ESPERIENZE E RICERCHE

La eterogeneità della emoglobina nei vertebrati

LEONARDO TENTORI, GIROLAMO VIVALDI e ADRIANA MASSA ( 0)

Laboratori di Biologia

Riassunto. - La presenza di due o più tipi differenti di emoglobina negli emùlisati del sangue di un singolo individuo è un fenomeno che si osserva in numerose specie di vertebrati. Questa molteplicità che viene comune· ment e designata come eterogeneità dell'emoglobina è determinata da diffe­renti meccanismi genetici ; è pertanto possibile classificare l'et erogeneità dell'emoglobina in dassi differenti in bast ai meccanismi genetici che deter· minano la presenza di differenti emoglobine negli emolisati dello st esso indi­viduo.

Nel presente lavoro vengono riportati i risultati ottenuti sottoponendo gli cmolisati di alcune specie di vertebrati paralldamente ad elettroforesi su gel d'amido e ad elettroforesi su gtl di poliacrilamide. Come è noto, con queste due tecniche di elettroforesi zonale si ottengono separazioni che ven­gono determinate oltre che dalla differente migrazione di proteine in un cam· po elettrico, anche da un fenomeno di filtraggio molecolarP. Gli esperimenti eseguiti hanno dimostrato che le due tecniche danno risultati praticamente sovrapponibili e possono essere considerate equivalenti ai fini della separa· zione di emoglobine eterogenee.

Sulla base della discussione dei risultati ottenuti, viene proposta una modifica della classifica2.ione di J ONES (1961) dei vari tipi di eterogeneità della emoglobina che dovrebbe essere distinta in et erogeneità di maturazione, di cui sono esempi le emoglobine embrionale, fetale e adulta umana ; etero­geneità genetica da geni alldici, di cui sono esempi le emoglobine anomale, ed et erogeneità per p.esenza di componenti minori da geni duplicati ed even· tualmente concatenati di cui sono esempi le emoglobine A ed A1 umane. Viene infine rilevata l 'opportunità di introdurre nella classificazione una quatta classe : eterogendtà da ambiguità nella traduzione del codice

genetico.

(0

) Borsista dei Laboratori di Biologia.

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Summary. (The heterogenity of hemoglobin in vertebrates).- The presence of two or more different types of hemoglobin in the hemolysate from a single individuai has been reported in many species of vertebrates. Such hemoglobin multiplicity is commonly called heterogeneity and is caused by different genetic mechanisms. lt is possible therefore to classify hemoglobin hetero­geneity in several groups, according to the genetic mechanisms which con­tro} hemoglobin production in the same individuai.

In the present work some experi.mental results obtained submitting to both starch gel and polyacrylamide gel electrophoresis the hemolysates from vari.9us species of vertebrates are reported. lt is known that in these two zonal electrophoresis procedures the resulting separations are due not only to a different migration of proteine in an electri.c field, but also to a pheno­menon of molecular sieving. The hemoglobins from a number of vertebrate species were submitted to electrophoresis, namely those of man, Afacaca mulatta, guinea pig, horse, ox, sheep, rabbit (Fig. l and 2), chicken (Fig. 3 and 4), Rana esculenta L. and Ambystoma tigrinum Green in the neotenic and metamorphosed stage (Fig. 5 and 6). Experi.mental work has shown that both t echniques give practically identica! results and can be considered as equivalent to one another in the separation of heterogeneous hemoglobins. On the basis of the discu ssion of the results obtained and in order to account for the genetic mechanisms by which hemoglobin heterogeneity is produced a modification of Jones classification of hemoglobin heterogeneity (1961) is suggested as follows : a) maturation het erogenei ty, exemplified by human embryonic, fetal and adult hemoglobins ; b) genetic heterogeneity due to allelic ~enes, such as the hcterogeneity caused by the abnormal human hemo­globins; and c) minor-componente het erogeneity due to duplicated and pos­sibly concatenated genes, an example of which is represented by human A and ~ hemoglobins. Finally it could be appropriate to introduce in the classi­fication a fourth group : d) heterogeneity due to ambiguity in genetic code translation.

