EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF

LIVER REDOXLIVER REDOXSTATUS INDUCED BY ISCHEMIA-STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-

REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND

TISSUTAL PARAMETERS.TISSUTAL PARAMETERS.Guzzetti E., Ferla F., Milani F., Accinni R., Aldrighetti L., Catena M., Ferla G.

Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia Istituto Scientifico San Raffaele

Università Vita-Salute San RaffaeleMilano

Controllo del sanguinamento Controllo del sanguinamento intraoperatorio: occlusione intermittente intraoperatorio: occlusione intermittente

del peduncolo vascolare epaticodel peduncolo vascolare epatico

Trasfusioni intraoperatorie di emazie Trasfusioni intraoperatorie di emazie concentrate o plasma fresco concentrate o plasma fresco congelato sono associate ad un congelato sono associate ad un peggioramento prognostico. peggioramento prognostico. 1, 21, 2

Occlusione intermittente del Occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico peduncolo vascolare epatico (manovra di Pringle): chiusura (manovra di Pringle): chiusura con uno strumento emostatico con uno strumento emostatico dell’intero ilo portobiliare (v.porta, dell’intero ilo portobiliare (v.porta, a.epatica, via biliare)a.epatica, via biliare)

1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on 1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on perioperative and long term outcone in patients perioperative and long term outcone in patients following hepatic resection for colorectal following hepatic resection for colorectal metastases. metastases. Ann Surg Ann Surg 2003;237:860-8702003;237:860-8702: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic 2: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic tumor resection without blood transfusion in tumor resection without blood transfusion in cirrhotic patients. cirrhotic patients. Arch Surg Arch Surg 1998;133:1007-10101998;133:1007-1010

Danno da ischemia e riperfusione (IR)Danno da ischemia e riperfusione (IR)Specie reattive dell’ossigenoSpecie reattive dell’ossigeno

• Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 33. .

• Produzione di radicali liberi: specie reattive di Produzione di radicali liberi: specie reattive di ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 44..

• Sistema antiossidante endogeno: molecole ed Sistema antiossidante endogeno: molecole ed enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai radicali liberi radicali liberi 55..

3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. 3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003;284:G15-G26 2003;284:G15-G26

4: Bayir H Reactive oxygen species. 4: Bayir H Reactive oxygen species. Crit Care MedCrit Care Med 2005;33(12):S498-S501. 2005;33(12):S498-S501.

5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-reperfusion injury: a review. reperfusion injury: a review. Liver Transpl Liver Transpl 2005;11:1031-1047.2005;11:1031-1047.

Glutatione (GSH) Glutatione (GSH) ((L-L--glutamil-L-cisteinilglicina)-glutamil-L-cisteinilglicina)

• Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può essere ossidato e ridotto. può essere ossidato e ridotto.

• Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 66..

GSSG2 GSH

H2O2 2 H2OGlutatione Perossidasi (GPx)

2 NADP+ + 2H+ 2 NADPH

Glutatione Reduttasi (GR)

6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. 6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. J Nutr J Nutr 2004;134:489-492.2004;134:489-492.

Studio Clinico SperimentaleStudio Clinico Sperimentale

SCOPOSCOPO: studiare le variazioni dello stato redox cellulare, : studiare le variazioni dello stato redox cellulare, indotte dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando indotte dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello tissutale epatico e a livello plasmaticotissutale epatico e a livello plasmatico..

PAZIENTIPAZIENTI: : • • Totale: n°43. Totale: n°43.

