evaluarea fitochimica la genotipuri de origanum

8/17/2019 Evaluarea Fitochimica La Genotipuri de Origanum

http://slidepdf.com/reader/full/evaluarea-fitochimica-la-genotipuri-de-origanum 1/8

Romanian Biological Sciences, Vol. IV, No.3-4, p.39–46, 2006

THE PHYTOCHEMICAL EVALUATION OF ORIGANUM VULGARE L.

GENOTYPES IN VITRO MICROPROPAGATION

EVALUAREA FITOCHIMICA LA GENOTIPURI DE ORIGANUM

VULGARE L. MULTIPLICATE IN VITRO

DOINA DANILA*, ELVIRA GILLE

*, CONSTANTA BARBU

**

* National Institute for Research and Developement of Biological Science, Bucharest

– „Stejarul” Scientific Research Centre Piatra-Neamt**

Research & Development Station for Medicinal and Aromatic Plants - Fundulea

Abstract. Among the aromatic and medicinal plants studied all over the world, from the point

of view of in vitro cultures, there is the group of the Labiatae. Using the regeneration

techniques of the tissue cultures of Origanum vulgare aimed the micropropagation of valuable

genotypes with well-defined biochemical characteristics. For all the tested genotypes (4), we

performed shoot regeneration by multiplying apical and axillary buds. The micropropagation

technique is a multiplication alternative for the selected genotypes, androsterile and

androfertile, in order to establish hybridation fields and a rapid promotion in the superior links

of the melioration process. The comparative studies, performed on herba were achieved to

identify the polyphenolic, flavonoidic, triterpenic components, as well as the volatile oil. Thedata obtained by phytochemical analysis assert that, by means of the micropropagation

techniques used in the experiment, the bioproductivity features are preserved, the phenotypic

expression reflecting the characteristics of the genotype.

Key words: in vitro plant regeneration, genotypes, phytochemical content

INTRODUCERE

Micropropagarea plantelor medicinale si aromatice este exploatata comercial pe

scara larga, in scopul obtinerii unor cantitati crescute de materie prima, cu calitati

bioproductive superioare, utila pentru industria farmaceutica si cosmetica. Prin

tehnica micropropagarii, poate fi controlata cantitatea si calitatea materialului vegetal

necesar pentru scopuri bine definite, inclusiv pentru procesul de ameliorare. Pe plan

mondial, cercetarile privind aceste aspecte s-au finalizat prin elaborarea de studii si

tehnici referitoare la o mare diversitate de specii medicinale si aromatice, inclusiv laspecii din familia Lamiaceae, valorificate pe scara larga din punct de vedere

comercial datorita continutului in ulei volatil [1, 2, 3].

Desi ne aflam intr-o etapa in care atentia specialistilor este puternic atrasa de

tehnicile ingineriei genetice si marile ei posibilitati in obtinerea de organisme cu

insusiri “programate”, culturile in vitro raman domenii de activitate cu mare impact

aplicativ pentru inducerea variabilitatii, dar si pentru promovarea in cultura si

multiplicarea unor genotipuri valoroase la plante de interes. Dezvoltarea unui sistem

de regenerare la specii producatoare de uleiuri volatile, faciliteaza programele de



Rom.Biol.Sci. 40

ameliorare a acestora, putand constitui si o etapa in multiplicarea materialului vegetal

rezultat in cercetarile de transformarea genetica la plante.

Regenerarea plantelor, direct din explante, este fundamentala in multiplicarea

germoplasmei elita via micropropagare. Pentru plantele medicinale si aromatice ce

sintetizeaza metaboliti secundari, care nu pot fi substituiti prin produsi de sinteza

chimica, este o alternativa in asigurarea materiei prime pentru industria

medicamentelor si cosmetice, in cazul in care variabilitatea spectrului fitochimic nu

este de dorit.

MATERIALE SI METODE

Materialul biologic provenit de la patru genotipuri de Origanum (C1/92,

C43/94, C39/94, C36/94) a fost multiplicat in vitro, obtinandu-se neoplantuleregenerate prin culturi de tesuturi.

Initierea culturii de tesuturi, s-a efectuat din explante (noduri si apexuri tulpinale)

prelevate din campul de selectie si ameliorare a SCPMA Fundulea (jud. Calarasi).

