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Cours II

Exemple de pathologie cardiaque:Le syndrome du QT long congénital

H. Abriel

Département de Pharmacologie et Toxicologie, UNILService de Cardiologie, CHUV

4 mai 2004, Formation continue des laborantin(e)s en recherche

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Plan du cours II

Pathologie modèle: Syndrome du QT long congénital

• Histoire d’un cas et description clinique du SQTL

• Excitabilité cardiaque (Rappel)

• Canaux ioniques et « patch-clamp »

• Mécanismes moléculaires et cellulaires du SQTL

• Investigations génétiques

• Investigations cellulaires

• Etudes animales

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Jon N. Mettler, Webpublisher: Jon est né le 27 mars 1974 dans la ville de Bienne. Al’âge de 17 ans, en hiver 1991, il fut confronté pour la première fois au syndrome du QT long. Lorsd’un camp de ski, il perdit connaissance à trois reprises. Puis, alors qu’il était transporté à l’hôpitalde Coire, il fit un arrêt cardiaque.

Après cet évènement dramatique, il fut investigué par les médecins jusqu’au moment où onl’informa de son diagnostique : il souffrait du syndrome du QT long congénital (SQTL).

Rapidement, Jon se rendit compte que le SQTL était peu connu en Europe ; et, à la recherched’informations au sujet du SQTL, il atteint bientôt les limites.

C’est pour cette raison qu’en 1997, Jon démarra le projet internet du « European Long QTSyndrome Information Center » (à présent QTsyndrome.ch), en équipe avec deux de ses amis (nonatteint par le SQTL) et de son plus jeune frère. Les objectifs de QTsyndrome.ch sont de collecter etde dispenser des informations précises à propos de cette maladie.

Jon est journaliste en économie et travaille pour la « Berner Zeitung », un des plus grands journauxen Suisse. Il pratique le Kendo, un art martial japonais.

Traduit du site www.QTsyndrome.ch, le 30 avril 2004

Un cas de syndrome du QT long congénital

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ECG avec intervalle QTc prolongé à 507 ms / (ne doit pas dépasser 440 ms)

intervalle QT prolongé

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Electrophysiologie cellulaire(Rappel)

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Couplage excitation-contraction (version 2)

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Conduction électrique à travers les cellules cardiaques

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Canaux ioniqueset la

technique du « patch-clamp »

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Canaux ioniques

•Les canaux ioniques sont des protéines membranairesqui permettent le passage des ions à travers la membrane cellulaire

•L’ouverture et la fermeture de ces canaux sont régulées soit par ladifférence de voltage transmembranaire, soit par des ligands intra-ou extracellulaires

Voltage-dépendants

Ligand-dépendants

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Appareillage de “patch-clamp”

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inside-out

Cellule attachée Cellule entière

Les “configurations” du patch-clamp

•Quatre configurations:

•Cellule entière•Cellule attachée•Patch inside-out•Patch outside-out

1 canal

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“Seal” de la pipette avec la cellule

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Voltage et Courant imposés

Voltage-clamp = voltage imposé Mesures de courants

Current-clamp = courant imposé Mesures de différences de voltage

5 n

A

2ms

50ms

-80 mV

0 mV

courants sodiquesde cardiomyocytes

isolés de souris

potentiel d’action cardiaquede cardiomyocytes

isolés de souris

-80 mV10 ms

0 pA

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Bases ioniques du potentiel d’action cardiaque

Nav1.5 (SCN5A) and β subunits

Cav1.2 and auxiliary subunits

Cav3.2 and auxiliary subunits

Na+-Ca2+ exchanger

Kv4.3

--

Kv7.1 (KCNQ1) and MinK (KCNE1)

Kv11.1 (hERG-KCNH2) and MirP1 (KCNE2)

Kir2.1

CFTR (Cl-), K2P family

Kv1.5

GIRK1+4 (IK-ACh), Kir6.2+SUR1 (IKATP)

Na+ current

L-type Ca2+ current

T-type Ca2+ current

Na+-Ca2+ exchange

ITo1 (4-AP sensitive)

ITo2 (Ca2+ activated)

IKs

IKr

IK1

ICl or IKp

IKur

IK ATP/ACh

0 mV

(0)

(1)(2)

(3)

(4)Courants Transporteurs ioniques

•Le potentiel d’action résulte des courants dépolarisants (en rouge –entrants) et, ensuite, repolarisants (en bleu – sortants)

•La durée du potentiel d’action est déterminée par un l’équilibre entre lescourants dépolarisants et repolarisants

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Canaux sodiques voltage-dépendants

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Structure des canaux sodiques

•Les canaux sodiques sont formés par desprotéines avec 24 segmentstransmembranaires (4x6 segmentsfortement homologues)

•Les segments S4 possèdent denombreux acides aminés positifs

•En microscopie électronique, les canauxont la forme d’une cloche

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Activation et inactivation des canaux sodiques

Repolarisation de la membrane, déplacement du segment inactivateur, et fermeturede la porte d’activation (lent, plusieurs millisecondes)

Dépolarisation initiale de la membrane,mouvement des α-hélices sensibles auvoltage, et ouverture du canal (<1ms)

Retour des α-hélices sensibles au voltagedans la position de repos, et inactivationdu canal (0.5-1.0 ms)

Ported’activation

Segmentinactivateur

α-hélicessensiblesau voltage

Pore Vestibule externe

Vestibuleinterne

Canal Na+ fermé Canal Na+ ouvert Canal Na+ inactivé

Extérieur

Cytosol

Membranedépolarisée

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-120

-30

2 ms

F O I

Courants unitaires mesurés en “patch-clamp”

Patch« inside-out »

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Syndrome du QT long congénital

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1856: Meissner en Allemagne présente le premier cas de QT long congénital.Il décrit le cas d’une fille sourde qui, suite à une émotion forte, perd connaissanceet décède subitement. Les parents de la fille rapportent que deux de ses frèressont aussi décédés subitement.

