extração, caracterização dos extratos de pinus halepensis · extração, caracterização dos...

Extração, caracterização dos extratos de Pinus halepensis

e modelação. Avaliação da sua atividade antioxidante,

antimicrobiana e antifúngica

Sara Alexandra Batista Figueira

Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Orientadores: Professor José Augusto Paixão Coelho Professor António Manuel de Figueiredo Palavra

Júri

Presidente: Professor Miguel Nobre Parreira Cacho Teixeira Orientador: Professor José Augusto Paixão Coelho

Vogal: Doutora Maria Beatriz Pinto Pereira Palma Nobre

maio de 2019

ii

Prefácio

O trabalho apresentado nesta tese foi realizado no Instituto Superior Técnico e no Instituto Superior

de Engenharia de Lisboa, durante o período de setembro de 2018 a janeiro de 2019, sob supervisão

do Professor Doutor José Augusto Paixão Coelho. A tese foi coorientada no Instituto Superior Técnico

pelo Professor Doutor António Manuel de Figueiredo Palavra.

iv

Declaração

Declaro que o presente documento é um trabalho original da minha autoria e que cumpre todos os

requisitos do Código de Conduta e Boas Práticas da Universidade de Lisboa.

vi

Agradecimentos

Gostaria de agradecer ao Professor José Coelho por me ter acompanhado neste processo, por ter

partilhado os seus conhecimentos, pelo nível de exigência e disponibilidade para me ajudar sempre

que necessário. Não esquecendo a sua simpatia e boa disposição.

Agradeço também ao Professor Dr. António Palavra por me ter proposto um tema tão aliciante de

mestrado e pela leitura da tese.

Agradeço ainda à Professora Paula Robalo pela simpatia e pelo uso do equipamento de microondas

e à Dra. Cecília Calado pelo uso do equipamento de espectrofotometria.

Agradeço ao Professor Amin Karmali, pela orientação e partilha de conhecimentos científicos sobre

microbiologia que foram indispensáveis para que este trabalho fosse concluído.

Agradeço ao meu namorado, Sérgio, pela paciência, disponibilidade e apoio nos bons e nos maus

momentos, por me motivar e acreditar em mim desde o início do meu percurso académico. Sem ele

este processo teria sido mais difícil.

Por fim, devo agradecer às pessoas mais importantes da minha vida, aos meus pais e à minha irmã,

pela sua dedicação, carinho, afeto, e apoio em todas as etapas que percorri, a sua disponibilidade e

preocupação diárias e os seus conselhos que influenciaram as minhas escolhas e me tornaram na

pessoa que sou hoje.

viii

Resumo

O crescente conhecimento das potencialidades do género Pinus na medicina tradicional,

nomeadamente das agulhas, têm promovido o estudo destas plantas.

O estudo de Pinus halepensis realizou-se através de extrações usando métodos

convencionais e não convencionais. Efetuou-se a hidrodestilação e a extração em Soxhlet com

metanol e hexano, onde se obtiveram rendimentos de 0,8% e de 15,3% e 16,3%, respetivamente.

Também foi realizada a extração supercrítica com CO2 (SFE) e extração por microondas. Na SFE

foram usadas diferentes condições de extração, obtendo-se um rendimento entre 0,88% e 1,79%.

A análise dos óleos obtidos foi efetuada por GC-FID sendo identificados treze compostos, nos

quais o β-Cariofileno, α-Pineno e α-Humulene estão presentes em maior quantidade.

Avaliou-se a atividade antioxidante e o teor de polifenóis dos diversos extratos e óleos

através dos métodos de DPPH e Folin-Ciocalteau. Considerando os rendimentos e por comparação

com o óleo essencial obtido os extratos conseguidos por Soxhlet apresentam maior poder

antioxidante e um maior teor em polifenóis. Os valores obtidos variaram entre 12,64 e 0,440

Trolox/mgextrato e entre 1215,2 e 602,6 µmol EAG/gextrato.

Para os óleos essenciais, avaliou-se o poder antimicrobiano contra Bacillus subtilis,

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus casei, Bacillus pumilus e Saccharomyces

cerevisiae, e antifúngico contra Ganoderma lucidium e Lentinula edodes. Verificou-se que os óleos

apresentaram atividade antimicrobiana contra todas as espécies microbianas exceto no caso da

Pseudomonas aeruginosa. Não apresentaram atividade antifúngica

A modelação matemática dos dados experimentais para os óleos voláteis obtidos da SFE foi

feita utilizando dois modelos, Sovová 1994 e Sovová 2005.

Palavras-chave: Pinus halepensis, óleo volátil, atividade biológica, atividade antioxidante,

polifenóis

x

Abstract

The importance and studies in the extraction from Pinus needles have increase due it too

different applications, namely in traditional medicine.

Extractions from Pinus halepensis have been carried out applying conventional and

unconventional methods. Hydrodistillation and Soxhlet extraction were performed with methanol and

hexane, yielding 0.8% and 15.3% and 16.3%, respectively. Supercritical CO2 and microwave

extractions have been used as comparison unconventional methods. Supercritical CO2 extraction and

microwave yields were obtained up to 1,79% and 0.8%, respectively.

GC-FID analysis (essential and volatile oils) were carried out being identified thirteen

compounds, in which the β-Cariofileno, α-Pineno and α-Humulene are present in higher quantities.

Antioxidant activity and polyphenols content on the extracts and oils through DPPH and Folin-

Ciocalteau method, were assessed. It was verified that the extracts obtained from Soxhlet presents

higher antioxidant activity and polyphenols content. The values obtained varied between 12,64 and

0,440 Trolox/mgextract and between 1215,2 e 602,6 µmol EAG/gextract, respectively.

Antimicrobial power against Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Lactobacillus casei, Bacillus pumilus and Saccharomyces cerevisiae, and antifungal power against

Ganoderma lucidium and Lentinula edodes, were tested. The values showed that the oils have

antimicrobial power against all species less Pseudomonas aeruginosa and do not present antifungal

power. Mathematical modeling of the data obtained by SFE was done applying two models, Sovová

1994 e Sovová 2005.

Keywords: Pinus halepensis, volatile oil, biological activity, antioxidant activity, polyphenols

xii

Abreviaturas e siglas

ABTS - 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfónico

ANOVA - Teste de análise da variância

BHT - Butil-hidroxitolueno

CI - Ionização química

CI50-Concentração que inibe 50%

CMI - Concentração Mínima Inibitória

DPPH - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

EI – Ionização de eletrões

EAG - Equivalentes de ácido gálico

FID – Ionização de chama

FSC – Fluidos supercríticos

GC - Cromatografia gasosa

CGL - Cromatografia gás-líquido

GC-MS - Cromatografia gasosa com detetor de espectrometria de massa

CGS - Comatografia gás-sólido

HD – Hidrodestilação

LOD - Limite de deteção

LOQ - Limite de quantificação

MAE- Extração assistida por micro-ondas

OMS – Organização Mundial de Saúde

PAM - Plantas Aromáticas e Medicinais

Pc- pressão supercrítica

Tc - temperatura crítica

Trolox - Ácido 2-carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano

SFE – Extração com fluidos supercríticos

xiv

Nomenclaturas

C- Concentração do soluto na fase fluída, kg.kg

-1

C0- Concentração do soluto na fase fluída, em t=0, kg.kg-1

C1- Constante do modelo 1 e 2

C2- Constante do modelo 1 e 2

e – Rendimento de extração, kg.kg-1

h – coordenada axial, m

H- Altura do leito de extração, m

k- Parâmetro de extensão do modelo de fluxo de pistão de Lack

K – Coeficiente de partição entre a concentração de soluto na fase sólida e gasosa

Kf – Coeficiente externo de transferência de massa, m.s-1

Ks – Coeficiente interno de transferência de massa, m.s-1

Mp – Massa inicial de planta no extrator, kg

q- Concentração de soluto na fase sólida, kg.kg-1

q0 – Concentração de soluto na fase sólida, em t=0, kg.kg-1

qk – Conteúdo inicial de soluto de difícil acesso no sólido, kg.kg-1

Q – Taxa de caudal fluido, kg.s-1

Qc – Coordenada do ponto de passagem entre a extração rápida e lenta, kg.kg-1

r- Fração inicial de soluto nas células fragmentadas

r0 – Fração inicial de soluto total e de soluto em células intactas

t- tempo, s

µ - Velocidade superficial do fluido supercrítico, m.s-1

z- Proporção dos parâmetros adimensionais do coeficiente externo de transferência de massa

zW – Coordenada axial adimensional entre a extração rápida e lenta

xi – Fração mássica de planta em cada peneiro

di – Diâmetro do peneiro

xv

Letras Gregas

α- Superfície do volume unitário de partículas, m-1

ɛ - Fração do leito vazio

ϒ – Razão entre a massa de solvente na matriz e no leito, kg.kg-1

ρf – Densidade do solvente

ρs – Densidade do sólido

Ʈ – Tempo adimensional

Ʈ m – Tempo adimensional onde se inicia o segundo período

Ʈn – Tempo adimensional onde se inicia o terceiro período

xvi

Índice

Prefácio .................................................................................................................................................ii

Declaração ........................................................................................................................................... iv

Agradecimentos .................................................................................................................................. vi

Resumo .............................................................................................................................................. viii

Abstract ................................................................................................................................................ x

Abreviaturas e siglas ........................................................................................................................... xii

Nomenclaturas .................................................................................................................................. xiv

Objetivos ..................................................................................................................................... 1 1.

Introdução ................................................................................................................................... 3 2.

Revisão da Literatura ................................................................................................................... 5 3.

3.1 Plantas Aromáticas e Medicinais ............................................................................................. 5

3.2 Óleos Essenciais ....................................................................................................................... 6

3.3 Género Pinus ........................................................................................................................... 7

3.3.1 Pinus halepensis .................................................................................................................. 8

3.3.1.1 Discrição Botânica ............................................................................................................... 9

3.3.1.2 Importância do Pinheiro de Alepo e suas Aplicações........................................................ 10

3.4 Métodos de Extração ............................................................................................................ 13

3.4.1 Extração Supercrítica com CO2 .......................................................................................... 13

3.4.2 Hidrodestilação.................................................................................................................. 15

3.4.3 Microondas ........................................................................................................................ 15

3.4.4 Sohxlet ............................................................................................................................... 16

3.5 Identificação dos principais componentes ............................................................................ 17

3.5.1 Cromatografia .................................................................................................................... 17

3.5.1.1 Cromatografia Gasosa (GC-FID) ......................................................................................... 17

3.6 Avaliação das Propriedades Antioxidantes ........................................................................... 18

3.6.1 DPPH .................................................................................................................................. 19

3.7 Determinação do Teor em Polifenóis .................................................................................... 20

3.8 Análise das propriedades antimicrobianas e antifúngicas .................................................... 22

3.9 Tratamento de Resultados e Análises Estatísticas ................................................................ 24

3.10 Modelação para a Extração Supercrítica ............................................................................... 24

3.10.1 Modelo 1 – Sovová 1994 ................................................................................................... 26

3.10.2 Modelo 2 – Sovová 2005 ................................................................................................... 28

Parte Experimental .................................................................................................................... 29 4.

xvii

4.1 Preparação da amostra: Determinação do tamanho de partícula e densidade ................... 29

4.2 Extração de Pinus halepensis................................................................................................. 29

4.2.1 Hidrodestilação.................................................................................................................. 29

4.2.2 Extração supercrítica ......................................................................................................... 30

4.2.3 Soxhlet ............................................................................................................................... 32

4.2.4 Microondas ........................................................................................................................ 32

4.3 Determinação dos compostos dos óleos .............................................................................. 33

4.3.1 GC-FID ................................................................................................................................ 33

4.4 Quantificação e caracterização dos extratos de P. halepensis .............................................. 33

4.4.1 Método do Radical Livre DPPH .......................................................................................... 33

4.4.2 Determinação do teor de Polifenóis ................................................................................. 34

4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana de Pinus halepensis ................................................. 34

4.5.1 Método de difusão de disco .............................................................................................. 35

4.5.2 Método de microdiluição em caldo .................................................................................. 36

Resultados e discussão .............................................................................................................. 37 5.

5.1 Determinação do tamanho de partícula e densidade de Pinus halepensis .......................... 37

5.2 Obtenção do óleo essencial de Pinus halepensis através do método convencional de

hidrodestilação .................................................................................................................................. 37

5.3 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de Soxhlet .... 38

5.4 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de Microondas

39

5.5 Obtenção do óleo volátil de P. halepensis através do método não-convencional com CO2

supercrítico ........................................................................................................................................ 40

5.6 Determinação dos compostos dos óleos por GC-FID ............................................................ 45

5.7 Quantificação e Caracterização de P. halepensis .................................................................. 47

5.7.1 Determinação do poder antioxidante por DPPH............................................................... 47

5.7.2 Determinação do teor de polifenóis ................................................................................. 49

5.8 Determinação da atividade antimicrobiana e antifúngica .................................................... 51

5.8 Modelação dos extratos supercríticos de P. halepensis ....................................................... 62

Conclusões e perspetivas futuras .............................................................................................. 67 6.

Referências ................................................................................................................................ 69 7.

Anexos ....................................................................................................................................... 76 8.

xviii

Índice de Figuras Figura 1: Constituintes dos óleos essenciais (Fonte: [[14]]) .................................................................... 7

Figura 2:Pinus halepensis Mill ................................................................................................................. 8

Figura 3: Representação das folhas (1), flores (2), frutos (3) e sementes (4) de P. halepensis ............ 10

Figura 4: Diagrama de fases pressão-temperatura de substâncias pura; (Fonte:[28]) ......................... 13

Figura 5:Reação do DPPH com espécies antioxidantes; (Fonte:[40]) ................................................... 19

Figura 6:Reação de substâncias redutoras com reagente de Folin-Ciocalteu. No exemplo, o ácido

gálico, em condição alcalina reage com o complexo fosfomolíbdico do reagente de Folin-Ciocalteu.

Na reação, há a mudança na cor, de amarelo para azul, indicando que houve redução do complexo

fosfomolíbdico; (Fonte:[45]) ................................................................................................................. 21

Figura 7: Montagem laboratorial da extração de óleo volátil de P. halepensis por hidrodestilação,

equipamento de Clevenger ................................................................................................................... 29

Figura 8:Esquema da instalação de SFE no IST. C-Garrafa de CO2; S1-Arrefeciemnto; F-Filtro; CP-

Bomba de circulação;BP-Regulador de pressão; M1-M4-Manómetros; S2-Permutador de calor; V-

Vaso de extração; SP1,SP2-Separadores; FL-Rotâmetro; DTM-Contador de gás seco ......................... 30

Figura 9: Equipamento de extração supercrítica com CO2 usado para extrair óleos voláteis de

extratos de folhas de P. halepensis ....................................................................................................... 30

Figura 10: Montagem laboratorial da extração por Soxhlet ................................................................. 32

Figura 11: Montagem Laboratorial da extração por microondas de óleo volátil de P. halepensis ...... 33

Figura 12: Extrato de P. halepensis obtido através da extração em Soxhlet ........................................ 38

Figura 13: Tonalidade da planta antes (2) e após (1) extração em Soxhlet com hexano e metanol .... 38

Figura 14: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo

para a respetiva P(bar) e T(ºC) .............................................................................................................. 41

Figura 15: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído em função da

mCO2/mplanta usada na extração supercrítica de P. halepensis para a respetiva P(bar) e T(ºC) ....... 41

Figura 16: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração

supercrítica de P. halepensis em função do tempo para a respetiva P(bar) e T(ºC) ............................. 42

Figura 17: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo

usando diferentes caudais de CO2 para a respetiva P(bar) , T(ºC) e caudal (L/min) ............................ 43


supercrítica de P. halepensis em função da massa de CO2 por massa de planta tendo em conta

diferentes caudais para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) ...................................................... 44


supercrítica de P. halepensis em função do tempo tendo em conta diferentes caudais para a

respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) ................................................................................................ 45

Figura 20: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o Trolox para a avaliação das

propriedades antioxidantes dos extratos de P. halepensis .................................................................. 47

Figura 21: Atividade antioxidante dos extratos de P. halepensis obtidos por extração em Soxhlet com

metanol e hexano .................................................................................................................................. 48

Figura 22: Poder antioxidante dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos

por hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) ........................................... 49

Figura 23: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o ácido gálico para determinação do

teor em polifenóis ................................................................................................................................. 49

Figura 24: Teor de polifenóis do extrato de P. halepensis obtido por extração em Soxhlet com

metanol e hexano .................................................................................................................................. 50

xix

Figura 25: Teor de polifenóis dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos por

hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min) .................................................. 51

Figura 26:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de

disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE

100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Ampicilina ....................................................................................... 52

Figura 27: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Escherichia Coli pelo método de

disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE

100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Gentamicina .................................................................................... 53

Figura 28:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus pumilus pelo método de

disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE


Figura 29: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lactobacillus casei pelo método de

disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE


Figura 30: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Pseudomonas aeruginosa pelo

método de disco, após 18h de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE

110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-Gentamicina ........................................................................ 56

Figura 31: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Saccharomyces cerevisiae pelo

método de disco, após 18h de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE

110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-Amphotericin B solubilized .................................................. 56

Figura 32:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Ganoderma lucidium pelo método

de difusão de disco após 1 semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-

SFE 110_50; E- 100_40; F-SFE 100_50; H-Amphotericin B solubilized .................................................. 57

Figura 33:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lentinula edodes pelo método de

difusão de disco após 1 semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-

SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-Amphotericin B solubilized ............................................ 58

Figura 34: Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição

em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de

extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e 50ºC, sem centrifugação .................................... 60

Figura 35:Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição

em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de

extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e 50ºC, após centrifugação ................................... 61

Figura 36: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os quatro

ensaios efetuados, nas condições de P(bar), T(ºC) e caudal constante de 8L/min .............................. 62

Figura 37: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios

efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais ............................................................ 62

Figura 38: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 2, Sovová 2005, para os quatro

ensaios efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e um caudal constante de 8L/min ......................... 63

Figura 39: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios

efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais ............................................................ 63

Figura 40: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de

100ºC e 150W durante 60minutos........................................................................................................ 79





xx

Índice de Tabelas

Tabela 1: Classificação Científica de Pinus halepensis Mill; (Fonte: [17]) .................................. 9

Tabela 2: Principais componentes dos óleos essenciais de P. halepensis de diferentes

origens reportados da literatura de agulhas, botões e galhos; (Fonte: [[6]])............................. 11

Tabela 3:Rendimentos e propriedades físico-químicas do óleo essencial das agulhas, cones

e hastes de P. halepensis provenientes da Tunísia; (Fonte: [9]) ................................................ 11

Tabela 4: Identificação de diferentes grupos de compostos em diferentes órgãos de P.

halepensis provenientes da Tunísia; (Fonte:[6])............................................................................ 12

Tabela 5:Distribuição quantitativa da amostra de P. halepensis nos diferentes peneiros ...... 37

Tabela 6: Condições operatórias para a extração de óleo essencial de P. halepensis por

microondas .......................................................................................................................................... 39

Tabela 7: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa

de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração

Supercrítica com CO2 ........................................................................................................................ 40

Tabela 8: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o processo

de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo volátil em

relação ao óleo obtido na hidrodestilação ...................................................................................... 42

Tabela 9: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa

de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração

Supercrítica com CO2 ........................................................................................................................ 43

Tabela 10: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o

processo de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo

volátil em relação ao óleo obtido na hidrodestilação .................................................................... 44

Tabela 11: Percentagem da composição do óleo essencial (EO) e óleo volátil (SFE) isolado

de P. halepensis ................................................................................................................................. 46

Tabela 12: Valores do poder antioxidante dos diferentes extratos obtidos a partir de P.

halepensis ............................................................................................................................................ 48

Tabela 13: Valores do teor de polifenóis dos diferentes extratos obtidos a partir de P.

halepensis ............................................................................................................................................ 50

Tabela 14:Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.

halepensis no crescimento de Bacillus subtilis através do método de difusão em disco ....... 52

Tabela 15: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P.

halepensis no crescimento de Escherichia coli através do método de difusão em disco ....... 53


halepensis no crescimento de Bacillus pumilus através do método de difusão em disco ...... 54


halepensis no crescimento de Lactobacillus casei através do método de difusão em disco; 55


halepensis no crescimento de Saccharomyces cerevisiae através do método de difusão em

disco...................................................................................................................................................... 57

Tabela 19: Condições operatórias usadas nos ensaios de microdiluição para Bacillus subtilis ............ 59

Tabela 20: Coeficientes de transferência de massa e respetivo desvio padrão para a

extração do óleo volátil de P. halepensis nas diferentes condições .......................................... 64

Tabela 21: Cálculo do coeficiente de transferência de massa externa usando a correlação

empírica proposta por Wakao e Kaguei [52] .................................................................................. 64

xxi

Tabela 22:Determinação do diâmetro de partícula de P. halepensis depois da sua trituração

e distribuição da mesma pelos diferentes peneiros com diferentes diâmetros ........................ 76

Tabela 23: Determinação da densidade aparente de P. halepensis .......................................... 76

Tabela 24: Dados para o cálculo das diferentes concentrações de óleos e de solvente para a

obtenção de uma concentração final de 60mg/mL ....................................................................... 77

Tabela 25: Determinação do rendimento da hidrodestilação com folhas de P. halepensis ................. 78

Tabela 26: Medições efetuadas e rendimentos obtidos na Extração com CO2 Supercrítico para a

obtenção do óleo volátil de P. halepensis ............................................................................................. 81

Tabela 27: Média dos valores de poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE

estudadas .............................................................................................................................................. 82

Tabela 28: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para o

poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE ................................................ 83

Tabela 29: Média dos valores de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE

estudadas .............................................................................................................................................. 84


teor de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE .................................................. 84

Tabela 31: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus subtilis e respetivos desvio

padrão e erros; ...................................................................................................................................... 85

Tabela 32:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para

Bacillus subtilis; ..................................................................................................................................... 86

Tabela 33: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Escherichia coli e respetivos desvio

padrão e erros; ...................................................................................................................................... 86

Tabela 34: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para

Escherichia coli; ..................................................................................................................................... 87

Tabela 35: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus pumilus e respetivos desvio

padrão e erros; ...................................................................................................................................... 87


Bacillus pumilus; .................................................................................................................................... 88

Tabela 37:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Lactobacillus casei e respetivos

desvio padrão e erros; ........................................................................................................................... 88


Lactobacillus casei; ................................................................................................................................ 89

Tabela 39:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de saccharomyces cerevisae e

respetivos desvio padrão e erros; ......................................................................................................... 89

Tabela 40:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para

saccharomyces cerevisae; ..................................................................................................................... 90

Tabela 41: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com

uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo

negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação ................................................................. 90


uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo





xxii






negativo e absorvância da amostra após centrifugação ....................................................................... 92










Tabela 49: Dados para o cálculo do kf teórico tendo em conta o método de Wakao e Kaguei ........... 93

1

Objetivos 1.

Este trabalho pretende estudar a planta Pinus halepensis proveniente da Tunísia, tendo em

conta:

i) Análise de diferentes métodos extrativos convencionais como a hidrodestilação em

Clevenger; solventes orgânicos em Soxhlet e métodos extrativos não convencionais

como a extração supercrítica e microondas a partir das suas folhas;

ii) Determinação e comparação dos diferentes rendimentos dos métodos;

iii) Identificação dos principais compostos presentes nos óleos por GC-FID e GC-MS;

iv) Avaliação das propriedades antioxidantes por DPPH;

v) Avaliação do teor de Polifenóis pelo método Folin-Ciocalteu;

vi) Avaliação das propriedades antimicrobianas e antifúngicas;

vii) Modelação do processo de extração com CO2 supercrítico.

