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Estudio del efecto de un agente crioprotector en la liofilización de una emulsión directa O/W. Andrés Felipe Bejarano, Laura Estefanía Erazo, Yissel Luengas, Óscar Alberto Álvarez*

*Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes 111711, Bogotá, Colombia.

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

Fecha de entrega: 1 de diciembre de 2017. Palabras clave Emulsión directa O/W, Poli-dimetilsiloxano, crioprotector, temperatura de transición vítrea, liofilización, microfluidizacón, estabilidad, recocido.

RESUMEN

Las emulsiones han sido ampliamente estudiadas gracias a su capacidad de retener, proteger y encapsular componentes activos tales como: vitaminas, medicinas, agentes microbianos y demás. Sin embargo, las emulsiones directas O/W presentan riesgos potenciales como contaminación, inestabilidad y degradación. La liofilización ha sido implementada por la industria para mitigar tales riesgos, y, la necesidad del uso de un crioprotector durante este proceso, ha sido reportada por varios autores. El efecto de los crioprotectores sobre una emulsión directa O/W reconstituida luego de ser sometida a un proceso de liofilización, carece de información, por tal motivo, el presente artículo tiene como objetivo analizar el efecto del crioprotector en la liofilización de una emulsión directa de Poli-dimetilsiloxano en agua. Para esto, en primer lugar, se varió la formulación de la emulsión (concentración y tipo de crioprotector) y las condiciones de liofilización, con base en el análisis de la temperatura de transición vítrea del sistema (𝑇") mediante DSC. Se estudió el efecto de la 𝑇" del crioprotector sobre la 𝑇" de la emulsión, permitiendo afirmar que la 𝑇" del crioprotector predomina sobre la 𝑇" de la emulsión; de igual forma, se evaluó el efecto de la microfluidización en la emulsión. Al evaluar las condiciones de liofilización, la implementación de un tratamiento térmico (recocido) es primordial para aumentar la 𝑇" de la emulsión y obtener un resultado exitoso, evitando que las muestras colapsen. Asimismo, aumentar la estabilidad de la emulsión mediante un proceso de microfluidización, permite obtener un mejor aspecto en el liofilizado. Al analizar la emulsión reconstituida, es posible afirmar que el tamaño de partícula disminuye en la emulsión en presencia de crioprotector, lo cual evidencia el efecto de este último durante dicho proceso. Finalmente, es importante mencionar que las condiciones de liofilización deben variar según el tipo y la concentración de crioprotector, con el fin de obtener un resultado satisfactorio.

I. Introducción

La necesidad de preservar productos farmacéuticos, material biológico y alimentos ha sido una preocupación constante para la humanidad. En la industria, gran parte de los productos desarrollados se encuentran asociados a sistemas termodinámicamente inestables de dos o más líquidos inmiscibles estabilizados por un agente tensoactivo o surfactante, conocidos como emulsiones.

Una emulsión está conformada por una fase acuosa, oleosa y una mezcla de surfactantes, que permite que una de las fases se disperse en la otra de manera estable. El primer estudio sobre el uso de surfactantes y estabilizantes y su efecto sobre una emulsión fue realizado por Griffin (Griffin, 1949). Cuando el aceite es dispersado en una fase continua de agua, el sistema se conoce como una emulsión directa O/W, mientras que, cuando el agua es dispersada en una fase continua

de aceite, el sistema se conoce como una emulsión inversa W/O. Asimismo, es posible encontrar sistemas en los cuáles una emulsión directa O/W puede coexistir con una emulsión inversa W/O, formando sistemas en los que, gotas más pequeñas, son dispersadas en gotas de mayor tamaño (Al-Bawab, Bozeya, Hasinovic, & E.Friberg, 2015). Ahora bien, para desarrollar el objetivo del presente artículo, se utilizarán únicamente sistemas de emulsiones directas.

La naturaleza inestable de una emulsión se debe a que el contacto entre las moléculas de aceite y agua no es energéticamente favorable, por tanto, los surfactantes (emulsificantes) son agregados a una emulsión con el fin de mejorar la estabilidad del sistema. Las moléculas de estos se adsorben a la superficie de las gotas de aceite durante la homogeneización de la misma, proporcionando una membrana protectora que previene

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la floculación y coalescencia (Capek, 2004). Estos procesos surgen típicamente por el tiempo de almacenamiento de una emulsión (Lladser, Medrano, & Arancibia, 1968).

Las emulsiones han sido ampliamente estudiadas gracias a su habilidad de proteger, encapsular y distribuir un componente activo como vitaminas, agentes microbianos, medicinas, saborizantes y demás. No obstante, las emulsiones directas, al estar compuestas por una fase continua acuosa, tienen riesgos potenciales de contaminación microbiológica, degradación por hidrólisis e inestabilidad físico-química (Morais, y otros, 2016). Además de esto, la estabilidad de la emulsión puede verse afectada durante los procesos de producción, tales como manufactura, purificación, transporte y almacenamiento (Frokjaer & Otzen, 2005). Por estas razones, se han evaluado diferentes técnicas que permitan mitigar la inestabilidad del sistema y los riesgos potenciales presentes, una de ellas, la liofilización.

En 1906, Bordas y d’Arsonval demostraron por primera vez que era posible eliminar el contenido de agua de una solución aplicando presiones de vacío (Bordas & d'Arsonval, 1906). Sin embargo, se tuvo que esperar hasta los comienzos de la segunda guerra mundial para ver un avance significativo en esta tecnología, cuando se comenzó la producción de plasma liofilizado gracias al aumento crítico de su demanda (Franks, 1998). Desde entonces, el proceso de liofilización ha sido ampliamente estudiado por diversos autores (Rey & May, 2017), a tal punto que, actualmente muchas compañías farmacéuticas y alimenticias usan el proceso de liofilización para la elaboración de sus productos (Najjar & Stubenrauch, 2009).

