INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA

DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

Oleh

RHENI HAFIDIANA

F34102016

2006

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2

Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4)

Ringkasan

Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak

dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Gula biasanya diartikan sebagai sukrosa untuk penggunaan komersial. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda, yaitu nira tebu mengandung 14 - 20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15 - 20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10 - 15% sukrosa.

Degradasi sukrosa merupakan hal yang harus dihindari pada industri gula karena mempersulit proses kristalisasi. Hal ini disebabkan oleh hidrolisis sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) atau senyawa turunan lainnya pada produk-produk gula seperti sukrosa, merupakan penyebab menurunnya kualitas produk tersebut. Inhibisi aktivitas enzim telah dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan tekanan tinggi, namun mempengaruhi kualitas produk. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH, konsentrasi enzim konsentrasi substrat, serta adanya inhibitor. Inhibitor dapat berupa bahan alami, seperti kentang, tomat dan tembakau. Akan tetapi, selain mengandung inhibitor, bahan tersebut masih mengandung bahan lain, sehingga perlu pemurnian. Kation Cu (II) dalam bentuk garam logam CuCl2 talah diteliti dapat menghambat aktivitas invertase. Terdapat garam Cu (II) lainnya, yaitu CuSO4. Aktivitas invertase dengan penambahan garam logam CuSO4 pada kondisi konsentrasi, konsentrasi substrat, pH, suhu dan lama pemanasan yang berbeda perlu diteliti, sehingga diketahui kemampuan inhibisi garam logam tersebut. Selain itu, dapat diketahui model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan hubungan perubahan pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa. Penelitian ini juga bertujuan untuk menentukan parameter kinetika laju degradasi (KM dan Vmaks) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4. Keseluruhan pengujian menggunakan metode pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan akibat hidrolisis sukrosa menggunakan DNS (dinitro salicylic acid). Pengaruh perubahan faktor pada setiap taraf ditentukan dengan menggunakan analisis sidik ragam (Anova) dan uji lanjut Duncan. Model dan parameter kinetika inhibisi yang paling sesuai ditentukan dengan menggunakan software SigmaPlot.

Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase dipengaruhi oleh perubahan konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan. Pada rasio konsentrasi invertase terhadap sukrosa 1 : 5000 dan pH larutan invertase 4.5, CuSO4 0.75-1.25 mM berperan sebagai aktivator invertase, sedangkan mulai konsentrasi 2.5 mM berperan sebagai inhibitor. Konsentrasi CuSO4 0.125 mM memberikan inhibisi tertinggi (95.1%) pada suhu 60C, pH larutan invertase 4.5, rasio invertase terhadap sukrosa 1 : 2500. Aktivitas invertase sangat rendah pada

3

pH 3 dan pH 7 ke atas serta turun signifikan hingga 20 detik pemanasan. Inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM terjadi pada lama pemanasan 0 10 detik.

Kinetika inhibisi laju degradasi sukrosa oleh CuSO4 yang dilakukan pada pH 7 dengan tiga titik suhu (40C, 50C, 60C) menghasilkan nilai KM dan Vmaks yang berbeda. Kecepatan reaksi meningkat dengan kenaikan suhu. Model kinetika inhibisi invertase oleh CuSO4 berbeda pada setiap suhu yang diujikan. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 40C adalah mixed (partial), dengan nilai KM 8.6 g/l, Vmaks 288.4 M/menit turun menjadi 64.1 M/menit, Ki 0.5817 mM, 75.1, 3.1. Model inhibisi oleh CuSO4 pada suhu 50C juga mixed (partial) dengan nilai KM 21.1 g/l, Vmaks 356.6 M/menit turun menjadi 69.02 M/menit, Ki 2.873e-9 mM, 1201.3, 232.5. Model inhibisi pada suhu 60C bersifat kompetitif (full), dengan nilai KM 3555e+6 g/l naik menjadi 4.622e+6 g/l, Vmaks 1.732e+7 M/menit, Ki 11.4 mM.

4

Inhibition on Invertase Activity in Sucrose Using Copper Sulphate (CuSO4)

Summary

Sucrose (glucose-1,2 fructose) is the most commonly used as sweetener

for human consumption. In commercial usage, the term sugar usually refers to sucrose. There are a number of sugars sources, such as sugarcane, coconut-palm juice, fan-palm juice and sugar beets which content of sucrose are different. Sugarcane contains 14-20% sucrose, coconut-palm juice contains 15-20% sucrose, while 10-15% in fan-palm juice.

Sucrose is widely used in industry for various purpose, but the degradation of sucrose is easily occured. Sucrose is converted into invert sugar, called reducing sugar or other derived compounds in many sugar products can cause decreasing quality of sugar. Enzyme inhibition is done by combining the temperature and high pressure, but its influence the quality of the product. Enzyme activity was influenced by temperature, pH value, enzyme concentration, substrate concentration, and presence of inhibitors. Inhibitors can be found natural sources, such as potato, tomato, and tobacco. Besides containing inhibitor, they still contain other ingredients, therefore purification is needed. Cu (II) cation as CuCl2 metal salt is known as element which can inhibit the activity of invertase. There are another Cu (II) as metal salt, it is CuSO4. The activity of invertase with addition of CuSO4 in different enzyme concentration, substrate concentration, pH, temperature and heat treatment should be learn, in order to recognize the inhibition capability of CuSO4. Besides that, the inhibition kinetic model can be figured out, which is needed for process engineering.

The objective of this research is to obtain the influence of substrate concentration, enzyme concentration, pH value, incubation temperature and heat treatment with present of CuSO4 concerning to sucrose degradation. Besides that, it was also to determine the inhibition kinetic parameter (KM and Vmaks) of the rate of sucrose degradation with addition of CuSO4. The whole research uses the reducing sugar measurement method, as a result of sucrose hydrolisis using DNS (dinitro salicylic acid). The influence of factors changes in each level are determined by using analysis of variance (ANOVA) and Duncan test. The most suitable model and parameter of inhibition kinetic is determined by using SigmaPlot software.

CuSO4 concentration, substrate concentration, enzyme concentration, pH value, incubation temperature and heat treatment affect inhibition by CuSO4. At the ratio of invertase to sucrose is 1 : 5000, CuSO4 0.75 - 1.25 mM can be used as an invertase activator, while as invertase inhibitor with the minimum concentration 2.5 mM. CuSO4 0.125 mM give maximum inhibition (95.1%) at 60C, pH value of invertase is 4.5, ratio of invertase to sucrose is 1 : 2500. Invertase activity is very low at pH 3 and more than pH 7. The activity was also decreases significantly until 20 second of heat treatment. Inhibition was occured by 0 10 second of heat treatment.

5

The kinetic inhibition of of sucrose degradation rate by CuSO4 0.125 mM done at pH 7 with three temperature treatment (40C, 50C, 60C) make KM and Vmaks value are vary. The reaction rate of it increases as well as the temperature. The inhibition kinetics model of invertase is different in each temperature. It is mixed (partial) when the temperature at 40C. KM 8.6 g/l, Vmaks 288.4 M/min decrease to 64.1 M/min, Ki 0.5817 mM, 75.1, 3.1. The inhibition kinetic model when the temperature at 50C was also mixed (partial). KM 21.1 g/l, Vmaks 356.6 M/menit decrease to 69.02 M/menit, Ki 2.873e-9 mM, 1201.3, 232.5, while competitive (full) at 60C with KM 3555e+6 g/l increase to 4.622e+6 g/l, Vmaks 1.732e+7 M/min, Ki 11.4 mM.

6

SURAT PERNYATAAN

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Inhibisi

Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO4)

adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen Pembimbing Akademik,

kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya.

Bogor, 31 Agustus 2006

Yang membuat pernyataan,

Rheni Hafidiana F34102016

7

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA

DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

RHENI HAFIDIANA

F34102016

2006

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

8

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN

MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO4)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

Fakultas Teknologi Pertanian

Institut Pertanian Bogor

Oleh

RHENI HAFIDIANA

F34102016

Dilahirkan pada tanggal 18 Juni 1984

di Boyolali

Tanggal lulus : 24 Agustus 2006

Menyetujui,

Bogor, September 2006

Prayoga Suryadarma, STP, MT. Pembimbing Akademik

9

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 18 Juni

1984. Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara

dari pasangan Widodo (Alm) dan Muslichah. Pada

tahun 1996, penulis menyelesaikan pendidikan sekolah dasar

di SDN 3 Boyolali. Penulis menyelesaikan pendidikan

sekolah menengah di SLTPN 1 Boyolali pada tahun 1999.

Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMUN 1 Boyolali dan lulus pada

tahun 2002.

Penulis melanjutkan pendidikan di Perguruan Tinggi Negeri, Institut

Pertanian Bogor tahun 2002 melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB)

di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian.

Selama kuliah di IPB, penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata kuliah

Laboratorium Lingkungan periode 2005/2006 dan Teknologi Minyak Atsiri dan

Kosmetika periode 2005/2006.

Penulis melaksanakan praktek lapang pada tahun 2005 dengan topik

Penerapan Aspek Pengawasan Mutu pada Proses Produksi Biskuit Bayi di PT.

Arnotts Indonesia-Bekasi, Jawa Barat. Untuk menyelesaikan tugas akhir ini,

penulis melakukan penelitian yang dituangkan dalam skripsi berjudul Inhibisi

Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat

(CuSO4).

KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah

memberikan berkat, rahmat, dan hidayah serta kemudahan sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Departemen Teknologi

Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada:

1. Prayoga Suryadarma, STP, MT selaku dosen pembimbing akademik yang

telah banyak memberikan arahan dan bimbingan , pada saat penelitian dan

dalam penyusunan skripsi ini.