Espera-se com este trabalho aumentar o conhecimento da composição e das propriedades

da planta Pinus halepensis da família Pinacacea e ainda potenciar as aplicações dos seus extratos.

3

Introdução 2.

O uso de plantas (inteiras ou as suas folhas, cascas, sementes e resinas) é tão antigo quanto

a história da humanidade, sendo utilizadas pelo homem como alimento, medicamento, na construção

de abrigos e até mesmo no seu aquecimento. Os efeitos benéficos para a saúde humana associados

ao uso de plantas, assim como dos seus óleos essenciais ou extratos, têm sido conhecidos desde a

antiguidade. [1]

Desde há 5000 anos que as plantas aromáticas são submetidas a processos de destilação

entrando em receitas de bálsamos, poções e em técnicas de prevenção e tratamento de doenças.[2]

Existem relatos do uso destas plantas pelos hindus e pelos egípcios em 2000 a.C.[1] Os egípcios

utilizavam os óleos essenciais, provenientes da destilação das plantas, em massagens para

embelezar e proteger a pele do clima árido e para embalsamar os mortos, mostrando que conheciam

as suas propriedades antissépticas. Estes conhecimentos foram-se difundindo de geração em

geração e as técnicas da extração destes óleos foram-se aperfeiçoando. Foi somente durante os

séculos XVI e XVII que os óleos essenciais tiveram as suas primeiras aplicações e sua introdução no

comércio. Posteriormente a aromaterapia cresceu rapidamente ao redor do mundo. O termo

"aromaterapia" teria sido criado por um químico francês, Maurice René de Gattefossé em 1937, que

após ter queimado as mãos as colocou, acidentalmente, num tanque que continha óleo essencial de

lavanda, pensando que fosse água. Para sua surpresa a dor passou e a cicatrização do ferimento

ocorreu sem infeção. A partir deste evento passou a investigar as atividades terapêuticas dos óleos

essenciais, que eram até então apenas usados como odorizantes e em produtos cosméticos.[3]

Atualmente tem-se verificado um interesse crescente pelos compostos bioativos das plantas,

nomeadamente os óleos essenciais, devido à ideia, generalizada, de que os produtos naturais

apresentam menor toxicidade e efeitos colaterais relativamente aos produtos sintéticos. [4]

Os óleos essenciais têm na sua constituição substâncias com um elevado valor comercial e

por isso possuem grande interesse industrial. Devido à sua importância e ao aumento do seu uso tem

havido um maior interesse, no meio científico, de desenvolver novos produtos e de comprovar as

suas propriedades como moléculas biologicamente ativas. Atualmente existem diversos trabalhos que

analisam e comparam as composições químicas dos óleos essenciais obtidos das mais diversas

fontes vegetais. Estes trabalhos, geralmente, são baseados em pesquisas a nível laboratorial usando

uma grande diversidade de espécies de plantas aromáticas e promovendo o desenvolvimento de

novos métodos para obtenção destes óleos essenciais com um elevado rendimento. [5]

O género Pinus pertence à família Pinacacea e ocorre naturalmente no hemisfério norte e têm

sido plantadas em algumas regiões do hemisfério sul. As propriedades medicinais e aromáticas dos

seus compostos químicos (nomeadamente resinas, óleos essenciais, terebentina, etc.) tornam-nas

numa das plantas mais importantes em toda a civilização. [6] O género Pinus é um género produtor

4

de madeira utilizado como matéria-prima para a produção de celulose e papel de qualidade superior,

chapas, laminados, móveis, tábuas ou ainda na construção de casas, caixotarias e pellets. Também

produz resinas cuja sua parte sólida é utilizada na produção de colas, vernizes, tintas e adesivos e a

fase líquida usada na indústria de solventes, fungicidas e germicidas.[7] Para além disso, este género

possui compostos voláteis, designados por óleos essenciais, que têm despertado, recentemente,

algum interesse devido à possibilidade do seu uso como aditivo natural para a substituição de

agentes antimicrobianos sintéticos por naturais e por possuir diferentes propriedades

farmacológicas.[6],[8]

No norte da bacia do mediterrâneo, Pinus halepensis é uma espécie pioneira e expansionista

que coloniza terrenos agrícolas abandonados caracterizados por uma elevada biodiversidade. Devido

à riqueza dos seus metabólitos secundários (terpenos, compostos fenólicos,..), P. halepensis pode

desempenhar um papel importante na sucessão de plantas através de vários processos. Por

exemplo, os compostos secundários podem afetar os simbiontes das raízes e a qualidade do local,

interferindo na decomposição, mineralização e humidificação.[6]

Vários estudos têm sido realizados em diversos países, nomeadamente relacionados com a

análise de compostos voláteis das agulhas de várias espécies de Pinus, mais especificamente os de

P. halepensis. A maioria destes ensaios foram feitos com espécies de P. halepensis provenientes da

América do Norte, e um número limitado de espécies do Mediterrâneo. Pesquisas em óleos

essenciais de espécies de Pinus encontram-se descritos uma vez que estes apresentam

propriedades terapêuticas, nomeadamente atividades antimicrobiana, antioxidante e herbicida. Estes

óleos também são usados como fragrâncias em cosméticos e aditivos aromatizantes para bebidas e

alimentos. Várias análises fitoquímicas de P. halepensis foram publicadas em terpenos, turpentina e

compostos fenólicos. A literatura relata alguns trabalhos sobre a composição química dos óleos

essenciais de P. halepensis provenientes de Itália, Argélia, Grécia, Marrocos e Turquia. [9],[8] [6]

Para que se possa desenvolver e explorar o potencial fitoquímico, farmacológico e agrotóxico

de P. halepensis é necessário que seja feito o estudo dos seus extratos bem como uma análise dos

seus componentes.

5

Revisão da Literatura 3.

3.1 Plantas Aromáticas e Medicinais

A expressão “Plantas Aromáticas e Medicinais - PAM” é utilizada indistintamente, como forma

de designar um grupo de plantas que se distinguem pelos seus fins e características. [10] São

consideradas PAMs, todas aquelas que podem ser usadas na cura ou prevenção de doenças, na

alimentação como conservante, aromatizante ou em cosmética e perfumes. As PAMs permaneceram

como principais agentes farmacêuticos até meados do século XX. Ao logo do século XX verificou-se

uma diminuição drástica da procura de PAMs. Esta diminuição está relacionada com a inovação

tecnológica e consequente desenvolvimento de produtos químicos sintéticos, que tiveram uma rápida

aceitação no mundo ocidental com desvalorização do uso de plantas em tratamentos. Porém a partir

de 2003 a procura aumentou devido, sobretudo, às alterações da consciência crítica humana

relativamente aos medicamentos de síntese química e aos benefícios de produtos bioativos à base

de plantas. Hoje em dia há uma maior procura de medicamentos à base de extratos vegetais, levando

a um maior investimento em estudos científicos, que envolvem a investigação das propriedades

terapêuticas das plantas. [11]

Cerca de 70% a 95% dos habitantes dos países em desenvolvimento, “principalmente, na

Ásia, África, América Latina e Médio Oriente”, utilizam-nas para os cuidados de saúde primários,

como apoio aos medicamentos tradicionais. Em alguns países desenvolvidos, o uso de medicação

tradicional é igualmente significativa, sendo cada vez mais utilizados no tratamento, prevenção e

manutenção da saúde pessoal, pois oferece benefícios terapêuticos e tratamentos mais

acessíveis.[12]

Na sua composição podem apresentar substâncias biologicamente ativas, tais como

saponinas, taninos, óleos essenciais, flavonoides, alcaloides e outros compostos complexos, com

propriedades curativas e que usualmente são encontrados nas mesmas como metabolitos

secundários. [12] A importância das plantas aromáticas e medicinais para produtos farmacêuticos,

indústrias de alimentos e fragrâncias é em parte devido a uma pequena fração, o óleo essencial.

Dependendo do método de extração usado, a composição do óleo essencial pode mudar levando a

desvios do odor natural da planta. [13] Devido à sua composição, têm sido utilizadas como fontes de

agentes terapêuticos através: i) do isolamento de compostos bioativos para o uso direto como drogas,

como por exemplo a digoxina, taxol e a morfina; ii) para a produção de compostos bioativos com

diferentes estruturas que permitam a síntese de compostos de entidades patenteáveis de maior

atividade ou de menor toxicidade; iii) para utilização como ferramentas farmacológicas; e iv) aplicação

da planta ou de algumas partes desta como medicamento.[12]

A Organização Mundial de Saúde (OMS) tem estimulado a utilização de plantas medicinais e

publicado vários relatórios com normas e guias de conservação, investigação e avaliação da

segurança e eficácia, controlo de qualidade, seleção de plantas medicinais e normas de

6

recomendação. Desta forma têm vindo a surgir cada vez mais produtos à base de plantas com

utilização em diversos sectores, nomeadamente na culinária, medicamentos, aromaterapia e

medicinas alternativas. [11]

Atualmente, as plantas aromáticas e medicinais têm um papel importante na indústria

cosmética, alimentar e farmacêutica. No entanto, existem informações sobre plantas medicinais que

ainda são desconhecidas e sendo estas uma fonte de compostos bioativos para a produção de novos

fármacos, é necessário investir na investigação para identificação destes constituintes ativos. [12]

3.2 Óleos Essenciais

Mais de 2000 espécies de plantas, de 60 famílias diferentes, permitem obter óleos essenciais

mas apenas cerca de 100 espécies são a base para a produção de óleos essenciais de importância

económica em todo o mundo. [4]

Os óleos essenciais, aroma ou essência, são os princípios odoríferos voláteis, produzidos

pelas plantas e são utilizados desde a antiguidade não só pelas suas propriedades medicinais

(antimicrobianas e antioxidantes), mas também pela sua importância na indústria de perfumes e

sabores. [4]

Os óleos essenciais são, em geral, uma mistura de compostos com características físico-

químicas próprias que quando combinadas, conferem ao óleo um odor particular. Estes possuem na

sua composição compostos naturais complexos e voláteis – os compostos terpénicos – que são

metabolitos secundários das plantas. Sendo misturas naturais muito complexas os óleos essenciais

podem conter cerca de 20-60 componentes em concentrações muito diferentes (Figura 1). [14]

Normalmente um óleo essencial é caracterizado por dois ou três componentes principais, em

concentrações bastante elevadas, em comparação com outros componentes, que por vezes estão

presentes em quantidades vestigiais. Geralmente, esses componentes principais determinam as

propriedades biológicas de determinado óleo essencial. Os monoterpenos são as moléculas mais

representativas de alguns óleos essenciais (às vezes constituindo cerca de 90 %). Já os

sesquiterpenos são uma grande família de produtos naturais que desempenham importantes papéis

ecológicos nas interações com os insetos e os microrganismos, pois atuam como atrativos ou

repelentes. Além disso estes compostos são os principais componentes de muitos óleos essenciais,

que são importantes comercialmente para as indústrias de aromas e fragrâncias. [4]

7

Figura 1: Constituintes dos óleos essenciais (Fonte: [[14]])

O tipo de material vegetal (folhas, caules, flores ou raízes), bem como o estádio de

desenvolvimento do órgão são dois fatores determinantes para a sua composição. Para cada espécie

em particular é importante escolher as melhores variedades e realizar um estudo detalhado sobre as

condições de cultivo, colheita e armazenamento, temperatura, tempo de destilação, produção de

biomassa e rendimento e qualidade do óleo essencial obtido. [14]

3.3 Género Pinus

O gênero Pinus pertence à família Pinacacea e compreende cerca de 250 espécies. É o

maior gênero de coníferas que ocorre naturalmente na região Mediterrânea, Caribe, Ásia, Europa,

América do Norte e América Central.[15]

São árvores perenes e resinosas que crescem até 3-80m de altura. Têm casca cinzenta

escura, frequentemente avermelhada, profundamente fissurada e áspera. As suas folhas são

apresentadas em grupos de 20-30 folhas que persistem em média um ano e meio. Apresentam

também flores masculinas com cerca de 1,5 cm de comprimento, dispostas em forma de cones. Os

pinheiros têm quatro tipos diferentes de folhas. As mudanças começam em primeiro lugar com um

verticilo de 4-20 folhas de sementes, seguidamente surgem folhas juvenis em plantas jovens com 2–

6 cm de comprimento de cor verde ou verde azulada arranjadas em espiral no broto. Estas são

posteriormente substituídas por folhas protetoras pequenas e não fotossintéticas a partir das folhas

https://pt.wikipedia.org/wiki/Semente

8

juvenis. Por fim as folhas protetoras dão origem a folhas adultas em forma de agulha, verdes e

enfaixadas em grupos de 2 a 5 agulhas. [7], [15]

O género Pinus possui diferentes propriedades farmacológicas e é amplamente utilizado na

prática terapêutica tradicional e como aditivo alimentar tendo uma elevada importância econômica.[8]

As suas agulhas apresentam propriedades anti-envelhecimento e anti-inflamatórias. Já as suas folhas

têm sido usadas para doenças do fígado, doenças de pele e hipertensão.[7]

Pinus é representado na Turquia por cinco espécies; nomeadamente P. brutia Tenore

(pinheiro turco), P. halepensis Mill (pinheiro de Alepo), P. nigra (pinheiro preto europeu), P. pinea L.

(pinheiro manso) e P. sylvestris L. (Pinheiro silvestre). [15]

3.3.1 Pinus halepensis

Pinus halepensis Mill pertence ao gênero Pinus da família Pinaceae. É a maior e mais

importante representante do género Pinus. A sua extensão continental estende-se do norte de África

(Marrocos, Argélia, Tunísia e Líbia) e Oriente Médio (Síria, Líbano, Jordânia, Palestina e Turquia) até

o sul da Europa Mediterrânea (Grécia Oriental, Croácia, norte de Itália, leste de França e leste de

Espanha).[16]

P. halepensis é conhecida pelas suas propriedades medicinais, bem como pela sua

importância econômica.[16] É usada para a produção de madeira e resina. A sua madeira é estável

mesmo com elevada humidade pelo que é usada para fins de construções, fabricação de móveis e

em menor escala para a fabricação de celulose e papel.[9]

Figura 2:Pinus halepensis Mill

9

Tabela 1: Classificação Científica de Pinus halepensis Mill; (Fonte: [17])

Reino

Plantae

Divisão

Spermatophyta

Sub- Divisão

Coniferophytina

Classe

Pinatae

Sub-Classe

Pinidae

Ordem

Pinales

Família

Pinaceae

Género

Pinus

Espécie

Pinus halepensis Mill

Nome Comum

Pinheiro-de-Alepo

3.3.1.1 Discrição Botânica

Pinus halepensis é uma árvore com cerca de 15 m de altura, resinosa com o tronco mais ou

menos tortuoso, copa sub-arredondada e ramos glabros. Possui 20 a 30 folhas em cada verticilo com

duração de mais ou menos 2 anos. Estas folhas estão agrupadas nas pontas dos ramos como

“pincel”, delgadas, primeiramente de cor azul-acinzentada e depois verde-escura, com 5-14 cm de

comprimento, com seção mais ou menos semilunar, ápice agudo e canais resiníferos junto da

superfície (Figura 3 - 1). Já o fruto tem a forma de um cone. (Figura 3 - 2). Os cones novos

apresentam uma cor verde-amarelada e os cones maduros uma cor acastanhada brilhante. Estes têm

cerca de 5-14 cm de comprimento e cerca de 3 cm de diâmetro, geralmente solitários, persistentes e

ovado-cônicos. Sobre o pedúnculo robusto, apontado para trás, com 1-2 cm de comprimento,

possuem escamas oblongas, mais ou menos angulosas com um disco pouco saliente e um múcron

ligeiramente saliente (Figura 3-3). As suas sementes são escuras, com cerca de 6 mm de

comprimento e ovado-oblongas e podem ser armazenadas por vários anos em embalagem

herméticas num lugar seco e frio. A germinação é sem pré-tratamento dentro de 15-30 dias. Não

precisa de micorrizas e podem ser plantadas diretamente no lugar definitivo ou em sacos plásticos

(Figura 3-4). [18]

Cresce relativamente bem em terrenos pobres de montanhas. Embora seja uma árvore de

fácil adaptação ao meio ambiente, não tolera climas extremamente frios e solos húmidos. Cresce

bem em climas com 400-800 mm de precipitação durante inverno, com 5-6 meses de seca, com

temperaturas de 2-34 °C e em altitudes de 1'500-2'500 m. Aguenta solos de textura ligeira até média

10

e com boa drenagem. É resistente ao frio, ao vento salgado e à seca e é moderadamente tolerante

ao fogo.[18]

Figura 3: Representação das folhas (1), flores (2), frutos (3) e sementes (4) de P. halepensis

3.3.1.2 Importância do Pinheiro de Alepo e suas Aplicações

O pinheiro de Alepo tem vários papéis ecológicos, socioeconômicos, terapêuticos e culinários.

A sua madeira tem um peso específico de 0,50-0,53 kg e tem uma durabilidade moderada. A

sua secagem e preservação é fácil pelo que pode ser utilizada para construções em geral e caixas.

Os troncos servem para postes de construção, para cercas e para lenha. É uma árvore resinosa que

é plantada muitas vezes para fins de proteção devido à forma do seu tronco. [18]

Este pinheiro possui óleos essenciais aromáticos que são um dos grupos mais importantes

dos componentes farmacologicamente ativos. São produzidos a partir do seu metabolismo

secundário e podem ser utilizados como aditivo alternativo em alimentos, bebidas, produtos

farmacêuticos, em preparações cosméticas e em produtos domésticos. [7]

Os principais componentes dos óleos essenciais de P. halepensis relatados na literatura

estão presentes na seguinte Tabela 2. [6]

1 2

3 4

11

Tabela 2: Principais componentes dos óleos essenciais de P. halepensis de diferentes origens reportados da literatura de

agulhas, botões e galhos; (Fonte: [[6]])

Origem da

Planta Argélia Grécia Itália Marrocos Turquia

Sítio Ghazaouet Saida Sidi

Feradj Tissemsilt Djefa

Método de

Extração HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD HD

Compostos % % % % % % % % % % % %

α-Pineno Nd 6,4 1,2 6,7 17,6 13,4 18,1 8,5 23,3 47,1 18,4 16,4

Sabineno Nd 0,7 1,2 7,0 2,6 1,3 9,4 6,1 3,7 Nd 0,1 0,6

β-Pineno Nd 5,6 0,2 2,0 1,6 1,1 2,0 1 3,1 2,8 46,8 18,7

Mircene Nd 0,5 3,1 8,7 3,2 6,6 27,9 1 16,3 6,3 1,3 3,8

3-Carene Nd 0,4 0,2 0,1 1,9 6,9 1,7 12,5 Nd 1,7 0,9 16,3

ρ-Cimeno Nd Nd Nd 0,3 3,0 Nd 1.1 1,0 0,7 0,4 Tr 0,1

Limoneno Nd 0,1 Tr 0,8 0,1 5,0 1.1 11,4 1,3 0,8 2,3 18,7

Terpinolene Nd 2,4 Nd Nd Nd Nd Nd 1,0 Nd Nd 0,3 1,8

Terpinen-4-ol 0,4 0,6 Tr Nd 0,6 0,7 Nd Nd 3,8 Nd Nd Nd

α-terpinolene Nd Nd 0,1 0,2 Tr 3,1 9,9 Nd 10,1 1 Nd Nd

E-β-cariofileno 3 Nd Nd 7,1 2,7 Nd Nd Nd Nd 11,2 9,2 9,5

α-humulene 0,74 10,5 7,9 2,8 1,4 3,4 2,9 Nd 3,2 2,7 1,8 1,8

Isovalerato de

2-feniletilo Nd Nd Nd 7,4 8,4 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd

Germacreno D Nd 0,8 0,5 0,2 Tr 0,5 0,1 Nd Nd tr 8,8 1,5

Óxido de

cariofileno 48,2 Nd Nd Nd Nd Nd 0,1 Nd 1,2 7,8 0,4 0,4

Bulnesol Nd Nd Nd Nd Nd 7,6 Nd Nd Nd Nd Nd Nd

Z-β-cariofileno Nd 25 40,3 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd

Aromadendeno Nd 5,4 7,1 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd

Óxido de

humuleno 6,7 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd

Thumbergol 8,3 Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd Nd

Nd-compostos não detetatos; tr- vestígios (>0,05%);

As diferenças encontradas na composição do óleo de P. halepensis coletada nos diferentes

países pode ser explicada pelo clima e condições do solo. [7],[19]

Tabela 3:Rendimentos e propriedades físico-químicas do óleo essencial das agulhas, cones e hastes de P.

halepensis provenientes da Tunísia; (Fonte: [9])

Órgãos Rendimento

(%)

Índice de

refração

Índice de

Acidez

Densidade Cor

Agulhas 0,85 ± 0,003 1,48 ± 0,0 1,76 ± 0,020 0,83 ± 0,0 Amarelo

Cones 0,80 ± 0,001 1,47 ± 0,0 2,40 ± 0,018 0,89 ± 0,0 Amarelo

Hastes 0,60 ± 0,005 1,48 ± 0,0 1,87 ± 0,001 0,87 ± 0,0 Transparente

12

Tendo em conta os diferentes órgãos foram até à data identificados 58 compostos nos óleos

provenientes das agulhas, 57 nos óleos provenientes dos cones e cerca de 27 nos óleos proveniente

das hastes. Dos 67 componentes identificados α-Pineno e β-Carofileno foram aqueles que foram

encontrados em maior quantidade em Argélia. Tendo em conta a Tabela 4 e considerando os

diferentes grupos de compostos, as hastes e os cones são constituídos na sua maioria por

hidrocarbonetos monoterpénicos (80,09% e 78,22% respetivamente) enquanto os monoterpenos

oxigenados e os hidrocarbonetos sesquiterpénicos estão presentes em menores quantidades. Por

outro lado, os hidrocarbonetos monoterpénicos (42,80%) e os hidrocarbonetos sesquiterpénicos

(48,29%) formam, em conjunto, a porção principal do óleo presente nas agulhas. [6]

Tabela 4: Identificação de diferentes grupos de compostos em diferentes órgãos de P. halepensis provenientes da Tunísia;

(Fonte:[6])

Agulhas Caules Hastes

Total identificado (%) 97,56 99,87 97,43

Hidrocarbonetos Monoterpénicos (%) 42,80 78,22 80,09

Monoterpenos Oxigenados (%) 1,31 3,08 1,13

Hidrocarbonetos Sesquiterpénicos (%) 48,29 15,82 6,42

Sesquiterpénicos Oxigenados (%) 5,16 2,75 9,78

A potencial atividade como herbicida de óleos essenciais do organismo de P. halepensis foi

avaliada através dos seus efeitos na germinação e crescimento de plântulas de S. arvensis, L.

rigidum e R. raphanistrum. Os resultados obtidos mostraram que os óleos essenciais de agulha, cone

e hastes inibiram completamente a germinação e o crescimento das plântulas de todas as plantas

daninhas testadas. [6] De igual modo a atividade antibacteriana, antifúngica e herbicida dos óleos

essenciais de P. halepensis foram em parte estudados. [6]

Os óleos essenciais isolados de agulhas, cones e caules de P. halepensis foram também

testados quanto à sua atividade antifúngica contra diversas estirpes. Os resultados da atividade

antifúngica mostraram ser significativamente reduzidos. Assim, parece que os óleos essenciais de P.

halepensis têm mais atividade bioherbicida do que biofungicida. [6]

Como uma fonte potencial de antimicrobianos de origem natural, os óleos essenciais foram

avaliados quanto aos seus efeitos inibitórios do crescimento de microrganismos patogênicos

(bactérias Gram-positivas e Gram-negativas). Foram registadas inibição contra diversos tipos de

bactérias nomeadamente L. monocytogenes, K. pneumoniae, E. faecalis, Acinetobacter baumanii. Por

outro lado mostrou-se ineficaz contra S. aureus, B. cereus, E. coli, Salmonella typhimurium e Proteus

mirabilis. Estes resultados mostram a possibilidade destes óleos apresentarem uma boa inibição

contra alguns microorganismos. [6]

13

3.4 Métodos de Extração

3.4.1 Extração Supercrítica com CO2

Devido ao elevado interesse da obtenção de produtos naturais biologicamente ativos, a

comunidade científica tem vindo a desenvolver tecnologias voltadas para o processo de extração

destes compostos. [20], [21], [22], [23]

De entre as tecnologias implementadas, a extração supercrítica proporciona a obtenção de

produtos isentos de resíduos tóxicos e de qualidade elevada quando comparadas aos produtos

obtidos por técnicas convencionais. [24], [25], [26]

O óleo obtido por esta técnica inovadora é atualmente designado por óleo volátil para o

distinguir do óleo essencial, o qual é por definição produzido principalmente pelas técnicas de

hidrodestilação e destilação por arrastamento de vapor.

