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Reunion Red Valenciana de Genomica y Proteomica 2004
Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas
Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células
transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides
autoinmunes humanos
M.Carrascal, L.Muixi1, P.Ruperez, D.Jaraquemada1 y J.AbiánBiological and Structural Mass Spectrometry Unit, IIBB/CSIC-IDIBAPS) and
Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
Class II biosynthetic pathway
ER
TGN
Endosomes
MHC class II Invariant chain (Ii)
HLA-DM
αβ-peptideαβ-CLIP
Antigenic protein
αβ3Ii3
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
MOLECULAS DE MHC DE CLASE II
- Los mecanismos de procesamiento y presentación de autoantígeno por las células epiteliales en enfermedades autoinmunes podrían ser diferentes a los utilizados por las APC profesionales.
- Las moléculas de MHC de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC) y están especializadas en la presentación de antígeno exógeno.
-Las moléculas de clase II también pueden expresarse en células epiteliales y pueden presentar antígenos endógenos. Relevancia: selección tímica, autoinmunidad, aloreconocimiento
- Las interacciones entre células epiteliales y células T son importantes en los procesos autoinmunes y están muy influenciadas por el repertorio peptídico.
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
Class II biosynthetic pathway
ER
TGN
Endosomes
MHC class II Invariant chain (Ii)
HLA-DM
αβ-peptideαβ-CLIP
Antigenic protein
αβ3Ii3
RIN-DR Ii DM
RIN-DR
RIN-DR Ii
RIN-DR DM
ANALISIS DE PEPTIDOS PROCEDENTES ANALISIS DE PEPTIDOS PROCEDENTES DE MOLÉCULAS DE MHC CLASE IIDE MOLÉCULAS DE MHC CLASE II
. Cantidad de muestra (3 x 109 células)
. Baja concentración de péptidos (30-300 fmol/108cel.)
. Heterogeneidad de pool peptídico.
. Tamaño de los péptidos: 14-28 aa
. Matriz compleja
. Péptidos desconocidos (El inmunoensayo no sirve)
. Cantidad de muestra (3 x 109 células)
. Baja concentración de péptidos (30-300 fmol/108cel.)
. Heterogeneidad de pool peptídico.
. Tamaño de los péptidos: 14-28 aa
. Matriz compleja
. Péptidos desconocidos (El inmunoensayo no sirve)
ESPECTROMETRÍA DE MASASEDMAN
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
IDENTIFICACION DE PEPTIDOS UNIDOS A MOLECULAS DE MHC DE CLASE II
Purificación por inmunoafinidadde HLA-DR
(anticuerpo monoclonal L243)
RIN-DR or B-LCL cells
A: H2O/AcN/TFA 95/5/0.05B: AcN/H2O/TFA 80/20/0.05
Columna:Vydac Protein & Peptide C18 25*0.21cm
Programa: Time %B0 015 090 6095 90100 90
Flujo: 200 µl/min
Detector: UV a 214 nm
Fracciones: Se recogen desde minuto 20 al 100, una fraccion cada minuto.Para el analisis MS se evaporan a sequedad y se redisuelven en MeOH/H2O 1/1 1% AcOH
Separación de moléculas con Peso molecular < 10KDa(Centricón 10000 MW)
FraccionamientoHPLC-UV
MALDI-TOFMSPeso molecular
nanoESI-MS/MSSecuenciación
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
ANALISIS DE LOS REPERTORIOS PEPTÍDICOS MEDIANTE MALDI-TOF
DR4IiDM
0.05
0.15
DR4Ii
0.05
0.15
2000 4000 6000
DR4DM
DR4
2000 4000 6000
DR4IiDM
0.05
0.15
DR4Ii
0.05
0.15
2000 4000 6000
DR4DM
DR4
2000 4000 6000
DR4IiDM
0.05
0.15
DR4IiDM
0.05
0.15
DR4Ii
0.05
0.15
2000 4000 6000
DR4Ii
0.05
0.15
2000 4000 6000
0.05
0.15
2000 4000 6000
0.05
0.15
0.05
0.15
2000 4000 60002000 4000 6000
DR4DMDR4DM
DR4
2000 4000 6000
DR4
2000 4000 60002000 4000 60002000 4000 60002000 4000 6000
Histograma de frecuencia de masas de los péptidos asociados a HLA-DR4 en las líneas celulares DR4IiDM, DR4DM, DR4Ii y DR4.
Anchura de Rangos= 100 Da.