• • Gruppo P: n° 36 (occlusione del Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo peduncolo vascolare eseguita)vascolare eseguita)

• • Gruppo NP: n°7 (occlusione del Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo peduncolo vascolare non eseguita – vascolare non eseguita – controllo)controllo)

MATERIALI E METODI:MATERIALI E METODI:

MODALITA’ DI CAMPIONAMENTOMODALITA’ DI CAMPIONAMENTO

Campioni plasmaticiCampioni plasmatici – prelievo di 12 ml di sangue venoso – prelievo di 12 ml di sangue venoso con il seguente timing:con il seguente timing:

• • T1: preoperatorioT1: preoperatorio•• T2: al termine dell’interventoT2: al termine dell’intervento•• T3: 1T3: 1a a giornata postoperatoriagiornata postoperatoria•• T4: 4T4: 4aa giornata postoperatoria giornata postoperatoria

Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Epatobiliare – Epatobiliare –

Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)

Campioni tissutaliCampioni tissutali - prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing:- prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing:

• • T1: prima della fase ischemicaT1: prima della fase ischemica

• • T2: dopo 10 min. di ischemiaT2: dopo 10 min. di ischemia

• • T3: dopo 20 min. di riperfusioneT3: dopo 20 min. di riperfusione

Campioni tissutaliCampioni tissutali• Cisteina (ridotta e totale)Cisteina (ridotta e totale)• Cisteinil-glicina (ridotta e totale)Cisteinil-glicina (ridotta e totale)• Glutatione (ridotto e totale)Glutatione (ridotto e totale)• Attività dell’enzima Glutatione perossidasiAttività dell’enzima Glutatione perossidasi• Attività dell’enzima Glutatione reduttasiAttività dell’enzima Glutatione reduttasi

Campioni plasmaticiCampioni plasmatici• CisteinaCisteina• Cisteinil-glicina Cisteinil-glicina • Glutatione Glutatione • Attività dell’enzima Glutatione perossidasiAttività dell’enzima Glutatione perossidasi• Attività dell’enzima Glutatione reduttasiAttività dell’enzima Glutatione reduttasi

MATERIALI E METODIMATERIALI E METODI

Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Clinica – Clinica –

Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)

RISULTATI:RISULTATI:CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONECARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE

VariabileVariabile Gruppo PGruppo P Gruppo Gruppo NPNP

N° pazientiN° pazienti 3636 77Età media (range) [anni]Età media (range) [anni] 54 (30-79)54 (30-79) 54 (26-83)54 (26-83)Sesso (maschi/femmine) [n]Sesso (maschi/femmine) [n] 18/1818/18 4/34/3Diagnosi [n]Diagnosi [n] Metastasi da neoplasia del colonMetastasi da neoplasia del colon 1717 22 EpatocarcinomaEpatocarcinoma 99 22 Neoplasie della colecistiNeoplasie della colecisti 22 22 Iperplasia nodulare focaleIperplasia nodulare focale 11 11 Metastasi non da neoplasia del colonMetastasi non da neoplasia del colon 22 ColangiocarcinomaColangiocarcinoma 33 EmangiomaEmangioma 22Concomitante epatopatia [n]Concomitante epatopatia [n] Fegato sano/HCV/pregressa CTFegato sano/HCV/pregressa CT 26/2/826/2/8 3/2/23/2/2

RISULTATI:RISULTATI:RESEZIONI EPATICHERESEZIONI EPATICHE

VariabileVariabile Gruppo PGruppo P Gruppo NPGruppo NPProcedura chururgica principale [n]Procedura chururgica principale [n] Epatectomia destraEpatectomia destra 1414 22 SegmentectomiaSegmentectomia 66 44 Nodulectomie multiple <5Nodulectomie multiple <5 11 11 BisegmentectomiaBisegmentectomia 77 Epatectomia sinistraEpatectomia sinistra 55 MesoepatectomiaMesoepatectomia 22 Epatectomia destra estesa al IV Epatectomia destra estesa al IV segm.segm.

11

Tipo di resezione [n]Tipo di resezione [n] Maggiore/MinoreMaggiore/Minore Anatomica/Non AnatomicaAnatomica/Non Anatomica Singola/MultiplaSingola/Multipla

22/1422/1433/333/330/630/6

2/52/54/34/35/25/2

Durata media del clampaggio (range) Durata media del clampaggio (range) [min.][min.]