La liofilización es el proceso en el que el agua de una solución es removida mediante dos procesos: secado primario y secado secundario. Durante el proceso de sublimación (secado primario), el agua pasa directamente de un estado sólido a un estado gaseoso reduciendo notoriamente la presión. Mientras que, en el proceso de desorción (secado secundario), el agua restante es removida al aumentar la temperatura manteniendo presiones bajas. Sumado a estas etapas, es necesaria una etapa preliminar de congelamiento, en la que la solución debe llevarse a temperaturas lo suficientemente bajas para convertirse en un sólido (Morais, y otros, 2016).

Durante la etapa preliminar o de congelamiento se forman cristales de agua y, a medida que el proceso continúa, la proporción de cristales aumenta, lo que resulta en un incremento de la concentración del líquido restante de la emulsión, es decir, la concentración de la fase oleosa. Este líquido altamente concentrado y viscoso se solidifica dando como resultado una fase amorfa, cristalina o amorfa-cristalina (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006).

Ahora bien, durante la segunda etapa o secado primario ocurren 4 procesos principales: i) se transfiere calor desde las bandejas del equipo hasta el frente de sublimación a través de la solución congelada, ii) el hielo se sublima y el vapor de agua pasa a través de la porción seca del producto hasta llegar a superficie, iii) el vapor de agua es transferido de la superficie del producto al condensador del equipo, y iv) el vapor de agua es condensado. Al final del secado primario se generan poros que resultan del espacio que ocupaban los cristales de agua (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006).

Fig. 1. Ciclo de liofilización. Figura adaptada de (Morais, y

otros, 2016).

El secado secundario y última etapa del proceso de liofilización, remueve el agua que es adsorbida en la superficie del producto cristalino o el agua que se encuentra disuelta en el sólido amorfo, con el fin de formar una solución sólida (Pikal, Shah, Roy, & Putman, 1990), estas etapas se ilustran en la Fig. 1.

Dada su versatilidad, el proceso de liofilización es ampliamente usado en la fabricación de productos farmacéuticos y biológicos, con el fin de prolongar su vida útil y mantener su estabilidad (Gaidhani, Halwakar, & Deepak Bhambere, 2016)

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Entre la amplia variedad de emulsiones, las emulsiones directas O/W son las más usadas en la industria farmacéutica y cosmética. Por esta razón, el proceso de liofilización de este tipo de emulsiones ha sido explorado a detalle, con el fin de proteger el componente activo de tales sistemas (Morais, y otros, 2016). Heinzelman y Franke estudiaron la habilidad de retener el contenido de aceite de pescado y la estabilidad en el tiempo de emulsiones directas liofilizadas en función de diferentes condiciones de liofilización, tales como la presencia de antioxidantes, tipos de crioprotector (Malto-dextrina y Lactosa), la tasa de congelamiento (lenta, media y rápida) y procedimiento de homogenización. Como resultados de este análisis, se obtuvieron diferencias significativas entre las tasas de congelamiento, destacando que hay un deterioro más rápido de la tasa lenta con respecto a la rápida, esto como consecuencia del efecto de un esfuerzo cortante aplicado, ausente en las otras tasas de congelamiento. Por otro lado, no fue posible clarificar las diferencias entre los productos liofilizados con respecto a los crioprotectores utilizados (Heinzelmann & Franke, 1999). Sin embargo, durante el proceso de congelamiento y secado se genera una variedad de efectos como cambios en la concentración del soluto, la formación de cristales, oxidación, cambios de pH y demás efectos que afectan la estabilidad de la emulsión, lo que hace necesario el uso de estabilizantes que permitan la protección del mismo durante el proceso (Wang, 2000).

El proceso de liofilización puede desestabilizar una emulsión, especialmente en la etapa de congelación, ya que, durante esta etapa, ocurre la cristalización del agua produciendo cargas mecánicas sobre la solución crio-concentrada. Esta solución concentrada puede inducir la agregación y en algunos casos, una fusión irreversible de partículas. Existen dos tipos de excipientes que permiten la protección frente a tensiones generadas durante el proceso de liofilización: los crioprotectores (congelamiento) y los lioprotectores (secado) (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006).

Diferentes mecanismos de protección de un crioprotector sobre el componente activo han sido reportados por varios autores (Morais, y otros, 2016). (I) El crioprotector puede disminuir la interacción entre las cadenas de carbono, evitando la desestabilización del sistema una vez se produce un intercalamiento en las cadenas lipídicas y, por tanto, las fuerzas de atracción de van der Waals disminuyen, reduciendo la temperatura de transición de fase (Ingvarsson, Yang,

Nielsen, Rantanen, & Foged, 2011). (II) La interacción entre los grupos hidroxilos del crioprotector con las moléculas de agua pueden incrementar la viscosidad del sistema, reduciendo las tensiones generadas por la cristalización del hielo (Sussich, Skopec, Brady, & Cesaro, 2001). (III) La presencia de un crioprotector permite mantener la organización espacial del sistema y, por tanto, la distancia entre las gotas de aceite de la emulsión durante el secado (Zhang, Liu, Qian, & Chen, 2008). (IV) Debido a la acción de un surfactante se generan capas protectoras alrededor de las moléculas de la fase dispersa y de la fase continua de una emulsión. Estas capas en principio producen fuerzas de repulsión entre ellas lo que evita la agregación de las mismas. Sin embargo, durante el proceso de liofilización, una de las capas tiende a degradarse causando una aglutinación entre capas y, con ello, un incremento de tamaño de partícula. En cambio, durante el proceso de liofilización con crioprotectores, las posiciones de las moléculas de agua son reemplazadas por moléculas de crioprotectores, formando una nueva capa protectora que evitará la aglutinación de las capas de surfactante (Zhang, Liu, Qian, & Chen, 2008). En general, el uso de un crioprotector es esencial para la producción de un liofilizado aceptable. (Morais, y otros, 2016).

