth and/or activity of one

or a limited number of bacteria in the colon, thus improving host health” (Gibson and

Roberfroid, 1995). In the most recently updated definition, “a dietary prebiotic is a

selectively fermented ingredient that results in specific changes in the composition

and/or activity of the gastrointestinal microbiota, thus conferring benefit(s) upon host

health” (Gibson et al., 2010). Oligosaccharides have been reported to decrease the

incidence of chronic diseases such as insulin resistance, diabetes mellitus, hypertension,

and metabolic syndrome (Alvarez-Sala Walther et al., 1996, Cani et al., 2007).

Moreover, recently it has been tested the role of oligosaccharides in the

prevention of muscle atrophy in type 2 diabetes (Xu et al., 2011, Lin et al., 2011, Li et

al., 2012). We wanted to test the effects of an α-galacto-oligosaccharide (OGT) in the

prevention of muscle atrophy in STZ-diabetic rats.

In our study the diabetes was confirmed by the increment of fasting glucose and

fructosamine plasmatic levels in STZ-induced diabetic rats relative to the control group

(Table 4.1). In addition, we found lower fasting insulin levels in diabetic animals. As

insulin is the major regulator of muscle insulin uptake, it could give us an idea of that

was disrupted the insulin-stimulated glucose uptake into muscle too (Jensen et al.,

2011).

We found that the treatment with OGT decreased significantly only the plasma

fructosamin values. It indicates that hyperglycemia was lasted all the experiment and

was associated with a pro-oxidant state, inasmuch as fructosamin level is considered as

a marker of glycated proteins (Poli et al., 1987), and that OGT treatment can prevents it.

Since the late 80's to the present it has been confirmed that muscle atrophy in

STZ-induced type 1 diabetes is characterized by an increase in muscle protein

degradation and a decrease in its synthesis (Smith et al., 1989) leading to a reduction in

muscle size (Price et al., 1996, Lecker et al., 2004). Several researchers have found that

Discussion

244

rodents supplemented with vitamin E and dehydroepiandrosterone (multifunctional

steroid secreted by the adrenal gland and brain with antioxidant properties) (Aragno et

al., 2002, Aragno et al., 2004), and submitted to exercise training (Chen et al., 2011),

exhibit less oxidative damage and muscle atrophy in STZ-diabetes models.

In our study, we weighed the anterior tibial and gastrocnemius muscles. We

found a significant decrease in their weights (44.2% and 42.1%). That were prevented

significantly by 12.5% and 15.3% respectively after administration of GOT (Figure

4.34).

Hyperglycemia, which occurs in STZ-induced diabetes, is associated with

oxisative stress (Bonnefont-Rousselot et al., 2000). In diabetes the oxidative injury is

mainly attributable to increased production of ROS and changes of the antioxidant

defense systems (Chang et al., 1993, Baynes and Thorpe, 1999). Superoxide dismutase

(SOD) is a crucial enzymatic defense system with an antioxidant role conferred, that

plays an important role in controlling the oxidation level of constitutive cellular

components (Brocca et al., 2008). For these reasons we measured the two forms of

superoxide dismutase in the atrophied muscle. We found that T1DM decreased

significantly the protein levels of the MnSOD in the tibialis anterior of the rats (-38.5%;

p<0.01) (Figure 4.35A). Treatment with OGT partially prevented this decrement (-

25.5%). On the other hand, Figure 4.35B shows that T1DM did not produce changes in

the levels of CuZnSOD. Suggesting that mitochondria have a great involvement in

skeletal muscle atrophy in this model.

The relationship between diabetes, phosphorylation of p38, and protein

degradation in skeletal muscle was observed in type 2 diabetic patients (Koistinen et al.,

2003). It was proposed that direct exposure of mammalian skeletal muscle to an

oxidative stress disturbs the insulin signaling pathway via the stimulation of p38 MAPK

(Henriksen et al., 2011). Also, it has been described the increased phosphorylation of p-

38 in skeletal muscle of STZ-diabetic rats (Hsu et al., 2013). Our study shows that in

skeletal muscle, STZ treatment up-regulates p38 MAPK phosphorylation. Interestingly,

OGT treatment prevents p38 MAPK activation (Figure 4.36).

Discussion

245

It can give us an idea that OGT supplementation partially prevents the loss of

muscle mass due to T1DM, maybe by limiting oxidative stress and p38 pathway

activation.

Finally, type 1 diabetes is an autoimmune inflammatory disease of the pancreatic

islets (Dixon et al., 2001). Several important pathophysiological development of

complications associated with this disease (hyperglycemia, hyperlipidemia, formation

and accumulation of advanced glycation end products, oxidative stress) and the

progressive and simultaneous decline of antioxidant defense mechanisms factors may

lead to the activation of NF-кB (El-Serag and Everhart, 2002, El-Serag et al., 2004).

Previously, it was confirmed that muscles from STZ-injected rats display

increased NF-кBp65 content without activation of the canonical pathway (Frier et al.,

2008, Kelleher et al., 2010).

Our results show that the NF-кBp65 content increased 38.7% (p=0.08) in the

cytosolic fractions of tibialis anterior of the diabetic animals, but the treatment with

OGT did not prevent this increment (-15.4%) (Figure 4.37).

Dr. Delamarche’s group demonstrated previously that the same α-galacto-

oligosaccharide combined with soy isoflavones supplementation normalized muscle

glucose level without restoring glycogen content and exhibited antioxidant and anti-

inflammatory properties in vivo in streptozotocin-induced diabetic rats. (Malardé et al.,

2013). Displaying these results we can hypothesize that the administration of the soy-

isoflavones plus the OGT could have a greater effect in preventing muscle atrophy in

STZ-induced diabetes.

CONCLUSIONES/CONCLUSIONS

Conclusiones

249

Los estudios realizados y los resultados descritos anteriormente permiten extraer

las siguientes conclusiones:

1. La actividad de la XO aumenta tras aplicar un protocolo de suspensión de

miembros posteriores tanto en ratas como ratones. Este aumento se previene

completamente mediante la administración de alopurinol.

2. La suspensión de miembros posteriores induce una disminución del mediador

inflamatorio IL-6 en el músculo esquelético y un aumento periférico de la 6-keto

prostaglandina F1α. Los tratamientos más efectivos para restituirlos son el

alopurinol y la indometacina más alopurinol.

3. El protocolo de suspensión de miembros posteriores induce una significativa

atrofia muscular (disminución del peso de los soleos, del CSA, del tamaño de las

fibras y del contenido de miosina). Los tratamientos con alopurinol,

indometacina, así como la supresión muscular de IKKα previene parcialmente

dicha atrofia muscular, siendo el tratamiento más efectivo la coadministración

de indometacina más alopurinol.

4. La suspensión de miembros posteriores origina la activación de dos cascadas de

señalización (p38-MAFbx) y (NF-кB-MuRF1-MHC1). El tratamiento con

alopurinol inhibe la primera vía, observándose incongruencias en la inhibición

de la vía NF-кB-MuRF1-MHC1, en ratas. No obstante, en ratones, el

tratamiento más efectivo para inhibir ambas vías fue la administración de

indometacina más alopurinol. La supresión muscular de IKKα inhibe

significativamente la vía dependiente de NF-кB.

5. La suspensión de miembros posteriores aumenta la expresión de la E3 ubiquitin-

ligasa Cbl-b, provocando una disminución de Akt. Los tratamientos con

alopurinol e indometacina más alopurinol restituyen dicha vía de síntesis

proteica, mientras que en los ratones mIKKα KO se revierte parcialmente.

6. El estrés oxidativo asociado a la diabetes inducida por estreptozotocina en ratas

produce una significativa pérdida de masa muscular.

7. Tanto la fosforilación de p38, como de NF-кB aumenta en el músculo atrofiado

en ratas diabéticas.

Conclusiones

250

8. La administración de α-galacto-oligosacáridos previene la disminución de la

enzima antioxidante MnSOD, así como la fosforilación de p38, sin observarse

una prevención significativa en la pérdida de masa muscular de las ratas

diabéticas.

Conclusions

251

Studies carried out and the results described above lead to the following

conclusions:

1. Rat and mouse XO activity is increased after a hindlimb unloading protocol.

Allopurinol administration prevents this increase.

2. Hindlimb unloading protocols induce a decrease in IL-6 skeletal muscle and an

increase of 6-keto prostaglandin F1α. Allopurinol and the combination of

indomethacin and allopurinol are the most effective treatments to restitute their

initial levels.

3. Hindlimb unloading protocols induce a significant muscle atrophy (decrease of

soleus weight, CSA, fiber size and myosin content). Treatment with allopurinol

and indomethacin, as well as muscle suppression of IKKα partially prevent this

atrophy, the coadministration of allopurinol and indomethacin being the most

effective treatment.

4. Hindlimb unloading protocol activate two signaling pathways: p38-MAFbx and

NF-кB-MuRF1-MHC1. Allopurinol treatment inhibits the former, although

some inconsistencies were found in the inhibition of the NF-кB-MuRF1-MHC1

pathway in rats. In any case, in mice, the coadministration of allopurinol and

indomethacin was the most effective treatment to inhibit the NF-кB dependent

pathway.

5. Hindlimb unloading protocol increase E3 ubiquitin ligase Cbl-b, thereby

decreasing Akt. The treatments with allopurinol and the coadministration of

allopurinol and indomethacin restore this protein synthesis pathway, while it is

partially reverted in mIKKα KO mice.

6. Oxidative stress associated to diabetes induced by streptozotocine in rats

produces a significant loss of muscle mass.

7. Both phosphorylation of p38 and NF-кB are increased in the atrophied muscle in

diabetic rats.

Conclusions

252

8. α-galacto-oligosaccharides administration prevents the reduction of the MnSOD

antioxidant enzyme, as well as the p38 phosphorylation, but a significant

prevention of muscle mass loss is not observed in diabetic rats.

BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía

255

Acharyya, S., Ladner, K. J., Nelsen, L. L., Damrauer, J., Reiser, P. J., Swoap, S. &

Guttridge, D. C. 2004. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of

skeletal muscle gene products. J Clin Invest, 114, 370-8.

Aeberhard, E. E., Henderson, S. A., Arabolos, N. S., Griscavage, J. M., Castro, F. E.,

Barrett, C. T. & Ignarro, L. J. 1995. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs

inhibit expression of the inducible nitric oxide synthase gene. Biochem Biophys

Res Commun, 208, 1053-9.

Alberti, K. G. & Zimmet, P. Z. 1998. Definition, diagnosis and classification of diabetes

mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes

mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med, 15, 539-53.

Albertini, R., Rindi, S., Passi, A., Bardoni, A., Salvini, R., Pallavicini, G. & De Luca,

G. 1996. The effect of cornea proteoglycans on liposome peroxidation. Arch.

Biochem. Biophys., 327, 207-214.

Alvarez-Sala Walther, L. A., Millán Núñez-Cortés, J. & de Oya Otero, M. 1996. [The

Mediterranean diet in Spain. Legend or reality? (II). Other elements in the

Mediterranean diet: vegetables and fruits, fish. Evolution of the diet and

cardiovascular diseases in Spain in the last decades]. Rev Clin Esp, 196, 636-46.

Allen, D. L., Yasui, W., Tanaka, T., Ohira, Y., Nagaoka, S., Sekiguchi, C., Hinds, W.

E., Roy, R. R. & Edgerton, V. R. 1996. Myonuclear number and myosin heavy

chain expression in rat soleus single muscle fibers after spaceflight. J Appl

Physiol (1985), 81, 145-51.

Allen, W. M., Bradley, R., Berrett, S., Parr, W. H., Swannack, K., Barton, C. R. &

Macphee, A. 1975. Degenerative myopathy with myoglobinuria in yearling

cattle. Br Vet J, 131, 292-308.

Ames, B. N. 1983. Dietary carcinogens and anticarcinogens. Oxygen radicals and

degenerative diseases. Science, 221, 1256-64.

Ames, B. N., Shigenaga, M. K. & Hagen, T. M. 1993. Oxidants, antioxidants, and the

degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 7915-7922.

Amir, R. E., Haecker, H., Karin, M. & Ciechanover, A. 2004. Mechanism of processing

of the NF-kappa B2 p100 precursor: identification of the specific polyubiquitin

chain-anchoring lysine residue and analysis of the role of NEDD8-modification

on the SCF(beta-TrCP) ubiquitin ligase. Oncogene, 23, 2540-7.

Andersen, H., Gadeberg, P. C., Brock, B. & Jakobsen, J. 1997. Muscular atrophy in

diabetic neuropathy: a stereological magnetic resonance imaging study.

Diabetologia, 40, 1062-9.

Andersen, H., Poulsen, P. L., Mogensen, C. E. & Jakobsen, J. 1996. Isokinetic muscle

strength in long-term IDDM patients in relation to diabetic complications.

Diabetes, 45, 440-5.

Angermüller, S., Bruder, G., Völkl, A., Wesch, H. & Fahimi, H. D. 1987. Localization

of xanthine oxidase in crystalline cores of peroxisomes. A cytochemical and

biochemical study. Eur J Cell Biol, 45, 137-44.

Anker, S. D. & Rauchhaus, M. 1999. Insights into the pathogenesis of chronic heart

failure: immune activation and cachexia. Curr Opin Cardiol, 14, 211-6.

Aragno, M., Mastrocola, R., Brignardello, E., Catalano, M., Robino, G., Manti, R.,

Parola, M., Danni, O. & Boccuzzi, G. 2002. Dehydroepiandrosterone modulates

nuclear factor-kappaB activation in hippocampus of diabetic rats.

Endocrinology, 143, 3250-8.

Aragno, M., Mastrocola, R., Catalano, M. G., Brignardello, E., Danni, O. & Boccuzzi,

G. 2004. Oxidative stress impairs skeletal muscle repair in diabetic rats.

Diabetes, 53, 1082-8.

Bibliografía

256

Aranda, R., Domenech, E., Rus, A. D., Real, J. T., Sastre, J., Vina, J. & Pallardo, F. V.

2007. Age-related increase in xanthine oxidase activity in human plasma and rat

tissues. Free Radic Res, 41, 1195-200.

Atalay M., L. D. E. 2002. Diabetes, oxidative stress and physical exercise Journal of

Sports Science and Medicine, 1, 1-14

Baeuerle, P. A. 1998. IkappaB-NF-kappaB structures: at the interface of inflammation

control. Cell, 95, 729-31.

Baeuerle, P. A. & Henkel, T. 1994. Function and activation of NF-kappa B in the

immune system. Annu Rev Immunol, 12, 141-79.

Baeza-Raja, B. & Muñoz-Cánoves, P. 2004. p38 MAPK-induced nuclear factor-kappaB

activity is required for skeletal muscle differentiation: role of interleukin-6. Mol

Biol Cell, 15, 2013-26.

Bakkar, N. & Guttridge, D. C. 2010. NF-kappaB signaling: a tale of two pathways in

skeletal myogenesis. Physiol Rev, 90, 495-511.

Baldwin, K. M. & Haddad, F. 2001. Effects of different activity and inactivity

paradigms on myosin heavy chain gene expression in striated muscle. J Appl

Physiol (1985), 90, 345-57.

Baltgalvis, K. A., Berger, F. G., Pena, M. M. O., Davis, J. M., Muga, S. J. & Carson, J.

A. 2008. Interleukin-6 and cachexia in ApcMin/+ mice. Am J Physiol Regul

Integr Comp Physiol, 294, R393-401.

Bar-Shai, M., Carmeli, E., Ljubuncic, P. & Reznick, A. Z. 2008. Exercise and

immobilization in aging animals: the involvement of oxidative stress and NF-

kappaB activation. Free Radic Biol Med, 44, 202-14.

Barbieri, E. & Sestili, P. 2012. Reactive oxygen species in skeletal muscle signaling. J

Signal Transduct, 2012, 982794.

Barrios, C., Hadala, M., Almansa, I., Bosch-Morell, F., Palanca, J. M. & Romero, F. J.

2011. Metabolic muscle damage and oxidative stress markers in an America's

Cup yachting crew. Eur J Appl Physiol, 111, 1341-50.

Bartoccioni, E., Michaelis, D. & Hohlfeld, R. 1994. Constitutive and cytokine-induced

production of interleukin-6 by human myoblasts. Immunol Lett, 42, 135-8.

Bashan, N., Kovsan, J., Kachko, I., Ovadia, H. & Rudich, A. 2009. Positive and

negative regulation of insulin signaling by reactive oxygen and nitrogen species.

Physiol Rev, 89, 27-71.

Baynes, J. W. 1991. Role of oxidative stress in development of complications in

diabetes. Diabetes, 40, 405-12.

Baynes, J. W. & Thorpe, S. R. 1999. Role of oxidative stress in diabetic complications:

a new perspective on an old paradigm. Diabetes, 48, 1-9.

Becker, B. F. 1993. Towards the physiological function of uric acid. Free Radic Biol

Med, 14, 615-31.

Beckman, J. S., Beckman, T. W., Chen, J., Marshall, P. A. & Freeman, B. A. 1990.

Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for

endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci U S A,

87, 1620-4.

Beckman, J. S., Parks, D. A., Pearson, J. D., Marshall, P. A. & Freeman, B. A. 1989. A

sensitive fluorometric assay for measuring xanthine dehydrogenase and oxidase

in tissues. Free Radic Biol Med, 6, 607-15.

Beere, P. A., Russell, S. D., Morey, M. C., Kitzman, D. W. & Higginbotham, M. B.

1999. Aerobic exercise training can reverse age-related peripheral circulatory

changes in healthy older men. Circulation, 100, 1085-94.

Bibliografía

257

Benboubetra, M., Gleeson, A., Harris, C. P., Khan, J., Arrar, L., Brennand, D., Reid, J.,

Reckless, J. D. & Harrison, R. 1997. Circulating anti-(xanthine oxidoreductase)

antibodies in healthy human adults. Eur J Clin Invest, 27, 611-9.

Bender, K., Göttlicher, M., Whiteside, S., Rahmsdorf, H. J. & Herrlich, P. 1998.

Sequential DNA damage-independent and -dependent activation of NF-kappaB

by UV. EMBO J, 17, 5170-81.

Berg, H. E., Larsson, L. & Tesch, P. A. 1997. Lower limb skeletal muscle function after

6 wk of bed rest. J Appl Physiol (1985), 82, 182-8.

Bermejo, P., Gómez-Serranillos, P., Santos, J., Pastor, E., Gil, P. & Martín-Aragón, S.

1997. Determination of malonaldehyde in Alzheimer's disease: a comparative

study of high-performance liquid chromatography and thiobarbituric acid test.

Gerontology, 43, 218-22.

Berne, R. M. 1963. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of

coronary blood flow. Am J Physiol, 204, 317-22.

Betters, J. L., Criswell, D. S., Shanely, R. A., Van Gammeren, D., Falk, D., Deruisseau,

K. C., Deering, M., Yimlamai, T. & Powers, S. K. 2004. Trolox attenuates

mechanical ventilation-induced diaphragmatic dysfunction and proteolysis. Am J

Respir Crit Care Med, 170, 1179-84.

Beveridge, L. A., Ramage, L., McMurdo, M. E. T., George, J. & Witham, M. D. 2013.

Allopurinol use is associated with greater functional gains in older rehabilitation

patients. Age Ageing, 42, 400-4.

Bhasin, B., Stiburkova, B., De Castro-Pretelt, M., Beck, N., Bodurtha, J. N. & Atta, M.

G. 2014. Hereditary renal hypouricemia: a new role for allopurinol? Am J Med,

127, e3-4.

Bieber, J. D. & Terkeltaub, R. A. 2004. Gout: on the brink of novel therapeutic options

for an ancient disease. Arthritis Rheum, 50, 2400-14.

Bielsky, B. H. & Gebieki, J. M. 1977. Application of radiation chemistry to biology. In:

W.A., P. (Ed.) Free radicals in biology., Academic Press.

Biemond, P., Swaak, A. J., Beindorff, C. M. & Koster, J. F. 1986. Superoxide-

dependent and -independent mechanisms of iron mobilization from ferritin by

xanthine oxidase. Implications for oxygen-free-radical-induced tissue

destruction during ischaemia and inflammation. Biochem J, 239, 169-73.

Bodine, S. C., Latres, E., Baumhueter, S., Lai, V. K., Nunez, L., Clarke, B. A.,

Poueymirou, W. T., Panaro, F. J., Na, E., Dharmarajan, K., Pan, Z. Q.,

Valenzuela, D. M., DeChiara, T. M., Stitt, T. N., Yancopoulos, G. D. & Glass,

D. J. 2001a. Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle

atrophy. Science, 294, 1704-8.

Bodine, S. C., Stitt, T. N., Gonzalez, M., Kline, W. O., Stover, G. L., Bauerlein, R.,

Zlotchenko, E., Scrimgeour, A., Lawrence, J. C., Glass, D. J. 2001. Akt/mTOR

pathway is a crucial regulator of skeletal muscle hypertrophy and can prevent

muscle atrophy in vivo. . Nat. Cell Biol., 3, 1014-1019.

Bonnefont-Rousselot, D., Bastard, J. P., Jaudon, M. C. & Delattre, J. 2000.

Consequences of the diabetic status on the oxidant/antioxidant balance. Diabetes

Metab, 26, 163-76.

Boonyarom, O., Kozuka, N., Matsuyama, K. & Murakami, S. 2009. Effect of electrical

stimulation to prevent muscle atrophy on morphologic and histologic properties

of hindlimb suspended rat hindlimb muscles. Am J Phys Med Rehabil, 88, 719-

26.

Booth, F. W. 1982. Effect of limb immobilization on skeletal muscle. J Appl Physiol

Respir Environ Exerc Physiol, 52, 1113-8.

Bibliografía

258

Booth, F. W. & Seider, M. J. 1979. Early change in skeletal muscle protein synthesis

after limb immobilization of rats. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol,

47, 974-7.

Booth, F. W. & Zwetsloot, K. A. 2010. Basic concepts about genes, inactivity and

aging. Scand J Med Sci Sports, 20, 1-4.

Borel, J. P., Monboisse, J. C. & Bellon, G. 1988. Med. Sci., 5, 304-311.

Borina, E., Pellegrino, M. A., D'Antona, G. & Bottinelli, R. 2010. Myosin and actin

content of human skeletal muscle fibers following 35 days bed rest. Scand J

Med Sci Sports, 20, 65-73.

Bose, B., Badve, S. V., Hiremath, S. S., Boudville, N., Brown, F. G., Cass, A., de

Zoysa, J. R., Fassett, R. G., Faull, R., Harris, D. C., Hawley, C. M., Kanellis, J.,

Palmer, S. C., Perkovic, V., Pascoe, E. M., Rangan, G. K., et al. 2014. Effects of

uric acid-lowering therapy on renal outcomes: a systematic review and meta-

analysis. Nephrol Dial Transplant, 29, 406-13.

Bowie, A. G., Moynagh, P. N., and O’Neill, L. A. J. 1997. Lipid peroxidation is

involved in the activation of NF-kappaB by tumor necrosis factor but not

interleukin-1 in the human endothelial cell line ECV304. Lack of involvement

of H2O2 inNF-kappaB activation by either cytokine in both primary and

transformed endothelial cells. J. Biol. Chem., 272, 25941–25950.

Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal

Biochem, 72, 248-54.

Braun, T. P., Zhu, X., Szumowski, M., Scott, G. D., Grossberg, A. J., Levasseur, P. R.,

Graham, K., Khan, S., Damaraju, S., Colmers, W. F., Baracos, V. E. & Marks,

D. L. 2011. Central nervous system inflammation induces muscle atrophy via

activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. J Exp Med, 208, 2449-63.

Bray, R. C. 1975. in: The Enzymes, 3rd ed., Vol. 12 (P. D. Boyer, ed.), pp. 299–419.

Breen, A. P. & Murphy, J. A. 1995. Reactions of oxyl radicals with DNA. Free Rad.

