espectroscopía de emisión molecular - módulo...

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Espectroscopía de emisión

molecular

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RELAJACION RADIATIVA:

LUMINISCENCIA

emisión de luz desde un estado excitado

electrónico

FLUORESCENCIA

Estado excitado singulete, transición

permitida, tiempos cortos, del orden de

10-10 a 10-7 segundos.

FOSFORESCENCIA

Estado excitado triplete, transición

prohibida, tiempos largos, mayores a

10-6 segundos, y hasta horas.

QUIMIOLUMINISCENCIA

Cualquiera de los anteriores si se alcanza

el estado excitado por una reacción

química. (Palitos de luz en recitales,

Luminol, bichos de luz, Noctiluca, etc.)

RELAJACION

NO RADIATIVA

no se emite luz, sino que el estado

excitado decae a traves de mecanismos

vibracionales y rotacionales

CONVERSION INTERNA

de un estado electronico a otro en tiempos

del orden del 10-12 segundos.

RELAJACION VIBRACIONAL

dentro de un estado electronico en tiempos

de 10-12 a 10-10 segundos.

fotones emitidos

Rendimiento (Q) = <1

fotones absorbidos

RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA (Q):

Aquellas moleculas que decaen rapidamente por relajacion no

radiativa tienen menos fluorescencia. Por eso las moleculas mas

fluorescentes suelen ser rígidas y/o estericamente impedidas de

rotar y vibrar.

Si tenemos que:

entonces Q = kf / (kf + kd )

= constante de velocidad de emisión

= constante de velocidad de decaimiento no radiativo

kf

kd

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= tiempo de vida intrínseca o natural,

sin ningún proceso no radiativo

TIEMPO DE VIDA INTRINSECO DE LA FLUORESCENCIA:

es el tiempo de vida si sólo volviera al estado basal por fluorescencia

Hay equipos para medir tiempos de vida de fluorescencia, que son

muy utiles en análisis químico.

Tambien hay microscopios de tiempos de vida de fluorescencia.

τn = 1 / kd

= tiempo de vida experimental

TIEMPO DE VIDA EXPERIMENTAL: tiempo promedio que un fluoróforo

pasa en el estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía)

τ = 1 / (kf + kd )

Fluorómetro de 2 monocromadores

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Fluorómetro de 1 monocromador

y detector de matriz de diodos

Fluorómetro con fuente de luz

monocromática

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Fuentes de luz

• Lamparas de Xenon,

continuas y pulsadas

• Lamparas de Hg

• Hg / Xe, fuertes en el

UV

• Lamparas de filamento

(malas)

• LEDs

• Laseres

Lamparas de arco de Xe

UV

Ozone Free

Visible

Lamparas de arco de Hg/Xe

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Light Emitting Diodes (LED)

350 nm to 1300 nm

390-405 nm,

UV cercano

Laseres

Helium-cadmium Nd-

YAG

doblado

532 nm

Diodo

laser

rojo

200 300 400 500 600 700

Wavelength (nm)

295nm

325nm

351 nm

364 nm

445nm

650 nm

576nm

Titanium:Sapphire

690 nm – 990 nm Blu-Ray

laser 405

nm

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Diodos Laser

Diodos Laser:

405 nm Violeta (Blu Ray)

445 nm Azul (diodo)

473 nm Azul (Nd-YAG)

532 nm Verde (Nd-YAG)

588 nm Amarillo

635 nm Rojo (diodo)

no es un diodo:

700-1000 nm IR (TiSa)

Detectores

Scallop

Image courtesy of BioMEDIA ASSOCIATES http://www.ebiomedia.com

Scallop Eyes

From http://www.eyedesignbook.com/index.html

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APD

El fotodiodo de avalancha es muy

rapido, chiquito, robusto, sirve para

contador de fotones y tambien en

régimen lineal (analógico). Tiene

buena respuesta en el IR cercano.

El fotomultiplicador (PMT) es

voluminoso, rápido y precisa de una

fuente de muy alta tension (1000 V).

