PERÚ: PAÍS MARÍTIMO, ANDINO, AMAZÓNICO, BIOCEÁNICO Y CON PERÚ: PAÍS MARÍTIMO, ANDINO, AMAZÓNICO, BIOCEÁNICO Y CON PRESENCIA EN LA ANTÁRTIDA PRESENCIA EN LA ANTÁRTIDA

SÍNTESIS DE SÍNTESIS DE PÉPTIDOSPÉPTIDOS

Dr. Américo Castro Dr. Américo Castro LunaLuna

Métodos de síntesisMétodos de síntesis1.Método en solución, 1.Método en solución, consiste en añadir consiste en añadir

reactivos a soluciones de cadenas reactivos a soluciones de cadenas peptídicas en crecimiento. Esta síntesis peptídicas en crecimiento. Esta síntesis es adecuada para sintetizar péptidos es adecuada para sintetizar péptidos pequeños, el rendimiento es bajo por la pequeños, el rendimiento es bajo por la purificación del proceso.purificación del proceso.

2.Método en fase sólida, 2.Método en fase sólida, consiste en consiste en añadir reactivos en cadenas peptídicas añadir reactivos en cadenas peptídicas en crecimiento enlazadas a un soporte en crecimiento enlazadas a un soporte sólido. Es más apto para sintetizar sólido. Es más apto para sintetizar péptidos y proteínas grandes.péptidos y proteínas grandes.

1.1. Síntesis de péptidos en solución,Síntesis de péptidos en solución, considerando la estructuraconsiderando la estructura del del tripéptido alanil-valil-fenilalanina:tripéptido alanil-valil-fenilalanina:

** Se empieza con el extremo N-Se empieza con el extremo N-terminal y termina en el C-terminal terminal y termina en el C-terminal o va de izquierda a derecha en la o va de izquierda a derecha en la forma en la que se simboliza el forma en la que se simboliza el péptido.péptido.

** Consiste en emparejar el grupo Consiste en emparejar el grupo carboxilo de la alanina con el grupo carboxilo de la alanina con el grupo amino de la valina para evitar amino de la valina para evitar reacciones colaterales se protege el reacciones colaterales se protege el grupo amino de la alanina como grupo amino de la alanina como amida, para hacerlo no nucleofílico.amida, para hacerlo no nucleofílico.

** Tratando el aminoácido libre con Tratando el aminoácido libre con cloroformiato de bencilo se obtiene cloroformiato de bencilo se obtiene un uretano que es eliminado al final un uretano que es eliminado al final de la síntesis.de la síntesis.

** Éste grupo protector se le denomina Éste grupo protector se le denomina como grupo bencilocarbonilo, grupo como grupo bencilocarbonilo, grupo carbobezoxi (Cbz) o grupo Z carbobezoxi (Cbz) o grupo Z

Paso preliminar: protección del grupo amino con Z, Paso preliminar: protección del grupo amino con Z, obteniéndose Z-Ala. obteniéndose Z-Ala.

CH2 - O - C - Cl + H2N - CH - C - OH

O O

CH3

cloroformiato de benciloZ - Cl

alaninaAla

CH2 - O - C - NH - CH - C - OH + HCl

O

CH3

O

benciloxicarbonil-alaninaZ - Ala

grupo Z

Luego se activa el grupo carboxilo con Luego se activa el grupo carboxilo con cloroformiato de etilo para obtener un cloroformiato de etilo para obtener un anhidrido mixto del aminoácido y ácido anhidrido mixto del aminoácido y ácido carbónico fuertemente activado frente a carbónico fuertemente activado frente a un ataque nucleofílico.un ataque nucleofílico.

Paso 1. Activación del grupo caboxiloPaso 1. Activación del grupo caboxilo: Al : Al tratar la alanina protegida y activada tratar la alanina protegida y activada con la valina, el grupo amino con la valina, el grupo amino nucleofílico de la valina ataca al nucleofílico de la valina ataca al carbonilo activado de la alanina, carbonilo activado de la alanina, desplazando al anhidrido y formando el desplazando al anhidrido y formando el enlace peptídicoenlace peptídico

alanina protegida

Z - NHCH - C - OH + Cl - C - OCH2CH3

O O

CH3

cloroformiato de etilo

anhídrído del ácido carbónico

Z - NHCH - C - O - C - OCH2CH3 + HCl

CH3

O O

anhídrido mixto

Paso 2. Apareamiento con la valina:Paso 2. Apareamiento con la valina: Para Para tener protegido el N del dipéptido Z-Al-tener protegido el N del dipéptido Z-Al-Val. La activación del grupo carboxilo Val. La activación del grupo carboxilo de la valina, con la adición de la de la valina, con la adición de la fenilalanina, da el tripéptido protegido fenilalanina, da el tripéptido protegido Z-Ala-Val-Phe.Z-Ala-Val-Phe.