Biol. Med., 18, 1033-1077.

Brocca, L., D'Antona, G., Bachi, A. & Pellegrino, M. A. 2008. Amino acid supplements

improve native antioxidant enzyme expression in the skeletal muscle of diabetic

mice. Am J Cardiol, 101, 57E-62E.

Buckey, J. 2006. Muscle loss: approach to maintaining strength. In: Space physiology.

New York (NY): Oxford University Press, 77-100.

Bui, N. T., Livolsi, A., Peyron, J. F. & Prehn, J. H. 2001. Activation of nuclear factor

kappaB and Bcl-x survival gene expression by nerve growth factor requires

tyrosine phosphorylation of IkappaBalpha. J Cell Biol, 152, 753-64.

Bulkley, G. B. 1993. Endothelial xanthine oxidase: a radical transducer of inflammatory

signals for reticuloendothelial activation. Br J Surg, 80, 684-6.

Bulkley, G. B. 1994. Reactive oxygen metabolites and reperfusion injury: aberrant

triggering of reticuloendothelial function. Lancet, 344, 934-6.

Byers, T. & Bowman, B. 1993. Vitamin E supplements and coronary heart disease. Nutr

Rev, 51, 333-6.

Byrnes, K. R., Fricke, S. T. & Faden, A. I. 2010. Neuropathological differences

between rats and mice after spinal cord injury. J Magn Reson Imaging, 32, 836-

46.

Cai, D., Frantz, J. D., Tawa, N. E., Melendez, P. A., Oh, B.-C., Lidov, H. G. W.,

Hasselgren, P.-O., Frontera, W. R., Lee, J., Glass, D. J. & Shoelson, S. E. 2004.

IKKbeta/NF-kappaB activation causes severe muscle wasting in mice. Cell, 119,

285-98.

Bibliografía

259

Calnan, D. R. & Brunet, A. 2008. The FoxO code. Oncogene, 27, 2276-88.

Cani, P. D., Neyrinck, A. M., Fava, F., Knauf, C., Burcelin, R. G., Tuohy, K. M.,

Gibson, G. R. & Delzenne, N. M. 2007. Selective increases of bifidobacteria in

gut microflora improve high-fat-diet-induced diabetes in mice through a

mechanism associated with endotoxaemia. Diabetologia, 50, 2374-83.

Cantini, M., Massimino, M. L., Rapizzi, E., Rossini, K., Catani, C., Dalla Libera, L. &

Carraro, U. 1995. Human satellite cell proliferation in vitro is regulated by

autocrine secretion of IL-6 stimulated by a soluble factor(s) released by

activated monocytes. Biochem Biophys Res Commun, 216, 49-53.

Cappola, T. P., Kass, D. A., Nelson, G. S., Berger, R. D., Rosas, G. O., Kobeissi, Z. A.,

Marbán, E. & Hare, J. M. 2001. Allopurinol improves myocardial efficiency in

patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. Circulation, 104, 2407-11.

Carlson CJ, B. F., Gordon SE. 1999. Skeletal muscle myostatin mRNA expression is

fiber-type specific and increases during hindlimb unloading. Am J Physiol Regul

Integr Comp Physiol, 277, R601–R606.

Caron, A. Z., Drouin, G., Desrosiers, J., Trensz, F. & Grenier, G. 2009. A novel

hindlimb immobilization procedure for studying skeletal muscle atrophy and

recovery in mouse. J Appl Physiol (1985), 106, 2049-59.

Caron, A. Z., Haroun, S., Leblanc, E., Trensz, F., Guindi, C., Amrani, A. & Grenier, G.

2011. The proteasome inhibitor MG132 reduces immobilization-induced

skeletal muscle atrophy in mice. BMC Musculoskelet Disord, 12, 185.

Carson, J. A., Nettleton, D. & Reecy, J. M. 2002. Differential gene expression in the rat

soleus muscle during early work overload-induced hypertrophy. FASEB J, 16,

207-9.

Cavallo, M. G., Fava, D., Monetini, L., Barone, F. & Pozzilli, P. 1996. Cell-mediated

immune response to beta casein in recent-onset insulin-dependent diabetes:

implications for disease pathogenesis. Lancet, 348, 926-8.

Centner, T., Yano, J., Kimura, E., McElhinny, A. S., Pelin, K., Witt, C. C., Bang, M. L.,

Trombitas, K., Granzier, H., Gregorio, C. C., Sorimachi, H. & Labeit, S. 2001.

Identification of muscle specific ring finger proteins as potential regulators of

the titin kinase domain. J Mol Biol, 306, 717-26.

Ceriello, A. 2000. Oxidative stress and glycemic regulation. Metabolism, 49, 27-9.

Ciechanover, A. & Schwartz, A. L. 1998. The ubiquitin-proteasome pathway: the

complexity and myriad functions of proteins death. Proc Natl Acad Sci U S A,

95, 2727-30.

Clanton, T. L., Zuo, L. & Klawitter, P. 1999. Oxidants and skeletal muscle function:

physiologic and pathophysiologic implications. Proc Soc Exp Biol Med, 222,

253-62.

Clarke, B. A., Drujan, D., Willis, M. S., Murphy, L. O., Corpina, R. A., Burova, E.,

Rakhilin, S. V., Stitt, T. N., Patterson, C., Latres, E. 2007. The E3 Ligase

MuRF1 degrades myosin heavy chain protein in dexamethasone-treated skeletal

muscle. Cell Metab., 6, 376-385.

Coderre, L., Kandror, K. V., Vallega, G. & Pilch, P. F. 1995. Identification and

characterization of an exercise-sensitive pool of glucose transporters in skeletal

muscle. J Biol Chem, 270, 27584-8.

Cohen, S., Brault, J. J., Gygi, S. P., Glass, D. J., Valenzuela, D. M., Gartner, C., Latres,

E. & Goldberg, A. L. 2009. During muscle atrophy, thick, but not thin, filament

components are degraded by MuRF1-dependent ubiquitylation. J Cell Biol, 185,

1083-95.

Bibliografía

260

Commoner, B., TOWNSEND, J. & PAKE, G. E. 1954. Free radicals in biological

materials. Nature, 174, 689-91.

Croce 1999. Vivisection or science? An investigation into testing drugs and

safeguarding health. London: Zed Books.

Cross, A. J., Slater, P., Simpson, M., Royston, C., Deakin, J. F., Perry, R. H. & Perry, E.

K. 1987. Sodium dependent D-[3H]aspartate binding in cerebral cortex in

patients with Alzheimer's and Parkinson's diseases. Neurosci Lett, 79, 213-7.

Cruz-Jentoft, A. J., Baeyens, J. P., Bauer, J. M., Boirie, Y., Cederholm, T., Landi, F.,

Martin, F. C., Michel, J. P., Rolland, Y., Schneider, S. M., Topinkova, E.,

Vandewoude, M. & Zamboni, M. 2010. Sarcopenia: European consensus on

definition and diagnosis: Report of the European Working Group on Sarcopenia

in Older People. Age Ageing, 39, 412-23.

Cruz-Jentoft, A. J., Triana, F. C., Gomez-Cabrera, M. C., Lopez-Soto, A., Masanes, F.,

Martin, P. M., Rexach, J. A., Hidalgo, D. R., Salva, A., Vina, J. & Formiga, F.

2011. [The emergent role of sarcopenia: Preliminary Report of the Observatory

of Sarcopenia of the Spanish Society of Geriatrics and Gerontology]. Rev Esp

Geriatr Gerontol, 46, 100-10.

Cutler, R. G. 1984. Urate and ascorbate: their possible roles as antioxidants in

determining longevity of mammalian species. Arch Gerontol Geriatr, 3, 321-48.

Chambers, D. E., Parks, D. A., Patterson, G., Roy, R., McCord, J. M., Yoshida, S.,

Parmley, L. F. & Downey, J. M. 1985. Xanthine oxidase as a source of free

radical damage in myocardial ischemia. J Mol Cell Cardiol, 17, 145-52.

Chance, B., Sies, H. & Boveris, A. 1979. Hydroperoxide metabolism in mammalian

organs. Physiol. Rev., 59, 527-605.

Chang, K. C., Chung, S. Y., Chong, W. S., Suh, J. S., Kim, S. H., Noh, H. K., Seong, B.

W., Ko, H. J. & Chun, K. W. 1993. Possible superoxide radical-induced

alteration of vascular reactivity in aortas from streptozotocin-treated rats. J

Pharmacol Exp Ther, 266, 992-1000.

Charlton, M. & Nair, K. S. 1998. Protein metabolism in insulin-dependent diabetes

mellitus. J Nutr, 128, 323S-327S.

Cheeseman, K. H. & Slater, T. F. 1993. An introduction to free radical biochemistry.

Br. Med. Bull., 49, 588-603.

Chen, C.-n. J., Brown-Borg, H. M., Rakoczy, S. G. & Thompson, L. V. 2008. Muscle

disuse: adaptation of antioxidant systems is age dependent. J Gerontol A Biol Sci

Med Sci, 63, 461-6.

Chen, G.-Q., Mou, C.-Y., Yang, Y.-Q., Wang, S. & Zhao, Z.-W. 2011. Exercise training

has beneficial anti-atrophy effects by inhibiting oxidative stress-induced MuRF1

upregulation in rats with diabetes. Life Sci, 89, 44-9.

Chen, Y.-W., Gregory, C. M., Scarborough, M. T., Shi, R., Walter, G. A. &

Vandenborne, K. 2007. Transcriptional pathways associated with skeletal

muscle disuse atrophy in humans. Physiol Genomics, 31, 510-20.

Chen, Z., Hagler, J., Palombella, V. J., Melandri, F., Scherer, D., Ballard, D. &

Maniatis, T. 1995. Signal-induced site-specific phosphorylation targets I kappa

B alpha to the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev, 9, 1586-97.

Childs, T. E., Spangenburg, E. E., Vyas, D. R. & Booth, F. W. 2003. Temporal

alterations in protein signaling cascades during recovery from muscle atrophy.

Am J Physiol Cell Physiol, 285, C391-8.

Chowdhury, P., Soulsby, M. E. & Scott, J. L. 2009. Effects of aminoguanidine on tissue

oxidative stress induced by hindlimb unloading in rats. Ann Clin Lab Sci, 39, 64-

70.

Bibliografía

261

Davies, K. J., Quintanilha, A. T., Brooks, G. A. & Packer, L. 1982a. Free radicals and

tissue damage produced by exercise. Biochem Biophys Res Commun, 107, 1198-

205.

Davies, K. J. A., Delsignore, M. E. & Lin, S. W. 1987a. Protein damage and

degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids. J. Biol. Chem.,

262, 9902-9907.

Davies, K. J. A., Pacifici, R. E. & Lin, S. W. 1987b. Protein damage and degradation by

oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein. J. Biol. Chem., 262,

9914-9920.

Davies, K. J. A., Quintanilha, A. T., Brooks, G. A. & Packer, L. 1982b. Free radicals

and tissue damage produced by exercise. Biochem. Biophys. Res. Commun., 107,

1198-1205.

DCCT-Research-Group 1993. The effect of intensive treatment of diabetes on the

development and progression of long-term complications in insulin-dependent

diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research

Group. N Engl J Med, 329, 977-86.

de Alvaro, C., Teruel, T., Hernandez, R. and Lorenzo, M. 2004. Tumor necrosis factor

alpha produces insulin resistance in skeletal muscle by activation of inhibitor

kappaB kinase in a p38 MAPK-dependent manner. J. Biol. Chem., 279, 17070-

17078.

de Jong, J. W., van der Meer, P., Nieukoop, A. S., Huizer, T., Stroeve, R. J. & Bos, E.

1990. Xanthine oxidoreductase activity in perfused hearts of various species,

including humans. Circ Res, 67, 770-3.

De Rossi, M., Bernasconi, P., Baggi, F., de Waal Malefyt, R. & Mantegazza, R. 2000.

Cytokines and chemokines are both expressed by human myoblasts: possible

relevance for the immune pathogenesis of muscle inflammation. Int Immunol,

12, 1329-35.

Dean, R. T., Gieseg, S. & Davies, M. J. 1993. Reactive species and their accumulation

on radical damaged proteins. TIBS., 18, 437-441.

DeCoster, V. A. 2001. Challenges of type 2 diabetes and role of health care social work:

a neglected area of practice. Health Soc Work, 26, 26-37.

deDuve, C. & Baudhuin, P. 1966. Peroxisomes (microbodies and related particles).

Physiology Reviews, 46, 323-357.

Dehoux, M. J. M., van Beneden, R. P., Fernández-Celemín, L., Lause, P. L. & Thissen,

J.-P. M. 2003. Induction of MafBx and Murf ubiquitin ligase mRNAs in rat

skeletal muscle after LPS injection. FEBS Lett, 544, 214-7.

Della Corte, E. & Stirpe, F. 1968. The regulation of rat-liver xanthine oxidase:

Activation by proteolytic enzymes. FEBS Lett, 2, 83-84.

Denne, S. C., Brechtel, G., Johnson, A., Liechty, E. A. & Baron, A. D. 1995. Skeletal

muscle proteolysis is reduced in noninsulin-dependent diabetes mellitus and is

unaltered by euglycemic hyperinsulinemia or intensive insulin therapy. J Clin

Endocrinol Metab, 80, 2371-7.

Derbre, F., Ferrando, B., Gomez-Cabrera, M. C., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V.

E., Olaso-Gonzalez, G., Diaz, A., Gratas-Delamarche, A., Cerda, M. & Viña, J.

2012. Inhibition of xanthine oxidase by allopurinol prevents skeletal muscle

atrophy: role of p38 MAPKinase and E3 ubiquitin ligases. PLoS One, 7, e46668.

Bibliografía

262

Desaphy, J.-F., Pierno, S., Liantonio, A., Giannuzzi, V., Digennaro, C., Dinardo, M. M.,

Camerino, G. M., Ricciuti, P., Brocca, L., Pellegrino, M. A., Bottinelli, R. &

Camerino, D. C. 2010. Antioxidant treatment of hindlimb-unloaded mouse

counteracts fiber type transition but not atrophy of disused muscles. Pharmacol

Res, 61, 553-63.

Desplanches, D., Ecochard, L., Sempore, B., Mayet-Sornay, M. H. & Favier, R. 2004.

Skeletal muscle HSP72 response to mechanical unloading: influence of

endurance training. Acta Physiol Scand, 180, 387-94.

Di Giovanni, S., Molon, A., Broccolini, A., Melcon, G., Mirabella, M., Hoffman, E. P.

& Servidei, S. 2004. Constitutive activation of MAPK cascade in acute

quadriplegic myopathy. Ann Neurol, 55, 195-206.

Diagnosis, E. C. o. t. & Mellitus, C. o. D. 2003. Report of the expert committee on the

diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care, 26 Suppl 1, S5-

20.

DiDonato, J., Mercurio, F., Rosette, C., Wu-Li, J., Suyang, H., Ghosh, S. & Karin, M.

1996. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its

ubiquitination and degradation. Mol Cell Biol, 16, 1295-304.

Dignam, J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. 1983. Accurate transcription initiation

by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.

Nucleic Acids Res, 11, 1475-89.

Dikov, A., Alexandrov, I., Russinova, A. & Boyadjieva-Michailova, A. 1988.

[Ultracytochemical demonstration of enzymes by reduction of potassium

hexacyanoferrate (III). I. A method for demonstration of xanthine oxidase]. Acta

Histochem, 83, 107-15.

Dillard, C. J., Litov, R. E. & Tappel, A. L. 1978. Effects of dietary vitamin E, selenium,

and polyunsaturated fats on in vivo lipid peroxidation in the rat as measured by

pentane production. Lipids, 13, 396-402.

Dinenno, F. A., Seals, D. R., DeSouza, C. A. & Tanaka, H. 2001. Age-related decreases

in basal limb blood flow in humans: time course, determinants and habitual

exercise effects. J Physiol, 531, 573-9.

Dixon, J. B., Bhathal, P. S. & O'Brien, P. E. 2001. Nonalcoholic fatty liver disease:

predictors of nonalcoholic steatohepatitis and liver fibrosis in the severely obese.

Gastroenterology, 121, 91-100.

Doehner, W., Schoene, N., Rauchhaus, M., Leyva-Leon, F., Pavitt, D. V., Reaveley, D.

A., Schuler, G., Coats, A. J. S., Anker, S. D. & Hambrecht, R. 2002. Effects of

xanthine oxidase inhibition with allopurinol on endothelial function and

peripheral blood flow in hyperuricemic patients with chronic heart failure:

results from 2 placebo-controlled studies. Circulation, 105, 2619-24.

Dogra, C., Changotra, H., Wedhas, N., Qin, X., Wergedal, J. E. & Kumar, A. 2007.

TNF-related weak inducer of apoptosis (TWEAK) is a potent skeletal muscle-

wasting cytokine. FASEB J, 21, 1857-69.

Doherty, T. J. 2003. Invited review: Aging and sarcopenia. J Appl Physiol, 95, 1717-27.

Dominique, J. E., and Gerard, C. 2006. Myostatin regulation of muscle development:

molecular basis, natural mutations, physiopathological aspects. . Exp Cell Res

312, 2401-2414.

Donald, R. & Johns, M. D. 1995. Mitochondrial DNA and disease. N. Engl. J. Med.,

333, 638-644.

Doroshow, J. & Hochstein, P. 1982. Redox cycling and the mechanism of action of

antibiotics in neoplasic diseades.) Pathology of Oxigen. New York, Academic

Press.

Bibliografía

263

Doyle, A., Zhang, G., Abdel Fattah, E. A., Eissa, N. T. & Li, Y.-P. 2011. Toll-like

receptor 4 mediates lipopolysaccharide-induced muscle catabolism via

coordinate activation of ubiquitin-proteasome and autophagy-lysosome

pathways. FASEB J, 25, 99-110.

Du, J., Wang, X., Miereles, C., Bailey, J. L., Debigare, R., Zheng, B., Price, S. R. &

Mitch, W. E. 2004. Activation of caspase-3 is an initial step triggering

accelerated muscle proteolysis in catabolic conditions. J Clin Invest, 113, 115-

23.

Dubois, R. N., Abramson, S. B., Crofford, L., Gupta, R. A., Simon, L. S., Van De Putte,

L. B. & Lipsky, P. E. 1998. Cyclooxygenase in biology and disease. FASEB J,

12, 1063-73.

Dumais, N., Barbeau, B., Olivier, M. & Tremblay, M. J. 1998. Prostaglandin E2 Up-

regulates HIV-1 long terminal repeat-driven gene activity in T cells via NF-

kappaB-dependent and -independent signaling pathways. J Biol Chem, 273,

27306-14.

Eberhart, C. E., Coffey, R. J., Radhika, A., Giardiello, F. M., Ferrenbach, S. & DuBois,

R. N. 1994. Up-regulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human

colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology, 107, 1183-8.

Egan, C. G., Lockhart, J. C. & Ferrell, W. R. 2004. Pathophysiology of vascular

dysfunction in a rat model of chronic joint inflammation. J Physiol, 557, 635-43.

Ekelund, U. E., Harrison, R. W., Shokek, O., Thakkar, R. N., Tunin, R. S., Senzaki, H.,

Kass, D. A., Marbán, E. & Hare, J. M. 1999. Intravenous allopurinol decreases

myocardial oxygen consumption and increases mechanical efficiency in dogs

with pacing-induced heart failure. Circ Res, 85, 437-45.

El-Serag, H. B. & Everhart, J. E. 2002. Diabetes increases the risk of acute hepatic

failure. Gastroenterology, 122, 1822-8.

El-Serag, H. B., Tran, T. & Everhart, J. E. 2004. Diabetes increases the risk of chronic

liver disease and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 126, 460-8.

Elion, G. B. 1989. Nobel Lecture. The purine path to chemotherapy. Biosci Rep, 9, 509-

29.

Elion, G. B., Kovensky, A. & Hitchings, G. H. 1966. Metabolic studies of allopurinol,

an inhibitor of xanthine oxidase. Biochem Pharmacol, 15, 863-80.

Elsner, M., Guldbakke, B., Tiedge, M., Munday, R. & Lenzen, S. 2000. Relative

importance of transport and alkylation for pancreatic beta-cell toxicity of

streptozotocin. Diabetologia, 43, 1528-33.

Engström, G., Stavenow, L., Hedblad, B., Lind, P., Eriksson, K.-F., Janzon, L. &

Lindgärde, F. 2003. Inflammation-sensitive plasma proteins, diabetes, and

mortality and incidence of myocardial infarction and stroke: a population-based

study. Diabetes, 52, 442-7.

Fajans, S. S. & Bell, G. I. 2011. MODY: history, genetics, pathophysiology, and clinical

decision making. Diabetes Care, 34, 1878-84.

Farid, M., Reid, M. B., Li, Y.-P., Gerken, E. & Durham, W. J. 2005. Effects of dietary

curcumin or N-acetylcysteine on NF-kappaB activity and contractile

performance in ambulatory and unloaded murine soleus. Nutr Metab (Lond), 2,

20.

Feltbower, R. G., McKinney, P. A., Parslow, R. C., Stephenson, C. R. & Bodansky, H.

J. 2003. Type 1 diabetes in Yorkshire, UK: time trends in 0-14 and 15-29-year-

olds, age at onset and age-period-cohort modelling. Diabet Med, 20, 437-41.

Bibliografía

264

Fernandes, A. F., Zhou, J., Zhang, X., Bian, Q., Sparrow, J., Taylor, A., Pereira, P. &

Shang, F. 2008. Oxidative inactivation of the proteasome in retinal pigment

epithelial cells. A potential link between oxidative stress and up-regulation of

interleukin-8. J Biol Chem, 283, 20745-53.

Ferretti, G. 1997. The effect of prolonged bed rest on maximal instantaneous muscle

power and its determinants. Int J Sports Med, 18 Suppl 4, S287-9.

Fielitz, J., Kim, M.-S., Shelton, J. M., Latif, S., Spencer, J. A., Glass, D. J., Richardson,

J. A., Bassel-Duby, R. & Olson, E. N. 2007. Myosin accumulation and striated

muscle myopathy result from the loss of muscle RING finger 1 and 3. J Clin

Invest, 117, 2486-95.

Fitts, R. H., Romatowski, J. G., Blaser, C., De La Cruz, L., Gettelman, G. J. & Widrick,

J. J. 2000. Effect of spaceflight on the isotonic contractile properties of single

skeletal muscle fibers in the rhesus monkey. J Gravit Physiol, 7, S53-4.

Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Léger, B. & Russell, A. P. 2011. The role and

regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflugers

Arch, 461, 325-35.

Fourlanos, S., Harrison, L. C. & Colman, P. G. 2008. The accelerator hypothesis and

increasing incidence of type 1 diabetes. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes,

15, 321-5.

Freeman, B. A. & Crapo, J. 1982. Biology of disease: Free radicals and tissue injure.

Lab. Invest., 47, 412-426.

Fridovich, I. 1974. Superoxide dismutase. Adv. Enzymol., 41, 35-97.

Fridovich, I. & Handler, P. 1962. Xanthine oxidase. V. Differential inhibition of the

reduction of various electron acceptors. J Biol Chem, 237, 916-21.

Frier, B. C., Noble, E. G. & Locke, M. 2008. Diabetes-induced atrophy is associated

with a muscle-specific alteration in NF-kappaB activation and expression. Cell

Stress Chaperones, 13, 287-96.

Frost, R. A. & Lang, C. H. 2008. Regulation of muscle growth by pathogen-associated

molecules. J Anim Sci, 86, E84-93.

Funato, K., Matsuo, A., Yata, H., Akima, H., Suzuki, Y., Gunji, A. & Fukunaga, T.

1997. Changes in force-velocity and power output of upper and lower extremity

musculature in young subjects following 20 days bed rest. J Gravit Physiol, 4,

S22-30.

