Emlősök korai embrionális génjei kifejeződésének vizsgálata

molekuláris biológiai módszerekkel

Doktori értekezés

Baji Gál Árpád

Biológia Doktori Iskola, iskolavezető: Prof. Erdei Anna

Szerkezeti biokémia program, programvezető: Prof. Gráf László

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar

Témavezető: Dr. Dinnyés András

MTA doktora, kutatócsoport vezető

Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő

Genetikai Újraprogramozás Csoport

Gödöllő, 2008. május

1

„Felfedezni valamit annyit tesz, mint látni, amit mindenki lát,

és közben arra gondolni, amire még senki.”

Szent-Györgyi Albert

2

TartalomjegyzékRövidítések......................................................................................................................................11. Bevezetés.....................................................................................................................................2

1.1 Genetika, epigenetika..................................................................................................31.2 Génexpresszió..............................................................................................................31.3 Epigenetikai újraprogramozódás.................................................................................4

1.3.1 DNS metiláció.................................................................................................51.3.2 Genomi imprinting..........................................................................................51.3.3 X kromoszóma inaktiválás..............................................................................51.3.4 Telomer fenntartás...........................................................................................61.3.5 Kromatin átrendeződés....................................................................................61.3.6 Hiszton módosítások.......................................................................................8

1.4 Hiszton-kód.................................................................................................................91.5 Emlősök korai egyedfejlődése...................................................................................11

1.5.1 Morfológiai leírás..........................................................................................121.5.2 Molekuláris megközelítés.............................................................................141.5.3 Megtermékenyítést követő változások..........................................................161.5.4 Embrionális genom aktiváció........................................................................171.5.5 Az első differenciálódást kísérő változások..................................................18

1.6 Embrió technológiák..................................................................................................191.6.1 In vitro tenyésztés..........................................................................................201.6.2 Parthenogenetikus aktiválás..........................................................................201.6.3 Krioprezerváció, vitrifikáció.........................................................................201.6.4 Klónozás........................................................................................................21

1.7 Molekuláris biológiai megközelítési lehetőségek......................................................221.7.1 Módszertár.....................................................................................................221.7.2 A génexpresszió vizsgálata............................................................................231.7.3 Reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció............251.7.4 Egyedi embriók és sejtek génexpressziós vizsgálata....................................26

1.8 Vizsgált gének............................................................................................................272. Célkitűzések...............................................................................................................................293. Anyagok, módszerek..................................................................................................................31

3.1 Anyagok, vegyszerek.................................................................................................313.1.1 Tápoldatok petesejt és embrió kinyeréséhez, tartásához és kezeléséhez......313.1.2 Molekuláris biológiai módszerekhez használt anyagok, oldatok..................31

3.2 Állatok, élő sejtek, embriók kezelése........................................................................323.2.1 Állatvédelmi szabályok.................................................................................323.2.2 Petesejt kinyerése..........................................................................................323.2.3 Embriók kinyerése.........................................................................................333.2.4 Embriók tenyésztése......................................................................................333.2.5 Embriók mélyhűtése, felmelegítése..............................................................333.2.6 Embriók szétválasztása blasztomer sejtekre.................................................343.2.7 Parthenogenetikus aktiválás..........................................................................34

3.3 Alkalmazott molekuláris vizsgálómódszerek............................................................353.3.1 Totál RNS izolálás emlős szövetből..............................................................353.3.2 mRNS izolálás...............................................................................................353.3.3 Reverz transzkripció......................................................................................353.3.4 Polimeráz láncreakció...................................................................................363.3.5 Agaróz gél-elektroforézis..............................................................................36

3

3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció...................................................................363.3.7 Primer tervezés..............................................................................................393.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés........................................................................403.3.9 Génexpresszió stabilitás vizsgálat.................................................................423.3.10 Egyéb molekuláris biológiai módszerek.....................................................42

4. Eredmények...............................................................................................................................434.1 Egyedi embriókon alapuló génexpressziós protokoll kifejlesztése és validálása......43

4.1.1 Primerek tervezési eljárásának validálása.....................................................434.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása.........................................474.1.3 Protokoll kidolgozása, jellemzése.................................................................484.1.4 Protokoll ellenőrzése.....................................................................................49

4.2 Embrió mélyhűtési módszerek összehasonlítása.......................................................504.3 Egér egyedfejlődésének összehasonlítása különböző körülmények között...............534.4 Nyúl egyedfejlődésének vizsgálata............................................................................574.5 Egér és szarvasmarha egyedfejlődésének összehasonlítása......................................624.6 HDAC és HAT gének expressziójának meghatározása egér embriókban.................64

5. Tárgyalás....................................................................................................................................665.1 Módszer fejlesztés.....................................................................................................665.2 Mélyhűtés..................................................................................................................685.3 Egér embriók tenyésztése és a parthenogenetikus aktiválás......................................695.4 Nyúl embriók egyedfejlődése és tenyésztése............................................................705.5 Egér és szarvasmarha összehasonlítása.....................................................................715.6 Hiszton kód szabályozása..........................................................................................725.7 Gyakorlati felhasználás, távlatok...............................................................................73

6. Következtetések.........................................................................................................................75Köszönetnyilvánítás.......................................................................................................................77Irodalomjegyzék............................................................................................................................78Függelékek.....................................................................................................................................91

I. Hiszton módosítások és funkcióik................................................................................91II. Egy sejt RNS tartalma.................................................................................................92III. A vizsgált gének szekvencia adatai............................................................................93IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása...............................................96

Összefoglalás...............................................................................................................................103Summary......................................................................................................................................104

4

RövidítésekARTs asszisztált reprodukciós technikák (assisted reproductive technologies)bp bázispárBSA szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumin)cDNS (mRNS-ről átírt) komplementer DNS (complementary DNA)CG (CpG) citozin-guanin nukleotid pár (citozin-foszfát-guanin)COC kumulusz-petesejt komplexek (cumulus oocyte complexes)Ct küszöbérték ciklusszám (threshold cycle)CV relatív szórás, variációs együttható (coefficient of variation)CZB Chatot Ziomek Bavister tápoldatDNS dezoxiribonukleinsav (deoxyribonucleic acid)dNTP dezoxi-nukleotid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)dT dezoxi-timinEBSS Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldat (Earle's Balanced Salt Solution)eCG vemhes kanca placentájában termelődő hormon (equine chorionic gonadotropin)ECS ösztruszban lévő szarvasmarha szérum (estrous cow serum)EDTA etiléndiamin-tetraecetsav (ethylenediamine tetraacetic acid)EGA embrionális genom aktiváció (embryonic genome activation)EST expresszált szekvencia címke (rövid génszakasz) (expressed sequence tag)GOI vizsgált gén (gene of interest)H1 hiszton 1 fehérjeH2A hiszton 2A fehérjeH2B hiszton 2B fehérjeH3 hiszton 3 fehérjeH4 hiszton 4 fehérjeH4-K12Ac acetilált lizin oldallánc a H4 hiszton fehérje 12-es pozíciójábanHAT hiszton acetil-transzferáz enzimhCG emberi korion gonadotróp hormon (human chorionic gonadotropin)HDAC hiszton-deacetiláz enzimHEPES N-2-hidroxietil-piperazin-N'-2-etán-szulfonsavHKG háztartási gén (housekeeping gene)ICM epiblaszt, belső sejtcsomó (inner cell mass)ISV gyors fagyasztás műszalmában (in-straw vitrification)MMLV Moloney egér leukémia vírus (Moloney Murine Leukemia Virus)mRNS hírvivő RNS (messenger RNS)PCR polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)PMSG vemhes kanca szérum gonadotróp hormon (pregnant mare serum gonadotropin)qRT-PCR kvantitatív, real-time RT-PCR (quantitative real-time RT-PCR)R2 determinációs együttható, a korreláció négyzete (coefficient of determination)RNáz ribonukleáz (ribonuclease - RNase)RNS ribonukleinsav (ribonucleic acid)RT reverz transzkripció (reverse transcription)SCNT testi sejtes sejtmagátültetés (somatic cell nuclear transfer)SDS nátrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulphate)SSV gyors fagyasztás szilárd felületen (solid surface vitrification)TAE Tris-acetát-EDTA puffer (Tris-Acetate-EDTA)TCM 199 szövetkultúra médium 199 (tissue culture medium 199)TE trofoblaszt, trofektoderma (trophectoderm)

1

1. Bevezetés

Ma már elfogadható mennyiségű bizonyíték áll rendelkezésre mind az orvostudományi,

mind az állati és növényi genetikai tanulmányokból arról, hogy az elsődleges DNS szekvencián

kívül is öröklődik információ generációkon át és befolyásolhatja az utódok fenotípusát. Ezt

epigenetikai információnak hívják és molekuláris alapjainak felfedezése a kutatók

érdeklődésének középpontjában áll.

A fejlődésbiológiai kutatások elsődleges célja sok év óta az emlősök egyedfejlődése során

zajló sejtes folyamatok molekuláris mechanizmusainak megértése. Napjainkban jutott oda a

tudomány, hogy a hagyományos genetikai és embriológiai kísérleti módszerek repertoárját

kiegészítsék a molekuláris és sejtbiológiai megközelítésekkel. Ennek eredményeképpen a mai

modern fejlődésbiológia több más tudományág, mint a biokémia, genomika és rendszerbiológia

határterületén valósul meg. A reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció

jelenleg az általánosan alkalmazott módszer, mely az mRNS mennyiségi meghatározásával, a

megfelelő adatelemzésével és a nyilvánvaló követelményekkel együtt alkalmas az egyedfejlődést

irányító génexpresszió vizsgálatára az orvostudományban, diagnosztikában, a mikrobiológiában

és a biotechnológiában.

Röviden a kutatás céljai, melyek a kutatócsoport emlős embrió technológiai (például

klónozási) munkáját szolgálják:

– alkalmas módszer kifejlesztése a génexpresszió mennyiségi meghatározására egyedi

sejtekben, embriókban, valamint a molekuláris, és epigenetikai újraprogramozódási

folyamatoknak a vizsgálata az emlősök korai egyedfejlődése alatt;

– a génexpresszió vizsgálata természetes és többféle módon előállított „mesterséges”

embriókban (in vivo, in vitro tenyésztett, parthenogenetikusan aktivált, mélyhűtött);

– különböző emlősállatok (egér, nyúl és szarvasmarha) összehasonlítása;

– a hiszton-kódot szabályozó különböző (hiszton acetil-transzferáz és hiszton-deacetiláz)

gének szerepének meghatározása.

Az értekezés több tudományterületet érint, mint a genetikát és molekuláris biológiát, az

epigenetikát, valamint az emlős embriológiát, és a biotechnológiát. Irodalmi áttekintésük és az

általánosan használt fogalmak, az alkalmazott módszerek elméleti háttere külön alfejezetekben

kerültek leírásra, rámutatva a kapcsolódási pontokra, mely alapján az elvégzett kísérleti munka

összefüggéseit egyszerűbben lehet majd megmagyarázni.

2

1.1 Genetika, epigenetika

Az egyedfejlődés sikeres, zavartalan lejátszódásáért jól szervezett, szabályozott

molekuláris folyamatok felelnek. Középpontjukban a genom, a két ivarsejt DNS állománya áll,

mely magában hordozza a teljes egyedfejlődés információját, programját. Amíg a DNS nukleotid

szekvenciája - a genetikai információ - a géneket, RNS és fehérje struktúrákat kódolja, ezek

programozott működését, kifejeződésük aktivációját-csöndesítését (ki- bekapcsolását), időbeli és

térbeli mintázatát, szövet és sejtspecifikus kifejeződését a primer szekvencián felüli, epigenetikai

információ határozza meg. Az epigenetikai mintázat tükrözi az adott sejt genotípusát, fejlődési

útját, az őt érő környezeti hatásokat, és végső soron a sejt fenotípusában fejeződik ki. Minden

egyedi sejtnek megvan a saját epigenetikai profilja, epigenomja (Morgan és mtsai. 2005.). Az

epigenetikai tényezők összessége a DNS funkciójának, a génexpressziónak a stabil, öröklődő és

visszafordítható módosulásai a sejtosztódás és fejlődés alatt anélkül, hogy a DNS szekvenciája

megváltozna. A kromatin szerkezetét, összetételét, helyspecifikus átalakítását érintik például a

DNS metilációjával vagy a DNS-t körülvevő hiszton fehérjék kémiai módosításaival, melyek

meghatározzák a DNS hozzáférését, transzkripciós aktivitását (Jones és Takai 2001., Jaenish és

Bird 2003.).

1.2 Génexpresszió

A génkifejeződés - génexpresszió - folyamatait a centrális dogmában foglalták össze

először (Crick 1970.). Első lépése a transzkripció, mely során általában egy génről a szabályozó

régiók (promóter) és a stop jel közötti információt hordozó, kódoló szakaszok (exonok) és a

köztes nem kódoló régiók (intronok) íródnak át a kétszálú DNS-ről egyszálú RNS-re. Az RNS

érése során (splicing) kivágódnak az intronok és létrejön az érett mRNS. Ezt követi a transzláció,

amikor az mRNS-ről fehérje szintetizálódik, végül a fehérje felveszi aktív formáját, egyéb

utólagos módosításokon eshet át, melyek után betölthetik specifikus szerepüket és kialakítják az

adott fenotípust (1. ábra). A genetikai információ - a DNS szekvencia - egy emlős szinte minden,

a zigótából kifejlődő sejtmaggal rendelkező testi sejtjében azonos (kivétel néhány specifikus

sejttípus, mint a limfociták). Alakjuk, felépítésük és működésük mégis egészen eltérő lehet,

mivel változó génkészlet fejeződik ki a különböző fejlődési stádiumokban és az egyes

sejtvonalakban, megadva a differenciálódott szöveti sejtek jellegét.

3

1.3 Epigenetikai újraprogramozódás

A preimplantációs egyedfejlődés során az epigenetikai módosítások szabályozzák például

az X kromoszóma inaktivációját, a genomi imprintinget, a telomerek hosszának szabályozását.

Központi szerepet töltenek be a génexpressziós mintázatának kialakításában a gének

aktiválásával, csöndesítésével. A sejtek elsődlegesen azáltal szabályozzák a génjeik aktivitását,

hogy növelik vagy csökkentik az adott gén transzkripcióját, amit fehérjéken, transzkripciós

faktorokon keresztül valósítanak meg a gének szabályozó régióihoz kapcsolódva. A

megtermékenyítést követő korai egyedfejlődés során - ahol a sejtek fejlődési potenciálja

nagymértékben megváltozik - az emlősök epigenomja a teljes genom szintjén

újraprogramozódik: az elősejtmagokban meglévő epigenetikai mintázat törlődik, és egy új

mintázat alakul ki. (Erről részletesebben olvasható az Egyesült Államok Élelmiszer és

Gyógyszerhatósága tanulmányában (FDA; Rudenko és mtsai. 2007.a,b).) Habár a kutatások

középpontjában főként a korai egyedfejlődésben zajló epigenetikai változások állnak, ezek

később, a felnőtt egyedben is lejátszódnak, például az ivarsejtek képzésekor. Szintén

valószínűsíthető, hogy a különböző orvosi beavatkozások, táplálékok és a környezeti kitettség

(vegyszerek) ezeknek a véletlenszerű megzavarásához vezethet, vagyis általában a környezethez

való adaptálódásnak is szükséges és normális része, melynek a folyamatait azonban még alig

ismerik (Bartolomei és Bickmore 2005.).

Az epigenetikai újraprogramozódással foglalkozó tudományág viszonylag fiatal. Még

4

1. ábra: Génkifejeződés.

A DNS molekulán az exonok rózsaszínnel, az intronok zölddel, a promóter és a stop jel pirossal vannak jelölve. (Forrás: http://hu.wikipedia.org/)

nem minden epigenetikai változást ismernek részleteiben, mivel a mögöttük rejlő molekuláris

folyamatok igen összetettek. Mindezzel együtt nagyon sok mindent tudnak már arról, hogy a

genom kifejeződését hogyan szabályozzák az egyedek, sejtek élete során. Ezek a különböző

típusú epigenetikai folyamatok: DNS metiláció, genomi (molekuláris) imprinting, X

kromoszóma inaktiválás, telomer fenntartás, kromatin átrendeződés (a kromatin szerkezet

szabályozott változásai), hiszton módosítások.

1.3.1 DNS metiláció

A DNS metilációs állapotát központi szerepűnek tartják a génexpresszió epigenetikai

szabályozásában, s mivel mind jobban kezdik megérteni ebben betöltött szerepét, ez az egyik

legaktívabban kutatott terület (Holliday 2005.; Scarano és mtsai. 2005.). A genomi DNS

metilációs mintázata a DNS nagy részén megtalálható metilált citozinokat, főként a CG

dinukleotidok 5' citozinjait jelenti, és a bizonyos régiókba - CpG szigetekbe - csoportosuló nem

metilált citozinokat. Az emlősök genomjában 30-40 ezer ilyen sziget található, főként háztartási

gének promóter régiói közelében, de szövet specifikus gének környezetében is (Antequera

2003.). A CG dinukletidokban lévő citozinokon megjelenő metiláció helyes mintázata szükséges

a normális egyedfejlődéshez, és szerepet játszik az X kromoszóma inaktiválásában és az

imprintingben is (Li és mtsai. 1993., Beard és mtsai. 1995.). A DNS metilációja az egyik

legstabilabb módosításnak tűnik, ezért ez az első számú jelölt, mely felelős a generációk közötti

epigenetikai öröklődésért. Azonban egy nemrégiben megjelent tanulmány alapján kijelenthető,

hogy az egérben (Mus musculus) nem ez a keresett epigenetikai jel (Blewitt és mtsai. 2006.).

1.3.2 Genomi imprinting

Emlősökben az anyai és apai genomok mindegyike szükséges a normális embrionális

egyedfejlődéshez. Működésbeli egyenlőtlenségüket epigenetikai folyamat, a genomi imprinting

határozza meg azáltal, hogy bizonyos gének aktivitása a szülői eredetétől függően szabályozódik

- vagyis vagy csak az apai, vagy csak az anyai kromoszómán elérhető és szabályozható, míg a

másikon nem. Így funkcionális különbség alakul ki a két szülői genom között, mely az

ivarsejtekben továbbítódik és a korai embrionális újraprogramozódás alatt is érintetlen marad

(Surani és mtsai. 1984.).

1.3.3 X kromoszóma inaktiválás

Az emlősök egyedfejlődésének már korai szakaszában az egyik X kromoszóma

transzkripcionálisan inaktiválódik, hogy az X kromoszóma géntermékeinek dózis kompenzációja

5

biztosítva legyen. Az inaktív X jellemzői a késői DNS replikáció és az epigenetikai módosítások,

mint a DNS metiláció, valamint hogy a hiszton 3 (H3) és hiszton 4 (H4) fehérjék kevéssé

acetiláltak, ellentétben az aktív X kromoszómával (Shi és mtsai. 2003.).

1.3.4 Telomer fenntartás

A telomerek az eukarióta kromoszómák végein található speciális, nem kódoló, ismétlődő

DNS szakaszok. A legtöbb testi sejtben védik a kromoszómák végeit a lebomlástól, elősegítik a

DNS replikáció befejezését és a sejtmagban való elhelyezkedésben is szerepük van. A

sejtosztódások során fokozatosan megrövidülnek, végül emiatt az osztódási képességüket is

elveszítik a sejtek. Ezt a jelenséget hívják a sejtek elöregedésének (Greider 1990.).

