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JBCA – Jornal Brasileiro de Ciência Animal 2012 5 (10): 385 – 396.
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Extração de DNA e RNA de fígado e músculo em tilápia do Nilo
Extraction of DNA and RNA from liver and muscle in Nile tilapia
Extracción de ADN y ARN de hígado y músculo en
tilapia del Nilo
Eliane Gasparino1, Fernanda Tanamati2,
Ariane Gomes Salles Tiburcio3, Stefania Caroline Claudino da Silva2,
André Luiz Seccatto Garcia4 e Angélica de Souza Khatlab4
Resumo
Na tilapicultura, os estudos em genética molecular têm se tornado cada
vez mais importantes, havendo a necessidade de obtenção de protocolos
funcionais para cada tecido. Foram utilizadas amostras de músculo e
fígado de tilápias do Nilo, e adaptados protocolos para extração de DNA
(para músculo e fígado) e RNA (para fígado). Para a extração de DNA do
fígado houve a redução do tempo em banho-maria (de 12 para duas
horas). Para a extração de DNA de fígado foram alteradas as seguintes
etapas: redução do tempo em banho-maria (de 12 para duas horas),
utilização de pequena fração de amostra inteira (sem maceração) e adição
de uma etapa de decantação. Para a extração de RNA de fígado, a
utilização de amostra macerada sugerida pelo protocolo foi substituída por
uma pequena fração de amostra inteira. As adaptações de protocolo de
extração de DNA de fígado e músculo e de extração de RNA de fígado em
tilápias do Nilo foram apropriadas gerando boa relação de absorbância
(A260/A280), e material genético de boa qualidade para análises
subsequentes.
Palavras-chave: Oreochromis niloticus, ácidos nucleicos, extração,
protocolo
1 Professora do curso de Graduação em Zootecnia e Pós Graduação em Zootecnia da Universidade
Estadual de Maringá. 2 Estudantes do Programa de Pós Graduação em Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá.
3 Estudante de Graduação em Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa.
4 Estudantes de Graduação em Zootecnia da Universidade Estadual de Maringá.
Autora para correspondência: Stefania Caroline Claudino da Silva. E-mail: [email protected]
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Abstract
In tilapia culture, molecular genetics studies have become increasingly
important, with the need for obtaining functional protocols for each tissue.
Samples of muscle and liver of tilapia were used and adapted protocols for
DNA extraction (for muscle and liver) and RNA (for liver). For the extraction
of DNA from the liver, the time of water bath was reduced (from 12 to two
hours). For the extraction of DNA from the liver the following steps were
changed: reducing time in the water bath (from12 to two hours), using a
small fraction of the entire sample (without maceration) and adding a step
of decantation. For extraction of RNA from liver, using the protocol
suggested by the macerated sample was replaced by a small fraction of the
entire sample. Alterations of DNA extraction protocol liver and muscle and
liver RNA extraction in Nile tilapia were appropriate generating a
good absorbance ratio (A260/A280), and good quality genetic material for
subsequent analysis.
Key words: Oreochromis niloticus, nucleic acids, extraction, protocol
Resumen
En el cultivo de Tilapia, los estudios en genética molecular se han
convertido cada vez más importantes, viendo la necesidad de obtener
protocolos funcionales para cada tejido. Fueron usadas muestras de
músculo e hígado de tilapias del Nilo, y adaptados protocolos para
extracción de ADN (para músculo e hígado) y ARN (para hígado). Para la
extracción de ADN del hígado hubo una reducción del tiempo en el baño
maría (de 12 para dos horas). Para la extracción de ADN de hígado fueron
alteradas las siguientes etapas: reducción del tiempo en el baño maría (de
12 para dos horas), utilización de un pequeño fragmento de la muestra
entera (sin maceración) y se agregó una etapa de decantación. Para la
extracción de ARN de hígado, la utilización de la muestra macerada
sugerida por el protocolo fue sustituida por un pequeño fragmento de la
muestra entera. Las adaptaciones del protocolo de extracción de ADN de
hígado y músculo y la extracción de ARN de hígado en tilapias del Nilo
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fueron apropiadas generando buena relación de absorbancia (A260/A280),
y buena calidad del material genético para análisis posteriores.