Si se quiere alargar esta cadena, se Si se quiere alargar esta cadena, se activa el extremo C-terminal y se le activa el extremo C-terminal y se le hace reaccionar con cloroformiato de hace reaccionar con cloroformiato de etilo; y posteriormente se le aparea con etilo; y posteriormente se le aparea con el aminoácido que se desea adicionar.el aminoácido que se desea adicionar.

Apareamiento con la valinaApareamiento con la valina

Z - NHCH - C - O - C - OCH2CH3 + H2N - CH - C - OH

CH(CH3)2CH3

O O

alanina, protegida y activada valina

Z - NHCH - C - NH - CH - C - OH + CH3CH2OH + CO2

CH(CH3)2CH3

O O

Z-Ala-Val

O

Z - NHCHCNHCH - C - OH + Cl - C - OEt

CH3

O O

CH(CH3)2

O

Z - NHCHCNHCH - C - O - C - OEt +HCl

O O O

CH3 CH(CH3)2

Z - Ala - NHCH - C - O - C - OEt + H2N - CH - C - OH

fenilalanina

O

CH(CH3)2

O

Z - Ala - NHCH - C - NH - CH - C - OH + CO2 + EtOH

O

H3C - CH - CH3

CH2 - Ph

Z-Ala-Val-PheCH2 - Ph

O

Paso 1: Activación del grupo carboxilo

Paso 2: Apareamiento con la f enilalanina

O

• La reacción final de esta síntesis consiste en La reacción final de esta síntesis consiste en desproteger desproteger el extremo N-terminal del el extremo N-terminal del tripéptido.tripéptido.

• Se rompe el enlace amido del N-terminal, sin Se rompe el enlace amido del N-terminal, sin romper ninguno de los enlaces peptídico del romper ninguno de los enlaces peptídico del péptido.péptido.

• El grupo bencilocarbonilo por ser parte de El grupo bencilocarbonilo por ser parte de amida y parte de éster del bencilo, por amida y parte de éster del bencilo, por hidrogenólisis de éste (Hhidrogenólisis de éste (H22. Pd) y en . Pd) y en condiciones suaves condiciones suaves se evita que no se se evita que no se rompan los enlaces peptídicos.rompan los enlaces peptídicos.

• Por este motivo el grupo bencilocarbonilo o Por este motivo el grupo bencilocarbonilo o grupo Z se utiliza para proteger el N-terminal.grupo Z se utiliza para proteger el N-terminal.

CH2 - O - C - NHCHC - Val - Phe

CH3

O O

Z-Ala-Val-Phe

H2NCHC - Val - Phe + CO2 +

CH3

O

CH3

Ala-Val-Phe

H2,Pd

DCC = N, N`- DCC = N, N`- diciclohexilcarbonildiimida: diciclohexilcarbonildiimida: acopla a acopla a los aminoácidos a través los aminoácidos a través del grupo del grupo amino y el grupoamino y el grupo carboxilo formando carboxilo formando amidas amidas

La DCC, sale al final como DCU (N, N` -La DCC, sale al final como DCU (N, N` -diciclohexilurea) como un buen grupo diciclohexilurea) como un buen grupo saliente.saliente.

N = C = N

(N,N`- diciclohexilcarbodiimida)

N = C = N

(N,N`- diciclohexilurea)

H HO

DCC

DCU

2.2. Síntesis de péptidos en fase sólida Síntesis de péptidos en fase sólida de Merrifield.de Merrifield.

** Desarrollo un método para Desarrollo un método para sintetizar péptidos sin tener que sintetizar péptidos sin tener que purificar los intermedios.purificar los intermedios.

** Unió las cadenas de péptidos en su Unió las cadenas de péptidos en su alargamiento con poliestireno alargamiento con poliestireno sólido, preparado de modo que por sólido, preparado de modo que por cada 100 anillos de benceno uno cada 100 anillos de benceno uno lleve un grupo clorometilo (-CHlleve un grupo clorometilo (-CH22Cl). Cl). Éste polímero se obtiene Éste polímero se obtiene copolimerizándo estireno con p.copolimerizándo estireno con p.(clorometil) estireno y se llama (clorometil) estireno y se llama resina de Merrifieldresina de Merrifield..

- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 - CH -

CH2Cl CH2Cl

Poliestireno clorometilado

CH2Cl

P

=

forma abreviada

** Después de añadir cada aminoácido, se Después de añadir cada aminoácido, se eliminan los reactivos en exceso con un eliminan los reactivos en exceso con un disolvente.disolvente.

** En este método se utiliza como En este método se utiliza como grupo grupo éster protector a una partícula sólida éster protector a una partícula sólida de polímerode polímero..