1.3.5 Kromatin átrendeződés

A kromoszóma anyaga a kromatin, mely

eukarióta sejtekben kettős szálú DNS és fehérjék

komplexéből áll. A kromatin szerveződésének több

szintje van, melyben a DNS molekula tömören össze

van csomagolva. A DNS két szála bázispárosodás

révén kettős hélix szerkezetet vesz fel, mely a

hiszton fehérjékkel nukleoszómákat formálnak és

mint a gyöngyök füzérszerűen ismétlődnek

szakaszonként - ezért hívják gyöngyfüzér

struktúrának. Ezek szabályosan összetömörödve

alkotják a kromatin szálat. A kromoszóma

működésétől függően a kromatin szál

feltekeredésével, hurkolódásával további

kondenzálódás érhető el (2. ábra). Szerkezete

dinamikusan változik az egyedfejlődés és

differenciálódás alatt. Fontos szerepet tölt be a gének

kifejeződésében, és a DNS megkettőződésében, a

replikációban is. A kromatin nem egységes a gének

eloszlása és a transzkripció aktivitása tekintetében.

Az eukariótákban a genom transzkripcionálisan aktív

(eukromatin) és inaktív (heterokromatin) részekre

tagolt. Az eukromatin a kromatin egy típusa, mely

6

2. ábra: A kromatin szerveződése.

A) DNS kettős hélix; B) gyöngyfüzér; C) kromatin szál; D) fellazult és E) kondenzált kromoszóma részlet; F) mitózisos kromoszóma. (Forrás: Alberts és mtsai. 2002.a)

gazdag génekben. A hiszton fehérjék nem kötődnek szorosan a DNS-hez, biztosítva ezáltal

egyfajta laza, nyitott szerkezetet, melyen sokféle molekula, fehérje hozzáférést nyerhet a DNS

megfelelő (szabályozó, kódoló) régióihoz. A génexpresszió aktív, szinte folyamatos az mRNS

átírás. Ezzel szemben a magasabb fokon rendeződött, zárt szerkezetű heterokromatin inaktív. A

DNS-t körülvevő hiszton fehérjék szoros kapcsolata miatt az RNS polimeráz (DNS-ről RNS

átírást végző) enzim nem fér hozzá a DNS-hez. A gének elhelyezkedése ezekben a részekben

ezért fontos szabályozója az expressziójuknak. Áthelyeződésük a nyitott és zárt kromatin

szerkezet között szükséges az expressziójuk hosszú távú változásához.

A kromatin alapegysége a

nukleoszóma, 146 bázispárnyi (bp) DNS-t

tartalmaz, mely két körben tekeredik fel egy

magot alkotó fehérje-komplexre (3. ábra). A

fehérje magot nyolc hiszton határozza meg:

két-két hiszton 2A (H2A), hiszton 2B

(H2B), H3 és H4 (Luger és mtsai. 1997.).

Az egyes nukleoszómákat egy rövid

„összekapcsoló” DNS szakasz és egy

hiszton 1 fehérje (H1) köti össze. A

hisztonok kis méretű, bázikus fehérjék. Öt

fő típusuk van (H1, H2A, H2B, H3 és H4),

egyenként körülbelül 130 aminosav

hosszúak. Mindegyik gazdag pozitív

töltésű, bázikus aminosavakban (arginin,

lizin, hisztidin), melyek szoros

kölcsönhatásba lépnek a negatívan töltött

DNS foszfát csoportjaival. A nukleoszómák

szerkezetükön keresztül szabályozzák a

transzkripciós komplexek kötődését a DNS

megfelelő régióihoz. A kromatin fellazulása

és a nukleoszómák átrendeződése

előfeltétele a transzkripció aktiválásának. A

fentiekre nézve csak a hímivarsejtek

jelentenek kivételt. A képzésük során

(spermiogenezis) a kromatin jelentősen

7

3. ábra: A nukleoszóma térbeli szerkezete.

A két körben feltekeredő DNS kettős szála barna-zöld színekkel, a magot képező hiszton fehérjék sárga (H2A), piros (H2B), kék (H3) és zöld (H4) színekkel, a Mn2+ és Cl-

ionok világoskék és sötétkék golyókkal vannak jelölve. PDB kód: 2CV5. Ábrázolás: UCSF chimera programmal (Pettersen és mtsai. 2004.). (Forrás: Tsunaka és mtsai. 2005.)

szorosabb formába tömörül, a génexpresszió teljesen felfüggesztődik és a hisztonok nagyrészt a

protaminnak nevezett, arginin-gazdag fehérjékkel helyettesítődnek (Braun 2001.).

1.3.6 Hiszton módosítások

A magasabb fokon rendeződött kromatin szerkezet szoros összefüggésben áll a

nukleoszómák magját alkotó hiszton fehérjék kinyúló N-terminálisának, ritkábban C-

terminálisának kovalens, transzláció utáni módosításaival. A hiszton H3 és H4 N-terminálisa az

eukarióták egyik legkonzervatívabb szekvenciája (Eberharter és Becker 2002.). A mostani

kutatásokból kiderül, hogy mennyire komplex rendszerről van szó, amit példáz a DNS

metilációjának, és a hisztonok acetilációjának, metilációjának, foszforilációjának és

ubiquitinációjának az óriási számbeli és minőségbeli változatossága is (Kanka 2003.; Quivy és

mtsai. 2004.; Cheung és Lau 2005.; Fuks 2005.; Verschure és mtsai. 2005.). Az eltérő hiszton

módosítások együttműködő vagy ellentétes kölcsönhatást gyakorolnak a kromatinhoz kötődő

fehérjékkel, amivel a transzkripcionálisan aktív vagy csöndes állapotok közti dinamikus

átmeneteket szabályozzák és szerepet játszanak a DNS megkettőződésében, a DNS hibák

javításában és a mitózisban is (részletesebben: Függelékek: I. Hiszton módosítások és funkcióik)

(Peterson és Laniel 2004.; Zhang és mtsai. 2007.). A hisztonok pozitív töltésű lizin oldalláncai a

DNS negatív töltésű foszfát csoportjaihoz szorosan kapcsolódnak. Az aktív géneknél a hisztonok

- főként a H3 és H4 - nagyon acetiláltak. Az acetilációjuk során semlegesítődnek, és a

nukleoszómális „gyöngyfüzér” becsomagoltsága csökken, így a DNS hozzáférhető lesz a

transzkripciós faktorok számára (4. ábra). Ezáltal a hiszton acetiláció, mint a kromoszómákon

található epigenetikai jel, a transzkripcióra való alkalmasságot jelöli, de az aktív transzkripcióval

nincs közvetlenül összefüggésben. Deacetilációjukkal ellentétes folyamat játszódik le, a

transzkripció gátlódik, és a kinyúló végek represszor fehérjéket kötnek meg (Grunstein 1997.).

Mint a preimplantációs embriófejlődés génexpressziójának legfontosabb epigenetikai

szabályozója, a DNS metiláció mellett ez a másik igen sokat tanulmányozott folyamat. Egyes

esetekben a DNS metiláció és a hiszton deacetiláció egyidejűleg eredményezi a géncsöndesítést

(Santoro és mtsai. 2002.).

Az hiszton végeken található acetilált lizin aminosavakat a bromodomének, bizonyos

kromatin átrendező és transzkripciót aktiváló fehérje szakaszok kötik, melyek körülbelül 100

aminosav hosszúak és négy α-hélixből állnak (Winston és Allis 1999.; Owen és mtsai. 2000.). A

kromatin szerkezet dinamikus átmeneteit a kapcsolódó nem-hiszton típusú kromoszómális

fehérjék biztosítják. Közülük kiemelkedő fontosságúak a „hiszton kódot” előállító és azt leolvasó

fehérjék, mint például a hiszton acetil-transzferáz (HAT) és a hiszton-deacetiláz (HDAC)

8

enzimek, melyek közösen együttműködve határozzák meg az általános genom szintű hiszton

acetiláltsági állapotot, és ennélfogva a transzkripciós állapotok közötti központi kapcsolóként

működnek (Shi és mtsai. 2003.). Érdekes módon olyan területeket is találtak a genomban,

amelyeken a génkifejeződés nincsen összhangban a helyi hiszton fehérjék módosításaival. Ez

egybecseng azzal az elképzeléssel, miszerint a genomnak jóval nagyobb része íródik át DNS-ről

RNS-re, mint korábban gondolták, és nem csak a klasszikus mRNS-eket kódolja, amelyek a

fehérjék szerkezetéhez szükséges információt hordozzák. A genom számos régiójáról fehérjéket

nem kódoló RNS-ek is átíródnak, amelyek elsősorban a génszabályozásban játszanak fontos

szerepet. Úgy tűnik, hogy ezeken a fehérjét nem kódoló genomi szakaszokon nem jelennek meg

az ismert hiszton módosítási mintázatok.

1.4 Hiszton-kód

A lehetséges sokféle kombináció alapján felállították az úgynevezett „hiszton-kód”

elméletét. Ez egy bonyolult szabályozó rendszer, amely jelentős mértékben kiterjeszti a genetikai

kód információtartalmát és a génexpresszió specifikus szabályozására egy epigenetikai

jelrendszert határoz meg (5. ábra). A de/acetiláció következetes mintázatára génről génre,

9

4. ábra: A hiszton acetiláció szerepe a génexpresszió szabályozásában.

A hisztonok lizin oldalláncainak acetilációjával a nukleoszómák fellazulnak, létrehozva egy nyitottabb kromatin szerkezetet, így a transzkripciós faktorok hozzáférhetnek a DNS-hez, a génexpresszió aktív (bal oldal). Ezzel ellentétes folyamat játszódik le a lizin oldalláncok deacetilációjával, géncsöndesítést okozva (jobb oldal). HDAC: hiszton-deacetiláz; HAT: hiszton acetil-transzferáz; N: hiszton N-terminális; Ac: acetiláció; TF: transzkripciós faktorok; RF: represszor fehérjék.

valamint a kód kombinatorikus felhasználásár azonban napjainkig nagyon kevés bizonyítékot

találtak (Turner 2000.; Strahl és Allis 2000.; Jenuwein és Allis 2001.; Kurdistani és mtsai. 2004.;

Nightingale és mtsai. 2006.).

A hiszton-kód acetil jelét létrehozó és szabályozó enzimek (HAT és HDAC) nagy

számban fordulnak elő az emlősökben. A hiszton acetil-transzferáz aktivitással rendelkező,

transzkripciót szabályozó koaktivátor fehérjék több különböző fehérjecsaládba tartoznak, melyek

különböző szubsztrátokat részesítenek előnyben, és más-más feladatokat látnak el a sejtekben.

Többségük a transzkripciót szabályozó, nagy komplexekben fordul elő, ezzel tovább tágítva a

viszonylag gyenge szubsztrát specificitásukat. A családok közötti szekvencia hasonlóság kicsi,

általában csak a hiszton acetil-transzferáz doménre korlátozódik (Marmorstein és Roth 2001.). A

10

5. ábra: Hiszton módosítások.

Az emberi hiszton fehérjék eddig ismert transzláció utáni módosításai: acetiláció (Ac), metiláció (Me), foszforiláció (P), ubiquitináció (U). A vastag sötétebb régiók az alfa-hélix struktúrát jelölik. (Forrás: www.histone.com/modification_map.htm)

HAT enzimek katalizálják az acetil csoport áthelyezését az acetil-koenzim A-ról a hiszton

fehérjék nukleoszómából kinyúló N-terminálisán található lizinek ε-amino csoportjára (4. ábra)

(Carrozza és mtsai. 2003.). Fontos szerepüket írták le egérben az egyedfejlődés során, valamint

emberben (Homo sapiens) rákos elváltozások okaként.

A hiszton-deacetiláz aktivitással rendelkező fehérjéket két családba sorolják, az egyik a

klasszikus HDAC család. Közös jellemzőjük a kromatin szerkezethez való kötődési képességük

a katalitikus doménen keresztül, valamint az acetil csoport eltávolítása a hiszton fehérjékről.

Mint a génexpressziós aktivitás szabályozói, aktívan kutatják a kóros génműködés

szabályozásában betöltött szerepüket a rákos elváltozásokban (Khochbin és mtsai. 2001.; de

Ruijter és mtsai. 2003.).

Több vizsgálatot végeztek preimplantációs stádiumú emlős embriókban a különböző

ismert HDAC és HAT gének expressziós mintázatának feltárására egérben, szarvasmarhában

(Bos taurus) és bundermajomban (Macaca mulatta), azonban egyik tanulmányba sem a teljes

készletet, hanem csak néhány (1-10) kiválasztott gént vontak be, és az újabban leírt HDAC

gének expresszióját még senki nem jellemezte (Schuettengruber és mtsai. 2003.; Hayashi és

mtsai. 2003.; McGraw és mtsai. 2003.; Zheng és mtsai. 2004.).

1.5 Emlősök korai egyedfejlődése

Az embrionális egyedfejlődés első, preimplantációs szakasza a petesejt

megtermékenyítésével kezdődik és az embrió méhbe való beágyazódásáig tart. Viszonylag lassú

folyamat, egérben átlagosan 4,5 napot vesz igénybe - míg embernél 6-7 napot, szarvasmarhában

17-34, birkában (Ovis aries) és sertésben (Sus scrofa) 14-16 napot (Ko 2004.). Lassú, de

funkcionálisan eseménydús sejtosztódások jellemzik, melyek során az embrió méretbeli,

tömegbeli növekedést nem mutat. Ez alatt történik meg az egyesülő ivarsejtek genomjának

epigenetikai újraprogramozódása, az embrionális genom aktivációja (EGA) és az első

differenciálódás.

A laboratóriumi (házi) egér széles körben, általánosan elfogadott és választott modell

szervezet az egyedfejlődés és az emberi betegségek tanulmányozásában. Az egér és az ember

számos fiziológiai és patológiai tulajdonsága azonos. Az idegi, szív- és érrendszeri, endokrin,

immun-, és egyéb belső szervrendszeri, valamint izom- és vázszerkezeti hasonlóságokról óriási

irodalom áll rendelkezésre (Rosenthal és Brown 2007.).

A szarvasmarha, mint nagy testű kísérleti modell állatfaj preimplantációs

egyedfejlődéséről szintén sok információ gyűlt már össze és ma is intenzíven tanulmányozzák.

11

Több vonatkozásban is eltér az egérétől, mint például a kisebb genom aktivációnak (minor

genome activation) és az EGA-nak az időzítése.

A nyúl (Oryctolagus cuniculus), mint klasszikus modellállat preimplantációs

egyedfejlődése, az embrionális genom aktivációja hasonló a nagy emlősökhöz és az emberhez,

és e mellett metabolizmus tanulmányokban, antitest termelésben és gyógyszer hatóanyagok

tesztelésében is előszeretettel használják (Graves és Moreadith 1993.). Az irodalomban ennek

ellenére nincs elegendő információ az embriók molekuláris biológiai és génexpressziós

vizsgálatáról. A különböző fajok génexpressziós mintázatainak összehasonlításából közelebb

lehet jutni a jelenségek faji különbségektől független, általános megértése felé.

Példaként az egér, mint a legkönnyebben vizsgálható és az egyik legjobban

tanulmányozott emlős modellállat korai egyedfejlődése kerül bemutatásra röviden.

1.5.1 Morfológiai leírás

A petefészekből kiszabaduló érett petesejt az ampullába, a petevezeték végső kitágult

szakaszába jut és itt a megtermékenyítés hatására esik át a meiózis második szakaszán. A

zigótában még két külön elősejtmagban lévő haploid szülői génállományok replikálódnak, majd

lezajlik az első sejtosztódás. Mivel a petesejtek érése, ovulációja és megtermékenyítése, valamint

a sejtosztódások nem

összehangoltak, aszinkron

zajlanak, az egyes embrionális

stádiumokat és a sejtosztódások

időpontjait bizonyos

időtartamokkal lehet csak

megadni (6. ábra). Az

állatvilágban ezek az első

embrionális sejtosztódások a

leghosszabbak, 12-24 órát

vesznek igénybe. A létrejövő

utódsejtek még teljesen azonosak,

totipotens blasztomerek, vagyis

képesek bármilyen sejttípust

létrehozni, differenciálódni, vagy

akár egyetlen blasztomer sejt is

élő állattá fejlődni.

12

6. ábra: Az egér preimplantációs egyedfejlődése.

Az 1. napon, az éjszakai fázisban történik meg a megtermékenyítés és a fejlődő embrió az 5. napon jut el a méhbe való beágyazódásig a különböző stádiumokon keresztül. (Forrás: Nagy és mtsai. 2003.a)

Az első néhány sejtosztódás során az embrió végighalad a petevezetéken és eljut a méhig.

Habár a blasztomerek is aszinkron osztódnak, megkülönböztetjük a kétsejtes, négysejtes,

nyolcsejtes, szedercsíra (vagy kompakt morula) (8-16 sejt), hólyagcsíra (vagy blasztociszta) (32-

64 sejt) stádiumokat, mint jellemző állapotokat (7.A ábra).

A nyolcsejtes stádium végén megkezdődik egy szintén emlősökre jellemző speciális

folyamat, a kompaktálódás, így a következő stádiumot kompakt morulának is nevezik (7.B ábra).

Az eddig gömbölyű, hézagosan elhelyezkedő blasztomer sejtek ellaposodnak, szorosabban

összerendeződnek. Ezt a struktúrát a külső sejtek által kialakított számos sejt-sejt kapcsolat

stabilizálja, elzárva a belső összekapcsolódó sejteket.

13

7. ábra: Egér embrió stádiumok.

A) Fázis kontraszt mikroszkóppal készített fényképek: petesejt (a), zigóta (b), kétsejtes (c), négysejtes (d), korai nyolcsejtes (e), szedercsíra (f), hólyagcsíra állapot (g); ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma;

B) nyolcsejtes embrió kompaktálódás előtti (h) és utáni (i) scanning elektronmikroszkópos felvétele (Forrás: Gilbert 2006.);

C) beágyazódás előtt a peteburokból kibújó hólyagcsíra (j).

A 16 sejtes szedercsírában történik meg az első differenciálódás, kialakul az első két

különböző sejttípus. A kevesebb belső sejt hozza létre az embrionális sejteket, a belső sejtcsomót

(ICM), míg a többségében külső sejtek az extraembrionális sejteket, a trofektodermát (TE). Ezzel

együtt elindul egy másik jelentős folyamat is: fokozatosan csökken a sejtek fejlődési potenciálja,

már csak pluripotensek - vagyis sokféle, de nem minden sejttípust képesek létrehozni, valamint

egymást nem képesek helyettesíteni. Az ICM sejtekből alakul ki többek között az embrió,

valamint a petehártya, allantoisz, amnion, míg a TE sejtek az embrió fejlődéséhez szükséges

járulékos struktúrákat, mint például a méhlepény embrionális részét, külső magzatburkot hozzák

létre.

A következő osztódások során a 64 sejtes állapotra lejátszódik még egy folyamat, az

üregesedés. Az embrió gömbölyű felszínét adó TE sejtek folyadékot termelnek belülre,

létrehozva egy üreget, a blasztocölt, melyben a TE belső felszínére kapcsolódik egyik oldalon az

ICM. Ezt a jellegzetes stádiumot hívják hólyagcsírának. Itt az embrió fejlődése lelassul, a

folytatáshoz szükséges a méhbe való beágyazódás. Eddig az embriót a petesejt burka, egy

extracelluláris mátrix (zóna pellucida) veszi körül, mely védi az embriót az idő előtti

megtapadástól a petevezetékben. A méhbe érve éri el körülbelül azt a késői hólyagcsíra állapotot,

amikor a TE sejtek termelte enzimek segítségével „ki tud bújni” ebből a burokból (7.C ábra), és

megtörténhet a méh falán a megtapadás, és beágyazódás (Nagy és mtsai. 2003.a; Gilbert 2006.).