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS PRESENTADOS POR MOLÉCULAS DE MHC DE CLASE IICOMPARACIÓN DE TÉCNICAS
Fr HPLC Técnica secuenciación Mr (Da) Motivo unión DR4 nº aa Proteína origen (aaa-aaf) acceso DB L.* IA**
nESI TOF TOF µLC P
1P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
34 x 1577.8 F V K D Q T V I Q N T D G N 14 Serotransferrin (559-572) 41,42 x 1691.8 D V A F V K D Q T V I Q N T D 15 Serotransferrin (556-570)
42 x 1749.9 D V A F V K D Q T V I Q N T D G 16 Serotransferrin (556-571)
41 x 1805.9 G D V A F V K D Q T V I Q N T D G 17 Serotransferrin (555-571) 41 x 1862.9 D V A F V K D Q T V I Q N T D G N 17 Serotransferrin (556-572) 41 x 1919.9 G D V A F V K D Q T V I Q N T D G N 18 Serotransferrin (555-572)
Q29443 E 6
39 x x 2230.1 K P V V A E F H G T K D N P Q T H Y Y 19 Serotransferrin (96-114) Q29443 E 1.7 31 x 1779.9 I K E K Y G K D A T N V G D E G G 17 α-enolase (196-212) P06733 C 3.4 53 x 1923.0 G V P L Y R H I A D L A G N S E V I 18 α-enolase (126-143) P06733 C 1.8 37 x 1565.8 I E K F E K E A A E M G K G 14 Elongation Factor ? (1-16) P24534 C 0.8 38 x 1241.7 F V R F D S D A A S Q 11 HLA-A2, A69 (57-67, 29-42) 37 x 1397.7 F V R F D S D A A S Q R 12 HLA-A2, A69 (57-68, 29-43) 40 x x x 1626.8 T Q F V R F D S D A A S Q R 14 HLA-A2, A69 (55-68, 27-43)
40,41 x x x 1741.8 D T Q F V R F D S D A A S Q R 15 HLA-A2, A69 (54-68, 26-43) 44 x 1872.9 D T Q F V R F D S D A A S Q R M 16 HLA-A2, A69 (54-69, 26-44) 42 x x 1955.9 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R 17 HLA-A2, A69 (52-68, 24-43) 41 x x 1856.8 D D T Q F V R F D S D A A S Q R 17 HLA-A2, A69 (53-68, 25-43) 44 x 1984.8 D D T Q F V R F D S D A A S Q R M 17 HLA-A2, A69 (53-69, 25-44) 43 x 1998.8 D T Q F V R F D S D A A S Q R M E 17 HLA-A2, A69 (54-70, 26-45)
44,45 x x x 2098.9 D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P 18 HLA-A2, A69 (54-71, 26-46) 44 x 2216.0 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E 19 HLA-A2, A69 (52-70, 24-45) 45 x 2214.1 D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P 19 HLA-A2, A69 (53-71, 25-46) 43 x x 2271.0 D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R 19 HLA-A2, A69 (54-72, 24-47) x 2370.3 D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R 20 HLA-A2, A69 (53-72, 25-45)
46 x x x 2313.0 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P 20 HLA-A2, A69 (52-71, 24-46) 44,45 x x 2469.1 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R 21 HLA-A2, A69 (52-72, 24-45)
51 x x 2823.3 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R A P W 24 HLA-A2, A69 (52-75, 24-48) 52,53 x x 3065.3 V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R A P W I E 26 HLA-A2, A69 (52-77, 24-50)
54 x 3327.6 Y V V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R A P W I E 28 HLA-A2, A69 (50-77, 22-50)
P01892P10316 M 3
38 x 1366.7 F V R F D S D A A S P R 12 HLA-B35 /HLA-Cw04 (58-68) 41 x x 1595.8 T Q F V R F D S D A A S P R 14 HLA-B35 /HLA-Cw04 (55-68) 41 x x x 1710.8 D T Q F V R F D S D A A S P R 15 HLA-B35 /HLA-Cw04 (54-68)
39,42 x x 1825.8 D D T Q F V R F D S D A A S P R 16 HLA-B35 /HLA-Cw04 (53-68) 43 x x 1924.8 V D D T Q F V R F D S D A A S P R 17 HLA-B35 /HLA-Cw04 (52-68)
P30685P30481 M 3
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS PRESENTADOS POR MOLÉCULAS DE MHC DE CLASE II
COMPARACIÓN DE TÉCNICAS
Comparación de resultados en la caracterización del repertorio peptídico mediante nESI-ITMS/MS, MALDI-TOF/TOF y capLC-ESIMS/MS.