** La automatización de este método permite La automatización de este método permite añadir varios aminoácidos.añadir varios aminoácidos.

** La máquina que Merrifield construyó, le La máquina que Merrifield construyó, le permitió sintetiza permitió sintetiza ribonucleasa ribonucleasa (124 (124 aminoácidos) en solo seis semanas, aminoácidos) en solo seis semanas, obteniendo un rendimiento de 17%.obteniendo un rendimiento de 17%.

** Merrifield, por éste trabajo de síntesis de Merrifield, por éste trabajo de síntesis de péptidos en fase sólida, obtuvo el premio péptidos en fase sólida, obtuvo el premio Nóbel de química en 1984.Nóbel de química en 1984.

RibonucleasaRibonucleasa

Utilización del grupo protector Utilización del grupo protector terc-terc-butiloxicarbonilo (BOC)butiloxicarbonilo (BOC)

El BOC es un grupo protector similar al grupo Z El BOC es un grupo protector similar al grupo Z que tiene grupo que tiene grupo terc-terc-butilo en lugar del grupo butilo en lugar del grupo bencilo y se elimina fácilmente en condiciones bencilo y se elimina fácilmente en condiciones ácidas.ácidas.

El cloruro de ácido del grupo BOC es inestable, El cloruro de ácido del grupo BOC es inestable, por lo que se utiliza el anhidrido, dicarbonato por lo que se utiliza el anhidrido, dicarbonato de di-terc-butilo para enlazar el grupo de di-terc-butilo para enlazar el grupo protector BOC al aminóácido.protector BOC al aminóácido.

Los grupos amino de los aminoácidos se Los grupos amino de los aminoácidos se protegen como protegen como derivados del BOC derivados del BOC y se y se introducen por medio del anhidrido introducen por medio del anhidrido dicarbonato de di-dicarbonato de di-terc-terc-butilo para enlazar el butilo para enlazar el grupo protector BOC al aminoácido.grupo protector BOC al aminoácido.

Los aminoácidos-BOC, los venden en casas Los aminoácidos-BOC, los venden en casas comerciales.comerciales.

Protección del grupo amino del aminoácido Protección del grupo amino del aminoácido como derivado BOC:como derivado BOC:

CH3

CH3

CH3

O

O

dicarbonato de di-terc-butilo

C C O

O

C O CH3 +

CH3

CH3

C

R

H2N CH COOH

CH3

CH3

CH3

R

O

O

C C NH CH COOH + CO2 + CH3

CH3

CH3

C OH

BOC-aminoácido

aminoácido

Los derivados BOC en presencia de ácido Los derivados BOC en presencia de ácido trifluoracético generan el aminoácido libretrifluoracético generan el aminoácido libre

CH3

CH3

CH3

RCF3COOH

O

O

BOC-aminoácido

C C NH CH COOH

R

H3N+ CH COOH + CO2 + CH2 = CCH3

CH3

isobutilenoaminoácido libre

BOC BOC = grupo protector = grupo protector tercterc--butiloxicarbonilobutiloxicarbonilo

H3C - C - O - C - O - C - O - C -CH3

CH3

CH3

CH3

CH3O O

Anhidrido dicarbonato de di-terc-butilo

ETAPAS EN LAS SÍNTESIS ETAPAS EN LAS SÍNTESIS DE PÉPTIDOS EN FASE DE PÉPTIDOS EN FASE

SÓLIDASÓLIDASe da en cuatro etapas.Se da en cuatro etapas.Paso 1Un aminoácido BOC protegido se enlazacovalentemente de poliestireno mediantela formación de una unión éster (reacciónSn2).

BOC - NHCHCOH + ClCH2 -

O

R

PolímeroPolímero

Paso 2El aminoácido unido al polímero se lavapara liberarlo del exceso de reactivo y enseguida se trata con ácido trifluoracéticopara eliminar el grupo BOC.

BOC - NHCHCOHCH2 -

O

R

PolímeroPolímero

Base

1. Lavar2. CF3 COOH

H2NCHCOCH2 -

O

R

PolímeroPolímero

Paso 3Un segundo aminoácido protegido porBOC se acopla al primero debido a lareacción con DCC. El exceso de reactivose elimina lavándolo del polímeroinsoluble

BOC - NHCHC - NHCHCOCH2 -

O

R

PolímeroPolímero

El ciclo se repite muchasveces

O

R

1. DCC, BOC - NHCHCOH

O

R`

BOC - NHCHC - ( NHCHC )n NHCHCOCH2 -

R`

PolímeroPolímero

R´´ R

O O O

2. Lavar

El ciclo de desprotección, acoplamientoy lavado se repite tantas veces como sedesee para añadir unidades deaminoácidos a la cadena en crecimiento.

