extra cellular protease from the antarctic yeast candida humicola

8/6/2019 Extra Cellular Protease From the Antarctic Yeast Candida Humicola

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V o l . 5 5 , N o . 3N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , M a r . 1 9 8 7 , p . 7 1 6 - 7 2 00 0 1 9 - 9 5 6 7 / 8 7 / 0 3 0 7 1 6 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 7 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f a P r o t e a s e f r o mB a c t e r o i d e s g i n g i v a l i sSETSUO FUJIMURA* AND TAKESHI NAKAMURA

D e p a r t m e n t of O r a l M i c r o b i o l o g y , M a t s u m o t o D e n t a l C o l l e g e , S h i o j i r i - C i t y , N a g a n o - P r e f e c t u r e , J a p a n 3 9 9 - 0 7R e c e i v e d 1 6 A p r i l 1 9 8 6 / A c c e p t e d 1 8 November 1 9 8 6

A p r o t e a s e wa s p u r i f i e d f r o m B a c t e r o i d e s g i n g i v a l i s ATCC 3 3 2 7 7 c u l t u r e f l u i d b y s e q u e n t i a l p r o c e d u r e si n c l u d i n g ammonium s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n , i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , a n d i s o e l e c t r i c f o c u s i n g . T h ee n zym e wa s a c t i v e a g a i n s t b e n z o y l - L - a r g i n i n e - p - n i t r o a n i l i d e , c a r b o b e n z o x y - L - p h e n y l a l a n y l - L - v a l y l - L - a r g i n i n e -p - n i t r o a n i l i d e , a z o a l b u m i n , a z o c a s e i n , a z o c o l l , a n d p - t o s y l - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h eenzyme wa s a b o u t 3 0 0 , 0 0 0 as d e t e r m i n e d b y g e l f i l t r a t i o n . I t s i s o e l e c t r i c p o i n t was 5 . 0 . T h e maximum a c t i v i t ywas f o u n d a t pH 7 . 5 , a n d t h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e f o r a c t i v i t y wa s b e t w e e n 4 0 a n d 4 5 C . T h e a p p a r e n t Kmv a l u e f o r b e n z o y l - L - a r g i n i n e - p - n i t r o a n i l i d e was 2 m M. T h e e nzy m e was i n h i b i t e d b y s u l f h y d r y l g r o u p - b l o c k i n gr e a g e n t s , t o s y l - L - l y s i n e c h l o r o m e t h y l k e t o n e , a n d EDTA. S o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r a n d d i i s o p r o p y l f l u o r o -p h o s p h a t e were n o t i n h i b i t o r y .

A l t h o u g h i t i s c l e a r t h a t p e r i o d o n t a l d i s e a s e i s i n i t i a t e d b yb a c t e r i a , r e l a t i v e l y f e w s p e c i e s may b e i n v o l v e d a s t h ec a u s a t i v e a g e n t s . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t many o f t h eg r a m - n e g a t i v e i s o l a t e s f r o m p e r i o d o n t i t i s l e s i o n s , i n c l u d i n gt h e b l a c k - p i g m e n t e d B a c t er o i de s g r o u p a n d p a r t i c u l a r l y B a c -t e r o i d e s g i n g i v a l i s , a r e s t r o n g l y a s s o c i a t e d w i t h t h e e t i o l o g ya n d p a t h o g e n e s i s o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e ( 1 6 , 2 6 , 2 7 ) . O n ec r i t e r i o n f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f B . g i n g i v a l i s f r o m o t h e rs p e c i e s o f B a c t e r o i d e s i s p r o d uc t io n o f a t r y p s i n - l i k e p r o t e -a s e f r o m t h i s o r g a n i s m ( 1 1 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h i se n z y m e i s a n i m p o r ta n t p a t h o g e ni c f a c t o r o f B . g i n g i v a l i s i np e r i o d o n t a l d i s e a s e ( 1 2 ) . R e c e n t l y , Y o s h i m u r a e t a l . ( 3 4 )p a r t i a l l y p u r i f i e d t h i s e n z y m e f r o m t h e e n v e l o p e f r a c t i o n o fB . g i n g i v a l i s . We a l s o h a v e f o u n d p r o t e o l y t i c a c t i v i t y i n t h ec u l t u r e f l u i d o f a s t r a i n o f B . g i n g i v a l i s . I n t h i s r e p o r t wed e s c r i b e t h e p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i s e n -z y m e .

MATERIALS AND METHODSB a c t e r i a l s t r a i n a n d c u l t i v a t i o n m e t h o d s . B . g i n g i v a l i sATCC 3 3 2 7 7 w a s u s e d a s t h e p r o d u c e r s t r a i n o f p r o t e a s e .T h e s t r a i n w a s g r o w n i n a g e n e r a l a n a e r o b i c m e d i u m b r o t h( N i s s u i S e i y a k u C o . , T o k y o , J a p a n ) s u p p l e m e n t e d w i t hh e m i n ( 5 m g / l i t e r ) a n d m e n a d i o n e ( 0 . 5 m g / l i t e r ) a t 3 7 C i n a na n a e r o b i c g l o v e b o x f i l l e d w i t h a m i x t u r e o f g a s e s ( N 2 - H 2 -C 0 2 ; 8 5 : 1 0 : 5 ) f o r 6 d a y s . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e g e n e r a la n a e r o b i c m e d i u m b r o t h w a s a s f o l l o w s , i n g r a m s p e r l i t e r :p e p t o n e , 1 0 . 0 ; s o y b e a n p e p t o n e , 3 . 0 ; p r o t e o s e p e p t o n e ,1 0 . 0 ; d i g e s t e d s e r u m p o w d e r , 1 3 . 0 ; y e a s t e x t r a c t , 5 . 0 ; b e e fe x t r a c t , 2 . 2 ; l i v e r e x t r a c t , 1 . 2 ; g l u c o s e , 3 . 0 ; d i b a s i c p o t a s -s i u m p h o s p h a t e , 2 . 5 ; N a C l , 3 . 0 ; s o l u b l e s t a r c h , 5 . 0 ; L -c y s t e i n , 0 . 3 ; a n d t h i o g l y c o l a t e , 0 . 3 . T h e pH o f t h e m e d i u mw a s 7 . 2 .A s s a y o f e n z y m e a c t i v i t y . ( i ) H y d r o l y s i s o f B z - L - A r g - p N Aa n d o t h e r p - n i t r o a n i l i d e d e r i v a t i v e s o f a m i n o a c i d s o r p e p t i d e .R o u t i n e a s s a y o f p r o t e a s e a c t i v i t y w a s c a r r i e d o u t w i t h as y n t h e t i c c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e , b e n z o y l - L - a r g i n i n e - p -n i t r o a n i l i d e ( B z - L - A r g - p N A ) , b y t h e m e t h o d o f E r l a n g e r e ta l . ( 7 ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o n s i s t e d o f 2 . 5 m l o f 1 mMB z - L - A r g - p N A i n 0 . 0 5 M T r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , 0 . 4 m l* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

