EVALUACIóN FINAL CURSO DE MéTODOS EN BIOTECNOLOGíAEvaluación Final Curso De Métodos En Biotecnología Alumno: Luis del Pozo Yauner Tema: Métodos Electroforéticos
Introducción: El nivel de desarrollo científico de las sociedades humanas ha sido estimado, por lo general, por la cantidad de conocimientos que atesoran, y la velocidad con que pueden generarlos. El conocimiento puede dividirse en dos grandes grupos: el que es mera descripción de nuestro entorno, sea este tan lejano como los mismos límites de nuestro universo, o tan cercano como las moléculas que nos componen; y el conocimiento ÒherramientaÓ, aquel que en forma de métodos, procedimientos y tecnologías, nos permite describir y sobre todo, modificar el entorno. Se reconoce, pues, un vínculo de génesis entre todas las partículas de conocimiento. El descriptivo se va convirtiendo en ÒherramientasÓ, y estas ayudan a generar nuevo conocimiento. La historia de las ciencias, y por consiguiente del hombre, ha sido también la historia del desarrollo de los métodos. En el caso de la Biología, su desarrollo ha estado condicionado por el avance de los métodos para identificar, aislar y describir las propiedades de las moléculas que componen los sistemas vivos. Uno de los más poderosos y populares de estos métodos es la electroforesis, que dado su grado de diversificación actual, es propio hablar de Òmétodos electroforéticosÓ. Como concepto, ÒelectroforesisÓ se refiere al movimiento que experimentan partículas cargadas, ya sean átomos individuales o grandes complejos moleculares, cuando son sometidas al efecto del un campo eléctrico. En este trabajo nos ocuparemos brevemente de su desarrollo histórico, de la descripción de los conceptos y principios básicos, así como de los métodos fundamentales usados en la actualidad, señalando algunas aplicaciones específicas de estos. La historia se inicia con Tiselius: En 1937 el bioquímico sueco Arne Tiselius dio a conocer un nuevo método para separar las proteínas de una mezcla. Este consistía en colocar un cierto volumen de una solución proteica, conteniendo dos o más de estas sustancias, en un tubo de vidrio en forma de ÒUÓ, sin llenar completamente este. Luego el espacio
restante en cada extremo se ocupaba con el volumen necesario de una solución de electrolitos libre de proteína, que actuaba como amortiguador. Debía tenerse mucha precaución al adicionar la solución amortiguadora, evitando que se mezclara con la solución de proteínas a separar. Luego se sumergía un electrodo en la solución amortiguadora libre de proteína de cada extremo, se conectaban los electrodos a una fuente de electricidad y se sometía todo el sistema a una campo eléctrico. Los componentes de la mezcla de proteínas comienzan a moverse a diferente velocidad, en virtud del signo y el número global de cargas, hacia el electrodo de carga opuesta. Se formaban frentes de movimiento que reflejaban la movilidad electroforética de cada componente, o grupos de componentes de la mezcla, por lo que se le dio el nombre de Òelectroforesis de frentes en movimientoÓ o Òmoving boundary electrophoresisÓ a este sistema. Este fue uno de los pocos métodos analíticos poderosos disponibles para los investigadores en la época del desarrollo inicial de la química de proteínas; no obstante, presentaba importantes desventajas, como exigir gran cantidad de muestra, ser muy laborioso y en la práctica no permitir la separación total de los componentes de la mezcla. Las desventajas radicaban en su propia concepción; la separación electroforética ocurría en el medio fluido del amortiguador, sin un soporte que por su naturaleza limitara la mezcla convectiva de los frentes en movimiento, sobre todo, apenas se suprimía el campo eléctrico. Como consecuencia, el poder de resolución del método era escaso. El sistema de Tiselius dio paso a aquellos que usaban un soporte sólido, o gelatinoso, embebido en la solución amortiguadora de pH, y sobre el que ocurría la separación electroforética. En estos sistemas la muestra era constreñida a moverse en el seno del soporte, y dada las cantidades relativamente pequeñas de muestras que podían aplicarse, la separación total de los componentes en bandas o zonas discretas se convertía en algo realizable. Al desconectar el campo eléctrico, cada componente de la mezcla se mantenía por un tiempo suficiente para fines prácticos, en la zona del soporte que había alcanzado durante la electroforesis. Se les llamó genéricamente Òelectroforesis de zonaÓ. Como puede suponerse, el soporte es un factor muy importante para este tipo de electroforesis. Uno de los primeros soportes usados fue el papel de filtro, pero tenían inconvenientes como su fragilidad y la escasa resolución que se alcanzaba en la separación, debido fundamentalmente al gran
tamaño de sus poros moleculares. Luego, el papel fue sustituido por las membranas de acetato de celulosa. Este material posee menor tamaño de poro, lo que resulta en mayor poder de resolución, pero de igual manera es frágil, lo cual hace su manipulación laboriosa, y no permitía alta reproducibilidad de los resultados. Probablemente esto se debió a la dificultad de establecer adecuados controles de calidad en su manufactura. El acetato de celulosa, no obstante, tuvo amplia aplicación en los métodos electroforéticos usados en los estudios clínicos, y aún se usa en muchas instituciones de salud de varios países. Los geles han sido muy usados como soportes electroforéticos, y en la actualidad permanecen, en el caso de los geles de agarosa y de poliacrilamida, como los soportes de elección para la mayoría de las técnicas electroforéticas aplicadas en las investigaciones en Biología y ciencias afines. El gel de almidón, muy utilizado por la década de los años 50s-60s, incrementó la resolución para algunas aplicaciones, pero tiene inconvenientes, como rango limitado de poro, lo cual limita el tamaño molecular de las especies que pueden ser separadas, y además provoca intensa electroendoosmosis. Este fenómeno también fue una limitante en el uso de otro gel, el de agar. Hace relativamente poco tiempo, y gracias al desarrollo de metodologías de purificación, se hizo posible obtener agarosa de alta pureza a partir de ciertas algas productoras de agar. Con este polisacárido natural se confeccionan geles que, en dependencia de la concentración del reactivo usada, poseen rango de poros de variado tamaño, aunque la distribución práctica de poros es fundamentalmente hacia el rango de poro grande. La eliminación de los grupos cargados disminuyó considerablemente el fenómeno de electroendoosmosis. El gel de poliacrilamida, cuyo desarrollo se inició antes que el de agarosa, es, junto con este último, los soportes que poseen importancia práctica en la actualidad. Las ventajas fundamentales del gel de poliacrilamida son la posibilidad de seleccionar con suficiente exactitud el rango de poro, que en su conjunto es de menor talla que en el gel de agarosa; además, es un gel resistente, inerte y transparente; esta última propiedad es muy importante para su uso en ciertos sistemas ópticos de detección y estimación de la concentración de componentes separados por electroforesis en él. El desarrollo de los soportes electroforéticos hizo posible el diseño de nuevos procedimientos de separación de las biomoléculas y otras sustancias sobre la base a su carga eléctrica. Hoy son
varios las técnicas que se valen de este principio, y constituyen valiosas herramientas en el laboratorio bioquímico. Las más conocidas son la electroforesis en gel de agarosa, la electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones nativas o desnaturalizantes, el enfoque isoeléctrico, la electroforesis bidimencional, la electroforesis en gel de campo pulsante y la electroforesis capilar. A ellas haremos referencia, en algunos casos brevemente, en este trabajo. Referencia:
Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. Fundamental Laboratory Approach For Biochemistry and Biotechnology. Pps 125-156. Fitzgerald Scienc4e Press. Inc., Bethesda, MD.
Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.
Algunos Conceptos Básicos: De inicio trataremos los conceptos básicos que se aplican a la mayoría de los métodos electroforéticos.
Una molécula de carga q en un campo eléctrico E experimenta una fuerza (F):
F=qE
La movilidad electroforética (µ) de una molécula es:
µ = = Donde v es la velocidad de movimiento de la molécula, y f es su coeficiente friccional.
Ley de Ohm: V= P=VI=RI2
Donde V es voltaje, R es resistencia del conductor, I es intensidad de la corriente y P es potencia. Esta relación nos indica que si incrementamos la I de la corriente en el experimento electroforético, la P, y por consiguiente, el calor generado se incrementa al cuadrado.
Dada la relación establecida en la ecuación:
P= Cuando disminuimos la fuerza iónica del amortiguador, y por tanto su conductividad, aumenta la resistencia (R) al paso de la corriente. Como consecuencia disminuye el calor generado por el sistema (P), si V se mantiene constante. Por cada dos veces que disminuyamos la fuerza iónica del amortiguador, podemos incrementar 1.4 veces el V sin provocar incremento significativo del calor generado
La movilidad efectiva (µeff) de un electrolito débil es un promedio de la movilidad efectiva de su forma ionizada:
µeff=µx Donde x es la fracción de moléculas ionizadas a un pH determinado, y µ es la movilidad de la forma ionizada. Referencias:
Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press.
Ninfa, A. J., & Ballou, D. P. (1998) Fundamental Laboratory Approach For Biochemistry and Biotechnology, pps 125-156. Fitzgerald Science Press. Inc., Bethesda, MD.
Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.