Pentru cultura de tesuturi s-au utilizat flacoane Erlemeyer (100 ml), pe mediul

MS (1962) solidificat cu 0,75 - 0,80 % agar-agar. Flacoanele inoculate au fost

mentinute in camera semiclimatizata a Centrului de Cercetari "Stejarul", la o

temperatura de 22 + 1oC, luminozitate de 2 000 lx.

Tabel 1. Multiplicarea si inradacinarea lastarilor de Origanum pe variante selectionate ale

mediului de cultura MS

Regulatori de crestere(mg/l)Genotipul Varianta

de mediu

(MS) BAP KIN NAA

Reactia morfogenetica

Faza de multiplicare a lastarilor

C1/92

C43/94C39/94

C36/94

B 02 0,2 - -Multiplicarea

redusa a lastarilor, cresterea

lastarilor,

C1/92

C43/94

C39/94

C36/94

KB 0,5 1,0 0,5

Multiplicarea si cresterea

lastarilor

cu aspect tipic, reducerea

vitrificarii tesuturilor

caulinare Faza de inradacinare a lastarilor

C1/92

C43/94

C39/94

C36/94

MR

(saruri

reduse ½)

- - 0,5

Rizogeneza masiva, lastari

cu radacini viguroase si

ramificate

C1/92

C43/94

C39/94

C36/94

MS - - -

Rizogeneza moderata,

alungirea lastarilor si

radacinilor



Origanum vulgare L. genotypes in vitro micropropagation41

Mediul de cultura MS s-a utilizat in 7 variante hormonale: doua pentru initierea

culturilor, trei pentru multiplicarea lastarilor si in alte doua pentru procesul de

rizogeneza (tabel 1). Suplimentarea mediului de cultura s-a realizat cu concentratii

diferite de auxine si citochinine, raportul dintre acestea fiind variabil in functie de

specificul fiecarei etape a regenerarii plantulelor.

Subcultivarea s-a efectuat, in functie de specificul fazei culturii, la intervale de 3-

6 saptamani, exceptand faza de initiere in care se impune supravegherea zilnica a

flacoanelor cu explante (foto 1).

Neoplantulele obtinute au fost transferat in campul de cultura experimentala

pentru analiza fitochimica comparativa. Cercetarile efectuate au avut in vedere

evaluarea cantitativa si calitativa, pentru o serie de principii farmacologic active, lavariantele obtinute in culturi conventionale (C) si in vitro (V).

Analiza fitochimica a probelor medii/varianta (herba) s-a realizat din extracte

diclormetanice (evidentierea triterpenelor si fitosterolilor), metanolice pentru dozarea

cantitativa a polifenolilor si flavonelor si de identificare a fractiunilor acestora.

Uleiurile volatile s-au analizat prin metoda Neo-Clevenger, iar identificarea

fractiunilor prin CSS [4, 5].

REZULTATE SI DISCUTII

Plantele, apartinand genotipurilor luate in studiu au constituit doua loturi

comparative:

A. lotul infiintat prin cultura in camp a plantelor obtinute in vitro – tehnologia demicropropagare.

B. lotul cu plante obtinute prin tehnici conventionale.

Pentru investigatiile fitochimice cantitative si calitative s-a prelevat materialul

vegetal (herba), la deplina inflorire a plantelor (6 – 24.07.2004)

Inradacinarea lastarilor regenerati in vitro si acomodarea neoplantulelorLastarii cu aspect relativ omogen au fost inoculati pe mediul de inradacinare iar

dupa circa 2 - 4 saptamani, variantele de mediu utilizate au indus formarea unui

sistem radicular viguros, ceea ce a permis transferarea regenerantilor in pahare cu apa

simpla – pe rondele de hartie de filtru, pentru acomodarea neoplantulelor – in sistem

hidroponic, la conditiile ex vitro.

Genotipurile C1/92 si C39/94, au manifestat o reactivitate crescuta pentrumultiplicarea si inradacinarea lastarilor, reactivitate manifestata, in general, pe toate

variantele mediului de cultura. Rezultatele obtinute pe tot parcursul fazelor

regenerarii in vitro, confirma studiile preliminare si certifica faptul ca, pentru

genotipurile selectionate la Origanum, clonarea prin culturi de tesuturi este viabila.