o f 0 . 0 5 M T r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , a n d 0 . 1 m l o f e n z y m e .A f t e r i n c u b a t i o n o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e a t 3 7 C f o r 3 0 m i n ,0 . 5 m l o f 5 N a c e t i c a c i d w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r et o s t o p t h e r e a c t i o n , a n d t h e r e l e a s e d p - n i t r o a n i l i n e w a sd e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e A 4 1 0 . O n e u n i t o f a c t i v i t y w a sd e f i n e d a s t h e l i b e r a t i o n o f 1 , u m o l o f p - n i t r o a n i l i n e p e r m i nu n d e r t h e s e c o n d i t i o n s .( i i ) H y d r o l y s i s o f a z o a l b u m i n a n d a z o c a s e i n . P r o t e o l y t i ca c t i v i t y a g a i n s t a z o a l b u m i n a n d a z o c a s e i n w a s d e t e r m i n e db y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y L e i g h t o n e t a l .( 1 3 ) . T h e r e a c t i o n m i x t u r e , c o n t a i n i n g 0 . 2 m l o f 5% a z o c a -s e i n o r a z o a l b u m i n d i s s o l v e d i n 0 . 0 5 M T r i s m a l e a t e b u f f e r( p H 7 . 5 ) , 0 . 7 m l o f T r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , a n d 0 . 1 m l o fe n z y m e s o l u t i o n , w a s i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 3 0 m i n . T h er e a c t i o n w a s s t o p p e d b y a d d i n g 1 m l o f 1 0 % t r i c h l o r o a c e t i ca c i d . T h e p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d 0 . 2m l o f 1 . 8 N NaOH w a s a d d ed t o 0 . 8 m l o f t h e s u p e r n a t a n ts o l u t i o n c o n t a i n i n g t h e d i a z o t i z e d t r i c h l o r o a c e t i c a c i d -s o l u b l e p e p t i d e s . T h e A 4 2 0 w a s m e a s u r e d , a n d 1 U o f a c t i v i t yw a s d e f i n e d a s t h e i n c r e a s e o f t h e A 4 2 0 b y 1 . 0 p e r m i n.( i i i ) H y d r o l y s i s o f a z o c o l l . H y d r o l y s i s o f a z o c o l l w a s e x a m -i n e d i n c e n t r i f u g e t u b e s . E a c h t u b e c o n t a i n e d 2 m g o fa z o c o l l , 0 . 9 m l o f 0 . 0 5 M T r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , a n d0 . 1 m l o f e n z y m e s o l u t i o n . A f t e r i n c ub a t i o n a t 3 7 C f o r 3 0m i n , t h e t u b e s w e r e i m m e d i a t e l y c h i l l e d i n a n i c e w a t e r b a t h .S u b s e q u e n t l y , t h e t u b e s w e r e c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n a t 1 , 0 0 0x g a t 4 C , a n d t h e A 5 2 0 o f t h e s u p e r n a t a n t s o l u t i o n w a sm e a s u r e d . T h e a c t i v i t y w a s d e f i n e d a s t h e i n c r e a s e o f t h eA 5 2 0 b y 1 . 0 p e r m i n .( i v ) C o l l a g e n a s e a c t i v i t y . H y d r o l y s i s o f i n s o l u b l e c o l l a g e nw a s t e s t e d b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y L o e s c h e e t a l . ( 1 5 )w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . B o v i n e A c h i l l e s t e n d o n c o l l a g e n ( 5m g ; S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) w a s i n c u b a t e dw i t h 1 m l o f t h e p u r i f i e d e n z y m e p r e p a r a t i o n i n 0 . 0 5 M T r i sm a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) a t 3 7 C w i t h s h a k i n g f o r 8 h . A f t e ri n c u b a t i o n t h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e f i l t e r e d t h r o u g h a f i l t e rm e m b r a n e ( p o r e s i z e , 0 . 4 5 , u m ; M i l l i p o r e C o r p . , B e d f o r d ,M a s s . ) , a n d t h e f i l t r a t e s w e r e s u b j e c t e d t o t h e n i n h y d r i nr e a c t i o n ( 1 8 ) t o d e t e c t t h e h y d r o l y t i c p r o d u c t s . I n a d d i t i o n ,c o l l a g e n a s e a c t i v i t y w a s a s s e s s e d b y u s i n g a s y n t h e t i c p e p -t i d e s u b s t r a t e f o r c o l l a g e n a s e , c a r b e n z o y l - g l y c y l - L - p r o l y l - L -l e u c y l - g l y c y l - L - p r o l i n e ( P r o t e i n I n s t i t u t e , I n c . , O s a k a , J a -p a n ) , a s d e s c r i b e d b y N a g a i e t a l . ( 1 9 ) . T h e n i n h y d r i n