Electroforesis en gel de agarosa: La agarosa es un polisacárido lineal que se extrae de ciertas variedades de algas productoras de agar (FMC Bioproduct, 1988, Sambrook et al, 1989). La estructura básica que se repite a lo largo del polímero lineal es una unidad compuesta por una molécula de D-galactosa y una de 3,6 anhidrido galactosa, unidas por enlace glucosídico. Cuando la agarosa es hidratada y fundida a
temperaturas altas y luego dejada enfriar, forma un gel en el que las cadenas polisacarídicas se entrelazan, en asociación física estabilizada por innumerables puentes de H, formando ases interconectador, que finalmente resultan en una densa red o malla cuyos poros moleculares limitan los espacios internos de la trama. Los poros del gel de agarosa son mayores que los del gel de poliacrilamida. En el gel de agarosa solo pueden ser separadas con eficiencia proteínas de peso molecular mayor de 500kDa, y moléculas de DNA de alrededor de 2000 pb. En la medida que se incrementa la concentración de agarosa en el gel, el tamaño de los poros disminuye. En el mercado hay disponibles muchos tipos de celdas electroforéticas para realizar electroforesis en geles de agarosa. Igualmente, están disponibles muchos tipos de agarosas, que varían en sus propiedades químicas y físicas, como la intensidad de la electroendoosmosis que su composición química promueve, la resistencia mecánica del gel, la porosidad, y la temperatura de gelificación, que para algunas de grado especial es significativamente baja sin que se afecten otras características como la resistencia mecánica del gel. Estas propiedades influyen significativamente en los resultados del proceso de separación electroforética (Sambrook et al, 1989). Aunque se ha usado en técnicas para proteínas, el uso más frecuente de la agarosa es en los métodos electroforéticos de separación de ácidos nucleicos. Varios factores determinan la velocidad de migración de una molécula de DNA en el gel de agarosa. Estos factores son: Tamaño molecular del DNA: Debido a la resistencia friccional que ejerce el gel sobre las moléculas de DNA que se mueven en su seno en respuesta al campo eléctrico, aquellas de mayor talla se moverán a una menor velocidad que las más pequeñas. La velocidad de migración es inversamente proporcional al log10 del número de pares de bases, para el caso de una molécula de DNA de doble cadena y lineal. Conformación del DNA: La forma o conformación del DNA influye significativamente en su movilidad electroforética. El DNA súper enrollado (forma I), el DNA circular mellado (forma II) y el DNA lineal de igual talla molecular migran a través del gel de agarosa a diferente velocidad. Si bien la
concentración de agarosa del gel es el factor que primariamente determina la velocidad relativa de migración de estas formas, otros factores como la fuerza del campo eléctrico aplicado, la fuerza iónica de amortiguador y el grado de súper enrollamiento de la molécula en forma I, también influyen en el valor de este término (Johnson and Grossman, 1977). Bajo algunas condiciones el DNA en forma I migra más rápidamente que el III, pero en otras el orden se invierte. Concentración de agarosa en el gel: Un fragmento de DNA lineal de un tamaño molecular dado migrará a diferentes velocidades en geles que posean diferente concentración de agarosa. La relación entre la movilidad electroforética (µ) y la concentración del gel (τ) se expresa en la siguiente ecuación: logµ=logµ0-Kr τ Donde µ0 es la movilidad electroforética libre del DNA, Kr es el coeficiente de retardo, una constante que se relaciona a las propiedades del gel y al tamaño y la forma de la molécula que migra. Esta relación nos dice que, modificando la concentración del gel, podemos resolver mezclas no totalmente separadas en un primer intento. El rango óptimo de separación de geles de agarosa en dependencia de la concentración se indica en la tabla siguiente:
Cantidad de agarosa en el gel, expresado en % (p/v)
Rango óptimo de separación de fragmentos lineales de
DNA (kb) 0,3 5-60 0,6 1-20 0,7 0,8-10 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2
Voltaje aplicado: A bajo voltaje la velocidad de migración del DNA es proporcional al voltaje aplicado. Pero en la medida que el campo eléctrico es intensificado, la movilidad de las moléculas de DNA de alto peso molecular comienza a no corresponder proporcionalmente al incremento del voltaje. Como
consecuencia, el rango efectivo de separación en el gel de agarosa disminuye con la elevación del voltaje. La máxima resolución en la separación de fragmentos de DNA de más de 2kb se logra cuando se realiza la corrida electroforética a 5 V/cm. La distancia a usar en este cálculo es la que separa en línea recta a los electrodos de la celda electroforética. Dirección del campo eléctrico: Los fragmentos lineales de DNA se alinean con relación a la dirección del campo eléctrico, de modo que al cambiar la dirección de este, estos fragmentos deben realinealse para iniciar el movimiento en la nueva dirección del campo. Los fragmentos de mayor talla consumen más tiempo en el proceso de realineamiento, y quedan rezagados con relación a los de talla menor. El cambio frecuente de la dirección del campo eléctrico es la base de la electroforesis en gel de campo pulsante. Composición de bases del DNA y la temperatura de corrida: La influencia de estos factores es menor en el gel de agarosa que en la electroforesis en gel de poliacrilamida, no obstante, en el caso de geles confeccionados con agarosa de bajo punto de fusión, o aquellos que contienen menos del 0,5% del polisacárido, es muy conveniente realizar el ensayo a 40C, para evitar la fusión del gel. Presencia de colorantes intercalantes: El colorante fluorescente intercalante Bromuro de Etidio reduce la movilidad electroforética del DNA lineal en un 15%. Este efecto se debe al intercalamiento de las moléculas del colorante entre las bases apiladas en la estructura del DNA, que torna rígidas y alargas a las moléculas lineales o circulares con mella. Composición del amortiguador: la movilidad electroforética del DNA es afectada por la composición y la fuerza iónica de amortiguador usado en el ensayo. En cuanto a la fuerza iónica, su efecto es expresión de la relación entre este parámetro y la corriente eléctrica que fluye a través del gel. En un medio de fuerza iónica cero, la conductancia es mínima y la movilidad electroforética del DNA es escaza, si es que migra. En cambio, si la fuerza iónica del amortiguador es muy alta, el flujo de corriente se incrementa, lo que resulta en mayor generación de calor, lo que puede incrementar la temperatura del sistema más allá del punto de fusión de la agarosa, y eventualmente desnaturalizar el DNA. Fragmentos lineales de DNA de doble cadena migran alrededor de un 10% más rápido en amortiguador TAE que en TBE o TPE, sin que esto signifique
incremento en la resolución. En cambio, la resolución de mezclas de DNA súper enrollado es mejor en TAE que en TBE. Varios aparatos y protocolos han sido desarrollados para satisfacer las diferentes exigencias del trabajo experimental relacionado con la separación electroforética de mezclas de DNA. Información abundante sobre este particular se encuentra disponible en el web y textos de métodos. Referencia:
FMC BioProducts (1988) ÒFMC BioProducts Sources Books,Ó Agarose Monog., 4th ed., pp. 51-106. FMC BioProducts, Rockland, Me. ¤ Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). ÒMolecular Cloning: A Laboratory Manual,Ó 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida: La casi inigualable resolución y flexibilidad que ofrece la electroforesis en gel de poliacrilamida ha convertido a esta técnica en una de las más usadas para la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Es posible variar la porosidad del gel y la composición del sistema de amortiguadores para satisfacer una amplio rango de requerimientos experimentales. La separación puede realizarse en virtud de las diferencias de carga, del tamaño molecular, o por una combinación de ambos. El gel de poliacrilamida se forma por la copolimerización de la acrilamida y un comonómero entrecruzante que es usualmente la N,NÕ-metilenebisacrilamida (bisacrilamida). El entrecruzante es un agente acrílico bifuncional que une covalentemente las cadenas lineales de poliacrilamida (Righetti et al, 1989). Además de la bisacrilamida se han usado otros entrecruzantes para propósito especiales, como el piperazinediacrilamide, o PDA, que permite obtener un gel con bajo fondo en la coloración con plata.
La reacción de polimerización, representada en la figura situada debajo, es de adición de grupos vinilos, iniciada por un sistema generador de radicales libres (Flory et al, 1953).