Furuno, K. & Goldberg, A. L. 1986. The activation of protein degradation in muscle by

Ca2+ or muscle injury does not involve a lysosomal mechanism. Biochem J,

237, 859-64.

Gallagher, D., Gutierrez, H., Gavalda, N., O'Keeffe, G., Hay, R. & Davies, A. M. 2007.

Nuclear factor-kappaB activation via tyrosine phosphorylation of inhibitor

kappaB-alpha is crucial for ciliary neurotrophic factor-promoted neurite growth

from developing neurons. J Neurosci, 27, 9664-9.

Ganda, O. P., Rossini, A. A. & Like, A. A. 1976. Studies on streptozotocin diabetes.

Diabetes, 25, 595-603.

Garg, A. K. & Aggarwal, B. B. 2002. Reactive oxygen intermediates in TNF signaling.

Mol Immunol, 39, 509-17.

Gelin, J., Andersson, C. & Lundholm, K. 1991. Effects of indomethacin, cytokines, and

cyclosporin A on tumor growth and the subsequent development of cancer

cachexia. Cancer Res, 51, 880-5.

Bibliografía

265

Genuth, S., Alberti, K. G. M. M., Bennett, P., Buse, J., Defronzo, R., Kahn, R.,

Kitzmiller, J., Knowler, W. C., Lebovitz, H., Lernmark, A., Nathan, D., Palmer,

J., Rizza, R., Saudek, C., Shaw, J., Steffes, M., et al. 2003. Follow-up report on

the diagnosis of diabetes mellitus. Diabetes Care, 26, 3160-7.

George, J., Carr, E., Davies, J., Belch, J. J. F. & Struthers, A. 2006. High-dose

allopurinol improves endothelial function by profoundly reducing vascular

oxidative stress and not by lowering uric acid. Circulation, 114, 2508-16.

George, J. & Struthers, A. D. 2009. Role of urate, xanthine oxidase and the effects of

allopurinol in vascular oxidative stress. Vasc Health Risk Manag, 5, 265-72.

Gerlach E, D. B., Dreisbach RH 1963. Der Nucleotid-Abbau im Herzmuskel bei

Sauerstoffmangel und seine mögliche Bedeutung für die Coronardurchblutung.

Naturwissenschaften 50.

Ghosh, S. & Karin, M. 2002. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell, 109 Suppl,

S81-96.

Ghosh, S., May, M. J. & Kopp, E. B. 1998. NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily

conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol, 16, 225-60.

Gibson, G. R. & Roberfroid, M. B. 1995. Dietary modulation of the human colonic

microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr, 125, 1401-12.

Gibson, G. R. S., K.P.; Rastall, R.A.; Tuohy, K.M.; Hotchkiss, A.; Dubert-Ferrandon,

A.; Gareau, M.; Murphy, E.F.; Saulnier, D.; Loh, G. 2010. Dietary prebiotics:

Current status and new definition. . J. Food Sci. Technol., 7, 1-19.

Giler, S. S., O.; Brosh, S.; Urca, I.; deVries, 1975. Serum xanthine oxidase in jaundice.

A. Clin. Chim. Acta 63, 37–40.

Giovanni Mantovani, S. D. A., Akio Inui,John E. Morley,Filippo Rossi Fanelli,Daniele

Scevola,Michael W. Schuster,Shing-Shing Yeh 2007. Cachexia and Wasting: A

Modern Approach. Springer, 283-289.

Girten, B., Oloff, C., Plato, P., Eveland, E., Merola, A. J. & Kazarian, L. 1989. Skeletal

muscle antioxidant enzyme levels in rats after simulated weightlessness,

exercise and dobutamine. Physiologist, 32, S59-60.

Giulivi, C. & Davies, K. J. A. 1993. Dityrosine and tyrosine oxidation products are

endogenous markers for the selective proteolysis of oxidatively modified red

blood cell hemoglobin by (the 19 S) proteasome. J. Biol. Chem., 268, 8752-

8759.

Glass, D. J. 2005. A signaling role for dystrophin: inhibiting skeletal muscle atrophy

pathways. Cancer Cell, 8, 351-2.

Glatigny, A. & Scazzocchio, C. 1995. Cloning and molecular characterization of hxA,

the gene coding for the xanthine dehydrogenase (purine hydroxylase I) of

Aspergillus nidulans. J Biol Chem, 270, 3534-50.

Glickman, M. H. & Ciechanover, A. 2002. The ubiquitin-proteasome proteolytic

pathway: destruction for the sake of construction. Physiol Rev, 82, 373-428.

Glund, S. & Krook, A. 2008. Role of interleukin-6 signalling in glucose and lipid

metabolism. Acta Physiol (Oxf), 192, 37-48.

Godber, B. L., Doel, J. J., Durgan, J., Eisenthal, R. & Harrison, R. 2000. A new route to

peroxynitrite: a role for xanthine oxidoreductase. FEBS Lett, 475, 93-6.

Goicoechea, M., de Vinuesa, S. G., Verdalles, U., Ruiz-Caro, C., Ampuero, J., Rincón,

A., Arroyo, D. & Luño, J. 2010. Effect of allopurinol in chronic kidney disease

progression and cardiovascular risk. Clin J Am Soc Nephrol, 5, 1388-93.

Goldberg, A. L., Tischler, M. & Libby, P. 1980. Regulation of protein degradation in

skeletal muscle. Biochem Soc Trans, 8, 497.

Bibliografía

266

Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W. & Cong, J. 2003. The calpain system.


Gomes, M. D., Lecker, S. H., Jagoe, R. T., Navon, A. & Goldberg, A. L. 2001. Atrogin-

1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy. Proc

Natl Acad Sci U S A, 98, 14440-5.

Gomez-Cabrera, M.-C., Borrás, C., Pallardó, F. V., Sastre, J., Ji, L. L. & Viña, J. 2005.

Decreasing xanthine oxidase-mediated oxidative stress prevents useful cellular

adaptations to exercise in rats. J Physiol, 567, 113-20.

Gomez-Cabrera, M.-C., Domenech, E. & Viña, J. 2008. Moderate exercise is an

antioxidant: upregulation of antioxidant genes by training. Free Radic Biol Med,

44, 126-31.

Gomez-Cabrera, M.-C., Martínez, A., Santangelo, G., Pallardó, F. V., Sastre, J. & Viña,

J. 2006. Oxidative stress in marathon runners: interest of antioxidant

supplementation. Br J Nutr, 96 Suppl 1, S31-3.

Gómez-Cabrera, M.-C., Pallardó, F. V., Sastre, J., Viña, J. & García-del-Moral, L.

2003. Allopurinol and markers of muscle damage among participants in the

Tour de France. JAMA, 289, 2503-4.

Gonzalez-Cadavid, N. F., Taylor, W. E., Yarasheski, K., Sinha-Hikim, I., Ma, K., Ezzat,

S., Shen, R., Lalani, R., Asa, S., Mamita, M., Nair, G., Arver, S. & Bhasin, S.

1998. Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men

and HIV-infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci U S A, 95,

14938-43.

Granado, M., Martín, A. I., Villanúa, M. A. & López-Calderón, A. 2007. Experimental

arthritis inhibits the insulin-like growth factor-I axis and induces muscle wasting

through cyclooxygenase-2 activation. Am J Physiol Endocrinol Metab, 292,

E1656-65.

Granger, D. N., G. Rutili, and J. M. McCord 1981. Superoxide radicals in feline

intestinal ischemia. Gastroenterology 81, 22–29.

Granger, D. N. H., M. E.; Parks, D. A. 1986. Ischemia-reperfusion injury: role of

oxygen-derived free radicals. . Acta Physiol. Scand. , 548(Suppl.), 47–63.

Grant, W. B. 2008. Hypothesis--ultraviolet-B irradiance and vitamin D reduce the risk

of viral infections and thus their sequelae, including autoimmune diseases and

some cancers. Photochem Photobiol, 84, 356-65.

Greenwald, R. A. & Moy, W. W. 1980. Effect of oxygen derived free radicals on

hyaluronic acid. Arthritis Rheum., 23, 455-463.

Grobet, L., Pirottin, D., Farnir, F., Poncelet, D., Royo, L. J., Brouwers, B., Christians,

E., Desmecht, D., Coignoul, F., Kahn, R. & Georges, M. 2003. Modulating

skeletal muscle mass by postnatal, muscle-specific inactivation of the myostatin

gene. Genesis, 35, 227-38.

Gustafsson, T., Osterlund, T., Flanagan, J. N., von Waldén, F., Trappe, T. A., Linnehan,

R. M. & Tesch, P. A. 2010. Effects of 3 days unloading on molecular regulators

of muscle size in humans. J Appl Physiol (1985), 109, 721-7.

Guttridge, D. C. 2004. Signaling pathways weigh in on decisions to make or break

skeletal muscle. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 7, 443-50.

Guttridge, D. C., Albanese, C., Reuther, J. Y., Pestell, R. G. & Baldwin, A. S. 1999.

NF-kappaB controls cell growth and differentiation through transcriptional

regulation of cyclin D1. Mol Cell Biol, 19, 5785-99.

Guttridge, D. C., Mayo, M. W., Madrid, L. V., Wang, C. Y. & Baldwin, A. S., Jr. 2000.

NF-kappaB-induced loss of MyoD messenger RNA: possible role in muscle

decay and cachexia. Science, 289, 2363-6.

Bibliografía

267

Häcker, H. & Karin, M. 2006. Regulation and function of IKK and IKK-related kinases.

Sci STKE, 2006, re13.

Haddad, F., Adams, G. R., Bodell, P. W. & Baldwin, K. M. 2006. Isometric resistance

exercise fails to counteract skeletal muscle atrophy processes during the initial

stages of unloading. J Appl Physiol (1985), 100, 433-41.

Haddad, F., Zaldivar, F., Cooper, D. M. & Adams, G. R. 2005. IL-6-induced skeletal

muscle atrophy. J Appl Physiol (1985), 98, 911-7.

Hageman, H. H., Bast, A. & Vermeulen, N. P. E. 1992. Monitoring of oxidative free

radical damage in vivo: Analytical aspects. Chem. Biol. Interactions., 82, 243-

293.

Hall-Angerås, M. A., U Zamir, O Hasselgren, P O Fischer, J E 1990. Interaction

between corticosterone and tumor necrosis factor stimulated protein breakdown

in rat skeletal muscle, similar to sepsis. Surgery, 108, 460-6.

Halliwell, B. 1991. Reactive oxygen species in living systems: Source, biochemistry

and role in human disease. Am. J. Med., 91, 14S-22S.

Halliwell, B. 1994. Free radicals, antioxidants and human disease: Curiosity, cause or

consequence? Lancet, 344, 721-724.

Halliwell, B. 1996. Antioxidants in human health and disease. Annu. Rev. Nutr., 16, 33-

50.

Halliwell, B. & Auroma, O. I. 1991. DNA damage by oxygen derived species. Its

mechanism of action and measurement in mammalian systems. FEBS Lett., 281,

9-19.

Halliwell B, G. J. 1999. Free Radicals in Biology and Medicine. London: Oxford Univ.

Press.

Halliwell, B. & Gutteridge, J. M. 1990a. Role of free radicals and catalytic metal ions in

human disease: an overview. Methods Enzymol, 186, 1-85.

Halliwell, B. & Gutteridge, J. M. 1995. The definition and measurement of antioxidants

in biological systems. Free Radic Biol Med, 18, 125-6.

Halliwell, B. & Gutteridge, J. M. C. 1989. Free radicals in biology and medicine.,

Oxford, Clarendon Press.

Halliwell, B. & Gutteridge, J. M. C. 1990b. Role of free radicals and catalytic metal

ions in human disease: an overview. Methods Enzymol., 186, 1-85.

Halliwell, B. a. J. M. C. G. 1985. Free Radicals in Biology and Medicine. . Oxford,

Clarendon Press.

Halliwell, B. y. G., J. M. C. 1989. Free radicals in biology and medicine. Oxford,

Clarendon Press.

Hamilton, A. L., Killian, K. J., Summers, E. & Jones, N. L. 1995. Muscle strength,

symptom intensity, and exercise capacity in patients with cardiorespiratory

disorders. Am J Respir Crit Care Med, 152, 2021-31.

Han, B., Zhu, M. J., Ma, C. & Du, M. 2007. Rat hindlimb unloading down-regulates

insulin like growth factor-1 signaling and AMP-activated protein kinase, and

leads to severe atrophy of the soleus muscle. Appl Physiol Nutr Metab, 32,

1115-23.

Handayaningsih, A.-E., Iguchi, G., Fukuoka, H., Nishizawa, H., Takahashi, M.,

Yamamoto, M., Herningtyas, E.-H., Okimura, Y., Kaji, H., Chihara, K., Seino,

S. & Takahashi, Y. 2011. Reactive oxygen species play an essential role in IGF-

I signaling and IGF-I-induced myocyte hypertrophy in C2C12 myocytes.

Endocrinology, 152, 912-21.

Bibliografía

268

Hara, K., Yonezawa, K., Weng, Q. P., Kozlowski, M. T., Belham, C. & Avruch, J.

1998. Amino acid sufficiency and mTOR regulate p70 S6 kinase and eIF-4E

BP1 through a common effector mechanism. J Biol Chem, 273, 14484-94.

Harjutsalo, V., Sjöberg, L. & Tuomilehto, J. 2008. Time trends in the incidence of type

1 diabetes in Finnish children: a cohort study. Lancet, 371, 1777-82.

Harman, D. 1956. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J

Gerontol, 11, 298-300.

Harris, C. M. & Massey, V. 1997. The reaction of reduced xanthine dehydrogenase with

molecular oxygen. Reaction kinetics and measurement of superoxide radical. J

Biol Chem, 272, 8370-9.

Harrison, R. 2002. Structure and function of xanthine oxidoreductase: where are we

now? Free Radic Biol Med, 33, 774-97.

Hassan, H. M. & Fridovich, I. 1977. Regulation of the synthesis of superoxide

dismutase in Escherichia coli. Induction by methyl viologen. J Biol Chem, 252,

7667-72.

Hasselgren, P. O. 1999. Glucocorticoids and muscle catabolism. Curr Opin Clin Nutr

Metab Care, 2, 201-5.

Hasselgren, P. O. & Fischer, J. E. 1997. The ubiquitin-proteasome pathway: review of a

novel intracellular mechanism of muscle protein breakdown during sepsis and

other catabolic conditions. Ann Surg, 225, 307-16.

Hasselgren, P. O., Wray, C. & Mammen, J. 2002. Molecular regulation of muscle

cachexia: it may be more than the proteasome. Biochem Biophys Res Commun,

290, 1-10.

Hassoun, P. M., Yu, F. S., Cote, C. G., Zulueta, J. J., Sawhney, R., Skinner, K. A.,

Skinner, H. B., Parks, D. A. & Lanzillo, J. J. 1998. Upregulation of xanthine

oxidase by lipopolysaccharide, interleukin-1, and hypoxia. Role in acute lung

injury. Am J Respir Crit Care Med, 158, 299-305.

Hassoun, P. M., Yu, F. S., Shedd, A. L., Zulueta, J. J., Thannickal, V. J., Lanzillo, J. J.

& Fanburg, B. L. 1994. Regulation of endothelial cell xanthine dehydrogenase

xanthine oxidase gene expression by oxygen tension. Am J Physiol, 266, L163-

71.

Hawke, T. J. & Garry, D. J. 2001. Myogenic satellite cells: physiology to molecular

biology. J Appl Physiol (1985), 91, 534-51.

Hayden, M. S. & Ghosh, S. 2004. Signaling to NF-kappaB. Genes Dev, 18, 2195-224.

Hellsten-Westing, Y. 1993. Immunohistochemical localization of xanthine oxidase in

human cardiac and skeletal muscle. Histochemistry, 100, 215-22.

Hellsten, Y., Frandsen, U., Orthenblad, N., Sjodin, B. & Richter, E. A. 1997. Xanthine

oxidase in human skeletal muscle following eccentric exercise: a role in

inflammation. J Physiol, 498 ( Pt 1), 239-48.

Henriksen, E. J., Diamond-Stanic, M. K. & Marchionne, E. M. 2011. Oxidative stress

and the etiology of insulin resistance and type 2 diabetes. Free Radic Biol Med,

51, 993-9.

Hille, R. & Massey, V. 1981. Studies on the oxidative half-reaction of xanthine oxidase.

J Biol Chem, 256, 9090-5.

Hille, R. & Nishino, T. 1995. Flavoprotein structure and mechanism. 4. Xanthine

oxidase and xanthine dehydrogenase. FASEB J, 9, 995-1003.

Hirner, S., Krohne, C., Schuster, A., Hoffmann, S., Witt, S., Erber, R., Sticht, C., Gasch,

A., Labeit, S. & Labeit, D. 2008. MuRF1-dependent regulation of systemic

carbohydrate metabolism as revealed from transgenic mouse studies. J Mol Biol,

379, 666-77.

Bibliografía

269

Hirosumi, J., Tuncman, G., Chang, L., Görgün, C. Z., Uysal, K. T., Maeda, K., Karin,

M. & Hotamisligil, G. S. 2002. A central role for JNK in obesity and insulin

resistance. Nature, 420, 333-6.

Hiscock, N., Chan, M. H. S., Bisucci, T., Darby, I. A. & Febbraio, M. A. 2004. Skeletal

myocytes are a source of interleukin-6 mRNA expression and protein release

during contraction: evidence of fiber type specificity. FASEB J, 18, 992-4.

Hitt, A., Graves, E. & McCarthy, D. O. 2005. Indomethacin preserves muscle mass and

reduces levels of E3 ligases and TNF receptor type 1 in the gastrocnemius

muscle of tumor-bearing mice. Res Nurs Health, 28, 56-66.

Hofer, T., Marzetti, E., Xu, J., Seo, A. Y., Gulec, S., Knutson, M. D., Leeuwenburgh, C.

& Dupont-Versteegden, E. E. 2008. Increased iron content and RNA oxidative

damage in skeletal muscle with aging and disuse atrophy. Exp Gerontol, 43,

563-70.

Hoffmann, A., Natoli, G. & Ghosh, G. 2006. Transcriptional regulation via the NF-

kappaB signaling module. Oncogene, 25, 6706-16.

Holley, A. K., Xu, Y., St Clair, D. K. & St Clair, W. H. 2010. RelB regulates

manganese superoxide dismutase gene and resistance to ionizing radiation of

prostate cancer cells. Ann N Y Acad Sci, 1201, 129-36.

Hong, K. W., Lee, W. S., Rhim, B. Y. & Shin, Y. W. 1989. Assessment of superoxide-

mediated release of vascular-inhibitory factor(s) from endothelial cells by using

a two-bath system. Experientia, 45, 320-2.

Hou, M., Hu, Q., Chen, Y., Zhao, L., Zhang, J. & Bache, R. J. 2006. Acute effects of

febuxostat, a nonpurine selective inhibitor of xanthine oxidase, in pacing

induced heart failure. J Cardiovasc Pharmacol, 48, 255-63.

Hsu, F.-L., Huang, C.-F., Chen, Y.-W., Yen, Y.-P., Wu, C.-T., Uang, B.-J., Yang, R.-S.

& Liu, S.-H. 2013. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight

natural product, on diabetic mouse models. Diabetes, 62, 628-38.

Hu, Y. F., Guo, Y. & Cheng, G. F. 2001. [Inhibitory effects of indomethacin and

meloxicam on NF-kappa B in mouse peritoneal macrophages]. Yao Xue Xue

Bao, 36, 161-4.

Hunter RB, S. E., Koncarevic A, Mitchell-Felton H, Essig DA, and Kandarian SC 2002.

Activation of an alternative NF-κB pathway in skeletal muscle during disuse

atrophy. FASEB J, 16, 529–538.

Hunter, R. B., Stevenson, E., Koncarevic, A., Mitchell-Felton, H., Essig, D. A. &

Kandarian, S. C. 2002. Activation of an alternative NF-kappaB pathway in

skeletal muscle during disuse atrophy. FASEB J, 16, 529-38.

Ichida, K., Amaya, Y., Noda, K., Minoshima, S., Hosoya, T., Sakai, O., Shimizu, N. &

Nishino, T. 1993. Cloning of the cDNA encoding human xanthine

dehydrogenase (oxidase): structural analysis of the protein and chromosomal

location of the gene. Gene, 133, 279-84.

Ichikawa, M., Nishino, T., Nishino, T. & Ichikawa, A. 1992. Subcellular localization of

xanthine oxidase in rat hepatocytes: high-resolution immunoelectron

microscopic study combined with biochemical analysis. J Histochem Cytochem,

40, 1097-103.

Ikemoto, M., Nikawa, T., Kano, M., Hirasaka, K., Kitano, T., Watanabe, C., Tanaka, R.,

Yamamoto, T., Kamada, M. & Kishi, K. 2002. Cysteine supplementation

prevents unweighting-induced ubiquitination in association with redox

regulation in rat skeletal muscle. Biol Chem, 383, 715-21.

Bibliografía

270

Ikemoto, M., Nikawa, T., Takeda, S., Watanabe, C., Kitano, T., Baldwin, K. M., Izumi,

R., Nonaka, I., Towatari, T., Teshima, S., Rokutan, K. & Kishi, K. 2001. Space

shuttle flight (STS-90) enhances degradation of rat myosin heavy chain in

association with activation of ubiquitin-proteasome pathway. FASEB J, 15,

1279-81.

Imbert, V., Rupec, R. A., Livolsi, A., Pahl, H. L., Traenckner, E. B., Mueller-

Dieckmann, C., Farahifar, D., Rossi, B., Auberger, P., Baeuerle, P. A. & Peyron,

J. F. 1996. Tyrosine phosphorylation of I kappa B-alpha activates NF-kappa B

without proteolytic degradation of I kappa B-alpha. Cell, 86, 787-98.

Jackman, R. W., Cornwell, E. W., Wu, C.-L. & Kandarian, S. C. 2013. Nuclear factor-

κB signalling and transcriptional regulation in skeletal muscle atrophy. Exp

Physiol, 98, 19-24.

Jackman, R. W. & Kandarian, S. C. 2004. The molecular basis of skeletal muscle

atrophy. Am J Physiol Cell Physiol, 287, C834-43.

Jackson, M. J. 1987. Muscle damage during exercise: possible role of free radicals and

protective effect of vitamin E. Proc Nutr Soc, 46, 77-80.

Jackson, M. J., Jones, D. A. & Edwards, R. H. 1983. Vitamin E and skeletal muscle.

Ciba Found Symp, 101, 224-39.

Jacque, E., Tchenio, T., Piton, G., Romeo, P.-H. & Baud, V. 2005. RelA repression of

RelB activity induces selective gene activation downstream of TNF receptors.

Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 14635-40.

Jagoe, R. T. & Goldberg, A. L. 2001. What do we really know about the ubiquitin-

proteasome pathway in muscle atrophy? Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 4,

183-90.

Jakobsen, J. & Reske-Nielsen, E. 1986. Diffuse muscle fiber atrophy in newly

diagnosed diabetes. Clin Neuropathol, 5, 73-7.

Jarasch, E. D., Grund, C., Bruder, G., Heid, H. W., Keenan, T. W. & Franke, W. W.

1981. Localization of xanthine oxidase in mammary-gland epithelium and

capillary endothelium. Cell, 25, 67-82.

Jaspers, S. R. & Tischler, M. E. 1984. Atrophy and growth failure of rat hindlimb

muscles in tail-cast suspension. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol,

57, 1472-9.

Jaspers, S. R. & Tischler, M. E. 1986. Role of glucocorticoids in the response of rat leg

muscles to reduced activity. Muscle Nerve, 9, 554-61.

Javesghani, D., Magder, S. A., Barreiro, E., Quinn, M. T. & Hussain, S. N. 2002.

Molecular characterization of a superoxide-generating NAD(P)H oxidase in the

ventilatory muscles. Am J Respir Crit Care Med, 165, 412-8.

