enzimas - biotecnología 2.1

ENZIMAS

BIOTECNOLOGA:

Prof. Adjunta: Dra. Stela Maris da Silva

Modelo genrico de una enzima Modelo de una glucanasa

Parte 2

ENZIMAS Temario de la SEGUNDA Clase REVISIN : ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN

Ecuacin de Lineweaver-Burk

CINTICA ENZIMTICA : Reaccin de orden uno / Reaccin de orden cero ENZIMAS ALOSTRICAS: MODULACIN ALOSTRICA - MODULACIN COVALENTE - Ecuacin de Hill. INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Inhibidores. Inhibicin competitiva, aplicaciones. Inhibicin no competitiva * Inhibicin mista Inhibicin irreversible

Constante de Michaelis-Menten (KM)

Concentracin del sustrato correspondiente

a la mitad de la velocidad mxima.

Enzimas tienen KM caracterstico para un sustrato en dado pH y misma temperatura.

Grado de afinidad entre enzima y sustrato

* Cuanto menor el KM, mayor la especificidad y vice-versa.

*Define la concentracin de substrato que una enzima requiere para

trabajar con eficiencia

En el ao de 1913 Michaelis y Menten formularon las bases de la

cintica enzimtica, para explicar como la concentracin del sustrato

[S] afecta la velocidad de la reaccin v.

La velocidad de la reaccin presenta 3 regiones de comportamiento

diferente, mientras se aumenta la concentracin del sustrato:

-parte a: v aumenta proporcionalmente

con aumento de [S].

-parte b: v aumenta no

proporcionalmente con aumento de [S].

-parte c: v no aumenta proporc.,

tendiendo a un valor mximo

(Vmax), siendo independiente de la [S]

El grfico presenta un conjunto de

reacciones que estn ocurriendo

simultneamente, de acuerdo a las

ecuaciones abajo:

cuando KM es pequeo, k1 es relativamente grande

y la barrera de energa libre para la formacin del

complejo es pequea.

As KM, reflete una habilidad de la enzima en ligarse a

los sustratos y realizar a catlisis.

desaparecimiento

formacin 1

32 )(

k

kkKM

Michaelis - Menten

Km ALTO = BAJA AFINIDAD y Km BAJO = ALTA AFINIDAD

Forma integrada

t

SS

KK

V

S

S

t mm

mx 00 1log3,2

Parmetros Cinticos:

Michaelis - Menten

Inclinacin

Al utilizarse una mayor concentracin de enzima, mayor ser la VMAX utilizndose la misma concentracin del substrato

Vmax es mayor en [E] maior, utilizndose la misma [S]

Michaelis - Menten

aumento en la concentracin de la enzima

aumento en la velocidad de reaccin


Aplicacin:Cuando se

grafica la velocidad de la

reaccin, v0, en relacin a la

concentracin de substrato,

S , no siempre es posible

determinar la condicin en

que se ha llegado a la

velocidad mxima, Vmax,

debido al incremento de la

pendiente en la hiprbola a

concentraciones de

substrato elevadas.

Figura: experimento cintico para la actividad enzimtica

Otro modo de obtenerse los valores de KM y de Vmax es a travs del

grfico de los dobles recprocos (1/V x 1/S), y de la ecuacin de

Lineweaver-Burk.


y = a . x + b Ecuacin

de la recta

Al aplicarse el inverso en ambos

lados de la ecuacin de Michaelis-

Menten, se obtn la ecuacin de

Lineweaver-Burk, que es una funcin

linear (una recta):

Tambin se utiliza para determinar el

mecanismo de accin de los diversos

tipos de inhibidores.

Tang

El intercepto de la recta en el eje x es igual a -1/KM

substituyendo y = 0 en la ecuacin tenemos:

0 = Km . 1 + 1 -1 = Km . 1 Vmax [S] Vmax Vmax Vmax [S]

-1 = Km - 1 = 1

[S] Km [S]

=KM/Vmax

a = coef. angular = Km/Vmax

(tangente ngulo alfa)

b = coef. linear = 1/Vmax

(intercepto en el eje y)

Donde:

y = a . x + b Ecuacin de la recta

Revisando: Es la inversa de la ecuacin de

Michaelis-Menten y representa una ecuacin del

tipo y = ax+ b:

Esa es una ecuacin de recta (y = ax + b) en que la inclinacin (a) es igual a KM/Vmx y el o intercepto (b) es igual a 1/Vmx,

Esa es la modo ms comn de determinar los parmetros cinticos (KM y Vmx).