Os processos de extração supercrítica consistem na separação de substâncias solúveis de

uma matriz sólida por contacto com um solvente que se encontra a temperaturas e pressões acima

do seu ponto critico. O ponto crítico de uma substância pura é definido como o ponto de diagrama de

fases onde termina a curva de equilíbrio líquido vapor e o menisco separando ambas as fases

desaparece e somente uma fase simples ocorre. Acima deste ponto temos apenas um fluido

homogéneo designado por

fluido supercrítico. [27]

Figura 4: Diagrama de fases pressão-temperatura de substâncias pura; (Fonte:[28])

A Figura 4 representa um diagrama de pressão e temperatura para substâncias puras. A

região no diagrama P-T acima da Pc e da Tc é chamada de região supercrítica. Nesta região, o fluido

supercrítico tem características termofísicas intermédias. Fluidos nestas condições supercríticas

exibem maior poder de solubilização e propriedades de transporte que aumentam as capacidades de

extração. Em particular, os fluidos supercríticos têm uma viscosidade menor e uma difusividade maior

Região

Supercrítica Líquido Sólido

Gás

Ponto Crítico

Pre

ssão

Temperatura

14

que os solventes líquidos. Portanto, eles podem penetrar os poros do material sólido mais

eficientemente do que os solventes líquidos. Diferentes substâncias têm diferentes pressões e

temperaturas críticas. Estas propriedades são importantes na seleção do fluido apropriado e as

condições de operação para qualquer aplicação em processos de SFE. [28]

Este processo consiste em duas etapas: a extração e a separação do extrato do solvente. Na

extração, o solvente supercrítico flui através de um leito fixo de partículas sólidas e dissolve os

componentes extraíveis do sólido. O solvente é alimentado no extrator e distribuído uniformemente na

entrada do leito fixo. O solvente e os componentes solúveis saem do extrator e alimentam o

separador onde se separam os produtos do solvente supercrítico. O método mais simples para a

regeneração do solvente consiste na redução da densidade por expansão, visto que a baixas

densidades o poder de solubilização do solvente diminui e os produtos precipitam. [20] O material

vegetal antes de ser submetido ao processo de extração é moído (triturado ou pulverizado) para

aumentar a área de superfície e promover uma boa mistura com o solvente, o que facilita o processo

de obtenção dos produtos naturais e aumenta a velocidade de extração. Por vezes, é sujeito

previamente a processos de pré-tratamento, como a secagem, de modo a evitar a sua degradação

por impurezas, microrganismos e exposição ao ar. [12]

Diversas substâncias foram utilizadas como fluidos supercríticos (FSC) nomeadamente o

etano, propano, butano, pentano, óxido nitroso, amoníaco, éter dimetílico, triflucrometano, água e

dióxido de carbono.[12] O solvente supercrítico de maior aplicabilidade é o dióxido de carbono por ser

não tóxico, de baixo custo, relativamente inerte do ponto de vista químico, e por apresentar condições

criticas (Tc=31,1ºC e Pc=72,9 bar) proporcionando temperaturas de processamento baixas e evitando

a degradação de produtos de alto valor acrescentado, características de interesse para as áreas de

alimentos, fármacos e de cosméticos. Finalmente, devido a ser uma molécula não polar, o CO2 é um

mau solvente de compostos polares contudo, através da adição de um composto polar, designado

por co-solvente, compostos polares podem também ser extraídos. O etanol e a água são os co-

solventes mais utilizados. [20]

A SFE usando dióxido de carbono é um método particularmente adequado para a extração de

materiais naturais a partir de plantas medicinais e aromáticas. A utilização destes processos

tecnológicos, comparativamente a outros métodos de extração convencionais permite: i) a utilização

de pequenas quantidades de amostra e de solventes orgânicos para extração; ii) a aplicação de CO2

supercrítico que não deixa resíduos prejudiciais no extrato; iii) a utilização de temperaturas mais

baixas e a ausência de ar possibilitam a conservação de estruturas dos compostos bioativos

presentes na planta. Escolhendo a pressão e temperatura ótimas, é possível precipitar os compostos

indesejáveis no primeiro separador e o óleo volátil no segundo. Outros parâmetros como tamanho de

partícula, tempo de extração e taxa de solvente influenciam o rendimento do processo e a qualidade

do óleo obtido. Todos estes parâmetros devem ser levados em conta para adquirir um conhecimento

completo do processo. [12], [27]

15

3.4.2 Hidrodestilação

A hidrodestilação é um método tradicional para a extração de compostos bioativos e de óleos

essenciais das plantas. [29] Existem três tipos de hidrodestilação: com imersão em água, com

imersão em água e injeção de vapor, e com injeção direta de vapor. Na hidrodestilação, o material

vegetal é imerso em água sob aquecimento até à fervura, resultando na formação de vapores que

arrastam os compostos voláteis, os quais, após condensação, se separam da fase aquosa por

decantação. A hidrodestilação envolve três processos físico-químicos principais: Hidrodifusão,

hidrólise e decomposição por calor. [30]

É um processo versátil que pode ser usado para pequenas ou grandes indústrias. A

hidrodestilação utilizando o aparelho Clevenger é o método oficial AOAC para a análise de óleos

voláteis e de especiarias. Vários investigadores usaram esta técnica para obter óleos essenciais de

diferentes fontes de plantas.[31] No entanto esta técnica tem algumas desvantagens como

modificações químicas e alteração da qualidade dos óleos essenciais e ainda perda de alguns

componentes voláteis devido às elevadas temperaturas de extração. Essa desvantagem limita o seu

uso para extração de compostos termolábeis.[32]

3.4.3 Microondas

A tecnologia de microondas tem sido recentemente aplicada para a extração de compostos

orgânicos. A extração por microondas tem vindo a ganhar destaque por apresentar um elevado

rendimento de produto extraído, curto tempo de extração e redução dos resíduos gerados. As

técnicas convencionais para a extração de matrizes sólidas consomem muito tempo e solventes e a

análise de numerosas amostras é limitada pela etapa de extração. O desenvolvimento de microondas

no campo da extração de compostos orgânicos ocorreu devido à necessidade de um método rápido,

seguro e barato para o estudo de um grande número de amostras. [33], [34]

Por favorecer, com maior precisão, o controle das condições do procedimento experimental

como tempo, temperatura e agitação magnética permite trabalhar em sistema fechado com frascos

vedados hermeticamente o que evita possíveis degradações térmicas e oxidação do material, por

exemplo. [33]

A extração assistida por microondas usa a energia proveniente de microondas para aquecer

solventes de forma rápida e eficiente. A matriz da planta já contém uma quantidade significativa de

água que absorve fortemente energias microondas o que causa o rompimento da célula, devido a um

superaquecimento interno, facilitando o processo de extração. Além disso a migração de iões

dissolvidos aumenta a penetração do solvente na matriz e consequentemente o rendimento de

extração.[35]

16

A radiação microondas possui uma frequência de 300-300000 MHz que provoca movimento

das espécies em solução pela migração de iões e/ou rotações de dipolo, causada pelo elevado

número de alterações do campo eletromagnético. Este mecanismo de aquecimento induzido vem da

interação entre as moléculas de solvente e da radiação eletromagnética gerada pelas microondas.

[35]

A utilização desta técnica tem-se mostrado promissora em diversos ramos industriais e

científicos. Este método possui certas vantagens como promover aquecimentos espacialmente

uniformes em menores intervalos de tempo, além de poder efetuar aquecimentos de forma seletiva,

dependendo de certas propriedades físico-químicas do material. Outra vantagem do processo é a

possibilidade da não utilização de solventes orgânicos ambientalmente agressivos. Em decorrência

dessas propriedades singulares, este método apresenta aplicação em processos como a dissolução

de soluções analíticas, no isolamento de analitos orgânicos, no pré-tratamento de amostras para

análises cromatográficas, na síntese de uma ampla gama de compostos orgânicos, na vulcanização

de borracha, no processamento de cerâmicos, na sinterização e na obtenção de óleos essenciais e

extratos vegetais. [36]

3.4.4 Sohxlet

De entre as metodologias de extração a quente, destaca-se a feita em equipamento tipo

Soxhlet. O primeiro aparelho foi desenvolvido por Franz Von Soxhlet em 1879 que ressaltou a

importância do grau de trituração da amostra quanto à duração e eficácia do processo. No processo

de liberação extrativa, têm-se em conta três etapas principais: a penetração do solvente no tecido; a

formação de uma micela intracelular e, a difusão do extrato na micela externa. Este método de

extração consiste no tratamento sucessivo e intermitente da amostra imersa num solvente puro (éter

de petróleo, éter dietílico ou n-hexano), devido à sifonagem e posterior condensação do solvente

aquecido dentro do balão que está na base do aparelho. [37] Este método possui vantagens e

desvantagens. Os principais inconvenientes que o método de Soxhlet apresenta são o tempo

requerido para a extração e o grande volume de solvente utilizado, o qual não é somente de alto

custo, mas também pode ser nocivo à saúde e ao meio ambiente. Já as principais vantagens que

apresenta são a amostra estar sempre em contato com o solvente, havendo a sua constante

renovação, a temperatura do sistema manter-se relativamente alta, visto que o calor aplicado para o

processo de evaporação é constante, é uma metodologia muito simples que não requer formação

especializada e que possibilita a extração de uma maior quantidade de óleo em relação a outros

métodos, sem a necessidade de filtração da micela após o término da extração, uma vez que a

amostra se encontra envolta num cartucho durante todo o procedimento. [37], [38]

17

3.5 Identificação dos principais componentes

3.5.1 Cromatografia

Entre os métodos de separação, a cromatografia tem grande aplicabilidade em áreas tão

diversas como ambiental, farmacêutica, análises clínicas, medicina legal e outras. A cromatografia

permite separar e quantificar componentes com características físico-químicas muito semelhantes,

tais como dioxinas e furanos, em misturas complexas. O limite de deteção obtido pela cromatografia

pode ser cerca de 100 a 1000 vezes menor que aquele obtido por outros métodos de separação. [39]

O processo de separação ocorre através da distribuição dos componentes da amostra entre

duas fases: uma fase fixa de grande área superficial (fase estacionária), que é percolada por um

fluido (fase móvel) numa direção definida. A fase móvel pode ser um gás inerte, um líquido ou um

fluido supercrítico, dependendo do tipo de cromatografia utilizada. A fase estacionária deve ser

imiscível com a fase móvel, podendo ser colocada numa coluna ou depositada numa superfície plana.

A fase móvel e a fase estacionária são escolhidas de modo a que os componentes da amostra se

distribuam entre elas de modo distinto. Os analitos fortemente retidos pela fase estacionária movem-

se mais lentamente na fase móvel e consequentemente são eluídos após os componentes com baixa

interação com a fase estacionária. Essa retenção seletiva dos componentes da amostra pela fase

estacionária é uma característica que resulta em migrações diferenciadas dos compostos de

interesse. De acordo com o estado físico da fase móvel utilizada, a cromatografia em coluna pode ser

classificada em cromatografia gasosa (gás inerte), cromatografia líquida (líquido) ou cromatografia

com fluido supercrítico (fluido no estado supercrítico). Com mais de um século de existência, a

cromatografia foi iniciada por Michael S. Tswett. [39]

3.5.1.1 Cromatografia Gasosa (GC-FID)

A cromatografia gasosa é uma das mais importantes técnicas analíticas disponíveis

atualmente. Num curto espaço de tempo tornou-se a principal técnica de separação e determinação

de compostos voláteis e/ou volatilizáveis. O excelente poder de resolução alcançado permite a

determinação de dezenas de diferentes compostos em matrizes complexas. Outra vantagem desta

técnica é que tem uma elevada sensibilidade e detetabilidade. A cromatografia gasosa pode ser

aplicada em amostras gasosas, líquidas ou sólidas, desde que os analitos sejam voláteis ou possam

ser volatilizados sem sofrer decomposição térmica. A cromatografia gasosa classifica-se, de acordo

com a natureza da fase estacionária, em cromatografia gás-sólido (CGS) e cromatografia gás-líquido

(CGL). A fase estacionária pode ser um sólido (CGS) ou um líquido imobilizado sobre um suporte

inerte (CGL), sendo que a CGL é a mais versátil e seletiva forma de cromatografia a gás, devido à

grande diversidade de fases líquidas disponíveis.[39]

18

A análise dos diferentes óleos (essencial e volátil) de P. halepensis foi efetuada usando a

cromatografia gasosa com deteção por espectrometria de massa (GC-MS), e à quantificação por GC-

FID determinando-se os diferentes constituintes dos mesmos.

A separação dos vários constituintes da amostra é feita na coluna: consoante são mais ou

menos adsorvidos ou absorvidos na fase estacionária, levarão mais ou menos tempo a percorrer a

coluna. A velocidade de progressão de um dado constituinte dependerá do caudal do gás de

arrastamento, da temperatura a que se encontra a coluna e da natureza da fase estacionária. À saída

da coluna encontra-se um detetor. O tipo de detetor mais usual na cromatografia gasosa é o de

ionização de chama (FID). Neste detetor, o gás que sai da coluna é misturado com uma quantidade

aproximadamente igual de hidrogénio e queimado numa atmosfera de ar. Os compostos orgânicos ao

serem queimados nestas condições produzem iões, dando origem à passagem de corrente entre dois

elétrodos situados na zona da chama.

Os constituintes dos óleos essenciais são identificados por comparação aos diferentes

padrões de fragmentação que se observam nos seus espectros de massa presentes em bibliotecas

de espectros, onde se relaciona os espectros obtidos das análises com os do banco de dados da

biblioteca. Existem bases de dados com espectros de massa de muitos componentes. A

cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massa permite realizar numa só operação, para uma

amostra da ordem de 1μL, uma análise quantitativa com uma indicação das proporções em que se

encontram os componentes. Quando se dispõe de substâncias padrão, a calibração do equipamento

permite uma análise quantitativa exata da amostra. No entanto esta técnica é geralmente

demorada.[5]

3.6 Avaliação das Propriedades Antioxidantes

O interesse por substâncias antioxidantes aumentou consideravelmente nos últimos anos

uma vez que moléculas que diminuem a peroxidação de lípidos podem minimizar ou inibir os danos

oxidativos causados ao ADN, proteínas e carboidratos causando envelhecimento e doenças

degenerativas, cancro, doenças cardiovasculares, cataratas e disfunções cerebrais, como Alzheimer

e Parkinson. [40] Devido à grande importância dada atualmente aos radicais livres e antioxidantes,

existe uma forte demanda por técnicas analíticas capazes de identificar e quantificar esses dois

grupos de compostos. [40]

Considerando a grande variedade de compostos com propriedades antioxidantes, alguns

métodos in vitro foram desenvolvidos para a avaliação da atividade anti-radicalar destas espécies.

Estes métodos empregam espécies radicalares estáveis em que a deteção do ponto final da reação

se realiza, geralmente, por medida da absorvância na região da radiação UV. Entre as metodologias

mais conhecidas para determinação da atividade antioxidante estão o DPPH (1,1-difenil-2-

picrilhidrazina) e o ABTS [2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfónico]. [40]

19

3.6.1 DPPH

O teste de DPPH é um dos métodos indiretos para se determinar a atividade antioxidante

mais antigo tendo surgido originalmente em 1950 para se descobrir os dadores de hidrogénio em

matérias naturais. Uma característica desse método é que ele não envolve condições drásticas de

temperatura e oxigenação. [41]

O método DPPH baseia-se na transferência de eletrões por ação de um antioxidante (AH) ou

uma espécie radicalar. O DPPH que possui cor púrpura é reduzido formando difenil-picril-hidrazina,

de coloração amarela. Devido à sua coloração, pode ser facilmente detetado por espectroscopia a

515nm devido à sua intensa absorção na região do visível. O método consiste em avaliar a

capacidade do DPPH reagir com dadores de hidrogênio, conforme apresentado na Figura 5. Na

presença de substâncias antioxidantes o mesmo recebe um H+ sendo então reduzido.[40]

Figura 5:Reação do DPPH com espécies antioxidantes; (Fonte:[40])

A capacidade de eliminar o radical DPPH (% de atividade antioxidante) é calculada utilizando a

seguinte equação:

𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐴𝑛𝑡𝑖𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 (%) =𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒(−)−𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎

𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒(−)× 100 (1)

Em que:

Acontrole(-)= absorvância da solução de DPPH sem a amostra;

Aamostra= absorvância da amostra com o DPPH.[40]

A percentagem de atividade antioxidante (%AA) corresponde à quantidade de DPPH

consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária para diminuir a

concentração inicial de DPPH em 50% é denominada por concentração inibitória (CI50). Quanto

maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua CI50 e maior a será a sua atividade

antioxidante. [41]

20

O método tem como vantagens ser de fácil execução, bastante reprodutível, permite a

avaliação de várias amostras em simultâneo diminuindo o tempo de ensaio. Outra vantagem

associada é o fato de ser possível realizar ensaios com baixas concentrações. No entanto, existe a

desvantagem de as moléculas de DPPH• serem muito volumosas, diminuindo desta forma o acesso

ao radical. [42]

De forma a uma melhor perceção dos resultados obtidos é frequente fazerem-se

comparações com antioxidantes de referência, sendo os mais utilizados o ácido ascórbico, o trolox e

o butil-hidroxitolueno (BHT). [42]

O trolox é um reagente que é facilmente adquirido e encontra-se disponível em forma de

cristais. Apresenta uma cor violeta bastante acentuada e é necessário evitar ou reduzir ao máximo a

sua exposição à luz, visto que a mesma provoca uma degradação do radical. [42]

3.7 Determinação do Teor em Polifenóis

Os polifenóis podem ser encontrados em quase todas as famílias de plantas e estão

concentrados no tecido foliar, na epiderme, na casca, flores e frutos tendo um papel biológico

importante nas plantas. Os polifenóis nos tecidos vegetais permitem a supressão e liberação de

hormonas de crescimento, como a auxina, permite a proteção da planta contra a radiação UV,

fornece “Propriedades sensoriais” para a sua proteção contra herbívoros, permitem a prevenção de

infeções microbianas e ainda participam no amadurecimento e outros processos de crescimento.[43]

Recentemente, os compostos polifenólicos ocupam um lugar de destaque na ciência

ambiental como importante classe de produtos naturais bioativos em todo o mundo. As suas

propriedades biológicas incluem efeitos anticancerígenos, antioxidantes e anti-inflamatórios. Estes

possuem também propriedades antimicrobianas e anti-carecinogénicas e ainda são uma fonte

importante, como agentes anti-infeciosos, contra patogénicos humanos resistentes a antibióticos. [43]

O monômero básico dos polifenóis é o anel fenólico e geralmente estes são classificados

como ácidos fenólicos e álcoois fenólicos. Dependendo da força do anel fenólico, os polifenóis podem

ser classificados em muitas classes, mas as classes principais nos polifenóis são os ácidos fenólicos,

flavonóides, estibinas, álcoois fenólicos e lignanas. Estes compostos são incorporados na dieta

humana e originários de plantas como frutas, legumes, cereais e café. [43]

Embora a determinação quantitativa de polifenóis seja prejudicada pela sua diversidade e

complexidade estrutural, vários métodos têm sido usados para determinar polifenóis em extratos de

plantas. Assumindo que a quantificação de polifenóis individuais não revela adequadamente a

proporção de procianidinas poliméricas, então a espectrofotometria na região ultravioleta pode ser

uma ferramenta útil para ajudar a resolver este problema.[44] As reações colorimétricas são

amplamente utilizadas no método espectrofotométrico UV/VIS, que é de fácil execução, rápido e de

21

baixo custo. No entanto, é importante que no ensaio colorimétrico se use uma substância de

referência para que este método possa medir, por comparação, a concentração total de grupos

hidroxila fenólicos no extrato da planta. Os polifenóis em extratos de plantas reagem com reagentes

redox específicos (reagente Folin-Ciocalteu) para formar um complexo azul que pode ser quantificado

por espectrofotometria de luz visível. O método de Folin-Ciocalteu é descrito em várias farmacopéias.

A composição química deste reagente inclui o ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) e ácido

fosfomolíbdico (H3PMo12O40), que são reduzidos a partir dos extratos ou substâncias testadas e que,

originalmente, possuem coloração amarela. Um meio com pH alcalino propicia que substâncias

redutoras, como as substâncias fenólicas, dissociem um protão levando à formação do anião

fenolato. Este anião é capaz de reduzir o reagente de Folin-Ciocalteu formando óxido de tungstênio

(W8O23) e óxido de molibdênio (Mo8O23). Estes óxidos possuem coloração azul que é detetável na

banda do espectro de 760 nm, possibilitando a quantificação dessas substâncias através da

espectrofotometria. [45]

Figura 6:Reação de substâncias redutoras com reagente de Folin-Ciocalteu. No exemplo, o ácido gálico, em condição alcalina reage com o complexo fosfomolíbdico do reagente de Folin-Ciocalteu. Na reação, há a mudança na cor, de amarelo para azul,

indicando que houve redução do complexo fosfomolíbdico; (Fonte:[45])

A absorção máxima dos cromóforos depende da solução alcalina e da concentração de

compostos fenólicos. No entanto, este reagente decompõe-se rapidamente em soluções alcalinas, o

que torna necessário o uso de um enorme excesso do reagente para obter uma reação completa.

Esse excesso pode resultar em precipitados e alta turbidez, impossibilitando a análise

espectrofotométrica. Para resolver este problema, Folin e Ciocalteu incluíram sais de lítio no

reagente, o que impediu a turvação. A reação geralmente fornece dados precisos e específicos para

vários grupos de compostos fenólicos, porque muitos compostos mudam de cor diferentemente

devido a diferenças na massa unitária e na cinética da reação. [44]

22

3.8 Análise das propriedades antimicrobianas e antifúngicas

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) aproximadamente 25% das mortes no

mundo inteiro são decorrentes de doenças causadas por microrganismos, sendo a segunda maior

causa de mortalidade mundial.[46]

O uso incorreto dos medicamentos antibacterianos e antifúngicos é descrito como um dos

principais responsáveis pelo aparecimento de microrganismos resistentes a medicamentos como

antibióticos, germicidas e desinfetantes. Isso ocorre principalmente pelo fato de as bactérias

apresentarem capacidade genética para adquirir e transmitir resistência contra esses agentes

antibacterianos atualmente disponíveis, assim como os fungos apresentarem mutações próprias, que

proporcionam o surgimento de estirpes resistentes. Esta problemática, atrelada às altas taxas de

resistência dos microrganismos, especialmente em ambientes hospitalares, justifica a urgência do

desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos e antifúngicos. As doenças infeciosas são

consideradas um grave problema de saúde pública, em virtude do impacto que geram à sociedade.