Palabras clave: Oreochromis niloticus, ácidos nucleicos, extracción,
protocolo
Introdução
Na tilapicultura, estudos em
genética molecular têm se tornado
cada vez mais importantes, uma vez
que possibilitam estudos aprofundados
de genes ligados a características
de interesse econômico.
Diversos são os protocolos
existentes para o isolamento de
DNA de peixes, sendo poucos os
que fornecem DNA de boa
qualidade e utilizam o DNA de
tecidos sólidos1. Embora já existam
diferentes protocolos funcionais
para diferentes tecidos, ainda
surgem problemas relacionados à
extração de DNA e RNA que
demandam tempo e recursos
financeiros para serem solucionados.
A boa qualidade do DNA é
essencial para se obter bons
resultados em experimentos,
especialmente no uso da reação da
polimerase em cadeia (PCR), onde
impurezas podem inibir o processo
de amplificação2. A obtenção de
RNA de boa quantidade e em
qualidade é fundamental para
análises moleculares, como
expressão gênica (qRT-PCR) ou
preparação de bibliotecas de cDNA.
A maioria dos métodos de extração
de RNA encontrados na literatura é
baseada em precipitação por
guanidina e fenol3, sendo que estes
geralmente levam em consideração
o tecido alvo em detrimento da
espécie animal, podendo haver
necessidade de adaptações em
caso de espécies muito divergentes.
Um importante aspecto a ser
avaliado para a extração de RNA é
a composição tecidual. Alguns
tecidos específicos apresentam
problemas particulares, tais como
elevado conteúdo de lipídio, além
da presença de inibidores
potencias. Outro fator importante a
ser considerado é o nível de
homogeneização da amostra, que é
dependente de sua composição,
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sendo que tecidos mais resistentes,
como músculo, requerem mais
homogeneização do que tecidos
menos densos, como o fígado4.
Desta forma, o objetivo deste
trabalho foi adaptar protocolos para
a extração de DNA e RNA de fígado
e de DNA de músculo de tilápia do Nilo.
Material e métodos
Foram utilizadas amostras de
tecido muscular e de fígado de
tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus),
armazenadas em nitrogênio líquido e
em freezer -80°C. Para a extração de
DNA utilizou-se como base a
metodologia descrita por Bardakci &
Skibinski5. Para a extração de RNA
utilizou-se como base a metodologia
recomendada pelo fabricante do
reagente Trizol® (Invitrogen, Carlsbad
CA, USA).
Extração de DNA de músculo
Uma amostra de
aproximadamente 30mg foi
acondicionada em microtubos
(1,5mL), e adicionados 550 µL de
tampão de lise, (50 mM de Tris-HCl,
50 mM de EDTA, 100 mM de NaCl
e 1% de SDS), 30 µL de SDS
(dodecil sulfato de sódio) e 10 µL de
proteinase K (200 µg mL-1). As
amostras foram incubadas em
banho-maria a 50ºC e retiradas
após 2 horas. Acrescentou-se então
600 µL de solução de NaCl (5M)
com posterior homogeneização e
centrifugação por 15 minutos a
12.000 rpm. Em seguida, 800 µL de
sobrenadante foram transferidos
para novos microtubos, precipitado
com 700 µL de álcool etílico
absoluto gelado e incubado por uma
hora a -20ºC. A amostra foi
novamente centrifugada por 15
minutos a 12.000 rpm, descartado o
sobrenadante, e o pellet de DNA
seco a temperatura ambiente por
aproximadamente 30 minutos. O
pellet foi ressuspendido em 70 µL
de TE (10 mM de Tris pH 8,0 e 1
mM de EDTA), levado ao banho-
maria a 37ºC por uma hora e em
seguida estocado no freezer a -
20ºC.
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Extração de DNA de fígado
Para a extração de DNA do
fígado, uma amostra de
aproximadamente 30 mg foi
acondicionada em microtubos
(1,5mL), e adicionados 550 µL de
tampão de lise, 30 µL de SDS, 10
µL de Proteinase K, e incubados em
banho-maria à 50°C por 2 horas.