En las recetas más comunes de confección de geles de poliacrilamida, la polimerización es iniciada por la adición de persulfato de amonio, que es el agente iniciador, y de tetrametiletilenediamina (TEMED), que funciona como agente acelerador. El TEMED acelera la descomposición del persulfato de amonio en radicales sulfato libres, los que inician la reacción al convertir a los monómeros de acrilamida en radicales libres que reaccionan, a su vez, con los monómeros no activados, procediendo de esta forma la polimerización; para esta se necesita la presencia de la base libre del TEME. La estructura del agente entrecruzante N,NÕ-metilenebisacrilamida es la de dos moléculas de acrilamidas unidas a través de sus grupos amino por una unidad de metilene. Esta estructura le permite a una molécula de entrecruzante participar en la reacción de polimerización de dos cadenas lineales en crecimiento. Cuando esto ocurre, las cadenas lineales quedan conectadas covalentemente por un puente de Cs y Ns alternantes. Este puente posee dos enlaces C-N de tipo peptídico, lo cual probablemente aporta cierto grado de rigidez a la estructura. Cuanto mayor es la concentración relativa del agente entrecruzante, mayor es la probabilidad de que se entrecrucen las cadenas lineales de poliacrilamida, aunque esto parece ser verdadero hasta cierto valor de concentración, como veremos luego (Gelfi C et al 1981a). Muchos factores influyen profundamente el curso de la reacción de polimerización, y si no son adecuadamente controlados, se pueden comprometer las propiedades del gel y Consecuentemente la reproducibilidad del ensayo electroforético. Entre estos factores destacan:
q Pureza de los reactivos: La presencia de impurezas como el ácido acrílico,
iones metálicos y acrilamida lineal, tanto en la acrilamida como en la Bis, pueden inhibir la reacción de polimerización, y modificar las propiedades del gel. q La concentración de los comonómeros: Los geles de poliacrilamidan son caracerizados convencionalmente por dos términos: El %T y el %C. El primero indica la concentración total de monómeros (acrilamida + bisacrilamida) expresadas en g/100mL de solución, y el %C indica la proporción relativa del entrecruzante en la concentración total de monómeros ([Acril+Bis]/[Bis]x100). El tamaño de poro efectivo del gel es una función inversa del valor de %T, lo cual significa que, a mayor valor de %T, para un valor fijo bajo de %C, menor el tamaño de poro. Por otra parte, la función que expresa la relación entre el valor de %C y el tamaño de poro es bifásica; puede ser representada como una campana invertida en un eje de coordenadas, donde x es %C e y es tamaño de poro. En la medida que se incrementa %C a un %T constante, disminuye en tamaño de poro, siendo este mínimo al valor de 5%C. A valores mayores de 5%C el tamaño de poro se incrementa (Gelfi C et al 1981a).
El rango de fraccionamiento con relación al valor de %T se representa en la siguiente tabla:
Rango de fraccionamiento para geles de poliacrilamida %T Rango Mr óptimo 5-12 20,000-150,000 10-15 10,000-80,000 > 15 <15,000
q El pH: Cuando el pH es menor de 6, la eficiencia de la reacción de polimerizaci˜n disminuye significativamente (Caglio & Righetti, 1993). Una forma de atenuar este efecto cuando se necesitan confeccionar geles a pH ácido, es usar riboflavina como fuente de radicales libres adicional, y la luz como activador en presencia de O2, de la liberación de estos radicales. q La presencia de O2: Puesto que la formación de poliacrilamida procede como una reacción de polimerización de radicales libres, la presencia de
agentes que reaccionan con estos y los atrapan, la inhibe. El oxígeno es ese tipo de inhibidor. Por eso se hace necesario, para ciertos requerimientos, eliminar el oxígeno disuelto en las soluciones de reactivos mediante degasado. En ocasiones también se hace necesario aislar del aire circundante a la solución donde está ocurriendo la reacción de polimerización, mediante una fina capa de agua previamente degasada. q Temperatura: En control de la temperatura es crítico para lograr reproducibilidad en la polimerización de la acrilamida. La temperatura tiene un efecto directo sobre la velocidad de la reacción de polimerización, pues esta es exotérmica. El calor liberado acelera, pues, a la reacción. La temperatura de polimerización también influye en las características finales del gel. El rango óptimo es de 230C a 250C. A temperaturas cercanas a cero se forman geles de aspecto turbio, porosos e inelásticos, y a temperaturas muy altas se forman cadenas poliméricas cortas y el gel también es inelástico (Gelfi, C. et al 1981b). q Aditivos: Aditivos como los detergentes SDS y Tritón X-100 pueden adicionarse a la mayoría de los sistemas de amortiguadores sin que se altere la polimerización. En cambio, la formamida y la urea provocan la formación de geles con tamaño de poro menor que el que acontecería si no estuvieran estos reactivos presentes. Además de los propios aditivos, los contaminantes que en ocasiones les acompañan pueden también inhibir la polimerización. q Tiempo: Si bien luego de transcurridos 15-20 min puede constatarse la formación del gel, la polimerización aún está procediendo. Se sugiere que cuando se emplee el sistema persulfato de amonio-TEMED, se permita que esta transcurra durante al menos 2 horas, para asegurar reproducibilidad en las características del gel. En cuanto al sistema riboflavina-luz, por lo general la reacción procede más lentamente, dependiendo de la intensidad de la luz.
La electroforesis en gel de poliacrilamida puede ser efectuada en condiciones no desnaturalizantes para las proteínas, y en ese caso se clasifica como Òelectroforesis en condiciones nativaÓ, o por el contrario, en Òcondiciones desnaturalizantesÓ, tales que aseguran total desnaturalización de estas. Esto es importante, pues si bien en ambos casos la fuerza que mueve a las moléculas cargadas a lo largo del gel es la atracción del polo con carga opuesta, la
separación de los componentes de la muestra no ocurre por el mismo principio en ambos casos. El sistema de amortiguadores tienen un efecto profundo en la corrida electroforética. El amortiguador determina las condiciones de potencia del sistema, y afecta la separación y resolusión de las bandas. Adicionalmente, cuando se desea realizar un experimento en condiciones nativas, es muy importante tener en cuenta el efecto de las características de fuerza iónica, composición de iones y pH del amortiguador sobre la actividad de las proteínas de la muestra. Los sistemas de amortiguadores para electroforesis en gel de poliacrilamida se clasifican en continuos y discontinuos. Sistema continuo: Es aquel en el que un mismo amortiguador, con el mismo pH, es usado en el gel y en los reservorios de los electrodos. Adicionalmente, las muestras son cargadas directamente en el gel donde ocurrirá la separación. Este sistema tiende a la difusión de las bandas, lo cual hace que tenga menor resolución que el sistema discontinuo. Cuando la concentración de los componentes de la muestra se acerca a 1mg/mL, este sistema puede ser usado. Sistema discontinuo: El primer sistema discontinuo fue desarrollado por Ornstein y Davis en 1964. Este fue un sistema para el análisis de proteínas del suero en estado nativo, que desde entonces ha sido aplicado a muchas otras proteínas. Este sistema consiste en cuatro partes interrelacionadas: (1) el gel concentrador (stacking gel), (2) el gel separador (running gel), (3) el amortiguador de electrodos, y (4) la muestra. El gel concentrador es de poros grandes (4%T), contiene amortiguador Tris-Cl 0.125M, pH 6.8 y se prepara en la parte superior del gel separador. Este último posee valores de 5-30%T, contiene Tris-Cl 0.375M, pH 8.8. El amortiguador de los electrodos es Tris 0.025 Glicina 0.192M, pH 8.3. La muestra se deposita sobre el gel concentrador, diluida en amortiguador de muestra Tris-Cl 0.0625 M, pH 6.8, y es cubierta por el amortiguador del cátodo (reservorio superior). Cuando es aplicado el campo eléctrico, los aniones Cl- y glicinato, así como las proteínas cargadas negativamente, comienzan a moverse hacia el ánodo. El Tris y otros cationes se mueven hacia el cátodo. Como la µeff del Cl- es mayor que la de la glicina a pH 8.3 (Dado que el pKa de la glicina es 9.8, solo 1/30 moléculas están disociadas a glicinato), se forma una
región de baja conductividad y alto campo eléctrico detrás del frente de movimiento del Cl-. Esto acelera el movimiento de las proteínas de la muestra y del frente de movimiento de la glicina a la misma velocidad del frente del Cl-. Se forma un arreglo de frentes en movimiento, con el Cl- al frente, la glicina en la retaguardia, y las proteínas en varios frentes comprimidos entre ambos. Esto ejerce un efecto de concentración de las proteínas que se ha planteado pueden llegar a alcanzar concentraciones del orden de 100mg/mL (Chen et al, 1978). El pH del gel concentrador asciende a 8.3 en la medida que la glicina se mueve a través de él. Dado que el gel concentrador posee poros grandes, no ejerce efecto de tamiz, y las proteínas avanzan solo dependiendo del efecto del campo eléctrico. Cuando los frentes atraviesan el gel concentrador y entran en el gel separador, la menor porosidad de este sí ejerce efecto de tamiz, resistiéndose al paso de las proteínas en dependencia de su tamaño molecular. Como este es un sistema en condiciones nativas, también la forma influye en la movilidad electroforética. A lo anterior debe añadirse que al penetrar las proteínas en el gel separador, experimentan un súbito cambio del pH del medio, de 8.3 a 8.8, el que luego asciende a 9.5 cuando el amortiguador Tris-CL es sustituido por Tris- glicina. Este es el valor de pH al ocurre la separación de los componentes de la muestra en bandas discretas. Laemmlin en 1970 modificó es sistema de Ornstein-Davis para usarlo en la estimación del peso molecular de las proteínas. él incorporó el detergente aniónico dodecil-sulfato de Na (SDS) al 0.1% en los amortiguadores del sistema de Ornstein-Davis, y adicionó un paso de desnaturalización al calor en presencia de 0.2% de SDS y 2-mercaptoetanol al 5%. En tales condiciones, los enlaces S-S de las proteínas se reducen, y las proteínas se desnaturalizan totalmente. El SDS se asocia a estas en una relación de 1.4g de SDS por gramo de proteína. Las propiedades del SDS se hacen dominantes sobre las de las proteínas, estas adoptan una conformación extendida, similar a bastoncillos, con dimensiones proporcionales a su masa molecular. En adición, la densidad de carga del complejo SDS-proteína es independiente del pH en el rango de 7 a 9. Por todo lo dicho, se hace claro que el fraccionamiento de los componentes de la muestra depende únicamente del efecto de tamiz del gel de poliacrilamida, de modo que es posible estimar con buena exactitud la masa molecular de una proteína, si se
posee varias de ellas de masa conocida (marcadores de peso molecular para SDS- PAGE), pues la relación entre la movilidad relativa de estas y el logaritmo de su peso molecular es lineal dentro de un rango relativamente amplio para cada sistema. Están disponibles en el comercio numerosos kits de proteínas de referencia de peso molecular, tanto para rango de peso bajo, alto, como rango amplio. En la tabla que sigue se muestra un ejemplo, comercializado por la compañía Bio-Rad, así como el gráfico donde se representa la relación lineal entre movilidad relativa relativa y log del peso molecular.