La presenza di emoglobine multiple è stata 'accertata negli emolisati di numerosi animali appartenenti a specie differenti (GRATZER & ALLISON,

1960). Tale molteplicità viene comunemente designata come eterogeneità dell'emoglobina, sottointendendosi il concetto di una eterogeneità di strut­tura chimica dovuta alla presenza negli emolisati di più specie molecolari, che come tali presentano un differente comportamento elettroforeùco e cro­matografico. Il significato fisiologico della presenza contemporanea di due o più tipi di emoglobina nello st esso individuo è tuttora non completamente rhiarito. Alcuni autori hanno voluto mettere in relazione la et erogeneità della emoglobina, intesa come sopra è stato specificato, con la filogen esi ;

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è dubbio tuttavia che tale eterogeneità possa utilmente essere impiegata come criterio diagnostico a qualunque livello tassonomico.

Un tentativo di classificazione della eterogeneità dell'emoglobina è stato compiuto da ]ONES (1961) che ne ha distinto tre tipi: una eterogeneità di maturazione, una eterogeneità genetica ed una eterogeneità per presenza di componenti minori. Un esempio della eterogeneità di maturazione è rap­prest>ntato dalla emoglobina F fetale (SILVESTRONI & BIANCO, 1963), pre­sente nell'uomo c in altri vertebrati ; tutte le anomalie descritte per l'emo­globina umana, come l'Rh S, l'Rh E, ecc. (LEHMANN & HuNTSMAN, 1966), rappresentano esempi di eterogeneità genetica ; infine esempi della etero­geneità ptr presenza di componenti minori sono la emoglobina A 1 umana e la emoglobina C della pecora (BEALE et al., 1966; BoYER et al., 1966).

Per lo studio di questi vari tipi di eterogeneità sono state e sono tuttora di valido aiuto le tecniche di separazione clettroforetica zonale. Nella pre­sente nota vengono riportati i risultati ottenuti sottoponendo ad elettroforesi su gel d'amido c su {!el di poliacrilamide gli emolisati di alcune specie di ani­mali che sono stati esaminati nel co1so di uno studio comparato sulla strut­tura della emoglobina dei vertebrati.

MATERIALI E METODI

Emoglobina. - La preparazione degli emolisati dal sangui' degli animali studiati, la purificazione della emoglobina e la separazione di essa dalle pro­teine non contenenti eme presenti negli emolisati venivano eseguite secondo le tecniche desctitte in un precedente lavoro (TENTORI et al., 1965).

Elettroforesi su gel d'amido e su gel di poliacrilamide. - Gli esperimenti di elettroforesi su geJ d'amido erano eseguiti secondo la tecnica di SMITHIES (1955) con un sistema discontinuo di tamponi tris-borato a pH 9,0 secondo HUISMAN (1960) alla t emperatura di 5° C (CARTA & SoRCINI, 1965).

L'elettroforesi su gel di poliacrilamide veniva eseguita in sistema ver­ticale su colonna, secondo la tecnica della elettroforesi discontinua di 0RN­STEIN & DAVIS (1959), con le modificazioni descritte in un precedente lavoro (MASSA, TENTOR1 & VIvALOI, 1967) ; la separazione elettroforetica avveniva ad un pH effettivo di circa g,o.

RISULTATI

La Fig. l e la Fig. 2 dimostrano gli elettroferogrammi ottenuti sotto­ponendo ad elettroforesi su gel d'amido ed ekttroforesi discontinua rispetti­vamente le emoglobint purificate di uomo (N. l), di Macaca mulatta (N. 2), di cavia (N. 3), di cavallo (N. 4), di bue (N. 5), di pecora (N. 6) e di coniglio (N. 7). Dal confronto delle due figure risulta evidente che la mobilità elettro-

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foretica e le separazioni ottenute con i due supporti possono essere consi­derate corrispondenti. Le emoglobine di scimmia, cavia, bue, pecora e coniglio appaiono omogenee ed hanno una mobilità elettroforetica simile alla emo­globina A umana, ad eccezione della emoglobina di coniglio che può essere

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Fig. l. - Elettroforesi su gel d'amido delle emoglobine di uomo (N. l), Macaca mulatta (N. 2), cavia (N. 3), cavallo (N. 4), bue (N. 5), pecora (N. 6) e coniglio (N. 7). Sistema discontinuo di tamponi tris-borato pH 9,0.

classificata come una emoglobina lenta . L'emoglobina dei due esemplari di cavallo esaminati è stata invece tisolta in due componenti che rappresen ­tano percentualmente il 44 % per la frazione lenta ed il 56 % per la frazione rapida.

t + Fig. 2. - Elettroforesi su gel di

poliacrilamide d e Il e emoglobine di uomo (N. 1), Macaca m&datta (N. 2), cavia (N. 3), cavallo (N. 4 ), bue (N. 5), pecora (N. 6) e coniglio (N. 7) ; p H 9,0.