São provocadas por microrganismos patogênicos que invadem o organismo do hospedeiro, evitam as

suas defesas e provocam danos aos tecidos.[46],[47]

A utilização de extratos, oriundos de produtos naturais, com a finalidade de serem agentes

antimicrobianos pode ser uma via importante, já que se tem em vista que os mesmos são dotados de

uma reduzida possibilidade de ocasionar resistência microbiana, porque os mesmos são misturas

complexas, o que torna a adaptação dos microrganismos difícil. [46], [48]

A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da determinação de uma

pequena quantidade da substância necessária para inibir o crescimento do microrganismo-teste; esse

valor é conhecido como Concentração Mínima Inibitória (CMI). Um aspeto bastante relevante na

determinação da CMI de extratos vegetais é a preocupação em relação aos aspetos toxicológicos,

microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais ou as suas combinações.

Atualmente existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos

extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem o método de difusão em ágar, método de

macrodiluição e microdiluição. As variações referentes à determinação da CMI de extratos de plantas

podem ser atribuídas a vários fatores entre eles podemos citar a técnica aplicada, o microrganismo e

a estirpe utilizada no teste, a origem da planta, a época da colheita, se os extratos foram preparados

a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada. Assim, não existe um método

padronizado para expressar os resultados de testes antimicrobianos de produtos naturais.

O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico, no

qual um microrganismo é estimulado a crescer num meio de cultura sólido com uma substância

biologicamente ativa onde posteriormente se relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento

do microrganismo com a concentração da substância em estudo. A aplicação do método de difusão

23

limita-se a microrganismos de crescimento rápido, sendo eles aeróbios ou aeróbios facultativos. A

avaliação é comparada a um padrão biológico de referência (controlo positivo) e a zona ou halo de

inibição de crescimento é medida partindo-se da circunferência do disco ou poço, até a margem onde

há crescimento de microrganismos. De acordo com a dimensão do halo os microrganismos podem

ser classificados como: sensíveis, quando o diâmetro da zona de inibição é maior ou igual a 3 mm;

moderadamente sensíveis quando o halo é maior que 2 mm mas menor que 3 mm; e resistentes,

quando o diâmetro é menor ou igual que 2 mm. Como controlo positivo, aplica-se um quimioterápico

padrão, e como controlo negativo o solvente utilizado para a dissolução dos extratos. As condições

de incubação recomendadas são temperatura entre 35-37ºC para bactérias durante 24 a 48 horas e

para fungos de 25 a 27ºC por 48 a 72 horas. [46]. Estes ensaios quando utilizados para avaliação de

produtos naturais, extratos ou compostos isolados, não são quantitativos pois apenas indicam se

existe inibição de crescimento microbiano. Para obtenção de resultados mais fiáveis neste teste, os

diâmetros da zona de inibição podem ser associados com as concentrações inibitórias mínimas

(CMIs) com microrganismos conhecidos por serem suscetíveis ou resistentes a vários agentes

antimicrobianos. [12]

O método de diluição em caldo tem em conta a relação entre a proporção de crescimento do

microrganismo em meio líquido e a concentração da substância antimicrobiana in vitro. A avaliação é

comparada com um padrão biológico de referência. O método fornece resultados quantitativos e não

é influenciado pela velocidade de crescimento dos microrganismos. Uma desvantagem é a

dificuldade na deteção de contaminações no caso de teste de materiais clínicos. Como controlo

positivo, utiliza-se um caldo com um quimioterápico padrão com a suspensão padronizada de

microrganismo em teste, e como controlo negativo o meio de cultura com o solvente usado para

dissolução da amostra e a suspensão microbiana. Podem ser usadas duas metodologias: a macro e

a microdiluição. A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, com volume de meio de cultura

entre 1 e 10 mL. Este método é trabalhoso, consome muito tempo, requerer muito espaço no

laboratório e gera grande quantidade de resíduos. A microdiluição utiliza microplacas com 96 poços,

com volume de meio de cultura entre 0,1 e 0,2 mL.[49] No método de diluição em caldo a CMI pode

ser determinada por espectrometria, através da atividade antimicrobiana que pode ser determinada

em termos de percentagem de inibição, que é dada pela expressão (2):

% 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 =[1−(𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎−𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜)]

𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑜 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100 (2)

No qual a Aamostra é a absorvância do crescimento microbiano na presença do agente antimicrobiano,

Acontrolo negativo é a absorvância do agente antimicrobiano dissolvido no meio de cultura e Acontrolo positivo

que é a absorvância do inoculo normalizado em meio de cultura. Este resultado indica a percentagem

de células microbianas que o potencial agente microbiano testado poderá ser capaz de inibir. [12]

24

3.9 Tratamento de Resultados e Análises Estatísticas

Condições ambientais, diferenças nos equipamentos e valores de referência são fatores que

causam diferenças nos dados. Essas variações nos dados são aceitáveis num nível restrito, que é

definido na etapa de desenvolvimento do método. Um dos passos mais importantes no

desenvolvimento de métodos envolve a determinação dos limites de qualificação e quantificação. A

qualidade dos dados varia devido a mudanças de reagentes, equipamentos, métodos de calibração,

operadores e/ou analistas. Por isso, o Controle de Qualidade e Garantia de Qualidade foram

estabelecidas para garantir a integridade dos resultados. Dessa forma, as práticas analíticas

precisam de usar resultados qualificados por métodos de validação. Os limites de deteção (LOD) e de

quantificação (LOQ) são os valores mais importantes que os investigadores procuram quando

consideram a validade do método. Problemas com a deteção e quantificação de um analito podem

resultar da concentração da amostra, de efeitos de matriz ou outras condições, como sensibilidade do

instrumento e pureza do reagente. [50]

A determinação dos limites de deteção e quantificação é efetuada por um método que se

apoia em considerações estatísticas e que se baseia em determinados parâmetros da curva de

calibração. As diferenças significativas entre médias são identificadas com auxílio dos testes de

Tukey HSD, de Scheffé. Enquanto as correlações e a verificação de linearidade é conseguida através

do teste de Pearson. [42]

Para uma curva de calibração linear, assume-se que a resposta do instrumento y está

linearmente relacionada com a concentração padrão x para uma faixa limitada de concentração. O

modelo pode ser expresso por:

𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (3)

Este modelo é usado para calcular a sensibilidade b e o LOD e LOQ. Portanto, o LOD e LOQ podem

ser expressos como:

𝐿𝑂𝐷 = 3𝑆𝑎 (4)

𝐿𝑂𝑄 =10𝑆𝑎

𝑏 (5)

onde Sa é o desvio padrão da resposta e b é a inclinação da curva de calibração.[51]

3.10 Modelação para a Extração Supercrítica

A modelação dos dados experimentais da extração supercrítica de óleos voláteis proveniente

de plantas aromáticas é importante, pois pode ser usado como uma ferramenta para o

dimensionamento, melhoria e ampliação desde o processo a nível laboratorial até ao processo numa

escala piloto e industrial. [22]

25

Vários modelos têm sido propostos na literatura para descrever a extração de óleos voláteis

com fluídos supercríticos. Para o projeto e otimização de processos de extração SFE, é necessário

conhecer as características da matéria-prima (concentração inicial do soluto na matriz da planta, a

composição da mistura do soluto, a humidade e pré-tratamentos, como secagem e moagem), os

parâmetros utilizados no processo de extração (pressão, temperatura, caudal do solvente) e os dados

de equilíbrio da fase fluida.[52]

Os modelos matemáticos disponíveis para descrever a extração de solutos de matrizes

sólidas utilizando fluidos supercríticos são classificados em quatro grupos principais: modelos

empíricos, modelos baseados em analogias de transferência de calor, modelo de núcleo encolhido e

modelos baseados em balanços de massa diferenciais. [52]

Os modelos mais bem-sucedidos nessa área científica descrevem o processo experimental

utilizando balanços de massa diferenciais para as fases fluida e sólida, como os propostos por

Reverchon e Sovová. [52] Estes modelos têm em consideração algumas características da matriz

vegetal, nomeadamente o tamanho das partículas e a porosidade do leito. Embora seja necessário

determinar vários coeficientes, estes modelos refletem os mecanismos por trás do processo de

extração (relações de equilíbrio e mecanismos de transferência de massa) [22], [52]

Todos os modelos matemáticos utilizados baseiam-se em algumas hipóteses gerais: i)

embora o leito sólido seja composto por partículas com um soluto multi-componente, assume-se que

o comportamento de todos os compostos extraídos é semelhante e podem ser descritos por um único

componente, uma vez que tendo em conta estudos anteriores foram obtidas composições

semelhantes para as amostras de extrato coletado sucessivamente, mostrando que as mudanças na

composição não eram significativas; ii) os gradientes de concentração na fase fluida desenvolvem-se

em escalas maiores que o tamanho da partícula; iii) o caudal do solvente é uniformemente distribuído

em todas as secções do extrator e a porosidade não é afetada durante o tempo de extração; iv) a

queda de pressão e os gradientes de temperatura dentro do extrator são desprezados e o leito sólido

é considerado homogêneo em relação à concentração inicial do soluto e ao tamanho de partícula; v)

o solvente é livre de soluto na entrada do extrator e flui axialmente através do leito do material vegetal

moído. [52]

A equação diferencial do balanço de massa considerando o fluxo de pistão é:

𝜕𝐶

𝜕𝑡+

𝑢𝜕𝐶

𝜀𝜕ℎ+

(1−𝜀)

𝜀

𝜌𝑠

𝜌𝑓

𝜕𝑞

𝜕𝑡= 0 (4)

E o rendimento de extração é:

26

𝑒 =�̇�

𝑡∫ 𝐶(ℎ = 𝐻)𝑑𝑡𝑡

0 (5)

Assume-se que as concentrações são homogêneas em ambas as fases através das seguintes

condições iniciais:

𝑞(ℎ, 𝑡 = 0) = 𝑞0, 𝐶(ℎ, 𝑡 = 0) = 𝐶0

E a condição de fronteira:

𝐶(ℎ = 0, 𝑡) = 0

3.10.1 Modelo 1 – Sovová 1994

O modelo de fluxo em pistão de Lack, desenvolvido por Sovová (1994) para a extração

supercrítica de óleo de sementes moídas, supõe que uma parte do soluto nas partículas da planta

obtida por moagem se encontra em células fragmentadas, facilmente acessíveis durante a extração,

e o resto do soluto se encontra inacessível em células intactas. A equação (6) descreve a extração do

soluto que se encontra acessível, controlada por transferência de massa externa: [52]

𝜕𝑞

𝜕𝑡= −

𝑘𝑓𝑎𝜌𝑓

𝜌𝑠(𝐶0 − 𝐶) para 𝑞 ≥ 𝑞𝑘 (6)

Presume-se que a concentração da fase fluida de equilíbrio, C0, seja igual à solubilidade do

óleo no solvente. Quando a concentração da fase sólida local é reduzida para q=qk, a extração das

células intactas começa, sendo esta controlada pela transferência de massa interna e traduzida por:

[52]

𝜕𝑞

𝜕𝑡= −𝑘𝑠𝑎𝑞 para 𝑞 < 𝑞𝑘 (7)

Assume-se uma concentração zero na superfície da partícula e posteriormente despreza-se o

termo de acumulação (𝜕𝐶 𝜕𝑡⁄ ) na equação (4). Procede-se a uma manipulação adicional baseada na

suposição de que extrato em solvente supercrítico é de baixa solubilidade. Assim, é obtida uma

aproximação analítica das equações (4), (5), (6) e (7).

27

𝑒 =

{

(

𝑞𝑘𝜏

𝑍) [1 − 𝑒𝑥𝑝(−𝑍)], 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏 < 𝜏𝑚

(𝑞𝑘𝜏

𝑍) [𝜏 − 𝜏𝑚𝑒𝑥𝑝(𝑍𝑤 − 𝑍)], 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏𝑚 ≤ 𝜏 < 𝜏𝑛

𝑞0 − (𝑞𝑘

𝑘𝑍) 𝑙𝑛{1 + [𝑒𝑥𝑝(𝑟0𝑘𝑍) − 1]

𝑒𝑥𝑝[𝑘(𝜏𝑚−𝜏)]

𝑟0, 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏 ≥ 𝜏𝑛

(8)

Onde o tempo adimensional é dado por:

𝜏 =𝑘𝑓𝑎𝜌𝑓𝐶0

𝜌𝑠𝑞𝑘𝑡 (9)

A relação dada entre o soluto total e o soluto das células intactas é dada por:

𝑟0 =𝑞0

𝑞𝑘 (10)

e onde Z é um termo adimensional proporcional ao coeficiente de transferência de massa externa

dado por:

𝑍 =𝑘𝑓𝑎𝑀𝑝

𝑄

𝜌𝑓

𝜌𝑠 (11)

A curva de extração consiste em três regiões. Na primeira região, que é controlada pela resistência

do filme de solvente, ocorre a extração do soluto acessível a 𝜏 ≥ 𝜏𝑚:

𝜏𝑚 = 𝑟0 − 1 (12)

Depois das partículas soltarem o soluto acessível, o CO2 difunde-se dentro delas para extrair o soluto

mais profundo, enquanto, a jusante dessa região, o soluto acessível continua a ser removido. As

dimensões da fronteira entre as regiões com e sem soluto facilmente acessível são dadas por:

𝑍𝑤 =1

𝑘𝑟0𝑙𝑛

𝑟0 𝑒𝑥𝑝[𝑘(𝜏−𝜏𝑚)]−1

𝑟0−1, 𝑝𝑎𝑟𝑎 𝜏𝑚 ≤ 𝜏 ≤ 𝜏𝑛 (13)

𝑘 =𝑘𝑠𝜌𝑠𝑞𝑘

𝑘𝑓𝜌𝑓𝐶0 (14)

A terceira e a última etapa corresponde à extração do soluto dentro das partículas, que é controlado

pela resistência interna de transferência de massa, e começa no tempo adimensional.

𝜏𝑛 = 𝜏𝑚 +1

𝑘𝑙𝑛

1+𝜏𝑚𝑒𝑥𝑝[𝑘(𝑟0𝑘𝑧)]

1+𝜏𝑚 (15)

Este modelo apresenta três parâmetros de transferência de massa ajustáveis, sendo eles k f, ks e r0.

[50]

28

3.10.2 Modelo 2 – Sovová 2005

A extensão do modelo de fluxo pistão de Lack para extração de óleos vegetais foi

posteriormente modificado por Sovová em 2005 para permitir a sua aplicação a diferentes tipos de

equilíbrio de fases e diferentes padrões de fluxo. As equações para o balanço de massa para a fase

sólida foram escritas separadamente para células intactas e fragmentadas, assumindo o coeficiente

de transferência de massa interna para determinar o transporte de células intactas para células

fragmentadas e o coeficiente de transferência de massa externa para controlar o transporte de

células fragmentadas para solvente. Agora no modelo, o parâmetro r é fração inicial de soluto nas

células fragmentadas e é dado por: [52]

𝑟 = 1 −𝑞𝑘

𝑞0 (16)

Foram propostas expressões aproximadas para curvas de extração para casos particulares

de fluxo de pistão e misturador ideal em combinação com diferentes relações de equilíbrio de fase. As

expressões consistem em duas partes, a primeira é válida para o período inicial, quando a extração

de células fragmentadas prevalece, e a segunda é válida para o período final controlado pela difusão

interna. Neste modelo, a expressão usa o sistema fluxo pistão, a relação de equilíbrio linear e

despreza a resistência de transferência de massa externa. [52]

𝑒 = �̇�𝑞0

𝐾+𝑦

𝑟

𝑝𝑎𝑟𝑎 0 ≤ �̇� ≥ 𝑄�̇�,

𝑒 = 𝑞0[1 − 𝐶1exp (−𝐶2𝑄)̇ ] 𝑝𝑎𝑟𝑎 �̇� > 𝑄�̇� (17)

Onde y é a razão entre a massa de solvente na matriz e no leito:

𝑦 =𝜌𝑓𝜀

𝜌𝑠(1−𝜀) (18)

Este modelo ainda possui dois parâmetros de transferência de massa ajustáveis, ks e r, que

são estimados a partir das constantes C1, C2, K e da coordenada �̇�c no ponto de cruzamento entre a

primeira e a segunda parte da curva de extração: [52]

𝑟 = 1 − 𝐶1exp (−𝐶2𝑄𝑐)̇ (19)

𝐾𝑠𝑎 =(1−𝑟)𝐶2

1−(1−𝑟)𝐾𝐶2

𝑄

𝑀𝑝 (20)

29

Parte Experimental 4.

4.1 Preparação da amostra: Determinação do tamanho de partícula e densidade

As folhas de Pinus halepensis foram colhidas em março de 2018 na Tunísia.

Estas foram posteriormente limpas e secas à temperatura ambiente e ao abrigo de luz num

local seco. Depois de secas, as folhas foram mantidas a -20ºC antes de se proceder à sua trituração.

A trituração foi efetuada com o auxílio de um moinho de lâminas (IKA WERKE M20) evitando a perda

de partículas de dimensões menores aquando da abertura do moinho. Por fim, a planta (com um teor

de humidade de aproximadamente 6%) foi sujeita a um sistema de peneiração (C.I.S.A Barcelona),

constituído por 8 compartimentos com diferentes diâmetros (1mm, 0,8mm, 0,63mm, 0,5mm, 0,4mm,

0,315mm, 0,2mm e 0,1mm) de forma determinar o diâmetro médio de partícula. (Anexo A) A

densidade aparente de P. halepensis foi determinada recorrendo a uma balança e a uma proveta.

(Anexo B)

A planta foi usada sempre nas mesmas condições.

4.2 Extração de Pinus halepensis

4.2.1 Hidrodestilação

A primeira técnica de extração realizada foi a hidrodestilação, recorrendo a um método

clássico de comparação, num equipamento Clevenger, com o objetivo de se obter óleo essencial de

P. halepensis.

O balão de fundo redondo, com capacidade para 1L, foi carregado com aproximadamente

100g de planta e 500mL de água destilada. O ensaio decorreu por um período de três horas, de

acordo com a montagem da figura seguinte.

Figura 7: Montagem laboratorial da extração de óleo volátil de P. halepensis por hidrodestilação, equipamento de Clevenger

30

4.2.2 Extração supercrítica

A segunda técnica de extração realizada foi a extração supercrítica, com o objetivo de se

obter óleo volátil de P. halepensis, tendo-se utilizado um equipamento existente no Laboratório de

Baro/Biotecnologia do Instituto Superior Técnico (IST). Nas Figuras 8 e 9 é apresentado,

respetivamente, o esquema e a fotografia do equipamento.

Figura 8:Esquema da instalação de SFE no IST. C-Garrafa de CO2; S1-Arrefeciemnto; F-Filtro; CP-Bomba de circulação;BP-

Regulador de pressão; M1-M4-Manómetros; S2-Permutador de calor; V-Vaso de extração; SP1,SP2-Separadores; FL-

Rotâmetro; DTM-Contador de gás seco

Figura 9: Equipamento de extração supercrítica com CO2 usado para extrair óleos voláteis de extratos de folhas de P.

halepensis

O CO2 (com uma pureza de 99,995%) proveniente de uma garrafa (C) é comprimido numa

bomba de diafragma (CP - Milton Roy model Milroyal B) e pré-aquecido num permutador de calor

(S2) antes de entrar no vaso de extração (V, 1L). A pressão é controlada por um regulador de

31

pressão (BP - Tescom Corporation model 26-1722-44-043) e medida num manómetro (M2, 0.7bar -

do tipo Bourdon). A temperatura do sistema, nomeadamente no vaso foi alcançada com a ajuda de

uma camisa de água sendo controlada através da sua medição em três pontos diferentes do vaso

(Topo, Base e Centro). O fluído supercrítico depois de atravessar a nossa matriz a extrair, é

descomprimido em dois separadores (SP1 e SP2 com 0,27L), sequenciais, permitindo o

fracionamento do extrato obtido, separando os compostos mais pesados como as ceras e outros do

óleo volátil obtido no segundo separador. A pressão correspondente aos dois separadores é

controlada em dois manómetros (M3, - Bourdon) (M4, - Bourdon). A temperatura no primeiro e no

segundo separador é controlada por banho termostático. O caudal de gás e volume total utilizado é

medido com um rotâmetro (FL) e um contador de gás seco (DTM - American Metter Company, model

DTM-200A), respetivamente. [28]

Foram realizadas seis extrações supercríticas. As condições estudadas foram com um caudal

constante de aproximadamente 8L/min a:

90bar e 40˚C;

100bar e 40˚C;

110bar e 50˚C;

100bar e 50˚C;

E para uma pressão e temperatura constante de 90bar e 40ºC foram estudados os caudais

aproximados de:

8L/min;

6L/min;

12L/min;

Um tubo de aço que se ajustava perfeitamente ao extrator foi utilizado para introduzir a nossa

matriz a extrair, facilitando o processo de limpeza e enchimento do vaso de extração. No fundo do

tubo de aço, e como filtro foi colocado uma quantidade de algodão, um esfregão de aço, algumas

esferas de vidro e outra quantidade e algodão até se obter uma altura de leito de 24cm. De seguida,

preencheu-se o tubo de extração com cerca de 70g de amostra (P. halepensis) seca, sempre

intercalada com esferas de vidro, e tapou-se com outro esfregão de aço para o seu isolamento, de

forma a não existir arrastamento de partículas sólidas da planta para fora do tubo. As esferas de vidro

entre as 70g de planta são colocadas para evitar a formação de aglomerados permitindo assim o

aumento da área de contacto com o CO2 para uma melhor extração dos óleos voláteis. Introduziu-se

o tubo de extração dentro do vaso de extração. Estabilizaram-se as condições de trabalho (pressão e

temperatura) para a obtenção das condições supercríticas. Iniciou-se o ensaio com a abertura das

válvulas V7, V8 e V9 fazendo-se variar as condições de estudo. A descompressão do CO2 foi

efetuada em dois passos sucessivos, a 70bar e -18ºC no separador SP1, e de seguida para o

separador a SP2, a 20 bar e 16ºC, sendo finalmente Libertado para a pressão atmosférica na válvula

V2. O ensaio continuou com a medição de vários pontos, onde se registou o volume total de CO2, o

32

tempo decorrido e a massa recolhida no SP2. A massa foi recolhida à pressão atmosférica e a uma

temperatura controlada por banho de gelo e sal no SP1 (aproximadamente -18˚C) e a um banho de

água tépida em SP2.

4.2.3 Soxhlet

A extração em Soxhlet foi realizada com a amostra de planta após extração supercrítica nas

condições de 90bar, 40ºC e um caudal de CO2 de 8L/min. Este método de extração foi realizado com

hexano e metanol com o objetivo de se obter os compostos lipídicos apolares e polares do extrato de

P. halepensis respetivamente.

Para tal, procedeu-se ao enchimento do cartucho com aproximadamente 12,55g de planta.

Usou-se um volume inicial de 250mL de hexano (Panreac) e posteriormente 250mL de metanol

(Panreac).

O ensaio decorreu por um período de três horas. Na Figura 10 é apresentado a instalação do

processo de extração Soxhlet.

Figura 10: Montagem laboratorial da extração por Soxhlet

4.2.4 Microondas

A extração em microondas foi realizada com o objetivo de obter óleos essenciais e analisar o

seu rendimento de extração em relação aos métodos anteriormente descritos.

Para tal, procedeu-se ao enchimento do balão de fundo redondo com capacidade de 100mL

com aproximadamente 15g de planta seca e 60mL de água destilada. O ensaio decorreu por um

33

período de uma hora com uma potência de 100W e uma temperatura limite de 108ºC em sistema

aberto, utilizando o sistema de Clevenger, adaptado para este sistema de aquecimento. Na Figura 11

é apresentado a instalação do processo de extração por microondas.

Figura 11: Montagem Laboratorial da extração por microondas de óleo volátil de P. halepensis

4.3 Determinação dos compostos dos óleos

4.3.1 GC-FID

Os óleos essenciais e voláteis, obtidos respetivamente por hidrodestilação e extração

supercrítica foram analisados por GC-FID de forma a quantificar os diferentes compostos presentes e

avaliar as diferenças entre os dois tipos de óleo.