7 1 6


2/5

B . GINGIVALIS PROTEASE ISOLATION AND CHARACTERIZATION 7 1 7

r e a c t i o n w a s e m p l o y e d t o d e t e r m i n e t h e h y d r o l y t i c p r o d u c t sb y t h e e n z y m e f r o m t h i s s u b s t r a t e .( v ) E s t e r a s e a c t i v i t y . E s t e r o l y t i c a c t i v i t y w a s a s s a y e d b yu s i n g p - t o s y l - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r b y t h e m e t h o d d e -s c r i b e d b y R i c k ( 2 4 ) .P r o t e i n d et e rm i n a ti o n. P r o t e i n w a s e s t i m a t e d b y t h em e t h o d d e s c r i b e d b y Lowry e t a l . ( 1 7 ) . F o r s a m p l e s c o n t a i n -i n g T r i t o n X - 1 0 0 , t h e p r o c e d u r e w a s c a r r i e d o u t w i t h s o d i u md o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) ( 2 5 ) .D e t e r m i n a t i o n o f o p t i m u m p H . P r o t e o l y t i c a c t i v i t y w a sa s s a y e d a t d i f f e r e n t pH v a l u e s b y u s i n g a p p r o p r i a t e b u f f e r s .S a m p l e s o f t h e p u r i f i e d p r o t e a s e p r e p a r a t i o n ( 0 . 1 m l ) i n 0 . 0 5M T r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) w e r e a d d e d t o a s s a y m i x t u r e sc o n t a i n i n g 2 . 5 m l o f B z - L - A r g - p N A s o l u t i o n i n 0 . 1 M o f t h ed i f f e r e n t t e s t b u f f e r s a n d 0 . 4 m l o f O . 1 M T r i s m a l e a t e b u f f e r .A c e t a t e b u f f e r ( p H 4 . 5 , 5 . 0 , 5 . 5 , 6 . 0 ) , p h o s p h a t e b u f f e r ( p H6 . 5 , 7 . 0 , a n d 7 . 5 ) , a n d T r i s h y d r o c h l o r i d e b u f f e r ( p H 8 . 0 , 8 . 5 ,a n d 9 . 0 ) w e r e u s e d .E f f e c t o f v a r i o u s r e a g e n t s o n t h e e n z y m e . T h e e f f e c t s o fi n h i b i t o r s a n d m e t a l i o n s o n t h e e n z y m e a c t i v i t y w e r e t e s t e da t pH 7 . 5 . T h e p u r i f i e d e n z y m e p r e p a r a t i o n w a s p r e i n c u -b a t e d w i t h e a c h r e a g e n t a t 2 5 C f o r 3 0 m i n . S u b s e q u e n t l y ,t h e s u b s t r a t e s o l u t i o n was a d d e d t o s t a r t t h e p r o t e o l y t i cr e a c t i o n . T h e a c t i v i t y w a s e x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t h ev a l u e f o r t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t , w h i c h d i d n o t i n c l u d e t h et e s t r e a g e n t s .P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T o e x a m i n e t h e p u r i t yo f t h e s a m p l e , p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s c a r -r i e d o u t b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y D a v i s ( 5 ) . T h e c o n c e n -t r a t i o n o f t h e g e l w a s 6 % . P r o t e i n b a n d s w e r e s t a i n e d w i t hC o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e G - 2 5 0 . S i m u l t a n e o u s l y , a n u n -s t a i n e d g e l w a s c u t i n t o 1 - m m - t h i c k n e s s p i e c e s , a n d e a c hp i e c e w a s i n c u b a t e d i n 1 m l o f 1 mM B z - L - A r g - p N A i n 0 . 2 MT r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) t o d e t e r m i n e t h e l o c a t i o n o fe n z y m e a c t i v i t y i n t h e g e l .D e t e r m i n a t i o n o f m o l e c u l a r w e i g h t . T h e m o l e c u l a r w e i g h tw a s d e t e r m i n e d b y g e l f i l t r a t i o n o n a S e p h a d e x G - 2 0 0c o l u m n , a s d e s c r i b e d b y A n d r e w s ( 2 ) . T h e m a r k e r p r o t e i n sw e r e c a t a l a s e ( M r , 2 3 2 , 0 0 0 ) , a l d o l a s e ( M r , 1 5 8 , 0 0 0 ) , b o v i n es e r u m a l b u m i n ( M r , 6 7 , 0 0 0 ) , c h y m o t r y p s i n o g e n A ( M ,2 5 , 0 0 0 ) , a n d R N a s e A ( M r , 1 3 , 7 0 0 ) .P r e p a r a t i o n o f c e l l e x t r a c t . T h e c e l l s o f B . g i n g i v a l i s ATCC3 3 2 7 7 t h a t w e r e h a r v e s t e d f r o m 2 , 0 0 0 m l o f c u l t u r e ( 1 3 g [ w e tw e i g h t ] ) w e r e s u s p e n d e d i n 0 . 0 5 M T r i s h y d r o c h l o r i d e b u f f e r( p H 7 . 5 ) , a n d t h e y w e r e s u b j e c t e d t o u l t r a s o n i c t r e a t m e n t a t9 KHz f o r 1 0 m i n a t 4 C . T r i t o n X - 1 0 0 was a d d e d a t 1% t ot h e s o n i c a t e d m a t e r i a l , f o l l o w e d b y s t i r r i n g f o r 2 h a t 4 C .F i n a l l y , t h i s s a m p l e was c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0m i n , a n d a c l e a r c e l l e x t r a c t was o b t a i n e d .I s o e l e c t r i c f o c u s i n g . I s o e l e c t r i c f o c u s i n g was c a r r i e d o u t a ta b o u t 4 C , w i t h a 1 1 0 - m l c a p a c i t y c o l u m n (LKB I n s t r u -m e n t s , I n c . , R o c k v i l l e , M d . ) w i t h 1% ( v o l / v o l ) a m p h o l i n e( p H 3 . 5 t o 1 0 . 0 ) , b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y V e s t e r b e r g e ta l . ( 3 3 ) . F o c u s i n g w a s d o n e f o r 3 0 h u n d e r c o n s t a n t v o l t a g e( 4 0 0 V ) . F r a c t i o n s o f 2 m l w e r e c o l l e c t e d , a n d t h e pH o f e a c hf r a c t i o n was m e a s u r e d . T h e a s s a y f o r p r o t e o l y t i c a c t i v i t yw a s c a r r i e d o u t b y u s i n g 0 . 1 - m l p o r t i o n s o f e a c h f r a c t i o n b yt h e m e t h o d d e s c r i b e d a b o v e .P u r i f i c a t i o n . C e l l - f r e e c u l t u r e f l u i d ( 2 , 0 0 0 m l ) was p r e p a r e db y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n . Ammoniums u l f a t e was a d d e d t o t h i s s a m p l e a t 30% s a t u r a t i o n , a n d t h em i x t u r e was s t i r r e d f o r a n a d d i t i o n a l 1 h . T h e p r e c i p i t a t e wasc o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 5 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n . T h i sp r e c i p i t a t e was s u s p e n d e d i n 5 0 m l o f 0 . 0 5 M T r i s h y d r o -c h l o r i d e b u f f e r ( p H 8 . 1 ) c o n t a i n i n g 0 . 0 1 M 2 - m e r c a p t o e t h -a n o l ( T M ) a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n . T h e

P o o l.40 . 4 10 . 3

00 . 2

0 . 1

E

U4

0 L

az 0

F r a c t i o n N o .F I G . 1 . F i r s t D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e -a s e . S y m b o l s : 0 , e n z y m e a c t i v i t y a g a i n s t B z - L - A r g - p N A ; -, A 2 8 0 ;N a C I c o n c e n t r a t i o n .