Aunque el formato más usado en la actualidad es el gel en forma de lámina, también se han desarrollado sistemas que emplean geles de forma tubular. En las electroforesis en gel de poliacrilamida, para la detección de las bandas se emplean colorantes como el negro amido, el azul brillante de Coommassie, pero también coloraciones con mayor sensibilidad para detectar proteínas. Uno de los métodos más sensibles es la coloración con plata (Rabilloud et al., 1990). También se emplea la coloración con Cu cuando se desea evitar el paso de
fijación en electroforesis de SDS-PAGE. La especificidad de reconocimiento de los anticuerpos permite identificar a componentes específicos de la muestra, separados durante la electroforesis, mediante el método de inmuno-fijación (immuno-blotting). Dado que los anticuerpos reconocen fundamentalmente epitopes conformacionales, su uso se limita a sistemas de electroforesis nativa. Como veremos en el caso de la 2D-SDS PAGE, la electroforesis en gel de poliacrilamida puede combinarse con otros métodos, como el PCR, para detectar cambios puntuales en genes que pueden ser causa de enfermedad, como es el caso de la Fenilcetonuria (Michiels, L., et al.) Referencias:
Caglio, S & Righetti, P. G. (1993) On the pH dependence of polymerization efficiency, as investigated by cappillary zone electrophoresis. Electrophoresis 14, 554-558.
Chen, D., Rodbard, D., Chrambach, A: (1978) Poliacrilamide gel electroforesis with optical scanning, using multiphasic buffer systems: The syack. Anal. Biochem. 89, 596-608.
Davis, B. J. (1964) Disc electrophoresis. II. Methods and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 404-427.
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Gelfi C and Righetti PG, Polymerization kinetics of polyacrylamide gels II. Effect of temperature, Electrophoresis 2, 220Ð228 (1981b)
Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteinsdurind the assembly of the head og bacteriophage T-4. Nature, 227, 680
¤ Michiels, L., Fran•ois, F., Raus, J. (1999) Identification of Disease Causing Mutations in Phenylketonuria by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Using the DCodeª System. Bulletin 2377. Bio-Rad. www.bio-rad.com.
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Voet, D., & Voet, J. (1995). Biochemistry. 2nd Edition, pps. 89-96. John Wiley & sons, Inc., New York.
Enfoque isoeléctrico: Este es un poderoso método para separar las moléculas anfotéricas de una mezcla sobre la base del valor de su pI. Las proteínas son el caso mejor conocido de moléculas afotéricas. Ellas se cargan negativamente cuando el pH del medio es mayor que el valor de su pI, en cambio, cuando ocurre lo contrario, el pH<pI, entonces su carga neta es de signo positivo. En ambas condiciones las moléculas se moverán en un campo eléctrico, obviamente dirigiéndose hacia el electrodo de carga opuesta. Pero la esencia del método radica en la respuesta de las moléculas anfotéricas cuando el valor de pH del medio se iguala al valor de su pI. En esas condiciones las cargas negativas de la especie son compensadas por igual número de cargas positivas, resultando en carga neta igual cero. Cuando esto ocurre, la molécula deja de responder al campo eléctrico y se detiene en la región donde pH=pI. Para la realización del enfoque isoeléctrico es necesario establecer un gradiente lineal y estable de pH a lo largo del gel, cuyo rango de valores estará determinado por los pI de los componentes de la muestra que son de nuestro
¤ Garfin, D. E. Electrophoretic Methods (1996). Reprinted from: Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research. Edited by Jay A. Glasel and Murray P. Detscher. Academic Press.
Just, W. W. (1983) Synthesis of carrier ampholytes for isoelectrric focusinf. In ÒMethods in EnzimologyÓ (C. Hirs and S. Timasheff, eds.), Vol. 91,
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Electroforesis Bidimensional: Dado que cada método electroforético hace uso de, fundamentalmente, una propiedad física diferente de las moléculas de la muestra para lograr su separación, la combinación de dos de estos puede incrementar la capacidad de resolución del ensayo en general. Esta es la lógica de la electroforesis bidimensional, en la que se combinan dos técnicas que separan las moléculas en base a características diferentes. La combinación más frecuentemente usada es la de enfoque isoeléctrico con la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. A este ensayo de le ha denominado 2-D PAGE. Los dos principios de separación son ortogonales y complementarios. Primero las proteínas son separadas en bases a su pI en un ensayo de enfoque isoeléctrico, usando un solo carril de un gel en lámina, o un gel en forma cilíndrica. La separación ocurre en una sola dimensión. Luego la porción de gel que contiene las proteínas es cortada en una tira, en el caso de ser un gel en lámina, o el cilindro de gel es tomado, y en ambos casos se adosan al extremo superior de un gel para SDS-PAGE. El gel del enfoque isoeléctrico se orienta de modo tal que el eje de movimiento de las proteínas durante el enfoque queda perpendicular a la dirección de movimiento durante la SDS-PAGE. Luego se realiza la segunda corrida, de modo que ahora la separación ocurre en una segunda dimensión, perpendicular a la anterior. Una vez concluida la separación electroforética, se efectúa el paso de identificación mediante coloraciones estándar para proteína, o especiales, según el interés. El uso de la coloración de plata aporta mucha sensibilidad de detección al método. El resultado final va ha depender de las condiciones elegidas para cada ensayo;
como, por ejemplo, el rango del gradiente de pH usado en el ensayo de enfoque isoeléctrico. La combinación de ambos métodos incrementa significativamente la resolución, y hace posible resolver mezclas muy complejas de proteínas. Esta característica ha convertido a la 2D-PAGE en una herramienta muy poderosa para la identificación de nuevas proteínas, y el estudio de los patrones de expresión de estas en la célula, bajo condiciones específicas, lo cual es muy importante en la comprensión de nuestro proteoma. Referencias:
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Hoving, S., Voshol, H., van Oostrum, J. (2001) High-Performance 2-D Gel Electropho resis using Narrow pH-Range ReadyStrip- IPG Strips. Bulletin 2587. Bio-Rad. www.bio-rad.com
Pandey, A., Mann, M. (2000). Proteomics to study genes and genomes. Nature, 405(15):837-846.
Electroforesis Capilar (EC): La EC es una familia de técnicas relacionadas que emplean capilares de pequeño diámetro interior (20-200µm) como celda donde estará contenido el sistema de amortiguadores donde ocurrirá la separación electroforética de los componentes de la muestra. Este formato permite acometer la separación, con muy alta eficiencia, de moléculas de estructura química muy diferentes, como proteínas y péptidos, DNA y carbohidratos. También es posible separar moléculas estructuralmente muy similares entre sí, como los enantiómeros, y pequeñas del tipo de los compuestos farmacéuticos. Las prestancias de este conjunto de técnicas se deben, en buena medida, al uso de alto voltaje, lo cual genera dentro del capilar tanto flujo electroforético de las especies iónicas de la muestra, como electroosmótico de la solución amortiguadora. Las altas propiedades de separación y los electroforegramas que resultan, recuerdan a un híbrido entre la SDS-PAGE y la HPLC. Las características generales y ventajas que supone el uso de la EC se pueden resumir en:
Emplea un tubo capilar donde ocurre la separación electroforética. Utiliza campos eléctricos de muy alta tensión, de hasta 500 V/cm. Usa metodología de detección muy moderna, que le dan al electroforegrama
semejanza a un cromatograma. Posee un grado de eficiencia del orden de la cromatografía de gas en capilar
, llegando a superarla en algunos casos. Requiere cantidades de muestra muy pequeñas, lo cual le convierte en un
procedimiento analítico muy útil para el trabajo con sustancias muy escasas y valiosas.
Su explotación es económica, pues consume pequeñas cantidades de reactivos.
Es aplicable a un amplio grupo de compuestos, superando en este rubro a muchos otros métodos electroforéticos.
La configuración instrumental básica para la EC es simple, y consta de los siguientes elementos:
a) Un tubo capilar de sílice fundida que posea una ventana óptica para el análisis del contenido. b) Una fuente de alto voltaje regulable. c) Un par de electrodos. d) Dos reservorios de solución amortiguadora. e) Un detector de UV.