Parmetros Cinticos: Revisando

Lineweaver-Burk

mxmx

m

VSV

K

V

111

Inclinacin

Ejemplo:

[S] (g/L) Vo (g/L.h)

0,25 0,78

0,51 1,25

1,03 1,66

2,52 2,19

4,33 2,35

7,25 2,57

0,0

1,0

2,0

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

Vo

(g

/L.h

)

Parmetros Cinticos

Parmetros Cinticos

Ejemplo: Lineweaver-Burk

y = 0,228x + 0,3668

R2 = 0,9991

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 1 2 3 4 5

1/[S] (L/g)

1/V

o (

L.h

/g)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

VSV

K

V

m

mx

m

mx

mx

mxmx

m

622,0228,0

73,23668,01

Portanto,

3668,01

228,01

111

0

0

As

:

Mtodo de Hanes SVV

K

V

S

mxmx

m 1

Inclinacin

Parmetros Cinticos

Ejemplo: Mtodo de Hanes

y = 0,3595x + 0,2419

R2 = 0,9993

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 2 4 6 8

[S] (g/L)

[S]/

Vo

(h

)

L

gK

V

K

hL

gV

V

SV

S

SVV

K

V

S

m

mx

m

mx

mx

mxmx

m

672,02419,0

78,23595,01

Portanto,

3595,02419,0

1

0

0

Parmetros Cinticos

As,

Mtodo de Eadie-Scatchard

S

VKVV mmx

Inclinacin

Parmetros Cinticos

CINTICA ENZIMTICA

Relacionada con:

Determinacin cuantitativa de las reacciones que catalizan las enzimas

Estudio sistemtico de los factores que afectan dichas velocidades

Miden la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores

Mecanismos de reaccin

Velocidad de una reaccin bioqumica:

El cambio de la concentracin de un reactante o producto por unidad de tiempo.

Orden de la reaccin:

Relaciona la concentracin del reactante, la

saturacin de la enzima con la velocidad de

la reaccin

A. Cintica de primer orden /orden uno

B. Cintica de orden cero

CINTICA ENZIMTICA

CINETICA DE PRIMER ORDEN/ ORDEN UNO

Cuando la velocidad depende de la primera potencia de la concentracin de un nico reactante y sugiere que el paso limitante de la velocidad es una reaccin unmolecular (no se requieren colisiones moleculares)

A P

La velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato, solo cuando la concentracin del sustrato es baja

La concentracin del reactante es funcin del tiempo ( t ; se consume la mitad del reactante)

Concentraciones muy bajas de sustrato

La reaccin se procesa como reaccin de orden UNO/Primer orden

[S]

Reaccin de Orden UNO

[S]

Determinar S utilizado o P formado durante cualquier

intervalo de tempo Ecuacin integrada de 1 orden.

0

0log3,2 ttkS

S


t1/2 = tiempo de media vida tiempo necesario para convertir en P mitad

del S presente.

kt

693,0

21


CINETICA DE ORDEN CERO

Cuando la adicin de un reactante no altera la velocidad de la reaccin

La velocidad es constante debido a que la concentracin del reactante es lo suficientemente elevada para saturar todos los lugares catalticos en la molcula de la enzima.

Cuando la concentracin del sustrato se hace lo suficientemente elevada de forma que la enzima se satura.

Reaccin de Orden Cero

[S] >> Km

S

SVV mx0

mxVV0La reaccin funciona como reaccin de orden cero.

Altas concentraciones de sustrato.

La velocidad de la reaccin

solamente es proporcional

a [E] cuando la enzima

est saturada, o sea,

reaccin es de orden cero

(independe) en relacin a

[S]

Eficiencia cataltica

Kcat/KM

Parmetro mas

adecuado para

comparaciones

cinticas

- k2 o kcat (constante cataltica) mede el poder cataltico de la enzima

v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1)

[ES] [Etotal]

Para calcular kcat se considera que toda la E existe como ES, y que v=Vmax

Kcat = velocidad limitante de cualquier reaccin enzimas saturadas;

Kcat y Km = ambiente celular, concentracin del sustrato y qumica de la reaccin.