p r e c i p i t a t e was d i s s o l v e d i n 4 0 m l o f TM c o n t a i n i n g 1%T r i t o n X - 1 0 0 ( T M T ) . A s l i g h t amount o f i n s o l u b l e m a t e r i a lw a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n .T h e s u p e r n a t a n t ( T M T - s o l u b l e f r a c t i o n ) c o n t a i n i n g t h e e n -z y m e a c t i v i t y was a p p l i e d t o a c o l u m n ( 1 . 5 b y 4 5 c m ) o fD E A E - c e l l u l o s e , w h i ch h a d b ee n e q u i l i b r a t e d e a r l i e r w i t hTMT. A f t e r t h e c o l u m n was w a s h e d w i t h 5 0 0 m l o f T M T , t h ec o l u m n was e l u t e d w i t h a l i n e a r c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t o fN a C l , w h i c h was g e n e r a t e d b y m i x i n g 2 5 0 m l o f TMTc o n t a i n i n g 0 . 4 M N a C l i n t o a n e q u a l v o l u m e o f TMT. T h ef l o w r a t e was 2 5 m l / h , a n d 5 - m l f r a c t i o n s were c o l l e c t e d . O n em a j o r a n d o n e m i n o r p e a k o f t h e p r o t e o l y t i c a c t i v i t ye m e r g e d f r o m t h e c o l u m n a t N a C l c o n c e n t r a t i o n s o f a b o u t0 . 1 a n d 0 . 2 M , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 1 ) . We u n d e r t o o k f u r t h e rp u r i f i c a t i o n o f t h e m a j o r f r a c t i o n b e c a u s e t h e m i n o r f r a c t i o nwas n e g l i g i b l e i n q u a n t i t y . T h e a c t i v e f r a c t i o n s i n d i c a t e d i nF i g . 1 w e r e c o l l e c t e d a n d d i a l y z e d a g a i n s t T M T , a n d c h r o -m a t o g r a p h y o n t h e D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n ( 1 . 5 b y 3 0 c m )was r e p e a t e d w i t h a l i n e a r c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t o f N a C lf r o m 0 t o 0 . 4 M ( 2 0 0 m l on e a c h s i d e ) . T h e a c t i v e f r a c t i o n sw e r e c o l l e c t e d a n d s u b j e c t e d t o p a r t i a l r e m o v a l o f T r i t o nX - 1 0 0 b y u s i n g B i o - B e a d s S M - 2 ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ,R i c h m o n d , C a l i f . ) b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y H o l l o w a y( 1 0 ) , f o l l o w e d b y d i a l y s i s a g a i n s t 1% g l y c i n e s o l u t i o n c o n -t a i n i n g 0 . 0 1 M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . When t h i s s a m p l e wase l e c t r o p h o r e s e d o n a n i s o e l e c t r i c f o c u s i n g c o l u m n , t h e e n -z y m e a c t i v i t y was c o n c e n t r a t e d a t t h e f r a c t i o n c o l l e c t e d a tpH 5 . 0 . F i n a l l y , t h i s f r a c t i o n was d i a l y z e d a g a i n s t 0 . 0 5 MT r i s m a l e a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) .RESULTS

P u r i f i c a t i o n . T h e c u l t u r e f l u i d ( 2 , 0 0 0 m l ) t h a t was u s e d a st h e s t a r t i n g m a t e r i a l f o r t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e c o n t a i n e d9 0 0 U o f p r o t e o l y t i c a c t i v i t y , b u t o n l y 1 1 0 U was f o u n d i nc e l l e x t r a c t s f r o m 1 3 g ( w e t w e i g h t ) o f t h e o r g a n i s m . A b o u t77% o f t h e e n z y m e a c t i v i t y i n t h e c u l t u r e f l u i d was r e c o v e r e di n t h e T M T - s o l u b l e f r a c t i o n . T h e e n z y m e was p u r i f i e d 4 , 1 9 0t i m e s , w i t h a r e c o v e r y o f 7 % ( T a b l e 1 ) . T h e p u r i f i e d p r e p a -r a t i o n was h o m o g e n e o u s , a s j u d g e d b y p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s ( F i g . 2 ) .M o l e c u l a r w e i g h t . T h e m o l e c u l a r w e i g h t , a s d e t e r m i n e d b yS e p h a d e x G - 2 0 0 g e l f i l t r a t i o n , was 3 0 0 , 0 0 0 .

V O L . 5 5 , 1 9 8 7


3/5

7 1 8 FUJIMURA AND NAKAMURATABLE 1 . P u r i f i c a t i o n o f p r o t e a s e

Total ~ T o t a l Y e d P u r i f i c a t i o nF r a c t i o n a c t i v i t y ( U ) p r o t e i n S p a c t ( % ) ( n t i o m eC u l t u r e f l u i d 9 0 0 4 1 , 0 0 0 0 . 0 2 1 0 0 1Ammonium s u l f a t e f r a c t i o n ( 3 0 % s a t u r a - 7 6 5 2 , 4 0 0 0 . 3 2 8 5 1 6t i o n )T M T - s o l u b l e f r a c t i o n 6 9 0 4 0 0 1 . 7 3 7 7 8 7F i r s t D E A E - c e l l u l o s e f r a c t i o n 2 5 0 5 7 4 . 3 9 2 8 2 2 0S e c o n d D E A E - c e l l u l o s e f r a c t i o n 1 8 0 2 5 7 . 2 0 2 0 3 6 0I s o e l e c t r i c f o c u s i n g 6 7 0 . 8 8 3 . 7 5 7 4 , 1 9 0

a E n z y m e a c t i v i t y p e r m il l i gr a m o f p r o t e i n i n t h e f r a c t i o n o f e a c h s t e p .