Cada extremo del capilar es sumergido en uno de los reservorios de amortiguador, y la ventana óptica es alineada con el detector. Luego de llenar el capilar con solución amortiguadora, la muestra puede ser introducida en él sumergiendo el extremo opuesto al que posee la ventana óptica en la solución de muestra, y posteriormente elevando este extremo unos 30 cm por encima del nivel del reservorio del extremo del detector. Ya introducida la muestra, se aplica el campo eléctrico y se procede a la separación electroforética. De hecho, la mayoría de los trabajos realizados en EC antes de 1988 se valieron de sistema confeccionados por los mismos investigadores. Los sistemas comerciales modernos se caracterizan, sobre todo, por su alto grado de automatización, conferido por el control computarizado de todas las operaciones, como la
inyección electrocinética de la muestra, el control exacto de la presión y la temperatura del sistema, el desarrollo de los procedimientos y las estrategias de separación; poseen eficaces sistemas de disipación de calor y de recolección de fracciones. Es necesario precisar el uso de algunos términos en el contexto de la electroforesis capilar. Los fundamentales son: Tiempo de migración (tm): Es el tiempo que toma a un soluto en moverse desde el inicio del tubo capilar hasta la ventana óptica del detector. Movilidad electroforética (µep): Se expresa en cm2/Vs y es la velocidad con que se mueve un ion a lo largo del capilar en respuesta a la intensidad del campo eléctrico. Velocidad electroforética (Vep): Se expresa en cm/s, y es la distancia que recorre un soluto por unidad de tiempo. Fuerza del campo eléctrico (E): Se expresa en V/cm. La relación entre estos términos es la siguiente:
µep = = (1) La Vep se calcula dividiendo la longitud del capilar (Ld) entre el valor de tm. La µep se calcula dividiendo la Vep entre E. La Vep es independiente del voltaje y de la longitud del capilar, pero es altamente dependiente del tipo de amortiguador empleado, el pH y la temperatura. Las dos medidas del capilar que son importantes son Ld, que es la longitud del capilar desde su inicio hasta la ventana del detector, y la longitud total (Lt), que incluye el segmento de capilar que continúa luego de la ventana del detector, y que sirve para conectar al capilar con el reservorio de amortiguador. La separación mensurable ocurre en el segmento Ld, mientras que el cálculo de E se realiza dividiendo el voltaje total entre Lt. La ecuación 1 nos permite calcular la µep aparente, pero el cálculo de la real debe tener en cuenta el efecto del flujo electroosmótico. Este factor debe ser
cuidadosamente controlado durante los experimentos de separación, para lograr alta reproducibilidad. La electroosmosis: Es uno de los procesos determinantes de la separación de los componentes de la muestra en la EC. Este fenómeno es consecuencia de los grupos ionizables presentes en la superficie interna de las paredes del capilar. La sílica fundida posee grupos silanol que están en contacto con el amortiguador contenido en el capilar. El grado de ionización de estos grupos depende del pH del amortiguador empleado en el ensayo. La sílica posee un pI de 1.5. A pH por encima de 1.5 la sílica se carga negativamente, y atrae cationes componentes del amortiguador, lo cual crea una doble capa de iones. Cuando se aplica un campo eléctrico a lo largo del capilar, la tendencia es que los aniones se muevan hacia el ánodo, y los catones hacia el cátodo, pero los grupos silanol de carga negativa están fijados en la pared del capilar y non pueden moverse libremente, pero los cationes de la doble capa, que si pueden hacerlo, se mueven hacia en cátodo, y en su movimiento arrastran moléculas de agua. El resultado es un flujo neto de solución amortiguadora en dirección al electrodo negativo, que puede ser muy intenso. A pH igual a 9.0 en amortiguador borato 20 mM el flojo electroosmótico (FEO) es de alrededor de 2mm/s, lo que en un capilar de 50 µm de diámetro interno significa un flojo neto de 4 nL/s. A pH igual a 3 el FEO es mucho menor, de 0.5 nL/s, lo que está determinado por el menor grado de ionización de los grupos silanol de la pared capilar. El FEO (Veo) es definido por la siguiente relación:
Veo = Donde es la constante dieléctrica del medio, η es la viscosidad del amortiguador, y ζ es el potencial zeta medido en el plano de corte cerca de la interfase líquido-sólido. El ζ está relacionado al inverso de la carga por unidad de área de superficie, al número de electrones de valencia, y a la raíz cuadrada de la concentración de electrolito. Puesto que esta es una relación inversa, el incremento de la concentración de electrolitos resulta en la disminución del FEO. El FEO puede ser controlado, o incluso suprimido, para realizar ciertos modos de
ensayo de EC. Por otro lado, el FEO permite el análisis simultaneo de aniones, cationes y especies neutras en una misma corrida electroforética. A pH neutro o alcalino el FEO es suficientemente intenso como para obligar a todas las especies a moverse hacia el ánodo. El orden de movimiento es: Cationes, especies neutras y finalmente aniones. Para describir el efecto del pH sobre el FEO y la movilidad de las especies ionizables de la muestra, emplearemos el caso de péptidos. Los péptidos son zwitteriones; a pH muy alcalino se cargan negativamente, y se mueven hacia el electrodo positivo (ánodo) en respuesta al campo eléctrico. Pero a pH alcalino el FEO es tan intenso que sobrepasa el efecto de atracción que ejerce el ánodo sobre los péptidos, y estos se mueven junto al amortiguador hacia el cátodo. A pH ácido, los péptidos se cargan positivamente, y el FEO es débil. Como resultado. ambos, los péptidos y el amortiguador fluyen hacia el cátodo. Para asegurar el total control del sistema se hace necesario medir la intensidad del FEO. Un modo de calcularlo es inyectando una muestra que contenga una molécula neutra, como el metanol o la acetona, y midiendo el tiempo que le toma en llegar hasta el detector. Para realizar modalidades de EC que se basan en el enfoque isoeléctrico (EI-EC) y la isotacoforesis (ISF-EC), se necesita eliminar el efecto de FEO. Ello se logra recubriendo la superficie interna del capilar con una sustancia no cargada, o usando capilares de teflón, que no poseen grupos químicos ionizables. También se han usado aditivos como la metilcelulosa. Cinética del flujo: Una consecuencia importante del uso del campo eléctrico como generador del flujo de amortiguador (FEO) en la EC, en lugar de los sistemas hidrodinámicos como las bombas de presión que se usan en los sistemas de cromatografía líquida, es que, en este último caso, el flujo posee un perfil de tipo laminar o parabólico, como consecuencia de la caída de presión que provoca la fricción de las moléculas del fluido con la superficie interna de los empaques y las paredes de las tuberías. Se establece un gradiente de flujo en el que la velocidad es mayor en las capas centrales del fluido y se aproxima a cero en las capas cercanas a la interfase líquido-sólido. Este gradiente de velocidad provoca que la banda o zona donde se mueve cada componente de la muestra se haga más ancha. Por el contrario, en los
sistemas en los que el campo eléctrico es quien provoca el flujo, la fuerza impulsora del FEO se distribuye uniformemente a todo lo largo del capilar, y en consecuencia, no se producen caídas de presión. La velocidad de flujo es uniforme en toda la sección transversal del capilar, excepto en la región muy cercana a la interfase líquido-sólido, donde la velocidad también se aproxima a cero. Eficiencia del sistema: La velocidad de migración, (Vep), se calcula según la ecuación:
νep= µep E = µep Donde V es el voltaje y L es la longitud total del capilar. El tiempo de migración (t) es:
t = =
Durante la migración a través del capilar ocurre dispersión de los picos (σ2) como consecuencia de la difusión molecular. La σ2 se calcula a partir de la ecuación:
σ2= 2Dmt= Donde Dm es el coeficiente de difusión del soluto (cm2/s). El número de platos teóricos (N) está dado por la relación siguiente:
N= Sustituyendo la ecuación de dispersión en la ecuación de cálculo de los platos teóricos, tenemos la siguiente relación:
N = Sustituyamos los valores de la mioglobina de corazón de caballo en la ecuación para el cálculo del número de platos teóricos. MW=13,900, µep=0.65x10-4 cm2/Vs (en amortiguador bicina/TEA 20mM, pH=8.5) Dm= 10-6 cm2/s, V=30,000 Volts. El cálculo de N es igual a 975x103 platos teóricos.
La dispersión en un sistema simple como el que analizamos aquí, se asume como difusión dependiente del tiempo solamente. Esta ecuación indica que las moléculas grandes como las proteínas y los Ac. Nucleicos, con coeficientes de difusión (D) pequeños, generarán el número mayor de platos teóricos. Un modo de incrementar la eficiencia en el sistema de EC es incrementando el voltaje, lo cual disminuye el tiempo de separación. El voltaje límite en los sistemas actuales es de 30kV. No obstante la posibilidad de usar capilares muy cortos para generar campos muy fuertes, el límite práctico para el incremento de la fuerza del campo eléctrico es la generación de calor, que se denomina Òcalentamiento de JouleÓ. El calentamiento de Joule es consecuencia de la resistencia del amortiguador al flujo de la corriente eléctrica. Esto puede ser atenuado mediante el uso de sistemas apropiados de disipación de calor, aunque con límites reales. No obstante las limitaciones que establece la difusión, la EC es un método útil para la separación de moléculas pequeñas, pues, dado que el valor de µep es una función de la relación carga / masa, las moléculas pequeñas tienden a tener mayor valor de µep. La resolución (Rs): La resolución entre dos especies componentes de la muestra se calcula mediante la ecuación:
Rs =
Donde Æ ep es la diferencia de movilidad electroforética entre los dos componentes, µep es el promedio de la movilidad electroforética de ambas especies y N es el número de platos teóricos. Si sustituimos el conteo de platos teóricos en la ecuación de resolución, se obtiene:
Rs= (0.177) Esta relación demuestra que incrementando el voltaje es una medida limitada para incrementar la resolución, pues para lograr el doble de la resolución es necesario incrementar el voltaje al cuádruplo. La clave de cualquier acción para incrementar
la resolución radica en Ƶep. La mejor forma de controlar la movilidad de los distintos componentes de la muestra es eligiendo la modalidad de EC apropiada unido a la selección del sistema amortiguador adecuado. La producción de calor durante los ensayos de EC es un fenómeno inevitable, dado el uso de campos eléctricos intensos. Los dos problemas fundamentales que provoca la generación de calor son:
¤ Gradientes de temperatura a través de la sección transversal del capilar. ¤ Cambios de la temperatura del sistema en función del tiempo (consecuencia de la disipación ineficiente del calor generado).