Na análise cromatográfica gasosa utilizou-se uma coluna DB-1 (id de 30m x 0,25mm,

espessura de filme de 0,25mm; J & W Scientific Inc). Durante a análise, a temperatura do forno foi de

40°C durante 2min, posteriormente a temperatura foi aumentando cerca de 3ºC/min até que fosse

atingida uma temperatura de 230°C. Por fim, aumentou-se o incremento para 5°C/min até serem

atingidos os 310°C. Esta temperatura final foi mantida isotermicamente durante 15minutos. As

temperaturas do injetor e detetor foram de 310°C, sendo o gás de arraste, hélio, ajustado para uma

velocidade linear de 24cm/s. Os compostos foram identificados com base nos seus índices de

retenção, em relação a uma mistura de n-alcanos C9 – C20, num detetor de FID e amostras padrão

em GC-MS.

4.4 Quantificação e caracterização dos extratos de P. halepensis

4.4.1 Método do Radical Livre DPPH

O poder antioxidante das amostras foi determinado de acordo com o descrito na literatura

[16], [53], com algumas alterações, recorrendo ao leitor de microplacas (BioTek Synergy 2).

34

Inicialmente foram utilizadas soluções de Trolox (Sigma Aldrich 98%) para uma gama de

concentrações de 20 a 280μg/mL, como antioxidante de referência para a realização da curva de

calibração.

Para tal foram utilizadas microplacas NUNC-96 de fundo plano onde 30μL de cada amostra

de Trolox com diferentes concentrações (20, 30, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 180, 220, 260 e 280µg/L)

dissolvidas em metanol foram misturadas com 270µL de solução de DPPH (4mM, 100μL). A mistura

reacional foi incubada sem exposição à luz durante 40minutos tendo sido lida num leitor de

microplacas, após ao período de incubação, a 515nm. De forma simultânea, foram efetuadas

medidas do branco, constituído apenas pelo solvente (neste caso, por metanol) e do controlo

constituído por 30μL de metanol e 270μL de DPPH.

Para a medição da atividade antioxidante dos nossos extratos o processo foi igual ao anterior

havendo a substituição das amostras de Trolox pelas amostras obtidas pelos processos descritos

anteriormente também dissolvidas em metanol.

Foram efetuados quadruplicados de cada concentração.

4.4.2 Determinação do teor de Polifenóis

A determinação do teor de polifenóis foi efetuada com base no método de Folin-Ciocalteu

com algumas alterações. [44], [53],[54]

Para tal recorreu-se a placas NUNC-96 e um leitor de placas (BioTek Synergy 2).

Inicialmente, as amostras de extratos e de óleos foram dissolvidas em metanol. Depois procedeu-se

ao teste do seu teor em polifenóis recorrendo-se ao seguinte procedimento: Pipetaram-se 30μL de

cada amostra para cada poço. De seguida, adicionaram-se 150μL de reagente Folin-Ciocalteu

(previamente diluído em água destilada, 1:10v/v). Deixou-se em repouso durante 4 minutos e

adicionaram-se 120μL de solução de carbonato de sódio (previamente preparado, 75g/L). Deixou-se

em repouso durante 30 minutos a 40ᵒC e efetuou-se a sua leitura a 765nm. Foram efetuados

quadruplicados de cada amostra.

De forma simultânea, foram efetuadas medidas ao branco constituído apenas por solvente

(neste caso, por metanol) e ao controlo, que é constituído por 30μL metanol, 150μL reagente Folin-

Ciocalteu e 120μL de solução de carbonato de sódio.

Utilizou-se uma solução de ácido gálico (Sigma Aldrich, 97,5-102,5%) para a realização da

curva de calibração (entre 0 e 55μg) para os resultados serem expressos em equivalentes de ácido

gálico.

4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana de Pinus halepensis

Para a avaliação da atividade antimicrobiana comparou-se os quatro óleos voláteis obtidos

pela extração supercrítica, um óleo obtido por microondas e o óleo obtido por hidrodestilação de P.

35

halepensis tendo-se testado seis espécies bacterianas, Bacillus subtilis ATCC 9372, Pseudomonas

aeruginosa L10, Escherichia coli ATCC 26666, Lactobacilus casei ATCC 7469 e Bacillus pumilus

ATCC 31093, uma espécie de levedura Sacaromyces cerevisae e duas espécies de fungos

Ganoderma lucidium e Lentinula edodes.

Os ensaios de suscetibilidade foram realizados de acordo aos estabelecidos nas normas de

Clinical and Laboratory Standards Institute [55] e National comitee for clinical Laboratory Standards

[56], mas com algumas alterações.

Para os métodos de suscetibilidade usados neste trabalho, o inóculo foi preparado pelo

método de crescimento, que consistiu na seleção de uma colónia isolada de estirpes puras de cada

microrganismo de placas de agar de crescimento com duração de 24h. A colónia isolada foi

posteriormente introduzida em tubos de ensaio com 5mL de meio de cultura estéril (Nutrient Broth,

Himedia) para bactérias e 5mL de meio de cultura estéril (Malt Extract, Himedia) para levedura.

Seguiu-se a incubação durante a noite destes com agitação a 37ºC para bactérias e 25ºC para a

levedura.

Posteriormente foi medida a absorvância de cada meio num espectrofotómetro (Thermo,

Nicolet evelution 300) a 655nm para as bactérias e 550nm para a levedura para medir o grau de

turbidez.

Obteve-se o inóculo final para se utilizar no método de difusão de disco.

Já para os fungos, selecionou-se um quadrado com cerca de 1cm de cada placa de

crescimento (presentes no laboratório de bioquímica do ISEL) e colocou-se numa placa com meio

PDA (Himedia) a incubar durante 72h a 25ºC. Posteriormente, rasparam-se as placas com a ajuda de

um bisturi sem ferir o agar em cerca de 500µL de NaCL (85%). Por fim, transferiu-se cada suspensão

para um eppendorf de 1mL.

Todo o material usado foi esterilizado na autoclave a 121ºC durante 15minutos. Todas as

soluções cuja composição se alterava com o tratamento térmico foram esterilizadas com recurso a

filtros de 0,45µm (Millipore).

A descrição da preparação dos meios encontra-se no Anexo C.

4.5.1 Método de difusão de disco

Para a aplicação do método de difusão de disco em agar teve-se por base o método de Bauer

et al. [57] e os procedimentos descritos na literatura, com algumas alterações.[6],[15]

Posteriormente à preparação dos inóculos, mergulhou-se um cotonete estéril no mesmo,

removendo-se o excesso de fluido do cotonete e inocularam-se as superfícies da placa de Petri com

Agar Nutrient (Himedia) para as bactérias e com PDA (Himedia) para os fungos e levedura.

36

Os discos de papel de filtro (Macherey-Nage) de diâmetro de 6mm, foram dispostos

uniformemente sobre a superfície de agar inoculada. Foram adicionados 10µL de cada solução em

estudo, controlo positivo e controlo negativo em cada um dos discos.

Os extratos de P. halepensis foram dissolvidos em dimetilsulfóxido 99,9% (DMSO, Merk) de

forma a obter uma concentração final de 60mg/mL.

Os controlos positivos usados foram a Ampicilina (Sigma-Aldrich) com uma concentração de

75µg/mL para B. subtilis e Gentamicina (Sigma-Aldrich) com uma concentração de 330µg/mL para as

restantes estirpes bacterianas. Já para os fungos e levedura foi usada a Amphotericin B solubilized

(Sigma-Aldrich). O solvente de dissolução dos extratos (DMSO) foi usado como controlo negativo. As

placas foram incubadas a 37ºC por um período de aproximadamente de 18h para as bactérias e

incubadas a 25ºC durante 24h para a levedura e 72h para os fungos.

O teste de cada microrganismo foi estudado em triplicado e o diâmetro das zonas de inibição

foi medido em milímetros com uma craveira, incluindo o diâmetro do disco.

4.5.2 Método de microdiluição em caldo

Para aplicação do método da microdiluição em caldo teve-se por base o método de Balouiri et

al. [58] e as normas: i) M07-A9 [55] e iii) M27-A2 [56].

Em microplacas de 96 poços estéreis testaram-se diferentes concentrações de extrato de

óleo essencial (5; 2,5; 1 e 0,5 mg/mL) e diferentes volumes de cada concentração (2,4,6 e 8µL)

provenientes da SFE a 110 bar e 50ºC em culturas de células de Bacillus subtilis. Deste modo,

distribuíram-se 20μL de inoculo previamente ajustado com uma turbidez de 0.5 McFarland, 2, 4, 6 ou

8µL de extrato de óleo de cada uma das concentrações e 178, 176, 174 ou 172µL de meio de cultura

estéril (himedia), respetivamente.

Adicionalmente, realizou-se um controlo negativo composto por 2, 4,6, ou 8μL de DMSO,

20μL de inoculo e 178, 176, 174 ou 172µL de meio de cultura estéril (himedia), respetivamente de

modo a perfazer um volume de 300 µL. O controlo positivo era constituído por 160μL de Nutrient

Broth, 20μL de inoculo e 20μL de Ampicilina.

Os extratos P. halepensis foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) 99,9% (Merck) para

uma concentração final de 5mg/mL. Posteriormente procedeu-se a diluições sucessivas de 1:2 dos

mesmos, através da adição de DMSO até a concentração final de 0,5mg/mL, obtendo-se assim uma

gama de concentrações entre 5mg/mL a 0,5mg/mL.

O teste de cada microrganismo na presença do extrato foi realizado em quadruplicado. Para

evitar que as placas secassem, estas foram tapadas e seladas e postas a incubar a 37°C por um

período compreendido entre 18h a 24h.

O crescimento microbiano foi determinado por um espectrofotómetro (Bio-Rad Model 680

microplate reader) a um comprimento de onda de 655nm.

37

Resultados e discussão 5.

5.1 Determinação do tamanho de partícula e densidade de Pinus halepensis

Depois de se triturar e de se peneirar a amostra de folhas de Pinus halepensis, obteve-se

uma distribuição da mesma tendo em conta o diâmetro de partícula de acordo com a Tabela 5.

Tabela 5:Distribuição quantitativa da amostra de P. halepensis nos diferentes peneiros

Peneiro Diâmetro (mm) Massa (g)

1 1,0 136,48

2 0,8 147,13

3 0,63 161,42

4 0,5 36,49

5 0,4 5,09

6 0,315 5,66

7 0,2 3,75

8 0,1 1,15

Massa Total (g): 497,17

O diâmetro médio da partícula foi determinado pela equação (21). De acordo com a fração

mássica retida em cada peneiro o valor obtido foi de 0,76 mm.

𝑑𝑖 =𝑥𝑖𝑑𝑖

∑𝑥𝑖𝑑𝑖 (21)

A densidade de P. halepensis foi de 0,35 g/mL, de acordo com os valores no Anexo B.

5.2 Obtenção do óleo essencial de Pinus halepensis através do método convencional de

hidrodestilação

A obtenção do óleo essencial foi efetuada através da hidrodestilação. O rendimento foi

determinado através da quantidade de óleo obtida, face à quantidade de planta pesada usada como

carga, sendo este de 0,8% (m/m) tendo em conta a massa de planta pesada. (Anexo D)

O óleo obtido caraterizou-se pela sua tonalidade transparente e apresentar um odor

característico bastante acentuado.

Estudos realizados revelam que o rendimento de hidrodestilação varia de região para região

havendo diferenças notórias entre espécies de P. halepensis cultivadas na Argélia, Marrocos, Grécia

e Itália. Os rendimentos variaram entre 0,50% e 0,89% (v/m).[6] No entanto um estudo realizado com

agulhas de P. halepensis colhidas na Turquia revelaram que o rendimento foi de 0,85%.[19]

38

5.3 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de Soxhlet

Os extratos de P. halepensis foram obtidos por extração em Soxhlet onde foi usado metanol,

como solvente, para obter compostos polares e o hexano, como solvente, para obter compostos

apolares. Após as extrações, o solvente contendo o extrato foi levado ao rotavapor para secagem e

posteriormente levado à linha de vácuo para garantir a secagem total do extrato e separação do

solvente usado. Obteve-se um rendimento no valor de 15,3% e de 16,3% respetivamente.

O extrato obtido apresentava uma tonalidade verde escura (Figura 12).

Figura 12: Extrato de P. halepensis obtido através da extração em Soxhlet

A planta após extração (Figura 13) apresentava uma cor acastanhada e sem aroma

percetível.

Figura 13: Tonalidade da planta antes (2) e após (1) extração em Soxhlet com hexano e metanol

1

2

39

5.4 Obtenção de extratos de Pinus halepensis através do método convencional de

Microondas

Os extratos de P. halepensis foram obtidos por extração em microondas em sistema aberto.

Para descobrir as condições ótimas para a extração de óleo essencial usando o microondas foram

testadas diferentes condições que se encontram representadas na Tabela 6 bem como os seus

respetivos rendimentos.

Tabela 6: Condições operatórias para a extração de óleo essencial de P. halepensis por microondas

Condições Operatórias

Nº Ensaio Potência (W) Temperatura (ºC) Tempo (min) Rendimento (%)

1 150 100 60 0,76

2 75 108 60 0,45

3 100 108 35 0,47

4 100 108 65 0,75

No ensaio 1 fixou-se a potência, temperatura e o tempo apresentados na Tabela 6. Este

ensaio teve um tempo total de extração de 54minutos e verificou-se que a temperatura de ebulição da

mistura era superior a 100ºC uma vez que a temperatura máxima atingida durante o ensaio foi de

108ºC. Deste modo, nos restantes ensaios a temperatura estabelecida foi de 108ºC. Posteriormente

realizou-se o ensaio 2, onde se constatou que o rendimento de extração obtido era menor que o

rendimento de extração pretendido tendo em conta o ensaio anterior pelo que foram descartadas

estas condições de potência. De seguida foi realizado o ensaio 3, onde se fixaram novamente a

temperatura e o tempo a uma potência de 100W. Neste ensaio verificou-se que era necessário

aumentar o tempo de extração visto que o rendimento obtido foi de apenas 0,47% (m/m). Por último

foi realizado o ensaio 4 sem tempo pré-estabelecido novamente a 100W. Verificou-se que passados

35minutos de ensaio o rendimento era de 0,6% (m/m) pelo que se realizaram mais 30minutos de

ensaio obtendo-se um rendimento final de 0,75% (m/m), mais semelhante ao rendimento obtido na

hidrodestilação. (Anexo E)

Pode-se concluir que as condições ótimas de extração usando o método de microondas são

uma potência de 100W, uma temperatura de 108ºC e um tempo de extração de aproximadamente 1h,

obtendo-se rendimentos idênticos à hidrodestilação convencional, mas para um tempo de 3h.

Os rendimentos foram determinados através da quantidade de óleo obtida, face à quantidade

de planta pesada usada como carga. O óleo obtido caraterizou-se pela sua tonalidade transparente e

apresentar um odor característico bastante acentuado semelhante ao óleo obtido pela

hidrodestilação.

40

5.5 Obtenção do óleo volátil de P. halepensis através do método não-convencional com CO2

supercrítico

O óleo volátil de P. halepensis com CO2 supercrítico foi obtido através de seis ensaios com as

condições operatórias apresentadas na Tabela 7.

Tabela 7: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração Supercrítica com CO2


Ensaio Pressão

(bar)

Temperatura

(ºC)

Caudal

(L/min)

mCO2

(kgCO2/kg

planta)

t (min) Rendimento

(%)

1 90 40 8 42,67 198 1,71

2 100 40 8 32,51 153 1,73

3 110 50 8 43,1 196 1,32

4 100 50 8 58,26 256 0,88

A massa extraída foi medida ao longo do tempo bem como o volume de solvente utilizado,

para permitir uma melhor compreensão da evolução da extração e se proceder ao cálculo do seu

rendimento. Quando se verificava que a massa extraída era insignificante para um determinado

volume, dava-se por terminado o ensaio. (Anexo F)

Através da extração supercrítica, obteve-se um óleo de tonalidade bem diferente ao

anteriormente obtido por hidrodestilação e microondas, uma vez que este agora apresentava uma cor

amarelada e com um odor mais intenso e ligeiramente diferente.

A influência das diferentes pressões e das diferentes temperaturas na extração do óleo volátil

de P. halepensis foi estudado usando um diâmetro de partícula de 0,76mm e um fluxo de CO2 de

aproximadamente 8L/min (Figura 14, 15 e 16).

Tendo em conta os dados da Tabela 7 verificou-se que os rendimentos do ensaio 1 e 3 são

semelhantes, no entanto no ensaio 1 são necessários mais tempo de extração e massa de CO2 para

a extração do óleo do que no ensaio 2. No último ensaio, nas condições do ensaio 4, verificou-se que

o rendimento de extração obtido foi o menor e o onde foi necessário uma maior quantidade de CO2 e

de tempo de extração (Figura 14).

Tendo em conta o estudo a diferentes pressões e temperaturas e o que foi dito anteriormente,

verifica-se que as condições de extração de 100bar e a 40ºC apresenta maior rendimento. Contudo, a

análise do óleo e as suas potencialidades, propriedades antioxidantes ou antimicrobianas, será

avaliada nos capítulos seguintes para comparação.

41

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0

Re

nd

ime

nto

Extr

ato

To

tal (%

)

Tempo (minutos)

110_50

100_40

90_40

100_50

Figura 14: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo para a respetiva P(bar) e T(ºC)

Figura 15: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído em função da mCO2/mplanta usada na extração supercrítica de P. halepensis para a respetiva P(bar) e T(ºC)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0Relç

ão

en

tre

ole

o v

olá

til e

óle

o e

sse

ncia

ll

mCO2/mplant

90_40

110_50

100_40

100_50

42

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0

Re

lçã

o e

ntr

e o

leo

esse

ncia

l e ó

leo

vo

látil

Tempo (minutos)

90_40

110_50

100_40

100_50

Tabela 8: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o processo de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo volátil em relação ao óleo obtido na hidrodestilação


Ensaio Pressão

(bar)

Temperatura

(ºC)

Caudal

(L/min) t (min)

Quantidade

de óleo

1 90 40 8 50 1,8

2 100 40 8 68 2,0

3 110 50 8 110 1,5

4 100 50 8 256 1,0

Fazendo uma comparação do óleo essencial extraído de P. halepensis na hidrodestilação e o

óleo volátil de P. halepensis obtido pela SFE (Figura 16 e Tabela 8) verifica-se que o óleo essencial

é extraído mais rapidamente nas condições de 90bar e 40ºC obtendo-se uma quantidade de óleo

volátil 1,8 vezes superior ao óleo obtido na hidrodestilação.

Figura 16: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração supercrítica de P. halepensis em função do tempo para a respetiva P(bar) e T(ºC)

A influência dos diferentes caudais na extração do óleo volátil de P. halepensis foram

estudados usando as condições operatórias apresentadas na Tabela 9.

43

Tabela 9: Condições Operatórias de pressão, temperatura, caudal massa de CO2 por massa de planta, tempo de extração e rendimento obtidos para o processo de Extração Supercrítica com CO2


Ensaio Pressão

(bar)

Temperatura

(ºC)

Caudal

(L/min)

mCO2

(kgCO2/kg

planta)

t (min) Rendimento

(%)

1 90 40 6 38,54 251 1,78

2 90 40 8 42,67 198 1,71

3 90 40 12 35,7 107 1,79

Tendo em conta estas três condições estudadas (Tabela 9, Figura 17 e Figura 18) verifica-

se que o rendimento é semelhante.

Figura 17: Rendimento da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis em função do tempo usando diferentes caudais de CO2 para a respetiva P(bar) , T(ºC) e caudal (L/min)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0

Ren

dim

ento

do

Ext

rato

To

tal(

%)

Tempo (minutos)

90_40_6

90_40_12

90_40_8

44

Figura 18: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração supercrítica de P. halepensis em função da massa de CO2 por massa de planta tendo em conta diferentes caudais para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal

(L/min)

Tabela 10: Condições Operatórias de pressão, temperatura e caudal usadas para o processo de Extração Supercrítica com CO2 e o tempo de extração e quantidade de óleo volátil em relação ao óleo obtido na hidrodestilação


Ensaio Pressão

(bar)

Temperatura

(ºC)

Caudal

(L/min) t (min)

Quantidade

de óleo

1 90 40 6 89 2,0

2 90 40 8 50 1,75

3 90 40 12 36 2,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

Rel

ção

en

tre

ole

o v

olá

til e

óle

o e

ssen

cial

mCO2/mplanta

90_40_6

90_40_8

90_40_12

45

Figura 19: Relação entre o óleo extraído na hidrodestilação e do óleo extraído na extração supercrítica de P. halepensis em função do tempo tendo em conta diferentes caudais para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min)

Tendo em conta o que foi dito anteriormente verifica-se que, um maior caudal de dióxido de

carbono reduz o tempo de extração, ou seja, o ensaio realizado com um caudal de 12L/min decorreu

de uma forma mais rápida do que o ensaio realizado com um caudal de 6L/min ou 8L/min. Por outro

lado, como o rendimento é semelhante nos três ensaios, também é possível constatar que, um

aumento do caudal de CO2 não se traduz num aumento do rendimento, pois a quantidade de óleo

presente na planta é a mesma.

Os parâmetros estudados mostraram diferentes influências no óleo volátil extraído. A pressão

e a temperatura controlam o rendimento de extração, uma vez que uma ligeira variação destes

parâmetros leva a uma alteração na densidade do solvente supercrítico. As diferenças de

rendimentos de extração são devido às diferentes densidades do solvente, uma vez que se sabe que

em densidades mais elevadas o CO2 supercrítico apresenta um poder de solvente mais forte mas

menor seletividade, ou seja, a elevadas densidades de solvente a melhoria do rendimento de

extração pode ter sido devido ao aumento da quantidade da cera cuticular e outros compostos não

voláteis. [27]

5.6 Determinação dos compostos dos óleos por GC-FID

O principal método de quantificação dos compostos presentes no óleo essencial e óleo volátil

foi a técnica de GC-FID. Na Tabela 11 são apresentados os resultados para o óleo essencial (HD) e

para o óleo volátil (SFE) nas duas condições de pressão e temperatura.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 300,0

Rel

ção

en

tre

ole

o v

olá

til e

óle

o e

ssen

cial

Tempo (minutos)

90_40_6

90_40_8

90_40_12

46

Tabela 11: Percentagem da composição do óleo essencial (EO) e óleo volátil (SFE) isolado de P. halepensis

Pinus halepensis

Componentes RI ESC

EO 90bar 90bar 100bar 100bar 110bar

40ºC 40ºC(R) 40ºC 40ºC(R) 50ºC

α-Pineno 933 11.2 7.5 6.8 5.7 6.2 7.3

Sabineno 962 0.9 0.5 0.7 0.5 0.5 0.6

β-Pineno 967 1.8 1.1 1.0 0.8 0.9 1.1

β-Myrceno 979 4.8 3.9 3.7 3.3 3.0 4.0

δ-3-Careno 1006 2.5 2.0 1.8 1.7 1.9 2.0

p-Cymeno 1009 0.9 0.5 0.7 0.6 0.5 0.6

α-Terpinoleno 1064 2.1 2.0 2.0 1.9 1.7 2.0

β-Carofileno 1415 47.3 52.4 53.0 54.1 53.5 52.8

Aromadendreno 1442 4.8 5.1 4.7 5.1 5.0 4.9

α-Humulene 1449 8.8 9.2 9.4 9.6 9.4 9.1

Germacreno D 1475 5.2 6.2 6.0 6.3 6.6 5.8

Cubebol 1489 1.9 2.0 1.9 1.9 2.1 1.9

Óxido de humuleno 1599 2.5 2.9 3.0 3.4 3.3 3.0

n-Heptacosano 2702 t t t 0.1 0.2 0.1

n-Octacosano 2805 t t t 0.1 0.1 T

n-Nonacosano 2898 t t t t T T

n-Triacontano 3000 t t t t T T

n-Hentriacontano 3100 t t t t T T

Compostos Identificados 94.7 95.3 94.7 95.1 94.9 95.2

Grupo de componentes

Monoterpenos hidrocarbonados

24.2

17.5 16.7 14.5 13.0 17.6

Monoterpenos oxigenados

T

t t t T T

Sesquiterpeno hidrocarbonados

66.1

72.9 73.1 75.1 74.5 72.6

Sesquiterpenos oxigenados

4.4

4.9 4.9 5.3 5.4 4.9

Fenilpropanoides

T

t t t T T

Outros

T t t 0.2 0.3 0.1

RI: indice de retenção calculados em relação a uma mistura de alcanos C9-C33 n-alcanos na coluna DB-1; t: traços (<0.1%).