La Fig. 3 rappresenta l 'elettroferogramma della emoglobina di pollo (N. 2) su gel d'amido in paragone con quello della emoglobina umana nor­male (N. l), e la Fig. 4 i corrispo~denti elettroferogrammi ottenuti con la tecnica della elettroforesi discontinua. Nelle condizioni del presente espeti-

.&nn. I si. Super. Sanità (1967) 3 , 501-514 .

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mento l'emoglobina di pollo dimostra una mobilità notevolmente inferiore a quella della emoglobina umana. Inoltre, mentre su gel d'amido è evidente la separazione della emoglobina di pollo in un componente maggiore e due

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Fig. 3. - Elettroforesi su gel d'amido delle emo­globine di uomo (N. l) e di pollo (N. 2) . Sistema di tamponi tris-borato pH 9,0.

romponenti minmi, con la tecnica della elettroforesi discontinua si mette in evidenza un solo componente minore.

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Fig. 4. - Elettroforesi su gel di poliacrilamide delle emoglobine dj

uomo (N. 1) e dj pollo (N. 2) ; pH 9,0.

Nella Fig. 5 e nella Fig. 6 vengono riportate le separazioni che si otten­gono sottoponendo ad elettroforesi su gd d'amido e rispettivamente ad elettrofmesi discontinua gli emolisati di Rana esculenta L. (N. 4) e di Amby­stoma trigrinum Green nello stadio neotenico (N. 2) e metamorfosato (N. 3) sempre in paragone con l'emoglobina umana (N. l). Le due specie di anfibi, appartenenti rispettivamente agli anuri e agli urodeli, hanno una emoglo­bina eterogenea con ambedue le tecniche. L'emoglobina di rana viene risolta

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in due componenti che hanno una mobilità clettroforetica maggiore della emoglobina umana ; questo quadro elettroforetico non presenta variazioni sia quando l'esperimento vien~ eseguito con l'emolisato di un singolo esem-

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Fig. S. - Elettroforesi su gel d'II.IDido delle emoglobine di uomo (N. 1), Amby~toma tigrinum Green nello stadio neotenico (N. 2) e metamorfosato (N. 3) e di Rana c~culenta L. (N. 4). Sistema discontinuo di tamponi tris-borato pH 9,0.

plare, sia quando l 'emolisato rappresenta il « pool ,, del sangue di più esem­plari. Anche il rapporto peiceiituale fra i due componenti, <>he rappresen­tano rispettivamente il 60 % e il 40 % dell'emoglobina totale, non suhisce variazioni . Anche nel caso di Ambystoma tigrinum Green si osserva una etero-

+ Fig. 6. - Elettroforesi su gel eli poliacrilamide

delle emoglobine di uomo (N. 1). Amby· storna ligrinum Green nello stadio neo· tenico (N. 2) e metamorfosato (N. 3) e di Rana esculenta L . (N. 4.) ; p H 9,0.

geneità per la presenza di due componenti, dei quali uno con mobilità maggiore ed il secondo con mobilità minore della emoglobina A umana. I rapporti quantitativi fra i due componenti sono dell'SO % e del 20 % sia nel caso dell'animale neotenico che nel caso dell'animale metamorfosato. Sia dal punto di vista del quadro elettroforetico che da quello dei rapporti fra i due

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componenti 1 risultati non cambiano se si opera sull'emolisato di un singolo individuo o sul 11 pool ,, del sangue di .Più individui. Il confronto fra l'elettro· ferogramma dell'emoglob:na di Ambystoma tigrinum nella fase neotenica e quella dell'emoglobina di Ambystoma tigrinum dopo la metamorfosi mette d'altra parte in evidenza che i due componenti dell'emoglobina d1:ll'animale neotenico hanno una mobilità elettroforetica differente da quella di ambedue i componenti dell'emoglobina dell'animale metamorfosato.