1.5.2 Molekuláris megközelítés

A fent leírt embriológiai és morfológiai változások hátterében számos összetett

molekuláris folyamat húzódik. A petesejt és a korai stádiumú embriók kis mérete ellenére

molekuláris biológiai és genetikai kutatásokból sok információ összegyűlt a genom, az RNS és

fehérje szintézis változásairól, szabályozásáról (Schultz 1986.; Edwards 2003.). Az egymást

követő sejtosztódások alatt az egész genomra kiterjedő, jól szervezett és gyorsan változó

génexpressziós mintázat valósul meg a normális egyedfejlődés biztosítására, szemben a felnőtt

szervezet differenciálódott sejtjeivel, melyek génexpressziójára egy állandó alapmintázat a

jellemző, és csak a genom kisebb része mutat változást a különféle környezeti hatásokra.

Az emlősök egyedfejlődése során két jelentős epigenetikai újraprogramozódás megy

végbe, mely során a génexpressziós mintázatok is megváltoznak minden sejtben. Először

közvetlenül a megtermékenyítés után (preimplantációs), majd később az ivarsejtek

képződésekor. Az elsőben a két ivarsejt nagyon eltérő epigenetikai mintázatú, kromatin

szerveződésű és sejtciklus fázisú haploid genomjából alakul ki a zigóta diploid génállománya.

Míg a kis méretű hímivarsejtben a DNS protamin fehérjékkel szorosan összetekerve, kompaktan

14

szállítódik, addig az óriási méretű emlős petesejtben a genom a testi sejtekre is jellemző hiszton

fehérjékkel lazábban szervezett kromatin struktúrában van jelen. Ahhoz, hogy kialakuljon az

egységesen működő genom, a két különböző struktúrának át kell alakulnia. A második genom

szintű újraprogramozódás az ivarsejtek képződésekor megy végbe az előbbihez képest sokkal

lassabban. Már a 11-12 napos embrióban megkezdődik egy általános DNS demetiláció a

primordiális csírasejtekben (primordial germ cells: PGC), melyet de novo metiláció követ,

kialakítva az ivarspecifikus imprinting mintázatot is. A hímivarsejtek esetén a folyamat a 18.

napon befejeződik, míg a petesejtnél az ovulációig tart (8. ábra).

A gének aktiválásának és inaktiválásának pontos időzítése kulcsfontosságú a normális

preimplantációs egyedfejlődésben. Az adott gének kifejeződésének hiánya, vagy bármilyen

késése rendellenességekhez vezet, ezért az újraprogramozódásban hibátlan aktiválási időzítésnek

és jól szervezett génkifejeződési mintázatnak kell megvalósulnia ahhoz, hogy megkezdődjön és

folytatódjon is az embrionális egyedfejlődés. Összehasonlító tanulmányokból kiderül, hogy bár

minden vizsgált emlősfajban lejátszódik az újraprogramozódás, annak mértéke és időzítése

jelentősen eltérhet a fajok között a preimplantációs egyedfejlődés során (Morgan és mtsai.

2005.).

15

8. ábra: Az epigenetikai újraprogramozódási ciklus egérben.

A preimplantációs egyedfejlődés alatt (jobb oldal), és az ivarsejtek képződésekor (bal oldal) lezajló folyamatok. ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; PGC: primordiális csírasejtek. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)

1.5.3 Megtermékenyítést követő változások

A megtermékenyítés után az első órától kezdve az apai kromatin szerkezet nagy

átalakuláson megy keresztül, amikor a protaminok lecserélődnek a petesejtben tárolt hiszton

fehérjékre, melyek közül főként a H3 és H4 hisztonok nagyon acetiláltak. Ezt követően a DNS

genom szintű demetilációja kezdődik el - bizonyos régiók kivételével, mint például a

centromerek heterokromatinja, és az apai metilált imprinting gének. A kromatin fellazul, és

létrejön az apai elősejtmag (Santos és Dean 2004.).

Ezalatt fejeződik be a petesejt második meiotikus osztódása kialakítva az anyai

elősejtmagot. Általános hiszton deacetiláció zajlik le az egér petesejtben a meiózis alatt, mely

szerepet játszhat a genom újraprogramozódásában. Ez elengedhetetlen előfeltétele annak, hogy a

differenciálódott petesejt átalakulhasson totipotens zigótává. A meiózis két szakasza között

kimutatható a kromatin szerkezet ideiglenes változása. A H4 hiszton 12-es acetilált lizinje (H4-

K12Ac) kulcsfontosságú epigenetikai jel, mely az aktív géneken található meg (Smith és mtsai.

2002.).

Az apai és anyai elősejtmag eltérő epigenetikai - DNS metilációs, hiszton acetilációs -

mintázata feltehetőleg az eltérő transzkripciós aktivitást határozza meg. Amíg a petesejt

megtermékenyítésekor mindkét genomban azonos mennyiségű, kevéssé acetilált hiszton H4

mutatható ki, addig ez a kiegyenlített állapot hamar megváltozik, és az apai elősejtmagban már

nagyobb mennyiségben van jelen a többszörösen acetilált H4 (9. ábra) (Adenot és mtsai. 1997.).

Az anyai genomban több heterokromatin szerkezet található és ezzel összhangban alacsonyabb a

transzkripciós aktivitás, szemben az apaival, ahol több eukromatikus régió, és lényegesen

aktívabb transzkripció mutatható ki (Reik és mtsai. 2003.). Ezt az apai genomról kimutatható

16

9. ábra: Újraprogramozódás az anyai és apai elősejtmagban.

Az aktív transzkripciót okozó módosítások zöld színnel, a gátlók pirossal, a protaminok lilával vannak jelölve, a színátmenetek a módosítások intenzitását, a pöttyözés a centromerek környékén található heterokromatint, valamint az imprinting mintázatot jelölik a megtermékenyítéstől a két elősejtmag egyesüléséig. Ac: acetiláció; Me: metiláció. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)

kisebb mértékű mRNS átírást hívják kisebb genom aktiválásnak (Memili és First 2000.). A két

elősejtmag egyesül, majd replikálódik, és végbemegy az első sejtosztódás létrehozva a két

utódsejtet (blasztomert), melyekben már egy sejtmagban együtt található meg a két szülői

genom. A kromatin szerkezeten alapuló, általános transzkripcionálisan gátolt állapot alakul ki,

melyért főként a HDAC enzimek a felelősek, és amelyet később a hiszton fehérjék fokozott

acetilációja vált fel (10. ábra) (Taylor és mtsai. 2003.).

1.5.4 Embrionális genom aktiváció

Az egérben az első sejtosztódás után megy végbe az első nagy fejlődésbeli átmenet: az

„anyaiból embrionálisba történő átmenet”, más néven az embrionális genom aktiváció, de ezzel

egyidejűleg több más jelentős molekuláris folyamat is lezajlik (Aoki és mtsai. 1997.). Az

egyedfejlődési programot eredendően az anyai - petesejt - eredetű RNS-ek és fehérjék indítják el.

Már a petesejtek fejlődése alatt mindenféle RNS - köztük az mRNS-ek - és fehérjék

szintetizálódnak és halmozódnak fel, melyek jellemzően nagyon stabilak. A petesejt növekedése

és érése során nagymértékben megváltozik az újan szintetizált fehérjék mintázata, valamint az

mRNS-ek közel fele lebomlik (Bachvarova 1985.). A fejlődés zavartalan továbbviteléhez

azonban új gének kifejeződése szükséges, az EGA során megtörténik a fő genom aktiváció:

– A petesejtben felhalmozott és tárolt specifikus RNS és fehérje tartalékok lebontása, melyek a

megtermékenyítéshez, az azt követő első sejtosztódáshoz és a genetikai

újraprogramozódáshoz nélkülözhetetlenek, és amiket azután már nem expresszál tovább az

17

10. ábra: A génexpresszió változása a korai egyedfejlődés során az egér embrióban.

embrió. Jellemző az anyai fehérjék nagyobb lecserélődési sebessége.

– Az anyai RNS-ek leváltása embrionálisokra, amikre mind a petesejtnek, mind a korai

embriónak folyamatosan szüksége van.

– A génexpresszió elindítása, új RNS-ek átírása, amik a petesejtben még nem voltak jelen, de

az embrió továbbfejlődéséhez szükségesek (Schultz 2002.). Az egérben már a kétsejtes

stádium közepétől számos embrionális gén aktiválódik, és megjelennek az embrió saját maga

termelte RNS-ek, fehérjék (11. ábra) (Piko és Clegg 1982.).

A különböző fajok között eltérés lehet, így például más rágcsálókban, mint a patkány

(Rattus norvegicus) (Zernicka-Goetz 1994.), vagy aranyhörcsög (Mesocricetus auratus)

(Seshagiri és mtsai. 1992.), szintén két sejtes állapotban, míg a szarvasmarhában (Mann és

Bartolomei 2002.), kecskében (Capra hircus) (Sakkas és mtsai. 1989.), birkában, nyúlban

később, a nyolcsejtes állapotban, a macskában (Felis catus) (Hoffert és mtsai. 1997.) és az

emberben pedig a négy-nyolcsejtes állapotban zajlik le (Telford és mtsai. 1990.).

1.5.5 Az első differenciálódást kísérő változások

A génexpresszió változása sokszor a környező sejtek differenciálódására indukálódik,

különböző faktorok kiválasztásával, vagy a sejt-sejt kapcsolatok változásával. Ez történik

például a szedercsíra állapotban (Kidder 2002.).

Az egysejtes stádiumtól kezdődően a DNS metiláció és hiszton módosítások genom

szintű mintázata is folyamatosan változik az osztódásokkal. A hólyagcsíra állapot létrejöttéig

18

11. ábra: Az egér embrionális genom aktivációját kísérő molekuláris folyamatok.

Pirossal az anyai, kékkel az apai, sárgával az embrionális genomhoz kapcsolódó események vannak jelölve, a színátmenetek az intenzitás változását jelzik az egyedfejlődés során. (Forrás: Schultz 2002.)

folyamatos a DNS demetilációja, majd amikor az embrionális (ICM) és extraembrionális (TE)

sejtek külön válnak, jelentkezik először az epigenetikai mintázatban is eltérés. A TE sejtekben

alacsony DNS metilációs szint mutatható ki, például az inaktív X kromoszómán. Az ICM-ben

széleskörű de novo metiláció zajlik már a szedercsíra állapottól kezdve, valamint a hiszton

acetiláció is fokozottabb (12. ábra). Ez az átprogramozódás szükséges az ICM sejtek

pluripotenciájának fenntartásához, a későbbi

sejtvonalak kialakításához, valamint a

génexpresszió helyes beindításához is az

embrióban.

A két sejttípus génexpressziójának eltérő

indukálása a kutatások középpontjában áll. Egér

embrionális őssejtek (embrionic stem cells:

ESC) vizsgálatából sikerült olyan

kulcsfontosságú géneket azonosítani, név szerint a Pou5f1 (Oct-4) és a Nanog homeobox

transzkripciós faktorokat, melyek specifikusak az ICM sejtekre és azok pluripotenciájának

fenntartásáért felelősek (Boiani és mtsai. 2002.; Mitsui és mtsai. 2003.).

1.6 Embrió technológiák

A legtöbb embrió technológia részét képezi az embriók hosszabb-rövidebb ideig tartó in

vitro körülmények közötti tenyésztése, ami - mint egy nem természetes fiziológiai környezet -

hatással van a génexpresszióra, ezen keresztül a fejlődés menetére is (Niemann és mtsai. 2002.).

Az anyai környezetből kivett és in vitro körülmények közt tenyésztett embriók a mesterséges

beavatkozások hatására minőségükben, fejlődésükben eltérnek a természetes módon létrejövő, in

vivo megfelelőjüktől. Feltehetőleg a tápanyagok (metionin, homocisztein, poliaminok, B12

vitamin, fólsav, urea) és környezeti hatások olyan finom változásokat indukálnak az epigenetikai

újraprogramozódásban, melyek csak később nyilvánulnak meg a fenotípusban, mint a korai

magzati elhalás, a születési súlyban való óriási különbségek, vagy számos felnőttkori betegség

(Taylor és mtsai. 2003.). Ezért a normális egyedfejlődés folyamatainak molekuláris szintű

meghatározása előfeltétele a terhesség alatti táplálkozás optimális kialakításának és a különböző

embrió technológiák javításának is.

Az in vitro tenyésztett embriók óriási előnye, hogy lényegesen egyszerűbb és könnyebb

kísérleteket végezni velük, azonban vizsgálatukból mégsem kapható az in vivo megfelelőjükkel

teljesen azonos eredmény, és ezekből nem minden esetben lehet egyértelműen következtetni a

természetes fejlődési folyamatokra. A különböző biotechnológiai úton előállított emlős embriók

19

12. ábra: Epigenetikai különbségek az egér embrió első két sejttípusában.

ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; Xi: inaktív X kromoszóma; többit lásd: 9. ábra. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)

összehasonlítása fontos különbségeket tárhat fel, ezért szükség van olyan további állatmodell

kísérletekre, amelyekből megérthető a korai embriók egyedfejlődési rugalmassága és amelyek

eredménye által javíthatók az embrió technológiák hatékonysága és mérsékelhetők a kedvezőtlen

következmények.

A fontosabb mesterséges beavatkozások, melyek a későbbiekben a vizsgálatok tárgyát

képezik: in vitro tenyésztés, parthenogenetikus aktiválás, krioprezerváció (fagyasztás) és

vitrifikáció (mélyhűtés), valamint a sejtmagátültetés (klónozás).

1.6.1 In vitro tenyésztés

A preimplantációs egyedfejlődés mesterséges körülmények között, in vitro is

hasonlóképpen végigmegy, de a folyamat nem teljesen zavartalan. Valamivel hosszabb időre van

szükség a hólyagcsíra stádium eléréséig, mint in vivo, az egyes stádiumokba lassabban jutnak el

az embriók, vagyis a fejlődés általános lelassulása jellemző (Harlow és Quinn 1982.). Számos

kísérlet irányul az in vitro tenyésztés optimális körülményeinek feltárására, az in vivo állapot

modellezésére. A fejlődéshez speciális tápoldatra, inkubációs hőmérsékletre és oxigén, illetve

szén-dioxid tartalomra van szükség (lásd a „3. Anyagok, módszerek” fejezetben: „3.2.4 Embriók

tenyésztése”). Az in vitro tenyésztéssel a külső környezeti feltételek hatásait lehet vizsgálni.

1.6.2 Parthenogenetikus aktiválás

A parthenogenetikus aktiváláskor a petesejtet kémiai anyagokkal indukálják. Ennek

hatására megtermékenyítés nélkül megkezdi az egyedfejlődést. A petesejt mesterséges aktiválása

a klónozásnak is fontos lépése. Az embrionális fejlődés beindításáért felelős, de gyakorlati

alkalmazásán túl lehetőséget nyújt a belső környezeti feltételek, a petesejt és genomjának hatásai,

valamint a megtermékenyülés alatt bekövetkező sejt- és molekuláris szintű változások

tanulmányozására is. Ezzel az eljárással a tisztán anyai génállományú diploid sejt in vitro

körülmények között szintén képes eljutni a hólyagcsíra állapotig. Élő állatot azonban nem lehet

így létrehozni, mert a petesejt érésekor lezajló imprinting eredményeképpen bizonyos

kulcsfontosságú gének inaktívak maradnak (Nagy és mtsai. 2003.a).

1.6.3 Krioprezerváció, vitrifikáció

A krioprezerváció (fagyasztva tartósítás, fagyasztás) lényege, hogy élő sejteket,

embriókat, vagy szöveteket a hőmérséklet megfelelő mértékű csökkentésével konzerválnak, és

egy későbbi időpontban - akár több évvel később - felhasználnak, így lehetővé teszi a

mintanyerés és felhasználás időbeli és térbeli elkülönítését (Nagy és mtsai. 2003.b).

Különleges, gyors fagyasztási eljárás a vitrifikáció (mélyhűtés): gyors fagyasztás szilárd

20

felületen (SSV), vagy műszalmában (ISV). A krioprezervációval szemben ezek során nagyobb

koncentrációban alkalmaznak krioprotektáns anyagokat, több lépésben történik az ekvilibráció és

nagy a hűtési sebesség, így a víztartalom amorf formában szilárdul meg, nincs ideje

kristályosodni. Egér embriókon alkalmazták először sikeresen (Rall és Fahy 1985.), azóta

egyszerűsége, olcsó és gyors kivitelezhetősége miatt széleskörűen elterjedt (Dinnyes és mtsai.

2000.; Vajta 2000.).

Nagyon kevés információ található az embrió mélyhűtést kísérő molekuláris biológiai

jelenségekről, a preimplantációs stádiumú embrió genom aktivációját, további fejlődését

befolyásoló hatásairól. A beavatkozást kísérő génexpressziós változások vizsgálata magyarázatot

adhat számos megfigyelt fejlődési különbségre, rendellenességre. A hűtési terhelés indukálta

sejtszintű válasz során elindul a sokat kutatott programozott sejthalál folyamata is, és a

felmelegítés során szintén számos gén aktiválódik (Sonna és mtsai. 2002.).

1.6.4 Klónozás

Mikromanipulációs technikával egy idegen sejt sejtmagját injektálva olyan petesejtbe,

amelyiknek előzőleg eltávolították a saját sejtmagját, majd mesterségesen aktiválva képes élő

állattá fejlődni (13. ábra). A testi sejtes sejtmagátültetés (SCNT) módszerét már 10 éve szinte

minden gazdasági haszonállatfajon „rutinszerűen” alkalmazzák, mindennek ellenére igen

alacsony hatékonyságú és növelése érdekében a technika összes lépésének javítása szükséges

(Wilmut és mtsai. 1997.; Dinnyes és mtsai. 2002.). Sejtmag átültetéses (vagy klónozási)

kísérletekből kiderült, hogy a két-, négy- és nyolcsejtes embriók, vagy a hólyagcsíra ICM és TE

sejtjeinek, sőt a felnőtt egyed testi sejtjének sejtmagja is képes élő állatot létrehozni, ha azt

petesejtbe viszik át (Cheong és mtsai. 1993a,b; Tsunoda és Kato 1998.; Wakayama és mtsai.

1998.). Ezt azt jelenti, hogy a petesejt citoplazmája hordozza azt a képességet, amivel át tudja

21

13. ábra: A testi sejtes sejtmagátültetés (klónozás) lépései.

programozni a sejtmagot.

Az értekezésnek nem lesz tárgya a továbbiakban, mégis itt említem meg a tenyésztési

nehézségek, a meddőség kikerülésére alkalmazott számos mesterséges reproduktív módszert,

összefoglaló nevükön asszisztált reprodukciós technikákat (ARTs), melyek az ivarsejtek

mindennemű manipulációját foglalják magukba. Sok tulajdonságuk közös a klónozással, és

gyakran együtt tárgyalják ezeket (Nagy és mtsai. 2003.c).