Técnica Consumo de muestra (%)
péptidos identificados Automatización proteínas
identificadasepítopos
caracterizados
nESI - ITMS/MS 40% 90 - 22 27MALDI - TOF - TOF 8% 52 + 20 21
capLC - MS/MS 16% 21 +++ 9 7TOTAL - 113 - 25 32
nESI-ITMS/MS
capLC-MS/MS
MALDI-TOF-TOF
48
6
16
728 1
7
nESI-ITMS/MS
capLC-MS/MS
MALDI-TOF-TOF
48
6
16
728 1
7
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSICm/z
Full MSm/z = 300-2000
736.4
927.1845.6
749.2
817.0 1003.2
1103.6705.3
644.2
1230.0 1390.81572.5502.6
1813.7
1002.8
1003.11002.5
1003.5
1003.8
1001.0 1003.0 1005.0m/z
500 700 900 1100 1300 1500 1700 1900
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Zoom ScanIón 1002.5 (+3)Mr = 3004.5 Da
FRACCION 49, B-LCL
[M2+2H]+2
[M2+3H]+3
[M1+2H]+2
[M1+3H]+3
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
791.1
931.4893.0
1047.71425.5
1223.5
1096.6676.5 1334.51567.6530.1
y11-NH3+ y14
+
b12+
b10+
b202+
b192+
y243+
y7+
y233+
y162+
y142+
y112+
y4+
FRACCION 49, B-LCL VDDTQFVRFDSDAAAPRGEPREPWVE
Mr: 3004.4 DaMS/MS m/z 1002.5
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
FRACCION 31, B-LCL
m/z400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
Full MSm/z = 300-2000
555.2
537.9
402.9 968.11369.4812.4 1105.8924.0726.4 1545.0
1830.41729.2
726 729 732m/z
729.7
729.2730.2
Zoom ScanIón 729.7 (+2)
Mr = 1456.7 Da
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC400 600 800 1000 1200 1400
m/z
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
729.1
711.3656.5614.9 746.1 940.4
1197.4764.0
1102.5500.8 973.1 1311.5860.41230.8354.4
MS/MS m/z 729.5
LNQELRADGTVNQMr: 1456.7 Da
m/z = 800-1600
FRACCION 31, B-LCL
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
850 950 1050 1150 1250 1350 1450
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
940.4
825.3
1366.11321.1 1382.31261.7
b7+
1197.4
1102.5973.1 1311.5860.4 873.7
1084.2923.6 997.1
1080.3 1230.81180.1
1153.9 1294.1
b12+
y11+b9
+
y9+
b11+
b8+
y8+
b12-NH3+
y10+b10
+
b11-NH3+y10-H2O+
b8-NH3+
m/z850 950 1050 1150 1250 1350 1450
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
940.4
825.3
1366.11321.1 1382.31261.7
b7+
1197.4
1102.5973.1 1311.5860.4 873.7
1084.2923.6 997.1
1080.3 1230.81180.1
1153.9 1294.1
b12+
y11+b9
+
y9+
b11+
b8+
y8+
b12-NH3+
y10+b10
+
b11-NH3+y10-H2O+
b8-NH3+
MS/MS m/z 729.5
LNQELRADGTVNQMr: 1456.7 Da
m/z = 800-1600L E Q
D G T V N
FRACCION 31, B-LCL
Reunion Red Valenciana de Genomica y Proteomica 2004
Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas
Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células
transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides
autoinmunes humanos
M.Carrascal, L.Muixi1, P.Ruperez, D.Jaraquemada1 y J.AbiánBiological and Structural Mass Spectrometry Unit, IIBB/CSIC-IDIBAPS) and
Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein
Exogenous G D V A F V K D Q T V Y Q N T D G Transferrin (555-571) D L R H T F S G V A S V E S S S G E Fetuin (311-329) Y D R N T K S P L F V G K V V N P T Q A Alpha-1-antiproteinase precursor (397-416) V A Q A S L G E Y L F E R L T L K H D Ferritin light chain (165-183)
Surface membrane N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal Growth Factor Receptor (271-286) Y N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal Growth Factor Receptor (270-286) E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (55-69) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (54-69) E G P E Y W E E Q T Q R A K G H MHC class I (55-71) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G H E MHC class I (54-71) Y V D D T E F V R Y D S D A E N P R MHC class I (28-45) A E Y E V Y V V A E N Q Q G K S K A N-CAM (679-696) N A E Y E V Y V V A E N Q Q G K S K A N-CAM (678-696) G I V Y T G D R T V M G R I ATPase α subunit (258-273) I V Y T G D R T V M G R I A ATPase α subunit (259-274) G I V Y T G D R T V M G R I A ATPase α subunit (258-274) G I V Y T G D R T V m G R I A ATPase α subunit (258-274) V H N Y F A I D P T T G A I H T Protocadherin (1818-1834) E P S V H N Y F A I D P T T G A I H Protocadherin (1815-1833) K N K D Y Y I I S T S N G S L E G Ephrin B2 precursor (129-145) T S W T A E K S I A Q L N S K Neprilysin (180-194)