2. Dr. Ir. Erliza Noor selaku dosen penguji atas masukannya untuk

penyempurnaan skripsi ini.

3. Drs. Purwoko, MSi selaku dosen penguji atas masukannya untuk

penyempurnaan skripsi ini.

4. Ibu, kakak dan saudara kembarku yang selalu memberikan dukungan,

semangat dan doa.

5. Teman sebimbingan (Rian, Annisa, Mba Fitri, dan Pak Ikhsan) atas

bantuan dan kebersamaannya.

6. Teman-teman TIN 39 dan semua pihak yang telah memberikan bantuan

kepada penulis baik selama penelitian maupun semenjak menjadi

mahasiswa TIN yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari

sempurna. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang dapat

membangun dan bermanfaat demi perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini

memberikan manfaat bagi pembaca.

Bogor, Agustus 2006

Penulis

xi

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR.................................................................................... x

DAFTAR ISI................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvii

I. PENDAHULUAN ................................................................................ 1 A. LATAR BELAKANG ..................................................................... 1

B. TUJUAN.......................................................................................... 2

II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 3 A. SUKROSA....................................................................................... 3

B. INVERTASE ................................................................................... 3

C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM..................................... 4

D. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA .............................................................. 5

1. Pengaruh Suhu ............................................................................ 5 2. Pengaruh pH................................................................................ 5 3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim ................................ 6 4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan ................................. 7 5. Pengaruh Inhibitor ..................................................................... 7

E. KINETIKA ENZIMATIK ............................................................... 10

III. METODOLOGI ................................................................................. 15 A. ALAT............................................................................................... 15

B. BAHAN ........................................................................................... 15

C. METODE PENELITIAN ................................................................ 15

1. Tahapan Penelitian ...................................................................... 15 2. Prosedur Percobaan ..................................................................... 17

xii

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................ 21 A. Aktivitas Invertase............................................................................ 21

B. Pengaruh Konsentrasi CuSO4........................................................... 22

C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa ............................................................................ 24

1. Pengaruh Konsentrasi Substrat ................................................... 24 2. Pengaruh Konsentrasi Enzim...................................................... 27 3. Pengaruh pH................................................................................ 30 4. Pengaruh Suhu ............................................................................ 33 5. Pengaruh Lama Pemanasan ....................................................... 36

D. Kinetika Inhibisi Reaksi Invertase .................................................. 38

V. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................. 45 A. KESIMPULAN................................................................................ 45

B. SARAN............................................................................................ 45

DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 46

LAMPIRAN.................................................................................................... 49

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Pengaruh jenis logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0.005 M terhadap aktivitas invertase ............................................ 8

Tabel 2. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 40C................... 39

Tabel 3. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 50C................... 41

Tabel 4. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 60C................... 43

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase ..................................... 3

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) .................................................. 5 Gambar 3. Pengaruh nilai pH terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) .................................................. 6 Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M2+) dan grup sulfhidril .................... 9

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988)....................................................... 10

Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk ............................................................. 11

Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif ................................................... 12

Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif ........................ 12 Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif. ............................................ 13 Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif. ................. 13 Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif. .............................................. 13 Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif. ................... 14 Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian. ................................................. 16 Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase

5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = 3.2267 x, r2 = 0.9721. ........................................................... 21 Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit ........................................................................................ 22 Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5mg/l, lama reaksi 5 menit ...................... 25

xv

Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit ........................................ 26

Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit ............... 28 Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit................................... 29 Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai pH terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit .................................................................... 30 Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada nilai pH yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l,

konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit ...................... 33 Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertasi 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit .............................................................................. 34 Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada suhu yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit....................... 36 Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap konsentrasi gula

pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit .......... 37 Gambar 25. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 pada lama pemanasan yang berbeda dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit .......... 38 Gambar 26. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 40C. .......................... 39 Gambar 27. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 40C................................ 40 Gambar 28. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 50C. .......................... 41 Gambar 29. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 50C................................ 42 Gambar 30. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 60C. .......................... 43

xvi

Gambar 31. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 60C................................ 43

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Prosedur penelitian................................................................... 49

Lampiran 2. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan penentuan konsentrasi CuSO4.................................................. 50 Lampiran 3. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi substrat .................................................. 51 Lampiran 4. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi substrat yang berbeda .......... 54 Lampiran 5. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi enzim..................................................... 55 Lampiran 6. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi enzim yang berbeda ............. 58 Lampiran 7. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh pH............................................................................. 59 Lampiran 8. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada pH yang berbeda ..................................... 62 Lampiran 9. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh suhu .......................................................................... 64 Lampiran 10. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada suhu yang berbeda................................... 67 Lampiran 11. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh lama pemanasan ....................................................... 69 Lampiran 12. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada lama pemanasan yang berbeda................ 71 Lampiran 13. Data kinetika inhibisi suhu 40C ............................................. 73

Lampiran 14. Data kinetika inhibisi suhu 50C ............................................. 74

Lampiran 15. Data kinetika inhibisi suhu 60C ............................................. 75

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Sukrosa, dengan nama sistematisnya -D-fructofuranosyl--D-

glucopyranoside termasuk kelompok disakarida nonpereduksi. Senyawa

organik ini merupakan sejenis karbohidrat yang manis, putih dan termasuk

bahan dasar makanan. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti

nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam

masing-masing nira tersebut berbeda. Nira tebu mengandung 14 - 20%

sukrosa, nira kelapa mengandung 15 - 20% sukrosa dan nira siwalan

mengandung 10 - 15% sukrosa.

Sukrosa banyak digunakan untuk berbagai keperluan dalam industri,

namun kerusakan sukrosa mudah terjadi. Proses degradasi sukrosa menjadi

gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) sering terjadi

karena lamanya waktu menunggu sebelum nira tebu diproses di industri gula.

Selain degradasi sukrosa, senyawa-senyawa hasil degradasi sukrosa tersebut

dapat mengganggu proses kristalisasi pada industri gula (sukrosa), sehingga

dapat menurunkan rendemen gula sukrosa. Astawan (2001) menyatakan

bahwa pembentukan gula invert juga tidak diharapkan pada pengolahan gula

semut. Jika kadar gula pereduksinya lebih dari 3 persen maka gula yang

dihasilkan akan menjadi lembek dan sangat higroskopis.

Kerusakan gula atau sukrosa dapat disebabkan oleh aktivitas enzim,

mikroorganisme ataupun perlakuan proses (misalnya asam, suhu tinggi, dan

lainnya). Invertase, merupakan salah satu enzim yang dihasilkan pada nira

tebu atau hasil aktivitas ekstraseluler mikroorganisme yang turut memicu

kerusakan sukrosa. Aktivitas invertase pada ekstrak nira tebu adalah

417.6 unit, sedangkan aktivitas spesifiknya 2.86 unit/mg (Rahman, 2004).

Upaya penghambatan perlu dilakukan untuk mengurangi kerusakan sukrosa,

salah satunya dengan menurunkan aktivitas invertase yang mendegradasi

sukrosa.

Upaya penghambatan laju kerusakan sukrosa melalui penurunan

aktivitas invertase telah dilakukan dengan perlakuan suhu, tekanan serta

2

penambahan inhibitor. Cavaille dan Didier (1996) mengkombinasikan

perlakuan tekanan tinggi dengan suhu untuk menginaktivasi invertase,

sedangkan Causette et al. (1998) melakukan inaktivasi enzim dengan

menggunakan gelembung gas inert. Akan tetapi, perlakuan suhu dan tekanan

yang tinggi akan mempengaruhi kualitas produk (sukrosa) akibat terjadinya

reaksi lain yang tidak diinginkan (lateral reaction). Inhibitor invertase juga

ditemukan di dalam umbi kentang (Ewing et al., 1977 dan Pressey, 1966),

tembakau, dan tomat (Pressey ,1994 dan Weil et al., 1994 dalam Greiner et

al., 1998). Inhibitor dari bahan alami tersebut juga memiliki kelemahan, yaitu

masih terdapat bahan lain selain inhibitor, bahkan mengandung invertase.

Jenis inhibitor lain yang dapat menghambat aktivitas invertase adalah

beberapa jenis garam logam, terutama HgCl2, FeCl2, CuCl2, dan CdCl2, yang

dapat menurunkan aktivitas hingga 45-99% (Rahman et al., 2004).

Terdapat garam logam lain, seperti CuSO4 yang juga tersusun dari

kation logam bivalen. Penggunaan garam logam ini memerlukan kondisi

tertentu agar dihasilkan kinerja inhibisi invertase yang optimal. Perubahan

faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, seperti konsentrasi substrat,

konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan perlu dilakukan pada saat

garam logam CuSO4 ditambahkan. Perlakuan tersebut diharapkan dapat

menghasilkan profil inhibisi aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa

serta diperoleh model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa

proses.

B. TUJUAN

Adapun tujuan penelitian ini antara lain untuk menentukan:

1. Pengaruh perubahan pH, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu

inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4

terhadap degradasi sukrosa

2. Parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya

penambahan CuSO4

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. SUKROSA

Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak

dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Salah satu sumber sukrosa terpenting

adalah tebu karena mengandung sukrosa hingga 20% (Glazer dan Nikaido,

1995 dalam Filho 1999). Sukrosa, dikenal sebagai gula meja (table sugar),

merupakan disakarida yang terbentuk dari satu molekul -D-glukosa dan satu

molekul -D-fruktosa yang dihubungkan oleh ikatan -1,2-glikosidik

(Rahman et al., 2004).