Sirve para contador de fotones y en

regimen lineal. Tiene mejor respuesta

a cortas longitudes de onda.

dinodosfotocátodo

λ

Fuente de 1000

a 2000 Volts

e-anodo

Salida de

corriente

e-

e-e-

divisor de tension hecho con resistencias

e-

e-e-e-

e-e-

e-

e-e-

Vacío

El PMT clásico

Window

13

Photon Counting (Digital) y detección analógica

Primary Advantages:

• Sensitivity (high signal/noise)

• Increased measurement stability

Primary Advantage:

• Broad dynamic range

• Adjustable range

Sig

nal

time

Constant

High Voltage Supply

Discriminator

Sets Level

PMT

TTL Output

(1 photon = 1 pulse)

PMTVoltage Supply

Computer

Anode Current

=

Pulse averaging

Medición

Photon Counting: Analog:

level

Ocean Optics Red Tide 650

1 - Entrada de fibra óptica

2 - Rendija única (entrada)

3 - filtro de entrada

4 - espejo enfocador 1

5 - red de difracción

6 - espejo enfocador 2

7 - lentecitos (opcionales)

8 - detector de array dediodos

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Ocean Optics Red Tide 650

12 bitsA/D

650 señales

analógicas

procesadorinterno USB

Detector Sony ILX511 CCD

No. of elements 2048 pixels

Sensitivity 75 photons per count (at 400 nm)

Pixel well depth ~62,500 electrons

Signal-to-noise ratio 250:1 (at full signal)

A/D resolution 12 bit

Dark noise 3.2 RMS counts (RMS = σ)

Corrected linearity >99.8%

Optical resolution ~2.0 nm FWHM

Stray light <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm

Dynamic range:

2 x 108 (system); 1300:1 for a single acquisition

Data transfer rate: Full scans into memory every

13 milliseconds with USB 2.0 port

Integration time: 10 microseconds to >60

seconds (detector's limit is ~15 sec)

Desde la fuente de luz a la

medición

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mediciónEfoton = hc/λ

λ = 405 nm

h = 6.62x10-34 J.s

c = 3x108 m.s-1

Efoton = 4.9x10-19 J

Ifuente = 0.1 mW de luz

= 10-4 W = 10-4 J.s-1

= 2.04x1014 fotones/s


mediciónde los 2.04x1014 fot/s,

solo el 1% llega al centrode la cubeta, porque el

LED lanza luz en un

angulo amplio.

Quedan 2.04x1012 fot/s

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mediciónExcitacion efectiva:

2.04x1012 fot/s

Absorbancia = 0.1

Transmitancia T = 10-A = 0.794 = 79.4%

Fracción absorbida = 1 - T = 0.206 = 20.6%

absorbió 4.20x1011 fot/s


medición

absorbió 4.20x1011 fot/s

eficiencia cuantica de fluorescencia = 0.22

emision = 9.24x1010 fot/s

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medición

emision = 9.24x1010 fot/s

pero solo una minima fracción pasa por elagujero de 2 mm a la entrada del instrumento!


medición

emision total = 9.24x1010 fot/s

emision que entra = 2.57x107 fot/s

distancia al

agujero = 3 cm

Area esfera de

3cm de radio =

4πR2 = 113 cm2

Area agujero =

πr2 = 0.031 cm2

fracción de luz

que entra =

0.00028 (0.03%)

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medición

emision que entra =

2.57x107 fot/s

Ancho de banda de la

fluorescencia = 150

nm, se divide entre

150 partes del sensor,

aprox. 197000 fotonespor cada una (aunque

a los centrales les toca

mas que a los bordes)


medición

197000 fotones por

cada parte del sensorcorrespondiente a un

nanometro, a 75

fotones por cuenta

(especificacion del

sensor del equipo) =

2630 cuentas / nm (si

dejamos que la luz se

capte durante 1

segundo).