PEPTIDOS PRESENTADOS POR CELULAS EPITELIALES(CELULAS RIN DR4IiDM)
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
PEPTIDOS PRESENTADOS POR APC (CELULAS B-LCL)
D R 4 m otif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source prote in
Surface m em brane V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P R H LA-A2 (28-48) D T Q F V R F D S D A A S Q R M E P H LA-A2 (30-47) V D D T Q F V R F D S D A A S Q R M E H LA-A2 (28-46) V D D T Q F V R F D S D A A S Q R H LA-A2 (28-44) D T Q F V R F D S D A A S Q R M H LA-A2 (30-45) D T Q F V R F D S D A A S Q R H LA-A2 (30-44) T Q F V R F D S D A A S Q R H LA-A2 (31-44) V D D T Q F V R F D S D A A S P R T E P R H LA-B35 (27-47) D T Q F V R F D S D A A S P R T E P H LA-B35 (29-46) V D D T Q F V R F D S D A A S P R T E P H LA-B35 (27-46) D D T Q F V R F D S D A A S P R H LA-B35 (28-43) E D L S S W T A A D T A A Q I T Q R H LA-C (122-139) D L S S W T A A D T A A Q I T Q R H LA-C (123-139) L S S W T A A D T A A Q I T Q H LA-C (124-138) L S S W T A A D T A A Q I T H LA-C (124-137) E D L R S W T A A D T A A Q I T Q H LA-C (128-144) D L R S W T A A D T A A Q I T Q H LA-C (129-144) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P R H LA-C (28-48) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P H LA-C (28-47) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P W V E H LA-C (28-51) V D D T Q F V R F D S D A A S P R G E P W H LA-C (28-49) V D D T Q F V Q F D S D A A S P R G E P R H LA-C (28-48) E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V Im m unoglobuline kappa cha in (187-205) E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P Im m unoglobuline kappa cha in (187-204) K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V Im m unoglobuline kappa cha in (188-205) E K H K V Y A C E V T H Q G L S Im m unoglobuline kappa cha in (187-202) H K V Y A C E V T H Q G L S S P V Im m unoglobuline kappa cha in (189-205) K H K V Y A C E V T H Q G L S Im m unoglobuline kappa cha in (188-202) H K V Y A C E V T H Q G L S Im m unoglobuline kappa cha in (189-202) H P V T G Q F L Y Q D S N W A S K V E T ransferrin receptor (561-534) K N T L Y L Q M N S L R A E D T A Im m unoglobuline heavy chain (31-47)
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
ORIGEN DE LOS PEPTIDOS PRESENTADOS POR MHC CLASE II EN LOS DIFERENTES COMPARTIMENTOS CELULARES
3%
22%
4%5%
11%1% 3%
51%
ORIGEN DE LOS PEPTIDOS
3%
11%
3%7%8%
68%
Membrana celularCitoplasmaExógenasRet. endoplasmáticoVesículas endocíticasVesículas secretorasNúcleoUbicuas
Células Epiteliales APC Profesionales(RIN DR4IiDM) (B-LCL)
Reunion Red Valenciana de Genomica y Proteomica 2004
Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas
Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células
transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides
autoinmunes humanos
M.Carrascal, L.Muixi1, P.Ruperez, D.Jaraquemada1 y J.AbiánBiological and Structural Mass Spectrometry Unit, IIBB/CSIC-IDIBAPS) and
Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE Ii Y DM (CELULAS DR4)
Los péptidos naturales asociados a DR4 en ausencia de Ii y de DM, no cumplen el motivo de unión a DR4 y corresponden principalmente a
extremos N y C terminales de proteínas citoplasmáticas.
DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein G F G D L K T P A G L Q V L N D Elongation factor 1-beta (1-16) Y V G D L H P D V T E A M L Polyadenilate-binding protein-1 (14-27) A R K L I G D P N L E F Small GTPASE (158-168) V P I D V D K T K V H N V E P V E S A R I E P P D T G L Y NEFA Precursor (23-53) I I D P G D S D I I R S M P E Q T G E K 60s Ribosomal protein L30 (95-114)
G N G G A A T T A E E N G S M M R HEMC Hydroxymethylbilane synthase(3-19) E A R G A R R G V K K V M V L Integrin A-1 precursor VLA-1 (264-278) L E T L H E A L n-chimaerin (251-258) M K I F V G N V D G A D T T P E E L SYT Interacting protein SIP (1-18) 16kD I G A G G T G A A L Y V M R L A L NADH-Ubiquin. oxidoreductase MLRQ (15-31) S A M T E E A A V A I K A M A K Initiation factor 5A (139-153) N V W Q V N T S R T R I T F V DNA Replication Licensing factor (706-719)
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE Ii Y DM (CELULAS DR4)
H 2 N - - - - - - M R Y V A S Y L L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - M K IF V G N V D G A D T T P E E L -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - M - G F G D L K T P A G L Q V L N D -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -C O O H H 2 N - - - - - - M S - G N G G A A T T A E E N G S M M R -- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - 1 3 A A - Y V G D L H P D V T E A M L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - 2 1 A A - IG A G G T G A A L Y V M R L A L - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - 2 4 A A - V P ID V D K T K V H N V E P V E S A R IE P P D T G L Y - - - - - - - - - - - - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - IV IQ N P T E -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A E F A K S L Q -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - F IS N H A Y - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - N V W Q V N T S R T R IT F V - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - S A M T E E A A V A IK A M A K -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A A V A IK A M A K -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - IID P G D S D IIR S M P E Q T G E K -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Q V T Q P T V G M N F K T P R G A V -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - V A Q A S L G E Y L F E R L T L K H D -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A L S Q D S T Y Q G E R A Y Q H G G V T G L S Q Y -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - R IE P F S S P P E L P D V M K P Q D S G G S A N E Q A V Q - - - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - P A L A P P E V V M D P A L A A Q Y E H D L E V A Q T T A L P D E D D D L -- - - - - - C O O H H 2 N - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A R K L IG D P N L E F - 4 0 A A - - - - - - - C O O H
EL 95% DE LOS PEPTIDOS SECUENCIADOS DE CELULAS HLA-DR4 CORRESPONDEN A EXTREMOS N- Y C- TERMINAL DE LAS PROTEINAS ORIGEN
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE DM (CELULAS DR4iI)
- En ausencia de DM, DR4 presenta casi exclusivamente péptidos CLIP derivados de la cadena invariante. - Todos los péptidos detectados cumplen el motivo de unión con preferencia por aminoácidos pequeños hidrofóbicos
DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein V G K T P I V G Q P S I P G G P V R Fetuin (331-347) G K T P I V G Q P S I P G G P V R Fetuin (332-347) S G E A F H V G K T P I V G Q P S Fetuin (325-341) S E Q H D I A I D L S P L A Q H E E G Mannose 6-phos./insulin-like growth fact. recep.(324-342) E G P E Y W E E Q T Q R A K G H E MHC class I (57-71) G R P T L L P E E I D D A F P L P58 8296-311) D L L S G K K N T V E G L P P L G G MK Protein tyrosine phosphatases non-receptor type 21(823-842) K P P K P V S K M R MA T P L L M Q A L P Invariant chain (99-119) L P K P P K P V S K M R M A T P L L M Q A L P M Invariant chain (97-120)
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
PEPTIDOS PRESENTADOS POR DR4 EN AUSENCIA DE Ii (CELULAS DR4DM)
La expresión de DM en presencia o ausencia de Ii, permite la asociación a DR4péptidos estables y que cumplen con el motivo de unión a DR4
DR4 motif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Source protein V L N Q E L R A D G T V N Q I E G Apolipoprotein D (77-93) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (56-69) R E G P E Y W E E Q T Q R A K G H E MHC class I (54-71) E G P E Y W E E Q T Q R A K G MHC class I (55-69) E R E G P E Y W E E Q T L V A K MHC non RT1 alpha 1 chain (77-93) E P S V H N Y F A I D P T T G A I H Protocadherin (1815-1833) L Y N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal growth factor receptor (270-287) N P T T Y Q M D V N P E G K Y S Epidermal growth factor receptor (272-287) E P G E P E F K I Y G N M H G N E A Carboxipeptidase H (102-119) S L Q E Y L A E Q N Q R Q L E S N Sulfated glycoprotein-1 (SGP-1) D E F K K F I S D K D A S V V G Protein disulfide isomerase ER-60 (143-158) I S W Y D N E Y G Y S N R V V D GAPDH (308-324) G F P K P P S Y N V A T T L P S Y D E Nedd4WWW (120-138) F P K P P S Y N V A T T L P S Y D E Nedd4WWW (121-138) G F P K P P S Y N V A T T L P S Y D E Nedd4WWW (118-138) F P K P P S Y N V A T T L P S Y D Nedd4WWW (121-137)
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
ANALISIS DE LOS REPERTORIOS PEPTÍDICOS MEDIANTE MALDI-TOF: INFLUENCIA DE LA EXPRESIÓN DE Ii EN CÉLULAS DM+
1845.84
2168.18
2326.071555.81 1861.841781.85 1967.021067.60 2671.26
Frac. 43DR4DM
2028.92
2168.21
1845.85
1781.861018.75 2013.991523.80
1067.05 2326.09
1000 1400 1800 2200 2600 3000Mass (m/z)
Frac. 43DR4IiDM
20
40
60
80
100
%In
tens
ity
2074.97
2041.951807.862231.09
1964.032288.112415.161230.48 1568.82 2746.47
1846.96
Frac. 40DR4DM
2074.99
1568.86
1846.952283.16
2041.971964.04
1807.87 2384.28
1000 1400 1800 2200 2600 3000
20
40
60
80
100
%In
tens
ity
2196.10
Frac. 40DR4IiDM
Mass (m/z)
Más del 50% de los iones detectados en la línea DR4DM se detectaron también en la triple transfectante(53%), mostrando que la expresión de HLA-DM molécula era suficiente para generar un repertorio estable aunque no igual al de las células DR4IiDM.