39 (10-86)39 (10-86) --

RISULTATI:RISULTATI:OUTCOME PERIOPERATORIOOUTCOME PERIOPERATORIO

VariabileVariabile Gruppo PGruppo P Gruppo NPGruppo NPPerdite ematiche medie (range) [ml]Perdite ematiche medie (range) [ml]Trasfusioni di EC intraoperatorie [U]Trasfusioni di EC intraoperatorie [U]

460 (100-460 (100-1500)1500)

44

400 (100-400 (100-700)700)

11Indici biochimici di funzionalità Indici biochimici di funzionalità epaticaepatica Picco ALT [media(ds)] Picco ALT [media(ds)] U/LU/L 493 (427)493 (427) 358 (256)358 (256) Picco AST [media(ds)] Picco AST [media(ds)] U/LU/L 503 (405)503 (405) 351 (226)351 (226) Picco bilirubina totale [media(ds)] Picco bilirubina totale [media(ds)] mg/dlmg/dl

1,42 (0,87)1,42 (0,87) 2,06 (1,07)2,06 (1,07)

Picco PT-INR [media(ds)] Picco PT-INR [media(ds)] 1,24 (0,21)1,24 (0,21) 1,17 (0,13)1,17 (0,13)Complicanze postoperatorie [n]Complicanze postoperatorie [n] Fistola biliareFistola biliare Insufficienza epaticaInsufficienza epatica Versamento pleuricoVersamento pleurico Infezione polmonareInfezione polmonare EmorragieEmorragie Fibrillazione atrialeFibrillazione atriale

444422111111

11----------

Degenza postoperatoria media Degenza postoperatoria media (range) [gg](range) [gg]

13,7 (5-66)13,7 (5-66) 8,4 (6-16)8,4 (6-16)

Mortalità postoperatoriaMortalità postoperatoria -- --

DATI BIOCHIMICIDATI BIOCHIMICICome varia la concentrazione degli Come varia la concentrazione degli antiossidanti tiolici in seguito a danno antiossidanti tiolici in seguito a danno

ischemico-riperfusorio?ischemico-riperfusorio?

RISULTATI: RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONECISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE

Cisteina

10

15

20

25

30

35

1 2 3

timing

mM

/gr

prot

Cisteina

10

15

20

25

30

35

1 2 3

timing

mM

/gr

prot

Cisteinilglicina

1,50

2,50

3,50

4,50

1 2 3

timing

m M/g

r pro

t

Cisteinilglicina

1,50

2,50

3,50

4,50

1 2 3

timing

m M/g

r pro

t

Glutatione

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

1 2 3

timing

mM

/gr p

rot

Glutatione

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

1 2 3

timing

mM

/gr p

rot

Riduzione delle Riduzione delle concentrazioni tissutali concentrazioni tissutali di glutatione e dei suoi di glutatione e dei suoi precursoriprecursori

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

Come varia lo stato ossidoriduttivo Come varia lo stato ossidoriduttivo degli antiossidanti tiolici in seguito degli antiossidanti tiolici in seguito

a danno ischemico-riperfusorio?a danno ischemico-riperfusorio?

Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma ridotta e totale dei composti tiolici, e forma ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto del glutatione. soprattutto del glutatione.

RISULTATI: RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA,

GLUTATIONEGLUTATIONE

Rapporto R/T composti Rapporto R/T composti tiolicitiolici

Gruppo PGruppo P Gruppo NPGruppo NP

T1T1 T2T2 T3T3 T1T1 T3T3

Cisteina R/TCisteina R/T 0,290,29 0,370,37 0,440,44 0,260,26 0,310,31

Cisteinil-glicina R/TCisteinil-glicina R/T 0,360,36 0,510,51 0,620,62 0,540,54 0,570,57

Glutatione R/TGlutatione R/T 0,450,45 0,530,53 0,710,71 0,610,61 0,920,92

Perché aumenta la concentrazione di GSH Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto?ridotto?