Transferul plantulelor in campul experimentalAcomodarea neoplantulelor la conditii ex vitro a fost realizata in spatii

semiclimatizate, pe parcursul lunilor lunilor martie – aprilie (2004) iar transferul

acestora s-a realizat, in campul experimental, la sfarsitul lunii aprilie. In realizarea



Rom.Biol.Sci. 42

loturilor de plante - prin transferul in camp a plantulele regenerate in vit ro s-a urmarit,

avand in vedere particularitatile biologice ale plantelor de Origanum, parcurgerea

tuturor fenofazelor pe parcursul anului 2004.

Caracteristicile de bioproductie care intereseaza a fi pastrate in mod deosebit la

plantele de Origanum, se refera la continutul in ulei volatil (caracter variabil, aflat sub

influenta factorilor de mediu) si continutul in principii active (polifenoli, flavone si

compusi sterolici).

Foto 1-5. Faze ale regenerarii in vitro si acomodarii neoplantulelor de Origanum vulgare

Investigatii fitochimice comparative la genotipuri de Origanum Pe langa inflorescente, ca sursa de materie prima in obtinerea uleiurilor volatile,

in practica fitofarmaceutica se valorifica si herba, datorita fitocomplexului ce o

caracterizeaza pentru o serie de principii active (polifenoli, flavone, triterpene).

Optiunea pentru analiza materialului vegetal din herba a plecat de la premiza ca

prezenta fitocomplexului confera posibilitatea unui studiu comparativ al materialului

obtinut (culturi conventionale si plante regenerate in vitro), mult mai diversificat

comparativ numai cu al uleiului volatil obtinut din flori.

Studiile comparative, realizate pe plante obtinute in cultura conventionala si in

vitro, s-au realizat pentru identificarea componentelor triterpenice si a uleiului (foto8–9). Aspectul cromatogramelor pe strat subtire, realizate pentru identificarea

calitativa a fractiunilor polifenolice si flavonice sunt redate in foto 6-7.

Datele referitoare la continutul in polifenoli si flavone sunt prezentate in tabel 2.

Analiza continutului de polifenoli si flavone din materialul vegetalCu toate ca uleiul volatil este produsul dominant si specific al inflorescentelor de

Origanum, herba se utilizeaza datorita continutului in diferite clase de principii active

(polifenoli, flavone, cumarine, triterpene, fitosteroli, taninuri). Actiunea antiseptica,




stomahica si spasmolitice ale produsului este legata de prezenta flavonelor, acizilor

polifenolcarboxilici si a uleiului volatil [6, 7].

Extractele metanolice, obtinute de la plantele investigate fitochimic, au fost

analizate cantitativ si calitativ pentru evaluarea continutului in polifenoli si flavone si

identificarea fractiunii acestora (tabel 2, foto 6-7).

Polifenoli - etaloane : acid cafeic,acid clorogenic, acid ferulic, acid cumaric

Flavone - etaloane : cvercetol, rutozid, apigenol, luteolina

Herba de Origanum se caracterizeaza prin echilibru intre compusii polifenolici si

flavonici, aspect reflectat si in analiza cantitativa. Cea mai mare cantitate s-a

evidentiat la probele 3 si 4.

Tabel 2. Continutul de flavone si polifenoli la genotipuri de Origanum (variante obtinute in culturi conventionale si in vitro)

Proba GenotipulPolifenoli

(acid cafeic g% s.u)

Flavone

(rutozid g% s.u)

1C 1.054 1.224C43/94

1V 1.357 1.371

2C 0.702 1.071C39/94

2V 1.288 1.100

3C 1.968 2.41C36/94

3V 1.396 1.638

4C 2.080 2.129C1/92

4V 1.459 1.690

Extractele alcoolice din produsul vegetal are si actiune antioxidanta (datorata

activitatii de inhibare a lipid-peroxidarii) si de acest efect este responsabil ac.

rozmarinic si polifenolii in general. Compozitia in polifenoli recomanda utilizarea si

in preparate cu actiune antiinflamatoare, antispastica, cu efecte in permeabilitatea

membranei.

Datele obtinute, prin analiza fitochimica cantitativa, vin in sprijinul afirmatiei ca,

prin tehnica de micropropagare utilizata in experiment, se manifesta expresia

fenotipica determinata de cea genotipica, plantele isi conserva caracterele de

bioproductivitate.