Jelnes, P., Santoni-Rugiu, E., Rasmussen, M., Friis, S. L., Nielsen, J. H., Tygstrup, N. &

Bisgaard, H. C. 2007. Remarkable heterogeneity displayed by oval cells in rat

and mouse models of stem cell-mediated liver regeneration. Hepatology, 45,

1462-70.

Jensen, J., Rustad, P. I., Kolnes, A. J. & Lai, Y.-C. 2011. The role of skeletal muscle

glycogen breakdown for regulation of insulin sensitivity by exercise. Front

Physiol, 2, 112.

Jeroudi, M. O., Hartley, C. J. & Bolli, R. 1994. Myocardial reperfusion injury: role of

oxygen radicals and potential therapy with antioxidants. Am J Cardiol, 73, 2B-

7B.

Bibliografía

271

Ji, G., Liu, D., Liu, J., Gao, H., Yuan, X. & Shen, G. 2010. p38 mitogen-activated

protein kinase up-regulates NF-kappaB transcriptional activation through RelA

phosphorylation during stretch-induced myogenesis. Biochem Biophys Res

Commun, 391, 547-51.

Jobin, C., Morteau, O., Han, D. S. & Balfour Sartor, R. 1998. Specific NF-kappaB

blockade selectively inhibits tumour necrosis factor-alpha-induced COX-2 but

not constitutive COX-1 gene expression in HT-29 cells. Immunology, 95, 537-

43.

Jogo, M., Shiraishi, S. & Tamura, T.-a. 2009. Identification of MAFbx as a myogenin-

engaged F-box protein in SCF ubiquitin ligase. FEBS Lett, 583, 2715-9.

Jones, S. W., Hill, R. J., Krasney, P. A., O'Conner, B., Peirce, N. & Greenhaff, P. L.

2004. Disuse atrophy and exercise rehabilitation in humans profoundly affects

the expression of genes associated with the regulation of skeletal muscle mass.

FASEB J, 18, 1025-7.

Jonsdottir, I. H., Schjerling, P., Ostrowski, K., Asp, S., Richter, E. A. & Pedersen, B. K.

2000. Muscle contractions induce interleukin-6 mRNA production in rat skeletal

muscles. J Physiol, 528 Pt 1, 157-63.

Judge, A. R., Koncarevic, A., Hunter, R. B., Liou, H.-C., Jackman, R. W. & Kandarian,

S. C. 2007. Role for IkappaBalpha, but not c-Rel, in skeletal muscle atrophy. Am

J Physiol Cell Physiol, 292, C372-82.

Kachaeva, E. V. & Shenkman, B. S. 2012. Various jobs of proteolytic enzymes in

skeletal muscle during unloading: facts and speculations. J Biomed Biotechnol,

2012, 493618.

Kadota, I. 1950. Studies on experimental diabetes mellitus, as produced by organic

reagents; oxine diabetes and dithizone diabetes. J Lab Clin Med, 35, 568-91.

Kamei, Y., Miura, S., Suzuki, M., Kai, Y., Mizukami, J., Taniguchi, T., Mochida, K.,

Hata, T., Matsuda, J., Aburatani, H., Nishino, I. & Ezaki, O. 2004. Skeletal

muscle FOXO1 (FKHR) transgenic mice have less skeletal muscle mass, down-

regulated Type I (slow twitch/red muscle) fiber genes, and impaired glycemic

control. J Biol Chem, 279, 41114-23.

Kao, M. P., Ang, D. S., Gandy, S. J., Nadir, M. A., Houston, J. G., Lang, C. C. &

Struthers, A. D. 2011. Allopurinol benefits left ventricular mass and endothelial

dysfunction in chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol, 22, 1382-9.

Karakelides, H., Asmann, Y. W., Bigelow, M. L., Short, K. R., Dhatariya, K., Coenen-

Schimke, J., Kahl, J., Mukhopadhyay, D. & Nair, K. S. 2007. Effect of insulin

deprivation on muscle mitochondrial ATP production and gene transcript levels

in type 1 diabetic subjects. Diabetes, 56, 2683-9.

Karin, M. & Ben-Neriah, Y. 2000. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of

NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol, 18, 621-63.

Karin, M. & Lin, A. 2002. NF-kappaB at the crossroads of life and death. Nat Immunol,

3, 221-7.

Kasai, H. & Nishimura, S. 1984. Hydroxylation of deoxyguanosine at the C-8 position

by ascorbic acid and other reducing agents. Nucleic Acids Res., 12, 2137-2145.

Kato, T., Delhase, M., Hoffmann, A. & Karin, M. 2003. CK2 Is a C-Terminal IkappaB

Kinase Responsible for NF-kappaB Activation during the UV Response. Mol

Cell, 12, 829-39.

Katz, A. 2007. Modulation of glucose transport in skeletal muscle by reactive oxygen

species. J Appl Physiol (1985), 102, 1671-6.

Katz, A., Broberg, S., Sahlin, K. & Wahren, J. 1986. Leg glucose uptake during

maximal dynamic exercise in humans. Am J Physiol, 251, E65-70.

Bibliografía

272

Kawakami, Y., Muraoka, Y., Kubo, K., Suzuki, Y. & Fukunaga, T. 2000. Changes in

muscle size and architecture following 20 days of bed rest. J Gravit Physiol, 7,

53-9.

Keane, M. M., Rivero-Lezcano, O. M., Mitchell, J. A., Robbins, K. C. & Lipkowitz, S.

1995. Cloning and characterization of cbl-b: a SH3 binding protein with

homology to the c-cbl proto-oncogene. Oncogene, 10, 2367-77.

Kelleher, A. R., Fairchild, T. J. & Keslacy, S. 2010. STZ-induced skeletal muscle

atrophy is associated with increased p65 content and downregulation of insulin

pathway without NF-κB canonical cascade activation. Acta Diabetol, 47, 315-

23.

Keller, C., Steensberg, A., Pilegaard, H., Osada, T., Saltin, B., Pedersen, B. K. &

Neufer, P. D. 2001. Transcriptional activation of the IL-6 gene in human

contracting skeletal muscle: influence of muscle glycogen content. FASEB J, 15,

2748-50.

Kennedy, A. L. & Lyons, T. J. 1997. Glycation, oxidation, and lipoxidation in the

development of diabetic complications. Metabolism, 46, 14-21.

Kern, P. A., Ranganathan, S., Li, C., Wood, L. & Ranganathan, G. 2001. Adipose tissue

tumor necrosis factor and interleukin-6 expression in human obesity and insulin

resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab, 280, E745-51.

Kline, W. O., Panaro, F. J., Yang, H. & Bodine, S. C. 2007. Rapamycin inhibits the

growth and muscle-sparing effects of clenbuterol. J Appl Physiol (1985), 102,

740-7.

Kobzik, L., Reid, M. B., Bredt, D. S. & Stamler, J. S. 1994. Nitric oxide in skeletal

muscle. Nature, 372, 546-8.

Koistinen, H. A., Chibalin, A. V. & Zierath, J. R. 2003. Aberrant p38 mitogen-activated

protein kinase signalling in skeletal muscle from Type 2 diabetic patients.


Kondo, H., Kodama, J., Kishibe, T. & Itokawa, Y. 1993a. Oxidative stress during

recovery from muscle atrophy. FEBS Lett, 326, 189-91.

Kondo, H., Miura, M. & Itokawa, Y. 1991. Oxidative stress in skeletal muscle atrophied

by immobilization. Acta Physiol Scand, 142, 527-8.

Kondo, H., Miura, M. & Itokawa, Y. 1993b. Antioxidant enzyme systems in skeletal

muscle atrophied by immobilization. Pflugers Arch, 422, 404-6.

Kondo, H., Miura, M., Kodama, J., Ahmed, S. M. & Itokawa, Y. 1992a. Role of iron in

oxidative stress in skeletal muscle atrophied by immobilization. Pflugers Arch,

421, 295-7.

Kondo, H., Miura, M., Nakagaki, I., Sasaki, S. & Itokawa, Y. 1992b. Trace element

movement and oxidative stress in skeletal muscle atrophied by immobilization.

Am J Physiol, 262, E583-90.

Kondo, H., Nakagaki, I., Sasaki, S., Hori, S. & Itokawa, Y. 1993c. Mechanism of

oxidative stress in skeletal muscle atrophied by immobilization. Am J Physiol,

265, E839-44.

Kondo, H., Nishino, K. & Itokawa, Y. 1994. Hydroxyl radical generation in skeletal

muscle atrophied by immobilization. FEBS Lett, 349, 169-72.

Koren, A., Schara, M. & Sentjurc, M. 1980. EPR measurements of free radicals during

tetanic contractions of frog skeletal muscle. . Period Biol. , 82, 399-401

Kourie, J. I. 1998. Interaction of reactive oxygen species with ion transport

mechanisms. Am J Physiol, 275, C1-24.

Bibliografía

273

Krawiec, B. J., Frost, R. A., Vary, T. C., Jefferson, L. S. & Lang, C. H. 2005. Hindlimb

casting decreases muscle mass in part by proteasome-dependent proteolysis but

independent of protein synthesis. Am J Physiol Endocrinol Metab, 289, E969-

80.

Krenitsky, T. A., Tuttle, J. V., Cattau, E. L. & Wang, P. 1974. A comparison of the

distribution and electron acceptor specificities of xanthine oxidase and aldehyde

oxidase. Comp Biochem Physiol B, 49, 687-703.

Krinsky, N. 1994. In: FREI, B. (Ed.) Natural antioxidants in human health and disease.

San Diego, Academic Press.

Kurosaka, M. & Machida, S. 2013. Interleukin-6-induced satellite cell proliferation is

regulated by induction of the JAK2/STAT3 signalling pathway through cyclin

D1 targeting. Cell Prolif, 46, 365-73.

Lack, J. A. & Stuart-Taylor, M. E. 1997. Calculation of drug dosage and body surface

area of children. Br J Anaesth, 78, 601-5.

Ladner, K. J., Caligiuri, M. A. & Guttridge, D. C. 2003. Tumor necrosis factor-

regulated biphasic activation of NF-kappa B is required for cytokine-induced

loss of skeletal muscle gene products. J Biol Chem, 278, 2294-303.

Lagirand-Cantaloube, J., Cornille, K., Csibi, A., Batonnet-Pichon, S., Leibovitch, M. P.

& Leibovitch, S. A. 2009. Inhibition of atrogin-1/MAFbx mediated MyoD

proteolysis prevents skeletal muscle atrophy in vivo. PLoS One, 4, e4973.

Lagirand-Cantaloube, J., Offner, N., Csibi, A., Leibovitch, M. P., Batonnet-Pichon, S.,

Tintignac, L. A., Segura, C. T. & Leibovitch, S. A. 2008. The initiation factor

eIF3-f is a major target for atrogin1/MAFbx function in skeletal muscle atrophy.

EMBO J, 27, 1266-76.

Lalani R, B. S., Byhower F, Tarnuzzer R, Grant M, Shen R, Asa S, Ezzat S, and

Gonzalez-Cadavid NF. 2000. Myostatin and insulin-like growth factor-I and -II

expression in the muscle of rats exposed to the microgravity environment of the

NeuroLab space shuttle flight. . J Endocrinol. 167, 417–428.

Langley, B., Thomas, M., Bishop, A., Sharma, M., Gilmour, S., and Kambadur, R.

2002. Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD

expression. . J Biol Chem 277, 49831-49840.

Latres, E., Amini, A. R., Amini, A. A., Griffiths, J., Martin, F. J., Wei, Y., Lin, H. C.,

Yancopoulos, G. D. & Glass, D. J. 2005. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)

inversely regulates atrophy-induced genes via the phosphatidylinositol 3-

kinase/Akt/mammalian target of rapamycin (PI3K/Akt/mTOR) pathway. J Biol

Chem, 280, 2737-44.

Lawler, J. M., Song, W. & Demaree, S. R. 2003. Hindlimb unloading increases

oxidative stress and disrupts antioxidant capacity in skeletal muscle. Free Radic

Biol Med, 35, 9-16.

Lawrence, T. & Fong, C. 2010. The resolution of inflammation: anti-inflammatory roles

for NF-kappaB. Int J Biochem Cell Biol, 42, 519-23.

Lawrenson, L., Poole, J. G., Kim, J., Brown, C., Patel, P. & Richardson, R. S. 2003.

Vascular and metabolic response to isolated small muscle mass exercise: effect

of age. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 285, H1023-31.

Le Douairon, L. S., Gratas-Delamarche, A., Malardé, L., Vincent, S., Zguira, M. S.,

Morel, S. L., Delamarche, P., Zouhal, H., Carré, F. & Bekono, F. R. 2010.

Intense exercise training induces adaptation in expression and responsiveness of

cardiac β-adrenoceptors in diabetic rats. Cardiovasc Diabetol, 9, 72.

Bibliografía

274

Lecker, S. H., Goldberg, A. L. & Mitch, W. E. 2006. Protein degradation by the

ubiquitin-proteasome pathway in normal and disease states. J Am Soc Nephrol,

17, 1807-19.

Lecker, S. H., Jagoe, R. T., Gilbert, A., Gomes, M., Baracos, V., Bailey, J., Price, S. R.,

Mitch, W. E. & Goldberg, A. L. 2004. Multiple types of skeletal muscle atrophy

involve a common program of changes in gene expression. FASEB J, 18, 39-51.

Lee, D. & Goldberg, A. 2011. Atrogin1/MAFbx: what atrophy, hypertrophy, and

cardiac failure have in common. Circ Res, 109, 123-6.

Lee, S. J. 2004. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol 20,

61-86.

Lee, S. W., Dai, G., Hu, Z., Wang, X., Du, J. & Mitch, W. E. 2004. Regulation of

muscle protein degradation: coordinated control of apoptotic and ubiquitin-

proteasome systems by phosphatidylinositol 3 kinase. J Am Soc Nephrol, 15,

1537-45.

Leeuwenburgh, C. 2003. Role of apoptosis in sarcopenia. J Gerontol A Biol Sci Med

Sci, 58, 999-1001.

Li, H.-H., Kedar, V., Zhang, C., McDonough, H., Arya, R., Wang, D.-Z. & Patterson,

C. 2004. Atrogin-1/muscle atrophy F-box inhibits calcineurin-dependent cardiac

hypertrophy by participating in an SCF ubiquitin ligase complex. J Clin Invest,

114, 1058-71.

Li, H., Malhotra, S. & Kumar, A. 2008. Nuclear factor-kappa B signaling in skeletal

muscle atrophy. J Mol Med (Berl), 86, 1113-26.

Li, H., Samouilov, A., Liu, X. & Zweier, J. L. 2001. Characterization of the magnitude

and kinetics of xanthine oxidase-catalyzed nitrite reduction. Evaluation of its

role in nitric oxide generation in anoxic tissues. J Biol Chem, 276, 24482-9.

Li, P.-B., Lin, W.-L., Wang, Y.-G., Peng, W., Cai, X.-Y. & Su, W.-W. 2012.

Antidiabetic activities of oligosaccharides of Ophiopogonis japonicus in

experimental type 2 diabetic rats. Int J Biol Macromol, 51, 749-55.

Li, X. & Stark, G. R. 2002. NFkappaB-dependent signaling pathways. Exp Hematol, 30,

285-96.

Li, Y.-P., Chen, Y., John, J., Moylan, J., Jin, B., Mann, D. L. & Reid, M. B. 2005. TNF-

alpha acts via p38 MAPK to stimulate expression of the ubiquitin ligase

atrogin1/MAFbx in skeletal muscle. FASEB J, 19, 362-70.

Li, Y. P. & Reid, M. B. 2000. NF-kappaB mediates the protein loss induced by TNF-

alpha in differentiated skeletal muscle myotubes. Am J Physiol Regul Integr

Comp Physiol, 279, R1165-70.

Li, Y. P., Schwartz, R. J., Waddell, I. D., Holloway, B. R. & Reid, M. B. 1998. Skeletal

muscle myocytes undergo protein loss and reactive oxygen-mediated NF-

kappaB activation in response to tumor necrosis factor alpha. FASEB J, 12, 871-

80.

Lim, J. H., Lee, J. I., Suh, Y. H., Kim, W., Song, J. H. & Jung, M. H. 2006.

Mitochondrial dysfunction induces aberrant insulin signalling and glucose

utilisation in murine C2C12 myotube cells. Diabetologia, 49, 1924-36.

Lin, H., Sun, S.-h., Gao, J., Liu, C. & Zhan, J. 2010. [The influence of indomethacin on

TNFα and skeletal muscle protein catabolism in chronic obstructive pulmonary

disease rat model]. Zhonghua Nei Ke Za Zhi, 49, 776-80.

Lin, W.-L., Su, W.-W., Cai, X.-Y., Luo, L.-K., Li, P.-B. & Wang, Y.-G. 2011.

Fermentation effects of oligosaccharides of Radix Ophiopogonis on alloxan-

induced diabetes in mice. Int J Biol Macromol, 49, 194-200.

Bibliografía

275

Linder, N., Rapola, J. & Raivio, K. O. 1999. Cellular expression of xanthine

oxidoreductase protein in normal human tissues. Lab Invest, 79, 967-74.

Linnane, A. W., Marzuki, S., Ozawa, T. & Tanaka, M. 1989. Mitochondrial DNA

mutations as an important contributor to ageing and degenerative diseases.

Lancet., 642-645.

Lippman, R. D. 1985. Rapid in vivo quantification and comparison of hydroperoxides

and oxidized collagen in aging mice, rabbits and man. Exp. Gerontol., 20, 1-5.

Liu, C.-M., Yang, Z., Liu, C.-W., Wang, R., Tien, P., Dale, R. & Sun, L.-Q. 2007.

Effect of RNA oligonucleotide targeting Foxo-1 on muscle growth in normal

and cancer cachexia mice. Cancer Gene Ther, 14, 945-52.

Lomonosova, Y. N., Kalamkarov, G. R., Bugrova, A. E., Shevchenko, T. F.,

Kartashkina, N. L., Lysenko, E. A., Shvets, V. I. & Nemirovskaya, T. L. 2011.

Protective effect of L-Arginine administration on proteins of unloaded m.

soleus. Biochemistry (Mosc), 76, 571-80.

Lomonosova, Y. N., Shenkman, B. S. & Nemirovskaya, T. L. 2012. Attenuation of

unloading-induced rat soleus atrophy with the heat-shock protein inducer 17-

(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin. FASEB J, 26, 4295-301.

Louis, M., Van Beneden, R., Dehoux, M., Thissen, J. P. & Francaux, M. 2004. Creatine

increases IGF-I and myogenic regulatory factor mRNA in C(2)C(12) cells.

FEBS Lett, 557, 243-7.

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. 1951. Protein

measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem, 193, 265-75.

Lund, S., Holman, G. D., Schmitz, O. & Pedersen, O. 1995. Contraction stimulates

translocation of glucose transporter GLUT4 in skeletal muscle through a

mechanism distinct from that of insulin. Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 5817-21.

Llovera, M., Garcia-Martinez, C., Agell, N., Lopez-Soriano, F. J. & Argiles, J. M. 1997.

TNF can directly induce the expression of ubiquitin-dependent proteolytic

system in rat soleus muscles. Biochem Biophys Res Commun, 230, 238-41.

Ma, K., Mallidis, C., Bhasin, S., Mahabadi, V., Artaza, J., Gonzalez-Cadavid, N., Arias,

J. & Salehian, B. 2003. Glucocorticoid-induced skeletal muscle atrophy is

associated with upregulation of myostatin gene expression. Am J Physiol

Endocrinol Metab, 285, E363-71.

Ma, R. C. W. & Chan, J. C. N. 2009. Diabetes: incidence of childhood type 1 diabetes:

a worrying trend. Nat Rev Endocrinol, 5, 529-30.

Macleod M, S. P. 2005. Can systematic reviews help animal experimental work? RDS

News winter.

Magnani, M., Crinelli, R., Bianchi, M. & Antonelli, A. 2000. The ubiquitin-dependent

proteolytic system and other potential targets for the modulation of nuclear

factor-kB (NF-kB). Curr Drug Targets, 1, 387-99.

Malardé, L., Vincent, S., Lefeuvre-Orfila, L., Efstathiou, T., Groussard, C. & Gratas-

Delamarche, A. 2013. A fermented soy permeate improves the skeletal muscle

glucose level without restoring the glycogen content in streptozotocin-induced

diabetic rats. J Med Food, 16, 176-9.

Manna, S. K., Zhang, H. J., Yan, T., Oberley, L. W. & Aggarwal, B. B. 1998.

Overexpression of manganese superoxide dismutase suppresses tumor necrosis

factor-induced apoptosis and activation of nuclear transcription factor-kappaB

and activated protein-1. J Biol Chem, 273, 13245-54.

Manning, B. D. & Cantley, L. C. 2007. AKT/PKB signaling: navigating downstream.

Cell, 129, 1261-74.

Bibliografía

276

Mares-Perlman, J. A., Lyle, B. J., Klein, R., Fisher, A. I., Brady, W. E.,

VandenLangenberg, G. M., Trabulsi, J. N. & Palta, M. 2000. Vitamin

supplement use and incident cataracts in a population-based study. Arch

Ophthalmol, 118, 1556-63.

Marfella, R., D'Amico, M., Esposito, K., Baldi, A., Di Filippo, C., Siniscalchi, M.,

Sasso, F. C., Portoghese, M., Cirillo, F., Cacciapuoti, F., Carbonara, O.,

Crescenzi, B., Baldi, F., Ceriello, A., Nicoletti, G. F., D'Andrea, F., et al. 2006.

The ubiquitin-proteasome system and inflammatory activity in diabetic

atherosclerotic plaques: effects of rosiglitazone treatment. Diabetes, 55, 622-32.

Mason, R. P. 1982. Free radical intermediates in the metabolism of toxicological

significance. In: PRYOR, W. A. (Ed.) Free radicals biology. New York,

Academic Press.

Massey, V., Schopfer, L. M. & Nishino, T. 1989. Differences in protein structure of

xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase revealed by reconstitution with

flavin active site probes. J Biol Chem, 264, 10567-73.

Matsui, T., Nagoshi, T. & Rosenzweig, A. 2003. Akt and PI 3-kinase signaling in

cardiomyocyte hypertrophy and survival. Cell Cycle, 2, 220-3.

Matuszczak, Y., Arbogast, S. & Reid, M. B. 2004. Allopurinol mitigates muscle

contractile dysfunction caused by hindlimb unloading in mice. Aviat Space

Environ Med, 75, 581-8.

Mayer, M., Shafrir, E., Kaiser, N., Milholland, R. J. & Rosen, F. 1976. Interaction of

glucocorticoid hormones with rat skeletal muscle: catabolic effects and hormone

binding. Metabolism, 25, 157-67.

McArdle, A., van der Meulen, J. H., Catapano, M., Symons, M. C., Faulkner, J. A. &

Jackson, M. J. 1999. Free radical activity following contraction-induced injury

to the extensor digitorum longus muscles of rats. Free Radic Biol Med, 26,

1085-91.

McCarthy, D. O., Whitney, P., Hitt, A. & Al-Majid, S. 2004. Indomethacin and

ibuprofen preserve gastrocnemius muscle mass in mice bearing the colon-26

adenocarcinoma. Res Nurs Health, 27, 174-84.

McCord, J. M. 1974. Free radicals and inflammation: protection of synovial fluid by

superoxide dismutase. Science, 185, 5229-531.

McCord, J. M. 1986. Superoxide dismutase: rationale for use in reperfusion injury and

inflammation. J Free Radic Biol Med, 2, 307-10.

McCord, J. M. & Fridovich, I. 1969. Superoxide dismutase. An enzymic function for

erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 244, 6049-55.

McCord, J. M., Keele, B. B. & Fridovich, Y. 1974. An enzyme based theory of obligate

anaerobius: the physiological function of superoxide dismutase. Proc Natl Acad

Sci USA, 41, 35-97.