Regulacin de la Actividad Enzimtica

Sistema enzimtico: producto de la reaccin de la 1 enzima sustrato de la enzima subsecuente;

Enzimas reguladoras determinan la velocidad de la secuencia;

Actividad cataltica o seales;

Molculas sealizadoras pequeos metabolitos o cofactores.

Se describe que reacciones catalizadas por

enzimas como reversibles, pero en un

organismo vivo eso normalmente no ocurre.

Ej.: Los productos de una dada reaccin son

rpidamente direccionados para otro

compartimiento celular y as la reaccin

reversa no ocurre.

La actividad enzimtica tambin puede ser

regulada de acuerdo con las tasas de sntesis

y degradacin. Adems la sntesis de enzimas

puede ser estimulada o inhibida. Los productos

formados en una dada reaccin enzimtica

muchas veces pueden funcionar como

inhibidores de la misma reaccin (Figura al

lado). As, cuando hay una gran cantidad de

productos, la actividad enzimtica es reprimida

y as sucesivamente.

Enzimas Alostricas

NO SIGUEN la cintica de Michaelis-Menten

Ligacin no covalente y reversible modulador;

Inhibicin por retroalimentacin: Si el inhibidor es el producto final mecanismo = retrorregulacin o feedback.

Enzima reguladora inhibida por el P final da va reequilibra las necesidades celulares;

Moduladores: inhibidores o activadores/estimuladores.

Enzimas Alostricas

Modulador = sustrato homotrpicas;

Modulador sustrato heterotrpicas;

Presentan Sitio alostrico (adems del sitio activo) especfico para el modulador;

Curva de saturacin sigmoidea subunidades mltiples.

Enzimas Alostricas

curvas de variacin de actividad moduladores inhibidores, activadores o los dos tipos.

1. Enzima Michaeliana 2. Enzima reguladora alostrica

Grfico V x S es una curva sigmoide

En su lugar, se obtiene una curva sigmoidal.

Los efectos alostricos homotrpicos o

heterotrpicos pueden ser positivos (activacin) o

negativos (inhibicin)

Interacciones alostricas homotrpicos son las que ocurren cuando

varias molculas idnticas - por ejemplo, varias molculas del sustrato

- se unen a la protena. Este efecto se denomina como cooperatividad

si el mismo se transmite a los diferentes protmeros de la protena.

Los efectos alostricos heterotrpicos son interacciones alostricas

que ocurren cuando diferentes sustancias - por ejemplo, inhibidor y

sustrato - se unen a la protena; son el efecto de un ligando en la unin

de otro ligando diferente.

Las curvas sigmoideas suelen indicar, una unin cooperativa del

sustrato al centro cataltico de la enzima. Esto quiere decir que la unin

de una molcula de sustrato influye en la unin de las molculas de

sustrato posteriores.

Este comportamiento es el ms comn en las enzimas multimricas,

que presentan varias zonas de interaccin con el sustrato.

El mecanismo de cooperacin es semejante al observado en la

hemoglobina. La unin de una molcula de sustrato a una de las

zonas de interaccin altera significativamente la afinidad por el

sustrato de las dems zonas de interaccin. Las enzimas con este tipo

de comportamiento son denominadas alostricas.

Cooperatividad positiva:la primera molcula de sustrato unida

incrementa la afinidad del resto de zonas de interaccin.

Cooperatividad negativa: la primera molcula de sustrato unida

reduce la afinidad de la enzima por nuevas molculas de sustrato.

Ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva: la aspartato

transcarbamilasa bacteriana y la fosfofructoquinasa y con cooperatividad

negativa, la tirosil ARNt-transferasa de mamferos.

La cooperatividad es un fenmeno bastante comn y puede llegar a ser

crucial en la regulacin de la respuesta enzimtica a cambios en la

concentracin de sustrato.

La cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho ms sensible

a la concentracin de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a

variar en gran medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de

concentracin de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa

hace que la enzima sea insensible a pequeos cambios en la

concentracin de sustrato.

Modelo propuesto por MONOD, WYMAN y CHANGEUX (1965).

La ecuacin de Hill suele ser utilizada para describir cuantitativamente

el grado de cooperatividad en cinticas no michaelianas.

El coeficiente de Hill (n) indica cuntas de las zonas de unin de

sustrato de una enzima afectan a la afinidad de la unin del sustrato

en el resto de las zonas de unin.