Dado la siguiente relación:
= El calor generado es proporcional al cuadrado de la intensidad del campo eléctrico. Por consiguiente, disminuyendo la intensidad del campo o incrementando la longitud del capilar, se disminuye dramáticamente el calor generado. Una consecuencia de la disipación del calor producido es el gradiente de temperatura antes mencionado. Dado que el calor se disipa por difusión, es de esperar que la temperatura en la zona central del capilar sea mayor que en las paredes del capilar. Como la viscosidad disminuye con el aumento de la temperatura, tanto el FEO como la µep se incrementarán para las moléculas que están en las capas de fluido más centrales en el capilar. La consecuencia es un perfil de flujo similar al hidrodinámico, con incremento del ancho de zonas o bandas de migración de las especies. El uso de capilares de muy pequeña sección transversal mejora la situación, al disminuir en el cuadrado del radio del capilar la corriente que pasa a través de él, y al mejorar la disipación del calor generado. La relación entre gradiente térmico (ÆT), radio del capilar (r), la potencia disipada (W) y la conductividad térmica (K) se expresa en la siguiente ecuación:
ÆT= 0.24 El segundo problema, el incremento de la temperatura en función del tiempo, se debe a la diferencia entre la velocidad de disipación y de generación del calor. La
variación de la temperatura resultante modifica la viscosidad del fluido y por consiguiente los factores que determinan el tiempo de migración de las moléculas. La solución del problema depende tanto del uso de capilares estrechos como del acoplamiento de sistemas de enfriamiento, que pueden ser por aire o por líquido. La limitante en el uso de capilares de pequeño diámetro interno es que al disminuir este también disminuye el path length y consecuantemente el límite de detección. La EC, como antes se mencionó, comprende una familia de técnicas que poseen diferencias dramáticas en cuanto a operatividad y características de separación. Estas técnicas son:
a. Electroforesis capilar de zona. b. Enfoque isoeléctrico. c. Electroforesis capilar en gel. d. Isotacoforesis. e. Cromatografía capilar miscelar electrocinética.
Dado los objetivos de este trabajo, nos ocuparemos de la descripción breve de las cuatro primeras técnicas. Electroforesis capilar de zona: Es la forma más simple de EC, y se le conoce también como EC de solución libre. El mecanismo de separación es basado en las diferencias de la relación carga / masa de los componentes de la muestra. Dos factores, la homogeneidad de la solución amortiguadora y la constancia de la intensidad del campo eléctrico son claves para lograr buenos resultados con esta técnica. Luego de la inyección de la muestra y aplicado el campo eléctrico, los componentes de la mezcla se separan en zonas discretas. El parámetro fundamental, µep, puede ser aproximado a partir de la teoría de Debeye-Hunckel- Henry:
µep= donde q es la carga neta, R es el radio de Stokes, y η es la viscosidad del medio. La EC de zona es muy útil para el análisis de mezclas de proteínas, como las proteasas, y péptidos, pues es posible lograr la completa separación de, por ejemplo, proteínas que solo difieren en un residuo de aminoácido. Esto puede ser muy importante en el análisis de los mapas trípticos, haciendo posible la
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Sub-Cell® GT Agarose Gel
Catalog Numbers 170-4401 to 170-4406 170-4481 to 170-4486
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Warranty Bio-Rad Laboratories warrants the Sub-Cell GT, Wide Mini-Sub® cell GT, and Mini-Sub cell GT
electrophoresis systems against defects in materials and workmanship for 1 year. If any defects occur in the instrument during this warranty period, Bio-Rad Laboratories will repair or replace the defective parts free. The following defects, however, are specifically excluded:
1. Defects caused by improper operation.
2. Repair or modification done by anyone other than Bio-Rad Laboratories or an authorized agent.
3. Use of fittings or other spare parts supplied by anyone other than Bio-Rad Laboratories.
4. Damage caused by accident or misuse.
5. Damage caused by disaster.
6. Corrosion due to use of improper solvent or sample.
This warranty does not apply to parts listed below:
1. Platinum Electrode Wires
To insure the best performance from the Sub-Cell GT electrophoresis systems, become fully acquainted with these operating instructions before use. Bio-Rad recommends that you first read these instructions carefully. Assemble and disassemble the unit completely without casting a gel. After these preliminary steps, you should be ready to cast and run a gel.
Bio-Rad also recommends that all Sub-Cell GT system components and accessories be inspected for damage, cleaned as recommended in this manual, and rinsed thoroughly with distilled water before use.
Record the following for your records:
For any inquiry or request for repair service, contact Bio-Rad Laboratories after confirming the model and serial number of your instrument.
Model
Section 4 Care and Maintenance...............................................................................11 4.1 Cleaning Sub-Cell GT Components ........................................................................12 4.2 Compatible Cleaning Agents ...................................................................................12 4.3 Maintenance Schedule .............................................................................................12 4.4 Electrode Replacement.............................................................................................13 4.5 RNase Decontamination ..........................................................................................14
Section 1 General Information
1.1 Introduction The Sub-Cell GT instruments (basic Sub-Cell GT cell, Wide Mini-Sub® cell GT, and Mini-
Sub cell GT) comprise a comprehensive and flexible gel electrophoresis system that effective- ly separates nucleic acids using submerged agarose gels. Submarine agarose gels are easy to cast and readily dissipate heat. These gels allow sample underlaying and prevent electrical field dis- continuities caused by wicks or sample well dehydration. Agarose gels are ideal for the separation of DNA restriction digestions, Polymerase Chain Reaction (PCR*)-amplified fragments, and genomic DNA and RNA prior to Southern or northern blotting. If operated correctly, agarose gel submarine electrophoresis can effectively separate nucleic acids from 20 base pairs to 20 kilobase pairs in length.
The Sub-Cell GT systems are designed for years of reproducible and rigorous use. These rugged systems incorporate many features that make casting and running agarose gels simple and efficient. The gel caster provides tape-free gel casting in trays. Gels can also be cast in the GT bases using specially designed wedge gates. Replaceable electrode cassettes provide a simple way to replace electrode wires. A comprehensive assortment of base and tray sizes, including a variety of preparative, analytical, and multichannel pipet compatible combs, makes these systems ideal for any agarose gel application.
Note:This manual contains instructions for the Sub-Cell GT electrophoresis systems only. Prior to the release of the Sub-Cell GT systems, Bio-Rad supplied similar agarose gel elec- trophoresis cells: the original Sub-Cell DNA electrophoresis cell, Wide Mini-Sub cell, and Mini- Sub cell systems. This manual does not provide information on these earlier versions. Contact your local Bio-Rad representative for information concerning the original Sub-Cell systems.
Definition of Symbols
Caution, risk of electrical shock Caution (refer to accompanying documents)
1.2 Safety The Sub-Cell GT electrophoresis systems are designed for maximum user safety. The buffer
chambers are made of 3/16 inch (.476 cm) thick injection-molded acrylic to create a leak-free electrophoresis environment. The safety lids surround the buffer chamber to protect the user from exposure to electrical currents. All Sub-Cell GT systems were designed for indoor use only.
Before use, inspect the GT base for cracks or chips, which may allow the buffer to leak from the base and cause a potential electrical hazard. Additionally, inspect all electrical cables, banana jacks, and plugs for loose connections, cracks, breaks, or corrosion. Do not use any part that is cracked, charred, or corroded. These parts may also cause a potential electrical hazard. Contact your local Bio-Rad representative before using a part that may be considered hazardous.
During electrophoresis, inspect the base and workbench for any signs of buffer leakage. If leaking buffer is detected, disconnect the power to the cell immediately and contact your local Bio-Rad representative.
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respect to ground. All of Bio-Rad’s power supplies meet this important safety requirement. The recommended power supply for this apparatus is the PowerPac 300 power supply. The PowerPac 300 power supply contains safety features such as no load, overload, rapid resis- tance change, and ground leak detection capabilities. The maximum specified operating param- eters for the Sub-Cell GT systems are given in Table 1.1.