McFarlane, C., Plummer, E., Thomas, M., Hennebry, A., Ashby, M., Ling, N., Smith,

H., Sharma, M. and Kambadur, R. 2006. Myostatin induces cachexia by

activating the ubiquitin proteolytic system through an NF-kappaB-independent,

FoxO1-dependent mechanism. . J. Cell. Physiol., 209, 501-514.

McGinley, C., Shafat, A. & Donnelly, A. E. 2009. Does antioxidant vitamin

supplementation protect against muscle damage? Sports Med, 39, 1011-32.

McKinnell, I. W. & Rudnicki, M. A. 2004. Molecular mechanisms of muscle atrophy.

Cell, 119, 907-10.

McLennan, S. V., Heffernan, S., Wright, L., Rae, C., Fisher, E., Yue, D. K. & Turtle, J.

R. 1991. Changes in hepatic glutathione metabolism in diabetes. Diabetes, 40,

344-8.

Bibliografía

277

McMahon, C. D., Popovic, L., Oldham, J. M., Jeanplong, F., Smith, H. K., Kambadur,

R., Sharma, M., Maxwell, L. & Bass, J. J. 2003. Myostatin-deficient mice lose

more skeletal muscle mass than wild-type controls during hindlimb suspension.

Am J Physiol Endocrinol Metab, 285, E82-7.

Melloul, D. 2008. Role of NF-kappaB in beta-cell death. Biochem Soc Trans, 36, 334-9.

Menconi, M., Fareed, M., O’Neal, P., Poylin, V., Wei, W. and Hasselgren, P. O. 2007.

Role of glucocorticoids in the molecular regulation of muscle wasting. Crit.

Care Med., 35, S602-S608.

Meneshian, A. & Bulkley, G. B. 2002. The physiology of endothelial xanthine oxidase:

from urate catabolism to reperfusion injury to inflammatory signal transduction.

Microcirculation, 9, 161-75.

Merforth, S., Osmers, A. & Dahlmann, B. 1999. Alterations of proteasome activities in

skeletal muscle tissue of diabetic rats. Mol Biol Rep, 26, 83-7.

Millar, T. M., Stevens, C. R. & Blake, D. R. 1997. Xanthine oxidase can generate nitric

oxide from nitrate in ischaemia. Biochem Soc Trans, 25, 528S.

Miller, T. A., Lesniewski, L. A., Muller-Delp, J. M., Majors, A. K., Scalise, D. & Delp,

M. D. 2001. Hindlimb unloading induces a collagen isoform shift in the soleus

muscle of the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 281, R1710-7.

Moelling, K., Schad, K., Bosse, M., Zimmermann, S. & Schweneker, M. 2002.

Regulation of Raf-Akt Cross-talk. J Biol Chem, 277, 31099-106.

Morey-Holton, E. R. & Globus, R. K. 2002. Hindlimb unloading rodent model:

technical aspects. J Appl Physiol, 92, 1367-77.

Morisato, D. & Anderson, K. V. 1995. Signaling pathways that establish the dorsal-

ventral pattern of the Drosophila embryo. Annu Rev Genet, 29, 371-99.

Morley, J. E., Thomas, D. R. & Wilson, M.-M. G. 2006. Cachexia: pathophysiology and

clinical relevance. Am J Clin Nutr, 83, 735-43.

Mourkioti, F., Kratsios, P., Luedde, T., Song, Y.-H., Delafontaine, P., Adami, R.,

Parente, V., Bottinelli, R., Pasparakis, M. & Rosenthal, N. 2006. Targeted

ablation of IKK2 improves skeletal muscle strength, maintains mass, and

promotes regeneration. J Clin Invest, 116, 2945-54.

Mullis K, F. F., Scharf S, Saiki R, Horn G, Elrich H 1986. Specific enzymatic

amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb

Symp Quant Biol, 51, 263-273.

Murrell, G. A. & Rapeport, W. G. 1986. Clinical pharmacokinetics of allopurinol. Clin

Pharmacokinet, 11, 343-53.

Nakamura, M. 1991. Allopurinol-insensitive oxygen radical formation by milk xanthine

oxidase systems. J Biochem, 110, 450-6.

Nakao, R., Hirasaka, K., Goto, J., Ishidoh, K., Yamada, C., Ohno, A., Okumura, Y.,

Nonaka, I., Yasutomo, K., Baldwin, K. M., Kominami, E., Higashibata, A.,

Nagano, K., Tanaka, K., Yasui, N., Mills, E. M., et al. 2009. Ubiquitin ligase

Cbl-b is a negative regulator for insulin-like growth factor 1 signaling during

muscle atrophy caused by unloading. Mol Cell Biol, 29, 4798-811.

Napetschnig, J. & Wu, H. 2013. Molecular basis of NF-κB signaling. Annu Rev

Biophys, 42, 443-68.

Naumova, A. V., Chacko, V. P., Ouwerkerk, R., Stull, L., Marbán, E. & Weiss, R. G.

2006. Xanthine oxidase inhibitors improve energetics and function after

infarction in failing mouse hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 290, H837-

43.

Bibliografía

278

Nikawa, T., Ishidoh, K., Hirasaka, K., Ishihara, I., Ikemoto, M., Kano, M., Kominami,

E., Nonaka, I., Ogawa, T., Adams, G. R., Baldwin, K. M., Yasui, N., Kishi, K.

& Takeda, S. i. 2004. Skeletal muscle gene expression in space-flown rats.

FASEB J, 18, 522-4.

Nisoli, E., Clementi, E., Paolucci, C., Cozzi, V., Tonello, C., Sciorati, C., Bracale, R.,

Valerio, A., Francolini, M., Moncada, S. & Carruba, M. O. 2003. Mitochondrial

biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Science, 299, 896-

9.

Niu, H., Chen, X., Gruppo, R. A., Li, D., Wang, Y., Zhang, L., Wang, K., Chai, W.,

Sun, Y., Ding, Z., Gartner, T. K. & Liu, J. 2012. Integrin αIIb-mediated

PI3K/Akt activation in platelets. PLoS One, 7, e47356.

Nordquist, J., Höglund, A.-S., Norman, H., Tang, X., Dworkin, B. & Larsson, L. 2007.

Transcription factors in muscle atrophy caused by blocked neuromuscular

transmission and muscle unloading in rats. Mol Med, 13, 461-70.

Obata, T., Brown, G. E. & Yaffe, M. B. 2000. MAP kinase pathways activated by

stress: the p38 MAPK pathway. Crit Care Med, 28, N67-77.

Oberley, L. W. 1988. Free radicals and diabetes. Free Radic Biol Med, 5, 113-24.

Ogawa, T., Furochi, H., Mameoka, M., Hirasaka, K., Onishi, Y., Suzue, N., Oarada, M.,

Akamatsu, M., Akima, H., Fukunaga, T., Kishi, K., Yasui, N., Ishidoh, K.,

Fukuoka, H. & Nikawa, T. 2006. Ubiquitin ligase gene expression in healthy

volunteers with 20-day bedrest. Muscle Nerve, 34, 463-9.

Oishi, Y., Ogata, T., Yamamoto, K.-i., Terada, M., Ohira, T., Ohira, Y., Taniguchi, K.

& Roy, R. R. 2008. Cellular adaptations in soleus muscle during recovery after

hindlimb unloading. Acta Physiol (Oxf), 192, 381-95.

Okamoto, H. 1985. Molecular basis of experimental diabetes degeneration, oncogenesis

and regeneration of pancreatic b-cells os islets of Langerhans. Bioassays 2: 15-

21.

Okamoto, T., Torii, S. & Machida, S. 2011. Differential gene expression of muscle-

specific ubiquitin ligase MAFbx/Atrogin-1 and MuRF1 in response to

immobilization-induced atrophy of slow-twitch and fast-twitch muscles. J

Physiol Sci, 61, 537-46.

Onkamo, P., Väänänen, S., Karvonen, M. & Tuomilehto, J. 1999. Worldwide increase

in incidence of Type I diabetes--the analysis of the data on published incidence

trends. Diabetologia, 42, 1395-403.

Orlander, J., Kiessling, K. H., Larsson, L., Karlsson, J. & Aniansson, A. 1978. Skeletal

muscle metabolism and ultrastructure in relation to age in sedentary men. Acta

Physiol Scand, 104, 249-61.

Ortis, F., Pirot, P., Naamane, N., Kreins, A. Y., Rasschaert, J., Moore, F., Théâtre, E.,

Verhaeghe, C., Magnusson, N. E., Chariot, A., Orntoft, T. F. & Eizirik, D. L.

2008. Induction of nuclear factor-kappaB and its downstream genes by TNF-

alpha and IL-1beta has a pro-apoptotic role in pancreatic beta cells.


Oztürk, Y., Altan, V. M. & Yildizoğlu-Ari, N. 1996. Effects of experimental diabetes

and insulin on smooth muscle functions. Pharmacol Rev, 48, 69-112.

Pacifici, R. E. & Davies, K. J. 1991. Protein, lipid and DNA repair systems in oxidative

stress: the free- radical theory of aging revisited. Gerontology, 37, 166-80.

Pacher, P., Nivorozhkin, A. & Szabó, C. 2006. Therapeutic effects of xanthine oxidase

inhibitors: renaissance half a century after the discovery of allopurinol.

Pharmacol Rev, 58, 87-114.

Bibliografía

279

Paddon-Jones, D., Sheffield-Moore, M., Urban, R. J., Sanford, A. P., Aarsland, A.,

Wolfe, R. R. & Ferrando, A. A. 2004. Essential amino acid and carbohydrate

supplementation ameliorates muscle protein loss in humans during 28 days

bedrest. J Clin Endocrinol Metab, 89, 4351-8.

Page, C. C., Moser, C. C., Chen, X. & Dutton, P. L. 1999. Natural engineering

principles of electron tunnelling in biological oxidation-reduction. Nature, 402,

47-52.

Pahl, H. L. 1999. Activators and target genes of Rel/NF-kappaB transcription factors.

Oncogene, 18, 6853-66.

Papaconstantinou, J. 2009. Insulin/IGF-1 and ROS signaling pathway cross-talk in

aging and longevity determination. Mol Cell Endocrinol, 299, 89-100.

Park, S. W., Goodpaster, B. H., Lee, J. S., Kuller, L. H., Boudreau, R., de Rekeneire,

N., Harris, T. B., Kritchevsky, S., Tylavsky, F. A., Nevitt, M., Cho, Y.-w.,

Newman, A. B., Health, A. & Study, B. C. 2009. Excessive loss of skeletal

muscle mass in older adults with type 2 diabetes. Diabetes Care, 32, 1993-7.

Park, S. W., Goodpaster, B. H., Strotmeyer, E. S., de Rekeneire, N., Harris, T. B.,

Schwartz, A. V., Tylavsky, F. A. & Newman, A. B. 2006. Decreased muscle

strength and quality in older adults with type 2 diabetes: the health, aging, and

body composition study. Diabetes, 55, 1813-8.

Park, S. W., Goodpaster, B. H., Strotmeyer, E. S., Kuller, L. H., Broudeau, R.,

Kammerer, C., de Rekeneire, N., Harris, T. B., Schwartz, A. V., Tylavsky, F. A.,

Cho, Y.-w., Newman, A. B., Health, A. & Study, B. C. 2007. Accelerated loss

of skeletal muscle strength in older adults with type 2 diabetes: the health, aging,

and body composition study. Diabetes Care, 30, 1507-12.

Parks, D. A. & Granger, D. N. 1986. Xanthine oxidase: biochemistry, distribution and

physiology. Acta Physiol Scand Suppl, 548, 87-99.

Parks, D. A. G., D. N. 1986. Xanthine oxidase: biochemisty, distribution and

physiology. . Acta Physiol. Scand. 1986., 548(Suppl.), 87–99.

Patterson, C. C., Dahlquist, G. G., Gyürüs, E., Green, A., Soltész, G. & Group, E. S.

2009. Incidence trends for childhood type 1 diabetes in Europe during 1989-

2003 and predicted new cases 2005-20: a multicentre prospective registration

study. Lancet, 373, 2027-33.

Pea, F. 2005. Pharmacology of drugs for hyperuricemia. Mechanisms, kinetics and

interactions. Contrib Nephrol, 147, 35-46.

Pedersen, B. K. & Febbraio, M. A. 2012. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle

as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol, 8, 457-65.

Pedersen, B. K. & Fischer, C. P. 2007. Beneficial health effects of exercise--the role of

IL-6 as a myokine. Trends Pharmacol Sci, 28, 152-6.

Penkowa, M., Keller, C., Keller, P., Jauffred, S. & Pedersen, B. K. 2003.

Immunohistochemical detection of interleukin-6 in human skeletal muscle fibers

following exercise. FASEB J, 17, 2166-8.

Pereira, S., Marliss, E. B., Morais, J. A., Chevalier, S. & Gougeon, R. 2008. Insulin

resistance of protein metabolism in type 2 diabetes. Diabetes, 57, 56-63.

Perkins, N. D. 2006. Post-translational modifications regulating the activity and

function of the nuclear factor kappa B pathway. Oncogene, 25, 6717-30.

Perkins, N. D. 2007. Integrating cell-signalling pathways with NF-kappaB and IKK

function. Nat Rev Mol Cell Biol, 8, 49-62.

Peterson, G. L. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al.

which is more generally applicable. Anal Biochem, 83, 346-56.

Bibliografía

280

Peterson, J. M., Bakkar, N. & Guttridge, D. C. 2011. NF-κB signaling in skeletal

muscle health and disease. Curr Top Dev Biol, 96, 85-119.

Peterson, J. M. & Guttridge, D. C. 2008. Skeletal muscle diseases, inflammation, and

NF-kappaB signaling: insights and opportunities for therapeutic intervention. Int

Rev Immunol, 27, 375-87.

Petrone, W. F., English, D. K., Wong, K. & McCord, J. M. 1980. Free radicals and

inflammation: superoxide-dependent activation of a neutrophil chemotactic

factor in plasma. Proc Natl Acad Sci U S A, 77, 1159-63.

Phan, S. H., Gannon, D. E., Varani, J., Ryan, U. S. & Ward, P. A. 1989. Xanthine

oxidase activity in rat pulmonary artery endothelial cells and its alteration by

activated neutrophils. Am J Pathol, 134, 1201-11.

Pickart, C. M. & Cohen, R. E. 2004. Proteasomes and their kin: proteases in the

machine age. Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 177-87.

Pizza, F. X., Hernandez, I. J. & Tidball, J. G. 1998. Nitric oxide synthase inhibition

reduces muscle inflammation and necrosis in modified muscle use. J Leukoc

Biol, 64, 427-33.

Poli, T., Lapolla, A., Plebani, M., Franchin, A. & Fedele, D. 1987. Glycated serum

protein determination: comparison between thiobarbituric acid and fructosamine

assays. Acta Diabetol Lat, 24, 241-7.

Poligone, B. & Baldwin, A. S. 2001. Positive and negative regulation of NF-kappaB by

COX-2: roles of different prostaglandins. J Biol Chem, 276, 38658-64.

Poole, J. G., Lawrenson, L., Kim, J., Brown, C. & Richardson, R. S. 2003. Vascular and

metabolic response to cycle exercise in sedentary humans: effect of age. Am J

Physiol Heart Circ Physiol, 284, H1251-9.

Pottle, D. & Gosselin, L. E. 2000. Impact of mechanical load on functional recovery

after muscle reloading. Med Sci Sports Exerc, 32, 2012-7.

Poulsen, P., Kyvik, K. O., Vaag, A. & Beck-Nielsen, H. 1999. Heritability of type II

(non-insulin-dependent) diabetes mellitus and abnormal glucose tolerance--a

population-based twin study. Diabetologia, 42, 139-45.

Powers, S. C., D.; Lawler, J.; Ji, L.; Martin, D.; Herb, R. y Dudley, G. 1994. Influence

of exercise and fiber type on antioxidant enzyme activity in rat skeletal muscle.

Am. J. Physiol. 266: R375-R380.

Powers, S. K., Kavazis, A. N. & DeRuisseau, K. C. 2005. Mechanisms of disuse muscle

atrophy: role of oxidative stress. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 288,

R337-44.

Price, S. R., Bailey, J. L., Wang, X., Jurkovitz, C., England, B. K., Ding, X., Phillips, L.

S. & Mitch, W. E. 1996. Muscle wasting in insulinopenic rats results from

activation of the ATP-dependent, ubiquitin-proteasome proteolytic pathway by a

mechanism including gene transcription. J Clin Invest, 98, 1703-8.

Primeau, A. J., Adhihetty, P. J. & Hood, D. A. 2002. Apoptosis in heart and skeletal

muscle. Can J Appl Physiol, 27, 349-95.

Proctor, D. N., Koch, D. W., Newcomer, S. C., Le, K. U. & Leuenberger, U. A. 2003.

Impaired leg vasodilation during dynamic exercise in healthy older women. J

Appl Physiol (1985), 95, 1963-70.

Purintrapiban, J., Wang, M. C. & Forsberg, N. E. 2003. Degradation of sarcomeric and

cytoskeletal proteins in cultured skeletal muscle cells. Comp Biochem Physiol B

Biochem Mol Biol, 136, 393-401.

Quintanilha, A. T. & Packer, L. 1983. Vitamin E, physical exercise and tissue oxidative

damage. Ciba Found Symp, 101, 56-69.

Bibliografía

281

Radi, R., Rubbo, H., Bush, K. & Freeman, B. A. 1997. Xanthine oxidase binding to

glycosaminoglycans: kinetics and superoxide dismutase interactions of

immobilized xanthine oxidase-heparin complexes. Arch Biochem Biophys, 339,

125-35.

Rakieten, N., Rakieten, M. L. & Nadkarni, M. V. 1963. Studies on the diabetogenic

action of streptozotocin (NSC-37917). Cancer Chemother Rep, 29, 91-8.

Reed, S. A., Senf, S. M., Cornwell, E. W., Kandarian, S. C. & Judge, A. R. 2011.

Inhibition of IkappaB kinase alpha (IKKα) or IKKbeta (IKKβ) plus forkhead

box O (Foxo) abolishes skeletal muscle atrophy. Biochem Biophys Res Commun,

405, 491-6.

Reid, M. B. 2005. Response of the ubiquitin-proteasome pathway to changes in muscle

activity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 288, R1423-31.

Reid, M. B. & Li, Y. P. 2001a. Cytokines and oxidative signalling in skeletal muscle.

Acta Physiol Scand, 171, 225-32.

Reid, M. B. & Li, Y. P. 2001b. Tumor necrosis factor-alpha and muscle wasting: a

cellular perspective. Respir Res, 2, 269-72.

Reske-Nielsen, E., Harmsen, A. & Vorre, P. 1977. Ultrastructure of muscle biopsies in

recent, short-term and long-term juvenile diabetes. Acta Neurol Scand, 55, 345-

62.

Richter, C., Park, J. W. & Ames, B. N. 1988. Normal oxidative damage to

mitochondrial and nuclear DNA is extensive. Proc. Natl. acad. Sci., 85, 6465-

6467.

Riley, D. A., Bain, J. L. W., Romatowski, J. G. & Fitts, R. H. 2005. Skeletal muscle

fiber atrophy: altered thin filament density changes slow fiber force and

shortening velocity. Am J Physiol Cell Physiol, 288, C360-5.

Rock, K. L., Gramm, C., Rothstein, L., Clark, K., Stein, R., Dick, L., Hwang, D. &

Goldberg, A. L. 1994. Inhibitors of the proteasome block the degradation of

most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I

molecules. Cell, 78, 761-71.

Rodriguez, A. M., Carrico, P. M., Mazurkiewicz, J. E. & Melendez, J. A. 2000.

Mitochondrial or cytosolic catalase reverses the MnSOD-dependent inhibition of

proliferation by enhancing respiratory chain activity, net ATP production, and

decreasing the steady state levels of H(2)O(2). Free Radic Biol Med, 29, 801-13.

Romagnoli, M., Gomez-Cabrera, M.-C., Perrelli, M.-G., Biasi, F., Pallardó, F. V.,

Sastre, J., Poli, G. & Viña, J. 2010. Xanthine oxidase-induced oxidative stress

causes activation of NF-kappaB and inflammation in the liver of type I diabetic

rats. Free Radic Biol Med, 49, 171-7.

Rommel, C., Bodine, S. C., Clarke, B. A., Rossman, R., Nunez, L., Stitt, T. N.,

Yancopoulos, G. D. & Glass, D. J. 2001. Mediation of IGF-1-induced skeletal

myotube hypertrophy by PI(3)K/Akt/mTOR and PI(3)K/Akt/GSK3 pathways.

Nat Cell Biol, 3, 1009-13.

Rosenberg, I. 1989. Summary comments: epidemiological and methodological

problems in determining nutritional status of older persons. American Journal of

Clinical Nutrition, 50, 1231-3.

Rosenberg, I. H. 1997. Sarcopenia: origins and clinical relevance. J Nutr, 127, 990S-

991S.

Rott, K. T. & Agudelo, C. A. 2003. Gout. JAMA, 289, 2857-60.

Bibliografía

282

Rouquette, M., Page, S., Bryant, R., Benboubetra, M., Stevens, C. R., Blake, D. R.,

Whish, W. D., Harrison, R. & Tosh, D. 1998. Xanthine oxidoreductase is

asymmetrically localised on the outer surface of human endothelial and

epithelial cells in culture. FEBS Lett, 426, 397-401.

Ruff, R. L. & Secrist, D. 1984. Inhibitors of prostaglandin synthesis or cathepsin B

prevent muscle wasting due to sepsis in the rat. J Clin Invest, 73, 1483-6.

Russell, S. T., Rajani, S., Dhadda, R. S. & Tisdale, M. J. 2009. Mechanism of induction

of muscle protein loss by hyperglycaemia. Exp Cell Res, 315, 16-25.

Sacheck, J. M., Hyatt, J.-P. K., Raffaello, A., Jagoe, R. T., Roy, R. R., Edgerton, V. R.,

Lecker, S. H. & Goldberg, A. L. 2007. Rapid disuse and denervation atrophy

involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during

systemic diseases. FASEB J, 21, 140-55.

Sacheck, J. M., Ohtsuka, A., McLary, S. C. and Goldberg, A. L. 2004. IGF-I stimulates

muscle growth by suppressing protein breakdown and expression of atrophy-

related ubiquitin ligases, atrogin-1 and MuRF1. Am. J. Physiol. Endocrinol.

Metab. , 287, E591-E601.

Saha, R. N., Jana, M. & Pahan, K. 2007. MAPK p38 regulates transcriptional activity of

NF-kappaB in primary human astrocytes via acetylation of p65. J Immunol, 179,

7101-9.

Sakuma, K., Watanabe, K., Hotta, N., Koike, T., Ishida, K., Katayama, K. & Akima, H.

2009. The adaptive responses in several mediators linked with hypertrophy and

atrophy of skeletal muscle after lower limb unloading in humans. Acta Physiol

(Oxf), 197, 151-9.

Salanova, M., Schiffl, G., Püttmann, B., Schoser, B. G. & Blottner, D. 2008. Molecular

biomarkers monitoring human skeletal muscle fibres and microvasculature

following long-term bed rest with and without countermeasures. J Anat, 212,

306-18.

Samouilov, A., Kuppusamy, P. & Zweier, J. L. 1998. Evaluation of the magnitude and

rate of nitric oxide production from nitrite in biological systems. Arch Biochem

Biophys, 357, 1-7.

Sandercock, P. & Roberts, I. 2002. Systematic reviews of animal experiments. Lancet,

360, 586.

Sanders, S. A., Eisenthal, R. & Harrison, R. 1997. NADH oxidase activity of human

xanthine oxidoreductase--generation of superoxide anion. Eur J Biochem, 245,

541-8.

Sandri, M. 2008. Signaling in muscle atrophy and hypertrophy. Physiology (Bethesda),

23, 160-70.