Em seguida, 600 µL de NaCl (5M)
foram adicionados às amostras, que
foram homogeneizadas e
centrifugadas por 15 minutos a
12.000 rpm. Em seguida, 800 µL do
sobrenadante foram transferidos
para um novo microtubo,
adicionando 700 µL de etanol
absoluto gelado e mantido em
repouso por 20 minutos à
temperatura ambiente, para a
decantação. Foram retirados 500 µL
do sobrenadante, dando início
novamente ao protocolo,
adicionando na sequência 550 µL
de tampão de lise, 30 µL de SDS
(dodecil sulfato de sódio) e 10 µL de
proteinase K (200 µg mL-1). As
amostras foram levadas ao banho-
maria a 50ºC por uma hora; depois
de retiradas, foram adicionados 600
µL de solução de NaCl (5 M),
homogeneizadas e centrifugadas
por 15 minutos a 12.000 rpm. Em
seguida, 800 µL do sobrenadante
foram transferidos para um novo
microtubo, adicionando 700 µL de
etanol absoluto gelado, e incubado
por uma hora a -20 ºC. Após isso,
realizou-se nova centrifugação por
15 minutos a 12.000 rpm,
descartou-se o sobrenadante e o
pellet de DNA seco a temperatura
ambiente por aproximadamente 30
minutos. O pellet foi ressuspendido
em 70 µL de TE (10 mM de Tris pH
8,0 e 1 mM de EDTA), levado ao
banho-maria a 37ºC por 40 minutos
e estocado no freezer a -20 ºC.
A concentração do DNA total foi
determinada por espectrofotometria
a 260 nm e a qualidade
determinada pelas razões
A260/A280. As amostras de DNA
(músculo e fígado) foram diluídas
em TE para uma concentração de
20 ng/µL e a integridade do DNA
verificada por eletroforese em gel de
agarose a 0,8%, revelada com 0,5
µg/mL de brometo de etídio. A
eletroforese foi conduzida em 100
volts por 60 minutos em cuba
horizontal, usando tampão TBE
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0,5X (500 mM de Tris-HCl, 60 mM
de ácido bórico e 83 mM de EDTA),
e a imagem capturada por um
sistema da L-pix (Loccus
biotecnologia).
Para a validação dos
protocolos de extração de DNA no
músculo e fígado foram realizadas
amplificações através da técnica de
PCR utilizando primer específico de
β-actina.
Extração de RNA de fígado
Para a extração de RNA, uma
amostra de aproximadamente 30
mg foi acondicionada em
microtubos (1,5 mL), com adição de
750 µL de Trizol®, adaptando o
sugerido pelos fabricantes (1
mL/100 mg de tecido). Foram
adicionados 250 µL de água ultra
pura com posterior homogeneização
em vortex, seguido de 5 minutos à
temperatura ambiente. A seguir
foram adicionados 200 µL de
clorofórmio, com nova
homogeneização em vortex e
repouso a temperatura ambiente por
5 minutos. Em seguida as amostras
foram centrifugadas por 15 minutos
a 12.000 rpm, transferidos 500 µL
de sobrenadante a um novo
microtubo, e adicionados 500 µL de
álcool isopropílico, deixando-as por
10 minutos à temperatura ambiente.
As amostras foram centrifugadas a
12.000 rpm, por 10 minutos,
descartado o sobrenadante,
restando apenas o pellet. Este foi
lavado com 1 mL de etanol 75% até
se desprender do fundo do
microtubo e transportado para a
centrifuga por 10 minutos a 12.000
rpm. Após a centrifugação, o pellet
foi seco por aproximadamente 30
minutos à temperatura ambiente e
100 µL de água ultra pura foi
acrescentado para estocagem.