O p t i m u m t e m p e r a t u r e . When t h e h y d r o l y s i s o f B z - L - A r g -pNA w a s c a r r i e d o u t a t v a r i o u s t e m p e r a t u r e s , t h e h i g h e s ta c t i v i t y w a s f o u n d a t 4 0 t o 4 5 C .O p t i m u m p H . T h e pH p r o f i l e o f t h e e n z y m e a c t i v i t yd e m o n s t r a t e d t h a t t h e e n z y m e h a d a n o p t i m u m pH o f 7 . 5 .Km v a l u e . From t h e e x t r a p o l a t i o n o f t h e L i n e w e a v e r - B u r kp l o t , a n a p p a r e n t Km v a l u e f o r B z - L - A r g - p N A w a s c a l c u l a t e dt o b e 2 mM ( F i g . 3 ) . A t h i g h s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s t h eh y d r o l y s i s r a t e d e c r e a s e d . T h i s r e s u l t c o u l d p o s s i b l y b ee x p l a i n e d b y a s u b s t r a t e i n h i b i t i o n p h e n o m e n o n .S u b s t r a t e s p e c i f i c i t y . T h e a c t i v i t i e s a g a i n s t s e v e r a l s u b -s t r a t e s w e r e c o m p a r e d . T h e e n z y m e p r e p a r a t i o n ( 0 . 2 1 8 U o fB z - L - A r g - p N A h y d r o l y t i c a c t i v i t y ) e x e r t e d 0 . 2 2 0 U o f a c t i v -i t y f o r c a r b e n z o y l - L - P h e - L - V a l - L - A r g - p N A , 0 . 0 1 3 U f o ra z o c a s e i n , 0 . 0 1 1 U f o r a z o a l b u m i n , 0 . 0 2 7 U f o r a z o c o l l , a n d0 . 0 5 0 U f o r p - t o s y l - L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r . L - A r g - p N a ,B z - D L - L y s - p N A , a n d L - L y s - p N A w e r e n o t h y d r o l y z e d . T h er e s u l t o f t h e n i n h y d r i n r e a c t i o n f o r t h e f i l t r a t e o f c o l l a g e nt h a t h a d b e e n i n c u b a t e d w i t h t h e e n z y m e w a s n e g a t i v e .From c a r b e n z o y l - g l y c y l - L - p r o l y l - L - l e u c y l - g l y c y l - L - p r o l i n e ,n i n h y d r i n - p o s i t i v e m a t e r i a l w a s n ot d et e c t e d a f t e r i n c u b a -t i o n w i t h t h e e n z y m e .E f f e c t s o f i n h i b i t o r s a n d m e t a l i o n s . T h e p o s s i b l e i n h i b i t o r ya n d a c t i v a t i n g e f f e c t s o f v a r i o u s c h e m i c a l s o n t h e p r o t e a s ea r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 2 . T h e e n z y m e w a s s e n s i t i v e t oi n h i b i t i o n b y p - c h l o r o m e t h y l m e r c u r i b e n z o a t e , N - e t h y l m a l e -i m i d e , a n d H g 2 + . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e s u l f h y d r y lg r o u p o f t h i s e n z y m e i s v e r y i m p o r t a n t t o t h e e n z y m a t i ca c t i v i t y . T o s y l - L - l y s i n e c h l o r o m e t h y l k e t o n e a l s o s t r o n g l yi n h i b i t e d t h e a c t i v i t y . T h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f EDTA w a so b v i o u s ; h o w e v e r , t h e f e r r o u s i o n c h e l a t o r O - p h e n a n t h r o l i n eh a d n o e f f e c t . S o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r a n d s e r i n e e n z y m e

U -

i n h i b i t o r s , s u c h a s d i i s o p r o p y l f l u o r o p h o s p h a t e , h a d s u b -s t a n t i a l l y n o e f f e c t . C o n s i d e r a b l e a c t i v a t i o n w a s s e e n i nC a 2 " a n d M g 2 "C o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n b y b e n z o y l - L - a r g i n i n e . I t w a s o b -s e r v e d t h a t b e n z o y l - L - a r g i n i n e , t h e h y d r o l y t i c p r o d u c t o fB z - L - A r g - p N A , i n h i b i t e d c o m p e t i t i v e l y t h e a c t i v i t y o f t h ee n z y m e . I t s K i v a l u e was c a l c u l a t e d t o b e 3 . 2 m M.DISCUSSION

T h e p r o t e a s e d e a l t w i t h i n t h i s s t u d y w a s s o l u b i l i z e d w i t hT r i t o n X - 1 0 0 a f t e r t h e c u l t u r e s u p e r n a t a n t w a s p r e c i p i t a t e dw i t h a r e l a t i v e l y l o w c o n c e n t r a t i o n o f ammonium s u l f a t e( 3 0 % s a t u r a t i o n ) . T h e e n z y m e w a s p r o b a b l y l i b e r a t e d i n t ot h e s u r r o u n d i n g m e d i u m a s t h e c o m p l e x f o r m , w i t h c e l ld e b r i s a c c u m u l a t i n g w i t h t h e p r o g r es s i on o f c e l l l y s i s .L a u g h o n e t a l . ( 1 1 ) d e m o n s t r a t e d t h e p r o d u c t i o n o f ap r o t e o l y t i c e n z y m e f r o m B . g i n g i v a l i s s t r a i n s w i t h a n A P IZYM s y s t e m ( A n a l y t a b P r o d u c t s , P l a i n v i e w , N . Y . ) t h a th y d r o l y z e d b e n z o y l - D L - a r g i n i n e - 2 - n a p h t h y l a m i d e . T h e y r e -f e r r e d t o t h i s e n z y m e a s t r y p s i n - l i k e p r o t e a s e . Van W i n k e l -h o f f e t a l . ( 3 2 ) a l s o o b t a i n e d s i m i l a r r e s u l t s . T h e y c o n f i r m e dt h a t a l l t h e t e s t e d s t r a i n s o f B . g i n g i v a l i s p o s s e s s e d t h eh y d r o l y t i c a c t i v i t y o f b e n z o y l - D L - a r g i n i n e - 2 - n a p h t h y l a m i d e .T h e e n z y m e p r e s e n t e d i n t h i s r e p o r t w a s a c t i v e a g a i n s t n o to n l y B z - L - A r g - p N A b u t a l s o c a r b e n z o y l - L - P h e - L - V a l - L - A r g -pNA, w h i c h i s a s u i t a b l e s u b s t r a t e f o r t r y p s i n , a n d p - t o s y l -L - a r g i n i n e m e t h y l e s t e r . T h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t t h e e n -z y m e i s a t r y p s i n - r e l a t e d p r o t e a s e b e c a u s e o f i t s s u b s t r a t es p e c i f i c i t y . G e n e r a l p r o t e o l y t i c s u b s t r a t e s ( a z o c a s e i n ,a z o a l b u m i n , a n d a z o c o l l ) w e r e a l s o f o u n d t o b e h y d r o l y z e d

v - i

5 10[ B z - L - a r g - p N A ] ,mM

1 5

F I G . 2 . P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e p u r i f i e d p r o t e -a s e ( w i t h o u t S D S ) . M i g r a t i o n w a s f r o m t o p t o b o t t o m .

I N F E C T . IMMUN.

F I G . 3 . L i n e w e a v e r - B u r k p l o t o f p r o t e a s e .