Sandri, M., Sandri, C., Gilbert, A., Skurk, C., Calabria, E., Picard, A., Walsh, K.,

Schiaffino, S., Lecker, S. H. & Goldberg, A. L. 2004. Foxo transcription factors

induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle

atrophy. Cell, 117, 399-412.

Sastre, J., Asensi, M., Gasco, E., Pallardo, F. V., Ferrero, J. A., Furukawa, T. & Vina, J.

1992. Exhaustive physical exercise causes oxidation of glutathione status in

blood: prevention by antioxidant administration. Am J Physiol, 263, R992-5.

Scotto d'Abusco, A., Politi, L., Giordano, C. & Scandurra, R. 2010. A peptidyl-

glucosamine derivative affects IKKalpha kinase activity in human chondrocytes.

Arthritis Res Ther, 12, R18.

Schakman, O., Gilson, H. and Thissen, J. P. 2008. Mechanisms of

glucocorticoidinduced myopathy. . J. Endocrinol, 197, 1-10.

Schardinger 1902. Z. Untersuch. Genussmittel. 5: 1113-1121.

Bibliografía

283

Scheidereit, C. 2006. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation

and transcription. Oncogene, 25, 6685-705.

Scherer, D. C., Brockman, J. A., Chen, Z., Maniatis, T. & Ballard, D. W. 1995. Signal-

induced degradation of I kappa B alpha requires site-specific ubiquitination.

Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 11259-63.

Schlesinger, N. 2004. Management of acute and chronic gouty arthritis: present state-of-

the-art. Drugs, 64, 2399-416.

Schmedtje, J. F., Ji, Y. S., Liu, W. L., DuBois, R. N. & Runge, M. S. 1997. Hypoxia

induces cyclooxygenase-2 via the NF-kappaB p65 transcription factor in human

vascular endothelial cells. J Biol Chem, 272, 601-8.

Schomer-Miller, B., Higashimoto, T., Lee, Y.-K. & Zandi, E. 2006. Regulation of

IkappaB kinase (IKK) complex by IKKgamma-dependent phosphorylation of

the T-loop and C terminus of IKKbeta. J Biol Chem, 281, 15268-76.

Schreck, R., Albermann, K. & Baeuerle, P. A. 1992. Nuclear factor kappa B: an

oxidative stress-responsive transcription factor of eukaryotic cells (a review).

Free Radic Res Commun, 17, 221-37.

Schreck, R., Rieber, P. & Baeuerle, P. A. 1991. Reactive oxygen intermediates as

apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B

transcription factor and HIV-1. EMBO J, 10, 2247-58.

Sen, C. K. & Packer, L. 1996. Antioxidant and redox regulation of gene transcription.

FASEB J, 10, 709-20.

Sen, C. K. M., E.; Kretzschmar, M.; Ha¨nninen, O. 1992. Skeletal muscle and liver

glutathione homeostasis in response to training, exercise, and immobilization. J.

Appl. Physiol., 73, 1265–1272.

Sen, R. & Baltimore, D. 1986. Multiple nuclear factors interact with the

immunoglobulin enhancer sequences. Cell, 46, 705-16.

Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M. & Judge, A. R. 2008. Hsp70 overexpression

inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal

muscle atrophy. FASEB J, 22, 3836-45.

Senftleben, U., Cao, Y., Xiao, G., Greten, F. R., Krahn, G., Bonizzi, G., Chen, Y., Hu,

Y., Fong, A., Sun, S. C. & Karin, M. 2001. Activation by IKKalpha of a second,

evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science, 293, 1495-9.

Seok, J., Warren, H. S., Cuenca, A. G., Mindrinos, M. N., Baker, H. V., Xu, W.,

Richards, D. R., McDonald-Smith, G. P., Gao, H., Hennessy, L., Finnerty, C. C.,

López, C. M., Honari, S., Moore, E. E., Minei, J. P., Cuschieri, J., et al. 2013.

Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory

diseases. Proc Natl Acad Sci U S A, 110, 3507-12.

Serrano, A. L., Baeza-Raja, B., Perdiguero, E., Jardí, M. & Muñoz-Cánoves, P. 2008.

Interleukin-6 is an essential regulator of satellite cell-mediated skeletal muscle

hypertrophy. Cell Metab, 7, 33-44.

Servais, S., Letexier, D., Favier, R., Duchamp, C. & Desplanches, D. 2007. Prevention

of unloading-induced atrophy by vitamin E supplementation: links between

oxidative stress and soleus muscle proteolysis? Free Radic Biol Med, 42, 627-

35.

Sestili, P., Barbieri, E., Martinelli, C., Battistelli, M., Guescini, M., Vallorani, L.,

Casadei, L., D'Emilio, A., Falcieri, E., Piccoli, G., Agostini, D., Annibalini, G.,

Paolillo, M., Gioacchini, A. M. & Stocchi, V. 2009. Creatine supplementation

prevents the inhibition of myogenic differentiation in oxidatively injured C2C12

murine myoblasts. Mol Nutr Food Res, 53, 1187-204.

Bibliografía

284

Sevanian, A., Davies, K. & Hochstein, P. 1985. Conservation of vitamin C by uric acid

in blood. J. Free Radic. Biol. Med., 1, 117-124.

Seynnes, O. R., Maffiuletti, N. A., Maganaris, C. N., de Boer, M. D., Pensini, M., di

Prampero, P. E. & Narici, M. V. 2008. Soleus T reflex modulation in response to

spinal and tendinous adaptations to unilateral lower limb suspension in humans.

Acta Physiol (Oxf), 194, 239-51.

Shanely, R. A., Zergeroglu, M. A., Lennon, S. L., Sugiura, T., Yimlamai, T., Enns, D.,

Belcastro, A. & Powers, S. K. 2002. Mechanical ventilation-induced

diaphragmatic atrophy is associated with oxidative injury and increased

proteolytic activity. Am J Respir Crit Care Med, 166, 1369-74.

Shen, C. C., Wertelecki, W., Driggers, W. J., LeDoux, S. P. & Wilson, G. L. 1995.

Repair of mitochondrial DNA damage induced by bleomycin in human cells.

Mutat Res, 337, 19-23.

Shibutani, S., Takeshita, M. & Grollman, A. 1992. Insertion of specific bases during

DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature, 349, 431-

434.

Shigenaga, M. K., Hagen, T. M. & Ames, B. N. 1994. Oxidative damage and

mitochondrial decay in aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10771-10778.

Shimizu, N., Yoshikawa, N., Ito, N., Maruyama, T., Suzuki, Y., Takeda, S., Nakae, J.,

Tagata, Y., Nishitani, S., Takehana, K. 2011. Crosstalk between glucocorticoid

receptor and nutritional sensor mTOR in skeletal muscle. . Cell Metab., 13, 170-

182.

Sies, H. 1983. Biochemistry of oxidative stress. Glutathione: storage, transport and

turnover in mammals. S. Y., T. Higashi and N.Tateishi, Japan Scientific Press,

Tokyo and UNU. Science Press, Utrech.: 63-69.

Sies, H. 1985. Oxidative stress. London: Academic.

Sies, H. 1985. Oxidative Stress. London: Academic.

Sies, H. 1986. Biochemistry of oxidative stress. Angew. Chem., 25, 1058-1071.

Sies, H. 1993. Strategies of antioxidant defense. Eur J Biochem, 215, 213-9.

Sies, H. & Cadenas, E. 1985. Oxidative stress: damage to intact cells and organs. Philos

Trans R Soc Lond B Biol Sci, 311, 617-31.

Siu, P. M., Pistilli, E. E. & Alway, S. E. 2008. Age-dependent increase in oxidative

stress in gastrocnemius muscle with unloading. J Appl Physiol, 105, 1695-705.

Siu, Y.-P., Leung, K.-T., Tong, M. K.-H. & Kwan, T.-H. 2006. Use of allopurinol in

slowing the progression of renal disease through its ability to lower serum uric

acid level. Am J Kidney Dis, 47, 51-9.

Sizemore, N., Lerner, N., Dombrowski, N., Sakurai, H. & Stark, G. R. 2002. Distinct

roles of the Ikappa B kinase alpha and beta subunits in liberating nuclear factor

kappa B (NF-kappa B) from Ikappa B and in phosphorylating the p65 subunit of

NF-kappa B. J Biol Chem, 277, 3863-9.

Slade R, C. K. e. a. 1983. Comparison of antioxidant substances in brochoalveolar

lavage cells and fluid from humans, guinea pigs, and rats. Exp. Lung. Res., 19,

469-484.

Slater, T. F. 1984. Free-radical mechanisms in tissue injury. Biochem J, 222, 1-15.

Smith, O. L., Wong, C. Y. & Gelfand, R. A. 1989. Skeletal muscle proteolysis in rats

with acute streptozocin-induced diabetes. Diabetes, 38, 1117-22.

Bibliografía

285

Sommerburg, O., Grune, T., Hampl, H., Riedel, E., van Kuijk, F. J., Ehrich, J. H. &

Siems, W. G. 1998. Does long-term treatment of renal anaemia with

recombinant erythropoietin influence oxidative stress in haemodialysed patients?

Nephrol Dial Transplant, 13, 2583-7.

Southgate, R. J., Neill, B., Prelovsek, O., El-Osta, A., Kamei, Y., Miura, S., Ezaki, O.,

McLoughlin, T. J., Zhang, W., Unterman, T. G. & Febbraio, M. A. 2007.

FOXO1 regulates the expression of 4E-BP1 and inhibits mTOR signaling in

mammalian skeletal muscle. J Biol Chem, 282, 21176-86.

Spiers, S., McArdle, F. & Jackson, M. J. 2000. Aging-related muscle dysfunction.

Failure of adaptation to oxidative stress? Ann N Y Acad Sci, 908, 341-3.

Springer, J., Tschirner, A., Hartman, K., Palus, S., Wirth, E. K., Ruis, S. B., Möller, N.,

von Haehling, S., Argiles, J. M., Köhrle, J., Adams, V., Anker, S. D. & Doehner,

W. 2012. Inhibition of xanthine oxidase reduces wasting and improves outcome

in a rat model of cancer cachexia. Int J Cancer, 131, 2187-96.

Springer, J., Tschirner, A., Hartman, K., von Haehling, S., Anker, S. D. & Doehner, W.

2013. The xanthine oxidase inhibitor oxypurinol reduces cancer cachexia-

induced cardiomyopathy. Int J Cardiol, 168, 3527-31.

Srikanthan, P. & Karlamangla, A. S. 2011. Relative muscle mass is inversely associated

with insulin resistance and prediabetes. Findings from the third National Health

and Nutrition Examination Survey. J Clin Endocrinol Metab, 96, 2898-903.

St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J. & Brand, M. D. 2002. Topology of

superoxide production from different sites in the mitochondrial electron

transport chain. J Biol Chem, 277, 44784-90.

Stadman, E. R. 1992. Protein oxidation and aging. Science, 257, 1220-1224.

Stamler, J. S. & Meissner, G. 2001. Physiology of nitric oxide in skeletal muscle.


Stitt, T. N., Drujan, D., Clarke, B. A., Panaro, F., Timofeyva, Y., Kline, W. O.,

Gonzalez, M., Yancopoulos, G. D. & Glass, D. J. 2004. The IGF-1/PI3K/Akt

pathway prevents expression of muscle atrophy-induced ubiquitin ligases by

inhibiting FOXO transcription factors. Mol Cell, 14, 395-403.

Straus, D. S., Pascual, G., Li, M., Welch, J. S., Ricote, M., Hsiang, C. H.,

Sengchanthalangsy, L. L., Ghosh, G. & Glass, C. K. 2000. 15-deoxy-delta

12,14-prostaglandin J2 inhibits multiple steps in the NF-kappa B signaling

pathway. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 4844-9.

Sun, S.-C. 2011. Non-canonical NF-κB signaling pathway. Cell Res, 21, 71-85.

Suter, M. & Richter, C. 1999. Fragmented mitochondrial DNA is the predominant

carrier of oxidized DNA bases. Biochemistry, 38, 459-64.

Suzuki, Y. J., Mizuno, M. & Packer, L. 1994. Signal transduction for nuclear factor-

kappa B activation. Proposed location of antioxidant-inhibitable step. J

Immunol, 153, 5008-15.

Taillandier, D., Aurousseau, E., Meynial-Denis, D., Bechet, D., Ferrara, M., Cottin, P.,

Ducastaing, A., Bigard, X., Guezennec, C. Y. & Schmid, H. P. 1996. Coordinate

activation of lysosomal, Ca 2+-activated and ATP-ubiquitin-dependent

proteinases in the unweighted rat soleus muscle. Biochem J, 316 ( Pt 1), 65-72.

Takada, A., J. Neil, et al. 1982. Clinicopathological study of alcoholicfibrosis. American

Journal of Gastroenterology., 77, 660-666.

Bibliografía

286

Takada, Y., Mukhopadhyay, A., Kundu, G. C., Mahabeleshwar, G. H., Singh, S. &

Aggarwal, B. B. 2003. Hydrogen peroxide activates NF-kappa B through

tyrosine phosphorylation of I kappa B alpha and serine phosphorylation of p65:

evidence for the involvement of I kappa B alpha kinase and Syk protein-tyrosine

kinase. J Biol Chem, 278, 24233-41.

Takahashi, A., Kureishi, Y., Yang, J., Luo, Z., Guo, K., Mukhopadhyay, D.,

Ivashchenko, Y., Branellec, D. & Walsh, K. 2002. Myogenic Akt signaling

regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol, 22,

4803-14.

Talmadge, R. J., Roy, R. R. & Edgerton, V. R. 1996. Distribution of myosin heavy

chain isoforms in non-weight-bearing rat soleus muscle fibers. J Appl Physiol

(1985), 81, 2540-6.

Tan, S., Yokoyama, Y., Dickens, E., Cash, T. G., Freeman, B. A. & Parks, D. A. 1993.

Xanthine oxidase activity in the circulation of rats following hemorrhagic shock.

Free Radic Biol Med, 15, 407-14.

Terada, L. S., Dormish, J. J., Shanley, P. F., Leff, J. A., Anderson, B. O. & Repine, J. E.

1992. Circulating xanthine oxidase mediates lung neutrophil sequestration after

intestinal ischemia-reperfusion. Am J Physiol, 263, L394-401.

Terada, L. S., Piermattei, D., Shibao, G. N., McManaman, J. L. & Wright, R. M. 1997.

Hypoxia regulates xanthine dehydrogenase activity at pre- and posttranslational

levels. Arch Biochem Biophys, 348, 163-8.

Terkeltaub, R. A. 2003. Clinical practice. Gout. N Engl J Med, 349, 1647-55.

Thomason, D. B., Biggs, R. B. & Booth, F. W. 1989. Protein metabolism and beta-

myosin heavy-chain mRNA in unweighted soleus muscle. Am J Physiol, 257,

R300-5.

Thomason, D. B. & Booth, F. W. 1990a. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb

unweighting. J Appl Physiol (1985), 68, 1-12.

Thompson MG, T. A., Partridge K, Garden K, Campbell GP, Calder G, and Palmer RM.

1999. Stimulation of myofibrillar protein degradation and expression of mRNA

encoding the ubiquitin-proteasome system in C2C12 myotubes by

dexamethasone: effect of the proteasome inhibitor MG-132. J Cell Physiol 181,

455–461.

Thurston, M. M., Phillips, B. B. & Bourg, C. A. 2013. Safety and efficacy of allopurinol

in chronic kidney disease. Ann Pharmacother, 47, 1507-16.

Tintignac, L. A., Lagirand, J., Batonnet, S., Sirri, V., Leibovitch, M. P. & Leibovitch, S.

A. 2005. Degradation of MyoD mediated by the SCF (MAFbx) ubiquitin ligase.

J Biol Chem, 280, 2847-56.

Tischler, M. E. 1994. Effect of the antiglucocorticoid RU38486 on protein metabolism

in unweighted soleus muscle. Metabolism, 43, 1451-5.

Tisdale, M. J. 2000. Biomedicine. Protein loss in cancer cachexia. Science, 289, 2293-4.

Tisdale, M. J. 2005. The ubiquitin-proteasome pathway as a therapeutic target for

muscle wasting. J Support Oncol, 3, 209-17.

Tolbert, N. E. & Essner, E. 1981. Microbodies: peroxisomes and glyoxysomes. J Cell

Biol, 91, 271s-283s.

Tomas FM, M. H., and Young VR 1979. Effect of glucocorticoid administration on the

rate of muscle protein breakdown in vivo in rats, as measured by urinary

excretion of N tau-methylhistidine. . Biochem J 178, 139–146.

Towbin H. Staehelin T., G. J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.

Proc. Natl. Sci. USA, 76, 4350-4354.

Bibliografía

287

Tracey, K. J. 2002. Lethal weight loss: the focus shifts to signal transduction. Sci STKE,

2002, pe21.

Trinder, P. 1969. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an

altemative oxygen receptor. Ann. Clin. Biochem., 6, 24-27

Tsujinaka, T., Ebisui, C., Fujita, J., Kishibuchi, M., Morimoto, T., Ogawa, A., Katsume,

A., Ohsugi, Y., Kominami, E. & Monden, M. 1995. Muscle undergoes atrophy

in association with increase of lysosomal cathepsin activity in interleukin-6

transgenic mouse. Biochem Biophys Res Commun, 207, 168-74.

Ukai, T., Cheng, C. P., Tachibana, H., Igawa, A., Zhang, Z. S., Cheng, H. J. & Little,

W. C. 2001. Allopurinol enhances the contractile response to dobutamine and

exercise in dogs with pacing-induced heart failure. Circulation, 103, 750-5.

UKPDS-Group. 1998. Intensive blood-glucose control with sulphonylureas or insulin

compared with conventional treatment and risk of complications in patients with

type 2 diabetes (UKPDS 33). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group.

Lancet, 352, 837-53.

Urso, M. L., Scrimgeour, A. G., Chen, Y.-W., Thompson, P. D. & Clarkson, P. M.

2006. Analysis of human skeletal muscle after 48 h immobilization reveals

alterations in mRNA and protein for extracellular matrix components. J Appl

Physiol (1985), 101, 1136-48.

Vallabhapurapu, S. & Karin, M. 2009. Regulation and function of NF-kappaB

transcription factors in the immune system. Annu Rev Immunol, 27, 693-733.

Vallée, S., Fouchier, F., Brémond, P., Briand, C., Marvaldi, J. & Champion, S. 2003.

Insulin-like growth factor-1 downregulates nuclear factor kappa B activation and

upregulates interleukin-8 gene expression induced by tumor necrosis factor

alpha. Biochem Biophys Res Commun, 305, 831-9.

Van Gammeren, D., Damrauer, J. S., Jackman, R. W. & Kandarian, S. C. 2009. The

IkappaB kinases IKKalpha and IKKbeta are necessary and sufficient for skeletal

muscle atrophy. FASEB J, 23, 362-70.

Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Shansky, J. & Feldstein, R. 1991. Insulin and IGF-I

induce pronounced hypertrophy of skeletal myofibers in tissue culture. Am J

Physiol, 260, C475-84.

Vermeulen, L., De Wilde, G., Van Damme, P., Vanden Berghe, W. & Haegeman, G.

2003. Transcriptional activation of the NF-kappaB p65 subunit by mitogen- and

stress-activated protein kinase-1 (MSK1). EMBO J, 22, 1313-24.

Viña, J., Gimeno, A., Sastre, J., Desco, C., Asensi, M., Pallardó, F. V., Cuesta, A.,

Ferrero, J. A., Terada, L. S. & Repine, J. E. 2000a. Mechanism of free radical

production in exhaustive exercise in humans and rats; role of xanthine oxidase

and protection by allopurinol. IUBMB Life, 49, 539-44.

Viña, J., Gomez-Cabrera, M. C., Lloret, A., Marquez, R., Miñana, J. B., Pallardó, F. V.

& Sastre, J. 2000b. Free radicals in exhaustive physical exercise: mechanism of

production, and protection by antioxidants. IUBMB Life, 50, 271-7.

Von Mering JV, M. O. 1889. Diabetes mellitus nach Pankreasexstirpation. Zbl Klin

Med, 10, 393.

Wadley, G. D., Nicolas, M. A., Hiam, D. S. & McConell, G. K. 2013. Xanthine oxidase

inhibition attenuates skeletal muscle signaling following acute exercise but does

not impair mitochondrial adaptations to endurance training. Am J Physiol

Endocrinol Metab, 304, E853-62.

Wahren, J., Saltin, B., Jorfeldt, L. & Pernow, B. 1974. Influence of age on the local

circulatory adaptation to leg exercise. Scand J Clin Lab Invest, 33, 79-86.

Bibliografía

288

Wang, T., Qiao, S., Lei, S., Liu, Y., Ng, K. F. J., Xu, A., Lam, K. S. L., Irwin, M. G. &

Xia, Z. 2011. N-acetylcysteine and allopurinol synergistically enhance cardiac

adiponectin content and reduce myocardial reperfusion injury in diabetic rats.

PLoS One, 6, e23967.

Washington, T. A., White, J. P., Davis, J. M., Wilson, L. B., Lowe, L. L., Sato, S. &

Carson, J. A. 2011. Skeletal muscle mass recovery from atrophy in IL-6

knockout mice. Acta Physiol (Oxf), 202, 657-69.

Weinbroum, A. N., V. G.; Tan, S.; Gelman, S.; Matalon, S.; Skinner, K. A.; Bradley, E.;

Parks, D. A. 1995. Liver ischemiareperfusion increases pulmonary permeability

in rat: role of circulating xanthine oxidase. Am. J. Physiol. , 268, F988–G996.

Wenke, J. C., Warren, G. L., Rathbone, C. R. & Armstrong, R. B. 2010. Mouse plantar

flexor muscle size and strength after inactivity and training. Aviat Space Environ

Med, 81, 632-8.

Werns, S. W. & Lucchesi, B. R. 1990. Free radicals and ischemic tissue injury. Trends

Pharmacol Sci, 11, 161-6.

Whidden, M. A., McClung, J. M., Falk, D. J., Hudson, M. B., Smuder, A. J., Nelson, W.

B. & Powers, S. K. 2009. Xanthine oxidase contributes to mechanical

ventilation-induced diaphragmatic oxidative stress and contractile dysfunction. J

Appl Physiol (1985), 106, 385-94.

White, C. R., Darley-Usmar, V., Berrington, W. R., McAdams, M., Gore, J. Z.,

Thompson, J. A., Parks, D. A., Tarpey, M. M. & Freeman, B. A. 1996.

Circulating plasma xanthine oxidase contributes to vascular dysfunction in

hypercholesterolemic rabbits. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 8745-9.

Williams, D., Kuipers, A., Mukai, C. & Thirsk, R. 2009. Acclimation during space

flight: effects on human physiology. CMAJ, 180, 1317-23.

Williamson, D., Gallagher, P., Harber, M., Hollon, C. & Trappe, S. 2003. Mitogen-

activated protein kinase (MAPK) pathway activation: effects of age and acute

exercise on human skeletal muscle. J Physiol, 547, 977-87.

Wills-Karp, M., Santeliz, J. & Karp, C. L. 2001. The germless theory of allergic

disease: revisiting the hygiene hypothesis. Nat Rev Immunol, 1, 69-75.

Wolf SP, G. A. e. a. 1986. Free radicals, lipids and protein degeneration. Trends Bioch.

Sci., 11, 27-31.

Wolfe, R. R. 2006. The underappreciated role of muscle in health and disease. Am J

Clin Nutr, 84, 475-82.

Wolff, S. P. 1993. Diabetes mellitus and free radicals. Free radicals, transition metals

and oxidative stress in the aetiology of diabetes mellitus and complications. Br

Med Bull, 49, 642-52.

Wray, D. W., Nishiyama, S. K., Monnet, A., Wary, C., Duteil, S. S., Carlier, P. G. &

Richardson, R. S. 2009. Antioxidants and aging: NMR-based evidence of

improved skeletal muscle perfusion and energetics. Am J Physiol Heart Circ

Physiol, 297, H1870-5.