Degradasi sukrosa dapat terjadi melalui hidrolisis asam atau secara

enzimatis oleh invertase (Monsan et al., 1984 dalam Filho et al., 1999).

Degradasi secara enzimatis terjadi ketika ikatan -1,2-glikosidik dihidrolisis

oleh enzim invertase (D-fructofuranosidase, EC 3.2.1.26) atau sucrose

synthase (UDP glucose: D-fructose 2-D-glucosyltransferase, EC 2.4.1.13).

Hidrolisis sukrosa menghasilkan campuran glukosa dan fruktosa yang disebut

dengan gula invert (invert sugar) (Rahman et al., 2004). Reaksi hidrolisis

sukrosa oleh invertase (juga disebut sebagai sucrase atau saccharose) dapat

dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase

B. INVERTASE

Sistem tatanama untuk invertase adalah beta-fructofuranosidase (EC

3.2.1.26), menunjukkan bahwa reaksi dikatalisasi oleh enzim ini adalah reaksi

H

4

hidrolisis (Wang, 2002). Invertase terdapat dalam jumlah yang beragam pada

tanaman maupun hewan dengan varietas yang luas. Sumber utama invertase

berasal dari ragi (yeast) dan fungi lainnya. Reed (1966) dalam Pancoast dan

Junk (1980) menyatakan bahwa ragi Saccharomyces cerevisiae dan S.

carlsbergensis merupakan sumber utama penghasil invertase untuk aplikasi

industri. Aspergillus orizae dan A. Niger adalah fungi yang juga merupakan

sumber invertase. Tanaman penghasil enzim ini antara lain tebu (Rahman et

al., 2004), buah mangga (Rahman et al., 2001), buah anggur (Nakanishi et al.,

1990), buah tomat (Konno et al., 1993 dalam Rahman et al., 2001), padi (Isla

et al., 1995) dan umbi kentang (Pressey et al., 1966).

Berbeda dengan sebagian besar enzim, invertase memiliki aktivitas

yang relatif tinggi pada kisaran pH yang luas antara 3.5 sampai 5.5, dengan

aktivitas optimum pada pH 4.5. Aktivitas maksimum dicapai pada suhu 55C.

Nilai Michaelis-Menten untuk jenis enzim yang berbeda bervariasi, tetapi

kebanyakan enzim memiliki nilai KM antara 2 mM 5 mM (Wang, 2002).

C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM

Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat

atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit

aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mikromol (mol; 10-6 mol) substrat

yang bereaksi atau produk yang dikatalisis setiap menit (Rodwell, 1981).

Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, pH, dan

suhu. Setiap enzim berfungsi optimal pada suhu, pH dan konsentrasi substrat

tertentu. Konsentrasi substrat yang rendah menyebabkan daerah aktif pada

enzim tidak semuanya terikat pada substrat. Terdapat suhu optimal dimana

reaksi berlangsung sangat cepat. Ketika suhu di atas suhu optimal, kecepatan

reaksi menurun tajam karena enzim sebagai protein akan terdenaturasi,

sedangkan pada suhu terlalu rendah, beberapa enzim tidak dapat bekerja.

Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh pH karena sifat ionik gugus karboksil

dan gugus amino mudah dipengaruhi pH (Pelczar dan Chan, 1986).

Enzim merupakan salah satu jenis protein globular. Stabilitas dan

aktivitas enzim ditentukan oleh konformasi tiga dimensinya yang dipengaruhi

5

oleh struktur tertier protein. Terdapat empat jenis interaksi yang menstabilkan

struktur tersebut pada suhu, pH dan konsentrasi ion normal, antara lain ikatan

hidrogen, gaya tarik ionik, interaksi hidrofobik dan jembatan kovalen.

(Lehninger, 1988).

D. FAKTOR FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA

Laju degradasi sukrosa dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain

suhu, pH, lama pemanasan, konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim. Laju

degradasi sukrosa dapat diperlambat atau bahkan dihambat dengan

penambahan inhibitor.

1. Pengaruh Suhu

Peningkatan suhu pada reaksi enzim memiliki dua pengaruh yang

tidak seimbang. Pengaruh tersebut adalah peningkatan laju reaksi dan di

sisi lain dapat menyebabkan inaktivasi enzim (Stauffer, 1989). Aktivitas

enzim invertase meningkat secara perlahan dengan kenaikan suhu. Suhu

maksimum aktivitas invertase adalah 60C, peningkatan suhu lebih lanjut

menyebabkan penurunan laju degradasi sukrosa (Rahman et al., 2004).

Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase di dalam tebu dapat dilihat

pada Gambar 2.

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

suhu (oC)

Akt

ivita

s re

latif

(%)

Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu

(Rahman et al., 2004)

2. Pengaruh pH

Invertase memberikan aktivitas maksimum pada pH 7.2. Aktivitas

turun perlahan pada pH asam, tetapi turun secara cepat pada pH basa.

6

Observasi ini menunjukkan bahwa enzim relatif stabil pada kisaran pH

asam sampai pH netral (Rahman et al., 2004). Nilai pH optimum invertase

dari benih padi adalah 7.0 (Chungliang et al. dalam Rahman et al., 2004).

Gambar 3 menunjukkan pengaruh pH terhadap aktivitas invertase pada

tebu (Rahman et al., 2004).

Gambar 3. Pengaruh nilai pH terhadap aktivitas invertase dari nira tebu

(Rahman et al., 2004)

Stauffer (1989) menyatakan bahwa perubahan pada laju reaksi

enzim oleh pH mungkin dapat disebabkan oleh tiga faktor, yakni:

a. Protonasi sisi aktif rantai asam amino pada kompleks enzim-

substrat (ES) berubah, menghasilkan perubahan kemampuan ES

dalam menghasilkan produk.

b. Perubahan muatan ion pada molekul substrat atau sisi aktif enzim

yang dapat mengubah kecenderungan dari dua molekul tersebut

untuk membentuk kompleks ES.

c. Perubahan pH dari netral dapat melemahkan stabilitas protein,

mempercepat denaturasi enzim yang bersifat irreversible.

3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim

Invertase dapat mengkatalisis sukrosa pada konsentrasi di atas

59%wt/vol. Peningkatan konsentrasi sukrosa lebih lanjut sampai

80%wt/vol menurunkan aktivitas enzim secara signifikan, mungkin

disebabkan oleh konsentrasi air rendah, inhibisi oleh substrat atau agregasi

substrat (Somiari dan Bielecki, 1995 dalam Filho et al., 1999).

Brown pada tahun 1902 melakukan penelitian tentang invertase,

menyatakan bahwa jika konsentrasi sukrosa lebih tinggi daripada

7

konsentrasi enzim, kecepatan reaksi menjadi tidak tergantung pada

konsentrasi sukrosa (Pancoast, 1980). Aktivitas enzimatik akan menurun

pada konsentrasi substrat yang tinggi dan cenderung membentuk asimtot.

Jenis penghambatan ini akan membentuk kompleks (dead end complex),

satu sisi molekul substrat terikat pada enzim dan molekul substrat lain

terikat pada sisi lain (sekunder) enzim (Suryani dan Mangunwidjaya,

2002).

4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan

Inaktivasi enzim dan mikroorganisme dapat dilakukan dengan

perlakuan suhu yang tinggi. Akan tetapi perlakuan suhu yang tinggi juga

dapat menyebabkan perubahan produk, sehingga kualitasnya menurun.

Metode lain yang dapat digunakan untuk menurunkan aktivitas enzim dan

mikroorganisme tanpa merusak produk yang diinginkan adalah dengan

cara pemberian gelembung gas inert. Pemberian gelembung gas inert

nitrogen mampu menurunkan aktivitas enzim (Causette et al., 1998).

5. Pengaruh Inhibitor

Banyak bahan yang dapat mengubah aktivitas suatu enzim dengan

menggabungkannya dalam suatu jalur yang mempengaruhi ikatan substrat.

Bahan-bahan yang mereduksi aktivitas suatu enzim dengan cara ini

dikenal sebagai inhibitor. Inhibitor terbagi menjadi dua jenis, yakni

inhibitor reversible yang membentuk kompleks dinamik dengan enzim dan

inhibitor irreversible yang dikenal dengan racun pengkatalis (contohnya

beberapa logam berat, seperti merkuri, Hg2+). Inhibitor mengikat molekul

enzim dan menurunkan aktivitasnya (Flickinger dan Drew, 1999). Stauffer

(1989) juga membagi inhibitor menjadi 3 golongan berdasarkan

affinitasnya terhadap molekul enzim sebagai berikut:

a. Inhibitor beraffinitas rendah

Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 1 M

hingga 106 M. Inhibitor ini sering menyerupai substrat dengan

kereaktifan yang biasa.

8

b. Inhibitor beraffinitas tinggi

Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara

106 M hingga 1012 M. Inhibitor ini menjadi transisi dari kompleks

enzim-substrat menjadi kompleks enzim-produk atau sebagai molekul

yang mengikat kuat pada sisi aktif enzim.

c. Inhibitor irreversible

Molekul inhibitor ini membentuk ikatan kovalen dengan

molekul pada sisi aktif enzim. Ikatan yang dibentuk bersifat stabil.

Reaksi lebih jauh lagi dari enzim dengan inhibitor ini (inhibitor

berlebih) menyebabkan enzim menjadi tidak aktif.