A szöveti, differenciálódott sejtek sejtmagjának rendkívüli alakíthatósága ellenére a

klónozás és más ARTs hatékonysága meglehetősen alacsony, eredménye nem jósolható, és

rendellenességek özönét írták le a klónozott embriókban, magzatokban és utódokban. Ezekben a

módszerekben az első testi sejtből klónozott emlős - Dolly nevű birka - előállítása óta sem

következett be nagy áttörés. Az állatok klónozásánál felmerült problémák közül a legfontosabbak

a korai vetélések gyakorisága, a vemhesség és a szülés során fellépő különféle problémák, az

utód születési és fejlődési rendellenességei, illetve a klónozott utódok gyakori korai elpusztulása,

melyek a gyakorlati felhasználás fő akadályai. Ezen problémák pontos oka még nem ismert, de a

rendszer bonyolultságából adódóan számos technikai tényező a felelős, valamint genom

újraprogramozódási hiányosságokra vezethetők vissza (Wilmut és mtsai. 2002). Az igen

alacsony hatékonyságnak az egyik legfőbb oka a nem teljes vagy nem tökéletes epigenetikai

újraprogramozódás, mely felveti az epimutációk jelentőségét, öröklődő jellegét is (Reik és mtsai.

2003.).

1.7 Molekuláris biológiai megközelítési lehetőségek

Az emlősök preimplantációs egyedfejlődése az egyik legnehezebben vizsgálható

folyamat, melynek több gyakorlati oka is van. Az állatvilágban az emlősök petesejtje az egyik

legkisebb méretű. Maradva az egér példájánál, egy frissen kiszabadult petesejt átlagosan 85 µm

átmérőjű, 8 pg DNS, 0,35-0,5 ng RNS - melyből csupán 1-20 pg az mRNS - és 23 ng fehérje

tartalommal, így nem meglepő, hogy nagyon nehéz kísérletekbe vonni, manipulálni. Másrészről

csak kis számban termelődik, általában kevesebb, mint 10 petesejt szabadul ki egy ciklusban.

Harmadsorban a beágyazódás előtti szakasz normálisan az anya szervezetén belül zajlik. Ezért a

petesejtek, embriók molekuláris biológiai vizsgálata nagy kihívást jelent (Nagy és mtsai. 2003.a;

Gilbert 2006.).

1.7.1 Módszertár

Korunk fejlődő molekuláris módszereinek az alkalmazásával újabb ismeretek szerezhetők

az emlősök korai egyedfejlődéséről, valamint segíthetnek az állattenyésztés különböző

22

biotechnológiai módszereinek, a klónozás és az ARTs hatékonyságának, és a terápiás

alkalmazások javításában (Kanka 2003.). Ilyen embrió genomikai és transzkriptomikai

módszerek: a teljes genom szekvenálások, a teljes cDNS könyvtárak és EST-szekvencia (cDNS-

ből származó rendszertelen DNS szakasz) gyűjtemények, az mRNS megkülönböztető

megjelenítés (differential display: DD), a szupresszív szubtraktív hibridizáció (suppression

subtractive hybridization: SSH), a szekvenáláson alapuló részleges génexpresszió vizsgálat

(serial analysis of gene-expression: SAGE), a reverz transzkripcióval (RT) kombinált polimeráz

láncreakció (PCR) (RT-PCR) különböző típusai (hagyományos-végpont, és kvantitatív, real-

time), és napjaink forradalmian új eszköze, a DNS mikrocsip technológia (DNS síkmátrix

technika) (Ko 2004., Diachenko és mtsai. 1996., Velculescu és mtsai. 1995., DeRisi és mtsai.

1996.). Az egyes azonosított expresszált embrionális gének jelentőségét és szerepét az RNS

interferenciával lehet tovább vizsgálni. A kromatin epigenetikai mintázatának vizsgálatára a

kromatin immunprecipitációs technika (chromatin immunoprecipitation: ChIP) szolgál. Ezeket

egészíti ki számos alap fehérjevizsgáló biokémiai módszer, mint a kétdimenziós SDS-

poliakrilamid gélelektroforézis, Western blot, fluoreszcens in situ hibridizáció (fluorescence in

situ hybridization: FISH).

1.7.2 A génexpresszió vizsgálata

A sejtben zajló folyamatok működésbeli változásai általában akkor történnek meg,

amikor a fehérjék aktivációs állapota, vagy mennyisége megváltozik. Ezzel együtt gyakran a

környezeti hatásokra, a differenciálódásra adott első sejtes válaszok a gének transzkripciójában

jelentkeznek, és sok nem kódoló mRNS is létezik, amelyek RNS formájában fejtik ki hatásukat

(Taylor és mtsai. 2003.). Mindezek alapján a sejtek környezeti hatásokra, például az eltérő

ingerekre a normális fejlődési folyamatokban, a különféle embrió technológiákra adott azonnali

reakcióját a gének transzkripciójának vizsgálatával, a génspecifikus mRNS-ek mennyiségének

meghatározásával, a szűkebb értelemben vett génexpresszió nyomon követésével lehet

kimutatni.

Az egy sejtben egy időpontban található átlagos mRNS mennyisége a 100000-es

nagyságrendnek felel meg, mely körülbelül 10000 gén expressziójából ered (részletesebben:

Függelékek: II. Egy sejt RNS tartalma). Ezek közül több ezer gén csak nagyon alacsony szinten

(≤ 10 mRNS/sejt) fejeződik ki, ami nagymértékben megnehezíti és problémássá teszi ezeknek a

globális elemzését (Kuznetsov és mtsai. 2002.). Amikor kis számú molekula határozza meg egy

kémiai egyensúlyban a reakció sorsát, bizonyos fokú véletlenszerű ingadozás várható. Ahogy

növekszik a molekulák (mRNS) száma, úgy nő a reakció jósolhatósága (a szintetizálódó fehérjék

23

száma) (Raser és O'Shea 2005.). Például ha egy transzkripciós aktivátor molekulából kevés

található a sejtekben, nagyfokú mRNS szint különbségek várhatók a sejtek között (Fiering és

mtsai. 2000.). Ezek a hatások hozzájárulnak a kimutatható nagy egyedi génexpressziós

különbségekhez, valamint ez a változékonyság előre vetíti fontos szerepüket az aszimmetria

létrehozásával a biológiai folyamatokban, például az egyedfejlődésben is, melyben a sejtek

differenciálódását határozza meg (Elowitz és mtsai. 2002.; Peixoto és mtsai. 2004.).

A sejtek génjei (DNS-e) viszonylag stabilnak, állandónak tekinthetők, ezzel szemben az

RNS, különösen az mRNS állományuk, összetételük nagymértékben változó, és tükrözi a gének

adott időben, adott helyen, adott környezeti tényezők melletti kifejeződését. Az RNS lényegesen

instabilabb a ribonukleáz (RNáz) fehérjék jelenlétének következtében, melyek az RNS

molekulákat bontják le. Az RNázok nagyon stabil enzimek, nem igényelnek kofaktorokat a

működésükhöz, igen kis mennyiségben is hatékonyak, nehéz őket inaktiválni, és gyakoriak. Az

RNáz szennyeződések megtalálhatók az ember bőrén, a levegőben, a porszemcséken is, ahol

baktériumok, gombák tenyésznek. Ezért az RNS tisztítása és vizsgálata sajátságos technikát,

különleges tisztaságot igényel.

A molekuláris biológia fejlődésének köszönhetően a korai embriófejlődés során

expresszált ismert gének száma fokozatosan növekszik. Mára már több mint 10000 gén

működését leírták a petesejttől a hólyagcsíra állapotig terjedő időszakban, az egér genom közel

egyharmadát (Ko és mtsai. 2000.; Zeng és mtsai. 2004.,2005.). Ezeknek a géneknek az mRNS

mintázata igen hasznos eszköz az embriók minősítésében, kulcsfontosságú gének funkciójának a

feltárásában, valamint az in vitro körülmények optimalizálásában. A normális egyedfejlődés

szabályozásáról ad információt az embrió stádium specifikus génexpressziós mintázatának

meghatározása. A különbségek azonosítása és a különböző rendellenes fenotípusokhoz társítása

hozzájárul a molekuláris folyamatok megismeréséhez. Ezenkívül a génexpresszió minőségi és

mennyiségi változásai, amik eltérést mutatnak a normálishoz képest, a későbbi fejlődési

rendellenességek lehetséges (rejtett) előjelei lehetnek. A génexpressziós mintázatok

összehasonlításával megállapítható, hogy a fejlődés normális vagy rendellenes, ami különösen

fontos a preimplantációs embrió technológiákban (ARTs, SCNT).

Az első alapvető lépések az összetett génszabályozó hálózatok megértése felé a

génexpressziós mintázatok jellemzése a különböző embrionális stádiumokban, valamint a

különböző módon előállított embriókban (in vivo, in vitro, parthenogenetikusan aktivált,

mélyhűtött, klónozott) és az újraprogramozódási folyamatok mechanizmusának,

szabályozásának megismerése (Lechniak 2002.). Azonban több nemrégen közölt génexpressziós

24

tanulmányban nem vettek figyelembe, illetve teljesen mellőztek fontos szempontokat az

eredmények értelmezésekor és tárgyalásakor. Sok génről írtak le rendellenes expressziót

különböző embrió technológiák alkalmazása során, melyek azonban nem álltak összefüggésben a

megfigyelt fenotípussal. Számos esetben pedig még ha a módszereket precízen alkalmazták is, a

kapott különbségek funkcionális jelentőségét ritkán értelmezték (Skern és mtsai. 2005.).

A génexpresszió végeredményben az egyedi sejtek szintjén szabályozódik. Ennek

ellenére ma a legtöbb génexpressziós vizsgálat még mindig több száz, ezer vagy akár millió sejt

felhasználásával történik gyakorlati megfontolásokból. Az így kapott „átlagos sejt” eredménye

elfedi az egyedek közti különbségeket, így nem valószínű, hogy ez kitűnik egy kis

sejtpopulációban, amikor teljes sejtkultúrát vagy szövetet vizsgálnak (Levsky és Singer 2003.;

Bengtsson és mtsai. 2005.).

1.7.3 Reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció

Az RT-PCR új lehetőséget teremtett a preimplantációs egyedfejlődés során zajló

génexpressziós változások tanulmányozásában. A módszer lényege, hogy a kis számú

petesejtből, embrióból kinyert RNS-t (mRNS-t) először cDNS-sé írják át (reverz transzkripció),

melyet a polimeráz láncreakció segítségével szekvencia (gén) specifikusan sokszorosítanak,

hogy valamilyen módszerrel aztán könnyen detektálható, akár számszerűsíthető jelet kapjanak. A

legáltalánosabban elfogadott és bevált technika a kvantitatív, reverz transzkripcióval kombinált

real-time polimeráz láncreakció (qRT-PCR) módszere. Összehasonlítva a hagyományos, vagy

más néven végpont RT-PCR-rel, számos előnye közül a legfontosabbak: érzékenyebb, sokkal

kényelmesebb (egyszerűbben kivitelezhető), szélesebb a kimutatási tartománya, pontosabban

reprodukálható (kisebb a variabilitása) és megbízhatóbb (Gal és mtsai. 2006.).

A real-time PCR az eredeti PCR egyszerű elméletét (Mullis és Faloona 1987.) párosítja a

fluoreszcens detektálás gyakorlatával, melyben a mennyiségi meghatározás újdonsága és alapja a

küszöbérték ciklusszám (Ct). A real-time PCR során a detektálási stratégia többféle is lehet. A

kísérletek során a fluoreszcens SYBR Green I festékre esett a választás, mely a szekvenciától

függetlenül minden kettős szálú DNS-hez kötődik, és ekkor megnő a fluoreszcencia intenzitása.

A mennyiségi mérések alapgondolata, hogy a PCR-be vitt specifikus DNS szekvencia és a

kimutatható termék mennyisége között számszerű összefüggés van. A PCR során minden

ciklusban egyszer, általában a végén mérik a kétszálú DNS termék fluoreszcens jelét. A mért

fluoreszcencia értékeknek az idő (itt a PCR ciklusok száma) függvényében ábrázolt görbéje

alapján számítható ki a Ct értéke, vagyis a PCR azon ciklusszám értéke, amelynél a reakcióban

felhalmozódó termék fluoreszcens jele először meghaladja a háttértől jól elkülöníthetően a

25

kimutatási küszöbértéket. A Ct fordítottan arányos a bevitt, mérni kívánt DNS mennyiségével,

vagy közvetve a kiindulási RNS mennyiségével a szigmoid görbe felfutó, exponenciális

szakaszában, ahol a PCR ideális körülményei feltételezhetők. Minél kisebb ciklusszámnál

mutatható ki a fluoreszcens jel, annál nagyobb a DNS/RNS kópiaszáma (Walker 2002.).

A fluoreszcens alapú PCR kémia az elmúlt 6 évben központi tudományos technológiává

fejlődött, és mára az „arany standard”-ként vált elfogadottá fertőző vírusok és baktériumok

mennyiségi meghatározásában a klinikai mintákból, egyszerű nukleotid polimorfizmus (single

nucleotide polymorphism: SNP) vizsgálatokban, genetikai változatok kimutatásában akár

egyetlen sejtből is, ivari meghatározásra emberi blasztomerekből, betegségek (például tumor)

diagnosztizálására, génterápia követésére, preimplantációs embriók RNS vizsgálatára, mikrochip

eredmények ellenőrzésére, vagy a biotechnológiai alkalmazásokban az élelmiszerek genetikai

módosításának mennyiségi meghatározására és a transzgenikus állatok zigóta jellegének, ploidia

fokának pontos meghatározására, és még több más alkalmazásban (Bustin 2004.).

1.7.4 Egyedi embriók és sejtek génexpressziós vizsgálata

Munkám során a génexpresszió (az mRNS mennyiség) változásának követésére,

összehasonlítására legalkalmasabb módszert, a qRT-PCR módszerét választom, mely

kiválasztásának indoklását a „4. Eredmények” fejezet: „4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek

összehasonlítása” részben ismertetem. A különböző felhasználási területen kipróbált módszer

számtalan változata közül kiválasztottam egyet, mely reményeim szerint alkalmazható és kellően

érzékeny az egyedi preimplantációs embrió minták vizsgálatára is. Részletes leírását a „3.

Anyagok, módszerek” fejezet „3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció” és „3.3.8 Kvantitatív PCR

adatelemzés” részekben tárgyalom.

Általában a beágyazódás előtti embriók génexpressziós vizsgálatában 5-20 egybegyűjtött

embriót használnak fel a mérésekhez (Zhang és mtsai. 1994.; Gutierrez-Adan és mtsai. 1997.;

Lighten és mtsai. 1997.; Wrenzycki és mtsai. 1998.; Edashige és mtsai. 2000.), és csak kivételes

esetekben egyedi embriókat (Steuerwald és mtsai. 1999., Hartshorn és mtsai. 2003.). Így csak a

csoport átlagos génexpressziós értéke kapható meg statisztikai értékelés nélkül, az egyedi

különbségeket nem lehet vizsgálni. Az embriók közti morfológiai, fejlődési különbségek mögött

bizonyosan génexpressziós különbségek állnak, melyeket eltérő epigenetikai mintázatok

okoznak és így ezeknek egyéb közvetett hatásai is feltételezhetők. Fontos szempont tehát az

eredmények helyes értelmezéséhez, hogy nem heterogén mintákon, hanem egyedi embriókon

végezzenek kísérleteket.

26

1.8 Vizsgált gének

A különböző kísérletekben vizsgált gének teljes nevét, a dolgozatban használt rövidített

nevét, valamint leírását az 1. táblázatban gyűjtöttem össze.

Rövid név Gén neve FunkcióActb actin, beta, cytoplasmic A fehérje minden eukarióta sejtben megtalálható nagy számban. A sejt

alakjának fenntartásában és mozgásképességében játszik szerepet. Általában használják referenciának, mint háztartási gén (Cleveland és mtsai. 1980.; Alonso és mtsai. 1986.; Kreuzer és mtsai. 1999.).

Cenpf centromere protein F A kromoszómák szétválásában játszik szerepet a mitózis során, másik neve mitozin (Zhu és mtsai. 1995.).

Cirbp cold inducible RNA binding protein

Hűtési stresszben van szerepe a sejtmagban (Nishiyama és mtsai. 1997.).

Dazap2 DAZ associated protein 2 RNS kötő fehérje, a DAZ infertilitási faktorhoz kötődik (Yang és mtsai. 1997.).

Eef1e1 eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1

A fehérje szintézisben van szerepe (Quevillon és Mirande 1996.).

Eif1a eukaryotic translation initiation factor 1A

A fehérje szintézis megkezdésében van szerepe, és a szállításban, mint membránfehérje (Roth és mtsai. 1987.).

Eif4e eukaryotic translation initiation factor 4E

A fehérje szintézis szabályozásában játszik szerepet a citoplazmában (Altmann és mtsai. 1989.).

G6pdx glucose-6-phosphate dehydrogenase X-linked

A sejt anyagcseréjében szerepet játszó enzim (Ruddle és Roderick 1968.).

Gapdh glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Klasszikus háztartási gén, a glikolízis energiatermelő fázisában részt vevő enzim (Crew és Mirskaia 1931.).

H2afz H2A histone family, member Z

A kromoszómák szerveződésében és a nukleoszóma felépítésében játszik szerepet (Misawa és mtsai. 2000.).

Hist2h2aa2 histone cluster 2, H2aa2 A nukleoszóma felépítésében, a kromoszómák kondenzálódásában és feltekeredésében, a génexpresszió szabályozásában szerepet játszó hiszton fehérje. Háztartási gén, közismert neve H2A (Sittman és mtsai. 1983.).

Hprt1 hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase 1

A purinok bioszintézisét és lebontását, valamint a hipoxantin és dopamin lebontását végzi (Coleman 1962.).

Hspa1a heat shock protein 1A A hőhatásra adott stressz válaszban, a DNS hibák javításában, és a telomerek hosszának fenntartásában játszik szerepet, közismertebb neve Hsp70 (Lowe és Moran 1986.).

Nanog Nanog homeobox Egy újonnan felfedezett transzkripciós faktor. Expresszióját korai stádiumú embriókban, embrionális őssejtekben, és többféle szövetben mutatták ki. A hólyagcsírában csak az ICM-ben van jelen, azok pluripotenciáját tartja fenn, valamint gátolja az extraembrionális endodermává differenciálódását (Kawai és mtsai. 2001.).

Pgk1 phosphoglycerate kinase 1 A glikolízisben részt vevő transzferáz enzim (Kozak és mtsai. 1974.).Polr2a polymerase (RNA) II (DNA

directed) polypeptide AAz RNS polimeráz II legnagyobb alegysége, mRNS szintetizáló enzim (Pravtcheva és mtsai. 1986.).

Pou5f1 POU domain, class 5, transcription factor 1

Transzkripciós faktor, közismert neve Oct-4. Expresszióját korai stádiumú embriókban, embrionális őssejtekben, az érett petesejtben, és a csírasejtvonalban mutatták ki. A hólyagcsíra állapotú embrióban csak az ICM-ben van jelen, azok pluripotenciáját tartja fenn (Schöler és mtsai. 1989.; Palmieri és mtsai. 1994.).

Ppia peptidylprolyl isomerase A Peptidil-prolil cisz-transz izomeráz aktivitása révén a fehérjék feltekeredésében játszik szerepet, másik neve ciklofillin A (Handschumacher és mtsai. 1984.).

Rbm3 RNA binding motif protein 3

Szerepet játszik a hűtési stresszben, a transzlációban riboszóma-kötési képessége által, valamint a mikroRNS-ek közvetítette géncsöndesítésben (Derry és mtsai. 1995.).