Xu, J., Wang, Y., Xu, D.-S., Ruan, K.-F., Feng, Y. & Wang, S. 2011. Hypoglycemic

effects of MDG-1, a polysaccharide derived from Ophiopogon japonicas, in the

ob/ob mouse model of type 2 diabetes mellitus. Int J Biol Macromol, 49, 657-62.

Yamamoto, Y., Verma, U. N., Prajapati, S., Kwak, Y.-T. & Gaynor, R. B. 2003.

Histone H3 phosphorylation by IKK-alpha is critical for cytokine-induced gene

expression. Nature, 423, 655-9.

Bibliografía

289

Yasuda, T., Yoshida, T., Goda, A. E., Horinaka, M., Yano, K., Shiraishi, T., Wakada,

M., Mizutani, Y., Miki, T. & Sakai, T. 2008. Anti-gout agent allopurinol exerts

cytotoxicity to human hormone-refractory prostate cancer cells in combination

with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand. Mol Cancer Res,

6, 1852-60.

Yerneni, K. K., Bai, W., Khan, B. V., Medford, R. M. & Natarajan, R. 1999.

Hyperglycemia-induced activation of nuclear transcription factor kappaB in

vascular smooth muscle cells. Diabetes, 48, 855-64.

Young, A. & Skelton, D. A. 1994. Applied physiology of strength and power in old age.

Int J Sports Med, 15, 149-51.

Young, I. S., Tate, S., Lightbody, J. H., McMaster, D. & Trimble, E. R. 1995. The

effects of desferrioxamine and ascorbate on oxidative stress in the streptozotocin

diabetic rat. Free Radic Biol Med, 18, 833-40.

Zamir, O., O'Brien, W., Thompson, R., Bloedow, D. C., Fischer, J. E. & Hasselgren, P.

O. 1994. Reduced muscle protein breakdown in septic rats following treatment

with interleukin-1 receptor antagonist. Int J Biochem, 26, 943-50.

Zamir, O. H., P O James, H Higashiguchi, T Fischer, J E 1993. Effect of tumor necrosis

factor or interleukin-1 on muscle amino acid uptake and the role of

glucocorticoids. Surg Gynecol Obstet, 177, 27-32.

Zerba, E., Komorovsky, T. E. & Faulkner, J. A. 1990. Free radical injury to skeletal

muscles of young, adult and old mice. Am. J. Physiol., 258, C429- C435.

Zergeroglu, M. A., McKenzie, M. J., Shanely, R. A., Van Gammeren, D., DeRuisseau,

K. C. & Powers, S. K. 2003. Mechanical ventilation-induced oxidative stress in

the diaphragm. J Appl Physiol (1985), 95, 1116-24.

Zhang, B.-T., Yeung, S. S., Liu, Y., Wang, H.-H., Wan, Y.-M., Ling, S.-K., Zhang, H.-

Y., Li, Y.-H. & Yeung, E. W. 2010. The effects of low frequency electrical

stimulation on satellite cell activity in rat skeletal muscle during hindlimb

suspension. BMC Cell Biol, 11, 87.

Zhang, H., He, Z., Gao, Y., Hinghofer-Szalkay, H. G. & Fan, X. 2007a. Muscle

composition after 14-day hindlimb unloading in rats: effects of two herbal

compounds. Aviat Space Environ Med, 78, 926-31.

Zhang, J., Warren, M. A., Shoemaker, S. F. & Ip, M. M. 2007b. NFkappaB1/p50 is not

required for tumor necrosis factor-stimulated growth of primary mammary

epithelial cells: implications for NFkappaB2/p52 and RelB. Endocrinology, 148,

268-78.

Zhang, X., Zhou, J., Fernandes, A. F., Sparrow, J. R., Pereira, P., Taylor, A. & Shang,

F. 2008. The proteasome: a target of oxidative damage in cultured human retina

pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 49, 3622-30.

Zhao, T.-J., Yan, Y.-B., Liu, Y. & Zhou, H.-M. 2007. The generation of the oxidized

form of creatine kinase is a negative regulation on muscle creatine kinase. J Biol

Chem, 282, 12022-9.

Zheng, Q., Zhang, Y., Ren, Y., Wu, Y., Yang, S., Zhang, Y., Chen, H., Li, W. & Zhu,

Y. 2014. Antiproliferative and Apoptotic Effects of Indomethacin on Human

Retinoblastoma Cell Line Y79 and the Involvement of β-Catenin, Nuclear

Factor-κB and Akt Signaling Pathways. Ophthalmic Res, 51, 109-15.

Zhou, L. Z., Johnson, A. P. & Rando, T. A. 2001. NF kappa B and AP-1 mediate

transcriptional responses to oxidative stress in skeletal muscle cells. Free Radic

Biol Med, 31, 1405-16.

Bibliografía

290

Zhou, W., Jiang, Z.-W., Tian, J., Jiang, J., Li, N. & Li, J.-S. 2003. Role of NF-kappaB

and cytokine in experimental cancer cachexia. World J Gastroenterol, 9, 1567-

70.

Zierath, J. R., Krook, A. & Wallberg-Henriksson, H. 2000. Insulin action and insulin

resistance in human skeletal muscle. Diabetologia, 43, 821-35.

Zimmers TA, D. M., Koniaris LG, Haynes P, Esquela AF, Tomkinson KN, McPherron

AC, Wolfman NM, and Lee SJ. 2002. Induction of cachexia in mice by

systemically administered myostatin. . Science 296, 1486–1488.

Inhibition of Xanthine Oxidase by Allopurinol PreventsSkeletal Muscle Atrophy: Role of p38 MAPKinase and E3Ubiquitin LigasesFrederic Derbre2., Beatriz Ferrando1., Mari Carmen Gomez-Cabrera1., Fabian Sanchis-Gomar1,

Vladimir E. Martinez-Bello1, Gloria Olaso-Gonzalez1, Ana Diaz3, Arlette Gratas-Delamarche1,

Miguel Cerda4, Jose Vina1*

1 Department of Physiology, University of Valencia, Fundacion Investigacion Hospital Clinico Universitario/INCLIVA, Valencia, Spain, 2 Laboratory ‘‘Movement Sport and

Health Sciences’’, University Rennes 2-ENS Cachan, Rennes, France, 3 UCIM, Faculty of Medicine, University of Valencia, Valencia, Spain, 4 Department of Pathology,

University of Valencia, Valencia, Spain

Abstract

Alterations in muscle play an important role in common diseases and conditions. Reactive oxygen species (ROS) aregenerated during hindlimb unloading due, at least in part, to the activation of xanthine oxidase (XO). The major aim of thisstudy was to determine the mechanism by which XO activation causes unloading-induced muscle atrophy in rats, and itspossible prevention by allopurinol, a well-known inhibitor of this enzyme. For this purpose we studied one of the mainredox sensitive signalling cascades involved in skeletal muscle atrophy i.e. p38 MAPKinase, and the expression of two wellknown muscle specific E3 ubiquitin ligases involved in proteolysis, the Muscle atrophy F-Box (MAFbx; also known as atrogin-1) and Muscle RING (Really Interesting New Gene) Finger-1 (MuRF-1). We found that hindlimb unloading induced asignificant increase in XO activity and in the protein expression of the antioxidant enzymes CuZnSOD and Catalase inskeletal muscle. The most relevant new fact reported in this paper is that inhibition of XO with allopurinol, a drug widelyused in clinical practice, prevents soleus muscle atrophy by ,20% after hindlimb unloading. This was associated with theinhibition of the p38 MAPK-MAFbx pathway. Our data suggest that XO was involved in the loss of muscle mass via theactivation of the p38MAPK-MAFbx pathway in unloaded muscle atrophy. Thus, allopurinol may have clinical benefits tocombat skeletal muscle atrophy in bedridden, astronauts, sarcopenic, and cachexic patients.

Citation: Derbre F, Ferrando B, Gomez-Cabrera MC, Sanchis-Gomar F, Martinez-Bello VE, et al. (2012) Inhibition of Xanthine Oxidase by Allopurinol PreventsSkeletal Muscle Atrophy: Role of p38 MAPKinase and E3 Ubiquitin Ligases. PLoS ONE 7(10): e46668. doi:10.1371/journal.pone.0046668

Editor: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada

Received March 28, 2012; Accepted September 4, 2012; Published October 5, 2012

Copyright: � 2012 Derbre et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Funding: This work is supported by grants SAF2010-19498, from the Spanish Ministry of Education and Science; PROMETEO/2010/074 from the Consellerıa deEducacion de la Generalitat Valenciana. ISCIII2006-RED13-027 from the ‘‘Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Envejecimiento y Fragilidad (RETICEF)’’, EUFunded COSTB35 and DPS2008- 06968 from Spanish Ministry of Innovation and Science. The studies have also been co-financed by FEDER funds from theEuropean Union. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.

* E-mail: [email protected]

. These authors contributed equally to this work.

Introduction

Skeletal muscle atrophy is a debilitating consequence of multiple

chronic diseases and conditions. It reduces treatment options and

positive clinical outcomes as well as compromising quality of life

and increasing morbidity and mortality [1]. Both systemic and

local factors can initiate muscle atrophy. Systemic factors include

increased myostatin and glucocorticoids; or a lack of anabolic

hormones such as insulin or insulin-like growth factor-1 [2]. Local

factors include muscle inactivity, muscle denervation or muscular

dystrophies, and muscle ageing [3].

Muscle atrophy and weakness are linked to oxidative stress in

several conditions: limb immobilization [4], hindlimb-unloading

[5,6,7,8,9], chronic obstructive pulmonary disease [10] and sepsis

[11]. Numerous cellular sites of ROS production exist in skeletal

muscle, including NAD(P)H oxidase, nitric oxide synthase, heme

oxygenase-1, mitochondria, and XO. The involvement of each of

these oxidant sources in chronic ROS overproduction during

muscular inactivity remains a topic of debate. Xanthine oxidore-

ductase (XOR) is an intracellular enzyme involved in purine

catabolism. This enzyme catalyzes the reduction of hypoxanthine

and xanthine to uric acid [12]. XOR exists in two interconvertible

forms, xanthine dehydrogenase (XDH) and XO. In the oxidase

form, molecular oxygen is used as the electron acceptor and

hypoxanthine and xanthine are reduced to uric acid and

superoxide. During activating conditions, XDH can be converted

to XO via sulfhydryl oxidation or proteolytic cleavage. McCord et

al. found that XO plays an essential role in ischemia-reperfusion

injury [13]. Moreover, XO is a source of oxidant production in

immobilized rats [14], in hindlimb unloading [8], in mechanical

ventilation-induced diaphragmatic contractile dysfunction [15],

and in cachexia [16]. However, the molecular mechanism(s) by

which this enzyme elicits skeletal muscle atrophy remains

unknown.

Allopurinol is a well-known inhibitor of XOR widely used in

clinical practice [17]. We have previously reported that allopurinol

PLOS ONE | www.plosone.org 1 October 2012 | Volume 7 | Issue 10 | e46668

prevents muscle oxidative damage during exhaustive physical

exercise by inhibiting the MAPKinase/NF-kB cell signalling

pathways [18,19]. P38 MAPK mediates oxidative stress-sensitive

cell signalling pathways and it has been suggested that chronic

ROS overproduction plays a role in its activation during muscular

inactivity [20,21].

The loss in muscle mass during muscular inactivity is caused by

both apoptosis of myonuclei [22] and by an imbalance between

protein synthesis and degradation [23]. The discovery of two

muscle-specific E3 ubiquitin ligases, Muscle atrophy F-Box

(MAFbx; also known as atrogin-1) and Muscle RING (Really

Interesting New Gene) Finger-1 (MuRF-1), prompted renewed

expectation in identifying muscle-specific targets for therapeutic

manipulation. MAFbx and MuRF-1 belong to the ubiquitin

proteasome pathway, the primary pathway involved in intracel-

lular protein degradation in skeletal muscle [24]. MAFbx and

MuRF-1 regulate the degradation of key proteins involved in

striated muscle growth and differentiation, including MyoD,

calcineurin, troponin-I, titin and myosin heavy and light chains

[25,26].

The major aim of this study was to determine the mechanism(s)

by which XO activation causes unloading-induced muscle atrophy

and its possible prevention by allopurinol.

We have found that in unloaded muscles, XO activates the p38

MAPK which leads to the activation of the E3 ubiquitin ligases

MAFbx. Both mechanisms trigger massive degradation of muscle

proteins that is significantly prevented by allopurinol administra-

tion.

Results

Soleus muscle atrophyWe used different methods to determine the role of XO in the

hindlimb unloading-induced soleus muscle atrophy. Hindlimb

suspension for 14 days caused a significant decrease in the cross-

sectional area of soleus muscle. Administration of allopurinol

significantly prevented this decrement (Figure 1, panels A and B).

Moreover, soleus muscle to body mass ratio was significantly

reduced after 14 days of unloading (49%, p,0.001). This muscle

atrophy was reduced to only 30% in the allopurinol treated

animals (p,0.01 vs unloaded group with water) (Figure 1, panel

C). We further tested the effect of inhibiting XO in the

maintenance of muscle integrity by determining the protein

content of an important component of the sarcomere, the slow

Myosin Heavy Chain (MHC) protein. Figure 1, panel D, shows

that after unloading there was a significant decrease in the protein

content of MHC in soleus muscle. In this case we found only a

partial prevention after treatment with allopurinol.

XO activityRat plasma (Figure 2A) and soleus muscle (Figure 2B) XO

activity increased significantly after two weeks of hindlimb

unloading. As expected, treatment with allopurinol completely

inhibited XO activation both in plasma and in skeletal muscle.

Oxidative stressAs shown in Figure 3, hindlimb unloading caused a significant

increase in skeletal muscle oxidative stress evidenced by carbon-

ylation of soleus proteins. A protein(s) with a molecular weight of

65 kDa was significantly carbonylated in the muscle of unloaded

rats (Figure 3A). We also determined plasma protein carbonylation

in our animals. Figure 3B shows a significant increase in the

carbonylation of low-molecular weight proteins (less than 50 kDa)

in the samples of the unloaded animals that received water. A

trend for allopurinol prevention of protein oxidation was found

although it did not reach statistical significance either in the soleus

or in plasma.

Antioxidant enzymesHindlimb unloading increased the protein levels of the cytosolic

CuZnSOD in the soleus muscle of the rats (Figure 4A). Catalase

protein levels were also elevated in the soleus muscle of the

unloaded animals (Figure 4B). Treatment with allopurinol did not

prevent the unloading-induced increase of these antioxidant

enzymes.

p38 MAPKp38 MAPK plays an important role in the coordination of the

cellular responses to many stress stimuli, including oxidative stress

[27]. Thus, we tested whether XO-derived ROS were involved in

the activation of p38 MAPK in soleus muscle. Figure 5 shows a

significant increase in the phosporylation of p38 MAPKinase in

the soleus muscle of the unloaded animals. Allopurinol treatment

completely prevented the p38 phosporylation. Total p38 protein

levels were unaltered in the different experimental groups. The

content of a-actin, a housekeeping protein marker in muscle, was

not altered in the various treatment groups of rats (data not

shown).

E3 ubiquitin ligases MAFbx and MuRF-1To finally identify the mechanism by which allopurinol prevents

the loss of muscle mass after hindlimb unloading, we determined

the expression, in soleus muscle, of two well-known muscle specific

E3 ubiquitin ligases namely, MAFbx and MuRF-1 [28]. As shown

in Figure 6 we found a very significant increase in MAFbx mRNA

expression in the soleus muscle of the unloaded animals and a

significant prevention after treatment with allopurinol. It has been

previously shown that p38 activity stimulates the expression of

MAFbx [21]. Thus, our results are consistent with the idea that

XO-derived radicals activate p38 and subsequently MAFbx

ubiquitin ligase. This triggers protein degradation and muscle

mass loss. All this is prevented by allopurinol. Regarding MuRF-1,

our results show that hindlimb unloading induced its expression in

the soleus muscle. However, although a tendency was found

(p = 0.09), we find no prevention after allopurinol treatment (data

not shown).

Discussion

XO is involved in the oxidative stress and soleus muscleatrophy associated to hindlimb unloading

Alterations in muscle play an important role in the most

common diseases and conditions. For instance heart disease and

cancer (two of the most prevalent chronic diseases) are often

associated with rapid and extensive loss of muscle mass, strength,

and metabolic function [29]. This loss of muscle mass is an

important determinant of survival. Preservation of skeletal muscle

is also critical during aging. Sarcopenia, the loss of muscle mass

and strength that occurs with aging, is a widespread syndrome that

has a devastating effect on quality of life and ultimately survival

[30]. Here we demonstrate that treatment with allopurinol

significantly prevents skeletal muscle atrophy after hindlimb

unloading in rats. We found a remarkable decrease in the cross-

sectional area of the rat’s soleus muscle after unloading and a

significant prevention after treatment with allopurinol (Figure 1,

panel A and B). We also measured the soleus muscle atrophy by

weighting the muscles, and we found a 20% prevention in the

unloading-induced soleus atrophy under allopurinol treatment

Xanthine Oxidase Is Involved in Muscle Atrophy


(p,0.01) (Figure 1, panel C). We further tested the effect of

inhibiting XO in the maintenance of muscle integrity by

determining the protein content of an important component of

the sarcomere, the slow MHC protein. Figure 1, panel D, shows

that after unloading there was a dramatic decrease in the protein

content of MHC. In this case, we found only a partial prevention

after treatment with allopurinol.

Eighteen years ago, Kondo and co-workers observed that

muscle atrophy caused by hindlimb unloading was associated with

an increase in lipid peroxidation and oxidized glutathione in rat

skeletal muscle [4]. This first study was followed by substantial

investigations in rodents confirming that muscular inactivity

induces oxidative stress in skeletal muscle [31,32]. Although the

role of oxidative stress in muscle atrophy has been recently

questioned in the hindlimb unloading animal model [33], several

researchers have found that rodents supplemented with vitamin E

[9,34], Bowman-Birk inhibitor concentrate (soy protein with

antioxidant properties) [6], and resveratrol [7], exhibit less

oxidative damage and muscle atrophy in muscle disuse models

(including hindlimg unloading). However, the source(s) of ROS

production in the unloading models is still a subject of debate. In

the pioneer work by Kondo and co-workers the authors pointed to

XO as the main source of ROS production in the atrophied

muscles [4]. Several years later Matuszczak et al. found that

administration of allopurinol to mice had protective effects during

hindlimb unloading [8]. Although, contrary to our results, the XO

inhibitor did not decrease the atrophy caused by prolonged

unloading, it blunted the contractile dysfunction in soleus muscles.

Figure 1. Allopurinol prevents soleus muscle atrophy after 14 days of hindlimb unloading in rats. (A) The reticulin staining (Originalmagnification, 46) shows a significant decrease in the soleus muscle cross-sectional area after hindlimb unloading. Allopurinol partially prevents it(Scale bar, 1 mm). (B) Quantitative analyses were used to confirm histological findings, by comparing the cross-sectional area of the different groups:control rats with water (CW) (n = 3), control rats with allopurinol (CA) (n = 3), unloading rats with water (UW) (n = 3) and unloading rats with allopurinol(UA) (n = 3). (C) Soleus muscle to body mass ratio. Values are mean (6SD) in CW (n = 9), CA (n = 9), UW (n = 7), and UA (n = 7). (D) Western blot anddensitometric analysis of slow skeletal muscle myosin heavy chain in CW (n = 3), CA (n = 3), UW (n = 3), and UA (n = 3). A two-factor ANOVA and posthoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g001



We consider that it is possible that the higher dose of allopurinol

used in our study could explain the differences between

Matuszczak’s data and ours. Although in both studies the drug

dose was 50 mg.Kg21, if we take into account the differences in

the surface area between rats and mice, we administered 300 mg/

m2 of allopurinol in our rat study while they administered

150 mg/m2 of allopurinol in their mice study. Body surface area

has been recommended as the main basis for drug dosage, because

the rate of metabolism or redistribution of a drug is proportional to

the metabolic rate, which reflects heat losses that are generally

Figure 2. Hindlimb unloading activates plasma and soleus muscle XO. Prevention by allopurinol. Mean (6SD) results of XO activity inplasma (A) and soleus (B) of control with water (CW) (n = 9), control with allopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) and unloaded withallopurinol (UA) (n = 7) rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g002

Figure 3. Effect of unloading and allopurinol treatment on soleus muscle and plasma protein carbonylation. Mean (6SD) results ofsoleus muscle carbonylated proteins (A) of control with water (CW) (n = 9), control with allopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) andunloaded with allopurinol (UA) (n = 7) rats. Figure B represents carbonylation of low-molecular weight protein (less than 50 kDa) in plasma of thesame animals. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g003



proportional to the surface area [35]. More recently the group of

Powers [15] showed that XO is involved in mechanical

ventilation-induced oxidative injury and contractile dysfunction

in the diaphragm. Respiratory muscle weakness produced by

mechanical ventilation is due to diaphragmatic contractile

dysfunction and atrophy and is directly linked to oxidative stress

[36]. However, the molecular mechanisms involved in the XO-

Figure 4. Effect of unloading and allopurinol treatment on the protein levels of soleus muscle antioxidant enzymes. Mean (6SD)results of CuZnSOD (A) and Catalase (B) protein levels in soleus muscle of control with water (CW) (n = 9), control with allopurinol (CA) (n = 9),unloaded with water (UW) (n = 7) and unloaded with allopurinol (UA) (n = 7) rats. A two-factor ANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons wereused to identify significant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g004

Figure 5. Effect of unloading and allopurinol treatment on theactivation of p38 MAPK. Mean (6SD) results of cytosolic p38 MAPKin soleus muscle of control with water (CW) (n = 9), control withallopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) and unloadedwith allopurinol (UA) (n = 7) rats. Activation levels were expressed as theratio between phosphorylated and total protein content. A two-factorANOVA and post hoc Bonferroni’s comparisons were used to identifysignificant differences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g005

Figure 6. Effect of unloading and allopurinol treatment on theMAFbx levels in soleus muscle. Mean (6SD) results of MAFbxmRNA levels in soleus muscle of control with water (CW) (n = 9), controlwith allopurinol (CA) (n = 9), unloaded with water (UW) (n = 7) andunloaded with allopurinol (UA) (n = 7) rats. A two-factor ANOVA andpost hoc Bonferroni’s comparisons were used to identify significantdifferences.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g006



mediated skeletal muscle atrophy are not well understood. We

have previously reported that inhibition of XO with allopurinol

prevents the exercise-induced oxidative stress in skeletal muscle by

inhibiting the MAPK/NF-kB signalling pathways [18,37]. Thus,

we aimed at determining the mechanism by which XO activation

causes unloading-induced muscle atrophy and its possible preven-

tion by allopurinol. We found a significant increase in plasma and

soleus muscle XO activity associated to hindlimb unloading that

was prevented completely by allopurinol treatment (See Figure 2).

It is generally accepted that the Ca+2-activated proteases

participate in the conversion of XDH into XO [13]. Kondo and

co-workers reported an increase of intracellular Ca+2 in atrophic

muscles using electron probe X-ray microanalysis [38]. Thus, the

increased intracellular Ca+2 might enhance the enzyme conversion

in the atrophied muscle through the activation of proteases [4].

We did not find a significant prevention of the protein oxidation

induced by hindlimb unloading after allopurinol administration.

Figure 3 shows a significant increase in the protein carbonylation

in the plasma and soleus muscle in the unloaded animals. A trend

for allopurinol prevention of protein oxidation was found although

it did not reach statistical significance. The failure of allopurinol

(or oxypurinol) to completely blunt the oxidative stress in skeletal

muscle using different unloading models has been previously

reported [8,15].