Penambahan garam logam dan senyawa kimia lainnya dapat

menyebabkan peningkatan atau penurunan aktivitas enzim. Peningkatan

dan penurunan aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh jenis garam logam

ataupun senyawa kimia yang ditambahkan. Pengaruh penambahan

beberapa jenis garam logam dan senyawa kimia lainnya terhadap aktivitas

enzim dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Pengaruh jenis garam logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0.005 M terhadap aktivitas invertase

No. Garam/bahan kimia Aktivitas relatif (%) 1 Tanpa bahan tambahan 100.00 2 MgCl2 115.00 3 KCl 110.82 4 NaCl 120.00 5 MnCl2 120.00 6 CaCl2 114.24 7 HgCl2 1.02 8 CuCl2 30.00 9 FeCl2 20.25 10 ZnCl2 68.27 11 CdCl2 55.26 12 AgNO3 80.00 13 AlCl3 78.00 14 EDTA 52.74 15 Glukosa 76.00 16 Asam asetat 45.30

Sumber: Rahman et al. (2004)

9

Hampir semua ion logam selalu berinteraksi dengan kompleks

protein secara cepat. Interaksi kompleks antara ion logam dengan protein

ada dua bentuk:

1. Metaloenzim

Ikatan ini merupakan subkelas dari metaloprotein. Protein

berikatan kuat dengan ion logam sehingga dianggap sebagai ikatan

yang sangat stabil dan lama. Ion logam menjadi bagian dari struktur

protein dan hanya dapat dilepas dalam keadaan tertentu.

2. Metal protein

Sistem ikatan ini memungkinkan ion logam mudah saling

bertukar dengan protein lain (reversible). Laju pertukaran ion logam

dengan kondisi larutan lingkungannya sangat mudah. Ion logam sulit

dalam menempati sisi protein yang tepat karena ion logam ini bersifat

sangat labil.

Kekuatan ikatan ion logam dengan protein tergantung pada muatan kation

yang mengikatnya. Semakin tinggi muatan kation dari logam maka

semakin kuat ikatannya dengan protein, sehingga ikatan tersebut lebih

stabil dan konstan (Darmono, 1995).

Hochster dan Quastel (1963) menyatakan, ikatan ion logam bivalen

dengan grup sulfhidril yang terdapat pada enzim kemungkinan terjadi

sebagai berikut:

E dll

S

E-SH E-S- + H+ E-S -M

+ M 2+

E-SH E-SH E-S- + H+

Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M2+) dan grup sulfhidril

Keterangan:

E-SH = enzim yang memiliki grup sulfhidril

H+ = ion H+ yang terlepas

M2+ = ion logam bivalen

10

E. KINETIKA ENZIMATIK

Enzim merupakan katalisator sejati. Molekul ini dapat meningkatkan

kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa adanya enzim akan berlangsung

lambat. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat dipengaruhi oleh

berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila

konsentrasi enzim dijaga konstan (Lehninger, 1988).

Setiap enzim memiliki sifat yang khas, dinyatakan dalam suatu tetapan

yaitu KM (tetapan Michaelis-Menten). Hampir semua enzim memiliki kurva

kecepatan reaksi dengan bentuk umum yang hampir sama yaitu hiperbola.

Oleh sebab itu, Michaelis-Menten mendefinisikan suatu tetapan untuk

menyatakan hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi

enzimatik. KM didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat

enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Persamaan Michaelis-

Menten adalah:

Vmaks [S] V0 =

KM + [S]

Keterangan:

V0 = kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S]

Vmaks = kecepatan maksimum

KM = tetapan Michaelis-Menten enzim pada substrat tertentu

[S] = konsentrasi substrat

Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988)

Nilai KM dan Vmaks sulit untuk ditentukan secara tepat dari grafik

sederhana yang ditunjukkan pada Gambar 5, karena Vmaks hanya diduga dan

11

tidak dapat diketahui nilai yang sebenarnya. Nilai KM yang lebih tepat dapat

diperoleh dengan memetakan data yang sama dengan cara yang berbeda,

yakni pemetaan kebalikan-ganda, didapat dari transformasi aljabar persamaan

Michaelis-Menten. Hasil transformasi persamaan Michaelis-Menten dikenal

dengan persamaan Lineweaver-Burk.

1 KM 1 1 = +

Vo Vmaks [S] Vmaks

Selain dapat menentukan Vmaks secara lebih tepat, persamaan ini bermanfaat

dalam menganalisa penghambatan enzim (Lehninger, 1988). Persamaan

Lineaweaver-Burk menghasilkan kurva yang ditunjukkan pada Gambar 6.

Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk

Kinetika inhibisi enzim menyangkut penentuan fungsi laju reaksi

terhadap konsentrasi substrat dengan inhibitor pada berbagai konsentrasi.

Kurva Lineweaver-Burk memungkinkan untuk menentukan jenis inhibisi

yang bersifat reversible, antara lain sebagai berikut.

1. Inhibisi Kompetitif

Inhibitor pada model inhibisi ini bersaing dengan substrat untuk

memasuki sisi aktif enzim. Struktur kimia inhibitor umumnya menyerupai

substrat. Oleh sebab itu, inhibitor tersebut dapat berikatan secara

reversible dengan enzim (Rodwell, 2000). Mekanisme inhibisi kompetitif

dapat dilihat pada Gambar 7 .

12

Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif

Penyajian garis lurus pada kurva Lineweaver-Burk memotong

sumbu ordinat pada titik yang sama. Vmaks tidak dipengaruhi oleh inhibitor

(Suryani dan Mangunwidjaja, 2002). Kurva Lineweaver-Burk untuk

model inhibisi kompetitif ditunjukkan pada Gambar 8.

Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif

2. Inhibisi Nonkompetitif

Model inhibisi nonkompetitif tidak menunjukkan adanya

persaingan antara inhibitor dengan substrat. Struktur inhibitor biasanya

tidak atau sedikit menyerupai struktur substrat. Inhibitor nonkompetitif

menurunkan kecepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian

sejumlah enzim (Vmaks yang lebih rendah), tetapi biasanya tidak

mempengaruhi nilai KM, ditunjukkan oleh kurva Lineweaver-Burk pada

Gambar 10. Mekanisme reaksi inhibisi nonkompetitif dapat dilihat pada

Gambar 9.

EI (inaktif)

ES (aktif) E + P

E

I

S

Ditambah inhibitor

Tanpa inhibitor 1/V1

-1/KM -1/KM 1/Vmaks

1/[S] 0

13

Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif

Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif

3. Inhibisi Unkompetitif

Inhibisi ini terjadi jika kompleks EI hilang, tetapi kompleks EIS

terbentuk. Inhibitor mengikat langsung pada kompleks enzim-substrat

(ES), bukan enzim bebas (Flickinger dan Drew, 1999). Mekanisme

inhibisi unkompetitif ditunjukkan pada Gambar 11.

Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif

ES E EIS S I

E + P

EI

ES

E

I

S

E + P

EIS

S

Ditambah inhibitor

Tanpa inhibitor

1/Vmaks

1/[S]

1/V1

-1/KM

-1/Vmaks

0

14

Inhibitor yang bersifat unkompetitif akan mempengaruhi fungsi

enzim, tetapi tidak terhadap ikatannya dengan substrat. Plot Lineweaver-

Burk untuk inhibisi unkompetitif adalah linier dengan kemiringan atau

slope KM/Vmaks seperti pada reaksi tanpa inhibitor, dapat dilihat pada

Gambar 12 (Simanjutak dan Silalahi, 2003).

Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif

1/[S]

1/V1

-1/KM

-1/Vmaks

0

Ditambah inhibitor

Tanpa inhibitor

1/Vmaks

III. METODOLOGI

A. ALAT

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan

gelas (pipet tetes, corong, tabung reaksi); peralatan ukur (pipet mikro, pipet

volumetri, labu takar, termometer, spektrofotometer, stopwatch dan

timbangan); serta peralatan pendukung (water bath dan vortex).

B. BAHAN

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sukrosa,

invertase (Sigma-Aldrich 19253: pH 4.5, 55C, 355 units/mg solid), dan

larutan CuSO4. Sedangkan bahan yang digunakan untuk analisa adalah NaOH

0.1 N, HCl 0.1 N, indikator PP, glukosa, fruktosa, buffer pH 3-11, pereaksi

DNS (dinitro salicylic acid) dan aquades.

C. METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini dibagi menjadi tahapan penelitian dan prosedur

percobaan. Tahapan penelitian menjelaskan tentang langkah-langkah yang

harus dilalui untuk mencapai tujuan penelitian, sedangkan prosedur percobaan

merupakan urutan kegiatan dan tatacara yang secara teknis dikerjakan dalam

setiap tahapan penelitian.

1. Tahapan Penelitian

Penelitian dilakukan dalam empat tahap, yaitu (1) Penentuan

aktivitas invertase, (2) Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4,

(3) Penentuan hubungan perubahan faktor konsentrasi substrat, konsentrasi

enzim, pH, suhu dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO4

terhadap degradasi sukrosa, (4) Penentuan parameter kinetika (KM dan

Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4.

Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.

16

Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian

a. Penentuan aktivitas invertase Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas

invertase, yaitu banyaknya invertase yang dapat membebaskan

1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada

kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan adalah kondisi optimum

invertase, yaitu pada suhu 55C, di dalam larutan buffer asetat pH 4.5.

Slope yang diperoleh dari gula pereduksi yang dihasilkan pada setiap

konsentrasi yang diujikan merupakan besarnya aktivitas enzim.

b. Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4

CuSO4 dengan konsentrasi yang berbeda diujikan pada reaksi

invertase dengan sukrosa. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari

kontrol (perlakuan invertase tanpa CuSO4) menunjukkan adanya

inhibisi, sebaliknya jika lebih tinggi dari kontrol menunjukkan aktivasi.

Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis sidik ragam

(ANOVA) dan uji lanjut Duncan.

Mulai

Penentuan aktivitas invertase

Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4

Penentuan pengaruh perubahan faktor dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa

Penentuan parameter kinetika (KM dan Vmaks) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4

Selesai

17

c. Penentuan pengaruh hubungan faktor dengan adanya penambahan CuSO4 terhadap degradasi sukrosa

Uji karakterisasi invertase yang dilakukan antara lain pengaruh

konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan

dengan ditambahkan CuSO4. Pengaruh yang diidentifikasi adalah

adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap

taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut

Duncan. Inhibisi invertase diukur berdasarkan perbandingan dengan

perlakuan tanpa CuSO4, dinyatakan dalam bentuk persen.

d. Penentuan parameter kinetika laju degradasi (KM dan Vmaks) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO4

Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga suhu yang

berbeda dan pH tertentu yang optimum bagi inhibisi invertase. Model

kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai

parameter kinetika (KM dan Vmaks) yang diperoleh dari plot Lineweaver-

Burk. Nilai KM diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu x,

sedangkan nilai Vmaks diperoleh dari perpotongan garis linier dengan

sumbu y.

2. Prosedur Percobaan Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah

sebagai berikut.

a. Penentuan aktivitas invertase Larutan invertase 0.01 g/l dan larutan sukrosa 50 g/l disiapkan

pada tabung reaksi yang terpisah. Masing-masing tabung reaksi

kemudian diinkubasi di dalam water bath suhu 55C sehingga suhu

tersebut dicapai oleh larutan di dalam tabung reaksi. Selanjutnya

sukrosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi invertase dan mulai

diukur waktu reaksi (t = 0). Reaksi dihentikan pada masing-masing

waktu yang diujikan, yaitu 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300

(detik), dengan memasukkan 2 ml pereaksi DNS. Kemudian tabung

tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95C. Setelah

18

10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

b. Penentuan konsentrasi inhibitor Larutan CuSO4 dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 mM-

3.75 mM. Masing-masing larutan CuSO4 dalam berbagai konsentrasi

dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan

sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dan divortex. Selanjutnya ditambahkan

1 ml invertase 0.01 g/l pada masing-masing tabung reaksi (t = 0). Pada

saat t = 5 menit, reaksi dihentikan dengan perekasi DNS. Prosedur

untuk menghentikan reaksi mengikuti prosedur sebelumnya pada

penentuan aktivitas.

c. Penentuan pengaruh perubahan faktor Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan dengan

maupun tanpa adanya penambahan inhibitor. Prosedur yang dilakukan

pada perlakuan tanpa inhibitor sama halnya dengan pengujian pada

karakterisasi invertase dengan inhibitor, hanya tidak ditambahkan

larutan CuSO4. Total volume larutan dalam tiap tabung reaksi tetap

sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah adalah aquades dan

buffer.

1. Pengaruh konsentrasi enzim

Larutan invertase 0.01 g/l disiapkan pada berbagai

konsentrasi sebanyak 0.0 - 0.83 ml dan ditambahkan larutan buffer

pH 7 hingga volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan

CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung

reaksi. Selanjutnya larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 1 ml

dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung

waktunya (t = 0 menit). Pada waktu t = 5 menit, dimasukkan 2 ml

pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi. Kemudian tabung

tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95C selama

10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan

didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang

540 nm.

19

2. Pengaruh konsentrasi substrat

Larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dimasukkan pada

masing-masing tabung reaksi yang berisi larutan sukrosa 50 g/l

dalam konsentrasi yang berbeda. Kemudian aquades ditambahkan

hingga volume campuran mencapai 2.0 ml. Larutan invertase

0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke masing-masing tabung

reaksi (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti

prosedur sebelumnya.

3. Pengaruh pH

Invertase 0.01g/l sebanyak 1.0 ml dilarutkan dengan

menggunakan buffer pH yang bervariasi (pH 3 - 11) pada tabung

reaksi. Selanjutnya masing-masing tabung reaksi ditambahkan

larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan 0.9 ml larutan sukrosa

50 g/l (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti

prosedur sebelumnya.

4. Pengaruh suhu

Penangas air mulai suhu 0 - 90oC disiapkan dengan interval

suhu 10oC. Pada setiap kelipatan suhu 10oC tersebut, diuji aktivitas

invertase. Larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml, 0.4 ml air dan

larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam setiap

tabung untuk setiap kelipatan suhu 10oC. Tabung reaksi

selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air pada rentang suhu

tersebut dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan

invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml ke dalam masing-masing tabung

reaksi (t = 0 menit) pada suhu inkubasi. Pengukuran reaksi

hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.

5. Pengaruh lama pemanasan

Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke

dalam masing-masing tabung reaksi dan dipanaskan dengan waktu

yang bervariasi dari 0 - 5 (menit). Setelah waktu yang diperlukan

dicapai, tabung reaksi dikeluarkan dari water bath dan didinginkan.

20

Setelah itu larutan CuSO4 2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan larutan

sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalamnya (t =

0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur

sebelumnya.

d. Penentuan parameter kinetika

Kondisi inhibisi invertase oleh CuSO4 yang optimum dipilih

(suhu dan pH) yang kemudian pada selang konsentrasi substrat

tertentu diuji aktivitasnya dalam menghidrolisis sukrosa.. Hasil yang

diperoleh kemudian diplotkan pada kurva kinetika (Lineweaver-Burk),

dan dihitung parameter kinetikanya (KM dan Vmaks) serta dibandingkan

antara perlakuan tanpa CuSO4 dan dengan penambahan CuSO4. Nilai

KM dan Vmaks dapat diperoleh dari persamaan linier plot kurva

Lineweaver-Burk. Slope yang diperoleh merupakan KM/Vmaks,

sedangkan intersep menunjukkan 1/Vmaks. Bentuk kurva Lineweaver-

Burk yang diperoleh menunjukkan model kinetika ihibisi. Penentuan

model kinetika menggunakan alat bantu program SigmaPlot 2004 for

Windows Version 9.01. Program ini menentukan model kinetika

inhibisi yang paling tepat berdasarkan nilai r2 tertinggi.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Kemampuan hidrolisis sukrosa oleh invertase dilakukan dengan mengukur

aktivitas enzim tersebut, sedangkan kemampuan inhibisi garam logam CuSO4 dilihat pada setiap perubahan faktor yang berpengaruh (konsentrasi substrat,

konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan) terhadap aktivitas enzim serta

perubahan parameter kinetika (KM dan Vmaks) inhibisi degradasi sukrosa.

A. Aktivitas Invertase

Penentuan aktivitas invertase penting dilakukan untuk mengetahui

seberapa besar perubahan mikromol sukrosa menjadi gula pereduksi setiap

menit reaksi. Slope yang diperoleh dari persamaan garis linier adalah 3.2267,

yang berarti bahwa invertase mampu menghidrolisis sukrosa 3.2267 M

menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu detik atau perubahan 0.3872 mol

sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu menit. Aktivitas invertase

digambarkan dalam bentuk kurva pada Gambar 14.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 50 100 150 200 250 300 350

lama reaksi (detik)

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (uM

)

Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi

yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = 3.2267 x, r2 = 0.9721

22

B. Pengaruh Konsentrasi CuSO4

Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO4 sebagai inhibitor dilakukan

berdasarkan uji daya inhibisi CuSO4 terhadap aktivitas invertase. Adanya

inhibisi invertase ditunjukkan dengan menurunnya gula pereduksi yang

dihasilkan dari hidrolisis sukrosa oleh invertase. Analisis sidik ragam

menunjukkan bahwa konsentrasi yang diujikan memberikan pengaruh yang

nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada

Lampiran 2. Konsentrasi gula pereduksi tertinggi diperoleh dari penambahan

larutan CuSO4 1.25 mM sebesar 2064.5 M, sedangkan konsentrasi gula

pereduksi terkecil ditunjukkan oleh penambahan larutan CuSO4 3.75 mM

sebesar 1052 M. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap aktivitas

invertase dapat dilihat pada Gambar 15.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 0.75 1 1.25 1.5 1.875 2.25 2.5 3.75

konsentrasi CuSO4 (mM)

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (uM

)

Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO4 terhadap konsentrasi gula

pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

Hasil uji daya inhibisi menunjukkan bahwa tidak semua konsentrasi

CuSO4 yang diujikan menunjukkan adanya penghambatan aktivitas invertase.

Gula pereduksi meningkat signifikan dengan penambahan larutan CuSO4

0.75 mM. Hal ini menunjukkan bahwa CuSO4 pada konsentrasi yang rendah

tidak memberikan pengaruh inhibisi terhadap aktivitas invertase. CuSO4

mempunyai peranan sebagai aktivator invertase pada konsentrasi yang relatif

23

kecil. Perubahan muatan pada enzim akibat penambahan CuSO4 menyebabkan

enzim mudah dalam mengikat substrat. Hal ini sesuai dengan teori bahwa

logam yang ditambahkan dalam bentuk garam organik memberikan kestabilan

enzim dengan cara menetralkan kelebihan muatan elektrostatik yang

melindungi molekul enzim sehingga konformasi enzim dapat dipertahankan

(Monsan dan Combess, 1984). Kation seperti Cu (II) kemungkinan terlibat

langsung dalam proses katalisis enzim, yaitu dalam pengikatan substrat ke sisi

aktif enzim, dalam menjaga konformasi enzim dan kestabilan substrat

(Whitaker, 1996).