DISCUSSIONE

A) Eterogeneità dell'emoglobina nelle specie esaminate.

Cavallo. - L'et erogeneità dell'emoglobina di cavallo è stata ampiamente riportata in letteratura (GRATZER & ALLISON, 1960). PERUTZ et al. (1959) hanno dimostrato che la differenza fra i due componenti dell'emoglobina di cavallo è situata in uno solo dei peptidi triptici solubili e consiste quindi n ella sostituzione di un solo amminoacido. Recentemente KILMARTIN & CLEGG (1967) hanno stabilito che la differenza &a i due componenti, rapido e lento, risiede n el residuo 60 della catena polipeptidica oc rappresentato da un residuo lisina nel componente lento e da un residuo glutammina nel com· ponente rapido. Questi autori hanno inoltre potuto dimostrare mediante l'analisi dei peptidi triptici che in alcuni cavalli sia il componente rapido eh;. il componente lento sono ete10genei . Essi infatti presentano un solo tipo di catene fj, ma due tipi di catene oc una delle quali con tirosina in posi?.ione 24, l'altra con fenilalanina nella stessa posizione. Esistono inoltre ca valli la cui emoglobina presenta solo tirosina in posizione 24 della catena oc del componente rapido e del componente lento ed ancora altri cavalli la cui emo­globina presenta solo fenilalanina nella posizione 24 della catena oc di ambe· due i componenti. In altre parole la eterogeneità dcll'emoglob:.Oa di cavallo è solo parzialmente rilevabile con l'elettroforesi, c la presenza costante di due componenti, quando si usi questa tecnica sperimentai·~. è dovuta alla diffe· renza di carica che esist e fra lisina t. glutammina, presenti rispettivamente, come abbiamo visto, ncHa posizione 60 della catena oc del componcnt'! lento c nella omologa posizione della catena a. del componente veloce ; l'elettrofo­resi d'altra parte non è capace di rilevare l'altro tipo di eterogeneità, provo­cata dalla prest..nza di tirosina o fenilalanina in posizione 24 della catena a.

sia del componente rapido che del componente lento poichè non esistono differenze di carica pe~ quesii due ultimi amminoacidi.

L'eterogeneità tirosina/fenilalanina potrebbe essere spiegata con l'esi· stenza di due geni allelici, tanto più che sono stati osservati individui con la sola varietà tirosina ed altri individui con la sola varietà fenilalanina ; questo

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tipo di e terogeneità potrebbe· essere quindi classificato come eterogeneità di tipo genetico secondo Jones e, sebbene gli autori esprimano qualche per­plessità, è questa ancora la spiegazione più plausibile. L 'et erogeneità lisina/ glutamina, quella cioè dimostrabile con t ecniche elettroforetiche, appan· ad un primo esame· essere dovuta alla presenza di due geni non allelici adia­centi , poichè non sono stati osservati mai individui omozigoti p«'r la lisina o per la glutammina, cioè con un solo componente dimostrabile con tecniche elettroforetiche, pur essendo il numero dei casi riportati in letteratura piut­tosto elevato. In questo caso talt' eterogeneità dovrebbe essen· classificata come eterogeneità per presenza di componenti minori secondo Joncs, del tutto analoga alla eterogeneità A (ot2 ~2 )/A2 (ot2 ~ 2) della emoglobina umana dovuta a due geni ot t' ò non allelici cd adiacenti (LEHMANN & ~UNTSMAN, 1966). Tuttavia la presenza in alcuni cavalli di tirosina e fenilalanina in posizione 24 della cat ene ot sia del componente rapido cht• del componente lento rende questa interpretazione poco plausibile poichè essa dovrebbe sottointenderc chP mutazioni indipcndPnti ma identichP abbiano a vuto luogo nello st esso codone di due geni differenti. P er ovviare a questa difficoltà sarebbe necessario ammettere che l'etcrogen P.ità lisina-glutammina sia do­vuta ad una ambiguità nella traduzioni' di un codone del RNA m essaggero analoga a quella postulata da RIFKI N, RIFKIN & KoNISBERG (1966) per spie­gare l'eterogeneità della emoglobina di un ceppo selezionato di topini f' da VoN EBRENSTEIN (1966) per spiegare la presenza di differenti cat ene ot nella emoglobina di coniglio. Qualora questa seconda interpretazione venisse pro­vata sperimentalmente sarebbe necessario aggiWlgere una quarta classe di et erogeneità a quelle ammesse nella classifica di Jones :eterogeneità per ambi­guità nella traduzione del codice genetico.