A complex cytoprotective system that includes antioxidant

enzymes is recruited against free radical damage. As previously

observed by different research groups, unloading induced the

expression of the antioxidant enzymes catalase and CuZnSOD in

soleus muscle [8,9]. These responses suggest that the muscle is

adapting to oxidative stress. Allopurinol administration did not

modulate the skeletal muscle antioxidant enzymes levels (See

Figure 4). Thus, our data support the idea that XO is not the only

source of ROS production in skeletal muscle during hindlimb

unloading.

Role of XO-derived ROS in the activation of thep38MAPK-E3 ubiquitin ligases signalling pathway duringhindlimb unloading

p38 is a stress-activated protein kinase that responds to a variety

of stimuli, including oxidative stress and TNF-a [39], and has been

identified as a likely mediator of catabolic signaling in skeletal

muscle [3,21]. Thus, we determined the phosphorylation of p38

MAPK in the soleus muscle samples. We found a significant

increase in p-p38 in the soleus of the unloaded animals that was

prevented by allopurinol administration (See Figure 5). Our results

are consistent with those reported by Childs et al. [40] which

found a 128% increase in p38 phosphorylation after 10 days of

hindlimb immobilization in rats. This was associated with a 38%

decrease in soleus muscle mass over the same period. One year

later Di Giovanni et al. [41] found that p38 phosphorylation was

elevated in atrophic muscles of patients with acute quadriplegic

myopathy and with neurogenic muscle atrophy. Other procata-

bolic conditions in which constitutive phosphorylation of skeletal

muscle p38 has been shown to be elevated include Type 2 diabetes

[42] and aging [43].

To identify the final mechanism by which allopurinol prevents

the loss of muscle mass after hindlimb unloading, we determined

the expression of two well known muscle specific E3 ubiquitin

ligases involved in several in vivo models of skeletal muscle atrophy,

MAFbx and MuRF-1 [28]. MAFbx and/or MuRF-1 mRNA are

up-regulated following immobilisation in humans, hibernating

squirrels, mice and rats [28]. The increases in MAFbx and MuRF-

1 are associated with immobilisation-induced increases in protea-

some dependent proteolysis. Treatments such as vitamin E [9] and

resistance exercise [44] blunt the induction of the atrogenes

following limb unloading.

Reid and co-workers showed in 2005 that p38 signalling

promotes skeletal muscle atrophy through the expression of

MAFbx in myotubes [21] but this was never tested in whole

muscle in vivo. Figure 6 shows a very significant increase in MAFbx

mRNA expression in the skeletal muscle of the unloaded animals

and a partial prevention after treatment with allopurinol. Our data

suggest that MAFbx gene is a downstream target of p38 MAPK

signaling. This is consistent with the concept that pathologic

elevation of p38 activity favours protein degradation and muscle

atrophy. Our study does not identify the mechanism by which p38

increases MAFbx mRNA levels. It has been previously hypoth-

esized that p38 MAPK can contribute to the activation of Foxo

(forkhead-type) transcription factors that have been identified as an

essential regulator of MAFbx in skeletal muscle [21,45].

Novel potential atrogenes have been identified using microarray

analysis [46]. In 2009 it was shown that induction of Cbl-b (a

RING-type ubiquitin ligase) in vivo was required for the loss of

muscle mass in response to unloading [47]. Thus, apart from

MuRF-1 and MAFbx, this ubiquitin ligase should be also properly

studied in future experimental designs.

Collectively, our data suggest that XO is involved in the

activation of the p38MAPK-MAFbx pathway in unloaded muscle

atrophy. We have shown that allopurinol treatment, during

unloading, completely prevents the activation of XO and partially

prevents the loss of muscle mass in soleus muscle. One of the main

oxidative-stress signalling cascades, p38-MAPKinase, is activated

after 14 days of hindlimb unloading. This activation coincides with

the increase in the mRNA expression of the proteolytic E3

ubiquitin ligases MuRF-1 and MAFbx in soleus muscle. Allopu-

rinol treatment significantly prevents the activation of the p38

Figure 7. Allopurinol prevents the loss of muscle mass duringhindlimb unloading via inhibition of p38 MAPK and the E3ubiquitin ligase Atrogin1/MAFbx.doi:10.1371/journal.pone.0046668.g007



MAPK-MAFbx pathway but not MuRF-1 one. A schematic

interpretation of our results is in Figure 7.

Recent findings show that inhibition of XO reduces oxidative

stress and improves skeletal muscle function in response to

electrically-stimulation in aged mice [48]. Hyperuricaemia has

been observed to be a negative prognostic marker in end-stage

cancer patients [49]. Moreover, elevated uric acid levels, resulting

from up-regulated XO activity, have been shown to have

predictive value for mortality in chronic heart failure [50]. Our

data support the idea that XO is not the only source of ROS

production in the skeletal muscle during hindlimb unloading, but

point out the potential benefit of allopurinol administration for

bedridden, astronauts, sarcopenic and cachexic patients.

Materials and Methods

Animal care and protocolThe experimental protocol was approved by the Committee on

Ethics in Research of the Faculty of Medicine, University of

Valencia.

Thirty-two young male Wistar rats (,300 g) were housed in a

temperature-controlled room (2462uC) with a light-dark cycle

(12:12 h). After one week of acclimation, the rats were assigned

randomly to one of four experimental conditions: freely ambulat-

ing with water (CW) (n = 9); freely ambulating treated with

allopurinol (CA) (n = 9); hindlimb unloaded with water (UW)

(n = 7); or hindlimb unloaded treated with allopurinol (UA) (n = 7).

Allopurinol (Sigma Chemical, St. Louis, MO) was administered

to the animals via the drinking water. An initial concentration of

25.6 mg.dl21 was adjusted daily to achieve a target of

50 mg.kg21.day21 as calculated for each animal based on daily

water intake. After a 48 h allopurinol pre-treatment, hindlimb

unloading was accomplished using the method of Morey-Holton

and Globus, a standard model used to unload antigravity muscles

[51]. In brief, ElastoplastH tape was wrapped along the long axis of

each animal’s tail. A metal clip on the tape was attached to a nylon

monofilament line via a stainless steel swivel. The distal end of the

nylon line was attached to an overhead support and was shortened

to suspend the animal in a 45u head-down tilt position. The swivel

enabled the animal to explore the cage (360u range of motion) and

obtain food and water freely. Animals were observed daily for

changes in appearance and activity. Each animal was weighed;

food, water, and allopurinol intakes were recorded; and the angle

of hindlimb suspension was adjusted if necessary. After 14 days of

conditioning, each animal was deeply anesthetized while hind-

limb-suspended. The animal then was removed from the

suspension device. Blood was obtained by venous puncture into

heparin-containing tubes. Soleus muscles were excised, weighed,

frozen in liquid nitrogen, and stored at 280uC until analysis. Rats

were then euthanized by an overdose of the anaesthetic.

Xanthine oxidase activityXO activity was measured in plasma and soleus muscle by the

fluorimetric method described in Beckman et al. [52]. Briefly,

isoxantopterine formation from pterine was followed fluorome-

trically as previously described (excitation at 345 nm and emission

at 390 nm) [53].

ImmunoblottingAliquots of muscle lysates (40–120 mg of proteins) were resolved

on 12.5% and 15% SDS-PAGE gels depending on the molecular

weight of the protein of interest [54]. Proteins were then

transferred to nitrocellulose membranes, which were incubated

overnight at 4uC with appropriate primary antibodies: anti-

CuZnSOD (1:5000, NovusBio), anti-Catalase (1:5000, Sigma

Aldrich, Missouri), anti-a-actin (1:700, Sigma Aldrich), anti-p38

MAPK, anti-Phospho-p38 MAPK (1:1000, Cell Signaling), and

anti-MHC (1:10000, Chemicon Millipore). Thereafter, mem-

branes were incubated with a secondary antibody for 1 h at room

temperature. Specific proteins were visualized by using the

enhanced chemiluminescence procedure as specified by the

manufacturer (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Autora-

diographic signals were assessed by using a scanning densitometer

(BioRad, Hercules, CA).

HistologyThe soleus muscle samples were formalin-fixed and paraffin-

embedded in blocks. Nine serial transverse sections of 5 mm were

obtained from each sample using a LEICA RM 2245 microtome

and were mounted on glass slides, three cuts in each. The cuts

were performed in the wider part of the soleus muscle.

Subsequently, the sections were stained using the Gomori method

for the reticulin stain. All the histological sections were visualized

using a LEICA DMD 108 light microscopy. These samples were

used to measure the cross-sectional areas of each muscle,

determined per field using the Img.Pro.Plus.6 software from

captured images at 46.

RNA isolation, reverse transcription and PCRTotal RNA was isolated with the RNeasyH Fibrous Tissue Mini

Kit (Quiagen, Madrid, Spain) following the manufacturer’s

instructions and the final pellets were resuspended in 20 mL of

nuclease-free H2O. The purity of the samples was assessed

determining the 260/280 nm ratio, which was always above 1.9.

We synthesized cDNA from 1 mg of RNA using random hexamer

primers and the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

(Applied Biosystems, Madrid, Spain). Reverse transcription

conditions comprised an initial incubation step at 25uC for

10 minutes to allow random hexamers annealing, followed by

cDNA synthesis at 37uC for 120 minutes, and final inactivation

step for 5 minutes at 95uC. Real-time PCR was performed with an

ABI 7900 sequence-detection system (Applied Biosystems, Madrid,

Spain). Primers for amplifying specific fragments of the genes were

obtained from Thermo Fisher Scientific GmbH (Ulm, Germany).

The specific primers used in our experiments are shown in Table 1.

Real-time PCR was performed in duplicate in a total reaction

volume of 20 mL using MaximaTM SYBR green/ROX qPCR

Master Mix (Fermentas, Madrid, Spain). The thermal cycling

protocol was as follows: initial denaturation for 10 minutes at

95uC was followed by 40 cycles of 10 seconds at 95uC, 10 s at

62uC and 10 s at 72uC. The fluorescence signal was measured at

the end of each extension step at 72uC. At the end of each

reaction, a melting curve analysis was performed to confirm that

only the specific products were amplified. The threshold cycle (Ct)

was converted to a relative gene expression by using a standard

curve. For each sample, the expression of the target gene was

normalized with the cyclophilin mRNA content.

Protein carbonylationOxidative modification of total proteins in plasma and skeletal

muscle fractions were assessed by immunoblot detection of protein

carbonyl groups using the ‘OxyBlot’ protein oxidation kit

(Intergen) as previously described [55]. Approximately 20 mg of

total protein was loaded onto gels and electrophoretically

separated. Antibody anti-dinitrophenylhydrazone was purchased

from Intergen Company (Purchase, NY). The procedure to

quantify total protein carbonyls with the OxyBlot kit was

densitometry of the blotting and of the Ponceau red staining (data



not shown), followed by finding the ratio between the total density

in the oxyblot and the total density in the Ponceau red staining.

Specific proteins were visualised by using the enhanced chemilu-

minescence (ECL) procedure as specified by the manufacturer

(Amersham). Autoradiographic signals were assessed using a

BioRad scanning densitometer.

StatisticsResults are expressed as means 6 SDs. Normality of

distribution was checked with the Kolmogorov test, and homo-

geneity of variance was tested by Levene’s statistics. To test for

statistically significant differences between the groups, two-way

ANOVA was used. When significant F-ratios were observed, a

Bonferroni multiple comparison’s test was applied to test

individual means. Statistical significance was assumed at p,0.05.

Acknowledgments

The authors thank to Dr. Dominique Desplanches for useful discussions on

hindlimb unloading protocols that helped them to design the unloading

cages for rats.

Author Contributions

Conceived and designed the experiments: JV AG-D. Performed the

experiments: FD BF MCG-C GO-G FS-G AD. Analyzed the data: VEM-

B. Contributed reagents/materials/analysis tools: MC. Wrote the paper:

JV MCG-C.

References

1. Lynch GS (2001) Therapies for improving muscle function in neuromuscular

disorders. Exerc Sport Sci Rev 29: 141–148.

2. Shavlakadze T, Grounds M (2006) Of bears, frogs, meat, mice and men:

complexity of factors affecting skeletal muscle mass and fat. Bioessays 28: 994–

1009.

3. Powers SK, Kavazis AN, McClung JM (2007) Oxidative stress and disuse muscle

atrophy. J Appl Physiol 102: 2389–2397.

4. Kondo H, Kodama J, Kishibe T, Itokawa Y (1993) Oxidative stress during

recovery from muscle atrophy. FEBS Lett 326: 189–191.

5. Lehmann R, Zhao X, Weigert C, Simon P, Fehrenbach E, et al. (2010) Medium

chain acylcarnitines dominate the metabolite pattern in humans under moderate

intensity exercise and support lipid oxidation. PLoS One 5: e11519.

6. Arbogast S, Smith J, Matuszczak Y, Hardin BJ, Moylan JS, et al. (2007)

Bowman-Birk inhibitor concentrate prevents atrophy, weakness, and oxidative

stress in soleus muscle of hindlimb-unloaded mice. J Appl Physiol 102: 956–964.

7. Jackson JR, Ryan MJ, Hao Y, Alway SE (2010) Mediation of endogenous

antioxidant enzymes and apoptotic signaling by resveratrol following muscle

disuse in the gastrocnemius muscles of young and old rats. Am J Physiol Regul

Integr Comp Physiol 299: R1572–1581.

8. Matuszczak Y, Arbogast S, Reid MB (2004) Allopurinol mitigates muscle

contractile dysfunction caused by hindlimb unloading in mice. Aviat Space

Environ Med 75: 581–588.

9. Servais S, Letexier D, Favier R, Duchamp C, Desplanches D (2007) Prevention

of unloading-induced atrophy by vitamin E supplementation: links between

oxidative stress and soleus muscle proteolysis? Free Radic Biol Med 42: 627–635.

10. Mador MJ, Bozkanat E (2001) Skeletal muscle dysfunction in chronic obstructive

pulmonary disease. Respir Res 2: 216–224.

11. Barreiro E, Gea J, Di Falco M, Kriazhev L, James S, et al. (2005) Protein

carbonyl formation in the diaphragm. Am J Respir Cell Mol Biol 32: 9–17.

12. Ibrahim B, Stoward PJ (1978) The histochemical localization of xanthine

oxidase. Histochem J 10: 615–617.

13. McCord JM (1985) Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury.

N Engl J Med 312: 159–163.

14. Kondo H, Nakagaki I, Sasaki S, Hori S, Itokawa Y (1993) Mechanism of

oxidative stress in skeletal muscle atrophied by immobilization. Am J Physiol

265: E839–844.

15. Whidden MA, McClung JM, Falk DJ, Hudson MB, Smuder AJ, et al. (2009)

Xanthine oxidase contributes to mechanical ventilation-induced diaphragmatic

oxidative stress and contractile dysfunction. J Appl Physiol 106: 385–394.

16. Costelli P, Carbo N, Tessitore L, Bagby GJ, Lopez-Soriano FJ, et al. (1993)

Tumor necrosis factor-alpha mediates changes in tissue protein turnover in a rat

cancer cachexia model. J Clin Invest 92: 2783–2789.

17. Moorhouse PC, Grootveld M, Halliwell B, Quinlan JG, Gutteridge JM (1987)

Allopurinol and oxypurinol are hydroxyl radical scavengers. FEBS Lett 213: 23–

28.

18. Gomez-Cabrera MC, Borras C, Pallardo FV, Sastre J, Ji LL, et al. (2005)

Decreasing xanthine oxidase-mediated oxidative stress prevents useful cellular

adaptations to exercise in rats. J Physiol 567: 113–120.

19. Gomez-Cabrera MC, Martinez A, Santangelo G, Pallardo FV, Sastre J, et al.

(2006) Oxidative stress in marathon runners: interest of antioxidant supplemen-tation. Br J Nutr 96 Suppl 1: S31–33.

20. Powers SK, Duarte J, Kavazis AN, Talbert EE (2010) Reactive oxygen species

are signalling molecules for skeletal muscle adaptation. Exp Physiol 95: 1–9.

21. Li YP, Chen Y, John J, Moylan J, Jin B, et al. (2005) TNF-alpha acts via p38MAPK to stimulate expression of the ubiquitin ligase atrogin1/MAFbx in

skeletal muscle. Faseb J 19: 362–370.

22. Oishi Y, Ogata T, Yamamoto KI, Terada M, Ohira T, et al. (2008) Cellularadaptations in soleus muscle during recovery after hindlimb unloading. Acta

Physiol (Oxf) 192: 381–395.

23. Phillips SM, Glover EI, Rennie MJ (2009) Alterations of protein turnoverunderlying disuse atrophy in human skeletal muscle. J Appl Physiol 107: 645–

654.

24. Lecker SH, Solomon V, Mitch WE, Goldberg AL (1999) Muscle proteinbreakdown and the critical role of the ubiquitin-proteasome pathway in normal

and disease states. J Nutr 129: 227S–237S.

25. Cohen S, Brault JJ, Gygi SP, Glass DJ, Valenzuela DM, et al. (2009) Duringmuscle atrophy, thick, but not thin, filament components are degraded by

MuRF1-dependent ubiquitylation. J Cell Biol 185: 1083–1095.

26. Witt SH, Granzier H, Witt CC, Labeit S (2005) MURF-1 and MURF-2 target aspecific subset of myofibrillar proteins redundantly: towards understanding

MURF-dependent muscle ubiquitination. J Mol Biol 350: 713–722.

27. Dolado I, Swat A, Ajenjo N, De Vita G, Cuadrado A, et al. (2007) p38alphaMAP kinase as a sensor of reactive oxygen species in tumorigenesis. Cancer Cell

11: 191–205.

28. Foletta VC, White LJ, Larsen AE, Leger B, Russell AP (2011) The role andregulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflugers

Arch 461: 325–335.

29. Wolfe RR (2006) The underappreciated role of muscle in health and disease.Am J Clin Nutr 84: 475–482.

30. Rosenberg IH (1997) Sarcopenia: origins and clinical relevance. J Nutr 127:

990S–991S.31. Koesterer TJ, Dodd SL, Powers S (2002) Increased antioxidant capacity does

not attenuate muscle atrophy caused by unweighting. J Appl Physiol 93: 1959–

1965.32. Lawler JM, Song W, Demaree SR (2003) Hindlimb unloading increases

oxidative stress and disrupts antioxidant capacity in skeletal muscle. Free Radic

Biol Med 35: 9–16.33. Pellegrino MA, Desaphy JF, Brocca L, Pierno S, Camerino DC, et al. (2011)

Redox homeostasis, oxidative stress and disuse muscle atrophy. J Physiol 589:

2147–2160.34. Appell HJ, Duarte JA, Soares JM (1997) Supplementation of vitamin E may

attenuate skeletal muscle immobilization atrophy. Int J Sports Med 18: 157–160.

35. Lack JA, Stuart-Taylor ME (1997) Calculation of drug dosage and body surfacearea of children. Br J Anaesth 78: 601–605.

36. Betters JL, Criswell DS, Shanely RA, Van Gammeren D, Falk D, et al. (2004)

Trolox attenuates mechanical ventilation-induced diaphragmatic dysfunctionand proteolysis. Am J Respir Crit Care Med 170: 1179–1184.

Table 1. Primer sequences used for real-time PCR.

Sense Anti-sense

MAFbx 59- GCCTGAACTACGATGTTGCAG - 39 39- GCTGGTCTTCAAGAACTTTC - 59

MuRF1 59- AGGTGCCTACTTGCTCCTTGT - 39 39 - GCTGTTTCCACAAGCTTGGTC - 59

Cyclophilin 59- GTGGCAAGTCCATCTACGGAG - 39 39- CCACAGTCGGAGATGGTGATC-59

doi:10.1371/journal.pone.0046668.t001



37. Gomez-Cabrera MC, Pallardo FV, Sastre J, Vina J, Garcia-del-Moral L (2003)

Allopurinol and markers of muscle damage among participants in the Tour deFrance. JAMA 289: 2503–2504.

38. Kondo H, Miura M, Nakagaki I, Sasaki S, Itokawa Y (1992) Trace element

movement and oxidative stress in skeletal muscle atrophied by immobilization.Am J Physiol 262: E583–590.

39. Obata T, Brown GE, Yaffe MB (2000) MAP kinase pathways activated by stress:the p38 MAPK pathway. Crit Care Med 28: N67–77.

40. Childs TE, Spangenburg EE, Vyas DR, Booth FW (2003) Temporal alterations

in protein signaling cascades during recovery from muscle atrophy. Am J PhysiolCell Physiol 285: C391–398.

41. Di Giovanni S, Molon A, Broccolini A, Melcon G, Mirabella M, et al. (2004)Constitutive activation of MAPK cascade in acute quadriplegic myopathy. Ann

Neurol 55: 195–206.42. Koistinen HA, Chibalin AV, Zierath JR (2003) Aberrant p38 mitogen-activated

protein kinase signalling in skeletal muscle from Type 2 diabetic patients.

Diabetologia 46: 1324–1328.43. Williamson D, Gallagher P, Harber M, Hollon C, Trappe S (2003) Mitogen-

activated protein kinase (MAPK) pathway activation: effects of age and acuteexercise on human skeletal muscle. J Physiol 547: 977–987.

44. Haddad F, Adams GR, Bodell PW, Baldwin KM (2006) Isometric resistance

exercise fails to counteract skeletal muscle atrophy processes during the initialstages of unloading. J Appl Physiol 100: 433–441.

45. Sandri M, Sandri C, Gilbert A, Skurk C, Calabria E, et al. (2004) Foxotranscription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and

cause skeletal muscle atrophy. Cell 117: 399–412.46. Nikawa T, Ishidoh K, Hirasaka K, Ishihara I, Ikemoto M, et al. (2004) Skeletal

muscle gene expression in space-flown rats. Faseb J 18: 522–524.

47. Nakao R, Hirasaka K, Goto J, Ishidoh K, Yamada C, et al. (2009) Ubiquitin

ligase Cbl-b is a negative regulator for insulin-like growth factor 1 signalingduring muscle atrophy caused by unloading. Mol Cell Biol 29: 4798–4811.

48. Ryan MJ, Jackson JR, Hao Y, Leonard SS, Alway SE (2011) Inhibition of

xanthine oxidase reduces oxidative stress and improves skeletal muscle functionin response to electrically stimulated isometric contractions in aged mice. Free

Radic Biol Med 51: 38–52.49. Shin HS, Lee HR, Lee DC, Shim JY, Cho KH, et al. (2006) Uric acid as a

prognostic factor for survival time: a prospective cohort study of terminally ill

cancer patients. J Pain Symptom Manage 31: 493–501.50. Anker SD, Doehner W, Rauchhaus M, Sharma R, Francis D, et al. (2003) Uric

acid and survival in chronic heart failure: validation and application inmetabolic, functional, and hemodynamic staging. Circulation 107: 1991–1997.

51. Morey-Holton ER, Globus RK (2002) Hindlimb unloading rodent model:technical aspects. J Appl Physiol 92: 1367–1377.

52. Beckman JS, Parks DA, Pearson JD, Marshall PA, Freeman BA (1989) A

sensitive fluorometric assay for measuring xanthine dehydrogenase and oxidasein tissues. Free Radic Biol Med 6: 607–615.

53. Gomez-Cabrera MC, Close GL, Kayani A, McArdle A, Vina J, et al. (2010)Effect of xanthine oxidase-generated extracellular superoxide on skeletal muscle

force generation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298: R2–8.

54. Ji LL, Gomez-Cabrera MC, Steinhafel N, Vina J (2004) Acute exercise activatesnuclear factor (NF)-kappaB signaling pathway in rat skeletal muscle. FASEB J

18: 1499–1506.55. Romagnoli M, Gomez-Cabrera MC, Perrelli MG, Biasi F, Pallardo FV, et al.

(2010) Xanthine oxidase-induced oxidative stress causes activation of NF-kappaB and inflammation in the liver of type I diabetic rats. Free Radic Biol

Med 49: 171–177.



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