Berdasarkan Gambar 15, besarnya penghambatan setelah aktivitas

invertase mencapai maksimum meningkat sedikit demi sedikit hingga

akhirnya mengalami inhibisi pada konsentrasi CuSO4 2.5 mM. Kemampuan

aktivasi enzim menurun dengan semakin tingginya konsentrasi CuSO4.

Besarnya inhibisi ini berbeda nyata dengan kontrol berdasarkan uji lanjut

Duncan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Gula pereduksi yang dihasilkan pada

konsentrasi CuSO4 2.5 mM adalah 1503.25 M, sedangkan invertase tanpa

CuSO4 (kontrol) menghasilkan gula pereduksi 1669.5 M, sehingga inhibisi

yang diberikan sebesar 9.96 %.

Inhibisi terhadap aktivitas invertase disebabkan oleh penghambatan

substrat untuk memasuki daerah katalitik enzim dimana kation logam Cu (II)

terikat pada sisi aktif enzim. Inhibisi dapat terjadi pada sisi aktif enzim

maupun sisi sekunder enzim. Jika inhibitor terikat pada sisi aktif enzim,

substrat tidak dapat membentuk kompleks dengan enzim, sehingga produk

tidak akan terbentuk. Inhibisi juga dapat terjadi selain pada sisi aktif enzim,

yaitu pada sisi sekunder enzim. Pengikatan inhibitor pada sisi sekunder enzim

menyebabkan perubahan konformasi enzim, sehingga affinitas enzim pada

substrat berkurang. Inhibisi pada fungsi katalitik enzim dapat terjadi pada

residu asam amino, yang dapat terletak pada sisi aktif enzim. Hal ini sesuai

dengan teori bahwa grup sulfhidril terdapat pada sisi aktif maupun di dekat

sisi aktif invertase yang penting dalam menjalankan fungsi katalitik enzim

tersebut (Sturm, 1999 dalam Hsiao et al., 2001).

24

Inhibisi terhadap aktivitas invertase juga disebabkan oleh adanya asam

yang terbentuk dari anion SO42- yang berikatan dengan kation H+ dari grup

sulfhidril invertase membentuk senyawa asam H2SO4. Penambahan CuSO4 dengan konsentrasi yang lebih tinggi menyebabkan terbentuknya senyawa

asam sulfat semakin banyak yang mengubah pH larutan menjadi lebih asam.

Hal ini sesuai dengan teori bahwa ion H+ yang berlebihan mempengaruhi

keseimbangan muatan pada sisi aktif enzim, sehingga kemampuan enzim

untuk mengikat substrat berkurang (Rodwell, 1981).

Jika konsentrasi CuSO4 dinaikkan maka inhibisi akan semakin besar,

seperti yang ditunjukkan oleh penambahan konsentrasi CuSO4 3.75 mM.

Inaktivasi bahkan dapat terjadi jika konsentrasi tersebut masih dinaikkan,

karena semakin banyak grup sulfhidril invertase yang terikat oleh kation

logam Cu (II) atau semakin banyak senyawa asam yang terbentuk. Hal ini

membuktikan bahwa kation logam Cu (II) bersifat sangat reaktif terhadap

grup sulfhidril pada kondisi konsentrasi yang tinggi. Hasil penelitian ini sesuai

dengan teori bahwa pengaruh inhibisi dari ion-ion logam disebabkan oleh

affinitas (kereaktifan) ion logam. Affinitas enzim terhadap ion logam berbeda

disesuaikan dengan sifat ikatan spesifik grup enzim yang terlibat. Kereaktifan

unsur-unsur atau senyawa untuk melakukan ikatan kompleks ditunjukkan oleh

konstanta pembentukan (log k1) (Klotz, 1954). Konstanta pembentukan kation

logam Cu (II) dengan gugus sulfida adalah 41.5 (Gurd dan Wilcox, 1954).

C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa

Aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa dipengaruhi oleh

beberapa faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim antara lain

konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu inkubasi dan lama

pemanasan. Perubahan faktor-faktor tersebut dengan penambahan CuSO4

dibahas sebagai berikut.

1. Pengaruh Konsentrasi Substrat

Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan

konsentrasi sukrosa memberikan pengaruh yang nyata terhadap

konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada Lampiran 3.

25

Semakin tinggi konsentrasi sukrosa diberikan, semakin tinggi konsentrasi

gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji menunjukkan rentang gula

pereduksi dari 0 M hingga 2157 M, dengan konsentrasi paling rendah

pada perlakuan tidak diberikan sukrosa dan konsentrasi tertinggi pada

sukrosa 20.75 g/l tanpa penambahan CuSO4. Hasil pengujian pengaruh

perubahan konsentrasi sukrosa terhadap aktivitas invertase dapat dilihat

pada Gambar 16.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75konsentrasi sukrosa (g/l)

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (uM

)

Perlakuan konsentrasi substrat dengan penambahan CuSO4 0.125 mMPerlakuan konsentrasi substrat tanpa CuSO4

Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap

konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

Peningkatan konsentrasi sukrosa meningkatkan gula pereduksi

yang dihasilkan. Peningkatan terjadi dengan curam dari invertase yang

tidak ditambahkan sukrosa (sukrosa 0 g/l) hingga sukrosa 12.5 g/l, baik

pada perlakuan tanpa maupun dengan penambahan CuSO4. Rasio

invertase terhadap sukrosa pada konsentrasi sukrosa 12.5 g/l adalah 1

: 2500. Selanjutnya, peningkatan secara landai terjadi dari konsentrasi

sukrosa 12.5 g/l hingga 16.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 3350) pada

perlakuan tanpa CuSO4. Hal ini disebabkan oleh enzim yang bekerja

semakin aktif jika substrat yang diberikan semakin banyak, karena

semakin banyak substrat yang berpeluang untuk berikatan dengan sisi aktif

enzim. Lehninger (1988) menyatakan bahwa pada konsentrasi substrat

26

yang rendah, kecepatan reaksi akan sangat rendah, tetapi kecepatan ini

akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi substrat.

Aktivitas invertase menjadi tidak berbeda nyata dari konsentrasi

sukrosa 16.75 g/l - 20.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 4150). Hal ini

disebabkan karena hampir semua sisi aktif invertase telah berikatan

dengan sukrosa membentuk kompleks enzim-substrat. Laju reaksi

meningkat dengan nilai yang semakin kecil hingga akhirnya tercapai titik

batas tertentu. Hal ini sesuai dengan teori bahwa bagaimanapun tingginya

konsentrasi substrat yang diberikan setelah titik batas ini tercapai,

kecepatan reaksi akan mendekati, tetapi tidak akan pernah mencapai garis

maksimum. Pada batas ini disebut dengan kecepatan maksimum (Vmaks),

enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih

cepat (Lehninger, 1988).

Kedua perlakuan, baik tanpa maupun dengan penambahan CuSO4

menunjukkan pola aktivitas invertase yang hampir sama, hanya berbeda

pada tingkat gula pereduksi yang dihasilkan. Konsentrasi CuSO4 mampu

menghambat aktivitas invertase dari taraf konsentrasi sukrosa 4.25 g/l

(invertase : sukrosa = 1 : 850) hingga konsentrasi sukrosa tertinggi

20.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 4150). Besar inhibisi yang diberikan

pada berbagai konsentrasi sukrosa, dapat dilihat pada Gambar 17.

31.1

13.09.2

37.2

2.4

0.05.0

10.015.020.025.030.035.040.045.050.0

0 4.25 8.25 12.5 16.75 20.75

konsentrasi sukrosa (g/l)

inhi

bisi

(%)

0

123

4567

89

subs

et

Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada

konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit

27

Perbedaan konsentrasi sukrosa berpengaruh nyata terhadap

besarnya inhibisi aktivitas invertase berdasarkan analisis sidik ragam,

dapat dilihat pada Lampiran 4. Inhibisi berbeda nyata ketika konsentrasi

sukrosa dinaikkan dari sukrosa 0 g/l hingga 4.25 g/l. Penambahan CuSO4 menyebabkan kation logam Cu (II) terikat pada grup sulfhidril enzim

invertase, sehingga inhibisi terjadi. Inhibisi tidak berbeda nyata dengan

kenaikan konsentrasi sukrosa 8.25 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 1650). Hal

ini menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi sukrosa menjadi 8.25 g/l

belum menurunkan kemampuan inhibisi oleh CuSO4 0.125 mM.

Kemampuan inhibisi turun secara tajam dengan kenaikan

konsentrasi sukrosa menjadi 12.5 g/l. Hal ini disebabkan karena pada

konsentrasi tersebut, laju pembentukan enzim-substrat pada perlakuan

tanpa CuSO4 masih meningkat, sehingga menghasilkan nilai gula

pereduksi yang tinggi di titik yang hampir sama dengan aktivitas enzim

invertase dengan CuSO4 0.125 mM. Aktivitas invertase dengan

penambahan CuSO4 0.125 mM pada rasio invertase terhadap sukrosa

1 : 2500 telah jenuh oleh substrat. Hal ini juga merupakan penyebab

inhibisi kembali meningkat dengan kenaikan sukrosa dari 12.5 g/l hingga

16.75 g/l (invertase : sukrosa = 1 : 3350).

2. Pengaruh Konsentrasi Enzim

Hasil hidrolisis sukrosa semakin meningkat dengan kenaikan

konsentrasi invertase, baik pada perlakuan tanpa CuSO4 maupun dengan

penambahan CuSO4. Gula pereduksi yang dihasilkan berada pada rentang

80.75 M hingga 1725.75 M, dapat dilihat pada Gambar 18. Hasil

analisis sidik ragam menunjukkan bahwa konsentrasi enzim yang diujikan

menunjukkan pengaruh nyata terhadap gula pereduksi yang dihasilkan.