Muchos azúcares han sido usados como crioprotectores incluyendo: monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Los crioprotectores más utilizados por otros autores han sido la trehalosa, maltosa, sacarosa, glucosa y manitol. A pesar de esto, debido a las diferencias encontradas en los resultados obtenidos por Zhang et al, es posible asumir que el efecto de los crioprotectores se relaciona con la estructura química y física del sistema (Zhang, Liu, Qian, & Chen, 2008). Algunos de los crioprotectores usados en la literatura y sus efectos durante la liofilización son reportados por Abdelwahed et al (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006). Entre las diferentes estructuras que poseen los azúcares, los disacáridos como la sacarosa o trehalosa, tienen un mayor efecto sobre las propiedades de vitrificación o una mayor actividad, en comparación a los monosacáridos como la glucosa o la fructosa durante el proceso de liofilización (Date, Samad, & Devarajan, 2010). En la Tabla 1 se pueden ver las estructuras moleculares de dos disacáridos y un monosacárido (sacarosa, lactosa y glucosa).

El primer y más importante paso para desarrollar un proceso de liofilización de una emulsión, es caracterizar la formulación de la misma (Rey & May, 2017). MacKenzie analizó cómo la liofilización se veía afectada por diferentes formulaciones midiendo

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Tabla 1. Azúcares disacáridos y monosacáridos utilizados como crioprotectores durante el proceso de liofilización (Date, Samad, & Devarajan, 2010)

Crioprotector Fórmula molecular Estructura Masa molecular

(g/mol)

Glucosa 𝐶%𝐻'(𝑂%

180.2

Sacarosa 𝐶'(𝐻((𝑂''

342.3

Lactosa 𝐶'(𝐻((𝑂''

342.3

propiedades como la temperatura de fusión (T+), la temperatura de transición vítrea (𝑇"), la temperatura eutéctica (𝑇,) de un sistema agua-sacarosa y un sistema NaCl/sacarosa (MacKenzie, 1972). Durante la primera etapa de la liofilización, el agua se convierte en hielo y los solutos se convierten en sólidos cristalinos o amorfos por debajo de su 𝑇", por lo tanto, la temperatura del sistema debe ser menor a la 𝑇" durante el congelamiento para asegurar que el sistema sea sólido y evitar el colapso durante la sublimación (Choi, y otros, 2007)

Finalmente, durante el proceso de liofilización de una emulsión, se pueden controlar diferentes variables que permiten determinar las condiciones óptimas de proceso. Estudios han demostrado que la eficiencia de este proceso puede ser analizada con el fin de encontrar resultados de manera predictiva, disminuyendo la cantidad de experimentación por prueba y error (Franks, 1998). Los parámetros que determinan el éxito de la liofilización se encuentran en las condiciones de proceso y la formulación y geometría de la muestra (Franks, 1998). Este artículo se enfocará en el análisis de los efectos de agentes crioprotectores durante el proceso de liofilización de una emulsión directa con un aceite de baja viscosidad, Poli-dimetilsiloxano (Bluestar silicones, s.f.).

II. Materiales y métodos

2.1. Materiales

Para la preparación de emulsiones directas O/W, se utilizó Poli-dimetilsiloxano (Rhodorsil® aceite 47V50) como la fase dispersa, como surfactante se implementó lecitina de huevo soluble en aceite HLB 4 y, como agente dispersante, se utilizó agua desionizada tipo 1 (Milli-Q®).

Con el fin de recuperar la mayor concentración de aceite después de realizar el proceso de liofilizado, se utilizaron diferentes tipos de crioprotectores. Para este procedimiento, se utilizaron tres crioprotectores teniendo en cuenta su estructura y peso molecular, ∝-D-glucosa C%H'(O%, sacarosa C'(H((O'' y lactosa industrial C'(H((O''.

2.2. Métodos

Durante la experimentación, se realizaron emulsiones al 30%p/p de aceite y 4%p/p de surfactante, variando la concentración de crioprotector (10, 15 y 20%p/p). Un análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC TA instruments Q2000) fue realizado para observar las temperaturas de transición vítrea y las temperaturas de cambios de estado, mediante un flujo de calor aplicado (Universidad Politécnica de Catalunya, 2013). Esto con el fin de proveer más información y realizar el proceso de liofilización satisfactoriamente.

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Tabla 2. Proceso de liofilización.

Etapa de liofilización Temperatura inicial (ºC)

Temperatura final (ºC)

Rampa de temperatura (ºC) Tiempo total (h)

Congelamiento 20 -40 0.1 12

Recocido -40 -20 0.1 6

-20 -40 0.1 6

Secado primario* -40 -35 0.1 27 Secado secundario -35 20 0.1 12

*Antes de iniciar la etapa de secado primario se enciende la bomba de vacío a una presión de 0.140mbar.

Luego de realizar las pruebas variando la concentración de lecitina y la concentración de aceite, se decidió evaluar el efecto de los crioprotectores en emulsiones con una concentración de lecitina y aceite de 4%p/p y 20%p/p, respectivamente. Ahora bien, fue necesario microfluidizar tales emulsiones (Microfluidizer M-110Y, Microfluidics Corp VR, Newton, MA) para obtener una mayor estabilidad. Una vez se microfluidizaron las emulsiones, se midió el tamaño de partícula (Zeta Sizer Nano range, Malvern) antes y después de liofilizar.

El procedimiento para la preparación de emulsiones; el análisis de calorimetría diferencial de barrido; el proceso de liofilización; el proceso de microfluidización y la medición del tamaño de partícula, se explican en detalle a continuación.

2.2.1 Preparación de emulsiones

En primer lugar, se mezclan los componentes solubles en agua (lecitina y∝-D-glucosa/sacarosa/lactosa) junto con el agua previamente calentada a 70ºC, esto con el fin de facilitar la solubilidad. Esta solución se homogeniza a 14000 rpm por 3 minutos (Heidolph SilentCrusher MVR, Schwabach, Germany). Luego, se agrega el aceite previamente calentado a 70ºC en la solución acuosa haciendo uso de una bomba peristátilca Thermo scientific a un flujo constante de 0.5ml/s. Finalmente, las emulsiones son homogeneizadas a 18,000 rpm durante 10 minutos.