4/5

B . GINGIVALIS PROTEASE ISOLATION AND CHARACTERIZATION 7 1 9TABLE 2 . E f f e c t s o f i n h i b i t o r s a n d m e t a l i o n s

R e a g e n t s C o n c n A c t i v i t y ( % )( M M )C o n t r o l 1 0 0p - C h l o r o m e t h y l m e r c u r i b e n z o a t e 0 . 0 1 0N - E t h y l m a l e i m i d e 1 . 0 0D i i s o p r o p y l f l u o r o p h o s p h a t e 5 . 0 9 3T o s y l - L - l y s i n e c h l o r o m e t h y l k e t o n e 0 . 0 1 0EDTA 1 . 0 1 3O - P h e n a n t h r o l i n e 5 . 0 9 8T r y p s i n i n h i b i t o r ( s o y b e a n ) 5 a 8 5C a 2 + 3 . 0 1 4 4M g 2 + 3 . 0 1 4 1H g 2 + 3 . 0 0

a 5 m g / m l .

b y t h i s e nzy m e. T h e presence o f t h i o l - d e p e n d e n t c o l l a g e n o -l y t i c enzyme i n t h e c u l t u r e f l u i d o f B . g i n g i v a l i s h a s b e e ns h o w n b y T o d a e t a l . ( 2 8 ) . G l y c y l p r o l y l d i p e p t i d y l a m i n o -p e p t i d a s e , w h i c h i s c o n s i d e r e d t o b e a b l e t o c l e a v e p a r t i a l l yd i g e s t e d c o l l a g e n , h a s b e e n p u r i f i e d f r o m B . g i n g i v a l i s ( 1 ) .C o l l a g e n a s e a c t i v i t y , h o w e v e r , was n o t d e m o n s t r a t e d i n o u renzyme when e x a m i n e d b y u s i n g c o l l a g e n f i b r i l o r a syn-t h e t i c p e p t i d e s u b s t r a t e f o r c o l l a g e n a s e .T h e enzyme s t u d i e d h e r e was n o t a s e r i n e e nzy m e ,b e c a u s e no s i g n i f i c a n t i n h i b i t i o n o f t h e enzyme b y d i i s o p r o -p y l f l u o r o p h o s p h a t e was o b s e r v e d . I t was i n h i b i t e d m a r k -e d l y b y t h e s u l f h y d r y l g r o u p - b l o c k i n g r e a g e n t s , i n d i c a t i n gt h a t t h i s enzyme i s a t h i o l enzyme. S o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o rh a d e s s e n t i a l l y no e f f e c t . T h e enzyme d i d n o t h y d r o l y z e t h el y s y l b o n d , a l t h o u g h i t h y d r o l y z e d t h e a r g i n y l b o n d s a n d t h ea r g i n y l e s t e r . C o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o f t h e p r o t e o l y t i c a c t i v -i t y b y b e n z o y l - L - a r g i n i n e was a l s o r e p o r t e d b y B e c h e t e t a l .( 3 ) i n t r y p s i n . T h e K i v a l u e i n t h i s case was 5 . 8 m M.T h e e n z y m a t i c p r o p e r t i e s o f B . g i n g i v a l i s ATCC 3 3 2 7 7r e s e m b l e d t h o s e o f t h e p r o t e a s e i s o l a t e d b y Y o s h i m u r a e t a l .( 3 4 ) f r o m a n o t h e r s t r a i n o f B . g i n g i v a l i s . O u r Km v a l u e f o rB z - L - A r g - p N A , h o w e v e r , was l a r g e r t h a n t h e i r v a l u e b y 2 0 0t i m e s , a n d o u r enzyme was much more s e n s i t i v e t o i n h i b i -t i o n b y t o s y l - L - l y s i n e c h l o r o m e t h y l k e t o n e t h a n was t h e i rp r e p a r a t i o n .N a k a t a e t a l . ( 2 1 ) r e v e a l e d t h a t s u b s t r a t e i n h i b i t i o n o fS t r e p t o m y c e s r e s u l t s i n t r y p s i n - l i k e enzymes. S u b s t r a t e i n -h i b i t i o n o f t r y p s i n was d e m o n s t r a t e d a l s o b y L i n e t a l . ( 1 4 )w h e n d i m e t h y l c a s e i n was u s e d as t h e s u b s t r a t e . N a k a t a a n dI s h i i ( 2 0 ) , h o w e v e r , r e p o r t e d o p p o s i t e o b s e r v a t i o n s ; t h e yc o n f i r m e d s u b s t r a t e a c t i v a t i o n i n b o v i n e p a n c r e a t i c t r y p s i n -c a t a l y z e d h y d r o l y s i s o f B z - L - A r g - p N A . S u b s t r a t e i n h i b i t i o no f t h e p r o t e a s e f r o m t h e B a c t e r o i d e s g r o u p was a l s o r e p o r t e di n B . r u m i n i c o l a ( 9 ) a n d B . a m y l o p h i l u s ( 4 ) .T h e m o l e cu l a r w e i g h t was e s t i m a t e d t o b e a b o u t 3 0 0 , 0 0 0b y g e l f i l t r a t i o n , b u t b y p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i sw i t h SDS a n d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , i t a p p e a r e d t o b e a b o u t6 5 , 0 0 0 ( d a t a n o t s h o w n ) . A l t h o u g h t h e reason f o r t h e s ed i f f e r e n t e s t i m a t e s i s o b s c u r e , o n e l i k e l y e x p l a n a t i o n mayi n v o l v e t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n p r o t e i n a n d T r i t o n X - 1 0 0 ,w h i c h r e s u l t s i n an i n c r e a s e i n t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r s i z e o ft h e p r o t e i n , as d i s c u s s e d b y P a c a u d ( 2 3 ) i n m e m b r a n e - b o u n dp r o t e a s e s o f E s c h e r i c h i a c o l i . I n t h i s case t h e m o l e c u l a rw e i g h t was e s t i m a t e d t o b e 6 5 0 , 0 0 0 a n d 3 4 , 0 0 0 b y g e lf i l t r a t i o n a n d S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , r e -s p e c t i v e l y .R e s u l t s o f s e v e r a l s t u d i e s ( 6 , 8 , 2 2 , 3 0 , 3 1 ) h a v e d e m o n -s t r a t e d t h a t t h e proenzyme o f c o l l a g e n a s e i s a c t i v a t e d b y

some f a c t o r s , i n c l u d i n g p r o t e a s e s . U i t t o a n d R a e s t e ( 2 9 )h a v e f o u n d t h a t c r e v i c u l a r f l u i d f r o m e i t h e r h e a l t h y o ri n f l a m e d g i n g i v a c o n t a i n e d l a t e n t c o l l a g e n a s e t h a t c o u l d b ea c t i v a t e d w i t h t r y p s i n . B a s e d on t h e s e f i n d i n g s , t h e p r e s e n c eo f a t r y p s i n - l i k e enzyme m ay b e r e l a t e d t o t h e p a t h o g e n e s i so f B . g i n g i v a l i s b e c a u s e c o l l a g e n a s e i s c o n s i d e r e d t o b e ani m p o r t a n t s t r a t e g e m f o r d a m a g i n g t h e t i s s u e .LITERATURE CITED