Macaca mulatta. - L'emoglobina di Macaca mulatta è risultata omo­genea nei due esemplari esaminati ; il dato è in accordo con quanto è stato riportato da MASIAR, TELEHA & VNEK (1963) mentre SniKAYA (1966) ha osservato n egli emolisati della st essa specie la presenza di due componenti. Nei due lavori citati non viene però riportato il numero dei soggetti sull 'emo­lisato dci quali è stata compiuta l 'indagine. CRAWFORD (1966) ha dimostrato che l 'emoglobina di una specie molto vicina, Macaca nemestrina, presenta una e·i:erogeneità genetica secondo la classificazione di Jones . Infatti, in una indagine estesa a 75 esemplari di questa specie, ha messo in evidenza tre dif­ferenti fenotipi : uno con un solo tipo d i emoglobina avente mobilità elet­troforetica corrispondent e a quella della emoglobina A umana, un secondo anch'esso con un secondo tipo di emoglobina elettroforeticamente più ra­pida, e finalmente un t erzo fenotipo che presenta ambedue le emoglobin e. Questi dati, in sieme ai risultati · d i esp erimenti di incrocio fra i due fenotipi con un solo tipo di emoglobina, dimostrano che in Macaca nemestrina esi-

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stono due tipi di emoglobina trasmessi ereditariamente da due geni allelici. Allo stato attuale, sulla base dei dati riportati nel presente lavoro e dci risul­tati del lavoro di MASIAR, TELEnA & VNEK (1963) e di SHIKAYA (1966), non è possibile stabiliu se anche nella specie JVlacaca mulatta l 'emoglobina pre­senti una eterogeneità di questo t ip él .

Bue. - L 'emoglobina di bue risulta omogenea nei due esemplari esa­minati ; il dato è in accordo con quanto riportato in letteratura (GRATZER & ALLISON, 1960; LEHMANN & H uNTSMAN, 1966) p t>r i bovini curopci ed africani; è noto tuttavia che i bovini indiani presentano spesso un secondo componente più veloce. Ora è noto ch e nell'Inghilterra meridionale c nel J ersey (LEHMANN & HuNTSMAN, 1966) si trovano alcuni bovini con una emo­globina di tipo indiano, eterogenea cioè per la presenza di un componente più veloce ; questa eterogeneità è probabilmente dovuta ad incroci con bo­vini delle razze asiatiche, incroci che hanno dato luogo anche in questo caso ad una eterogeneità di tipo genetico secondo Joncs.

Pecora. - Ancne l'1•moglobina di pecora è risu ltata omogenea c con la stessa mobilità della emoglobina umana A nei due esemplari esaminati nel presente esperimento . È ben noto dalla letteratura (GRATZER & ALLISON, 1960; LEAMANN & H uNTSMAN, 1966) che l'emoglobina tli pccora è etero­genea per la presenza di due componenti indicati come emoglobina A ed emoglobina B. Anche in questo caso si tratta di una et erogeneità di tipo gen etico secondo la classificazione di Jones ed infa1ti sono stati osservati tre differenti fenotipi, uno con sola r moglobina A, un secondo eon la sola emo­globina B ed un terzo con le due cmoglobint' A e B (BEALE et al., 1966 ; BoYER et al., 1966) ; nella peco ra esiste inoltn· un secondo tipo di etPro· geneità per la prl.!senza di un componente minore denominato emoglobina C che è sempre presente negli esemplari i cui emolisati contengono emoglo­bina A t' che quindi viene trasmesso ereditariamente da un gene conca­tenato con quPllo che trasmett·:> il ca rattere emoglobina A. L 'emoglobin a B di pecora presenta la stessa mobilità elettroforetiea della emoglobina A umana <' quindi l'emoglobina messa in t•videnza n1•l presente esperimento è classificabile rome emoglobina B, cd infatti il componenti• minore C non risulta presentt•.