1957: Jervell et Lange-Nielsen décrivent des cas d’enfants sourds avec uneprolongation de l’intervalle QT et une histoire de morts subites dans la famille.

1964: Romano et Ward décrivent de manière indépendante des enfants avec unehistoire de morts subites et une prolongation de l’intervalle QT (sans surdité).

1980: Moss et Schwartz débutent un registre international de patients et famillesavec un syndrome du QT long congénital.

1995-1996: Identification et caractérisation des trois principaux gènes impliqués chezles patients avec un syndrome du QT long congénital.

2001: Publication du premier modèle murin porteur d’une mutation humaine causantle syndrome du QT long congénital.

Historique du syndrome du QT long congénital

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Syndrome du QT long congénital

• Causes génétiques (mutations familiales ou de novo)

• 7 différents gènes mutés

• Sous-unités de canaux ioniques -> canalopathies cardiaques génétiques

• Syndrome de Romano-Ward

• Syndrome de Jervell and Lange-Nielsen

• Dans env. 20-40% des cas les gènes sont encore inconnus

• La pénétrance des phénotypes (cliniques et ECG) est très variable

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Potentield’action

cardiaque 0 mV

ECG de surface

Intervalle QT

(0)

(1)(2)

(3)(4)

P

Q

S

R

T

Torsades de pointes

Le syndrome du QT long provoque des arythmies malignes

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IK

Courant Na+

0 mV

Mutations avec“perte de fonction”

Mutations avec“gain de fonction”

Normal Normal SQTLSQTL

Mécanismes du QT long congénital

Type LQT-3

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LQT-3: mutations de SCN5AInvestigations génétiques

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1 2 3 51 2 3 5 61 2 3 5 61 2 3 5 6

NH2

+++++++

+++++++

+++++++

+++++++

I II IVIII

COOH

6

Trois mutations du gène SCN5A: SQTL type 3

Y1795C

ΔKPQet

ΔQKP

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Mutation LQT-3 Y1795C

Rivolta I. et al, JBC 2001

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Analyse de l’ADN génomique des patients:Extraction de l’ADN et PCR

Sang complet(anticoagulé)

Frottis de la muqueuse

buccale

Autres spécimens

Extraction de l’ADN génomique

Amplificationpar PCR des exons

codants des gènes candidats

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Analyse de l’ADN génomique des patients:HPLC dénaturante et séquencage

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LQT-3: mutations de SCN5AExpression dans des cellules mammifères

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Etudes des canaux sodiques dans les cellules HEK

Génération des mutations dans

de l’ADNc

cDNAWT

cDNAmuté

X

Mesures en patch-clamp des

courants WT et mutants

Transfectionde l’ADNcdans les

cellules HEK

+cDNACellules HEK

ou

cDNA

X

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WT Y1795C

5 ms

Expression dans les cellules HEK des canaux mutés

Rivolta I. et al, JBC 2001

•Les canaux mutés s’expriment normalement dans les cellules HEK et lespropriétés biophysiques de ces courants peuvent être analysées en détails

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Y1795CWT

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Per

sist

ent

curr

ent

(% o

f th

e p

eak

curr

ent)

Y1795CWT

**

50 ms

Mutation du canal sodique qui génère un courantpersistant

•La mutation Y1795C interfère avec l’inactivation du canal sodique et génère un«courant persistant»•Ce courant persistant, dans les cellules cardiaques, est un courant dépolarisantet ainsi il retarde la repolarisation du potentiel d’action•Le potentiel d’action prolongé chez les porteurs de cette mutation est à l’originede la prolongation de l’intervalle QT et des manifestations cliniques

courantpersistant

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Les canaux mutés restent ouverts plus longtemps

Patch« inside-out »

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Modèle animal:Souris porteuse d’un gène mutant LQT-3

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ECG de souris avec mutation LQT-3: ΔKPQ

•ECG mesurés chez des souris WT et porteuse de la mutation ΔKPQ

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Potentiel d’action de souris avec mutation LQT-3: ΔKPQ

WT

MutantΔKPQ

•Potentiel d’action cardiaque mesuré en condition de cellule entière et en courant imposé

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Courants persistants mesurés sur des myocytes de souris

WT

mutant

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Tachycardie ventriculaire chez une souris LQT-3

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Résumé et Conclusions

• Le SQTL est une maladie rare, mais aux conséquences dévastatrices

• En 2004, nous avons une compréhension des mécanismes patho-

logiques du SQTL (génétique, moléculaire, cellulaire et animal entier)

• Cependant, il n’existe pas encore de traitements efficaces…

• Le SQTL représente une « pathologie modèle » pour la compréhension

des morts subites survenant lors de maladies cardiaques fréquentes