Hasil uji statistik tersebut dapat dilihat pada Lampiran 5.

28

0200400600800

100012001400160018002000

0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15

konsentrasi invertase (mg/l)

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (uM

)

Perlakuan konsentrasi enzim dengan penambahan CuSO4 0.125 mM

Perlakuan konsentrasi enzim tanpa CuSO4

Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit

Aktivitas invertase pada konsentrasi enzim 0 mg/l hingga 0.15 mg/l

(invertase : sukrosa = 1 : 1.67 x 105) tidak memberikan respon pengaruh

yang berbeda nyata, baik pada perlakuan dengan mupun tanpa CuSO4.

Kedua taraf konsentrasi enzim tersebut memiliki kemampuan yang hampir

sama dalam menghidrolisis sukrosa. Hal ini dapat disebabkan oleh sisi

aktif enzim telah berikatan dengan sejumlah substrat dan menjadi jenuh,

sehingga produk yang dihasilkan sedikit. Hal ini sesuai dengan teori

bahwa konsentrasi enzim yang terbatas membuat substrat berlebih.

Substrat dapat berperan sebagai inhibitor jika substrat mengikat sisi lain

dari enzim karena dapat mengubah konformasi enzim. Substrat yang

berlebih akan membatasi laju reaksi katalisis enzim (Suryani dan

Mangunwidjaya, 2002).

Peningkatan aktivitas terjadi ketika konsentrasi enzim invertase

dinaikkan menjadi 0.85 mg/l ( invertase : sukrosa = 1 : 2.9 x 104) pada

perlakuan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM, dan 1.65 mg/l pada

perlakuan tanpa CuSO4. Peningkatan gula pereduksi masih terjadi hingga

taraf konsentrasi enzim tertinggi yaitu 4.15 mg/l (invertase : sukrosa =

1 : 6 x 103), baik pada perlakuan dengan maupun tanpa penambahan

CuSO4. Akan tetapi, peningkatan yang terjadi pada perlakuan tanpa

29

CuSO4 lebih curam. Hal ini menunjukkan bahwa kation logam Cu (II)

mampu menghambat laju pembentukan kompleks enzim-substrat.

Semakin tinggi konsentrasi enzim, semakin banyak sisi aktif enzim yang

berikatan dengan sukrosa sehingga semakin tinggi gula pereduksi yang

dihasilkan. Hal ini sesuai dengan teori bahwa kecepatan reaksi tergantung

pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator di dalam suatu

reaksi. Peningkatan konsentrasi enzim umumnya akan meningkatkan

hidrolisis substrat menjadi produk (Simanjutak dan Silalahi, 2003).

Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perbedaan taraf

konsentrasi enzim berpengaruh nyata terhadap persen inhibisi, dapat

dilihat pada Lampiran 6. Inhibisi oleh garam logam CuSO4 mulai terjadi

pada konsentrasi invertase 2.5 mg/l (invertase : sukrosa = 1 : 104), dapat

dilihat pada Gambar 19. Konsentrasi enzim di bawah konsentrasi tersebut

belum menunjukkan inhibisi. Hal ini dapat terjadi karena adanya

penurunan laju inversi oleh konsentrasi substrat yang berlebih, sehingga

kation Cu (II) tidak dapat memasuki sisi aktif invertase. Inhibisi pada

konsentrasi invertase 2.5 mg/l mulai terlihat karena substrat tidak berlebih

atau telah diimbangi dengan kenaikan konsentrasi enzim, sehingga

kompetisi mulai terjadi antara sukrosa dengan kation Cu (II) dalam

mengikat sisi aktif enzim.

15.8

41.854.8

-130.7

-62.1-88.8

-55.5

-200.0

-150.0

-100.0

-50.0

0.0

50.0

100.0

0 0.15 0.85 1.65 2.5 3.35 4.15

konsentrasi invertase (mg/l)

inhibisi (%

)

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5su

bset

Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada

konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, pH 7, lama reaksi 5 menit

Inhibisi pada konsentrasi invertase 2.5 3.35 mg/l

(invertase : sukrosa = 1 : 7.5 x 103) tidak berbeda nyata. Begitu juga

30

dengan konsentrasi invertase 3.35 4.15 mg/l. Hal ini menunjukkan

bahwa untuk mencapai inhibisi yang lebih besar, diperlukan konsentrasi

CuSO4 yang lebih tinggi untuk mengikat sisi aktif enzim yang masih

bebas.

3. Pengaruh pH

Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan nilai pH

memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi

yang dihasilkan. Perubahan pH menyebabkan perubahan muatan pada

gugus residu asam amino dan sisi aktif enzim. Gugus residu asam amino

merupakan asam atau basa lemah yang dapat terprotonasi atau terionisasi

oleh pengaruh pH lingkungan.

Pengujian pengaruh nilai pH dilakukan pada rasio invertase

terhadap sukrosa 1 : 4500, dan konsentrasi CuSO4 0.125 mM, sedangkan

perlakuan tanpa CuSO4 menggunakan invertase : sukrosa 1 : 5000. Gula

pereduksi yang dihasilkan berbeda pada rentang 85.75 M hingga

2267 M, dapat dilihat pada Gambar 20. Konsentrasi gula pereduksi

paling rendah diperlihatkan pada pH 11, perlakuan tanpa penambahan

CuSO4 dan konsentrasi tertinggi pada pH 5, perlakuan dengan

penambahan CuSO4 0.125 mM. Hasil uji statistik pengaruh pH dapat

dilihat pada Lampiran 7.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 2 4 6 8 10 12

pH

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (uM

)

Perlakuan pH dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan pH tanpa CuSO4

Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai pH terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit

31

Invertase dengan maupun tanpa penambahan CuSO4 menunjukkan

pola aktivitas yang hampir sama, yaitu aktivitas invertase meningkat dari

pH 3 sampai titik optimum pada pH 5. Aktivitas menurun dengan

peningkatan pH sampai pH 8 untuk invertase tanpa CuSO4 dan pH 7 untuk

invertase dengan penambahan CuSO4 0.125 mM, setelah itu enzim

menjadi inaktif.

Adanya penambahan CuSO4 memberikan tambahan asam pada

larutan, akan tetapi diimbangi dengan adanya buffer pH yang

mempertahankan nilai pH. Hal ini sesuai dengan teori bahwa penambahan

ion H+ atau OH- ke dalam buffer hanya menyebabkan perubahan kecil

pada nisbah konsentrasi relatif asam lemah dan anionnya. Penurunan salah

satu komponen dari sistem buffer dengan penambahan sedikit asam

diimbangi dengan tepat oleh peningkatan komponen lainnya. Jumlah

komponen buffer tidak berubah, yang berubah hanya nisbahnya

(Lehninger, 1988).

Aktivitas hidrolisis sukrosa oleh invertase sangat rendah pada pH

yang sangat asam (pH 3) dan basa tinggi (pH 8 - 11). Hal ini menunjukkan

bahwa pada pH yang sangat asam, gugus fungsionil pada sisi aktif enzim

terganggu oleh adanya ion H+ yang berlebihan, sedangkan pada pH basa

tinggi aktivitas invertase rendah karena ion OH- yang berlebihan.

Perubahan pH akan menyebabkan suatu bentuk kurva seperti yang

diperlihatkan pada Gambar 20. Bentuk kurva tersebut dipengaruhi oleh

faktor-faktor sebagai berkut.

1. Denaturasi enzim pada pH yang sangat tinggi atau rendah

Hasil pengujian perubahan pH, denaturasi enzim terjadi pada

pH 3 ke bawah untuk pH asam dan pH 8 ke atas untuk pH basa. Hal

ini terlihat pada Gambar 20, konsentrasi gula pereduksi yang

dihasilkan pada pH 8 ke atas sangat rendah dan tidak berbeda nyata.

Denaturasi enzim menyebabkan konformasi enzim rusak, karena

struktur protein globular terbuka tanpa memecah ikatan kovalen dalam

kerangka polipeptida. Ikatan hidrogen antara gugus residu atom

nitrogen pada asam amino menjadi terbuka karena muatannya menjadi

32

tidak seimbang oleh pengaruh pH. Hal ini sesuai dengan teori bahwa

enzim terdenaturasi di suhu ruang pada pH tinggi atau rendah,

sehingga enzim kehilangan aktivitasnya yang bersifat tidak dapat balik

(irreversible) (Stauffer, 1989).

2. Pengaruh terhadap keadaan muatan substrat atau enzim

Enzim merupakan protein yang sangat dipengaruhi oleh pH.

pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas enzim karena sifat ionik

gugus karboksil dan gugus asam amino, yang menyebabkan enzim

tidak dapat berinteraksi dengan substrat atau sebaliknya, menjadi

mudah berikatan dengan substrat. Rodwell (1981) menyatakan bahwa

perubahan muatan pada enzim dapat mempengaruhi aktivitas baik

dengan perubahan struktur maupun dengan perubahan muatan pada

residu asam amino yang berfungsi mengikat substrat atau katalisis.