27

Rövid név Gén neve FunkcióSfrs3 splicing factor,

arginine/serine-rich 3Az mRNS érésben játszik fontos szerepet, másik neve SRp20 (Ayane és mtsai. 1991.).

Slc2a3 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 3

Egy plazmamembrán transzportfehérje, közismert neve Glut-3. Felnőtt egérben főként az agy neuronsejtjeiben található meg, és ez az egyik első embrionálisan kifejeződő glükóz-transzporter fehérje a korai hólyagcsíra állapotú embrió trofektoderma sejtjeiben (Kayano és mtsai. 1988.; Pantaleon és mtsai. 1997.).

Sod1 superoxide dismutase 1, soluble

Az oxidatív és hő stresszben, öregedésben játszik fontos szerepet. A reaktív oxigén gyökök eltávolítására képes a citoplazmában, részt vesz a DNS kettős szálú töréseinek javításában, másik neve CuSOD (Selander és mtsai. 1969.).

Sod2 superoxide dismutase 2, mitochondrial

Az előbbihez hasonló, de a mitokondriumban található enzim, másik neve MnSOD (Creagan és mtsai. 1973.).

Trp53 transformation related protein 53

Egy transzkripciós faktor, a sejtciklust blokkolja, kulcsszerepe van a DNS károsodást követő jelátvitelben, a programozott sejthalálban, közismertebb neve p53 fehérje (Oren és mtsai. 1983.).

Ubc ubiquitin C Fehérjék transzláció utáni módosítását végző kisméretű szabályozó fehérje (Board és mtsai. 1992.).

Ywhaz tyrosine 3-monooxygenase/ tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide

A jelátvitelben szereplő fehérje, foszforilált szerin oldalláncot képes megkötni (Suen és mtsai. 1995.).

Hiszton-deacetilázok: közös tulajdonságuk, hogy a kromatin szerkezet módosításával, a hisztonok deacetilációjával a transzkripció szabályozását végzik.Hdac1Hdac2Hdac3Hdac4Hdac5Hdac6Hdac7Hdac8Hdac9Hdac10Hdac11

histone deacetylase 1 (Yang és mtsai. 1996.)histone deacetylase 2 (Yang és mtsai. 1996.)histone deacetylase 3 (Mahlknecht és mtsai. 1999.)histone deacetylase 4 (Jeong és mtsai. 2004.)histone deacetylase 5 (Verdel és Khochbin 1999.)histone deacetylase 6 (Verdel és Khochbin 1999.)histone deacetylase 7 (Kao és mtsai. 2000.)histone deacetylase 8 (Kawai és mtsai. 2001.)histone deacetylase 9 (Zhang és mtsai. 2001.)histone deacetylase 10 (Kao és mtsai. 2002.)histone deacetylase 11 (Strausberg és mtsai. 2002.)

Hiszton acetil-transzferázok: hiszton acetil-transzferáz aktivitásuk révén a transzkripció szabályozását végzik.CrebbpEp300Gcn5l2Hat1HtatipPcafTaf1

CREB binding protein (Chrivia és mtsai. 1993.)E1A binding protein p300 (Missero és mtsai. 1993.)GCN5 general control of amino acid synthesis-like 2 (yeast) (Xu és mtsai. 1998.)histone aminotransferase 1 (Bulfield 1978.)HIV-1 tat interactive protein, homolog (human) (Ran és Pereira-Smith 2000.)p300/CBP-associated factor (Xu és mtsai. 1998.)TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor (Derry és Barnard 1989.)

1. táblázat: Az értekezésben szereplő vizsgált gének.

28

2. Célkitűzések

A Genetikai Újraprogramozás Csoport 2002-ben jött létre a Wellcome Trust és az EUFP6

támogatásával a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpontban. Elsődleges célja

Magyarországon meghonosítani, továbbfejleszteni és optimalizálni a különböző embrió

technológiákat emlősállatokon, mint az in vitro embrió előállítást, parthenogenetikus aktiválást,

mélyhűtést, embrionális őssejt tenyésztést és a testi sejtes sejtmagátültetést (klónozást). Ezek a

módszerek alapvető fontosságúak a hazai biotechnológiai kutatások szempontjából, mivel

lehetőséget nyújtanak új, genetikailag módosított, emberi betegségeket modellező állatok

létrehozására. Jelenleg egéren és nyúlon folynak kísérletek, valamint nemzetközi együttműködés

keretében patkányon, sertésen és szarvasmarhán is. A kutatások előrehaladását jelentősen

segítené, ha az egyedfejlődésben, a pluripotencia kialakításában szerepet játszó gének működése

vizsgálható lenne. Az értekezésben leírt kísérletek ezeket a célokat támogatták molekuláris

biológiai megközelítésben.

Céljaim között szerepeltek a következő vizsgálatok.

(1) Egy olyan új érzékeny módszer kifejlesztése, mellyel a sejtek, embriók génexpressziós

aktivitását egyedi szinten vizsgálni tudom, és nem csak csoportátlagokat, hanem a csoporton

belül az egyedek közti eltéréseket, a csoport homogenitását is értékelni lehet. Kétféle reverz

transzkripcióval kombinált polimeráz láncreakció (RT-PCR) módszer összehasonlítására

vállalkoztam (végpont RT-PCR és real-time RT-PCR), majd egy teljes protokoll

kifejlesztésére és jellemzésére. Az ellenőrzésére négy-nyolcsejtes egér embriók egyedi

blasztomer sejtjeiben vizsgáltam a génexpressziót.

(2) Az embrionális genom aktiváció (EGA) előtti és utáni egér embrióknak a mélyhűtésre, és az

azt követő felmelegítésre, mint stresszre (terhelésre) adott válaszának összehasonlítása két

különböző embrió mélyhűtési módszer alkalmazása során (gyors fagyasztás szilárd felületen

és műszalmában). A referencia génnek használt Actb expressziójában tapasztalt változás

miatt újabb referencia gének kiválasztása vált szükségessé.

(3) Az in vitro tenyésztési körülmények és a parthenogenetikus aktiválás hatásának vizsgálata az

egyedfejlődésre egér embriókban több háztartási gén expressziójának meghatározásával és

ezek alapján megfelelő referencia gének kiválasztása.

(4) Alkalmas referencia gének kiválasztása in vivo és in vitro előállított nyúl embriókban,

valamint két, a nyúlban eddig le nem írt pluripotencia fenntartásáért felelős gén (Pou5f1

(Oct-4), Nanog) azonosítása és jellemzése.

(5) Az egér és szarvasmarha preimplantációs egyedfejlődésének vizsgálata a kisebb genom

29

aktiváció és az EGA vonatkozásában.

(6) Különböző hiszton acetil-transzferáz (HAT) és hiszton-deacetiláz (HDAC) enzimeket kódoló

gének expressziós mintázatának meghatározása és mennyiségi jellemzése egér embriókban.

Óriási előrelépést jelentene, ha a széles spektrumból ki lehetne választani azokat, amelyek

aktívan szerepet játszanak a preimplantációs egyedfejlődés során lezajló újraprogramozódás

molekuláris folyamataiban, valamint az EGA alatt.

30

3. Anyagok, módszerek

Külön alfejezetekre bontva tárgyalom 1) a felhasznált anyagokat és vegyszereket, 2) az

állatok, élő sejtek, embriók, valamint szöveti minták kezelését, és 3) az alkalmazott molekuláris

biológiai módszereket.

3.1 Anyagok, vegyszerek

Az értekezésben szereplő összes kémiai anyag, vegyszer a Sigma-Aldrich Kft-től (Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO, USA) származik, kivéve ahol az eltérő eredetet zárójelben jelölöm.

3.1.1 Tápoldatok petesejt és embrió kinyeréséhez, tartásához és kezeléséhez

CZB tápoldat : 81,62 mM NaCl, 4,83 mM KCl, 1,18 mM KH2PO4, 1,18 mM MgSO4, 1,7

mM CaCl2, 25,12 mM NaHCO3, 31,3 mM nátrium-laktát, 0,27 mM nátrium-piruvát, 1 mM L-

glutamin, 0,11 mM EDTA, 3 mg/ml szarvasmarha szérum albumin (BSA), 10 µg/ml gentamicin,

10 µg/ml fenolvörös (Chatot és mtsai. 1989.).

M2 tápoldat: 94,62 mM NaCl, 4,78 mM KCl, 1,19 mM KH2PO4, 1,19 mM MgSO4, 4,15

mM NaHCO3, 1,71 mM CaCl2, 5,56 mM D-glükóz, 23,28 mM nátrium-laktát, 0,33 mM nátrium-

piruvát, 4 mg/ml BSA, 100 egység/ml nátrium-penicillin G, 50 µg/ml streptomicin, 10 µg/ml

fenolvörös, 20,85 mM HEPES.

módosított TCM 199 : TCM 199 (Biochrom, Berlin, Germany) kiegészítve: L-glutamin,

25 mM HEPES, 22 µg/ml piruvát, 2,2 µg/ml NaHCO3, 50 µg/ml gentamicin, 10 egység/ml

vemhes kanca placentájában termelődő hormon (eCG), 5 egység/ml emberi korion gonadotróp

hormon (hCG), 10 % ösztruszban lévő szarvasmarha szérum (ECS).

EBSS (Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldat) : 200 µg/ml CaCl2, 6,8 mg/ml NaCl, 400 µg/ml

KCl, 140 µg/ml NaH2PO4, 200 µg/ml MgSO4, 2,2 mg/ml NaHCO3, 1 mg/ml D-glükóz, 10 µg/ml

fenolvörös (Earle és mtsai. 1943.).

3.1.2 Molekuláris biológiai módszerekhez használt anyagok, oldatok

G élfuttató puffer : 25 % Ficoll 400, 0,25 % xiléncianol, 25 mM EDTA.

Agaróz/ TAE gél (2 %) : 8 g agaróz por oldva 400 ml TAE pufferben.

TAE puffer: 50x TAE puffer (242 g Tris, 57,1 ml jégecetsav, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8),

1 l-re kiegészítve desztillált vízzel) desztillált vízzel hígítva 50-szeresre.

31

A többi felhasznált anyag, oldat leírása megtalálható „Sambrook: Molecular cloning

Appendix 1” fejezetében (Sambrook és Russel. 2001.a).

3.2 Állatok, élő sejtek, embriók kezelése

3.2.1 Állatvédelmi szabályok

A kísérletekbe vont állatok (egér és nyúl) tartása, a rajtuk alkalmazott kísérleti eljárások,

valamint az állatokból kinyert petesejtek, embriók kezelése a Munkahelyi Állatvédelmi Bizottság

„Állatkísérlet végzésre szóló engedély”-ével történtek (Mezőgazdasági Biotechnológiai

Kutatóközpont, Gödöllő; engedély szám: 126/3/2003.).

3.2.2 Petesejt kinyerése

A nagyobb mennyiségű petesejt minta kinyerésére a többszörös ovulációt

(szuperovulációt) kiváltó gyakorlati módszert alkalmaztuk.

Svájci albínó ICR (CD1) kültenyésztett egértörzsből 8 hetes nőstényeket kezeltünk

intraperitoneálisan 5 egység vemhes kanca szérum gonadotróp hormonjával (PMSG, Folligon®

Intervet, The Netherlands), majd 48 órát követően 5 egység hCG-vel (Choragon® Richter

Gedeon Rt., Hungary). A hCG kezelés után 16 órával a nyak eltörésével (cervikális diszlokáció)

megölt állatokból kivettük a petevezetéket. A kumulusz sejtektől körülvett érett petesejteket

(COC) kimostuk a petevezeték ampulla részéből. A kumulusz sejteket CZB-HEPES tápoldatban

(Millipore, Billerica, MA, USA) oldott 1 mg/ml hialuronidázzal távolítottuk el.

Nőstény Hycole hibrid nyulakat 120 egység PMSG intramuszkuláris, majd 72 órával

később 170 egység hCG intraperitoneális beadással kezeltük. A hCG kezelés után 16 órával a

petesejteket kimostuk a megölt állatok petevezetékének ampulla részéből. A kumulusz sejteket

M2 tápoldatban oldott 0,1 %-os hialuronidázzal távolítottuk el és a meiózis második szakaszában

lévő érett petesejteket kiválogattuk.

A vágóhídi szarvasmarha petefészkekből kivágott 20-25 COC-et szilikonolajjal fedett

módosított TCM 199 tápoldat cseppekben tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 39 °C-

on. 24 óra múlva a morfológiailag érett petesejteket elkülönítettük a kumulusz sejtektől (Eckert

és Niemann 1995.).

A petesejteket átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam

további felhasználásig -80 °C-on.

32

3.2.3 Embriók kinyerése

A petesejthez hasonlóan a nagyobb mennyiségű embrió minta kinyerésére a

szuperovulációs módszert alkalmaztuk a fent leírtak szerint.

A PMSG-val és hCG-val kezelt ICR nőstény egereket pároztattuk hím egyedekkel. A

hCG kezelés után 20 órával a kumulusz sejtektől körülvett zigótákat kimostuk a megölt állatok

petevezetékéből. A kumulusz sejteket CZB-HEPES tápoldatban oldott 1 mg/ml hialuronidázzal

távolítottuk el. A későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 38 (korai kétsejtes), 46 (késői

kétsejtes), 58 (négysejtes), 65 (nyolcsejtes), 78 (szedercsíra), 93 (hólyagcsíra és késői

hólyagcsíra) órában megölt állatok petevezetékéből, illetve méhéből mostuk ki.

A PMSG-val és hCG-val kezelt nőstény Hycole hibrid nyulakat pároztattuk hím

egyedekkel. A hCG kezelés után 20 órával a zigótákat kimostuk a megölt állatok petevezetékéből

M2 tápoldattal. Morfológiájuk alapján minősítve mikroszkóp alatt válogattuk ki a két

elősejtmaggal, két sarki testtel, tömör sejtplazmával rendelkezőket. A későbbi stádiumú

embriókat a hCG oltást követő 26 (kétsejtes), 41 (korai nyolcsejtes), 47 (késői nyolcsejtes), 62

(szedercsíra), 98 (hólyagcsíra) órával megölt állatok petevezetékéből, illetve méhéből mostuk ki.

Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam

további felhasználásig -80 °C-on.

3.2.4 Embriók tenyésztése

A fent leírt módon kinyert egér zigótákat 20 µl 5 mg/ml BSA tartalmú CZB-HEPES

oldatcseppekben, ásványolaj alatt tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 37 °C-on. A

későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 38 (korai kétsejtes), 46 (késői kétsejtes), 65

(nyolcsejtes), 93 (hólyagcsíra és késői hólyagcsíra) óráig tenyésztettük.

A fent leírt módon kinyert nyúl zigótákat 50 µl EBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

cseppekben, ásványolaj alatt tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 38,5 °C-on

(Mitalipov és mtsai. 1999.). Az embriókat a hCG oltást követő 26 (kétsejtes), 44 (korai

nyolcsejtes), 54 (késői nyolcsejtes), 68 (szedercsíra), 103 (hólyagcsíra) óráig tenyésztettük.

Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam

további felhasználásig -80 °C-on.

3.2.5 Embriók mélyhűtése, felmelegítése

Gyors fagyasztás szilárd felületen (SSV) (Dinnyes 2000.): Az egér embriókat

alapoldatban (4 mg/ml BSA-tartalmú CZB-tápoldat) való mosásuk után ekvilibráló oldatban (4

33

% etilénglikol az alapoldatban) tartottuk szobahőmérsékleten 5-10 percig. Háromszor öblítettük

vitrifikációs oldat cseppekben (35 % etilénglikol, 5 % poli(vinil-pirrolidon), 400 mM trehalóz az

alapoldatban) fél-fél percig, majd egy félig folyékony nitrogénbe merülő (körülbelül -180 °C-ra

lehűtött) acélkocka száraz felszínére csöppentettük. Az 1-2 µl-es cseppekben vitrifikált

embriókat kriocsövekben tároltuk további felhasználásig -196 °C-on folyékony nitrogénben.

Felmelegítéskor a mélyhűtött mintákat 37 °C-os 300 mM trehalóz oldatba tettük 1 percre, majd

rehidratáltuk szobahőmérsékleten: 150 mM trehalóz oldatba tettük 2 percre, majd 75 mM

trehalóz oldatba 2 percre, aztán alapoldatba további 2 percre, végül CZB-tápoldatban tartottuk a

további vizsgálatokig.

Gyors fagyasztás műszalmában (ISV) (Kasai és mtsai. 1990.) módosított oldatokkal: A

vitrifikációs oldat 40 % etilénglikolt, 5 % poli(vinil-pirrolidon)t, 400 mM trehalózt tartalmaz a

fent leírt alapoldatban, mely így nem képez látható jégkristályokat sem a folyékony nitrogén

hőmérsékletére való lehűtéskor, sem a felolvasztáskor. Az egér embriókat 4 % etilénglikol

tartalmú alapoldatban tartottuk szobahőmérsékleten 5-10 percig, majd ekvilibráló oldatban 1

percig. A mintákat 250 µl-es műszalmába töltöttük, és lezárás után folyékony nitrogén gőzébe

helyeztük 3 percig, végül folyékony nitrogénbe merítve tároltuk további felhasználásig -196 °C-

on. Felmelegítéskor a mélyhűtött mintákat 10 másodperc levegőn tartás után 37 °C-os vízfürdőbe

tettük 15-20 másodpercre, majd 37 °C-os 300 mM trehalóz oldatba további 1 percre, végül

rehidratáltuk a fent leírt módon.

3.2.6 Embriók szétválasztása blasztomer sejtekre

A kinyert négy- és nyolcsejtes egér embriókról savas Tyrode-oldattal (Nagy és mtsai.

2003.d) távolítottuk el a petesejt burkát (zóna pellucida) (Nicolson és mtsai. 1975.). A blasztomer

sejteket tompa végű kapillárissal való finom pipettázással, mechanikusan választottuk el

egymástól. Az ép, szétválasztott sejteket átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként

fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on.

3.2.7 Parthenogenetikus aktiválás

A kinyert érett egér petesejteket kezeltük 10 mM SrCl2-dal Ca2+-mentes, 5 µg/ml

citokalazin B-vel kiegészített CZB-tápoldatban 5 órát. A sikeresen aktivált petesejteket,

melyekben kialakult az egy, vagy mindkét elősejtmag, tenyésztettük tovább CZB-

oldatcseppekben, ásványolaj alatt, párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 37 °C-on a korai

kétsejtes, késői kétsejtes, nyolcsejtes, hólyagcsíra stádiumig. Az embriókat átmosva, RNáz

mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on.

34

3.3 Alkalmazott molekuláris vizsgálómódszerek

3.3.1 Totál RNS izolálás emlős szövetből

A különböző állati szövetekből (pl. máj) az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)

segítségével izoláltam nagy mennyiségű RNS-t a további RT-PCR alkalmazásokhoz a használati

utasításnak megfelelően. Röviden összefoglalva: 20 mg frissen fagyasztott szövetdarab

homogenizálása és lízise után a 200 bp-nál hosszabb RNS-eket szilikagél membránhoz kötöttem,

majd többszöri tisztító mosás után leoldottam RNáz mentes desztillált vízzel. A kinyert RNS

minta koncentrációját 260 nm-en mért abszorpciója alapján határoztam meg, tisztaságát 260/280

nm-en mért abszorpciós hányadossal (> 1,95) ellenőriztem. További felhasználásig fagyasztva

tároltam -80 °C-on.