Analiza fitochimica calitativa reflecta existenta unui spectru biosintetic

diversificat pentru polifenoli si flavone (foto 6 – 7).

Spectrul biosintetic al compusilor polifenolici si flavonici este aproape identic la

probele de la plantele din culturi conventionale si regenerate in vitro, cu mici exceptii.

In conformitate cu etaloanele, dintre polifenoli, s-au identificat fractiunile

urmatoare: acidul cafeic, acidul clorogenic - un derivat al acestuia (cu exceptia probei

2) si acidul cafeic. Probele 3 si 4 prezinta mai multe fractiuni polifenolice, aspect

reflectat si la nivel cantitativ (tabel 2). La proba 1, calitativ sunt mai numeroase

fractiunile flavonice (6), fiind prezent rutozidul si luteolina (mai redusa ca intensitate

la proba 4). O reducere numerica a fractiunilor flavonice (3) se inregistreaza la proba



Rom.Biol.Sci. 44

2, la care apare un spot diferit (de culoare albastruie cu Rf=0.29), mai accentuat la

varianta V; la varianta C se evidentiaza lipsa unui un spot (Rf=0.71), care este prezent

la toate celelalte probe analizate.

Desi numarul fractiunilor este mai redus la probele 3 si 4, acestea prezinta valori

mai crescute ale continutului de flavone.

Pe langa componentele uleiului volatil, prezenta compusilor polifenolici si

flavonici recomanda utilizarea herbei in infuzii, datorita proprietatilor antioxidante,

antiinflamatorii si antimicrobiene.

Foto 6. CSS pentru compusi polifenolici la

genotipuri de Origanum obtinute prin culturi

conventionale si micropropagare

Foto 7. CSS pentru compusi flavonici la



Analiza triterpenelor si uleiului volatil din materialul vegetalDozarea calitativa a uleiului s-a facut din materialul vegetal (herba), supus

extractiei diclormetanice iar developarea s-a realizat in doua sisteme: pentrutriterpene si fitosteroli precum si pentru uleiuri volatile. Metoda evidentiaza atat

componentele uleiului cat si compusii terpenici – precursori biogenetici ai uleiurilor

volatile.

Pentru triterpene s-au utilizat urmatoarele etaloane: colesterol, betta-sitosterol,

stigmasterol, acid oleanolic, acid ursolic.

Spectrul biosintetic pentru aceasta clasa de compusi este asemanator la plantele

provenite din cultura conventionala si la cele regenerate in vitro (anul I de vegetatie)

– difera doar cantitatea dar nu si numarul fractiunilor terpenice si sterolice (Foto 8-9).

In conformitate cu etaloanele s-a identificat prezenta betta-sitosterolului, acidului

oleanolic si a acidului ursolic, cantitatea cea mai crescuta se inregistreaza la proba 1.

Proba 4 (C+V) se caracterizeaza prin prezenta unei fractiuni (spot portocaliu), derivat

de ulei volatil, prezent doar la genotipul C1/92, aspect reflectat si in CSS a uleiurilorvolatile, unde in conformitate cu etaloanele s-a identificat timolul.

In general, la ambele tipuri de variante (C+V) se conserva spectrul biosintetic, cu

exceptia probei 4, la care apar diferente sensibile la nivel calitativ. Rezultatele

obtinute sunt in concordanta cu cele mentionate in literatura de specialitate.

In vederea identificarii fractiunilor volatile (etaloane : borneol, timol, linalool,

camfor, menthol) din herba de Origanum, materialul vegetal a fost supus extractiei cu

diclormetan si etanol 70%.

Pentru probele analizate, fractiunile volatile (6) sunt identice in cadrul aceleeasi

probe, pentru ambele variante (C+V). Linalolul este prezent la toate probele. La proba




2, s-a identificat timolul, in cantitate mai crescuta la varianta C. Probele 2 si 3

prezinta in plus o fractiune volatila (de culoare albastra), cu Rf=0.36, care lipseste la

probele 1 si 4. In literatura de specialitate exista discordante in ceea ce priveste

continutul de compusi fenolici (timol si carvacrol), menionandu-se continutul

timolului in ulei volatil de 15-90% (8, 9).

In conformitate cu etaloanele nu s-a identificat borneolul dar s-a identificat

fractiunea identica mentolului dar in cantitati reduse (urme).