Pollo.- Mentre nei casi fin qui t"8a mina ti l'elettroforesi su gel d 'a mido t· l'elettroforesi discontinua hanno portato a risultati t"quivalcnti, nrl caso dcll 'cmogloh iua di pollo l'elettroforesi su gel d 'amido ha rivdatu la presenza di due componenti minori, mentre l'elettroforesi discontinua ne ha messo in evidenza uno solo. Evidentemente La seconda tecnica permette in questo caso una risoluzione meno efficace di quella che si ottiene .·u gel d'amido ; d'altra parte il dato ottenuto con l'cl!'ttroforesi su gel di amido conferma

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510 ESPERIENZE E RICERCHE

quanto è stato osservato da MuLLER (1961) sottoponendo l'emoglobina di pollo a cromatografia su Amberlite IRC-50, da SCRNECK et al. (1963) mediante cromatografia su CM-cellulosa ed elettroforesi su blocco d'amido e da MAT­SUDA & TAKEI (1963) mediante cromatografia su CM-cellulosa . È quindi molto probabile che i componenti minori della emoglobina di pollo siano effettivamente due, anche se la elettroforesi discontinua sembrerebbe pro­vare il contrario ed occorre qui sottolineare la necessità da usare sempre più di una tecnica per stabilire se una particolare proteina è o no omogenea. Comunque l'et erogeneità dell'emoglobina di pollo piò essere classifir.ata se­condo la dizione di Jones come una eterogeneità per presenza di componenti minori, poichè sia nel caso della elettroforesi su gel d'amido che in quello della elettroforesi discontinua due componenti minori o u n solo componente minore, rispettivamente, sono risultati sempre presenti negli emolisati di tutti gli esemplari esaminati, che nel presente esperimento sono stati sei .

cc Rana esculenta )) L. e (( Ambystoma tigrinum )) Green. - La costanza dei risultati ottenuti nelle separazioni eseguite su emolisati di singoli esemplari di Rana esculenta e di Ambystoma tigrinum o di << pool )) di sangue di numerosi esemplari della stessa specie permette di classificare l'eterogeneità della emo­globina di queste due specie come eterogeneità per presenza di componenti minori secondo J ones. CHIEFFI, SrNISCALCO & ADINOLFI (1960), usando la t ecnica della elettroforesi su carta, hanno osservato nella rana questo tipo di eterogeneità. La diversa mobilità elettroforetica delle emoglobine di Amby­stoma tigrinum in fase neotenica nei confronti di quella dell'emoglobina del­l'animale metamorfosato indica che durante la metamorfosi l'emoglobina di A mbystoma tigrinum subisce cambiamenti strutturali come del resto è stato confermato da altri dati sulla struttura delle emoproteine di questi animali nelle due fasi della loro vita (TENTORI et al. , 1967). Le presenti osservazioni indicano che i cambiamenti strutturali riguardano ambedue i componenti dell 'emoglobina. L'esistenza di un tipo di emoglobina caratteristico della fase larvale e di un secondo t ipo caratteristico della fase metamorfosata è un esempio di eterogeneità di maturazione della emoglobina. Per analogia con quanto avviene nell'emoglobina umana fetale si potrebbe supporre che i geni strutturali dell'emoglobina di Ambystoma tigrinum nella fase n eotenica siano soggetti ad un meccanismo di controllo comune che ne sopprime la funzione nel momento in cui i geni strutturali dell'emoglobina di Ambystoma tigrinum in fase metamorfosata vengono attivati.

B) Criteri di classificazione dell'eterogeneità dell'emoglobina.

I risultati sperimentali che abbiano fin qui esposti offrono alcuni esempi di emoglobine multiple in differenti specie animali che possono essere classi­ficati nei tre tipi di eterogeneità distinti nella classifica di Jones ; tuttavia

Ann. lat. Super. Sanità (1967) 3, 50 1·514.

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è opportuno fare subito alcune osst.rvazioni a questo proposito. Infatti sia la dizione et erogeneità genetica che la dizione et erogeneità per presenza di componenti minori sono improprie e possono dar luogo ad equivoci.