2.2.2 Microfluidización

El proceso de microfluidización se realizó con el objetivo de mejorar la estabilidad de la emulsión antes de someterla al proceso de liofilizado. Para ello, cada emulsión fue situada en el microfluidizador bajo una presión de 18,000 psi con una frecuencia de 5 ciclos (Microfluidizer M-110Y, Microfluidics Corp VR, Newton, MA). Mediante este proceso, se ejercen fuerzas

de impacto a altas presiones y una alta frecuencia de vibraciones que causan un rompimiento de las partículas, disminuyendo su tamaño y aumentando la estabilidad de la emulsión (Jafari S. , 2017).

2.2.3 Medición de DSC

La medición de la calorimetría diferencial de barrido se realizó mediante dos condiciones de operación diferentes. Para el aceite puro, se implementó un análisis por calentamiento de -80 a 100ºC con una rampa de 5ºC/min. Por otro lado, para las emulsiones del aceite con y sin crioprotector, se utilizó una rampa de 5ºC/min de -80 a 0ºC, con el fin de observar únicamente los comportamientos térmicos antes de la temperatura de cristalización de la fase acuosa de la emulsión. El DSC operó con un flujo de nitrógeno de 50mL/s.

2.2.4 Liofilización

Para llevar a cabo el proceso de liofilizado se utilizó el liofilizador LABCONCO Model 7948020. Dentro de las condiciones de liofilizado se evaluaron diferentes procesos modificando el número de etapas, la rampa de temperatura en el secado primario, la duración del secado primario y la duración del secado secundario. Sin embargo, fue necesario aplicar un tratamiento térmico conocido como “recocido” durante el proceso, con el fin de aumentar la temperatura de transición vítrea del sistema (Tang & Michael, 2004) (Rey & May, 2017). Este proceso consta de 4 etapas y se muestra en la Tabla 2.

La inclusión de una etapa de recocido tiene dos objetivos principales. El primero es completar la cristalización de la muestra cuando el componente cristalino no se cristaliza totalmente, luego de la rampa de congelamiento. El segundo consiste en incrementar la 𝑇" presente en la muestra, con el fin de aumentar la eficiencia del secado primario para que se pueda

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realizar a una mayor temperatura (Wang, 2000). Por ejemplo, el recocido a una temperatura de -20°C, logró incrementar la 𝑇" de una emulsión de glicina:sacarosa de -44 a -33°C, lo cual tiene como resultado una mejor apariencia en el liofilizado y una mayor resistencia a esfuerzos mecánicos durante las siguientes etapas de liofilización (Wang, 2000). En otras palabras, el secado primario se puede llevar a cabo a una mayor temperatura.

Durante el secado primario, la temperatura aumenta de -40 a -35ºC, esto se aplica para compensar el cambio de fase causado por la sublimación del agua (Morais, y otros, 2016).

El liofilizado se realizó en viales de 20ml con una relación diámetro/volumen de 1cm/1ml, teniendo en cuenta la relación óptima para la liofilización de una emulsión (Luengas, Navarrete, & Álvarez, 2016)

2.2.5 Reconstitución de la muestra liofilizada

Para reconstituir la emulsión ya liofilizada, se agregó 9𝑚𝐿 de agua desionizada a cada vial y se agitó durante 5 min a una velocidad de 800 rpm (vórtex). Esto con el fin de realizar las mediciones posteriores de tamaño de partícula.

2.2.6 Medición tamaño de partícula

Con el fin de analizar i) la estabilidad de la emulsión y ii) el efecto del crioprotector sobre una emulsión, se midió el tamaño de partícula antes y después de liofilizar. Para ello, se utilizó el Zeta Sizer nano range de Malvern cuyo rango de medición va de 0.3𝑛𝑚 −10𝜇𝑚.

Por otro lado, se obtuvo la interacción microscópica entre la fase continua y la fase dispersa de la emulsión O/W. Para esto, se utilizó el microscopio Olympus CX21 con un objetivo de inmersión de 100x. Se analizaron las emulsiones con presencia de sacarosa como crioprotector, antes y después del proceso de liofilización.

III. RESULTADOS

3.1 Análisis de DSC

La temperatura de transición vítrea (𝑇") se determinó como una temperatura característica de cada componente (Painter & Michael, 2009). Choi et al. analizaron el comportamiento de la temperatura de transición vítrea de emulsiones dobles con presencia de

diferentes tipos de crioprotectores (Glucosa, trehalosa, HES y carragenina). En sus resultados se reportó que para el caso de la presencia de trehalosa, la ′𝑇" de la emulsión es casi igual a la′𝑇" de una solución pura de trehalosa (Choi, y otros, 2007).

Ahora bien, es importante analizar la temperatura de transición vítrea debido a su influencia en las emulsiones al momento de liofilizar. Es necesario que el equipo (liofilizador) alcance una 𝑇" menor a la de la emulsión, para obtener un liofilizado exitoso (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006). Una vez se realizaron los análisis, se encontró que, en presencia de glucosa, no se evidencia una transición vítrea clara durante el análisis de DSC. Sin embargo, se reportó un pico de temperatura cercano a la ′𝑇"de una solución pura de glucosa. Reid et al. explica esto relacionando una propiedad térmica sobre la vitrificación y desvitrificación analizada en una solución de sacarosa usando DSC. La vitrificación ocurre cuando, durante un congelamiento, una muestra presenta una fase vítrea sin llegar a cristalizarse, mientras que la desvitrificación sucede cuando la muestra pasa de una fase vítrea a una fase cristalina (Reid, 1984). Esta teoría explica que, durante el análisis DSC realizado a la emulsión de glucosa, se evidenció un proceso de transición vítrea y desvitrificación simultáneo. Por estas razones, es posible afirmar que la ′𝑇" del crioprotector predomina sobre la ′𝑇" en una emulsión (Choi, y otros, 2007)