3.3.2 mRNS izolálás

A különböző stádiumú embriókból, petesejtből a Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit

(Invitrogen Dynal, CA, USA) segítségével izoláltam mRNS-t a további RT-PCR

alkalmazásokhoz a használati utasításnak megfelelően. A módszer lényege, hogy mágneses

polisztirol gyöngyökhöz kapcsolt 25 nukleotid hosszú dT szekvcenciák (oligo (dT)25)

segítségével a feltárt sejtekben lévő, 3' végen poliA farokkal bíró mRNS-eket a bázispárosodás

révén igen tisztán elválasztja a sejt többi alkotójától. Röviden összefoglalva: A sejtek, embriók

lízise után hozzáadtam az oligo (dT)25 szuszpenzióját, majd a rövid inkubáció leteltével speciális

mágnesre helyezve a mintákat a felülúszó többszöri lecserélésével átmostam a kötött mRNS

mintát, végül rövid hőkezeléssel RNáz mentes desztillált vízben leoldottam a mágneses

gyöngyökről. Az mRNS-t azonnal átírtam cDNS-sé, tisztaságát (genomi DNS szennyezés

jelenlétét) az úgynevezett -RT reakcióval ellenőriztem.

3.3.3 Reverz transzkripció

Az általam használt reverz transzkripció (RT) reakcióját Sambrook: Molecular cloning 8.

fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam

(Sambrook és Russel 2001.b). Az MMLV RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

felhasználásával összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: enzim puffer, 5 mM MgCl2,

1 mM dNTP, 2,5 µM random hexamer primer, 20 egység RNáz inhibitor, 50 egység MMLV

reverz transzkriptáz enzim, RNáz mentes desztillált vízzel kiegészítve. A frissen izolált mRNS

mintát, vagy fagyasztva tárolt szöveti RNS mintát (maximum 1 µg/reakció) 5 perces 70 °C-on

történő hőkezelés után a reakcióelegyhez adtam 20 µl végtérfogatban. A reakció inkubációs

35

körülményei: 10 perc 25 °C-on (primer feltapadás), 60 perc 42 °C-on (cDNS szintézis), 5 perc

99 °C-on (inaktiválás). Az átírt cDNS-t -20 °C-on tároltam a későbbi felhasználásig. A genomi

DNS szennyezés jelenlétét -RT reakcióval ellenőriztem, amelyben a reverz transzkriptáz enzim

kihagyásával az inkubáció során a minta RNS tartalma elbomlik, míg az esetleges, épen maradt

DNS tartalom az ellenőrző PCR vizsgálattal kimutatható.

3.3.4 Polimeráz láncreakció

Az általam használt polimeráz láncreakciót (PCR) Sambrook: Molecular cloning 8.

fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam

(Sambrook és Russel 2001.b). Az összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: enzim

puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,5-0,5 µM specifikus primer, 1 egység Taq DNS

polimeráz enzim (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), cDNS minta, desztillált vízzel kiegészítve 50

µl végtérfogatra. A reakció inkubációs programját MJ PT-200 PCR készüléken (MJ Research,

Waltham, MA, USA) futtattam: 2 perc 97 °C-on (cDNS denaturálás), 2 perc 72 °C-on (enzim

hozzáadás), majd 25-43 ciklusban: 15 másodperc 95 °C-on (denaturálás), 15 másodperc 57 °C-

on (primer feltapadás), 15 másodperc 72 °C-on (cDNS szintézis). A ciklusok után 5 perc 72 °C-

os cDNS szintézis, végül 5 perc 8 °C-on történő leállítás következett. A reakció termékét agaróz

gélen futtattam meg.

3.3.5 Agaróz gél-elektroforézis

Az agaróz gél-elektroforézist Sambrook: Molecular cloning 5. fejezetében leírt általános

ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam (Sambrook és Russel 2001.c).

A PCR leállítását követően a mintákhoz gélfuttató puffert adtam. Az előre elkészített, 0,5 µg/ml

etídium-bromidot tartalmazó, 2 %-os agaróz/TAE gélre 25 µl mintát vittem fel és futtattam meg

4,5 V/cm elektromos térerőn 1 órán át. A gélt High Performance Ultraviolet Transilluminator

(Ultraviolet Products, Cambridge, UK) ultraibolya fényében Quantix digitális kamerával

(Photometrics, Tucson, AZ, USA) fényképeztem le és az IPLab-Gel denzitometriás képelemző

program (Scanalytics, Fairfax, VA, USA) segítségével értékeltem.

3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció

A különböző kísérletekben eltérő készülékeket, reagenseket, inkubációs programokat

használtam, az azonos kísérlethez tartozókat zárójelbe tett római számmal (I-II-III-IV) jelölöm

(Bustin és Nolan 2004.). Az összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta:

- QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD, USA) (I), QuantiTect iQ

36

SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), SYBR Green PCR

Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III), SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix

(IV);

- 0,3 (II, III, IV)-0,5 (I) µM specifikus primer;

- cDNS minta;

- desztillált vízzel kiegészítve 10 (I)-25 (II, III, IV) µl végtérfogatra.

A reakció inkubációs programját LightCycler (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)

(I), iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

(II), ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III),

Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) (IV) real-time PCR készüléken

futtattam:

- 2 (II, IV)-10 (III)-15 (I) perc 95 °C-on (cDNS denaturálás, enzim aktiválás);

- majd 45 (III, IV)-50 (I, II)-55 (I) ciklusban (a denaturálás-primer feltapadás-cDNS szintézis):

15 másodperc 94 °C-on - 20 másodperc 57 °C-on - 20 másodperc 72 °C-on (I), 20 másodperc 95

°C-on - 20 másodperc 60 °C-on - 20 másodperc 72 °C-on (II), 15 másodperc 95 °C-on - 60

másodperc 60 °C-on (III), 15 másodperc 95 °C-on - 20 másodperc 60 °C-on - 30 másodperc 72

°C-on (IV). Minden ciklus végén mértem a kétszálú DNS termék fluoreszcens jelét.

A küszöbérték ciklusszámokat (Ct), ahol a készülék először mért fluoreszcens jelet a

háttérzaj fölött, a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research,

Mortlake, Australia) programmal határoztam meg, melyet a kétszer derivált görbék

maximumának 20 %-ánál állapít meg (14. ábra).

A szekvencia specifikus termék tisztaságát a reakció lezajlása után olvadáspont méréssel

ellenőriztem: 30 másodperc 95 °C-on, majd visszahűtés 30 másodperc 65 °C, végül 0,1

°C/másodperc sebességgel felmelegítve 98 °C-ra folyamatosan mérve a fluoreszcens jelet. A

fluoreszcencia intenzitás hirtelen csökkenése a DNS két szálának hő hatására történő szétválását,

“felolvadását” jelzi. A felvett DNS olvadási görbe alapján ábrázolható a mért fluoreszcencia

negatív első deriváltja a hőmérséklet függvényében (15. ábra). A kapott görbe csúcsa megadja a

PCR termék olvadáspontját, a görbe alatti terület pedig arányos a termék mennyiségével (Ririe

1997.).

37

38

14. ábra: A küszöbérték ciklusszám (Ct) meghatározása egy hígítási sor 5 mintájában.

Felül: Jellegzetes real-time PCR grafikon. A vízszintes tengelyen a ciklusszám (idő), a függőlegesen a fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve; a görbék színárnyalata a kiindulási minta koncentrációját, a zöld görbe a negatív kontrollt jelzi. Alul: A görbék maximumának 20 %-ánál meghúzott kék vízszintes vonal és a görbék metszéspontjánál leolvashatók a Ct értékek (függőleges kék vonal).

15. ábra: PCR termékek olvadáspontjának meghatározása emlős mintákból.

Felül: Jellegzetes olvadási görbe a real-time PCR specifikusságának ellenőrzésére. Alul: A leolvasható PCR termékek olvadáspontja: 24 egér minta: 89,5°C; 7 szarvasmarha minta: 86°C; a negatív kontrollban mért primer dimer: 73,5°C. (Forrás: Gal és mtsai. 2006.)

3.3.7 Primer tervezés

A kísérleteimben vizsgált gének szekvencia adatait (teljes szekvencia, exon-intron

határok) az Ensembl (Ensembl Project database, http://www.ensembl.org) (Hubbard és mtsai.

2007.) és az NCBI (National Center for Biotechnology Information;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov) adatbázisaiból gyűjtöttem ki. A gének szekvencia adatai

részletesebben megtalálhatók: Függelékek: III. A vizsgált gének szekvencia adatai. A

génspecifikus primerek tervezését a Primer Express Software (Applied Biosystems, Foster City,

CA, USA) és az Oligo 6 primer elemző program (Molecular Biology Insights, Cascade, CO,

USA) segítségével végeztem.

A tervezés során számos feltételnek próbáltam eleget tenni:

- az esetleges genomi DNS szennyezés PCR-t zavaró hatásának elkerülésére az 5' és 3'

primereket eltérő exonokra helyeztem;

- a primer párok legyenek hasonló hosszúak (15-30 nukleotid), és hasonló G és C nukleotid

tartalmúak;

- a primerek lehetőleg hasonló magas feltapadási hőmérsékletűek legyenek (± 2 °C), mely a nem

specifikus feltapadás és a reakció gátlásának lehetőségét csökkenti;

- a termék mérete kicsi, 80-200 bp közötti, a primerektől eltérő olvadáspontú legyen;

- a cél mRNS molekula térbeli szerkezetét az RNAstructure (Version 4.5) program segítségével

modelleztem (Mathews és mtsai. 2004.). Ezzel ellenőriztem, hogy a primerek megfelelő

szakaszra tapadnak fel, ahol az RNS nyitottabb hurokszerű szerkezetet vesz fel és nem

bázispárosodik önmagával;

- a nem specifikus bázispárosodás elkerülésére nem ismétlődő szakaszokat kerestem;

- az RNS tisztítás, kezelés során előforduló töredezés zavaró hatása miatt főként a gének 3' végét

részesítettem előnyben, mely nagyobb valószínűséggel marad épen;

- lehetőleg hasonló sokszorosítási hatékonyságúak legyenek a primer párok;

- primer dimer képződés ne legyen (számottevő), a primerek 3' vége ne legyen gazdag G és C

nukleotidokban, vagyis a primerek összetapadásának energiája lényegesen kisebb legyen a

primer 3' vége és a termék bázispárosodási energiájánál;

- a kiválasztás segítésére az Amplify 3 (Version 3.1.4) programmal modelleztem a reakciót

(Engels 1993.);

39

- a nem génspecifikus bázispárosodás ellenőrzésére az összes primer párt összevetettem az NCBI

nukleotid gyűjtemény, illetve egér genomi és transzkripciós adatbázisával (Nucleotide collection;

Mouse genomic + transcript) a BLASTN 2.2.18 program segítségével (Basic BLAST: nucleotide

blast: blastn (blastn)) (Altschul és mtsai. 1997.).

Végül azokat a primer párokat választottam ki, melyek a legtöbb feltételnek eleget tettek,

és a kísérleteket csak ezekkel végeztem el.

3.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés

A real-time PCR készüléken mért nagy mennyiségű számadatokat a megfelelő

LightCycler Quantification Software 3.5 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) (I), Bio-Rad

iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Optical System Software Version 3.1. (Bio-Rad

Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), ABI PRISM 7000 SDS Software (Applied Biosystems,

Foster City, CA) (III), és a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett

Research, Mortlake, Australia) (IV) programokkal dolgoztam fel elsődlegesen, hogy

kiértékelhető, összehasonlítható adatokhoz jussak. Az eljárásnak jelentős hatása van a végső

eredményre, ezért ennek a menetét részletesen tárgyalom.

Kísérleteimben általában a standard görbe módszerrel számítottam ki a relatív mRNS

mennyiségeket a mért Ct értékekből (Rasmussen 2001.).

Ennek lényege, hogy először megmértem ismert

mennyiségű kiindulási standard mintából - májból, vagy 5-

10 egybegyűjtött embrióból előállított cDNS törzsoldatból -

készített hígítási sor Ct értékeit minden egyes génre,

melyből megállapítható a két mennyiség közti összefüggés.

Minden hígítási sort háromszor ismételtem meg. A kapott

adatsorra féllogaritmikus ábrázolásban lineáris trendvonalat

illesztve számítható a regressziós egyenes (standard görbe)

egyenlete: a meredekség és az y-tengellyel való

metszéspont, valamint a korreláció négyzete, vagyis a

determinációs együttható (R2), mely az illeszkedés jóságát

jellemzi, és esetlegesen megállapítható a kimutathatósági

határ is (16. ábra).

A reakció exponenciális szakaszában elméletileg a

PCR hatékonysága 100 %-os, vagyis minden ciklusban

40

16. ábra: Standard görbe módszer.

Három független hígítási sor 5-5 mintájában mért Ct értékei különböző színnel vannak ábrázolva, valamint kékkel a rájuk illesztett trendvonal egyenlete, determinációs együtthatója (R2), és az ebből számítható PCR hatékonysága (E). Az alsó kimutathatósági határ ebben az esetben a körülbelül 0,001 embrióból kapott cDNS mennyiség.

megkétszereződik a kiindulási célszekvencia mennyisége. A gyakorlatban ez általában nem

teljesül és szekvenciánként, primerenként, mintánként, reakciónként is eltérő lehet, ezért a DNS,

és közvetve az RNS mennyiségi meghatározásánál nagyon fontos a reakció hatékonyságát

figyelembe venni: Xn = X0(1+E)n

ahol Xn az n ciklus után mért cDNS mennyiség, X0 a kiindulási (meghatározandó) mennyiség, E

a PCR hatékonysága (PCR efficiency), és n a ciklusszám. Meghatározására többféle módszer is

használatos, mely jól közelíti a valós értéket (Rasmussen 2001.; Tichopad és mtsai. 2003.;

Ramakers és mtsai. 2003.). A standard görbe meredekségéből számítható a PCR hatékonysága a

következő képlettel: E = (10-1/meredekség)-1.

A másik általam alkalmazott számítási módszerrel a reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem

figyelembe a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research,

Mortlake, Australia) program Comparative Quantitation Analysis alkalmazásának segítségével.

Mint minden mennyiségi értékelés esetén, az mRNS szintek összehasonlító vizsgálatánál

is alapvetően szükséges az adatokat azonos viszonyítási alapra hozni, normalizálni, mely során a

génexpressziós értékeket korrigálom a minták közti sejtszám, RNS tartalom és degradáció,

valamint az RT hatékonyság eltéréseire, és az esetleges bemérési különbségekre. A szakirodalom

sokféle lehetőséget kínál, melyek közül a háztartási gén (HKG) expressziós értékével történő

normalizálás széles körben elterjedt módszer a legkülönbözőbb kísérletekben (Bustin 2000.,

2002.; Huggett és mtsai. 2005.). Ezek olyan folyamatosan expresszálódó gének, amelyek

termékei általában alapvetőek és nélkülözhetetlenek a minimális sejtfunkciók fenntartásában,

mint például a transzkripciót, transzlációt, vagy jelátvitelt szabályozó fehérjék (Butte és mtsai.

2001.). A vizsgált gének (GOI) expressziós értékeit normalizáltam a referenciának választott

gén(ek) - általában valamilyen, a kísérleti körülményektől, fejlődési stádiumoktól függetlenül

változatlanul, stabilan expresszálódó háztartási gén(ek) - értékeivel: az egyes mintákban mért

adott gén RNS mennyiségét elosztottam az ugyanabban a mintában mért referencia, vagy több

referencia RNS mennyisége mértani középértékével.

A mintákban mért küszöbérték ciklusszámokból, és a meghatározott PCR

hatékonyságokból ki tudtam számítani egy adott mintához, mint kontrollhoz - általában

petesejthez, vagy blasztomer sejthez, egysejtes embrióhoz - viszonyított relatív RNS

mennyiségeket (R). Az alábbi képlet leírja a számítás menetét: R = (EGOI)ΔCt(GOI)/(EHKG)Ct(HKG)

ahol ΔCt = Ctkontroll-Ctminta (Livak 1997., Livak és Schmittgen 2001.; Pfaffl 2001., Pfaffl és mtsai.

2002.). Ezeket az R értékeket tüntettem fel az ábrákon.

41

Részletesebben az adott kísérlet eredményeinél, illetve a megfelelő ábráknál tárgyalom

ettől az általános kiértékeléstől való eltéréseket, készülék specifikus számításokat.

3.3.9 Génexpresszió stabilitás vizsgálat

A legmegfelelőbb referencia gének kiválasztását, valamint a különböző embrió

stádiumok közti génexpresszió stabilitás vizsgálatát a geNorm Visual Basic application for

Microsoft Excel program segítségével végeztem (Vandesompele és mtsai. 2002.). A

meghatározásnak az az alapelve, hogy két ideális referencia gén expressziójának (mRNS

mennyiségének) aránya azonos minden mintában függetlenül azok eredetétől, típusától.

Számítása az expressziós arányok logaritmusának szórásából történik. Egy választott gén

stabilitási értéke (M) egyenlő a többi génnel páronkénti összehasonlításából kapott szórások

átlagával. Az M értékek alapján sorba rendezhetők a gének, és minél kisebb az M, annál

stabilabb az expresszió a vizsgált minták között. Végül a kiválasztott 3 legstabilabb referencia

gén expressziójából számítható az általános normalizációs faktor (NF) is, mely a későbbiekben

használható a vizsgálni kívánt gének expressziójának normalizálására.

3.3.10 Egyéb molekuláris biológiai módszerek

Az egyéb alapvető módszereket (plazmid DNS gyors alkalikus tisztítása, kompetens sejt

készítése, transzformálás, DNS izolálás emlős szövetből, DNS izolálás vérből, koncentráció

mérés spektrofotométerrel, DNS fenolos tisztítása, ligálás, emésztés) Sambrook: Molecular

cloning 1., 6., és Appendix 8 fejezeteiből vettem át (Sambrook és Russel 2001.d).

42

4. Eredmények

4.1 Egyedi embriókon alapuló génexpressziós protokoll kifejlesztése és validálása

4.1.1 Primerek tervezési eljárásának validálása

A módszer validálása (megerősítése) több vizsgálattal történt:

– A PCR optimalizálására különböző primer koncentráció kombinációkat (0,1/0,1; 0,1/0,3;

0,3/0,1; 0,3/0,3; 0,1/0,5; 0,3/0,5; 0,5/0,1; 0,5/0,3; 0,5/0,5 µM) alkalmazva választottam ki a

leghatékonyabb párosítást.

– Az esetleges PCR-t gátló anyagok (sejtalkotók, vegyszerek) jelenlétét a minta cDNS-ben az

úgynevezett SPUD módszerrel ellenőriztem (Nolan és mtsai. 2006.a).

– Minden reakció után a felvett hőmérsékleti görbe segítségével megmértem a termék(ek)

olvadáspontját, mely jellemzően szekvenciaspecifikus (15. ábra).

– A PCR termék(ek) méretét először agaróz gél-

elektroforézissel ellenőriztem (17. ábra). Ehhez

rendeltem hozzá az olvadáspont értékeket, így a

későbbiekben ezeket használhattam a

célszekvencia azonosítására.

– Ahhoz, hogy mennyiségileg összehasonlítható

legyen a különböző gének különböző szakaszának

expressziója különböző PCR-ben, számításba kell

venni a primerek PCR hatékonyságát is. Ezt

általában hólyagcsíra cDNS hígítási sorral

határoztam meg, mivel a korai embrionális gének

mindegyike kifejeződik ebben a mintában.