Paso 4Después de que se forma elpéptido deseado, eltratamiento con HFanhídroelimina el grupo BOC final yrompe el enlace éster con elpolímero; esto produce elpéptido libre.

HF

H2NCHC ( NHCHC )n NHCHCOH + HOCH2 -

R`

PolímeroPolímero

R´´ R

O O O

Síntesis de péptidos en fase sólidaSíntesis de péptidos en fase sólida

Síntesis de Ala-Val-Phe (tripéptido)Síntesis de Ala-Val-Phe (tripéptido)

1. 1. La síntesis empieza con la unión La síntesis empieza con la unión del del aminoácido del extremo C-aminoácido del extremo C-terminal con terminal con el N protegido (BOC-el N protegido (BOC-fenilalanina) al fenilalanina) al polímero.polímero.

Me3C - O - C - NH - CH - C - O- + CH2 - Cl2

O

Ph - CH2Boc

PBoc - Phe

Me3C - O - C - NH - CH - C - O - CH2

O

Ph - CH2Boc

PBoc - Phe P

O

O

2.2. El ácido trifluoracético (TFA) libera El ácido trifluoracético (TFA) libera el el grupo protector BOC de la grupo protector BOC de la fenilalanina fenilalanina para que su grupo para que su grupo amino se pueda amino se pueda aclopar con el aclopar con el aminoácido siguienteaminoácido siguiente

Me3C - O - C - NH - CH - C - O - CH2

O

Ph - CH2Boc

PBoc - Phe P

O (TFA)CF3COOH

H3N - CH - C - O - CH2

O

Ph - CH2

PPhe P

+

3.3. El segundo aminoácido (valina) El segundo aminoácido (valina) protegido por protegido por BOC se acopla al BOC se acopla al primero con la adición de DCC.primero con la adición de DCC.

NH - CH - C - O- + H3N - CH - C - O - CH2+

(CH3)2CH

Boc - Val

PPhe P

O O

Ph - CH2

Boc

DCC

NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH2 + DCU

(CH3)2CH

Boc - Val - Phe PP

O O

Ph - CH2

Boc

Para acoplar la alanina, se desprotege la cadena tratándola Para acoplar la alanina, se desprotege la cadena tratándola con TFA y luego se añade BOC-alanina y DCC.con TFA y luego se añade BOC-alanina y DCC.

Paso 1: Paso 1: DesprotecciónDesprotección

NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH2

(CH3)2CH

PP

O O

Ph - CH2

Boc

(TFA)

H3N - CH - C - NH - CH - C - O - CH2 + CH3 - C = CH3

(CH3)2CH

Val - Phe PP

O O

Ph - CH2

Boc - Val - Phe

CF3COOH

CH3

+ CO2+

Paso 2: Paso 2: acoplamientoacoplamiento

H3N - CH - C - NH - CH - C - O - CH2

(CH3)2CH

Val - Phe PP

O O

Ph - CH2

CH3

DCC

+

NH - CH - C - O-

O

Boc

NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH2 + DCU

O

Boc

O O

CH3 (CH3)2CH Ph - CH2

PBoc - Ala - Val - Phe P

Si se estuviera sintetizando un péptido más Si se estuviera sintetizando un péptido más largo, la adición de cada aminoácido sucesivo largo, la adición de cada aminoácido sucesivo requeriría la repetición de dos pasos: requeriría la repetición de dos pasos:

1.1. Utilización de ácido trifluoracético (TFA) para Utilización de ácido trifluoracético (TFA) para desproteger el grupo amino del final de la desproteger el grupo amino del final de la cadena en crecimiento.cadena en crecimiento.

2.2. La adición del siguiente BOC-aminoácido, La adición del siguiente BOC-aminoácido, utilizando DCC como agente de acoplamiento. utilizando DCC como agente de acoplamiento.

Una vez que se ha completado el péptido, se ha Una vez que se ha completado el péptido, se ha de eliminar el grupo protector BOC final y se ha de eliminar el grupo protector BOC final y se ha de separar el péptido del polímero. El HF anhidro de separar el péptido del polímero. El HF anhidro rompe la unión éster que enlaza el péptido al rompe la unión éster que enlaza el péptido al polímero y también elimina el grupo protector polímero y también elimina el grupo protector BOC, Tal como lo veremos continuando con la BOC, Tal como lo veremos continuando con la síntesis:síntesis:

NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - O - CH2

O

Boc

O O

CH3 (CH3)2CH Ph - CH2

PBoc - Ala - Val - Phe P

HF

H3N - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - OH + CO2 + CH3 - C = CH2

O O O

CH3 (CH3)2CH Ph - CH2

+CH3

CH2FP+

Ala - Val - Phe