A concentração do RNA total foi
determinada por espectrofotometria
a 260 nm, a qualidade determinada
pelas razões A260/A280. A
integridade do RNA total foi
verificada por eletroforese em gel
desnaturante de agarose 0,8 %
(tampão MOPS 1X [0,02 M de ácido
3- propaneusulfonico, 0,005 M de
acetato de sódio e 0,001 M EDTA] e
2,5 % de formaldeído). Para a
visualização foram utilizados 5, 10 e
15µL de RNA em tampão de
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carregamento, revelado com 0,5
µg/mL de brometo de etídio, sendo
a eletroforese conduzida em 100
volts por 60 minutos em cuba
horizontal, usando tampão TBE
0,5X e a imagem capturada por um
sistema da L-pix (Loccus
biotecnologia). Para o teste de
validação do protocolo foi utilizado
primer específico de β – actina e
análise de qRT-PCR.
Resultado e discussão
Para a extração de DNA de
músculo, a principal modificação
realizada foi a redução do banho-
maria de 12 horas do protocolo
original para 2 horas, tornando mais
rápido o procedimento de extração
sem alterar a qualidade e
quantidade do DNA total extraído.
O protocolo utilizado neste
experimento consistiu em uma
adaptação ao protocolo de Bardakci
& Skibinski5, além da substituição
de fenol-clorofórmio por solução
salina6. Outros autores também
observaram bons resultados de
extração de DNA em Jundiá
(Rhamdia quelen)7 com a utilização
de um protocolo com substituição
de fenol-clorofórmio por solução
salina em músculo, entretanto, com
tempo de 12 horas de banho-maria.
Bardakci & Skibinski5
utilizaram amostras de nadadeira
caudal cortadas em pequenos
fragmentos para a extração de
DNA. Neste trabalho, as amostras
de músculo foram submetidas à
extração em duas formas distintas,
inteiras ou maceradas formando
pequenos fragmentos. As amostras
maceradas se mostraram
aparentemente mais sujas durante o
processo, entretanto, a razão das
absorbâncias (Tabela 1)
demonstrou pouca diferença entre
os resultados de razão A260/A280
entre as amostras inteiras ou
fragmentadas. Os valores de
absorbância evidenciam ainda que
amostras inteiras promoveram não
só uma menor liberação de resíduos
(A280), mas também reduziram a
quantidade de material genético
(A260).
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Tabela 1: Valores de absorbância obtidos na
a razão
AMOSTRAS
Músculo
macerado
Músculo inteiro
A integridade do DNA e
RNA total foi verificada por
eletroforese em gel de
Figura 1: Gel de desnaturante de agarose: canaleta 1(DNA); canaleta 3 e 4 – Fígado
Em experimentos anteriores
com a utilização de amostras de
fígado de tilápia do Nilo observou
rasileiro de Ciência Animal 2012 5 (10): 385 – 396.
Valores de absorbância obtidos na quantificação de DNA e
A260 A280 A260/A280
0,1558 0,0867
0,0409 0,0227
A integridade do DNA e
RNA total foi verificada por
eletroforese em gel de agarose
0,8% (Figura 1), comprovando
a eficiência dos três protocolos
testados.
Gel de desnaturante de agarose: canaleta 1 e 2 - Músculo inteiroFígado inteiro (DNA); canaleta 5 e 6 – Fígado
Em experimentos anteriores
com a utilização de amostras de
fígado de tilápia do Nilo observou-se
a formação de grumos durante o
processo de extração
utilizando protocolos obtidos na
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quantificação de DNA e
A260/A280
1,7970
1,8017
(Figura 1), comprovando
a eficiência dos três protocolos
Músculo inteiro Fígado inteiro
a formação de grumos durante o
processo de extração de RNA
utilizando protocolos obtidos na
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literatura, e de uma película de
aparência gordurosa na extração de
Figura 2: Amostras com formação da película de gordura sobre a solução. A seta indica a película de gordura.
Para a extração de DNA do
fígado, assim como no músculo,
houve redução do tempo de
permanência das amostras em
banho-maria de 12 para 2 horas.