Összesítettem az általam sikeresen megtervezett, és a különböző kísérletekben felhasznált

primer párok adatait: szekvenciájukat, pozíciójukat, ideális feltapadási hőmérsékletüket, és a

specifikus PCR termék méretét (2. táblázat). A standard görbék adatait, a PCR hatékonyságokat,

és a PCR termékek olvadáspontját a 3. táblázatban adom meg.

43

17. ábra: PCR termékek agaróz gél-elektroforézis fényképe emlős mintákból.

A negatív kontrollban (Ne) a primer dimer képződése, az egér (E) és szarvasmarha (Sz) mintákban 182 bp nagyságú termék mutatható ki. M: molekulatömeg marker.

Gén rövid neve Primer párokSzekvencia (5' → 3') Pozíció

Ta (°C)

Termék mérete (bp)

Actb ATGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC TGGTACCACCAGACAGCACTGTGTTG

798-823 964-989

60 192

Actb (NY) TCCGCCGCCGGCCCACACTAGTCCTTCTGGCCCATGC

42-60 212-229

60 188

Cenpf (SZ) CCAGCTGTTGGTTTGGAGG TTGTAAAGAAAGGGTTTGC

8992-9011 9145-9164

50 173

Cirpb AGCTCGGGAGGGTCCTACA GACGCGGAGGGCTTTTACT

545-565 597-615

60 71

Crebbp GGCCAGGACCGCTTTGTTTAT GGGCTCTTGGACTGTGGCTCACC

5282-5302 5456-5478

60 197

Dazap2 CTTATTATCCAGTTGGTCCC GTTACAAGGACGTTGGC

319-328 483-499

55 181

Eef1e1 GCGGAGTTGAGGCTGCTGGAGA AGACTCGGGCCATTGTTTGTCTG

30-51 117-139

60 110

Eef1e1 (EEF1E1) (NY) ACCGCAGAAGAGAAAGCCATAG AGCGATGTAGCCCATAGTAGAGGA

103-124 269-292

68 190

Eif1a AAGAAGTCTGAAGGCCTATG CAGAGAACTTGGAATGTAGC

654-670 805-824

55 171

Eif4e ACTGCTGTGCCTTATTGGAG CGGAGGAAGTCCTAACCTTT

413-432 568-587

55 175

Ep300 ATCCAGCGGTCAAGCACCAGTGTC CGGCTAGGAACAGGAGAAGGTGAA

2770-2793 2905-2928

60 159

G6pdx (G6PD) (NY) AGCCCGCCTCCACTGACTCC ACCACGTTGTCCGCCTGCAC

842-861 910-929

60 88

Gapdh TGACGTGCCGCCTGGAGAAA AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG

728-747 802-825

60 98

Gapdh (NY) CAAGTTCCACGGCACGGTCA CTCGGCACCAGCATCACCC

230-249 329-347

68 118

Gcn5l2 GGGAAAGGAGAAGGGCAAGGAG CGACTGCGCAACCGTTCTGTCAT

2184-2205 2359-2381

60 198

H2afz ACAGCGCAGCCATCCTGGAGTA TTCCCGATCAGCGATTTGTGGA

314-335 494-515

60 202

H2afz (H2AV_RABIT) (NY) AGAGCCGGCTGCCAGTTCCCAGTCGCGCCCACACGTCC

61-79127-145

59 85

Hat1 GTGGATGATGAAAGATGGCACTACT GTGGCCCTGACCTTGAAATGGA

612-636 767-788

60 177

Hdac1 TTCAACTTGCCCATGCTGATGC TGGTCATGTTGGAAGGGCTGATGT

885-906 1045-1068

60 184

Hdac2 CCGGTGTTTGATGGACTCTTTGAGTTTCCAGCCCAATTGACAGCCATATCAG

512-537 597-622

56 111

Hdac3 CACCCGCATCGAGAATCAGAAC TCGGCCTCGTCAGTCCTGTCATAC

1029-1050 1158-1181

60 153

Hdac4 ACCGCTATGACGATGGGAACTTCT AGGCCACCCGTGAAAGCCATGTTG

2672-2695 2754-2777

60 106

Hdac5 ACCGCCATCTGTGATGCCTCTGA AGTGTGGCAACCGCATTGACGCT

3305-3327 3398-3420

60 116

Hdac6 GTTATGCCCACCTCACCCACCTAC TGGATGACCTCACTGATTGAAACC

1472-2495 2650-2673

60 202

Hdac7 GGGCTTCAATGTCAACGTGGCTTGG AGCAAACTCTCGGGCAATGG

2365-2389 2457-2476

60 112

Hdac8 TACTATTGCCGGAGATCCAATGTGT CGAGCCGTGTTGGCAAGGTTATAGC

885-909 998-1022

60 138

44

Gén rövid neve Primer párokSzekvencia (5' → 3') Pozíció

Ta (°C)

Termék mérete (bp)

Hdac9 CGTCCCTGCCCAATATCACTCTG AACGTGGCTGGAGGACGCTGCAATG

974-996 1113-1137

60 164

Hdac10 TGGAATCATGGATGGGCAGATAAGA TGTCCCAGGGCCACACAGAG

1611-1635 1726-1745

60 135

Hdac11 CATCTTTCTTCCCAACTTCCTTGTG CTCCACAGCCAGCTTCCCTGC

336-360 412-432

60 97

Hist2h2aa2 GTCGTGGCAAGCAAGGAG GATCTCGGCCGTTAGGTACTC

51-68 212-232

60 182

Hprt1 GCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAG CCCTGAAGTACTCATTATAGTCAAGGGCAT

579-606 666-695

60 117

Hprt1 (O46381_RABIT) (NY) ACGTCGAGGACTTGGAAAGGGTGTT GGCCTCCCATCTCCTTCATCACATC

83-107 154-178

68 96

Hspa1a AAGAACGCGCTCGAGTCCTAT TTGTCAGCCTCGCTGAGCTT

1618-1638 1684-1703

60 86

Htatip CCGCCTCAAGCCGTGGTACTTC GAGATGGTGCCCTTGCGGTAAAT

720-741 877-899

60 180

Nanog TGGTTGAAGACTAGCAATGGT GTCTGGCTGCCCCACAT

664-684 778-794

60 131

Pcaf TAAAGAGCCCAAAGACCCTGAGCA CCCGGAGCTTCTGTTCTCTTCACT

2115-2138 2211-2234

60 120

Pgk1 (PGK1) (NY) TGTTGGTCGGGCGAAGCAG CAGTGTCTCCACCGCCGATG

972-989 1101-1120

60 149

Polr2a (POLR2A) (NY) AGACTTCTCGGCCCGCACTG ACTTGGCGCCTGGGTACTGG

1077-1096 1233-1252

68 176

Pou5f1 CCACCATCTGTCGCTTCG CACCAGGGTCTCCGATTTG

573-590 691-710

60 138

Pou5f1 (ember) AGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAG AGGAGTACAGTGCAGTGAAGTGAG

628-653 1039-1062

60 435

Pou5f1 (ENSOCUG00000017160) (NY)

CGAGTGAGAGGCAACTTGGCGGTTACAGAACCACACACG

718-736 823-842

57 125

Ppia CGCGTCTCCTTCGAGCTGTTTG TGTAAAGTCACCACCCTGGCACAT

100-121 226-249

60 150

Ppia (PPIA_RABIT) (NY) TCCAGGGTTTATGTGCCAGGGTG CGTTTGCCATGGACAAGATGCC

102-124 217-238

68 137

Rbm3 CACCTTCACAAACCCAGAGCAT GATTTGGCGCCCATCCA

232-253 291-307

60 76

Sfrs3 GCGCAGATCCCCAAGAAGG ATCGGCTACGAGACCTAGAGA

336-354 472-452

60 137

Slc2a3 CTTCTGAGAGCGGCTTCTG CAACAGTCACGGCGAACA

29-47 163-181

60 153

Sod1 ACCTCATTTTAATCCTCACTCTAAGAAAC ATTGGCCACACCGTCCTTT

302-330 389-407

60 106

Sod2 TTACAGATTGCTGCCTGCTCTAAT ATCCCCAGCAGCGGAATAA

543-566 595-613

60 71

Taf1 CCCCGTGTGCTTCAAGAGAATAC GGGTGTTGGACTTGGGATCAGG

3547-3569 3679-3700

60 154

Trp53 GCTTCTCCGAAGACTGGATGA AGAGGGAGCTCGAGGCTGAT

520-540 567-586

60 67

Ubc CGTCGAGCCCAGTGTTACCACCAAGAAGG CCCCCATCACACCCAAGAACAAGCACAAG

1920-1948 2003-2031

60 112

45

Gén rövid neve Primer párokSzekvencia (5' → 3') Pozíció

Ta (°C)

Termék mérete (bp)

Ywhaz (YWHAZ) (NY) GGTCTGGCCCTTAACTTCTCTGTGTTCTA GCGTGCTGTCTTTGTATGATTCTTCACTT

505-533 618-646

68 142

2. táblázat: Primer adatok.

Ta: feltapadási hőmérséklet; NY: nyúl szekvenciára tervezett primerek; SZ: szarvasmarha szekvenciára tervezett primerek.

Gén rövid neve Y tengely metszéspontja

Meredekség Determinációs együttható (R2)

PCR hatékonyság (E)

Tm (°C)

Actb 22,16 -2,96 0,99 1,17 86

Actb (NY) 21,88 -3,37 0,98 0,98 92

Cirpb 36,56 -2,64 0,97 1,40 78

Eef1e1 26,95 -2,87 0,96 1,23 86

Eef1e1 (EEF1E1) (NY) 20,73 -3,51 0,97 0,93 84

G6pdx (G6PD) (NY) 23,84 -3,48 0,99 0,94 86

Gapdh 21,69 -3,49 0,98 0,93 86

Gapdh (NY) 18,58 -3,43 0,99 0,96 87

H2afz 21,20 -3,81 0,99 0,83 86

H2afz (H2AV_RABIT) (NY) 19,18 -3,62 0,99 0,89 88

Hist2h2aa2 41,43 -3,72 0,98 0,86 89,5

Hprt1 23,02 -3,57 0,97 0,91 82

Hprt1 (O46381_RABIT) (NY) 22,87 -3,44 0,99 0,95 82

Hspa1a 37,83 -2,58 0,96 1,44 83

Nanog 38,52 -3,50 0,97 0,93 86,5

Pgk1 (PGK1) (NY) 17,12 -3,55 0,99 0,91 86

Polr2a (POLR2A) (NY) 22,33 -3,42 0,96 0,96 89

Pou5f1 29,51 -3,65 0,99 0,88 87

Pou5f1 (ENSOCUG00000017160) (NY)

17,32 -3,83 1,00 0,82 88

Ppia 20,84 -3,71 0,98 0,86 84

Ppia (PPIA_RABIT) (NY) 16,31 -3,55 1,00 0,91 86

Rbm3 35,04 -2,54 0,93 1,48 79

Slc2a3 44,72 -3,32 0,96 1,00 86

Sod1 33,48 -3,20 0,99 1,05 82

Sod2 33,03 -3,01 1,00 1,15 78

Trp53 37,41 -2,98 0,95 1,17 79

Ubc 23,32 -3,67 0,97 0,87 84

Ywhaz (YWHAZ) (NY) 20,09 -3,42 0,99 0,96 82

3. táblázat: Standard görbe, PCR hatékonyság, és olvadáspont adatok.

Tm: a PCR termékek olvadáspontja; NY: nyúlban mért értékek.

46

4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása

A kvantitatív végpont és real-time RT-PCR (I) összehasonlításakor vizsgáltam a két

módszer érzékenységét (alsó kimutatási határát), mérési tartományát, és a megbízhatóságát

(reprodukálhatóságát). Egér máj cDNS törzsoldatból készített hígítási sorában mértem a

Hist2h2aa2 (H2A) gén expresszióját, melyből azt az eredményt kaptam, hogy a real-time RT-PCR:

– több mint két nagyságrenddel érzékenyebb, vagyis alacsonyabb az alsó kimutatási határa (1

pg mRNS) szemben a végpont RT-PCR-rel (50 pg mRNS);

– legalább két nagyságrenddel nagyobb a mérési tartománya (1 pg-50 ng mRNS) szemben a

végpont RT-PCR-rel (50 pg-50 ng mRNS), azonban a felső határt nem sikerült elérni;

– standard görbéjének determinációs együtthatója jobban közelít az 1-hez (R2=0,982) szemben

a végpont RT-PCR-rel (R2=0,937), vagyis az illeszkedés jósága miatt megbízhatóbbak az így

mért eredmények (18. ábra) (4. táblázat).

Jellemzők Real-time RT-PCR Végpont RT-PCRMérési tartomány 1 pg - 50 ng cDNS 50 pg - 50 ng cDNSAlsó kimutatási határ 1 pg cDNS 50 pg cDNSStandard görbe determinációs együtthatója R2 = 0,982 R2 = 0,937Mért értékek Ct: 35,43 ± 0,29 Denzitometriás érték: 134789 ± 50893Relatív szórás CV = 18,63 % CV = 37,76 %Mintaszám n = 32 n = 31Kiindulási minta 50 pg cDNS 500 pg cDNS

4. táblázat: A kétféle RT-PCR módszer összehasonlítása.

Egy-egy kiválasztott hígítási ponton mérve a reprodukálhatóságot, a 30 mérés ismétlése

alapján a real-time RT-PCR bizonyult megbízhatóbbnak. Az adott standard törzsoldathoz

viszonyított RNS mennyiségek relatív szórás értéke (CV=18,63 %) kevesebb, mint fele volt a

végpont RT-PCR értékénél (CV=37,76 %) (4. táblázat). A minta számának növekedésével ez a

47

18. ábra: A kétféle RT-PCR módszerrel kapott standard görbék.

különbség az n=8 mintáig nem volt kimutatható (19. ábra).

4.1.3 Protokoll kidolgozása, jellemzése

A kiválasztott real-time RT-PCR módszer lépéseinek - az mRNS tisztítás, RT és PCR -

technikai hibáját úgy mértem meg, hogy az egér máj RNS törzsoldat egy kiválasztott, az egyedi

egér embriók expressziós szintjét közelítő hígítása

A) 10 azonos mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, átírtam cDNS-sé;

B) 10-szeres mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, és 10 egyenlő részét átírtam cDNS-sé;

C) 10-szeres mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, átírtam cDNS-sé, és 10 egyenlő részre

osztottam;

majd real-time PCR-rel (I) mértem a Hist2h2aa2 gén expresszióját minden mintában. Az így

kapott 10-10-10 ismétlés relatív szórása: A) az mRNS tisztítás, RT és PCR együttes technikai

hibája (CV=27,43 %); B) az RT és PCR (CV=12,74 %); C) a PCR technikai hibája (CV=21,21

%). A protokollban rejlő hibát összehasonlítottam 4-6 egyedi, in vivo egér zigótában, nyolcsejtes

embrióban és hólyagcsírában mért CV értékeivel: 58,28 %, 159,06 % és 49,62 %, melyek a

minták közti egyedi eltérésekből - a biológiai különbségekből - és a mérés technikai hibájából

tevődnek össze (5. táblázat). Az embrió minták CV értékei 2-5,5-szer nagyobbak voltak a

technikai hibáknál, vagyis a „mérési zaj”-on túl is kimutathatók az embriók, egyedi sejtek közti

expressziós különbségek.

Lépések, minták Szórás Megjegyzésreal-time PCR CV = 21,21 % (Ct: 35,41 ± 0,33) C) cDNS standardból (n = 10)RT + real-time PCR CV = 12,74 % (Ct: 35,11 ± 0,21) B) mRNS standardból (n = 10)mRNS tisztítás + RT + real-time PCR CV = 27,43 % (Ct: 35,21 ± 0,48) A) RNS standardból (n = 10)Zigóta CV = 58,28 % (Ct: 34,66 ± 0,50) (n = 5)Nyolcsejtes embrió CV = 159,06 % (Ct: 34,54 ± 1,48) (n = 6)Hólyagcsíra CV = 49,62 % (Ct: 35,28 ± 0,56) (n = 4)

5. táblázat: A real-time PCR-en alapuló protokoll egyes lépéseinek technikai hibái és a biológiai különbségek.

48

19. ábra: A kétféle RT-PCR módszer reprodukálhatósága.

4.1.4 Protokoll ellenőrzése

Hat darab négy- és hat darab nyolcsejtes egér embriót blasztomer sejtjeire szétválasztva

vizsgáltam az egyedi sejtekben a kiválasztott gének expresszióját: Actb (referencia), Nanog,

Pou5f1, Slc2a3 (II). Sikerült a négysejtes embriók 21 sejtjéből kimutatni a Nanog és a Pou5f1

géneket (20. ábra). A nyolcsejtes

embriók 60 sejtjéből mindhárom

vizsgált gén relatív mRNS szintjét

meghatároztam (21. ábra). Egyes

sejtekben semmilyen mRNS-t nem

sikerült kimutatni, feltehetőleg azok

a szétválasztás, és gyűjtés során

sérültek meg, illetve vesztek el. A

négysejtes embriók

blasztomerjeiben nem találtam

Slc2a3 expressziót, a Nanog

expressziójában 9-szeres, a Pou5f1

expressziójában 10-szeres

különbségeket mértem egy embrió 4

sejtje között. A nyolcsejtes embriók

sejtjeiben a Nanog génnél nagyobb,

28-szoros expressziós

különbségeket, a Pou5f1-nél kisebb,

2-8-szoros, és a Slc2a3 génnél 12-

szeres különbségeket kaptam.

Egyazon embrió blasztomer sejtjei

között egy a négyből kiemelkedően magas Pou5f1 expressziót mutatott a négysejtes embriókban,

és kettő a nyolcból kiemelkedően magas Nanog expressziót a nyolcsejtes embriókban.

49

20. ábra: Génexpresszió négysejtes embriók egyedi sejtjeiben.

Az azonos embrióból származó értékek azonos színnel és betűvel vannak jelölve: A, B, C, D, E, F jelű embriók 1, 2, 3, 4 számú sejtjei. X jellel vannak megkülönböztetve azok a minták (E/1; F/1; F/2), amikben nem volt kimutatható génexpresszió.

4.2 Embrió mélyhűtési módszerek összehasonlítása

A kísérletben vizsgáltam a Cirpb, Hspa1a, Rbm3, Sod1, Sod2, Trp53 és Actb (referencia)

gének expressziójának változását egy- és nyolcsejtes egér embriók szilárd felületen (SSV) és

műszalmában (ISV) történő vitrifikációja során. A felmelegítés után 3 órával az RNS szintjén

azonnal bekövetkező gyors reakciót, a felmelegítés után 10 órával jelentkező lassú reakciót,

50

21. ábra: Génexpresszió nyolcsejtes embriók egyedi sejtjeiben.

Az azonos embrióból származó értékek azonos színnel és betűvel vannak jelölve: G, H, I, J, K, L jelű embriók 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 számú sejtjei. X jellel vannak megkülönböztetve azok a minták (I/8; J/7; J/8; K/7), amikben nem volt kimutatható génexpresszió. Egy mintánál két sejtet nem sikerült szétválasztani, ott két sejtből (G/1-2) történtek a mérések.

amikor a sejtosztódások már elkezdődtek, vagy teljesen le is zajlottak, valamint a hólyagcsíra

állapotig in vitro tovább tenyésztett embriókban az esetleges maradandó változásokat mértem

csoportonként 6-6 egyedben. A közös viszonyítási pont az in vivo egy- és nyolcsejtes egér

embriók, kontrollként a mélyhűtés nélkül in vitro tenyésztett, megfelelő időpontokban vett

embriók génexpressziós értékei szolgáltak (III).