El coeficiente de Hill puede tomar valores mayores o menores que 1:

n < 1: indica cooperatividad negativa.

n > 1: indica cooperatividad positiva.

Ecuacin de Hill

El grfico de Hill puede

ser obtenido a travs de la

siguiente relacin:

Se ha verificado

experimentalmente que el

declive, n, no indica el n de

sitios de ligacin (activos) y s

un grado de interaccin

(cooperatividad) entre estos el coeficiente de Hill, nH.

Modificacin Covalente

-Fosforilacin y desfosforilacin - Activacin de zimogenios

Ligacin covalente de un grupo qumico a su estructura;

Metabolismo alterado acciona vas inactivas e inhiben vas activas.

Al contrario de la alosteria en la modulacin

covalente la enzima es modificada covalentemente por

dos otras enzimas: una quinasa fosforila la enzima

empleando ATP, e una fosfatasa remueve el grupo

fosfato de la enzima fosforilada.

La modulacin covalente es energticamente cara, debido a que necesita 2 otras protenas y ATP para

regular la actividad de UNA enzima.

Al contrario, en la alosteria la enzima es controlada por las

concentraciones relativas de sus efectores y la afinidad de la

enzima por estos efectores.

inactiva activa

Fosforilacin - Defosforilacin

quinasa

fosfatasa

enzima

fosfato

sustrato

zimogenos: las proteasas son sintetizadas en una forma inactiva; estn en una conformacin desfavorable, con bloqueo o desajuste de los residuos del sitio cataltico.

conformacin desfavorable: resulta de porciones adicionales de la cadena poli-peptdica, que deben ser retirados para que la protena asuma la forma activa.

Conversin del zimogeno a proteasa activa: puede resultar de la accin proteoltica de otra proteasa, o de alteraciones del pH o temperatura do medio, o

an, de la adsorcin do zimogeno a una superficie negativa. Estos eventos

determinan mudanza conformacional y/o auto-hidrlisis por la propia proteasa.

activacin es irreversible: y por ese motivo energticamente cara para el organismo.

Ativacin de zimogenos

Es un caso especfico de modulacin covalente exclusivo de

algunos tipos de enzimas proteolticas.

ZIMOGENOS

Enzimas de accin

extracelular

zimogenos

Hidrolisis de ligaciones peptidicas

Remocin de residuos de aminocidos

Nueva Estructura Tridimensional

plasma, trato

digestivo

precursores inactivos intracelulares

Transformacin

extracelular

Enzima

Activa

Zimogeno Intracelular

Enzima activa Extracelular

Clivagen proteoltica

Extracelular

Zimogenos (proenzimas) son formas de enzimas

Ellas son activadas por la remocin de secciones de pptidos

Ej.: proinsulina es convertida en insulina por la remocin de

33 a.a de la cadena

INIBICIN ENZIMTICA

La inhibicin enzimtica es importante por varias razones:

Sirve como un mecanismo de control fundamental en los sistemas biolgico permitiendo la regulacin de los caminos

metablicos.

Muchos medicamentos actan inhibiendo enzimas especficas en el cerebro o en los tejidos corporales.

La comprensin del mecanismo de inhibicin enzimtica es, por tanto, esencial. Los propios inhibidores se usan frecuentemente

como herramientas para el estudio del mecanismo de las propias

enzimas.

Inhibicin enzimtica

Tipos de inhibidores enzimticos:

Reversibles: Unin no covalente de un inhibidor a la enzima

a. Competitiva

b. No competitiva

c.

Irreversibles: Unin covalente del inhibidor al enzima

Ejemplos de inhibidores: Elementos naturales, toxinas especficas,

venenos, iones, frmacos. Envenenadores: se unen irreversiblemente al centro activo de la enzima impidiendo permanentemente que esta acte. (Gas nervioso)

Mista

REVERSIBLE: se enlaza a la enzima pero no permanentemente con lo que la inhibicin es transitoria. Los inhibidores reversibles se

pueden eliminar normalmente mediante dilisis o cambios en el pH o en la disolucin de buffer.

IRREVERSIBLE : se enlaza permanentemente a la enzima con lo que la inhibicin es completa. Los inhibidores irreversibles se unen

covalentemente a la enzima con lo cual resultan muy difciles de

eliminar.