Para corroborar lo anterior, se realió una prueba de DSC en las emulsiones microfluidizadas con sacarosa a 10%, 15% y 20%. La temperatura de transición vítrea de la sacarosa se encuentra en el rango de -35ºC y -30ºC, mientras que la del aceite dispersado en la emulsión se encuentra entre -127ºC y -123ºC (Wang, 2000). Una vez se incrementa la cantidad de sacarosa presente en la emulsión, la temperatura de transición vítrea igualmente incrementa, tal comportamiento es corroborado por (Choi, y otros, 2007). Cuando la concentración de sacarosa es del 20%, se pueden presentar dos ′𝑇" correspondientes a -33 y -27ºC; lo que indica que una sustancia puede tener más de una temperatura de transición vítrea. La temperatura más baja implica que una mayor parte de la cadena polimérica del aceite en sí tiene menor movilidad, mientras que la temperatura más alta corresponde a una mayor movilidad en una mayor parte de la cadena polimérica (Painter & Michael, 2009). Sin embargo, este aspecto únicamente se aprecia a nivel molecular, ya que, se tiene que tener en cuenta a la

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estructura polimérica como una cadena larga en la que, durante una disminución de temperatura, la movilidad de las ramificaciones del polímero a nivel molecular, disminuye.

Por otro lado, la temperatura de transición vítrea de la emulsión de aceite para una concentración de sacarosa del 15%, es de -58 y -34ºC. Para una concentración del 10%, 𝑇" es -61 y -20ºC. Para la glucosa y la lactosa no se realizó análisis de DSC, aun así, otros autores afirman que la temperatura de transición vítrea de estos compuestos es -43 y -32°C respectivamente (Wang,2012).

3.2 Emulsión liofilizada

Teniendo en cuenta las condiciones de operación mencionadas en la sección II, fue posible estandarizar un proceso para liofilizar las emulsiones de aceite poli-dimetilsiloxano con glucosa, sacarosa y lactosa. Sin embargo, se determinó que, para lograr liofilizar las muestras, es indispensable someter las emulsiones a un proceso de microfluidización, con el fin de disminuir el tamaño de partícula y de esta forma, obtener una emulsión más estable. La estabilidad de una emulsión antes de ser liofilizada es de vital importancia con el fin de obtener un liofilizado exitoso, ya que, en caso de presentar una separación de fases durante la

liofilización, la capa menos densa (aceite) evitará una correcta sublimación del agua durante la etapa de secado. Los resultados de la liofilización de emulsiones con glucosa, implementado o no la microfluidización (ver Fig. 2) corroboran esta afirmación.

Debido a que las emulsiones microfluidizadas con ausencia de crioprotector (control) fueron liofilizadas exitosamente, es posible mencionar que la estabilidad de la emulsión antes de ser liofilizada, es un factor primordial para obtener un liofilizado exitoso.

En el caso de las emulsiones con glucosa, los resultados indican que las emulsiones microfluidizadas fueron liofilizadas exitosamente a pesar de que la 𝑇" reportada del crioprotector es menor a la permitida por el equipo. Esto puede deberse al aumento de estabilidad de la emulsión por medio de la microfluidización o a la etapa de recocido que, permite incrementar la 𝑇" hasta una temperatura alcanzable por el equipo, teniendo en cuenta que para las muestras sin microfluidizar no se aplicó este tratamiento térmico. Con el fin de descartar alguna de las dos razones supuestas, es necesario como trabajo futuro realizar un análisis DSC para observar el comportamiento de la 𝑇" de la emulsión luego de ser liofilizada.

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La liofilización de muestras con una concentración de 20% de crioprotector no fueron exitosas para los tres tipos de crioprotectores utilizados (glucosa, sacarosa y lactosa). Los efectos de la concentración de crioprotector sobre el proceso de liofilización de una emulsión directa han sido reportados por varios autores (Sameti, y otros, 2003) (Zhang, Liu, Qian, & Chen, 2008) (Morais, y otros, 2016). En la mayoría de estudios sobre crioprotectores, una mayor concentración de crioprotector representa una mayor estabilidad de las partículas gracias a disminución en la agregación de las mismas (Lee, Kim, Kim, & Lee, 2009). A pesar de esto, en algunos casos, incrementar la concentración de crioprotector hasta un cierto nivel, permite alcanzar un límite de estabilización o incluso desestabilizar las partículas (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006), por ejemplo, Sameti et al reportaron un aumento en la agregación de partículas durante la liofilización de nanopartículas de óxido de silicio con una concentración de 20% glucosa (Sameti, y otros, 2003). En la mayoría de estudios, las posibles causas que explican estos efectos inusuales de la concentración se atribuyen a las interacciones específicas entre crioprotectores, solventes y partículas del componente disperso. Sin embargo, Lee et al proponen una posible causa más general al encontrar que estos efectos de concentración del crioprotector tienen una relación directa con la tasa de congelamiento antes del secado primario durante la liofilización, al afirmar que una mayor concentración de crioprotector y una rápida tasa de congelamiento favorecen la dispersión de partículas, evitando la agregación de las mismas (Lee, Kim, Kim, & Lee, 2009). Debido a que ninguna muestra en presencia de una concentración de 20% fue liofilizada

correctamente, es posible que la tasa de congelamiento aplicada durante el proceso de liofilización fuera muy lenta, la cual pudo tener un efecto adverso sobre la dispersión de partículas en las emulsiones con altas concentraciones de crioprotector, causando así, una desestabilización de la emulsión justo antes del secado primario. Una vez finalizó el proceso de liofilizado, las emulsiones con una concentración de 15% de crioprotector, evidenciaron un comportamiento de colapso donde la muestra no estaba uniforme (ver Fig. 3).

Las muestras que evidenciaron dicho comportamiento, se observaron periódicamente durante el secado secundario y, mostraron una perturbación donde creció una capa de la misma muestra en la cima de la emulsión, afectando su aspecto. Esto se debe principalmente al proceso de recocido antes del secado primario y a la humedad presente en la muestra al finalizar el secado secundario (Wang, 2000).