Na Tabela 11 são identificados maioritariamente os 13 componentes que representam pelo

menos 94% dos componentes totais no óleo. Os compostos voláteis obtidos são dominados por

hidrocarbonetos sesquiterpénicos nomeadamente pelo β-Carofileno (52,4% a 54,1%). Em

quantidades variáveis, o α-Pineno (5,7% a 7,5%) e o Óxido de Humuleno (2,9% a 3,4%) são os

compostos que dominam as diferentes amostras de monoterpenos hidrocarbonados e sesquiterpenos

oxigenados, respetivamente.

Observa-se que o óleo essencial contém um teor mais elevado de monoterpenos

hidrocarbonados e um teor menor de sesquiterpenos hidrocarbonados do que os óleos voláteis

obtidos com CO2 supercrítico. De uma forma geral nos óleos voláteis é possível verificar a presença

47

de ceras como n-Heptacosano e n-Octacosano. Tanto o α-Pineno como o β-cariofileno são

responsáveis pelo odor da planta o que pode justificar o odor intenso dos óleos bem como as

diferenças de odor do óleo de hidrodestilação e o óleo de SFE uma vez que estes estão presentes

em maior quantidade e em quantidades diferentes em cada um dos óleos.

Em geral, tendo em conta os resultados obtidos verifica-se que estes estão de acordo com a

informação retirada da literatura no ponto 3.3.1.2.

5.7 Quantificação e Caracterização de P. halepensis

5.7.1 Determinação do poder antioxidante por DPPH

A avaliação do poder antioxidante dos diferentes extratos foi efetuada em relação a um

composto referência, o Trolox (Figura 20). Desta forma, todos os resultados são expressos em

equivalentes de Trolox de acordo com a equação Y=-9,188+0,781X.

Figura 20: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o Trolox para a avaliação das propriedades antioxidantes dos

extratos de P. halepensis

Verificou-se que a extração em Soxhlet confere um maior poder antioxidante do que os outros

extratos como se encontra representado na Tabela 12.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160

% In

ibiç

ão

Concentração (µg/mL)

48

Tabela 12: Valores do poder antioxidante dos diferentes extratos obtidos a partir de P. halepensis


Ensaio Pressão (bar) Temperatura

(ºC)

Caudal

(L/min)

µg

Trolox/mgextrato

SFE

1 90 40 8 0,440

2 100 40 8 0,633

3 110 50 8 0,564

4 100 50 8 0,556

5 90 40 6 0,606

6 90 40 12 0,568

HD 7 0,613

Soxhlet 8 Metanol 12,64

9 Hexano 5,89

Pela análise do gráfico (Figura 21), verifica-se que, o extrato obtido usando como solvente o

metanol, apresenta um poder antioxidante superior em relação ao extrato obtido usando como

solvente hexano (Tabela 12).

Figura 21: Atividade antioxidante dos extratos de P. halepensis obtidos por extração em Soxhlet com metanol e hexano

Pela análise do gráfico da Figura 22 e do Anexo G-Tabela 28 que apesar de terem valores

diferentes estes são estatisticamente iguais tendo em conta a análise do tratamento estatístico.

0

2

4

6

8

10

12

14

µg T

rolo

x/m

gext

Soxhlet Hexano

Soxhlet Metanol

49

Figura 22: Poder antioxidante dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos por hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min)

Sendo o Trolox o composto de referência, quanto maior for o valor de equivalentes de Trolox

maior será o poder antioxidante dos extratos analisados.

5.7.2 Determinação do teor de polifenóis

A quantificação dos polifenóis dos diferentes extratos foi efetuada para o ácido gálico, um

composto de referência, cuja reta de calibração se encontra representada na Figura 23. Deste modo,

todos os resultados são expressos em equivalentes de ácido gálico de acordo com a equação

Y=0,0069+0,027X.

Figura 23: Curva de calibração e respetiva regressão linear para o ácido gálico para determinação do teor em polifenóis

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

µg

Tro

lox/

mge

xt

SFE 90_40_6

SFE 90_40_12

SFE 90_40

SFE 100_40

SFE 110_50

SFE 100_50

HD

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

Ab

sorv

ânci

a

Massa(µg)

50

Verificou-se que o maior teor de polifenóis foi obtido no extrato proveniente da extração em

Soxhlet. Já o teor de polifenóis dos restantes extratos de óleo volátil e de óleo essencial é

significativamente inferior, como se encontra representado na Tabela 13.

Tabela 13: Valores do teor de polifenóis dos diferentes extratos obtidos a partir de P. halepensis


Ensaio Pressão (bar) Temperatura

(ºC)

Caudal

(L/min) EAG/gextrato

SFE

1 90 40 8 902,1

2 100 40 8 694,6

3 110 50 8 739,5

4 100 50 8 684,4

5 90 40 6 811,3

6 90 40 12 621,2

HD 7 602,6

Soxhlet 8 Metanol 1215,2

9 Hexano 1193,2

Pela análise do gráfico (Figura 24), verifica-se que, o extrato obtido usando como solvente

metanol, apresenta um teor em polifenóis estatisticamente igual ao extrato obtido usando como

solvente hexano apesar de terem valores diferentes. (Anexo G- Tabela 30)

Figura 24: Teor de polifenóis do extrato de P. halepensis obtido por extração em Soxhlet com metanol e hexano

Tendo em conta os extratos obtidos pela SFE, verifica-se que os extratos que contêm uma

maior teor de polifenóis são os que foram obtidos nas condições de 90bar e 40ºC tanto para um

caudal de CO2 de 8L/min como para um caudal de 6L/min, sendo estatisticamente semelhantes entre

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

µm

ol E

AG

/gex

t

Soxhlet Metanol

Soxhlet Hexano

51

si tendo em conta a análise estatística apresentada no Anexo G- Tabela 30. Posteriormente seguem-

se os restantes extratos de óleos provenientes da SFE e da HD que apesar de terem valores

diferentes através da análise do tratamento estatístico se verifica que são estatisticamente iguais

entre si. (Anexo G-Tabela 30)

Figura 25: Teor de polifenóis dos extratos de óleos e de óleos essenciais de P. halepensis obtidos por hidrodestilação e SFE para a respetiva P(bar), T(ºC) e caudal (L/min)

Comparados os resultados com a literatura [59], verifica-se que o óleo essencial apresenta

um teor em polifenóis de 91,77mgEAG/g de extrato. Apesar de os valores serem semelhantes, o

desvio do valor do ensaio e o valor da literatura pode dever-se ao facto de num caso o óleo ter sido

dissolvido em metanol e o outro em etanol e a localização da colheita da planta que apesar de serem

ambas provenientes da Tunísia, serem de regiões diferentes.

5.8 Determinação da atividade antimicrobiana e antifúngica

A suscetibilidade antimicrobiana dos diferentes extratos obtidos por extração supercrítica de

P. halepensis foi avaliada pelo método de difusão de disco em agar, utilizando diferentes estirpes

microbianas, uma estirpe de levedura e duas estipes de fungos.

A avaliação do potencial microbiano foi realizada com base no diâmetro de inibição (DZI) de

crescimento microbiano em torno do disco que continha uma concentração de extrato de 60mg/mL.

No caso de não existir uma zona de inibição, foi assumido que os extratos não eram suscetíveis ao

agente microbiano testado. A atividade dos diferentes extratos foi comparada com a presença de um

controlo negativo, constituído pelo solvente de diluição dos extratos, o DMSO, e um controlo positivo,

constituído pelo antibiótico de referência para cada estirpe microbiana. Deste modo, foi possível

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

800,0

900,0

1000,0

µm

ol E

AG

/gex

t

SFE_90_40

SFE_110_50

SFE_100_40

SFE_100_50

SFE_90_40_6

SFE_90_40_12

HD

52

averiguar a sensibilidade do método, sendo que, o mesmo só é válido se o controlo positivo não

mostrar crescimento microbiano e o controlo negativo apresentar crescimento.

O diâmetro da zona de inibição em mm foi calculado incluindo o disco com 6mm.

Verifica-se que, para Bacillus subtilis, todos os extratos apresentaram um efeito inibitório em

torno dos discos (Figura 26). Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria

irregular, foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 10,2±1,1 e 14,7±0,5

mm.

Figura 26:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de disco, após 18h de incubação

a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-Ampicilina

O DMSO (controlo negativo) não mostrou uma ação inibitória no crescimento desta bactéria,

enquanto a Ampicilina com uma concentração de 75µg/mL (controlo positivo), demonstrou ação

inibitória com um diâmetro de zona de inibição de 26,4±0,9mm. Analisando os resultados verifica-se

que Bacillus subtilis apresentou maior suscetibilidade antimicrobiana na SFE nas três primeiras

condições da Tabela 14 exibindo portanto o maior diâmetro de zona de inibição não apresentando

diferenças estatisticamente significativas entre si (Anexo G-Tabela 32). Segue-se o extrato de SFE

nas condições de 100bar e 50ºC, o extrato de MAE e o extrato de HD, que são diferentes entre si

mas estatisticamente iguais quando sujeitos a uma análise estatística (Anexo G-Tabela 32), na qual

a bactéria demonstrou menor suscetibilidade.

Tabela 14:Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus

subtilis através do método de difusão em disco

Ampicilina

DMSO SFE 90_40

SFE 110_50

SFE 100_40

SFE 100_50

HD MAE

DZI (mm) Bacillu

s subtilis

26,4±0,9 0,0±0,

0 14,1±0,

1 14,3±0,

1 14,7±0,

5 11,6±0,

6 10,3±1,

0 11,7±0,

1

A A

B

C D

E

F

G

T

H H

53

Quanto a Escherichia coli, todos os extratos exibiram efeito inibitório no crescimento em torno

dos discos (Figura 27). Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria irregular,

foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 9,4±0,4 e 11,4±0,3 mm.

Figura 27: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Escherichia Coli pelo método de disco, após 18h de

incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-

Gentamicina

O DMSO (controlo negativo) não mostrou nenhuma ação inibitória no crescimento da bactéria

em estudo. No entanto, a Gentamicina, presente numa concentração de 330 µg/mL (controlo

positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 22,4±0,2mm, demonstrando assim a sua

ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Escherichia coli apresentou maior

suscetibilidade antimicrobiana na SFE, nomeadamente na terceira e quarta da Tabela 15 exibindo

portanto o maior diâmetro de zona de inibição não apresentando diferenças estatisticamente

significativas entre si quando sujeitas a análise estatística (Anexo H-Tabela 34). Seguem-se os

restantes extratos de SFE, HD e MAE, na qual a bactéria demonstrou menor suscetibilidade não

havendo também diferenças estatisticamente significativas entre si quando sujeitas a análise

estatística (Anexo H-Tabela 34).

Tabela 15: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de

Escherichia coli através do método de difusão em disco

Gentamicina

DMSO SFE 90_40

SFE 110_50

SFE 100_40

SFE 100_50

HD MAE

DZI (mm) Escherichi

a Coli 22,4±0,2

0,0±0,0

9,9±0,8

9,1±0,2

11,4±0,3

11,3±0,5

9,4±0,4

9,7±0,3

A

B

C

D

E F

G

H

54

Em relação a Bacillus pumilus, todos os extratos exibiram efeito inibitório no crescimento em


irregular, foi possível a sua medição. O seu diâmetro de inibição variou entre 9,6±0,5 e 11,9±0,6 mm.

Figura 28:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus pumilus pelo método de disco, após 18h de

incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-

Gentamicina




ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Bacillus pumilus apresentou maior

suscetibilidade antimicrobiana na SFE, nomeadamente nas condições dois, três e quatro

apresentadas na Tabela 16 exibindo portanto o maior diâmetro de zona de inibição não apresentando

diferenças estatisticamente significativas entre si tendo em conta as análises estatísticas

apresentadas no Anexo H-Tabela 36. Seguem-se os extratos de SFE nas condições 90bar e 40ºC,

MAE e HD na qual a bactéria demonstrou menor suscetibilidade não apresentando diferenças

estatísticas quando analisadas estatisticamente. (Anexo G- Tabela 36)

Tabela 16: Diâmetros da zona de inibição da atividade antimicrobiana dos extratos de P. halepensis no crescimento de Bacillus

pumilus através do método de difusão em disco

Gentamicina DMSO SFE 90_40

SFE 110_50

SFE 100_40

SFE 100_50

HD MAE

DZI (mm) Bacillus pumilus

22,0±1,0 0,0±0,0 10,5±0,7 11,2±0,7 11,7±0,7 11,9±0,6 9,6±0,5 10,7±0,5

Quanto a Lactobacillus casei, todos os extratos exibiram efeito inibitório no crescimento em



A

C

D

E F

B

G

H

55

Figura 29: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lactobacillus casei pelo método de disco, após 18h de

incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; G-MAE; H-

Gentamicina




ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Lactobacillus casei apresentou

maior suscetibilidade antimicrobiana na SFE, nomeadamente nas condições 100bar e 490ºC

exibindo, portanto, o maior diâmetro de zona de inibição. Seguem-se os restantes extratos na qual a

bactéria demonstrou menor suscetibilidade. Apesar de estes últimos valores serem diferentes na

Tabela 17, quando analisados estatisticamente não apresentaram diferenças estatísticas entre si.

(Anexo G-Tabela 38)


Lactobacillus casei através do método de difusão em disco;

Gentamicina DMSO SFE 90_40

SFE 110_50

SFE 100_40

SFE 100_50

HD MAE

DZI (mm) Lactobacillus

casei 24,7±1,2 0,0±0,0 10,0±0,7 10,8±0,6 12,7±1,2 11,9±0,6 9,7±0,6 10,7±0,3

Quanto a Pseudomonas aeruginosa, nenhum dos extratos exibiram efeito inibitório no

crescimento em torno dos discos (Figura 30).

A

C

D

E F

B

G

H

56

Figura 30: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Pseudomonas aeruginosa pelo método de disco, após 18h

de incubação a 37ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-

Gentamicina




ação inibitória e a validade dos resultados.

Também se realizou o teste de difusão de disco para a análise de leveduras, nomeadamente

a Saccharomyces cerevisiae (Figura 31). Neste ensaio verifica-se que todos os extratos mostraram

efeito inibitório a volta do disco. Apesar de algumas zonas de inibição apresentarem uma geometria


Figura 31: Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Saccharomyces cerevisiae pelo método de disco, após 18h

de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-

Amphotericin B solubilized

A B

C

D

E F

H

A

B

C

D

E

F

G

H

57


em estudo. No entanto, a Amphotericin B solubilized, presente numa concentração de 5mg/mL

(controlo positivo), apresentou um diâmetro de zona de inibição de 14,5±0,7mm, demonstrando

assim a sua ação inibitória. Analisando os resultados, foi possível constatar que Saccharomyces

cerevisiae apresentou maior suscetibilidade antimicrobiana na HD exibindo portanto o maior diâmetro

de zona de inibição. Seguem-se os restantes extratos, nas condições dois, três, quatro e cinco de

acordo com a Tabela 18, que apresentam diâmetros de zona de inibição intermédios e que não

apresentam diferenças estatisticamente significativas entre si apesar de terem valores diferentes.

(Anexo G-Tabela 40) Por último o extrato de SFE nas condições de 90bar e 40ºC foi o extrato na

qual a bactéria demonstrou menor suscetibilidade.


Saccharomyces cerevisiae através do método de difusão em disco


DMSO SFE 90_40

SFE 110_50

SFE 100_40

SFE 100_50

HD MAE

DZI (mm)

Saccharomyces cerevisiae

14,5±0,7 0,0±0,0 8,1±0,1 9,8±0,8 9,5±0,7 9,2±0,3 10,6±0,9 10,2±0,8

Por fim, também se realizaram testes de difusão de disco para duas espécies de fungos,

nomeadamente, Ganoderma lucidium e Lentinula edodes.

Nestes ensaios verificou-se que nenhum extrato apresentou efeito inibitório a volta do disco

em nenhuma das duas espécies. (Figura 32 e 33)

Figura 32:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Ganoderma lucidium pelo método de difusão de disco após 1

semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E- 100_40; F-SFE 100_50; H-


A A

B

B

C C

D D

E E F

F

G G

H H

58

Figura 33:Efeito dos extratos de P. halepensis no crescimento de Lentinula edodes pelo método de difusão de disco após 1

semana de incubação a 25ºC. A-DMSO; B-Hidrodestilação; C-SFE 90_40; D-SFE 110_50; E-SFE 100_40; F-SFE 100_50; H-


Os óleos essenciais de P. halepensis mostram um bom efeito inibitório contra a levedura em

estudo e contra a maior parte das estirpes bacterianas estudadas. No entanto mostrou-se ineficaz

como antifúngico.

Considerando todos os ensaios efetuados verifica-se que em nenhum deles, o diâmetro da

zona de inibição dos extratos foi superior ao diâmetro de zona de inibição do controlo positivo,

antibiótico de referência. Assim, o efeito antimicrobiano dos extratos de P. halepensis contra os

microrganismos de teste é pouco significativo quando comparado com o antibiótico de referência.

Eventualmente, para obtenção de um maior diâmetro da zona de inibição dos extratos para as

estirpes em estudo ter-se-ia de aumentar a concentração dos mesmos, dado que estes extratos

podem ter algum potencial como uma fonte alternativa de agentes antimicrobianos.

De acordo com a literatura, foram avaliadas a atividade antimicrobiana contra S. aureus, P.

aeruginosa, E. coli e B.cereus usando o método de discos com óleo essencial proveniente das folhas

secas de P. halepensis da região de Argélia. O óleo essencial mostrou uma forte atividade contra S.

aureus e B. cereus. Contrariamente, o óleo foi ineficaz contra P. aeruginosa e E.coli. Em comparação

com a literatura vemos algumas diferenças, nomeadamente a ação inibitória contra E. coli. Tais

resultados podem dever-se aos rendimentos e às diferentes composições dos óleos que são

resultantes de processos adaptativos, nomeadamente as condições ecológicas (como condições

climáticas, altitude, regiões geográficas), período de colheita da planta e o método de extração de

óleo essencial.[6]

No geral, os óleos essenciais revelaram atividades antimicrobianas em bactérias Gram-

positivas e bactérias Gram-negativas e em espécies de levedura; no entanto, foram verificadas

A A

B

B

C C

D

D E E

F F

G G

H H

59

atividades antibacterianas mais significativas em bactérias Gram-positivas do que em bactérias

Gram-negativas, o que pode ser consequência das diferenças na constituição da parede celular.[60]

No método de microdiluição em caldo, a atividade antimicrobiana de P. halepensis foi

avaliada considerando a estirpe de Bacillus subtilis tendo em conta as condições apresentadas na

Tabela 19.

Tabela 19: Condições operatórias usadas nos ensaios de microdiluição para Bacillus subtilis


Nº Ensaio Pressão (bar) Temperatura (ºC) Concentração de

OV (mg/mL)

Volume OV

(µL)

1

110 50

5

2

2 4

3 6

4 8

5

2,5

2

6 4

7 6

8 8

9

1

2

10 4

11 6

12 8

13

0,5

2 14

15 4

16 6 8

Estes ensaios permitiram determinar as correspondentes percentagens de inibição utilizando

a Equação 22.

%𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 =1−(𝐴𝐶𝑁−𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)

𝐴𝐶𝑁−𝐴𝐶𝑃 (22)

De modo a validar este método, realizou-se um controlo positivo (constituído por meio de

cultura, inoculo e Ampicilina) que não deve apresentar crescimento microbiano e o controlo negativo

(que consiste no meio de cultura, inoculo e DMSO) que deve apresentar crescimento. Para efeitos de

cálculo utilizou-se um valor médio das absorvâncias para o controlo positivo e para o controlo

negativo de cada concentração. Os resultados obtidos neste ensaio encontram-se no Anexo I.

60

Figura 34: Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e

50ºC, sem centrifugação

Analisando a Figura 34, os ensaios realizados para Bacillus subtilis que apresentam uma

percentagem de inibição acima de 100% foram desprezados, uma vez que o controlo negativo

(constituído por inoculo, DMSO e meio de cultura) não apresentou crescimento como seria esperado.

A ausência de crescimento deste microrganismo nestas condições pode estar relacionada com a

presença de uma concentração mais elevada de DMSO. Este solvente pode ter agido com um agente

bacteriostático, inibindo assim o crescimento de Bacillus subtilis.

Assim sendo, tendo em conta os restantes resultados, espera-se que à medida que o volume

e as concentrações de extrato aumentem que aumente a percentagem de inibição. No entanto não

conseguimos verificar esse padrão nem retirar conclusões. Pensa-se que tal facto se deveu à

formação de um precipitado após o contacto do extrato de óleo de P. halepensis com o meio de

cultura o que poderia alterar os valores de absorvância e consequentemente a % de Inibição. Para

tentar resolver o problema realizou-se uma centrifugação diferencial. Com esta técnica esperava-se

que, devido aos diferentes pesos moleculares, que a cultura celular se afundassem e o precipitado do

óleo ficasse no sobrenadante voltando-se a medir a absorvância após retirar o sobrenadante e

perfazer o volume do precipitado celular com meio estéril até aos 300 µL. Após centrifugação obteve-

se o gráfico da Figura 35.

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

0,5 1 2,5 5

% In

ibiç

ão

Concentração (mg/mL)

Extrato-2µL

Extrato-4µL

Extrato-6µL

Extrato-8µL

61

Figura 35:Percentagem de inibição no crescimento de Bacillus subtilis pelo método de microdiluição em caldo, após 18h de incubação a 37ºC, em função da concentração dos diferentes volumes de extrato de P. halepensis nas condições de 110bar e

50ºC, após centrifugação

Analisando a Figura 35 verificou-se, na maioria dos casos que, quanto maior a concentração

e o volume de extrato maior a percentagem de inibição contra a espécie Bacillus subtilis.

Conclui-se também que para um volume de extrato de 2µL, 4 µL e 6 µL a CIM90 encontra-se

acima de 5mg/mL. Para o volume de extrato de 8µL a CIM90 encontra-se entre 1mg/mL e 5mg/mL. O

maior grau de inibição foi verificado para um volume de 8 µL e uma com contração de extrato de óleo

de 5mg/mL apresentando um valor de aproximadamente 100%.

Para um volume de extrato de 8 µL e uma concentração de 2,5mg/mL os ensaios realizados

não foram conclusivos, uma vez que o controlo negativo (constituído por inoculo, DMSO e meio de

cultura) não apresentou crescimento como seria esperado. A ausência de crescimento pode estar

relacionada com a presença de DMSO como já foi referido anteriormente.