INIBICIN ENZIMTICA : Revisando

Un inhibidor competitivo normalmente es similar a la enzima en

tamao y forma con lo que compite por la enzima con el sustrato al

unirse a la enzima por el mismo centro activo.

La velocidad de reaccin se reduce porque baja la proporcin de

molculas unidas al substrato.

Cuanto ms inhibidor hay presente, ms complejo EI es originado y

menos producto se forma.

Inhibicin competitiva

Ejemplo: inhibicin del malonato

sobre la succnico deshidrogenasa.

Muchas veces el propio producto

de la reaccin acta como inhibidor

competitivo ya que es

qumicamente parecido a substrato

y as se produce un tpico

mecanismo de feedback en el que

el propio producto de la reaccin

regula la accin de la enzima.

[S] Vmx =

KM

Experimento

1 [E], [S] = cte

2 [E], [I] = cte

1/V0 x 1/[S]


SIN inhibidor

Inclinacin

Ecuacin de Michaelis-Menten

Lineweaver-Burk

SK

IK

SVV

Im

mx

1

SV

KIK

VV mx

Im

mx

11

11


ISKK

K

V

V

mI

m

I

10

Relacin entre las velocidades CON y SIN Inhibidor

[S] = influencia del [I] es

despreciable.


El inhibidor es anlogo estructural del sustrato y compite con l por la ligacin al sitio activo

con aumento de la [sustrato], disminuye la inhibicin indicando as un competicin entre S e I

no hay alteracin de Vmax y hay un aumento de KM debido a un factor , que permite el clculo de la constante de inhibicin: Ki

S

E

I

I

I

S

P

S

S

S

S

S

S

S S

Inhibicin competitiva (reversible)

Ejemplos de Inhibicin Competitiva Reversible

Ejemplos de Inhibicin Competitiva Reversible

METOTREXATO

En este tipo de inhibicin tanto el sustrato como el inhibidor se

enlazan a la enzima pero en sitios activos diferentes. El enlace de I

ejerce un efecto sobre el centro activo probablemente afectando a la

estructura de la enzima que ya no funciona tan eficientemente. En

consecuencia Vmax se altera pero no se altera KM.

El aumento de [S] no restituye el valor de Vmax (no se consigue desplazar las

molculas de inhibidor de los sitios activos).

La expresin matemtica para el mecanismo Michaelis-Menten para este tipo de inhibicin es:

Vmax [S] V= ( [S] + Km) ( 1 + [I] / K i)

Inhibicin NO competitiva

Ocupa otro sitio ES, EI y EIS;

[S] = no lleva todas las E productiva;

Vmx y KM normal

KM( normal porque la afinidad de la enzima por el sustrato se

mantiene).


Ecuacin de la velocidad:

Lineweaver-Burk

II

m

mx

K

IS

K

IK

SVV

11

ImxImx

m

K

I

VSK

I

V

K

V1

111

1


SIN inhibidor

Inclinacin

Inhibicin Mista

El inhibidor acta de manera similar al no competitivo y no se liga al

sitio activo. El KM (aumenta) y Vmx (disminuye).

inhibidor no es anlogo estructural del sustrato - no se liga al sitio activo

inhibidor se liga a E y al ES

aumento de la [sustrato] no disminuye la inhibicin - no hay competencia

KM aumenta y Vmax disminuye

E

P E

S

S

E I

I

I

I

I

S Inhibicin mista

S

S

S

I I

S

S

I

S

Inhibicin IRREVERSIBLE

El inhibidor se une permanentemente a la enzima de las siguientes formas:

Ligacin covalente

Destruccin de un grupo funcional esencial al funcionamiento de la enzima

Ligacin no covalente particularmente estable

INHIBICIN ENZIMTICA

Vmx y KM =


Ecuacin de Michaelis-Menten:

SK

SEIkVV

m

mxI ][3


Lineweaver-Burk:

SEIKV

K

EIKVV mx

m

mxI

111

33



Ejemplos de Inhibidores enzimticos irreversibles: Compuestos orgnicos

clorados o fosforados

Reaccionan con el residuo S1 de serino-enzimas, formando un complejo

irreversible.

Una de las enzimas altamente sensible a estos compuestos es la acetilcolinesterasa, responsable por la metabolizacin del neurotransmisor

acetilcolina en neuronas centrales y perifricos.