Table 1.1 Sub-Cell GT systems operating parameters Sub-Cell Wide Mini-Sub Mini-Sub GT Cell Cell GT Cell GT
Maximum voltage limit 200 VDC 150 VDC 150 VDC Maximum power limit 40 Watts 45 Watts 10 Watts Maximum Buffer temperature 40 C 40 C 40 C
Current to the cell, provided from the external power supply, enters the unit through the lid assembly, providing a safety interlock. Current to the cell is broken when the lid is removed. Do not attempt to circumvent this safety interlock, and always turn the power supply off before removing the lid or when working with the cell.
Important: These Bio-Rad instruments are certified to meet IEC 1010-1** safety stan- dards. IEC-certified products are safe to use when operated in accordance with the instruction manual. This instrument should not be modified in any way. Alteration of this instrument will:
• Void the manufacturer’s warranty • Void the IEC 1010-1 safety certification • Create a potential safety hazard
IEC 1010-1 certification applies to equipment designed to be safe between the operating temperatures of 4 °C and 40 °C and altitudes up to 2,000 meters. Instruments are also safe at a max- imum relative humidity of 80% for temperatures up to 31 °C decreasing linearly to 50 % at 40 °C. Bio-Rad is not responsible for any injury or damage caused by the use of this instru- ment for purposes other than those for which it is intended, or by modifications of the instrument not performed by Bio-Rad or an authorized agent. No user-serviceable parts are contained in this apparatus. To insure electrical safety, do not attempt to service this apparatus.
1.3 System Components Each of the Sub-Cell GT systems comes with the components listed in Table 1.2 (see
Figure 1.1 for part description). Check your instrument to be sure all items are present. Note any damage to the unit which may have occurred during shipping. Notify Bio-Rad Laboratories if any items are missing or damaged.
Table 1.2 Sub-Cell GT System Components Sub-Cell GT Wide Mini-Sub Cell Mini-Sub Cell
System GT System GT System Item Quantity Quantity Quantity GT Base (buffer chamber) 1 1 1 Gel Casting Gates 2 2 2 Safety Lid and Cables 1 1 1 UVTP Gel Tray 1 1 1 Fixed Position Comb 2 2 2
(15 well, 1.5 mm thick) (15 well, 1.5 mm thick) (8 well, 1.5 mm thick) (20 well, 1.5 mm thick) (20 well, 1.5 mm thick) (15 well, 1.5 mm thick)
Leveling Bubble 1 1 1 Gel Caster (optional) 1 1 1 Instruction Manual 1 1 1
2
UVTP gel tray
Gel caster
Cam lever
Fluorescent ruler
Leveling bubble
1.4 Specifications
Sub-Cell GT Wide Mini-Sub Cell Mini-Sub Cell System GT System GT System
GT base footprint (L x W x H) 42 x 19.5 x 10 cm 26 x 20 x 7.5 cm 26 x 12 x 6.5 cm GT base buffer volume 1,500–2,000 ml 650–900 ml 265–320 ml GT base gel size 15 x 15 cm 15 x 7 cm 7 x 7 cm Gel tray sizes 15 x 10 cm 15 x 7 cm 7 x 7 cm
15 x 15 cm 15 x 10 cm 7 x 10 cm 15 x 20 cm 15 x 25 cm
Construction GT base Molded clear plastic Gel casting gates Aluminum Safety lid Molded clear plastic Banana plug/electrode cassette Molded polycarbonate Banana plugs Gold-plated brass, 4.4 cm length Electrodes Platinum, 0.25 mm diameter Electrical cables Dual, 20 AWG, tinned copper wire cable
Flame-retardant polyurethane insulation jacket Electrical leads Nickel silver Gel tray UV-transparent acrylic plastic (UVTP) Combs Molded plastic and machined acrylic Gel casting device Polycarbonate
0.64 cm silicon foam
Section 2 Operating Instructions
Note: See Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation, for information on the preparation of RNA gels. See References 1 and 2 for more information on DNA and RNA electrophoresis.
2.1 DNA Gel Preparation DNA agarose gels can be used to separate and visualize DNA of various sizes. Before cast-
ing an agarose gel, consult Table 2.1 to determine the appropriate percent agarose gel to use, based on the size of DNA to be separated.
Procedure
1. Determine the amount of agarose (grams) required to make the desired agarose gel con- centration and volume. Use Tables 2.1 and 2.2 as a guide for agarose concentration and gel volume requirements.
Example: For a 1% agarose gel, add 1 gram of agarose to 100 ml of 1x electrophoresis buffer.
4
GT base buffer volumes will vary depending on the size and thickness of the gel used.
Table 2.1 Gel Concentration Required for DNA Separation 1-2
Gel Concentration (%) DNA Size (Kb) 0.50 1–30 0.75 0.8–12 1.00 0.5–10 1.25 0.4–7 1.50 0.2–3 2–5* 0.01–0.5
* Sieving agarose such as AmpliSize® agarose
Table 2.2 Gel Volume Requirements Gel Size 0.25 cm thick 0.5 cm thick 0.75 cm thick 1.0 cm thick Base 7 x 7 cm 10 ml 20 ml 30 ml 40 ml
15 x 7 cm 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 15 x 15 cm 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml Tray 7 x 7 cm 10 ml 20 ml 30 ml 40 ml 7 x 10 cm 15 ml 30 ml 45 ml 60 ml
15 x 7 cm 20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 15 x 10 cm 30 ml 60 ml 90 ml 120 ml 15 x 15 cm 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml 15 x 20 cm 70 ml 140 ml 210 ml 280 ml 15 x 25 cm 90 ml 180 ml 270 ml 360 ml
2. Add the agarose to a suitable container (e.g., 250 ml Erlenmeyer flask, Wheaton bottle, etc.). Add the appropriate amount of 1x electrophoresis buffer (see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation, for electrophoresis buffer preparation) and swirl to sus- pend the agarose powder in the buffer. If using an Erlenmeyer flask, invert a 25 ml Erlenmeyer flask into the open end of the 250 ml Erlenmeyer flask containing the agarose. The small flask acts as a reflux chamber, allowing long or vigorous boiling without much evaporation.
Note: A mark can be put on the lower flask at the same level as the liquid. If evaporation occurs, water can be added to bring the liquid back to the original starting level.
3. The agarose can be melted by boiling on a magnetic hot plate (Step 4a) or in a microwave oven (Step 4b).
Caution: Always wear protective gloves, goggles, and a lab coat while preparing and cast- ing agarose gels. The vessels containing hot agarose can cause severe burns if allowed to contact skin. Additionally, molten agarose can boil over when swirled.
Magnetic Hot Plate Method
4a. Add a stir bar to the undissolved agarose solution. Heat the solution to boiling while stirring on a magnetic hot plate. Bubbles or foam should disrupt before rising to the neck of the flask.
Microwave Oven Method
4b. Place the gel solution into the microwave. Using a low to medium setting, set the timer for a minimum of 5 minutes, stopping the microwave oven every 30 seconds and swirling the flask gently to suspend the undissolved agarose. This technique is the fastest and safest way to dissolve agarose.
5. Boil and swirl the solution until all of the small translucent agarose particles are dissolved. With the small flask still in place, set aside to cool to 60 °C before pouring.
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2.2 Casting Agarose Gel Slabs There are several ways to cast agarose submarine gels using the Sub-Cell GT systems.
Gels may be cast with or without a UV-transparent plastic (UVTP) tray directly on the stage of the Sub-Cell GT bases using the gel casting gates. Gels may also be cast on the removable UVTP trays with the aid of the gel caster or with standard laboratory tape.
Casting gels on the base stages
1. Level the Sub-Cell base using the leveling bubble provided.
2. Slide the gel casting gates into the slots at opposite ends of the gel stage.
3. Place the comb(s) into the appropriate slot(s) of the base so that the sample wells are near the cathode (black). DNA samples will migrate toward the anode (red) during electrophoresis.
4. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution has cooled to 50–60 C pour the molten agarose between the gates.
Warning: Hot agarose (>60 C) may cause the plastic in the cell to warp or craze and will decrease the lifetime of the Sub-Cell base. Warping may also result in sample wells of uneven depth.
5. Allow 20–40 minutes for the gel to solidify at room temperature.
6. Carefully remove the comb from the solidified gel. Remove the gel casting gates.
7. Submerge the gel beneath 2 to 6 mm of 1x electrophoresis buffer (see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to avoid pH and heat effects.
Casting Gels on the Base Stage With UVTP Tray
1. Level the cell using the leveling bubble provided.
2. Place the UVTP tray on the cell base stage.
Note: The Mini-Sub cell GT requires the 7 x 7 cm UVTP tray for casting in the base. The Wide-Mini-Sub cell GT requires the 15 x 7 cm UVTP tray and the Sub-Cell GT sys- tem requires the 15 x 15 cm UVTP tray for casting in the base.
3. Slide the gel casting gates into the slots at opposite ends of the base stage. Insure the gates are evenly seated in the slots and the gates uniformly contact all edges of the UVTP tray. The weight of the gates provides a tight seal to prevent any leakage problems during gel casting.
4. Place the comb(s) into the appropriate slot(s) of the trays so that the sample wells are near the cathode (black). DNA samples will migrate toward the anode (red) during electrophoresis.
5. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution has cooled to 50-60 °C, pour the molten agarose between the gates.
Warning: Hot agarose (>60 °C) may cause the tray to warp or craze and will decrease the lifetime of the tray. Warping may also result in sample wells of uneven depth.