Es importante destacar la influencia que tiene el recocido sobre el proceso de secado secundario según el tipo de crioprotector utilizado, puesto que, con este procedimiento se busca eliminar la pequeña capa que se forma en la cima de la muestra. Lo anterior se debe a que esta capa puede prevenir la transferencia de vapor de agua, disminuyendo la tasa de sublimación y provocando que la emulsión se sobrecaliente y/o colapse. Dependiendo del crioprotector y su concentración en la emulsión, es necesario modificar el proceso de recocido. A mayor cantidad de carbohidrato, se necesita un mayor tiempo de estabilización durante el procedimiento de recocido (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006).

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Fig 4. Tamaño de partícula para las emulsiones antes y después del proceso de liofilización.

Además, dependiendo del crioprotector, es necesario modificar la temperatura de recocido, donde el rango debe estar entre la 𝑇" y la temperatura de fusión (𝑇=) de la muestra (Abdelwahed, Degobert, & Fessi, 2006). Sin embargo, debido a que no se realizó un análisis DSC para el resto de emulsiones con diferentes crioprotectores, se utilizó la misma temperatura de -40 y -20°C, equivalente a la calorimetría diferencial de barrido de la sacarosa. Asimismo, una vez inicia el secado primario, es importante que la temperatura del equipo no exceda la temperatura de transición vítrea, para evitar que la matriz sólida de la muestra sufra perturbaciones, disminuyendo la viscosidad y generando un colapso en la emulsión (WANG, CHEN, & CHEN, 2012)

A lo largo del proceso de liofilizado, hubo perturbaciones durante las etapas de liofilización, razón por la cual, existieron algunos efectos de errores sistemáticos sobre las muestras realizadas. Para evitar el colapso de las muestras, es necesario garantizar que el ciclo del secado primario se complete satisfactoriamente (bajo el tiempo establecido en la sección de metodología) para que la cantidad de agua sea menor al 35% y que, de esta forma, el secado secundario se realice satisfactoriamente (Wang, 2000) (Morais, y otros, 2016).

Además de la etapa de recocido, otro factor que influye en la calidad de las muestras después de ser sometidas al proceso de liofilizado, es la humedad presente en la emulsión al finalizar el secado secundario

(Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006). El principal objetivo del secado secundario es disminuir la humedad restante en las muestras (Morais, y otros, 2016). El área superficial es un factor que afecta la sublimación del agua restante en las muestras, ya que, cuando ocurre un rápido secado secundario, se producen pequeños cristales con áreas superficiales de mayor tamaño. Lo anterior favorece la desorción del agua y previene la formación de la capa de la muestra en la cima de la emulsión. Por otro lado, si la taza de secado secundario es lenta, el área superficial de los cristales es menor, lo cual impide que la desorción del agua sea satisfactoria (Morais, y otros, 2016). Sumado a esto, es necesario controlar la cámara de presión junto con la temperatura, con el fin de mejorar la tasa de sublimación y de esta forma, prevenir el sobrecalentamiento y/o el colapso de la muestra (Abdelwahed, Degobert, Stainmesse, & Fessi, 2006).

3.4 Tamaño de partícula

El tamaño de partícula (modificado por el proceso de microfluidización) puede proveer información sobre el comportamiento de la emulsión donde, la inestabilidad se manifiesta principalmente en emulsiones con mayor tamaño de partícula. En otras palabras, las emulsiones con gotas de un diámetro pequeño, tienen una tendencia a ser más estables y a presentar una menor coalescencia con respecto a las partículas que tienen un diámetro más grande (O. Robin, Vuillemard, & Paquin, 1992).

El tamaño de partícula de las emulsiones antes de liofilizar y después de liofilizar, en presencia y ausencia

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de crioprotector se presenta en la Fig. 4. El tamaño de partícula para las emulsiones sin crioprotector aumentó significativamente, este incremento puede atribuirse a la fusión y/o agregación de gotas (Moretton, Chiappetta, & Sosnik, 2012). Por otro lado, las emulsiones con crioprotector presentaron una disminución en su tamaño de partícula. Los crioprotectores con un peso molecular pequeño (glucosa, sacarosa y lactosa) permiten

mantener el tamaño de partícula e incluso disminuirlo, mientras que crioprotectores con un mayor peso molecular (k-carragenina) inducen a la agregación y, por ende, a un aumento de tamaño de partícula debido a la posibilidad de que formen una red con las gotas del componente activo, mediante un mecanismo de coalescencia parcial, permitiendo la agregación de partículas (Choi, y otros, 2007).

El tamaño de partícula después de liofilizar para las emulsiones con crioprotector no presenta una diferencia significativa, esto debido a que los crioprotectores utilizados tienen un peso molecular similar y menor a

otros que permiten aglomeración. A pesar de que se ve una disminución en el tamaño de partícula en presencia de crioprotectores de bajo peso molecular, Choi et al afirman que un aumento en la tasa de congelamiento

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durante la liofilización genera cambios más significativos en la distribución de tamaño de partícula (Choi, y otros, 2007).

El efecto de la concentración de crioprotector sobre el tamaño de partícula de una emulsión se puede analizar mediante las emulsiones con los tres crioprotectores analizados. Las emulsiones antes de liofilizar muestran un aumento de ±100𝑛𝑚 al aumentar la concentración de crioprotector un 5%. De igual forma, si se analiza la relación entre la concentración de crioprotector y el cambio de tamaño de partícula, se puede afirmar que, a mayor concentración, mayor será el cambio en el tamaño de partícula de la emulsión. Date et al encontraron una relación similar en la que, a una mayor concentración de trehalosa y fructosa (crioprotectores con peso molecular similar a la sacarosa y glucosa, respectivamente), se presentaba un mayor cambio en el tamaño de partícula (Date, Samad, & Devarajan, 2010).

Para determinar de qué manera el crioprotector afecta la emulsión, se visualizó microscópicamente el comportamiento de las gotas de aceite en presencia de este compuesto. Como se puede observar en la Fig. 5, las emulsiones que poseen una baja concentración de crioprotector (fig. 5B), no mantienen una organización espacial definida, ya que tienen gotas de aceite con mayor fuerza de atracción entre sí, disminuyendo el espacio que hay entre cada una. Por otro lado, cuando la concentración de crioprotector es igual o superior a 15% (fig. 5C-5D) se puede ver el aumento de las fuerzas de repulsión generado por el agente crioprotector y el surfactante (Zhang, Liu, Qian, & Chen, 2008).