Ese es el mecanismo de accin de los insecticidas organofosforados, como el malathion y el parathion. La acetilcolinesterasa de insectos as como la de mamferos son igualmente inhibidas por estos insecticidas.

Contribuye para la toxicidad de ambos insecticidas a longa media vida que presentan en el ambiente.

dosis letal: 3-13 mg/Kg, oral

Insecticidas

organofosforados

media vida 23 aos


Acetilcolinesterase unida al sarin o gas nervioso (dosis letal 0,01 mg/kg, oral), un organofosforado altamente txico y voltil, que reacciona con el

residuo Ser activo de la enzima..

Usos de inactivadores: Medicamentos Venenos

Aspirina: inhibe la ciclooxigenasa 1 y la ciclooxigenasa 2, que son enzimas que

producen un mensajero ( prostaglandina )que acta en casos de inflamacin,

suprimiendo el dolor y la inflamacin.

El cianuro es un inactivador enzimtico irreversible, que se combina con cobre

y zinc en el sitio activo da enzima citocromo c oxidasa bloqueando la

respiracin celular

Inhibicin ENZIMTICA

PMSF phenylmethane

sulphonyl fluoride

H3C SO2F

E

E

Enzima + diisopropilfluorofosfato

F-

enzima inhibida

En laboratorio, serino-enzimas pueden ser identificadas por ser

eficientemente inhibidas por compuestos organofosforados no tan txicos

como el diisopropilfluorofosfato (DFP) o el fluoreto de fenilmetilenosulfonila

(PMSF).

Diferentes compuestos son utilizados en laboratorio para identificar el

mecanismo cataltico de las enzimas, empleando reacciones especficas

para las cadenas laterales de aminocidos que pueden hacer parte del sitio

activo de esas enzimas.

* Alteracin en genes que codifican enzimas (mutaciones o

delecciones) podrn tener como efecto el surgimiento de enfermedades

genticas.

* Fenilcetonuria - Una mutacin en un nico aminocido de la enzima

fenilalanina hidroxilasa, que cataliza el primer paso en la degradacin

de la fenilalanina, resulta en la acumulacin de fenilalanina y de los

productos asociados. Problemas: puede causar retraso mental si no

tratada.

* Mutaciones en genes que codifican enzimas involucradas en la

reparacin del DNA causan sndromes de cancro hereditario, como la

xerodermia pigmentosa.

Defectos en esas enzimas pueden causar cancro, visto que el cuerpo queda

con menor habilidad menor para reparar mutaciones en el genoma. El proceso

genera una lenta acumulacin de mutaciones y resulta en el desarrollo de

muchos tipos de cancro en el paciente.

ENZIMAS Y PATOLOGAS

Fuentes y bibliografa

1. J. L. Snchez Guilln. EL METABOLISMO CELULAR: GENERALIDADES. ENZIMAS. Publicacin online. Pag.1-8

2. P. Gasesa y J. Hubble, Tecnologa de las enzimas. Editorial Acribis. S.A., Segunda Edicin, Zaragoza, Espaa, 1990. (Publicacin: Biotecnologa Tecnologa enzimtica)

3. Mariotto, Juliana. CINTICA ENZIMTICA: apuntes. Universidade Federal de Santa Catarina.

4. S. F. Aiba et al., "Biochemical Engineering", 2nd Edition, Academic Press, New York. 5.Voegt, D. and Voegt, J. G. Biochemistry. 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York,USA,1997. 6. Stephanopoulus, G. N.; Aristidou, A A; Nielsen, J. Metabolic Engineering: Principles and Methods; 1st Edition, Academic Press, California, USA, 1998. Texto: Marcell Crispim Cintica Enzimtica USP-Instituto de Ciencias Biomdicas Apuntes: Ing. Jorge N. Fuentes Berazategui- Titular de la Ctedra de Biotecnologa

de UTN-FRM.

Otros sitios:

http://www.brenda.uni-koeln.de/

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/

http://merops.sanger.ac.uk/c Url: http://www.wikipedia.com http://www.bioygeo.info/AnimacionesBio1.htm http:://www.icp.csis.es/biocatlisis/web3lineas.html http:www.mty.itesm.mx/data/cd/html http//www.unav.es/memoria/8-99/ingenieria.html -laguna.fmedic.unam.mx/

enzimas - biotecnología 2.1

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