Para que a película de
aparência gordurosa não
prejudicasse o processo
de 20 minutos de decantação foi
adicionada em substituição a
tempo de 1 hora no freezer a
rasileiro de Ciência Animal 2012 5 (10): 385 – 396.
literatura, e de uma película de
aparência gordurosa na extração de
DNA utilizando o protocolo de
Bardakci & Skibinski (Figura
Amostras com formação da película de gordura sobre a solução. A seta indica a película de gordura.
de DNA do
assim como no músculo,
houve redução do tempo de
das amostras em
12 para 2 horas.
película de
aparência gordurosa não
prejudicasse o processo, uma etapa
de 20 minutos de decantação foi
em substituição ao
tempo de 1 hora no freezer a -20°C
descrito no protocolo anteri
intuito de precipitar
Após esta decantação
sobrenadante foi transferido para
um novo microtubo,
procedimento de extração.
destas modificações, a
segundo banho-maria à 37°C foi
reduzida para 40 minutos
entre amostras inteiras e maceradas
também foram realizadas, como nas
amostras de músculo.
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DNA utilizando o protocolo de
(Figura 2).
Amostras com formação da película de gordura sobre a solução. A
protocolo anterior, no
intuito de precipitar esta película.
decantação, o
transferido para
reiniciando o
procedimento de extração. Além
destas modificações, a duração do
maria à 37°C foi
reduzida para 40 minutos, e testes
entre amostras inteiras e maceradas
também foram realizadas, como nas
.
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As razões de absorbância
entre as amostra de fígado inteiro e
macerado mostram melhores
resultados para as amostras inteiras
(Tabela 2).
Tabela 2: Valores de absorbância obtidos na quantificação de DNA e a razão
AMOSTRAS A260 A280 A260/A280
Fígado macerado 0,0167 0,0105 1,5905
Fígado inteiro 0,0129 0,0068 1,8970
Os valores de absorbância a
280nm sugerem ainda maior
liberação de resíduos nas amostras
maceradas, podendo prejudicar
futuros processos.
Para o processo de extração
de RNA de fígado foi utilizado como
base o protocolo indicado pelos
fabricantes de Trizol®. Neste
protocolo, os fabricantes indicam a
maceração da amostra para
melhorar o contato com o reagente.
Entretanto, logo após a etapa de
precipitação observou-se a
formação de grumos de aspecto
gorduroso em todo o sobrenadante,
e não apenas na superfície como
observado na extração de DNA do
fígado. Assim como na extração de
DNA do fígado, uma etapa de
decantação foi proposta na tentativa
de eliminar os grumos
(possivelmente proteína), entretanto,
para a extração de RNA essa etapa
não foi bem sucedida, ocorrendo o
surgimento de novos grumos assim
que o protocolo foi reiniciado.
Os fabricantes do Trizol®
sugerem ainda a adição de uma
etapa extra de isolamento para
amostras com alto conteúdo de
proteínas, gordura, polissacarídeos
ou material extracelular, geralmente
observados em tecido muscular e
tecido gorduroso, entretanto, após a
adição desta etapa extra de
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isolamento, ainda se observou a
formação dos grumos de aspecto
gorduroso.
A substituição de amostras
maceradas por uma amostra inteira
proporcionou o não surgimento dos
grumos, e melhores valores de
absorbância (Tabela 3).
Tabela 3: Valores de absorbância obtidos na quantificação de RNA e a razão
AMOSTRAS A260 A280 A260/A280
Fígado macerado 0,223 0,1521 1,4661
Fígado inteiro 0,241 0,1472 1,6372
A utilização de amostra inteira
em substituição às maceradas
promoveu melhores resultados de
concentração (260nm) e qualidade
(A260/A280) do material genético,
além de diminuir as concentrações
de resíduos na amostra (280nm).
Os testes de validação
realizados (primer específico de β –
actina e análise de PCR para DNA e
qRT-PCR para RNA) confirmaram a
eficiência das modificações
realizadas, podendo estas serem
aplicadas em outros trabalhos.
Conclusão
As adaptações feitas nos
protocolos originais apresentaram
resultados satisfatórios tanto para a
extração de DNA e RNA de fígado
quanto para extração de DNA de
músculo em amostras oriundas de
tilápia do Nilo.
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Recebido em: Junho de 2012 Aceito em: Outubro de 2012 Publicado em: Dezembro de 2012