Reunion Red Valenciana de Genomica y Proteomica 2004
Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas
Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células
transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides
autoinmunes humanos
M.Carrascal, L.Muixi1, P.Ruperez, D.Jaraquemada1 y J.AbiánBiological and Structural Mass Spectrometry Unit, IIBB/CSIC-IDIBAPS) and
Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
EXPRESIÓN PROTEICA DIFERENCIAL EN CÉLULAS RIN TRANSFECTADAS CON HLA-DR4, Ii Y HLA-DM
(SISTEMA DIGE)
1
8
6
5
4
2
7
3
9
Células RIN Células RIN- DR4IiDM
pI103
pI103
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
ANÁLISIS DE IMAGEN CON EL SOFTWARE PROGENESIS
Mancha 745T student 0.00046Av. Ratio = -1.62
Mancha 416T student 0.00064Av. Ratio = -1.69
Mancha 833T student 0.00057
Av. Ratio = 1.7
Mancha 1097T student 3.20E-06Av. Ratio = 1.56
Mancha 1535T student 6.70E-05Av. Ratio = 2.47
Mancha 1692T student 3.50E-05Av. Ratio = 2.14
Mancha 1895T student 1.50e-07Av. Ratio = 5.13
Mancha 2012T student 9.70E-0.5
Av. Ratio = 4.79
Mancha 2046T student 0.00098
Av. Ratio = 2.1
Mancha 745T student 0.00046Av. Ratio = -1.62
Mancha 416T student 0.00064Av. Ratio = -1.69
Mancha 833T student 0.00057
Av. Ratio = 1.7
Mancha 745T student 0.00046Av. Ratio = -1.62
Mancha 745T student 0.00046Av. Ratio = -1.62
Mancha 416T student 0.00064Av. Ratio = -1.69
Mancha 416T student 0.00064Av. Ratio = -1.69
Mancha 833T student 0.00057
Av. Ratio = 1.7
Mancha 833T student 0.00057
Av. Ratio = 1.7
Mancha 1097T student 3.20E-06Av. Ratio = 1.56
Mancha 1535T student 6.70E-05Av. Ratio = 2.47
Mancha 1692T student 3.50E-05Av. Ratio = 2.14
Mancha 1097T student 3.20E-06Av. Ratio = 1.56
Mancha 1097T student 3.20E-06Av. Ratio = 1.56
Mancha 1535T student 6.70E-05Av. Ratio = 2.47
Mancha 1535T student 6.70E-05Av. Ratio = 2.47
Mancha 1692T student 3.50E-05Av. Ratio = 2.14
Mancha 1692T student 3.50E-05Av. Ratio = 2.14
Mancha 1895T student 1.50e-07Av. Ratio = 5.13
Mancha 2012T student 9.70E-0.5
Av. Ratio = 4.79
Mancha 2046T student 0.00098
Av. Ratio = 2.1
Mancha 1895T student 1.50e-07Av. Ratio = 5.13
Mancha 1895T student 1.50e-07Av. Ratio = 5.13
Mancha 2012T student 9.70E-0.5
Av. Ratio = 4.79
Mancha 2012T student 9.70E-0.5
Av. Ratio = 4.79
Mancha 2046T student 0.00098
Av. Ratio = 2.1
Mancha 2046T student 0.00098
Av. Ratio = 2.1
MANCHAS DIFERENCIALES
1
8
6
54
2
7
3
9
RIN RIN- DR4IiDM
pI 103 pI 103
Manchas detectadas y emparejadas para cada una de las imagenes obtenidas en el análisis de expresión diferencial mediante el sistema DIGE.
Línea celular Imagen Marcaje Manchas
detectadasManchas
emparejadasDR4IiDM 1* Cy5 2238 2238DR4IiDM 2 Cy5 1815 1311DR4IiDM 3 Cy3 2187 1383DR4IiDM 4 Cy3 1969 1304
RIN 1 Cy3 2238 2238RIN 2 Cy3 1815 1311RIN 3 Cy5 2187 1383RIN 4 Cy5 1969 1304
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DIFERENCIALES
Regulacióntranscripción
71
71
71
Actividad catalítica
Superoxide dismutase (Mn), mitoch. prec.
Glutathione S-transferase Yb-1
Short chain, 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase,mitoch. prec.