Em geral, tendo em conta o método de microdiluição para Bacillus subtilis tal como no método

de difusão de disco, o maior ou menor valor de CMI de cada extrato, pode estar associado às

características intrínsecas dos microrganismos testados, que estão relacionados com a

permeabilidade da sua superfície celular para com os extratos e a sua composição[12]. Apesar de

nos diferentes ensaios, com volumes diferentes de extrato, não se ter usado o mesmo volume de

meio de cultura e consequentemente oferecer diferentes quantidades de nutrientes à cultura celular,

pensa-se que os resultados não foram afetados, uma vez que a diferença de volumes era muito

pequena, na ordem dos µL.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

180,0

200,0

0,5 1 2,5 5

% In

ibiç

ão

Extrato-2µL

Extrato-4µL

Extrato-6µL

Extrato-8µL

62

5.8 Modelação dos extratos supercríticos de P. halepensis

Pelo modelo de Sovová 1994, o ajuste dos dados experimentais, para os 4 ensaios com os

mesmos caudais e 3 ensaios com caudais iguais estão representados na Figura 36 e Figura 37,

respetivamente.

Figura 36: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os quatro ensaios efetuados, nas condições de P(bar), T(ºC) e caudal constante de 8L/min

Figura 37: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios efetuados nas condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0 50 100 150 200 250 300

Y (

%)

t (minutos)

90_40_8

100_40_8

100_50_8

110_50_8

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0 50 100 150 200

Y (

%)

t(minutos)

90_40_8

90_40_6

90_40_12

63

Pelo modelo de Sovová 2015, o ajuste dos dados experimentais, para os 4 ensaios com os

mesmos caudais e três ensaios com caudais iguais estão representados na Figura 38 e Figura 39,

respetivamente.

Figura 38: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 2, Sovová 2005, para os quatro ensaios efetuados nas

condições de P(bar), T(ºC) e um caudal constante de 8L/min

Figura 39: Modelação dos resultados experimentais pelo Modelo 1, Sovová 1994, para os três ensaios efetuados nas

condições de P(bar), T(ºC) e diferentes caudais

Os coeficientes externos e internos de transferência de massa (kf e ks) e o desvio padrão (%)

obtidos pela modelação da extração supercrítica do óleo volátil de P. halepensis pelos métodos de

Sovová 1994 e Sovová 2005 encontram-se apresentados na Tabela 20.

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0,02

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

Y (%

)

t (minutos)

90_40_8

100_40_8

100_50_8

110_50_8

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

Y(%

)

t (minutos)

90_40_6

90_40_8

90_40_12

64

Tabela 20: Coeficientes de transferência de massa e respetivo desvio padrão para a extração do óleo volátil de P. halepensis

nas diferentes condições

Tabela 21: Cálculo do coeficiente de transferência de massa externa usando a correlação empírica proposta por Wakao e Kaguei [52]

Pressão (bar) Temperatura (ºC)

Caudal de CO2 (L/min)

Kf*10e6

90 40 8 0,16 100 40 8 0,19 100 50 8 0,35 110 50 8 0,27 90 40 6 0,13 90 40 12 0,21

Analisando os ensaios realizados para o mesmo caudal de CO2 e diferentes condições de

pressão e temperatura não conseguimos estabelecer um padrão entre estas e os coeficientes de

transferência de massa. Tendo em conta o modelo de Sovavá 1994 verifica-se que tanto o coeficiente

de massa externo como interno se comportam da mesma maneira. Ambos aumentam quando

passamos de 90 bar para 100 bar mantendo a temperatura, diminuem quando mantemos a pressão e

aumentamos a temperatura e voltam a diminuir quando aumentamos a pressão e mantemos a

temperatura. Para o modelo de Sovavá 2005, verifica-se uma diminuição do coeficiente de massa

interno quando aumentamos a pressão e diminuímos a temperatura, um aumento quando mantemos

a pressão e aumentamos a temperatura e de novo uma diminuição quando aumentamos a pressão e

mantemos a temperatura.

Já no ensaio realizado a 90 bar e 40ºC para diferentes caudais usando o modelo de Sovavá

2005, verificamos que o coeficiente interno de transferência de massa aumenta com o aumento do

caudal de CO2. Já para o modelo de Sovavá 1994, verifica-se uma diminuição do coeficiente de

massa interno de 6 para 8L/min de CO2 e um aumento de 8L/min para 12L/min. No coeficiente de

massa externo verifica-se o oposto.

Foi determinado o desvio padrão, onde se obtiveram valores inferiores a 6%, o que leva a

concluir que estes são modelos que apresentam uma boa solução para o ajuste destes dados

Sovová 1994

Sovová 2005

Pressão (bar)

Temperatura (ºC)

Caudal de CO2 (L/min)

KS*1e8 Kf*1e6 Desvio Padrão

(%) KS*1e8

Desvio Padrão

(%)

90 40 8 3,14 3,42 1,59 7,51 2,44

100 40 8 9,04 9,66 11,4 2,43 14,2

100 50 8 5,08 3,90 3,21 7,71 4,42

110 50 8 4,19 1,01 0,89 6,90 5,50

90 40 6 6,06 0,60 1,64 6,15 4,21

90 40 12 6,01 1,48 2,28 15,7 3,98

65

experimentais menos nos dados relativos à SFE a 100bar e 40ºC onde obtivemos desvios acima de

11%.

O modelo de Sovová apresenta uma modelação mais aplicada para a transferência de massa

no processo de extração de óleos vegetais com dióxido de carbono supercrítico. Este modelo assume

a existência de dois períodos no processo de extração, no primeiro o óleo de fácil acesso é removido

a uma taxa constante, e no segundo período a resistência interna à transferência de massa controla o

processo de extração, correspondendo a transferência de massa do óleo de difícil acesso, presente

no interior da matriz sólida.

Tendo em conta os gráficos apresentados era esperado que fossem identificados dois

períodos destintos: uma primeira parte em que se vê um aumento linear da curva no qual o óleo

extraído é de fácil acesso e ocorre rapidamente. E uma segunda parte onde se vê uma estabilização

da curva a tender para um patamar onde está a ser extraído o óleo de difícil acesso.

Uma das desvantagens deste modelo é que não inclui a interação matriz soluto, que

desempenha um papel fundamental na extração de óleos voláteis. Além disso, o coeficiente de

transferência de massa da fase fluida, Kf, além de descrever o período de equilíbrio da extração,

também reflete o seu desvio ao modelo de fluxo pistão, pois é obtido pelo ajuste da curva no período

de transição em relação ao rendimento experimental, pelo que os valores de Kf avaliados não são

confiáveis, a menos que o padrão de fluxo real seja levado em conta no modelo. Portanto, o Ks é

estimado de uma forma mais precisa, tornando-o mais significativo do que o coeficiente Kf. Isso é

corroborado pelo cálculo do coeficiente de transferência de massa externa usando a correlação

empírica proposta por Wakao e Kaguei [52] (Anexo I). Das Tabelas 20 e 21 pode-se observar que,

em geral, o Kf estimado pelo modelo é maior do que quando obtido pela correlação.

67

Conclusões e perspetivas futuras 6.

Tendo em conta o trabalho apresentado anteriormente verificou-se que o rendimento de

extração dos extratos e dos óleos de P. halepensis dependem da técnica de extração usada. Pelos

métodos de extração convencionais, nomeadamente a hidrodestilação e a extração em Soxhlet com

metanol e hexano, obtiveram-se os rendimentos 0,8% e 15,3% e 16,3%, respetivamente. Já os

rendimentos mais elevados obtidos pelos métodos não convencionais, nomeadamente da SFE de

óleos voláteis com CO2 e de extração por microondas, foram de 1,79% e 0,76%, respetivamente. Esta

diferença de valores entre os métodos convencionais e os não convencionais deve-se possivelmente

à extração de diferentes compostos que apresentam propriedades físico-químicas diferentes.

Foram estudadas diferentes condições de extração na SFE usando CO2, nomeadamente

diferentes pressões, temperaturas e caudais. Tendo em conta os diferentes caudais de extração,

verificou-se que os rendimentos de extração não foram afetados, as únicas diferenças verificadas

foram em relação ao tempo de extração uma vez que o óleo volátil da planta é sempre o mesmo e

não há alterações na densidade do solvente supercrítico. No entanto, quando se varia a temperatura

ou a pressão verifica-se que os rendimentos de extração sofrem alterações. Este facto pode dever-se

à alteração da densidade do solvente supercrítico que pode levar à extração de componentes não

voláteis.

Para analisar os constituintes dos óleos obtidos pelos métodos de extração estudados,

nomeadamente HD e SFE com CO2 foi feita uma análise GC-FID. Foram identificados treze

compostos dos quais o α-Pineno, β-cariofileno e o α -humuleno se encontravam em maior quantidade

para ambos os óleos. Os resultados estão de acordo com os resultados da literatura uma vez que, os

sesquiterpenos hidrocarbonados e os monoterpenos hidrocarbonados se encontram em maior

quantidade e os sesquiterpenos oxigenados em menor quantidade, no entanto não foram

identificados monoterpenos oxigenados.

Através do método de DPPH estudou-se a capacidade antioxidante dos extratos e óleos

voláteis obtidos. Verificou-se que o extrato com maior capacidade antioxidante é o obtido em Soxhlet

e o de óleos voláteis foi verificado na SFE a 100bar e a 40ºC tendo por base de comparação o

composto de referência Trolox.

Pelo estudo do teor de polifenóis, usando o método de Folin-Ciocalteau, verificou-se de igual

forma um teor de polifenóis mais elevado nos extratos obtidos em Soxhlet e dos óleos voláteis para a

SFE nas condições de 90bar e 40ºC.

De forma a testar as propriedades antimicrobianas e antifúngicas usou-se o teste de difusão

de discos onde se verificou que era eficaz contra todas as bactérias estudadas, menos a

Pseudomonas aeruginosa e não apresentava atividade antifúngica. Também foram realizados testes

68

antimicrobianos em meio líquido, através da microdiluição em caldo usando Bacillus subtilis, onde

também se verificou inibição no seu crescimento. No entanto, sabe-se que este efeito está

dependente das características dos microrganismos e da composição dos extratos pelo que seria

recomendável associar os métodos de difusão em disco e microdiluição em caldo para uma gama de

concentrações de extrato maiores para comprovar este efeito antimicrobiano.

A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais é atribuída a um número pequeno de

terpenos e compostos fenólicos, no entanto é difícil atribuir a atividade de uma mistura complexa a

um constituinte único ou particular, mas pode-se afirmar que a variação na composição química do

óleo essencial ou volátil pode ser responsável pelas diferentes atividades antibacterianas.

A modelação dos resultados experimentais da extração supercrítica permitiu um bom ajuste

dos dados experimentais da SFE do óleo volátil menos nas condições de 100 bar e 40ºC Nos dois

modelos estudados, Sovová 1994 e Sovová 2005, os coeficientes de transferência de massa interna

e externa apresentam valores na mesma ordem de grandeza e desvios padrão no ajuste entre 0,89%

e 14,19%. A utilidade prática destes modelos prende-se com a possível previsão de comportamentos

a diferentes condições de trabalho (pressão, temperatura e caudal de CO2), bem como o

conhecimento do regime em causa (laminar ou turbulento).

De forma a dar continuidade ao estudo de P. halepensis sugere-se a realização da SFE com

co-solventes, a realização de diferentes testes para avaliar a atividade antioxidante de modo a

consolidar os dados obtidos. Realizar o estudo do teor de flavonoides. Estudar a atividade biológica

em meio líquido com outras estirpes microbianas e ainda, comparar os extratos e os óleos obtidos ao

nível da sua composição química, por exemplo através de HPLC.

69

Referências 7.

[1] M. D. Trancoso, “Essential oils project: extraction, importance and aplications in the everyday,”

Rev. Práxis, vol. V, no. 9, pp. 89–96, 2013.

[2] J. F. D. Lopes, “Cultivo e processamento de plantas aromáticas,” Faculdade de Ciências e

Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2014.

[3] M. G. F. De La Cruz, “O uso de óleos essenciais na terapêutica,” Boa Esperança, 2000.

[4] Â. P. M. Tavares, “Composição terpénica e actividade antioxidante de plantas e óleos,”

Universidade de Aveiro, 2011.

[5] A. H. Seffens, “Estudo da composição química dos óleos essenciais obtidos por destilação por

arraste a vapor em escala laboratorial e industrial,” Pontificia Universidade Católica Do Rio

Grande Do Sul, 2010.

[6] N. D. Nadia Fekih, Hocine Allali, Salima Merghache, Faïza Chaïb, Djamila Merghache,

Mohamed El Amine and J. C. Alain Muselli, Boufeldja Tabti, “Chemical composition and

antibacterial activity of P inus halepensis M iller growing in W est N orthern of A lgeria C

hemical,” Asian Pacific J. Trop. Dis., vol. 4, no. 2, pp. 97–103, 2014.

[7] N. H. Paiva, “Pinus,” Cult. Essências Exóticas e Nativ., vol. II, pp. 1–8, 2008.

[8] T. M. J. Widad M. K. Al-ani, Rasha Eldalawy, “Research Article Pharmacognostic and Volatile

Oils Content for Iraqi and Turkish Pinus halepensis,” Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., vol. 45, no.

30, pp. 160–164, 2017.

[9] I. Amri, L. Hamrouni, and M. Hanana, “A comparison of soil quality and yield parameters under

organic and conventional vineyard systems in Mediterranean conditions (West Turkey),” Biol.

Agric. Hortic. An Int. J. Sustain. Prod. Syst., vol. 29, pp. 37–41, 2013.

[10] R. dos R. Silvestres, “Plantas Aromáticas e Medicinais.” .

[11] P. A. P. de Azevedo, “Produção de Plantas Aromáticas e Medicinais (Plano de Negócios),”

Universidade do Minho, 2011.

[12] M. P. Dos Santos, “Extração e caracterização de extratos de Jatropha gossypiifolia L.

Avaliação da sua atividade antimicrobiana e antioxidante,” Instituto Superior de Engenharia de

Lisboa,2014.

[13] C. Grosso, V. Ferraro, A. C. Figueiredo, J. G. Barroso, J. A. Coelho, and A. M. Palavra,

“Supercritical carbon dioxide extraction of volatile oil from Italian coriander seeds,” Food

Chem., vol. 111, no. 1, pp. 197–203, 2008.

[14] A. C. Figueiredo, J. G. Barroso, and L. G. Pedro, “Plantas Aromáticas e Medicinais. Factores

que afectam a produção,” Potencialidades e Apl. das Plantas Aromáticas e Med., vol. 3a Ed,

pp. 1–18, 2007.

[15] K. M. G. Ulukanli Zeynep, Karaborklu Salih, Bozok Fuat, Ates Burhan, Erdogan Selim, Cenet

Menderes, “Chemical composition, antimicrobial, insecticidal, phytotoxic and antioxidant

activities of Mediterranean Pinus brutia and Pinus pinea resin essential oils,” Chin. J. Nat.

70

Med., vol. 12, no. 12, pp. 901–910, 2014.

[16] Z. Djerrad, L. Kadik, and A. Djouahri, “Chemical variability and antioxidant activities among

Pinus halepensis Mill . essential oils provenances , depending on geographic variation and

environmental conditions,” Ind. Crop. Prod., vol. 74, pp. 440–449, 2015.

[17] “Jardim Botânico utad : Pinus halepensis Mill. ”[Online]. Available:

https://jb.utad.pt/especie/Pinus_halepensis. [Accessed: 30 de Outubro].

[18] “Pinus halepensis.” [Online]. Available: https://www.gvmelle.com/bomen/pi_hale.htm.

[Accessed: 08 de Outubro].

[19] B. Agriculture, A. Ismail, L. Hamrouni, M. Hanana, C. De Biotechnologie, and S. Gargouri,

“Biological Agriculture & Horticulture : An International Journal for Sustainable Chemical

composition , physico- chemical properties , antifungal and herbicidal activities of Pinus

halepensis Miller essential oils,” no. June, 2013.

[20] M. E. A. Vania Maria Borges Cunha, Marcilene Paiva Silva, Elinéia Castro Costa, Raul Nunes

de Carvalho, Nélio Teixeira Machado, “Extração Supercritica : Simulação Do Sistema Solvente

+ Cossolvente Com o Aspen Hysys,” Quim. e Empreendedorismo, no. 15o, 2017.

[21] J. M. N. A.M.F.Palavra, J. P. Coelho, J.G. Barroso, A. P. Rauter, J.M.N.A. Fareleira A. Mainar,

J.S. Urieta, B.P. Nobre, L. Gouveia, R.L. Mendes, J.M.S. Cabral, “Supercritical Carbon Dioxide

Extraction of Bioactive Compounds from Microalgae and Volatile Oils from Aromatic Plants, J.

Supercritical Fluids,” J. Supercrit. Fluids, vol. 60, pp. 21–27, 2011.

[22] J. P. Coelho et al., “Extraction of Volatile Oil from Aromatic Plants with Supercritical Carbon

Dioxide: Experiments and Modeling,” Molecules, vol. 17, pp. 10550–10572, 2012.

[23] J. P. Coelho, R. M. Filipe, M. P. Robalo, and R. P. Stateva, “Recovering value from organic

waste materials: Supercritical fluid extraction of oil from industrial grape seeds,” J. Supercrit.

Fluids, vol. 141, pp. 68–77, Nov. 2018.

[24] M. A. A. Meireles, “Extração supercrítica de óleos essenciais de condimentos usando dióxido

de carbono,” Bol. da SBCTA, vol. 31, no. no.1, pp. 9–14, 1997.

[25] A. Coelho J, Veiga J, Karmali A, Nicolai M, Pinto Reis C, Nobre B, Palavra, “Supercritical CO2

Extracts and Volatile Oil of Basil (Ocimum basilicum L.) Comparison with Conventional

Methods. Separations,” vol. 5(2), no. 21, pp. 1–12, 2018.

[26] R. P. Coelho, J.A.P., Filipe, R.M., Palavra, A.F., Naydenova, G. P., Yankov, D.S, Stateva,

“Semi-Empirical Models and Cubic Equations of State for Correlation of Solids Solubility in

scCO2: From Simple to Complex Substances,” Open Chem. Eng. J., vol. 10, pp. 29–40, 2016.

[27] C. Reis-Vasco, J. A. P. Coelho, “Comparison of pennyroyal oils obtained by supercritical CO 2

extraction and hydrodistillation,” Flavour Fragr. J., vol. 14, pp. 156–160, 1999.

[28] E. Riera, Y. Gol, A. Blanco, J. A. Gallego, M. Blasco, and A. Mulet, “Mass transfer

enhancement in supercritical fluids extraction by means of power ultrasound,” Ultrason.

Sonochem., vol. 11, pp. 241–244, 2004.

[29] C.L. Prins, C. S. L. Lemos, “Efeito do tempo de extração sobre a composição e o rendimento

71

do óleo essencial de alecrim ( Rosmarinus officinalis ),” Rev. Bras. Farmacogn. Brazilian J.

Pharmacogn., vol. v.8, no. no4, pp. 92–95, 2006.

[30] J. Azmir et al., “Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials : A

review,” J. Food Eng., vol. 117, no. 4, pp. 426–436, 2013.

[31] L. V Silva, D. L. Nelson, M. F. B. Drummond, L. Dufossé, and M. B. A. Glória, “Comparison of

hydrodistillation methods for the deodorization of turmeric,” Food Res. Int., vol. 38, pp. 1087–

1096, 2005.

[32] K. K. Mechergui et al., “Chemical composition and antioxidant activity of Tunisian Origanum

glandulosum Desf. essential oil and volatile oil obtain by supercritical CO 2 extraction,” Int. J.

Adv. Res., vol. 2, no. 12, pp. 337–343, 2014.

[33] A. Tsukui and C. M. Rezende, “Extração assistida por micro-ondas e química verde,” Rev.

Virtual Quim., vol. 6, no. 6, pp. 1713–1725, 2014.

[34] M. Letellier, H. Budzinski, L. Charrier, S. Capes, and A. M. Dorthe, “Optimization by factorial

design of focused microwave assisted extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons from

marine sediment,” Fresenius. J. Anal. Chem., vol. 364, no. 3, pp. 228–237, 1999.

[35] D. F. da Silva, “Extração assistida por microondas no preparo de um bioerbicida a partir das

folhas da canavalia ensiformis : aplicação em plantas invasoras na cultura de soja

convencional e as consequências no solo", Universidade de São Paulo Instituto de Quimica de

São Carlos, 2016.

[36] É. de G. Baroni, “Extração de óleo essencial de Lippia Alba utilizando hidrodestilação e

extração", XIX Encontro Jovens Pesqui. Univ. Caxias do Sul, p. 2011, 2011.

[37] L. F. de A. e M. A. B. R. elson Aloir Santana Brum, “Método De Extração Da Fração Lipidica

De Matérias Primas De Origem Animal E Vegetal.Pdf,” Quim. Novaova, vol. 32, no. 4, pp. 849–

854, 2009.

[38] A. Paula Gusso, P. Mattanna, L. Gustavo de Pellegrini, D. Buzatti Cassanego, N. Silvia Pereira

dos Santos Richards, and A. de Souza Ribeiro, “Artigo Técnico Comparação de diferentes

métodos analíticos para quantificação de lipidos em creme de Ricotta,” Rev. Inst. Laticínios

Cândido Tostes, vol. 389, no. 67, pp. 51–55, 2012.

[39] Dulce magalhães e J. C. Masini José Carlos Penteado, “Experimento didático sobre

cromatografia gasosa: uma abordagem analítica e ambiental,” vol. 31, no. 8, pp. 2190–2193,

2008.

[40] J. C. Juliana Couto Nascimento, Luiz Fernando Oliveira Lage, Cláudio Rodrigues Dayrell

Camargos and F. Q. O. Amaral, Lucas Martins Costa, Adriana Nascimento de Sousa,

“Determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH e doseamento de flavonóides

totais em extratos de folhas da Bauhinia variegata L.,” Rev. Bras. Fármacia, vol. 92(4), no. 4,

pp. 327–332, 2011.

[41] F. B. Leonardo Luiz Borges; Tathiana Carvalho Lúcio; Eric de Souza Gil1, Eduardo, “Uma

abordagem sobre métodos analiticos para determinação da atividade antioxidante em

72

produtos naturais,” Enciclopédia Biosf. Cent. Científico Conhecer, vol. 7, pp. 47–55, 2011.

[42] A. A. S. Cardoso, “Extração supercrítica do Agastache foeniculum ( Lamiaceae )

Caracterização dos Extratos e Modelação,” Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, 2017.

[43] M. Abbas, F. Saeed, F. M. Anjum, T. Tufail, M. S. Bashir, and A. Ishtiaq, “Natural polyphenols :

An overview Natural polyphenols : An overview,” Int. J. Food Prop., vol. 20, no. 8, pp. 1689–

1699, 2017.

[44] G. C. L. and J. C. P. de M. Andressa Blainski, “Application and Analysis of the Folin Ciocalteu

Method for the Determination of the Total Phenolic Content from Limonium Brasiliense L.,”

Molecules, vol. 18, pp. 6852–6865, 2013.

[45] P. Torres and F. Chow, “Ensaio em microplaca de substâncias redutoras pelo método do

Folin- Ciocalteu para extratos de algas Ensaio em microplaca de substâncias redutoras pelo

método do Folin-Ciocalteu para extratos de algas,” Inst. Biociências, Univ. São Paulo, no.

January, 2017.

[46] S. R. Tintino, A. A. D. C. Neto, I. R. A. Menezes, C. D. D. M. Oliveira, and H. D. M. Coutinho,

“Atividade antimicrobiana e efeito combinado sobre drogas antifungicas e antibacterianas do

fruto de Morinda citrifolia L .,” Acta Biológica Colomb., vol. 20, no. 3, pp. 193–200, 2015.

[47] C. D. C. Guimarães, T. C. Ferreira, R. Canato, F. De Oliveira, P. U. Simioni, and A. Ugrinovich,

“Atividade antimicrobiana in vitro do extrato aquoso e do óleo essencial do alecrim (

Rosmarinus officinalis L .) e do cravo-da-índia ( Caryophyllus aromaticus L .) frente a cepas de

Staphylococcus aureus e Escherichia coli,” Rev. Bras. Biociência, vol. 15, no. 2, pp. 83–89,

2017.