Effettivamente tutti i tipi di et erogent it? distinti da Jones sono prodotti con un meccanismo genetico poichè la struttura delle different i emoglobine è sempre la traduzione di una informazione che viene trasmessa dal mat eriale genetico presente e caratteristico della specie cui l 'emoglobina appartiene ; è quindi evidente l' improprietà del t ermine et erogeneità genetica per desi­gnare un particolare tipo di eterogeneità.

In realtà, parlando di eterogeneità genetica , Jones int ende riferirsi a quel tipo di et erogeneità della emoglobina det erminata dalla presenza negli individui di una dat.a specie di due o più geni allelici p er mezzo dei quali i due o più tipi di emoglobina vengono trasmessi come caratteri mendeliani indipendenti . Gli esempi di et erogeneità genetica più conosciuti quando Jones propose la sua classificazione erano rappresentati dalle emoglobine an omale umane ; pertanto il concetlo di et erogeneità genetica è legato alla presenza di emoglobine diverse negli emolisati di due differenti individui. In questi casi le emoglobine differiscono nella loro struttura a livello di un solo ammi­noacido per ciascuna coppia di subunità e quindi di due amminoacidi per ciascuna molecola di emoglobina. Una differenza di entità cosi limita ta è provocata da una singola mutazione nel materiale genetico il quale deter­mina la struttura della corrispondwte subunità della emoproteina. Quindi la presenza di una delle due emoproteine in alcuni membri di una dat a specie, dell'altra in altri membri della st essa specie c di tutte e due nei rest anti indi­vidui della specie, dimostra che quest e emoglobine sono determinat e da due geni allelici di cui uno è sorto appunto per effetto di questa sin gola mutazione. Come abbiamo visto, an che le emoglobine di pecora, di bue e di Macaca nemestrina debbono essere classificate fra le emoglobine che presentano una eterogen eità genetica ed a questo punto è necessario sottolineare che in questi casi le due o più varianti presentano delle differ enze ben più est ese. Un esem­pio tipico è rappresentato dall 'emoglobina di pecora, delJa quale è stata re~ntemente det erminata la struttura primaria ( BOYER et al., 1966) e nella quale le differen ze fra la catena ~ della emoglobina A e quella della emoglo­bina B sono localizzate a livello di 7 aminoacidi ed implicano da 7 a 9 muta­zioni del materiale genetico .

Il t ermine et erogeneità per presenza di componenti minori è improprio perch è si limita a definire le caratteristiche di un fenotipo senza t ener conto del meccanismo genetico che lo det ermina . An che in questo caso l'esempio meglio conosciuto è rappresentato dalla emoglobina dell'uomo normale adulto ch e, come è n oto, presenta due componenti :l'emoglobina A e l'emo­globina A1 che rappresentano il 98 % ed il 2 % rispettivamente del totale ; come abbiamo vist o, anche le emoglobine di cavallo, per la quale i r apportl

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fra i due componenti sono del 56 % t' dd 44 %, d i Rana esculenta, con u11 rapporto fra i du t> eomponf'n ti dPI 60 °~ e df' l 40 °~,, di Amb_ystoma tig rinum. con un rapporto fra i due• componenti dell'SO % e• dd 20 %, t' di pollo con ra pporti {ra i t t e· componenti di 7S %, Hl 0