6. Allow 20-40 minutes for the gel to solidify at room temperature.
7. Carefully remove the comb from the solidified gel. Remove the gel casting gates.
8. Submerge the gel beneath 2 to 6 mm of 1x electrophoresis buffer (see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to prevent pH and heat effects.
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Removable tray (UVTP) gel casting using a Gel Caster or Mini-Gel Caster
1. Level the Gel Caster or Mini-Gel Caster using the leveling feet in the gel caster and the leveling bub- ble provided.
2. Disengage and slide the movable wall to the open end of the Gel Caster or Mini-Gel Caster by turning and lifting the cam peg upward.
Note: If casting more than one gel with the Gel Caster, add the removable gel casting wall to the gel caster. The removable wall will allow casting of two 15 x 10 cm trays, four 7 x10 cm trays or one 15 x 10 cm and one 15 x15 cm trays.
3. Place the open edge of the UVTP tray against the fixed wall of the Gel Caster or Mini-Gel Caster.
4. Slide the movable wall against the edge of the UVTP tray (Figure 2.1).
5. To seal the open tray ends, engage the cam peg by turning and pressing downward simul- taneously.
6. When the cam peg has dropped into the appropriate slot, turn the peg in either direction until resistance is felt. This action seals the edges of the tray for casting.
7. Place the comb(s) into the appropriate slot(s) of the tray.
Fig. 2.1. Sealing the UVTP tray for gel casting.
8. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution has cooled to 50–60 C pour the molten agarose between the gates.
Warning: Hot agarose (>60 C) may cause the tray to warp or craze and will decrease the lifetime of the tray. Warping may also result in sample wells of uneven depth.
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Engage and seal (press down and rotate)
Slide forward
Lift cam lever up
9. Allow 20–40 minutes for the gel to solidify at room temperature.
10. Carefully remove the comb from the solidified gel.
11. Disengage the cam peg by turning and lifting upward. Slide the movable wall away from the tray. Remove the tray from the Gel Caster or Mini-Gel Caster.
Note: While the gel is solidifying, a light seal is formed between the gasket and the gel (especially for low percentage agarose gels [<0.8%]). Before moving the wall away from the tray, carefully lift the tray on one side to release the seal or use a spatula to break the seal between the agarose and gasket.
12. Place the tray onto the leveled Sub-Cell base so that the sample wells are near the cathode (black). DNA samples will migrate toward the anode (red) during electrophoresis.
13. Submerge the gel beneath 2 to 6 mm of 1x electrophoresis buffer (see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to avoid pH and heat effects.
Removable tray (UVTP) gel casting using tape
1. Seal the ends of the UVTP gel tray securely with strips of standard laboratory tape. Press the tape firmly to the edges of the gel tray to form a fluid-tight seal.
2. Level the gel tray on a leveling table or workbench using the leveling bubble provided with the instrument.
3. Prepare the desired concentration and amount of agarose in 1x electrophoresis buffer (see Section 2.1). When the agarose solution has cooled to 50–60 C pour the molten agarose into the gel tray.
Warning: Hot agarose (>60 C) may cause the tray to warp or craze and will decrease the lifetime of the tray. Warping may also result in sample wells of uneven depth.
4. Allow 20–40 minutes for the gel to solidify at room temperature.
5. Carefully remove the comb from the solidified gel.
6. Remove the tape from the edges of the gel tray.
7. Place the tray onto the leveled Sub-Cell base so that the sample wells are near the cath- ode (black). DNA samples will migrate toward the anode (red) during electrophoresis.
8. Submerge the gel under 2 to 6 mm buffer (see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation). Use greater depth overlay (more buffer) with increasing voltages to avoid pH and heat effects.
2.3 Electrophoresis After the agarose gel has solidified, sample loading and electrophoresis can begin. Agarose
gels can be run in many different types of electrophoresis buffers. Nucleic acid agarose gel electrophoresis is usually conducted with either Tris-Acetate-EDTA (TAE) buffer or Tris- Borate-EDTA (TBE) buffer. While TAE buffer provides faster electrophoretic migration of linear DNA and better resolution of supercoiled DNA, TBE buffers have a stronger buffering capacity for longer or higher voltage electrophoresis runs. Bio-Rad offers premixed 50x TAE and 10x TBE buffers, as well as individual buffer reagents for use with the Sub-Cell GT systems.
1. Prepare samples for gel loading. The maximum sample loading volumes for Bio-Rad’s combs are listed in Section 6.2. Loading volume is dependent upon the type of comb used (i.e., well thickness and length) and thickness of the gel.
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2. When loading volume is determined, add standard nucleic acid sample loading dye to a final 1x concentration to make samples dense for underlaying into sample wells (see Section 3, Gel and Electrophoresis Reagent Preparation, for sample loading dye preparation).
3. Load the samples into the wells using standard pipets. Multichannel pipets can be used for loading samples only with the Bio-Rad MP combs (see Section 6.2).
Note: Sample wells are often difficult to see. Well visualization can be enhanced by placing black paper or tape under the base or trays where comb placement or well formation is common.
4. Place the lid on the DNA cell carefully. Do not disturb the samples. The Sub-Cell GT system lids attach to the base in only one orientation. To attach the lid correctly, match the red and black banana jacks on the lid with the red and black banana plugs of the base.
5. Power requirements vary depending on gel thickness, length and concentration, and type of electrophoresis buffer used. Refer to Tables 2.3 and 2.4 for relative sample migration rates and for DNA size migration with sample loading dyes for the different Sub-Cell GT systems.
Note: Buffer recirculation is not required for most standard DNA and RNA agarose gel electrophoresis. If buffer recirculation is required, simply turn off the power supply, remove the safety lid, and mix the running buffer as desired. After the buffer has been mixed, reconnect the safety lid and continue electrophoresis.
Table 2.3 Relative Sample Migration Rates *
Bromophenol Blue Cell Type Voltage Migration Rate Sub-Cell GT cell, 15 x 15 cm gel 75 V 3.0 cm/hr Wide Mini-Sub cell GT, 15 x 10 cm gel 75 V 4.5 cm/hr Mini-Sub cell GT, 7 x 10 cm gel 75 V 4.5 cm/hr * These sample migration rates were determined based on a 0.5 cm thick 1.0% agarose gel using Bio-Rad’s Molecular Biology
Certified Agarose in 1x TAE electrophoresis buffer (diluted from Bio-Rad’s Premixed 50x TAE Buffer). Migration rates will vary depending on the voltage, current, and type of agarose or buffer used.
Table 2.4 DNA size migration with sample loading dyes Agarose Concentration (%) Xylene Cyanol Bromophenol Blue
0.5–1.5 4–5 Kb 400–500 bp 2.0–3.0** 750 bp 100 bp 4.0–5.0** 125 bp 25 bp
** Sieving agarose such as AmpliSize agarose.
2.4 Nucleic Acid Staining and Visualization Gels can be removed from the base or gel tray for nucleic acid staining. The gel can also
remain on the UVTP gel tray for staining.
Ethidium Bromide Staining Procedure
1. Place the gel into the appropriate volume of 0.5 µg/ml ethidium bromide (EtBr) stain for 15–30 minutes. Use enough staining solution to cover the entire gel.
Caution: Ethidium bromide is a suspected carcinogen and should be handled with extreme care. Always wear gloves, eye glasses, and a laboratory coat. Dispose of used EtBr solutions and gels appropriately (Review EtBr Material Safety Data Sheet [MSDS] for proper disposal methods).
2. Destain the gel for 10–30 minutes in dH2O using the same volume used for staining.
Note: Ethidium Bromide can be removed from the DNA with extended destaining. This will cause lower sensitivity of detection. However, insufficient destaining will create higher background fluorescence.
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3. Rinse the gel briefly with dH2O to remove any residual staining solution.
4. Place the gel on a UV transilluminator for nucleic acid visualization and analysis. DNA- Ethidium Bromide complexes may be illuminated with UV light of 254, 302, or 366 nm. Sensitivity decreases with illumination at higher wavelengths. However, nicking of DNA will increase below 302 nm. Table 2.5 gives the percentage of transmittance of UV light through 1/4” (.64 cm) UV-transparent plastic.
Note: Nucleic acids in the gel can be visualized through the UVTP trays. If a UVTP tray is not used, place household plastic wrap between the UV transilluminator and the gel to avoid contaminating the transilluminator with nucleic acids or EtBr.
Table 2.5 Percent UV Transmittance through 1/4” (.64 cm) UV Transparent Plastic (UVTP)
Approximate Wavelength (nm) % Transmittance
254 0 302 80 360 90
5. Photograph the gel using standard cameras and film (e.g., Bio-Rad’s Standard Polaroid Gel Documentation System) or with CCD-based digitized image analysis systems (e.g., Gel Doc™ 1000 UV fluorescent gel documentation system). Gels are generally pho- tographed with a yellow, orange, or red interference filter. Red filters generally give the cleanest background. Bio-Rad offers a full-line of standard photography and CCD-based imaging systems for nucleic acid gel analysis.
2.5 Note on Blotting Nucleic acids within the gel can be transferred to membranes using the techniques of
Southern and Northern blotting. It is beyond the scope of this instruction manual to include blotting procedures. Consult