Células RIN- DR4IiDM
Peroxiredoxin 1
Thimet oligopeptidaseGlutamate dehydrogenase 1
Creatine kinase, mitoch. 1
HIV-1 tat interactive protein 2, homolog
Oxidoreductasa : Glutamato deshidrogenasa3-hidroxiacil - CoA deshidrogenasaPeroxiredoxina 1Superoxido dismutasa [Mn]
Transferasa: Glutatión S - transferasa Mu 1 Creatina kinase
Quinasa:Creatina kinase
Hidrolasa: Oligopeptidasa Thimet
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Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas
Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células
transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides
autoinmunes humanos
M.Carrascal, L.Muixi1, P.Ruperez, D.Jaraquemada1 y J.AbiánBiological and Structural Mass Spectrometry Unit, IIBB/CSIC-IDIBAPS) and
Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS QUE INTERACCIONAN CON HLA-DR4 EN UNA CÉLULA EPITELIAL QUE EXPRESA MHCII
- Unión del anticuerpo L243 a las bolas de Sefarosa.
- Lisis “suave de las células”: Solubilización de las moléculas de MHC sin romper las interacciones entre proteínas.
PROTOCOLO:
Separación de las proteínas por SDS-PAGE y 2DE
DR α
1 2 3 4 5 6
- Purificacion por Inmunoafinidad de DR4 y proteínas asociadas.
1) Proteinas no solubilizadas en 2) y solubilizada con 2% SDS 2) Proteinas solubilizado con 1% digitonina3) Fracción no retenida control (incubación con bolas bloqueadas)4) Fraccion retenida control (eluido)5) Fracción no retenida bolas-Ab L2436) Fraccion retenida bolas-Ab L243 (eluido)
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS AFINES POR HLA-DR4 MEDIANTE SDS-PAGE
kDa
75
50
25
37
20
15
ExtractoTotal
NoRetenido Eluido Extracto
TotalNo
RetenidoEluido
DR4IiDM RIN
αβ
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS AFINES A HLA-DR4 EN CÉLULAS EPITELIALES TRANSFECTADAS CON DIFERENTES
COMBINACIONES DE LAS MOLÉCULAS HLA-DR, Ii Y HLADM
pI 103 pI 103 pI 103
RIN DR4 DR4Ii
pI 103 pI 103 pI 103
B-LCL (DR4)DR4DM DR4IiDM
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS AFINES A HLA-DR4 EN CÉLULAS EPITELIALES TRANSFECTADAS CON DIFERENTES COMBINACIONES DE LAS
MOLÉCULAS HLA-DR, Ii Y HLADM
HLA-DRA
HLA-DRB1_0401DR4
RINB-LCL
DR4IiDM4
DR4Ii
DR4DM
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS AFINES POR HLA-DR4 MEDIANTE 2DEANALISIS DE IMAGEN
27
29
28
65
37
31
34
33
32
41
39
3038
36
64
Específicas DR4IiDM Comunes
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
PROTEÍNAS DIFERENCIALES IDENTIFICADAS
Proteína identificada Masa (KDa)/pI nº acceso*
78 kDa glucose-regulated protein precursor (BIP) 75 / 5.1 P06761
Glucose regulated protein, 58 kDa 57 / 5.9 38382858
Heat shock cognate protein, 71 kDa 71 / 5.4 5729877
Heat shock 70 kDa protein 9B 74 / 6.0 21040386
Peroxiredoxin 4 (Macht DIGE) 31 / 6.2 Q63716
Protein disulfide isomerase precursor 57 / 4.8 P04785
Similar to protein OS-9 precursor 79 / 5.1 34865783
Similar to reticulocalbin 38 / 4.7 34856626
Vacuolar ATP synthase catalitic subunit A 68 / 5.4 34869154
Vacuolar ATP synthase subunit B 57 / 5.6 17105370
Reunion Red Valenciana de Genomica y Proteomica 2004
Estudio de la presentaciEstudio de la presentacióón den de ppééptidosptidos por HLA clase II por HLA clase II mediante tmediante téécnicascnicas proteproteóómicasmicas
Secuenciación de péptidos presentados por HLA-II• Comparación de los repertorios observados en células
transfectadas y en una APC profesional• Influencia de las moleculas Ii y HLA-DM en el repertorio• Proteoma de la célula RIN transfectada• Chaperonas alternativas a Ii y DM• Identificación de péptidos antigénicos en tiroides
autoinmunes humanos
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Immunology Unit, Institut de Biotecnologia i Biomedicina, UAB, Barcelona, Spain
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A
CLASE II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.