0 e J 5 °,0 debbono essi' n classi­ficati' come· rterogt•n ce per prl'se•n7.a di componenti minori , ed in effetti, pur con notevoli differenze rispetto all 'emoglooina uman a nd contC'nuto pcrcen­tualt· clt•i componenti, ciascun a di q ucstt· emoglot>int' presf'nta un compo­nenti' minon· . Tuttavia, e qursto puù c·!'sen · <:ausa d i confu sione, t>sistono dci fc•notipi con un l'o m ponen te· minort· eh<' sottin t«> nrlono un me·ccanismu genetico completamenti· differ«>nh·, basti ricordart• la f'tl'rogeneità dell 'emo­globin a uma na per pre!'enza di emoglobitw anoma lt• che dcvt• PSSt'rt' clal'si­ficata com e· eterO{{en<'ità genetica; ad c:se•mpio (TF.NTORJ f't al. , 1'967) i rap­porti fra emoglobina A ecl emo~lobina Beilinson sono dc•l 65 °·0 c 35 %, fra emoglobin a A t•d emoglobina D1'uujnlt d i' l 58 % c• 42 %, fra c•moglobina A cd emoglobina S dci 59,3 % c 40,7 % c così , -ia ; in tutti quc·sti casi la prt·­senza clc·IIP emoglobine· anomale in pt'rCPntuali minori risulta d alla minort· t:'Sprcssività dc·i geni , -arianti rispctto all"allPII' normalt•. Tn n•altà, come• è stato dctto so p t a, l'e·terogencità classificata da .l one·s eome cterogenc•ità JWr pn·senza di compont•nt.i mino1 i è do vuta alla prt'st•nza negli individui di una spc•cic• di due· grni r lw nt·ll'uomu si è dimostrato essc·re concat enati (ed è probabi li' lo sian o ancht• negli altri animali) i quali determinan o un ft·notipo con dur differenti emoglobi ne, !;{'mpn prt·senti negli individui di quella SJI I'Cie negli stessi r a pporti , rapport i cht · possono ov,·iaml'ntt' essen · differenti in SJW(ie divcrse.

Il t ermine rtrrogencit à di maturaziotH: intlnt• appart• a ppropriato poi chè effettivaml'ntr una talt· e tNogcnt>ità si manifesta in una fase di maturazionl' clell' individuo come quella del passaggio dalla vita embrionali' (emoglobina l'mbrionalc) alla vita fetalr (emoglobina fetali') e da quest a a lla vita extra­uterina n ell ' uomo P n ei mammiferi t' del passaggio dalla vita !arvale alla vita adulta, cioè nrl corso della metamorfosi, negli anfibi. È bene a questo punto sottolineare che l'etrrogcneità di maturazione è riscontrabile n el feno­tipo solo in det erminati periocli della vita eli un individuo, c precisam ente' nella fase embrionale dello sviluppo, nell' ultimo }JI'riodo della vita intran­t erina e nel primo vcriodo della vita extrauterina nell'uomo e nei mammiferi, nel cor so della mt>tamorfosi n egli anfibi, come ad esrmpio in R ana catasbeiana (BAGLIONI & Sl'ARKS, 1963) e presumibilmentl' per analogia in A mbystoma

tigrinum. Almeno nell' uom o la eterogen eità di maturazionc è sost enuta dalla presenza nell'indi viduo di geni differenti che det erminano la proclu1.ion e di tre tipi differenti di emoglobina : quella cmbrionalt•, quella fetale c quella adulta, che differiscono fra lorg in una coppia di suhunità, essendo l'emoglo­bina embrionale costituita da due catc·ne polipeptidiche a. e due catene poli­prtidichr e:, quella fetali' da dut· catf•nr polipetidiche a. c da due cat en e poli-

. -1t111 . l sl. SIIJicr. Sa~tilrì ( I!H;7) 3 , 5111 -51~ -

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peptidiche y, mentrt.- l'adulta è costituita da due catene oc e da due catene ~ ; nella vita intrauterina sono funzionanti i geni che det erminano le catene e: prima e quelli che determinano le catene y in seguito, mentre quelli che det er· minano la struttura dt.lla catena ~ sono silenti, nella vita extrauterina accade il contra1io ; la et erogeneità di maturazione si osserva nel periodo di . transi­zione poichè gli eritrociti conten~ono in questo periodo sia l'emoglobina adulta che quella fetale .

In conclusione, la classificazione dei vari tipi di eterogeneità della emo· globina elaborata da Jones è senza dubbio valida poichè ciascuna delle classi propost e sottointende un meccanismo differente n ella produzione di tale et erogen eità ; comunque, ad evitare confusione, sarebbe opportuno speci· fìcare con maggiore preci!!ione il meccanismo genetico responsabile dei vari tipi di et erogen,:ità distinguendo una eterogeneità di maturazione, una et ero· geneità genetica da geni allelici ed una eterogeneità per presenza di compo­nenti minori da geni duplicati ed eventualmente concatenati. Infine sarà probabilmente necessario introdurre una quarta classe di et erogeneità : )'et erogeneità da ami...iguità nella traduzione dd codice genetico.

19 giugno 1967.

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