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La absorbancia de la muestra atenúa la entrada

de la luz de excitación

Efecto de filtro interno

Rhodamine B

from Jameson et. al., Methods in Enzymology (2002), 360:1

epsilon [F]/um Abs Abs /2 T 1-T

20000 0 0 0 1 0

1 0.02 0.01 0.9772 0.0228

2 0.04 0.02 0.955 0.045

3 0.06 0.03 0.9333 0.0667

4 0.08 0.04 0.912 0.088

5 0.1 0.05 0.8913 0.1087

6 0.12 0.06 0.871 0.129

7 0.14 0.07 0.8511 0.1489

8 0.16 0.08 0.8318 0.1682

9 0.18 0.09 0.8128 0.1872

10 0.2 0.1 0.7943 0.2057

11 0.22 0.11 0.7762 0.2238

12 0.24 0.12 0.7586 0.2414

13 0.26 0.13 0.7413 0.2587

14 0.28 0.14 0.7244 0.2756

15 0.3 0.15 0.7079 0.2921

16 0.32 0.16 0.6918 0.3082

17 0.34 0.17 0.6761 0.3239

18 0.36 0.18 0.6607 0.3393

19 0.38 0.19 0.6457 0.3543

20 0.4 0.2 0.631 0.369

21 0.42 0.21 0.6166 0.3834

22 0.44 0.22 0.6026 0.3974

23 0.46 0.23 0.5888 0.4112

24 0.48 0.24 0.5754 0.4246

25 0.5 0.25 0.5623 0.4377

26 0.52 0.26 0.5495 0.4505

27 0.54 0.27 0.537 0.463

28 0.56 0.28 0.5248 0.4752

29 0.58 0.29 0.5129 0.4871

30 0.6 0.3 0.5012 0.4988

31 0.62 0.31 0.4898 0.5102

32 0.64 0.32 0.4786 0.5214

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.5 1 1.5 2

absorbancia

flu

ore

sc

en

cia

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 0.1 0.2 0.3

absorbancia

flu

ore

sc

en

cia

Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo

Efecto de filtro interno

Se usan concentraciones con absorbancia menor a 0.1

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Geometría de la medición de fluorescencia

Tiempos de vida

La La luminiscencialuminiscencia decaedecae exponencialmenteexponencialmente

τ = 1 / (kf + kd )

L

t

LL etτ

−

Φ=Φ0)(

τ

Φ

(t)Φ

L

0

L

L emisionemision a a tiempo tiempo = t= t

emision emision a a tiempo tiempo = 0= 0

tiempo tiempo de de vida vida experimentalexperimental

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Midiendo tiempos de vida obtenemos

informacion valiosa

Quenching Quenching estatico estatico ((formacion formacion de de complejoscomplejos):):

El El fluoroforo fluoroforo se se une une a a una molecula una molecula “quencher”, y “quencher”, y el complejo formado el complejo formado no no esesemisivoemisivo. . Solamente el fluoroforo Solamente el fluoroforo no no unido puede emitir luzunido puede emitir luz. Los . Los tiempos tiempos dedevida vida son son los mismoslos mismos, , los correspondientes los correspondientes al al fluoroforofluoroforo..

Quenching Quenching dinamico por mecanismodinamico por mecanismo de de Förster Förster (FRET): (FRET):

Un aceptorUn aceptor de de energía cerca energía cerca ( (peropero no no tanto tanto)) del fluoroforo del fluoroforo le “come” le “come” su suenergia por un mecanismoenergia por un mecanismo de de acoplamiento dipolo acoplamiento dipolo--dipolodipolo. Al. Al fluoroforo fluoroforo se se lo lollama “donor” y al quencher “llama “donor” y al quencher “aceptoraceptor”. La ”. La constanteconstante de energy transfer de energy transfer caecaecomo como RR-6-6. Se . Se usausa muchomucho en en estudiosestudios biológicosbiológicos..

QuenchingQuenching dinámico dinámico ( (colisionalcolisional):):

LaLa molecula molecula quencher quencher colisiona colisiona con con el estado excitado del fluoroforo el estado excitado del fluoroforo y le y le hace haceperder su energiaperder su energia en forma no en forma no radiativa radiativa. El. El tiempo tiempo de de fluorescencia fluorescencia se reduce se reduceporque kporque knrnr aumenta aumenta,, ya que ya que hay hay una nuevo paso una nuevo paso de de desactivacion desactivacion..

Quenching estatico

La emision decae con la concentración de quencher.

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Quenching dinámico

¿ que tipo de quenching es ?

estáticodinámico

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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

http://http://www.olympusfluoview.com/applications/fretintro.htmlwww.olympusfluoview.com/applications/fretintro.html

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