1 . A b i k o , Y . , M. H a y a k a w a , S . M u r a i , a n d H . T a k i g u c h i . 1 9 8 5 .G l y c y l p r o l y l d i p e p t i d y l a m i n o p e p t i d a s e f r o m B a c t e r o i d e s g i n g i -v a l i s . J . D en t . R es . 6 4 : 1 0 6 - 1 1 1 .2 . A n d r e w s , P . 1 9 6 4 . E s t i m a t i o n o f m o l e c u l a r w e i g h t s o f p r o t e i n sb y S e p h a d e x g e l f i l t r a t i o n . B i o c h e m . J . 9 1 : 2 2 2 - 2 3 3 .3 . B e c h e t , J . J . , M. C . G a r d i e n n e t , a n d J . Y o n . 1 9 6 6 . E t u d e d el ' i n h i b t i o n d e l ' a c t i v i t d e s t e r a s i q u e d e l a t r y p s i n e p a r l e s d e r i v d sa c i d e s e t a m i d e s d e s e s t e r s s p d c i f i q u e s . B i o c h i m . B i op h ys . A c t a1 2 2 : 1 0 1 - 1 1 5 .4 . B l a c k b u r n , T . H . 1 9 6 8 . T h e p r o t e a s e l i b e r a t e d f r o m B a c t e r o i d e sa m y l o p h i l u s s t r a i n H1 8 b y m e c h a n i c a l d i s i n t e g r a t i o n . J . G e n .M i cr o bi o l . 5 3 : 3 7 - 5 1 .5 . D a v i s , B . J . 1 9 6 4 . D i s c e l e c t r o p h o r e s i s . I I . M e t h o d s a n d a p p l i -c a t i o n t o human s e r u m p r o t e i n s . A n n . N . Y . A c a d . S c i .1 2 1 : 4 0 4 - 4 2 7 .6 . E e c k h o u t , Y . , a nd G . V a e s . 1 9 7 7 . F u r t h e r s t u d i e s o n t h e a c t i v a -t i o n o f p r o c o l l a g e n a s e , l a t e n t p r e c u r s o r o f b o n e c o l l a g e n a s e .E f f e c t s o f l y s o s o m a l c a t h e p s i n B , p l a s m i n , a n d k a l l i k r e i n , a f i ds p o n t a n e o u s a c t i v a t i o n . B i o c h e m . J . 1 6 6 : 2 1 - 3 1 .7 . E r l a n g e r , B . F . , N . K o k o w s k y , a n d W. C o h e n . 1 9 6 1 . T h ep r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f t w o new c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e so f t r y p s i n . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 9 5 : 2 7 1 - 2 7 8 .8 . H a r p e r , E . , K . J . B l o c h , a n d J . G r o s s . 1 9 7 1 . T h e z y m o g e n o ft a d p o l e c o l l a g e n a s e . B i o c h e m i s t r y 1 0 : 3 0 3 5 - 3 0 4 1 .9 . H a z l e w o o d , G . P . , G . A . J o n e s , a n d J . L . M a n g a n . 1 9 8 1 .H y d r o l y s i s o f l e a f f r a c t i o n 1 p r o t e i n b y t h e p r o t e o l y t i c r u m e nb a c t e r i u m B a c t e r o i d e s r u m i n i c o l a R 8 / 4 . J . G e n . M i c r o b i o l .1 2 3 : 2 2 3 - 2 3 2 .1 0 . H o l l o w a y , P . W. 1 9 7 3 . A s i m p l e p r o c e d u r e f o r r e m o v a l o f T r i t o nX - 1 0 0 f r o m p r o t e i n s a mp l e. A na l . B i o c h e m . 5 3 : 3 0 4 - 3 0 8 .1 1 . L a u g h o n , B . E . , S . A . S y e d , a n d W. J . L o e s c h e . 1 9 8 2 . API ZYMs y s t e m f o r i d e n t i f i c a t i o n o f B a c t e r o i d e s s p p . , C a p n o c y t o p h a g as p . , a n d s p i r o c h e t e s o f o r a l o r i g i n . J . C l i n . M i c r o b i o l . 1 5 : 9 7 - 1 0 2 .1 2 . L a u g h o n , B . E . , S . A . S y e d , a n d W. J . L o e s c h e . 1 9 8 2 . R a p i di d e n t i f i c a t i o n o f B a c t e r o i d e s g i n g i v a l i s . J . C l i n . M i c r o b i o l .1 5 : 3 4 5 - 3 4 6 .1 3 . L e i g h t o n , T . J . , R . H . D o i , R . A . W a r r e n , a n d R . A . K e l l e n .1 9 7 3 . T h e r e l a t i o n s h i p o f s e r i n e p r o t e a s e a c t i v i t y t o RNAp o l y m e r a s e m o d i f i c a t i o n a n d s p o r u l a t i o n i n B a c i l l u s s u b t i l i s . J .M o l . B i o l . 7 6 : 1 0 3 - 1 2 2 .1 4 . L i n , Y . , G . E . M e a n s , a n d R . E . F e e n e y . 1 9 6 9 . T h e a c t i o n o fp r o t e o l y t i c e n z y m e s o n N , N - d i m e t h y l p r o t e i n s . B a s i s f o r am i c r o a s s a y f o r p r o t e o l y t i c e n z y m e s . J . B i o l . C h e m . 2 4 4 : 7 8 9 -7 9 3 .1 5 . L o e s c h e , W. J . , K . U . P a un i o, M. P . W o o l f o l k , a n d R N . H o c k e t t .1 9 7 4 . C o l l a g e n o l y t i c a c t i v i t y o f d e n t a l p l a q u e a s s o c i a t e d w i t hp e r i o d o n t a l p a t h o l o g y . I n f e c t . I m m u n . 9 : 3 2 9 - 3 3 6 .1 6 . L o e s c h e , W. J . , S . A . S y e d , E . S c h m i d t , a n d E . C . M o r r i s o n .1 9 8 5 . B a c t e r i a l p r o f i l e s o f s u b g i n g i v a l p l a q u e s i n p e r i o d o n t i t i s .J . P e r i o d o n t o l . 5 6 : 4 4 7 - 4 5 6 .1 7 . L o w r y , 0 . H . , N . Y . R o s e b r o u g h , A . L . F a r r , a n d R . J . R a n d a l l .1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t . J .B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 8 .1 8 . M o o r e , S . , a n d W . H . S t e i n . 1 9 4 8 . P h o t o m e t r i c n i n h y d r i nm e t h o d f o r u s e i n t h e c h r o m a t o g r a p h y o f a m i n o a c i d s . J . B i o l .C h e m . 1 7 6 : 3 6 7 - 3 8 8 .1 9 . N a g a i , Y . , S . S a k a k i b a r a , H . N o d a , a n d S . A k a b o r i . 1 9 6 0 .H y d r o l y s i s o f s y n t h e t i c p e p t i d e s b y c o l l a g e n a s e . B i o c h i m . B i o -p h y s . A c t a 3 7 : 5 6 7 - 5 6 9 .2 0 . N a k a t a , H . , a n d S . I s h i i . 1 9 7 0 . S u b s t r a t e a c t i v a t i o n i n t h e t r y p s i nc a t a l y z e d h y d r o l y s i s o f b e n z o y l - L - a r g i n i n e - p - n i t r o a n i l i d e .B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 1 : 3 9 3 - 4 0 0 .