[48] E. Almeida et al., “Comparação de métodos para avaliação da atividade antimicrobiana e

determinação da concentração inibitória mínima ( cim ) de extratos vegetais aquosos e

etanólicos,” Pharmacol. / Sci. Artic., vol. 81, no. 3, pp. 218–225, 2014.

[49] E. A. Ostrosky, M. K. Mizumoto, M. E. L. Lima, T. M. Kaneko, S. O. Nishikawa, and B. R.

Freitas, “Divulgação da concentração mínima inibitória ( CMI ) de plantas medicinais,” Brazilian

J. Pharmacogn., vol. 18, no. 2, pp. 301–307, 2008.

[50] N. Saadati, P. Abdullah, Z. Zakaria, S. Belin, T. Sany, and M. Rezayi, “Limit of detection and

limit of quantification development procedures for organochlorine pesticides analysis in water

and sediment matrices,” Chem. Cent. J., vol. 63, no. 7, pp. 1–10, 2013.

[51] V. B. G. Alankar Shrivastava, “Methods for the determination of limit of detection and limit of

quantitation of the analytical methods,” Chronicles Young Sci., vol. 2, no. 1, pp. 21–25, 2011.

[52] C. Grosso, J. P. Coelho, F. L. P. Pessoa, J. M. N. A. Fareleira, J. G. Barroso, and J. S. Urieta,

“Mathematical modelling of supercritical CO 2 extraction of volatile oils from aromatic plants,”

Chem. Eng. Sci., vol. 65, pp. 3579–3590, 2010.

[53] O. B. Simona Carmen Duda, Liviu Alexandru Marghitas, Daniel Dezmireana, Marcel Dudab,

Rodica Margaoana, “Changes in major bioactive compounds with antioxidant activity of

Agastache foeniculum , Lavandula angustifolia , Melissa officinalis and Nepeta cataria : Effect

73

of harvest time and plant species,” Ind. Crop. Prod., vol. 77, pp. 499–507, 2015.

[54] A. Guri, P. Kefalas, and V. Roussis, “Antioxidant potential of six pine species,” Phyther. Res.,

vol. 20, no. 4, pp. 263–266, 2006.

[55] C. and L. S. Institute, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That

Grow Aerobically ; Approved Standard — Ninth Edition, vol. 32, no. 2. 2012.

[56] N. Document, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ;

Approved Standard — Second Edition Serving the World ’ s Medical Science Community

Through Voluntary Consensus, vol. 22, no. 15. 2002.

[57] M. A. W. Bauer, M.D. , W. M . M . KirbyI , J . C . Sherris, M. Turck, “Antibiotic susceptibility

testing by standardized single disk method ,” Am. J. Clin. Pathol., vol. 45, no. 4, pp. 493–496,

2018.

[58] M. Balouiri, M. Sadiki, and S. K. Ibnsouda, “Methods for in vitro evaluating antimicrobial

activity : A review $,” J. Pharm. Anal., vol. 6, no. 2, pp. 71–79, 2016.

[59] O. Ustun, F. S. Senol, M. Kurkcuoglu, I. E. Orhan, M. Kartal, and K. H. C. Baser, “Investigation

on chemical composition, anticholinesterase and antioxidant activities of extracts and essential

oils of Turkish Pinus species and pycnogenol,” Ind. Crops Prod., vol. 38, no. 1, pp. 115–123,

2012.

[60] Z. S. Miti et al., “Industrial Crops & Products Comparative study of the essential oils of four

Pinus species : Chemical composition , antimicrobial and insect larvicidal activity,” vol. 111, no.

October 2017, pp. 55–62, 2018.

76

Anexos 8.

ANEXO A - Distribuição do tamanho de partícula e determinação do diâmetro médio da mesma

Tabela 22:Determinação do diâmetro de partícula de P. halepensis depois da sua trituração e distribuição da mesma pelos diferentes peneiros com diferentes diâmetros

Diâmetro (mm) Massa (g) Fração Mássica F*D

1 136,48 0,275 0,275

0,8 147,13 0,296 0,237

0,63 161,42 0,325 0,205

0,5 36,49 0,073 0,0367

0,4 5,09 0,010 0,0041

0,315 5,66 0,011 0,0036

0,2 3,75 0,008 0,0015

0,1 1,15 0,002 0,00023

Diâmetro (mm) 0,76

ANEXO B – Determinação da densidade de Pinus halepensis

Tabela 23: Determinação da densidade aparente de P. halepensis

Volume (mL) Massa (g) Densidade (g/mL)

1,0 0,354 0,354

2,0 0,703 0,352

3,0 1,043 0,348

4,0 1,383 0,346

5,0 1,729 0,346

Média: 0,349

Desvio Padrão 0,004

Erro (%): 1,08

ANEXO C – Preparação de meios

- Meios de cultura usados:

Nutriente agar: Meio de cultura usado no crescimento de bactérias. A sua preparação foi

feita tendo em conta a indicação do frasco com uma concentração de 28g/L;

PDA: Meio de cultura usado no crescimento de fungos. A sua preparação foi feita tendo em

conta a indicação do frasco com uma concentração de 39,2g/L;

77

Malt Extract: Meio de cultura usado no crescimento de leveduras. A sua preparação foi feita

com uma concentração de 46g/L tendo em conta as seguintes proporções:

- Malt extratc:20g

- Peptona:6g

- Dextrose:20g

- 1 L de água destilada;

- Extratos:

Para estudar o efeito da inibição dos extratos obtidos por HD e ESF no método de difusão de

discos usou-se uma concentração de óleo de 60mg/mL. O solvente usado foi o DMSO.

Os cálculos para a obtenção desta concentração para os diferentes óleos encontram-se

especificadas na Tabela 24.

Tabela 24: Dados para o cálculo das diferentes concentrações de óleos e de solvente para a obtenção de uma concentração final de 60mg/mL

Massa

eppendorf

(g)

Massa

eppendorf +

Massa Óleo (g)

Massa Óleo (g) VDMSO

(mL)

VDMSO

(µL)

SFE -90bar_40ºC 2,788 2,813 0,025 0,423 423,3

SFE -100bar_40ºC 2,807 2,851 0,044 0,725 725,0

SFE- 110bar _50ºC 2,783 2,809 0,025 0,423 423,3

SFE-100bar _50ºC 2,807 2,836 0,029 0,482 481,7

HD 2,788 2,816 0,028 0,462 461,7

- Antibióticos usados:

Ampicilina:

- Preparar uma solução de 3mL com uma concentração de 7,5µg/mL (C16H18N3O4SNa);

- Transferir a suspensão em eppendorfs e armazenar a -4ºC.

Sulfato de Gentamicina:

- Preparar uma solução de 3mL com uma concentração de 330 μg/mL (11% de água e 571µg

Gentamicina base/mg);


Amphotericin b:

78

- Preparar uma solução de 1mL com uma concentração de 5,2mg/mL (C47H73NO17);


- Preparação da solução de 0.5 Farlan

-Preparar uma solução de 5mL com uma concentração de 0,48mol/L de Cloreto de Bário (1,175% v/v

de BaCl2.2H2O)

-Preparar uma solução de 0,18mol/L de Ácido Sulfúrico (H2SO4 a 1% v/v)

-Com agitação adicionar 0,5mL da solução de bário a 99,5mL de solução de H2SO4

-Verificar se a densidade da turbidez do padrão (absorvância) se encontra entre 0,08 -0,13 a 625nm

-Transferir a suspensão para tubos de 4 a 6mL em tubos de tampa roscada, selar e armazenar no

escuro à temperatura ambiente.

-Agitar sempre o padrão no vórtex antes de cada medição.

ANEXO D – Cálculo do Rendimento em Peso Seco da Hidrodestilação

Tabela 25: Determinação do rendimento da hidrodestilação com folhas de P. halepensis

Hidrodestilação M óleo (g) Rendimento (%)

1 0,784 0,784

2 0,825 0,825

3 0,775 0,775

Média: 0,795

79

ANEXO E- Microondas

Figura 40: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de 100ºC e 150W

durante 60minutos

80

Figura 41: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de 108ºC e 100W

durante 35minutos

81

Figura 42: Extração de óleo essencial da planta P. halepensis por microondas usando as condições de 108ºC e 100W durante 65minutos

ANEXO F - Medições efetuadas para a obtenção do óleo supercrítico

Tabela 26: Medições efetuadas e rendimentos obtidos na Extração com CO2 Supercrítico para a obtenção do óleo volátil de P. halepensis

Ensaio

Tempo

(min) Volume de CO2 (mL) Massa extraída (g)

Rendimento de

Extração (%)

90bar

40ºC

8L/min

1 17,00 140,61 0,2209 0,316

2 17,75 146,23 0,2097 0,615

3 22,58 187,94 0,2776 1,012

4 26,43 214,18 0,1493 1,225

5 31,28 253,41 0,0986 1,366

6 38,09 309,41 0,1489 1,579

7 45,00 353,96 0,0921 1,710

110bar

50ºC

8L/min

1 18,00 140,00 0,1070 0,153

2 18,45 151,94 0,1142 0,316

3 23,20 192,94 0,1341 0,508

4 38,50 304,28 0,2116 0,810

5 50,00 400,45 0,2118 1,112

6 48,05 404,38 0,1439 1,318

100bar

40ºC

8L/min

1 18,83 133,42 0,1243 0,178

2 19,33 155,35 0,1862 0,444

3 25,58 204,71 0,2851 0,851

4 38,00 305,18 0,2549 1,215

5 50,93 404,60 0,3604 1,730

100bar

50ºC

8L/min

1 16,20 154,12 0,0570 0,081

2 23,23 201,13 0,0640 0,173

3 36,35 310,15 0,1271 0,354

4 47,12 401,37 0,1363 0,549

5 60,00 500,46 0,1156 0,714

6 72,97 603,24 0,1146 0,878

90bar

40ºC

5,73L/min

1 28,82 154,01 0,3726 0,308

2 27,88 147,80 0,3858 0,628

3 33,00 199,11 0,3717 0,935

4 42,37 252,46 0,3709 1,242

82

5 50,57 297,62 0,3652 1,544

6 68,00 399,08 0,2846 1,780

90bar

40ºC

12L/min

1 12,23 150,00 0,4098 0,339

2 15,83 199,52 0,4430 0,706

3 21,23 270,65 0,5268 1,141

4 24,88 306,57 0,3857 1,461

5 33,16 414,58 0,4042 1,795

ANEXO G – Comparação estatística

As comparações estatísticas foram realizadas pelo oneway ANOVA seguido pelo teste Turkey

HSD. Os valores que apresentam um valor de probabilidade (p) menor que 0,05 são considerados

estatisticamente não significativos.

- Poder Antioxidante

Tabela 27: Média dos valores de poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE estudadas

Condições Média Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

SFE 90_40_6 0,61 0,05 8,20 A

SFE 90_40_12 0,57 0,03 5,26 B

SFE 90_40 0,44 0,03 6,82 C

SFE 110_50 0,56 0,05 8,93 D

SFE 100_40 0,63 0,04 6,35 E

SFE 100_50 0,57 0,04 7,02 F

HD 0,61 0,02 3,28 G

Soxhlet Hexano 5,89 0,24 4,07 H

Soxhlet Metanol 12,6 0,19 1,51 I

83


poder antioxidante de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE

Par

A B C D E F G H I

A

p-

value -

0.8999947

0.6441406

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.0010053

0.0010053

p - Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

B

p-

value - -

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.0010053

0.0010053

p - -

Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

C

p-

value - - -

0.8999947

0.5559413

0.8999947

0.6720432

0.0010053

0.0010053

p - - -

Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

D

p-

value - - - -

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.0010053

0.0010053

p - - - -

Insignificante

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

E

p-

value - - - - -

0.8999947

0.8999947

0.0010053

0.0010053

p - - - - -

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

F

p-

value - - - - - -

0.8999947

0.0010053

0.0010053

p - - - - - -

Insignificante

<0,01 <0,01

G

p-

value - - - - - - -

0.0010053

0.0010053

p - - - - - - - <0,01 <0,01

H

p-

value - - - - - - - -

0.0010053

p - - - - - - - - <0,01

84

- Teor de Polifenois

Tabela 29: Média dos valores de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE estudadas

Condições Média Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

SFE 90_40 0,44 0,02 4,27 A

SFE 110_50 0,35 0,24 6,86 B

SFE 100_40 0,37 0,01 2,11 C

SFE 90_40_6 0,42 0,01 3,46 D

SFE 90_40_12 0,35 0,01 2,33 E

SFE 100_50 0,36 0,01 3,5 F

HD 0,34 0,02 6,57 G

Soxhlet Hexano 0,51 0,02 4,23 H

Soxhlet Metanol 0,55 0,04 7,17 I

Tabela 30: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para o teor de polifenois de P. Halepensis nas diferentes condições de SFE

Par

A B C D E F G H I

A

p-

value - 0.0010

053

0.0181979

0.8999947

0.0011939

0.0010053

0.0010053

0.0010053

0.0078227

P - <0,01

p<0.05

Insignificante

<0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01

B

p-

value - -

0.6523915

0.0068670

0.8999947

0.8999947

0.8999947

0.0010053

0.0010053

P - -

Insignificante

p<0.01

Insignificante

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

C

p-

value - - -

0.1613756

0.7871381

0.8281449

0.3906172

0.0010053

0.0010053

P - - -

Insignificante

Insignificante

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

D

p-

value - - - -

0.0115368

0.0092676

0.0025169

0.0010053

0.0010053

P - - - -

p<0.05

<0,01 <0,01 <0,01 <0,01

E p-

value - - - - -

0.8999947

0.8999947

0.0010053

0.0010053

85

P - - - - -

Insignificante

Insignificante

<0,01 <0,01

F

p-

value - - - - - -

0.8999947

0.0010053

0.0010053

P - - - - - -

Insignificante

<0,01 <0,01

G

p-

value - - - - - - -

0.0010053

0.0010053

P - - - - - - - <0,01 <0,01

H

p-

value - - - - - - - -

0.4692917

P - - - - - - - -

Insignificante

- Atividade Antimicrobiana

Tabela 31: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus subtilis e respetivos desvio padrão e erros;

Média

Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

Controlo 26,4 0,9 3,6

DMSO - - -

HD 10,3 1,0 9,6 A

SFE 90_40 14,1 0,1 0,5 B

SFE 110_50 14,3 0,1 1,0 C

SFE 100_40 14,7 0,5 3,4 D

SFE 100_50 11,6 0,6 5,5 E

MAE 11,7 0,1 0,9 F

86

Tabela 32:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Bacillus subtilis;

Par A B C D E F

A

p-value - 0.0028066 0.0022782 0.0013477 0.2947236 0.2043412

p - <0,01 <0,01 <0,01 Insignificante Insignificante

B

p-value - - 0.8999947 0.8828612 0.0209513 0.0290724

p - - Insignificante Insignificante <0,05 <0,05

C

p-value - - - 0.8999947 0.0159764 0.0219412

p - - - Insignificante <0,05 <0,05

D

p-value - - - - 0.0080862 0.0108165

p - - - - <0,01 <0,05

E

p-value - - - - - 0.8999947

p - - - - - Insignificante

Tabela 33: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Escherichia coli e respetivos desvio padrão e erros;

Média

Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

Controlo 22,4 0,2 1,0

DMSO - - -

Hidrodestilação 9,4 0,4 4,1 A

SFE 90_40 9,9 0,8 7,9 B

SFE 110_50 9,1 0,2 2,5 C

SFE 100_40 11,4 0,3 2,5 D

SFE 100_50 11,3 0,5 4,7 E

MAE 9,7 0,3 3,2 F

87

Tabela 34: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Escherichia coli;

Par A B C D E F

A

p-value - 0.6843989 0.8999947 0.0010053 0.0010053 0.8999947

p - Insignificante Insignificante <0,01 <0,01 Insignificante

B

p-value - - 0.3893697 0.0043740 0.0063093 0.8999947

p - - Insignificante <0,01 <0,01 Insignificante

C

p-value - - - 0.0010053 0.0010053 0.7470496

p - - - <0,01 <0,01 Insignificante

D

p-value - - - - 0.8999947 0.0026709

p - - - - Insignificante <0,01

E

p-value - - - - - 0.0037435

p - - - - - <0,01

Tabela 35: Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Bacillus pumilus e respetivos desvio padrão e erros;

Média

Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

Controlo 22,0 1,0 4,55

DMSO - - -


SFE 90_40 10,5 0,7 6,2 B

SFE 110_50 11,2 0,7 6,5 C

SFE 100_40 11,7 0,7 5,6 D

SFE 100_50 11,9 0,6 5,4 E

MAE 10,7 0,5 4,6 F

88

Tabela 36: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Bacillus pumilus;

Par A B C D E F

A

p-value - 0.3209812 0.0157638 0.0010053 0.0010053 0.4021565

p - Insignificante <0,05 <0,01 <0,01 Insignificante

B

p-value - - 0.6406530 0.1172982 0.0349517 0.8999947

p - - Insignificante Insignificante <0,05 Insignificante

C

p-value - - - 0.8540059 0.5235452 0.8999947

p - - - Insignificante Insignificante Insignificante

D

p-value - - - - 0.8999947 0.4229704

p - - - - Insignificante Insignificante

E

p-value - - - - - 0.2008390


Tabela 37:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de Lactobacillus casei e respetivos desvio padrão e erros;

Média

Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

Controlo 24,7 1,2 4,7

DMSO - - -


SFE 90_40 10,8 0,6 5,3 B

SFE 110_50 12,7 1,2 9,6 C

SFE 100_40 10,2 0,5 5,2 D

SFE 100_50 10,7 0,3 2,5 E

MAE 10,0 0,7 7,4 F

89

Tabela 38: Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para Lactobacillus casei;

Par A B C D E F

A

p-value - 0.8999947 0.2196127 0.0010053 0.8970597 0.4281913

p - Insignificante Insignificante <0,01 Insignificante Insignificante

B

p-value - - 0.6238834 0.0010053 0.8999947 0.7935205

p - - Insignificante <0,01 Insignificante Insignificante

C

p-value - - - 0.0078546 0.8190097 0.8999947

p - - - <0,01 Insignificante Insignificante

D

p-value - - - - 0.0010661 0.0171641

p - - - - <0,01 <0,05

E

p-value - - - - - 0.8999947


Tabela 39:Média dos valores do diâmetro de zona de Inibição de saccharomyces cerevisae e respetivos desvio padrão e erros;

Média

Desvio Padrão

Erro (%)

Designação

Controlo 14,5 0,7 4,9

DMSO - - -


SFE 90_40 8,1 0,1 0,9 B

SFE 110_50 9,8 0,8 7,8 C

SFE 100_40 9,5 0,7 7,4 D

SFE 100_50 9,2 0,3 3,1 E

MAE 10,2 0,8 8,0 F

90

Tabela 40:Comparações estatísticas realizadas pelo oneway ANOVA pelo teste de Turkey HSD para saccharomyces cerevisae;

Par A B C D E F

A

p-value - 0.0205321 0.6297375 0.5523514 0.3255088 0.8999947

p - <0,05 Insignificante Insignificante Insignificante Insignificante

B

p-value - - 0.1649268 0.4502915 0.6529627 0.0550494

p - - Insignificante Insignificante Insignificante Insignificante

C

p-value - - - 0.8999947 0.8999947 0.8999947

p - - - Insignificante Insignificante Insignificante

D

p-value - - - - 0.8999947 0.8544063

p - - - - Insignificante Insignificante

E

p-value - - - - - 0.6205579


ANEXO H- Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis com extratos de P.

halepensis

Tabela 41: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação

Volume de extrato (µL) Acontrolo negativo Aamostra

2 0,22 0,13

4 0,23 0,35

6 0,27 0,26

8 0,25 0,37

91

Tabela 42: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação


2 0,24 0,06

4 0,24 0,08

6 0,22 0,35

8 0,14 0,27

Tabela 43: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 1mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação


2 0,22 0,05

4 0,23 0,06

6 0,26 0,10

8 0,23 0,08

Tabela 44: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 0,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra antes da centrifugação


2 0,21 0,17

4 0,24 0,08

6 0,24 0,11

8 0,22 0,06

92

Tabela 45: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação


2 0,17 0,10

4 0,16 0,18

6 0,18 0,23

8 0,27 0,26

Tabela 46: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 2,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação


2 0,20 0,05

4 0,24 0,06

6 0,24 0,11

8 0,17 0,26

Tabela 47: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 1mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação


2 0,19 0,15

4 0,20 0,05

6 0,19 0,05

8 0,22 0,06

93

Tabela 48: Percentagem de inibição do crescimento de Bacillus subtilis a diferentes volumes com uma concentração de 0,5mg/mL de extrato de folhas de P. halepensis e absorvância do controlo negativo e absorvância da amostra após centrifugação


2 0,19 0,05

4 0,22 0,04

6 0,24 0,05

8 0,21 0,06

ANEXO I- Determinação do Coeficiente de transferência de massa pelo método de Wakao e

Kaguei

Tabela 49: Dados para o cálculo do kf teórico tendo em conta o método de Wakao e Kaguei

Para calcular o coeficiente de transferência de massa usei as seguintes fórmulas [52]:

- Cálculo do número de Reynols:

𝑅𝑒 =𝑑𝑝𝜌𝑓𝑢

𝜇𝑓

-Cálculo do número de Schmidt:

𝑆𝑐 =𝜇𝑓

𝜌𝑓𝐷12

-Cálculo do número de Sherwood:

𝑆ℎ = 2 + 1,1𝑅𝑒0,6𝑆𝑐1/3

Condições viscosidade

(cP) Pf

(kg/m3)

d(m) V*10e4 (m/s)

V12 (cm

3/mol)

Re Sh Sc D12*10e-

11 kf*10e6

90bar_40ºC_8L/min 0,034806 485,5 0,0458 3,20 219,95 204,27 431,31 4128,15 1,74 0,16

100bar_40ºC_8L/min 0,047825 628,61 0,0458 2,32 221,44 139,81 297,65 2668,26 2,85 0,19

100bar_50ºC_8L/min 0,028368 386 0,0458 4,39 221,44 273,59 387,53 1766,85 4,16 0,35

110bar_50ºC_8L/min 0,03661 502,64 0,0458 3,05 219,066 191,54 318,82 1862,87 3,91 0,27

90bar_40ºC_6L/min 0,034806 485,5 0,0458 2,15 219,95 137,31 340,27 4128,15 1,74 0,13

90bar_40ºC_12L/min 0,034806 485,5 0,0458 4,83 219,95 308,68 551,99 4128,15 1,74 0,21

94

-Estimativa do coeficiente de difusão:

𝐷12 = 7,4 × 10−12

𝑇√∅𝑀1

𝜇𝑓𝑉2𝑏𝑝0,6

-Cálculo do coeficiente de transferência de massa:

𝑆ℎ =𝑑𝑝𝐾𝑓

𝐷12

Onde:

𝑑𝑝 – Diâmetro do leito, m

𝜌𝑓 – Densidade do solvente

𝑢- Velocidade, m/s

𝜇𝑓- Viscosidade do solvente, cP (http://webbook.nist.gov/chemistry)

∅- Fator de fluidos,assume valor 1 para o Dioxido de Carbono

𝑉2𝑏𝑝-Volume molar do óleo volátil, foi calculado tendo em conta os três maiores constituintes do óleo

essencial, α-Pineno, β-cariofileno e α-humuleno, m3/kmol

𝑀1- Massa Molar do Dióxido de Carbono, Kg/Kmol

𝑇- Temperatuira usada na SFE, K

extração, caracterização dos extratos de pinus halepensis · extração, caracterização dos...

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