Tingkat pH yang rendah menyebabkan enzim mengalami protonasi

dan kehilangan muatan negatif:

Enz - + H+ Enz-H

Tingkat pH yang tinggi menyebabkan ion substrat (SH+) mengalami

ionisasi dan kehilangan muatan positif:

SH+ S + H+

3. Perubahan konformasi enzim

Perubahan konformasi enzim juga dipengaruhi oleh perubahan

muatan asam amino. Aktivitas dapat menjadi rendah pada pH yang

sangat tinggi atau sangat rendah atau sebaliknya menjadi maksimum

pada pH tertentu. Berdasarkan Gambar 20, perubahan konformasi

enzim yang berpengaruh pada tingginya aktivitas di pH 5 dapat terjadi

karena struktur enzim menjadi lebih kompak. Rodwell (1981)

menyatakan, suatu gugus yang bermuatan jauh dari bagian dimana

substrat terikat, mungkin perlu untuk mempertahankan struktur tersier

atau kuartener yang aktif. Apabila muatan pada gugus ini diubah,

molekul protein dapat terbuka atau menjadi lebih kompak.

33

Inhibisi oleh CuSO4 terhadap invertase tidak terjadi pada pH yang

diujikan kecuali pada pH 7. Akan tetapi persen inhibisi yang dihasilkan

pada pH 7 tidak berbeda nyata dengan pH 4 6, dapat dilihat pada

Lampiran 8. Hal ini membuktikan bahwa ikatan antara enzim invertase

dengan kation logam Cu (II) sangat dipengaruhi oleh tingkat pH.

Perubahan pH menyebabkan kereaktifan Cu (II) berkurang karena

perubahan muatan pada enzim, sehingga inhibisi tidak terjadi.

15.0

-6.8-14.2

-196.0

-29.6

-261.4

-186.8

-255.0-281.3

-400.0

-350.0

-300.0

-250.0

-200.0

-150.0

-100.0

-50.0

0.0

50.0

3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

inhi

bisi

(%)

0

1

2

3

4

5

subs

et

Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada nilai

pH yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit

4. Pengaruh Suhu

Pengujian pengaruh perubahan suhu dilakukan pada rasio invertase

terhadap sukrosa 1 : 2500, dengan konsentrasi CuSO4 0.125 mM. Analisis

sidik ragam menunjukkan bahwa perubahan suhu berpengaruh nyata

terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik

tersebut dapat dilihat pada Lampiran 9. Perubahan suhu menghasilkan

konsentrasi gula pereduksi pada rentang 140.75 M hingga 3537 M.

Konsentrasi tertinggi pada suhu 50C dengan perlakuan tanpa CuSO4 dan

konsentrasi terkecil pada suhu 70C dengan penambahan CuSO4

0.125 mM. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap aktivitas invertase

dapat dilihat pada Gambar 22.

34

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90suhu (oC)

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (uM

)

Perlakuan suhu dengan penambahan CuSO4 0.125 mM Perlakuan suhu tanpa CuSO4

Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit

Aktivitas invertase semakin meningkat dengan kenaikan suhu

hingga mencapai aktivitas maksimum. Peningkatan suhu lebih lanjut

setelah titik maksimum menyebabkan penurunan aktivitas invertase dalam

menghidrolisis sukrosa. Kedua perlakuan terhadap invertase, dengan

maupun tanpa penambahan CuSO4 menunjukkan pola aktivitas tersebut.

Peningkatan aktivitas invertase tanpa CuSO4 terjadi ketika suhu

dinaikkan dari 0C - 50C dan 0C - 40C pada perlakuan dengan

penambahan CuSO4 0.125 mM. Peningkatan suhu menyebabkan kenaikan

energi kinetik yang membuat molekul enzim dan substrat saling

bertumbukan sehingga semakin banyak kompleks enzim-substrat yang

terbentuk. Energi kinetik tersebut mampu meningkatkan aktivitas enzim

hingga maksimal pada suhu 50C, kemudian aktivitas enzim turun dengan

tajam pada suhu yang lebih tinggi hingga 70C. Webb (1963) menyatakan

bahwa suhu pada saat aktivitas enzim maksimum disebut dengan suhu

optimum. Rodwell (1981) juga menyatakan, suhu optimum kebanyakan

enzim adalah suhu sel atau di atas suhu sel tempat enzim-enzim berada.

Aktivitas enzim di bawah maupun di atas suhu optimum enzim

lebih rendah. Hal ini disebabkan oleh rusaknya ikatan-ikatan yang

mempertahankan struktur enzim. Jika ikatan sekunder rusak, keadaan

katalitik enzim aktif menjadi berubah. Rusaknya struktur dan konformasi

enzim dapat menyebabkan enzim kehilangan aktivitas biologisnya yang

disebut dengan denaturasi enzim oleh suhu tinggi. Ikatan-ikatan sekunder

35

enzim yang lemah, seperti ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik

semakin lemah ikatannya dengan meningkatnya suhu. Hal ini

menyebabkan denaturasi yang bersifat reversible pada suhu 60 - 70C

dengan perlakuan tanpa CuSO4 dan 50C dengan penambahan CuSO4

0.125 mM. Denaturasi irreversible terjadi jika ikatan kovalen pada enzim

telah rusak, yaitu mulai suhu 70C pada perlakuan tanpa CuSO4 dan mulai

suhu 60C pada dengan penambahan CuSO4 0.125 mM. Hal ini sesuai

dengan teori bahwa kenaikan kecepatan aktivitas enzim di bawah suhu

optimum disebabkan oleh kenaikan energi kinetik molekul-molekul yang

bereaksi. Akan tetapi apabila suhu tetap dinaikkan, energi kinetik

molekul-molekul enzim menjadi demikian besar sehingga melampaui

penghalang energi untuk memecahkan ikatan sekunder (Rodwell, 1981).

Penambahan CuSO4 0.125 mM menyebabkan invertase menjadi

lebih stabil oleh perubahan suhu, karena perubahan terjadi tidak secara

tajam atau signifikan. Hal ini dapat dilihat bahwa aktivitas invertase pada

perubahan suhu 10C menjadi 20C tidak berbeda nyata. Kenaikan

aktivitas menjadi 30C terjadi secara landai, dan perubahan menjadi suhu

40C juga tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap

konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Begitu juga dengan pola

penurunan aktivitas invertase dari suhu optimum enzim ke suhu yang

lebih tinggi juga tidak sebesar yang terjadi pada perlakuan tanpa CuSO4.

Inhibisi oleh CuSO4 terjadi mulai suhu 10C hingga 90C, dapat

dilihat pada Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase tidak terjadi pada suhu

0C. Hal ini dapat disebabkan selain invertase kurang aktif pada suhu

rendah karena energi kinetik yang rendah, reaksi pengikatan oleh kation

logam Cu (II) juga tidak terjadi pada suhu yang sangat rendah. Suhu dapat

mempengaruhi perubahan konfigurasi dari sisi aktif enzim. Jika sisi aktif

enzim mudah mengalami perubahan struktur, fleksibilitas enzim akan

berubah sehingga manyebabkan inhibitor lebih mudah atau lebih sulit

untuk mengikat enzim (Webb, 1963).

Daya inhibisi CuSO4 dipengaruhi oleh perubahan suhu pada taraf

0 - 90C, dapat dilihat pada Lampiran 10. Besarnya persen inhibisi oleh

36

perubahan suhu dapat dilihat pada Gambar 23. Hasil uji pengaruh suhu

menunjukkan besarnya inhibisi meningkat seiring dengan kenaikan

sampai dengan suhu 60C, kemudian turun secara tajam. Hal ini

menunjukkan bahwa perubahan konfigurasi sisi aktif enzim oleh suhu

dapat menyebabkan inhibitor mudah atau sulit untuk mengikat enzim.

Inhibisi menjadi sangat besar pada saat suhu 60C karena aktivitas

invertase tanpa CuSO4 masih tinggi, sedangkan aktivitas invertase dengan

penambahan CuSO4 0.125 mM sangat rendah karena telah mengalami

denaturasi. Inhibisi menurun setelah suhu optimum karena aktivitas

invertase baik dengan maupun tanpa CuSO4 telah turun. Hal ini

menunjukkan bahwa CuSO4 0.125 mM efektif dalam menghambat

aktivitas invertase pada suhu optimum enzim pada rasio konsentrasi

invertase : sukrosa 1 : 2500.

-12.2

6.8

37.6

53.5

69.7

85.595.1

83.6

68.4

12.3

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

suhu (oC)

%in

hibi

si

0

1

2

3

4

5

6

7

8

subs

et

Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO4 0.125 mM pada suhu yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit

5. Pengaruh Lama Pemanasan

Pengujian pengaruh lama pemanasan dilakukan pada rasio

invertase terhadap sukrosa 1 : 2500, dengan konsentrasi CuSO4 0.125 mM.

Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa pemanasan invertase yang

dilakukan pada waktu yang berbeda memberikan pengaruh yang nyata

terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan. Hasil uji statistik

tersebut dapat dilihat pada Lampiran 11. Gula pereduksi yang dihasilkan

37

berda pada rentang 82 M hingga 1467 M, dengan konsentrasi tertinggi

pada invertase yang tidak dipanaskan dan konsentrasi terkecil pada

pemanasan 60 detik dan 300 detik pada perlakuan tanpa CuSO4. Pengaruh

lama pemanasan terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar

24.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 10 20 30 40 50 60 300

lama pemanasan (detik)

kons

entra

si g

ula

pere

duks

i (u

M)

Perlakuan lama pemanasan dengan penambahan CuSO4 0.125 mM

Perlakuan lama pemanasan tanpa CuSO4

Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit

Pengujian pengaruh lama pemasan ini memberikan hasil bahwa

semakin lama waktu pemanasan, semakin rendah aktivitas invertase dalam

menghidrolisis sukrosa. Invertase menunjukkan kestabilan terhadap panas

dalam waktu yang sangat singkat. Aktivitas enzim terus menurun