RISULTATI: RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DEL GLUTATIONESTATO REDOX DEL GLUTATIONE

ATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI

GR

50

55

60

65

70

75

80

85

90

1 2 3

timing

U/g

r pro

t

GR

50

55

60

65

70

75

80

85

90

1 2 3

timing

U/g

r pro

t

Lieve incremento Lieve incremento dell’attività della dell’attività della glutatione reduttasi glutatione reduttasi al termine della fase al termine della fase riperfusoria.riperfusoria.

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

CONCLUSIONI: CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALIANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI

1.1. Consumo di glutatione e dei suoi precursori.Consumo di glutatione e dei suoi precursori.

La scarsità di glutatione potrebbe essere il La scarsità di glutatione potrebbe essere il fattore limitante l’attività della glutatione fattore limitante l’attività della glutatione reduttasi.reduttasi.

2.2. Condizione intracellulare di stress ossidativo, Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato con miglioramento dello stato ossidoriduttivo del glutatione al termine della ossidoriduttivo del glutatione al termine della fase riperfusoria (mantenuta attività fase riperfusoria (mantenuta attività dell’enzima glutatione reduttasi).dell’enzima glutatione reduttasi).

RISULTATI: RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI CAMPIONI PLASMATICI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA,

GLUTATIONEGLUTATIONE

Cisteina

100150200250300350

1 2 3 4

timing

Mm/

L

Cisteina

100150200250300350

1 2 3 4

timing

Mm/

L

Cisteinil glicina

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4

timing

m M/L

Cisteinil glicina

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4

timing

m M/L

Glutatione

012345

6789

10

1 2 3 4

timing

m M/

Glutatione

012345

6789

10

1 2 3 4

timing

m M/

Livelli basali preoperatori Livelli basali preoperatori ridotti di GSH. ridotti di GSH.

Consumo nell’immediato Consumo nell’immediato postoperatorio, seguito da un postoperatorio, seguito da un progressivo recupero.progressivo recupero.

Alterazioni più evidenti nel Alterazioni più evidenti nel gruppo P.gruppo P.

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

Val. riferimentoVal. riferimento

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

Val. riferimentoVal. riferimento

RISULTATI: RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICICAMPIONI PLASMATICIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI

GR

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4

timing

U/L

GR

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4

timing

U/L

Notevole incremento Notevole incremento dell’attività dell’attività dell’enzima dell’enzima glutatione reduttasi glutatione reduttasi nel postoperatorio.nel postoperatorio.

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

Val. riferimentoVal. riferimento

Gruppo PGruppo P

Gruppo NPGruppo NP

Val. riferimentoVal. riferimento

GR

50

55

60

65

70

75

80

85

90

1 2 3

timing

U/g

r pro

t

GR

50

55

60

65

70

75

80

85

90

1 2 3

timing

U/g

r pro

t

Campione tissutale

CONCLUSIONI: CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI PLASMATICIANALISI SU CAMPIONI PLASMATICI

Livelli scarsi di GSH a livello basale Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio. preoperatorio.

Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un progressivo incremento della concentrazione progressivo incremento della concentrazione plasmatica di GSH e precursori, e ad un plasmatica di GSH e precursori, e ad un miglioramento del loro stato ossidoriduttivo miglioramento del loro stato ossidoriduttivo (notevole aumento dell’attività della glutatione (notevole aumento dell’attività della glutatione reduttasi).reduttasi).

CONCLUSIONICONCLUSIONI

1.1. Riscontro a livello preoperatorio di scarse Riscontro a livello preoperatorio di scarse riserve intracellulari di glutatione.riserve intracellulari di glutatione.

2.2. Consumo di precursori del glutatione, che Consumo di precursori del glutatione, che impedisce la produzione del glutatione stesso.impedisce la produzione del glutatione stesso.

3.3. Condizione intracellulare di stress ossidativo, Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo con miglioramento dello stato ossidoriduttivo nelle giornate postoperatorie. nelle giornate postoperatorie.

4.4. Simile trend di modifica delle concentrazioni Simile trend di modifica delle concentrazioni tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.