Asimismo, las fuerzas de repulsión generadas aumentan la distancia presente entre cada gota de la fase dispersa, evitando el contacto simultáneo entre gota y gota. En otras palabras, se puede observar cómo el crioprotector contribuye a la estabilidad de emulsión.

IV. CONCLUSIONES

Los resultados de este estudio evidencian que, la liofilización de las emulsiones de aceite en agua, tienen un mejor aspecto una vez se estabiliza la muestra a través del proceso de microfluidización. La temperatura de transición vítrea de la emulsión se rige por la 𝑇" del crioprotector y, llevar a cabo el proceso de recocido antes del secado primario, aumenta esa temperatura evitando el colapso de las muestras.

Por otro lado, es necesario modificar las temperaturas de liofilizado según el tipo de crioprotector y la concentración utilizada. Esto se debe a que estas variables afectan la emulsión liofilizada. Finalmente, la presencia de crioprotector afecta el diámetro de partícula de la emulsión reconstituida, disminuyendo su tamaño en comparación a las muestras de control.

V. TRABAJO A FUTURO

Aunque fue posible analizar el efecto de tres tipos de crioprotectores sobre la liofilización de emulsiones con Poli-dimetilsiloxano, durante el presente artículo no se evaluó la protección que tales crioprotectores generan sobre el componente activo. Por lo tanto, se sugiere establecer un método para cuantificar los cambios en la concentración de aceite después del proceso de liofilizado. Para ello, no se recomienda utilizar un análisis por espectrofotometría, debido a que es necesario realizar disoluciones menores al 1% de aceite, para que el haz luminoso pueda traspasar a través de la muestra y se pueda conocer con certeza la cantidad de luz absorbida por el aceite. Por el contrario, existen métodos para determinar la concentración del poli-dimetilsiloxano mediante un análisis de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) usando tolueno (Shodex, 2013), cloroformo (Shodex, 2008) o metanol como eluyente presente en la columna (Lei, Chen, You, He, & Hu, 2017).

De igual forma, a pesar de que se encontró que aumentar la estabilidad de una emulsión al microfluidizar, permite liofilizar satisfactoriamente las emulsiones, este proceso es considerado un método de emulsificación de alto gasto energético debido a que posee muy altas densidades energéticas (Jafari, He, & Bhandari, 2007). Por esta razón, se recomienda estandarizar un proceso de preparación de emulsión, que permita obtener una emulsión estable y no sea necesario microfluidizar, variando la concentración de aceite, del surfactante, el tiempo y/o velocidades de homogenización.

Se propone optimizar el tiempo de liofilizado teniendo en cuenta la temperatura de colapso de los crioprotectores utilizados en las emulsiones de aceite. Para ello, se puede utilizar un microscopio equipado con una pequeña cámara de secado en frío, la cual contiene un control de temperatura en cada etapa, una bomba de vacío para asegurar la evacuación y un vidrio óptico para observar detalladamente el proceso de la muestra (Abdelwahed, Degobert, & Fessi, 2006). Lo anterior con el objetivo de conocer la temperatura de colapso y

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con ello, saber las temperaturas necesarias para cada etapa del proceso de liofilizado. De la misma manera, es posible, encontrar tales propiedades térmicas de las muestras a liofilizar por medio de un análisis DSC por enfriamiento.

Finalmente, gracias a los resultados obtenidos en el presente artículo, se propone variar algunas condiciones durante el proceso de liofilización, con el fin de mejorar la apariencia del liofilizado en futuras experimentaciones. En primer lugar, es necesario aumentar la tasa de congelación para que la dispersión de partículas en la emulsión no tenga un efecto adverso. En segundo lugar, el tiempo de recocido debe ser diferente dependiendo de la concentración del crioprotector. En tercer lugar, se debe asegurar que, antes de iniciar el secado secundario, el secado primario haya finalizado completamente y la humedad de la muestra no supere el 30%. Finalmente, aumentar la tasa de secado secundario podría aumentar el área superficial de la muestra, una vez se generen pequeños cristales en la emulsión liofilizada.

VI. REFERENCIAS

Universidad Politécnica de Catalunya. (n.d.). Servicios científico-técnicos de la UPC. Retrieved Septiembre 20, 2017, from http://www.upc.edu/sct/es/equip/358/analizador-dsc-calorimetria-diferencial-barrido.html

Painter, P., & M. C. (2009). Essentials of Polymer Science and Engineering. Pennsylvania: Destech publications, Inc.

Lladser, M., Medrano, C., & Arancibia, A. (1968, Junio). The use of supports in the lyophilization of oil-in-water emulsions. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 20(6), 450-455.

Frokjaer, S., & Otzen, D. (2005, Abril). Protein drug stability: a formulation challenge. National Reviews Drug Discovery, 4(4), 298-306.

Bordas, F., & d'Arsonval, M. (1906). R. Acad. Sci. Paris, 142(1058 y 1079), 143-567.

Franks, F. (1998, Mayo). Freeze-drying of bioproducts: putting principles into practice. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 45(3), 221-229.

Najjar, R., & Stubenrauch, C. (2009). Phase diagrams of microemulsions containing reducing agents and metal salts as bases for the synthesis of metallic nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Scienc, 331(1), 214-220.

Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., & Fessi, H. (2006, Diciembre 30). Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews, 58(15), 1688-1713.

Morais, A., N, A. É., Júnior, F. X., Oliveira, C. d., Marcelino, H., G, B., . . . A, E. (2016, Abril). Freeze-drying of emulsified systems: A review. International Journal of Pharmaceutics, 503(1-2), 102-114.

Pikal, M., Shah, S., Roy, M., & Putman, R. (1990, Mayo 21). The secondary drying stage of freeze drying: drying kinetics as a function of temperature and chamber pressure. International Journal of Pharmaceutics, 6(3), 203-207.