VOL. 5 5 , 1 9 8 7


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7 2 0 FUJIMURA AND NAKAMURA2 1 . N a k a t a , H . , N . Y o s h i d a , Y . N a r a h a s h i , a n d S . I s h i i . 1 9 7 2 .S u b s t r a t e a c t i v a t i o n a n d s u b s t r a t e i n h i b i t i o n o f t r y p s i n - l i k ee n z y m e s f r o m t h r e e s t r a i n s o f S t r e p t o m y c e s s p e c i e s . J .B i o c h e m . ( T o k y o ) 7 1 : 1 0 8 5 - 1 0 8 8 .2 2 . O r o n s k y , A . L . , R . J . P e r p e r , a n d H . C . S c h r o d e r . 1 9 7 3 .P h a g o c y t i c r e l e a s e a n d a c t i v a t i o n o f h u m a n l e u k o c y t e p r o c o l l a -g e n a s e . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 4 6 : 4 1 7 - 4 1 8 .2 3 . P a c a u d , M . 1 9 8 2 . P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o n o v e lp r o t e o l y t i c e n z y m e s i n m e m b r a n e o f E s c h e r i c h i a c o l i . P r o t e a s eI V a n d p r o t e a s e V . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 4 3 3 3 - 4 3 3 9 .2 4 . R i c k , W. 1 9 7 4 . T r y p s i n , p . 1 0 1 3 - 1 0 2 4 . I n H . U . B e r g m e y e r( e d . ) , M e t h o d s o f e n z y m a t i c a n a l y s i s , v o l . 2 . A c a d e m i c P r e s s ,I n c . , Ne w Y o r k .2 5 . S a n d e r m a n n , H . , a n d J . L . S t r o m i n g e r . 1 9 7 2 . P u r i f i c a t i o n a n dp r o p e r t i e s o f C 5 5 - i s o p r e n o i d a l c o h o l p h o s p h o k i n a s e f r o mS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 5 1 2 4 - 5 1 3 1 .2 6 . S l o t s , J . 1 9 7 9 . S u b g i n g i v a l m i c r o f l o r a a n d p e r i o d o n t a l d i s e a s e . J .C l i n . P e r i o d o n t o l . 6 : 3 5 1 - 3 8 2 .2 7 . T a n ne r, A . C . R . , C . H a f f e r , G . T . B r a t t h a l l , R . A . V i s c o n t i , a n dS . S . S o c r a n s k y . 1 9 7 9 . A s t u d y o f b a c t e r i a a s s o c i a t e d w i t ha d v a n c i n g p e r i o d o n t i t i s i n m a n . J . C l i n . P e r i o d o n t o l . 6 : 2 7 8 -3 0 7 .2 8 . T o d a , K . , M. O t s u k a , Y . I s h i k a w a , M. S a t o , Y . Y a m a m o t o , a n dR . N a k a m u r a . 1 9 8 4 . T h i o l - d e p e n d e n t c o l l a g e n o l y t i c a c t i v i t y i n

I N F E C T . IMMUN.c u l t u r e m e d i a o f B a c t e r o i d e s g i n g i v a l i s . J . P e r i o d o n t a l R e s .1 9 : 3 7 2 - 3 8 1 .2 9 . U i t t o , V . - J . , a n d A . - M . R a e s t e . 1 9 7 8 . A c t i v a t i o n o f l a t e n t c o l l a -g e n a s e o f human l e u k o c y t e s a n d g i n g i v a l f l u i d b y b a c t e r i a lp l a q u e . J . D e n t . R e s . 5 7 : 8 4 4 - 8 5 1 .3 0 . V a e s , G . 1 9 7 2 . T h e r e l e a s e o f c o l l a g e n a s e a s a n i n a c t i v e p r o -e n z y m e b y b o n e e x p l a n t s i n c u l t u r e . B i o c h e m . J . 1 2 6 : 2 7 5 - 2 8 9 .3 1 . V a e s , G . , a n d Y . E e c k h o u t . 1 9 7 5 . T h e p r e c u r s o r o f b o n ec o l l a g e n a s e a n d i t s a c t i v a t i o n , p . 3 9 1 - 3 9 7 . I n H . P e t e r s ( e d . ) ,P r o t i d e s o f b i o l o g i c a l f l u i d s , v o l . 2 2 . P e r g a m o n P r e s s , I n c . ,O x f o r d .3 2 . V a n W i n k e l h o f f , A . J . , T . J . M. v a n S t e e n b e r g e n , N . K i p p u w ,a n d J . d e G r a a f f . 1 9 8 6 . E n z y m a t i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f o r a l a n dn o n - o r a l b l a ck - p i g m en t ed B a ct e ro i d es s p e c i e s . A n t o n i e v a nL e e u w e n h o e k J . M i c r o b i o l . S e r o l . 5 2 : 1 6 3 - 1 7 13 3 . V e s t e r b e r g , O . , T . W a d s t r o m , K . V e s t e r b e r g , H . S v e n s s o n , a n dB . M a l m g r e n . 1 9 6 7 . S t u d i e s o n e x t r a c e l l u l a r p r o t e i n s f r o mS t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . I . S e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o fe n z y m e s a n d t o x i n s b y i s o e l e c t r i c f o c u s i n g . B i o c h i m . B i o p h y s .A c t a 1 3 3 : 4 3 5 - 4 4 5 .3 4 . Y o s h i m u r a , F . , M. N i s h i k a w a , T . S u z u k i , C . I . H o o v e r , a n d E .N e w b r u n . 1 9 8 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t r y p s i n - l i k e p r o t e a s e f r o mt h e b a c t e r i u m B a c t e r o i d e s g i n g i v a l i s i s o l a t e d f r o m h u m a n d e n -t a l p l a q u e . A rc h . O ra l B i o l . 2 9 : 5 5 9 - 5 6 4 .

extra cellular protease from the antarctic yeast candida humicola

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