FraccionamientoHPLC -UV
Tejido tiroideo autoinmune
Purificación de HLA -DRpor inmunoafinidad
(mAb L243)
Separación de moléculas con Mr < 10KDa
(Centricón 10000 MW)
Homogeneización mecánica yrecuperación de proteinas de membrana
Solubilización de proteinas de membrana (Lisis con 0.5% NP-40)
min
mA
U
Determinación depesos moleculares
MALDI - reTOFMS
Identicación depéptidos
nESI -ITMS/MS
ID tiroides Expresión de clase II Fenotipo para clase II Cantidad (g)
TB-190 ++ DRB1*1101, DRB1*1104, DQB1*0301 < 1 TB-269 ++ DRB1*1101, DRB1*1104, DQB1*0301 2 TB-270 +++ DRB1*0701, DQB1*0202, DQB1*0303 3.3 TB-237 + DRB1*1501, DQB1*0602 1.1 TB-448 ++ DRB1*0407, DRB1*1501, DQB1*0301, 8
Tabla I: Tejido utilizado para la identificación de péptidos asociados a la molécula de MHCII.
min20 40 60
TB2703.3 g
TB190> 1g
min20 40 60
AU
40
80
TB4488 g
min20 40 60
AU
40
80AU
40
80
TB2692 g
min20 40 60
AU
40
80
20 40 60 min
TB2371.1 g
AU
40
80
B-LCL500 x 10 6 células
min20 40 60
AU
40
80
Perfiles HPLC-UV de la línea celular B-LCL (5 x 106 células) y de los tiroides analizados
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A CLASE
II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.
Relat
ive A
bund
ance
CPTPCQ LQAEQAFLRTVQMr: 2030.0 Da
MS/MS ión 1016.0
20
40
60
80
100 943.1934.1
965.6763.3
834.2
1528.31162.5
503.1 616.2
1268.3
1091.4
1290.5 1415.4 1684.7
628.0
1197.3 1403.71785.9 1884.7
x4
y 4 y 5y 6
y 7
y 9
y 10
y 11
y 12
b17b16
b15
b14
b13
b12
b11
b17 2+
b17-H2O2+
893.5
A
943.1
m/z
934.1913.6
1015.3901.6
1051.1834.2763.5
1162.7 1529.11268.5
1197.3 1290.7 1684.8
628.2503.1
1415.7
1403.8
1786.5 1884.7347.3
300 500 700 900 1100 1300 1500 1700
20
40
60
80
100
x4B
péptido sintético
peptido tiroides TB448
Tiroglobulina [726-743]
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A CLASE
II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.
MHCII DQB1*0602 [75-89]Re
lative
Abu
ndan
ce
DVGVYRAVTPQGRPDMr: 1628.9 Da
MS/MS ión 815.4
m/z
20
40
60
80
100
B
300 500 700 900 1100 1300 1500
758.1
700.6 807.0679.2
669.3
940.4961.3
860.2
542.7
1242.8869.2 1382.61186.71079.9
397.01012.5 1260.41129.5271.7 1398.8
x8
20
40
60
80
100
A758.3
700.0807.2
669.5
961.6940.6
860.5
1242.9 1382.81186.71079.7 1259.8
422.2272.0 1012.6 1398.9
x8
y 6
y 9
y 10
y 11
y 12
b12b11b13b8
b13 2+
b13-H2O2+
b2
b9
y 14 2+
péptido sintético
peptido tiroides TB448
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS A CLASE
II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.
261 291 301
381 391
KNYAEAKDVF
401 411
541 551
581
1 11 21 31 41 51 61 71
MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD
81 91 101 111 121 131 141 151
ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK
161 171 181 191 201 211 221 231
KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV
241 251 271 281 311
ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK ECCEKPLLEK SHCIAEVEND
321 331 341 351 361 371
EMPADLPSLA ADFVESKDVC LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE
421 431 441 451 461 471
FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTK KVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGS K CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV
481 491 501 511 521 531
LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRP CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ TALVELVKHK
561 571 591 601
PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV AASQAALGL
LGEYKFQNALLVRYT
LGEYKFQNALLVRYTK
TPTLVEVSRNLGKVG
VSTPTLVEVSRNLGKVG
STPTLVEVSRNLGKVG
TPTLVEVSRNLGKVGS
QLGEYKFQNALLVRYT
Figura 4: Secuencia aminoacídica de la albúmina sérica humana, con los epítopos caracterizados a partir de los tiroides TB190, 260 y 270 marcados en rojo. Los péptidos identificados para cada epítopo se muestran encuadrados en naranja.
Joaquín Abián 2002, EMEB IIBB-CSIC
CARACTERIZACIÓN DEL REPERTORIO ASOCIADO A LA MOLÉCULA DE MHCII EN UN SISTEMA IN VIVO: ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS
ASOCIADOS A CLASE II EN TIROIDES AFECTADOS CON LA ENFERMEDAD DE GRAVES-BASEDOW.
Localización celular de las proteínas origen identificadas a partir de tejido tiroideo.
Membrana (4)
Sangre (3)
Membrana (4)
Sangre (3)(4)(4)Intracelular
Matriz extracelular
(5)
Matriz extracelular
(5)
Matriz extracelular
(5)Coloide (2)Coloide (2)