Gaidhani, K. A., Halwakar, M., & Deepak Bhambere, P. S. (2016, Enero 27). Lyophilization/Freeze drying - A review. World Journal of Pharmaceutical Research, 4(8), 516-543.

Heinzelmann, K., & Franke, K. (1999, Enero 15). Using freezing and drying techniques of emulsions for the microencapsulation of fish oil to improve oxidation stability. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 12(3-6), 223-229.

Wang, W. (2000, Agosto 1). Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics, 203(1-2), 1-60.

Ingvarsson, P., Yang, M., Nielsen, H., Rantanen, J., & Foged, C. (2011, Marzo). Stabilization of liposomes during drying. Expert Opinion on Drug Delivery, 8(3), 375-378.

Sussich, F., Skopec, C., Brady, J., & Cesaro, A. (2001, Agosto 30). Reversible dehydration of trehalose and anhydrobiosis: from solution state to an exotic crystal? Carbohydrate Research, 334(3), 165-176.

Zhang, L., Liu, L., Qian, Y., & Chen, Y. (2008, Junio). The effects of cryoprotectants on the freeze-drying of ibuprofen-loaded solid lipid microparticles (SLM). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 69(2), 750-759.

MacKenzie, A. (1972, Abril). Freezing, freeze-drying and freeze-substitution. Proceedings of the Workshop on Biological Specimen Preparation Techniques for Scanning Electron Microscopy. IIT Research.

Choi, M., Briançon, S., Bazile, D., Royere, A., MIn, S., & Fessi, H. (2007, Junio 6). Effect of Cryoprotectant and Freeze-Drying Process on the Stability of W/O/W Emulsions. Drying Technology An International Journal , 25, 809-819.

13

Griffin, C. (1949). Classification of surface-active agents by HLB. Journal of cosmetic science, 1, 311-326.

Al-Bawab, A., Bozeya, A., Hasinovic, H., & E.Friberg, S. (2015). Three-phase surfactant-less emulsions. Arabian Journal of Chemistry, 8(2), 246-254.

Capek, I. (2004). Degradation of kinetically-stable o/w emulsions. Adv. Colloid Interface Sci(107), 125-155.

Rey, L., & May, J. C. (2017). Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products. Londres: Informa Health Care.

Bluestar silicones. (n.d.). Rhodorsil® Oils 47 Technical information. Retrieved from Silitech: http://www.silitech.ch/upload/complement_info_fournisseur_d/32.pdf

Tang, X. (., & M. J. (2004). Design of Freeze-Drying Processes for Pharmaceuticals: practical advice. Pharmaceutical research, 21(2), 191-200.

Reid, D. (1984, Febrero). Cryomicroscopic studies of the freezing of model solutions of cryobiological interest. Cryobiology, 21(1), 60-67.

O. Robin, V. B., Vuillemard, J., & Paquin, P. (1992). Microfluidization of dairy model emulsions. I. Preparation of emulsions and influence of processing and formulation on the size distribution of milk fat globules (Vol. 72). Université Laval, Sainte-Foy, centre de recherche en sciences et technologies du lait (STELA), département de sciences et technologie des aliments , Québec, Canada: Lait.

Sameti, M., Bohr, G., Kumar, M. R., Kneuer, C., Bakowsky, U., Nacken, M., & Lehr, H. S.-M. (2003). Stabilization by freeze-drying of cationically modified silica nanoparticles for gene delivery (Vol. 266). Int. J. Pharm.

Lee, M., Kim, M., Kim, S., & Lee, J. (2009, Diciembre). Cryoprotectants for freeze drying of drug nano-suspensions: effect of freezing rate. J Pharm Sci, 98(12), 4808-17.

Abdelwahed, W., Degobert, G., & Fessi, H. (2006, Febrero 17). A pilot study of freeze drying of poly(epsilon-caprolactone) nanocapsules stabilized by poly(vinyl alcohol): Formulation and process optimization, 309(1-2), 178-188.

WANG, W., CHEN, M., & CHEN, G. (2012, Junio ). Issues in Freeze Drying of Aqueous Solutions. Chinese Journal of Chemical Engineering, 20(3), 551-559.

Moretton, M., Chiappetta, D., & Sosnik, A. (2012). Cryoprotection-lyophilization and physical stabilization of rifampicin-loaded flower-like polymeric micelles. J. R. Soc, 9, 487-502.

Date, P. V., Samad, A., & Devarajan, P. V. (2010, Marzo). Freeze Thaw: A Simple Approach for Prediction of Optimal Cryoprotectant for Freeze Drying . AAPS PharmSciTech, 11(1), 304-313.

Jafari, S. (2017). Nanoencapsulation Technologies for the Food and Nutraceutical Industries. Academic press.

Luengas, Y., Navarrete, C., & Álvarez, Ó. (2016). Estudio de las propiedades fisicoquímicas de una solución reconstituida, del liofilizado de una emulsión PFOB. Universidad de los Andes, Ingeniería Biomédica, Bogotá.

Lei, Y., Chen, B., You, L., He, M., & Hu, B. (2017, Diciembre 1). Polydimethylsiloxane/MIL-100(Fe) coated stir bar sorptive extraction-high performance liquid chromatography for the determination of triazines in environmental water samples. 175, 158-167.

Shodex. (2013). Polydimethylsiloxane (Toluene Eluent) por GCP. Retrieved from Shodex.

Shodex. (2008). Low MW Polydimethylsiloxane (Chloroform) for GCP. Retrieved from Shodex: https://www.shodex.com/en/dc/06/06/08.html

Jafari, S. M., He, Y., & Bhandari, B. (2007). Production of sub-micron emulsions by ultrasound and microfluidization techniques. Journal of Food Engineering, 82(4), 478-488.

Parnis, J. M., & B.Oldham, K. (2013, Septiembre 1). Beyond the Beer–Lambert law: The dependence of absorbance on time in photochemistry. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 267, 6-10.

W.P.Brennan. (1976, Diciembre). Some applications of differential scanning calorimetry for the analysis of polymers. Thermochimica Acta, 17(3), 285-293.