Foto 8. CSS pentru compusi triterpenici si

fitosterolici la genotipuri de Origanum

obtinute prin culturi conventionale simicropropagare

Foto 9. CSS pentru uleiuri volatile la



Prezenta linaloolului, si a celorlalte componente, confirma calitatea uleiului

volatil, la genotipurile luate in studiu. Camforul este fractiunea volatila care,

impreuna cu geraniolul si cineolul, imprima aroma florilor iar continutul ridicat in

linalool si acetat de linalil confera calitate uleiului (10).In cadrul fiecarei variante (1 – 4), constatam ca exista o corespondenta

biosintetica intre probe (C/herba plantelor din culturi conventionale – V/herba

plantelor regenerate in vitro).

Studiul comparativ al probelor (herba de la plante din cultura conventionala si

regenerate in vitro) confirma calitatile bioproductive atat al materialului de origine cat

si al regenerantilor in vitro.

CONCLUZII

Pentru toate genotipurile de Origanum testate (4) s-a efectuat multiplicarea

(micropropagarea) in vitro a plantelor, obtinandu-se 30-40 plantule/varianta;

reactivitatea organogenetica mai accentuata s-a inregistrat la C1/92 si C39/94. Fazeleacomodarii si transferului in campul experimental nu a ridicat probleme deosebite,

inregistrandu-se o supravietuire de 90%.

In 24 – 30 saptamani de cultura, se poate obtine un numar convenabil de plantule,

tehnica de micropropagare constituind o alternativa de inmultire pentru genotipurile

selectionate, androsterile si androfertile, in vederea infiintarii unor campuri de

hibridare si promovarea rapida in verigile superioare ale procesului de ameliorare.

Datele obtinute, prin analiza fitochimica cantitativa, vin in sprijinul afirmatiei ca,

prin tehnica de micropropagare utilizata in experiment, se manifesta expresia



Rom.Biol.Sci. 46

fenotipica determinata de cea genotipica, plantele isi conserva caracterele de

bioproductivitate. Lucrarea a fost realizata in cadrul proiectului CEEX- BIOTECH 21/10.10.2005 si PNCDI -

AGRAL 2050/19.11.2001

BIBLIOGRAFIE

1.

BAJAJ Y.P.S., FURMANOWA M., OLSZOWSKA O., 1988 – Biotechnology of the

Micropropagation of Medicinal and Aromatic Plants, Biotechnology in Agriculture and

Forestry 4, Medicinal and Aromatic Plants I. Y.P. Bajaj (ed.), Springer – Verlag, Berlin,

Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, 60-102

2. CELLAROVA E., 1992 – Micropropagation of Mentha. In Biotechnology in agriculture and

forestry (ed.) Y P S Bajaj (Berlin, Springer-Verlag) vol 99 pp 262-276.3.

VERONESE P., LI H., NIU X., WELLER S.C., BRESSAN R.A., HASEGAWA P.M., 2001

– Bioengineering mint crop improvement. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Kluwer

Academic Publishers, 64 (2/3):133-144.

4.

*** Farmacopeea Romana, ed. a X-a, 1993, Ed. Medicala, Bucuresti.

5. *** European Pharmacopoeia, 4th ed., Council of Europe, Strasbourg, 2002.

6.

HINORE J.B. HARVALA C.E., HINON E.B., 1989 – Antimicrobial activity of 32 common

constituents of essential oils. Pharmazie, 44, 302-303.

7. KONAKCHIEV, A., GENOVA, E., COULADIS, M., 2004 – Chemical composition of the

essential oil of Origanum vulgare ssp. hirtum (Link) Ietswaart in Bulgaria. Comptes redus de

l’Academie bulgare des Sciences, 57(11):49-51.

8. CIULEI I., GRIGORESCU EM., STANESCU U., 1993 – Plante medicinale, Fitochimie si

Fitoterapie, vol.II, Editura Medicala, Bucuresti.

9.

TAMAS M., OPREAN I., 2003 – Precizari asupra compozitiei chimice a uleiului volatil deOriganum vulgare L. ( LAMIACEAE ). In: Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iasi – 2003,

vol.107, nr.2, Supliment, 31-34.

10.

BRUNETON J., 1995 – Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Lavoisier

Press, Londre, Paris, New York, 365 – 367.

evaluarea fitochimica la genotipuri de origanum

Documents