Az egysejtes embriókban az ISV-nél a 3 órás időpontban mind a hat vizsgált gén

expressziója megemelkedett a kontrollhoz képest 2-33-szoros mértékben, míg az SSV-t követően

csak kisebb mértékű (0,3-2-szeres) változásokat mértem. Az ISV embriókban 10 órával a

felmelegítés után mind a hat gén expressziós értéke visszacsökkent a kontrollhoz közeli értékre,

a Cirbp, a Hsp70 és a Trp53 értéke szignifikánsan kisebb a 3 órás értékekhez képest. Az SSV-nél

ugyanakkor csak kismértékű eltérések találhatók a kontrollhoz és a 3 órás értékekhez képest is.

Figyelemre méltó a Trp53 csökkenése 10 óránál mindkét kezelésnél (22. ábra).

A nyolcsejtes embriókban eltérő génexpressziós mintázatot kaptam. Az ISV-nél a 3 órás

időpontban hasonlóan az egysejtes embriókhoz mind a hat vizsgált gén expressziója

51

22. ábra: Mélyhűtés hatása a génexpresszióra egysejtes egér embriókban.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.

megemelkedett - közülük a Cirbp és a Sod2 szignifikánsan. Ezzel ellentétben az SSV-t követően

a Hsp70 és a Trp53 mutatott jelentős növekedést. Mindkét kezelésben 10 órával a felmelegítés

után hasonló expressziós mintázatot, megemelkedett szinteket kaptam, kivéve az Rbm3 esetében,

valamint az ISV-nél a Sod1 és a Trp53 esetén (23. ábra). Fontos felhívni a figyelmet arra, hogy a

referencia Actb gén expressziója a nyolcsejtes ISV embriókban váratlanul megemelkedett, míg

az összes többi esetben nem tapasztaltam eltérést, viszonylag állandó szintet mértem (24. ábra).

Ebből kifolyólag a nyolcsejtes eredményeket nem sikerült normalizálni, melyet az ábrán is külön

kihangsúlyoztam.

A hólyagcsírákban nem találtam szignifikáns különbségeket, az egysejtes embriók

esetében 2,6-szoros, a nyolcsejtes embrióknál 5-szörös volt a legnagyobb eltérés a különböző

csoportok között.

52

23. ábra: Mélyhűtés hatása a génexpresszióra nyolcsejtes egér embriókban.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.

4.3 Egér egyedfejlődésének összehasonlítása különböző körülmények között

A kísérlet célja volt több különböző és független sejtfunkciókban szerepet játszó, az

irodalomban klasszikusnak számító háztartási gén alkalmasságának vizsgálata egér petesejtekben

és embriókban. A gének expressziós stabilitásának meghatározásával és sorba rendezésével

kiválaszthatók a normalizálásra legalkalmasabbak a jövőbeni kísérletekhez. A kiindulási 12

génből (Actb, Bmp7, Eef1e1, Gapdh, H2afz, Hist2h2aa2, Hprt1, Polr2a, Ppia, Tbp, Tubb4, Ubc)

elővizsgálatok és optimalizálás után választottam ki az összehasonlító vizsgálatba vont 7

legalkalmasabbat: Actb, Gapdh, Eef1e1, H2afz, Hprt1, Ppia, Ubc. A három különböző kezelési-

tenyésztési csoport (in vivo, in vitro, valamint a parthenogenetikus aktivált és in vitro tenyésztett)

közös viszonyítási pontjául az in vivo kinyert petesejtek szolgáltak. A vizsgálatban a korai és

késői kétsejtes, nyolcsejtes, hólyagcsíra és késői (kibújó) hólyagcsíra stádiumú embriókban

mértem csoportonként 6-6 egyedben a kiválasztott 7 gén expresszióját, kivéve a

parthenogenetikus aktivációt, ahol a késői hólyagcsíra állapotig nem jutnak el az embriók (IV).

Általánosságban mindhárom csoportban a legtöbb gén expressziója növekedett a korai

kétsejtes állapotban, legnagyobb mértékben az Eef1e1 (4-8-szorosan), majd lecsökkent a késői

kétsejtes állapotban, kivéve a H2afz és a Ppia géneket, melyek folyamatos emelkedést mutattak.

A kétsejtes állapottól kezdve a késői hólyagcsíráig mindegyik gén expressziója növekedett a

fejlődés előrehaladtával és a sejtszám növekedésével. Az összehasonlításból jól látható, hogy az

in vivo embriókban a két hólyagcsíra állapot között a növekedés tovább folytatódott (1,3-2,6-

szoros), ezzel szemben az in vitro mintákban hasonló expressziós szinteket kaptam (25-27.

ábrák).

53

24. ábra: Az Actb gén expressziójának változása a mélyhűtés hatására.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.

54

25. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vivo egér embriókban.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c és d: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).

55

26. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vitro egér embriókban.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c és d: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).

A csoportok közti eltéréseket értékelve a kétsejtes állapotban hasonló expressziót

mutattak a különböző csoportok, kivéve a korai kétsejtes állapotban a H2afz és Ppia gének, ahol

szignifikánsan alacsonyabbak voltak az in vitro és parthenogenetikus minták értékei, valamint a

késői kétsejtes állapotban a Gapdh gén, melynél szignifikánsan magasabb volt az in vitro minták

értéke. A nyolcsejtes állapotban az in vitro értékek valamivel magasabbak voltak, a hólyagcsíra

állapotokban ellenben az in vitro és parthenogenetikus minták értékei alacsonyabbak voltak,

melyek közül szignifikánsan eltértek az Actb, Eef1e1 és H2afz géneké (28. ábra).

56

27. ábra: A referencia gének expressziós mintázata parthenogenetikusan aktivált egér embriókban.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b és c: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).

A gének expressziós stabilitási értékeit (M) a geNorm Visual Basic application for

Microsoft Excel program segítségével határoztam meg a három csoportban külön-külön (29.

ábra). A H2afz, Hprt1 és Ppia gének

mutatkoztak a legstabilabbaknak, majd

sorra következtek: Ubc, Gapdh, Eef1e1,

és Actb gének. A legkevésbé stabil az

Actb volt az in vivo és az in vitro

csoportok esetében, míg a

parthenogenetikus csoportban az Eef1e1.

A három csoportból az in vivo M értékek

voltak a legalacsonyabbak, és a

parthenogenetikusé a legmagasabbak.

4.4 Nyúl egyedfejlődésének vizsgálata

A kiindulási 13 génből (Actb, B2m, Eef1e1, G6pdx, Gapdh, H2afz, Hprt1, Pgk1, Polr2a,

Ppia, Tbp, Ubc, Ywhaz) elővizsgálatok és optimalizálás után választottam ki az összehasonlító

vizsgálatba vont 10 legalkalmasabbat: Actb, Eef1e1, G6pdx, Gapdh, H2afz, Hprt1, Pgk1, Polr2a,

Ppia, Ywhaz. A választott 10 referencia gén expresszióját sikerült megmérni és azonosítani

57

28. ábra: A referencia gének expressziójának összehasonlítása a különböző egér embriókban.

A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; * az in vivo mintáktól, # az in vitro mintáktól való szignifikáns eltéréseket jelöli (p<0,05).

29. ábra: A referencia gének expressziós stabilitási értékei a különböző egér embriókban.

petesejtben, egysejtes embriókban, az in vivo és in vitro kétsejtes, korai és késői nyolcsejtes, és

hólyagcsíra stádiumú embriókban csoportonként 5-5 mintában (IV). A más fajokban már

meghatározott homológ Pou5f1 és Nanog szekvenciák összehasonlításából kiindulva próbáltam

azonosítani ezeket a géneket nyúlban is. A kiindulási viszonyítási pont az in vivo gyűjtött

petesejtek voltak, az egysejtes embriók szintén csak in vivo álltak rendelkezésre. Az Actb gén

esetében különös körültekintéssel jártam el. Három különböző szekvenciára is terveztem

primereket, melyek közül végül az X60733 azonosítójú, és hibásan „ACT-5”-nek (gamma non-

muscle actin) nevezett NCBI referencia szekvenciát választottam. A nukleotid és az aminosav

szekvenciák ortológ szekvenciákkal történő összehasonlítása is megerősítette, hogy ez hasonlít a

legjobban a többi fajban leírt Actb génhez, és az adatbázis kezelői is visszajeleztek, hogy a

megnevezésük valóban hibás.

Az egysejtes állapotra csökkent az Eef1e1, G6pdx, H2afz, Hprt1, Pgk1 és Ppia gének

expressziós szintje, ellenben növekedett az Actb, Gapdh és Polr2a géneké. Általában a referencia

gének expressziós mintázata hasonló volt mindkét tenyésztési körülmények között: a nyolcsejtes

állapotig csökkenő mRNS szinteket, majd a szedercsíra és hólyagcsíra állapotokban kimagaslóan

magas értékeket mértem az Actb, Gapdh és Ppia esetében. A H2afz, Hprt1, Ywhaz géneknél

folyamatos emelkedett az expresszió, és a nyolcsejtes állapotban sem történt visszaesés (30-31.

ábrák).

58

59

30. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vivo nyúl embriókban.

A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c, d és e: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).

Az in vitro tenyésztés hatását elemezve a génexpressziós mintázatok nagy hasonlóságot

mutattak mind a 10 referencia génre. Általában az in vivo embriókban mért expresszió magasabb

volt (kivéve az Actb és Pgk1) szignifikáns eltéréssel a kétsejtes állapotban az Eef1e1, G6pdx,

60

31. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vitro nyúl embriókban.

A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c, d és e: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05); * az in vivo mintáktól való szignifikáns eltéréseket jelöli (p<0,05).

Ppia és Ywhaz géneknél, a szedercsíra állapotban az Actb, Gapdh, H2afz, Ppia és Ywhaz

géneknél, valamint a hólyagcsíra állapotban a Hprt1 és Polr2a gének esetében. Ezzel szemben a

nyolcsejtes állapotban az in vitro embriókban volt magasabb az expressziós érték, az Actb,

Eef1e1, Gapdh és Ywhaz géneknél szignifikáns különbséggel (30-31. ábrák).

A gének expressziójának stabilitását elemezve hasonló M értékeket és a sorrendben

kisebb eltérést kaptam az in vivo és in

vitro mintákban. A három legstabilabb

gén az in vivo minták esetén: H2afz,

Hprt1, Ywhaz, majd sorra: Actb, Ppia,

G6pdx, Gapdh, Eef1e1, Polr2a, Pgk1. Az

in vitro minták esetén: H2afz, Ywhaz,

Hprt1, majd G6pdx, Ppia, Gapdh, Eef1e1,

Polr2a, Actb, Pgk1, vagyis a három

legstabilabb gén mindkét esetben ugyanaz

volt (32. ábra).

Az egyes fajokból származó ismert Nanog és Pou5f1 szekvenciákat számítógépes

programok segítségével elemezve a konzervált régiók homológ szakaszaira olyan univerzális

PCR primer párokat terveztem, melyekkel reményeim szerint a nyúl embrió mintákból

génspecifikus cDNS szakaszokat lehet kimutatni, kinyerni és azonosítani. A teljes genom szintű

összehasonlítások alapján a nyúl genomja az ismertek közül az emberéhez hasonlít a legjobban.

Az emberi szekvenciára optimalizált univerzális primer párokkal sikerült egy 131 nukleotid

hosszú Nanog, és egy 435 nukleotid hosszú Pou5f1 cDNS részletet kimutatni 10 egybegyűjtött

embrió mintából, valamint meghatározni a szekvenciáját a nyúlban elsőként. Szekvencia

elemzésnek alávetve, a homológiaviszonyok alapján csak a több más fajban már leírt Pou5f1

génekkel mutatott nagyfokú hasonlóságot (Függelékek: IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának

összehasonlítása), míg a feltételezett nyúl Nanog

szekvencia egér és emberi pszeudogénekhez is

hasonlított. Ezek alapján új, már nyúl specifikus

primerekkel és a kiválasztott referencia génekkel

lehetett a Pou5f1 expresszióját meghatározni a

különböző szöveti mintákban, és embrió

stádiumokban. A szövetspecifikus vizsgálatban a

Pou5f1 gén expresszióját mutattam ki agyban,

lépben, vesében és a petefészekben (33. ábra).

61

32. ábra: A referencia gének expressziós stabilitási értékei a különböző nyúl embriókban.

33. ábra: A Pou5f1 gén szövetspecifikus expressziója nyúlban.

A PCR termékek agaróz gél-elektroforézis fényképe különböző szöveti mintákból: A: agy; I: izom; B: bőr; L: lép; M: máj; V: vese; P: petefészek; MM: molekulatömeg marker.

Az in vitro embrió

mintákban kapott fejlődési stádium-

specifikus expressziós mintázat: a

petesejtekben és a zigótákban

viszonylag magas mRNS szinteket

mértem, majd a megtermékenyítést

követően folyamatosan csökkent a

nyolcsejtes stádiumig, és ettől

kezdve enyhén növekedni kezdett

(34. ábra).

4.5 Egér és szarvasmarha egyedfejlődésének összehasonlítása

Az alapelgondolás szerint olyan petesejt/embrió specifikus, egyedfejlődésben szerepet

játszó transzkripciós faktorokat és géneket választottam, amelyeket a szarvasmarhában korábban

azonosítottak a kisebb genom aktiváció során: Cenpf, Dazap2, Eif1a, Eif4e, Sfrs3. A

szarvasmarha genomja még nem ismert minden részletében, így a kiválasztásra került, vizsgált

gének közül néhánynak a teljes szekvenciája helyett csak töredék szekvenciákra alapoztam a

primerek tervezését, az expressziójuk mérését. A két fajban közösen használt primereket egy

meghatározott, a két szekvencia homológiaviszonyain alapuló, úgynevezett konszenzus

szekvenciára terveztem, melyek az Eif1a kivételével minden gén esetében mindkét fajban jól

működtek. Mivel a két fajban az embrionális genom aktiváció más stádiumban zajlik le, az

egérnél különválasztottam a korai és késői kétsejtes, míg a szarvasmarhánál a korai és késői

nyolcsejtes állapotokat. A szarvasmarha esetében 8-20 egybegyűjtött embrió minták átlagos egy

embrió egyenértékű részében mértem az mRNS szinteket (IV). A protokolltól eltérően ebben a

kísérletben nem referencia gén expressziós értékével normalizáltam, hanem külső referenciával,

vagyis egy idegen eredetű, a mintákhoz hozzáadott ismert és azonos mennyiségű kontroll RNS -

észak-amerikai szentjánosbogár (Photinus pyralis) luciferáz gén (Promega, Madison, WI, USA)

- mért értékével. További eltérés volt a mennyiségi kiértékelésben, hogy a reakciónkénti egyedi

hatékonyságot vettem figyelembe a PCR készülék programjának (Comparative Quantitation

Analysis) segítségével.

Szarvasmarhában az Eif1a gén expresszióját nem sikerült mérni, a többi 4 gén a

petesejthez képest 3-5-szörös emelkedést mutatott a nyolcsejtes állapotig, ahol lecsökkent az

expressziójuk, majd a hólyagcsíra állapotig újra emelkedett (35. ábra). Az egérben nem kaptam

hasonló mintázatot. A késői kétsejtes állapotig enyhe csökkenést mutattak, és egyedül az Eif4e

62

34. ábra: A Pou5f1 gén expressziós mintázata in vitro nyúl embriókban.

A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve; a, b és c: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).

gén mutatott kisebb expressziós növekedést a késői kétsejtes állapottól kezdve (36. ábra).

63

35. ábra: A vizsgált gének expressziós mintázata szarvasmarha embriókban.

36. ábra: A vizsgált gének expressziós mintázata egér embriókban.

A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.

4.6 HDAC és HAT gének expressziójának meghatározása egér embriókban

A rendelkezésre álló ismeretek birtokában az eddig leírt 11 HDAC, 7 HAT gén és 3

referencia gén expressziós mintázatának mennyiségi összehasonlítására vállalkoztam az egér

preimplantációs egyedfejlődése során in vivo petesejtekben és a különböző stádiumú

embriókban. Az összesen 21 gén (Crebbp, Ep300, Gcn5l2, Hat1, Hdac1, Hdac2, Hdac3, Hdac4,

Hdac5, Hdac6, Hdac7, Hdac8, Hdac9, Hdac10, Hdac11, Htatip, Pcaf, Taf1, és referenciának:

H2afz, Hprt1, Ppia) expressziójának méréséhez az egy embrió korlátozott mennyisége miatt a

stádiumonként (petesejt, egy-korai és késői két-négy-nyolcsejtes, szedercsíra és hólyagcsíra) 6-6

egyedet kettéválasztottam, és csak háromban mértem a Hdac1-7 géneket, a másik háromban a

többi gént (IV). A működési és szerkezeti (szekvencia) hasonlóság nagyfokú a HDAC enzimek

esetében, ezért nagy hangsúlyt kapott a génspecifikus primerek tervezése a keresztreakciók

elkerülése miatt. A Hdac1 és Hdac2 géneket különös figyelemmel kísértem, mivel az

adatbázisban fellelhető információk a kísérlet tervezése és kivitelezése alatt megváltoztak.

Esetükben új primerek és mérések váltak szükségessé. A mennyiségi kiértékelésben a

reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem figyelembe a PCR készülék programjának

(Comparative Quantitation Analysis) segítségével. Több gén nem volt kimutatható a petesejtben,

mint kiindulási alapban (Hdac5, Hdac6, Hdac10, Pcaf), vagy egyik stádiumban sem (Hdac7,

Hdac11), így ezek esetében más, általában a kétsejtes stádiumhoz viszonyított expressziós

értékeket tüntettem fel.

A korai és késői kétsejtes állapotok közötti EGA, mint fontos választóvonal

szempontjából tekintve az eredményeket:

– a Hdac1 expressziója a petesejttől kezdve folyamatosan csökkent, majd az EGA alatt újra

megemelkedett és lassan csökkent le a további sejtosztódások alatt;

– a HDAC gének közül a Hdac3, Hdac8 és Hdac9 expressziója mutatott növekedést a kisebb

genom aktiváció alatt, a korai kétsejtes állapotig, majd folyamatos csökkent;

– az EGA alatt fejeződött ki legerősebben a Hdac5, Hdac6 és Hdac10, hasonlóan a HAT gének

közül a Crebbp és Pcaf;

– a petesejttől kezdve folyamatos csökkenés volt tapasztalható függetlenül az EGA-tól a Hdac2

és Hdac4, valamint az Ep300, Gcn5l2, Hat1, Htatip és Taf1 gének esetében (37-38. ábrák).

64

65

37. ábra: A HDAC gének expressziós mintázata egér embriókban.

A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.

38. ábra: A HAT gének expressziós mintázata egér embriókban.

A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.

5. Tárgyalás

5.1 Módszer fejlesztés

A két RT-PCR módszer összehasonlításából kiderült, hogy a real-time RT-PCR több mint

két nagyságrenddel érzékenyebb a végpont RT-PCR-nél, melyet a nagyobb mennyiségű

kiindulási mintával, embriók egybegyűjtésével lehet valamiképpen ellensúlyozni. Az egyedi

embriók, blasztomer sejtek génexpressziójának mennyiségi méréséhez azonban a real-time RT-

PCR az alkalmasabb. A megbízhatóság, a reprodukálhatóság tekintetében szintén ez a módszer

adott szignifikánsan jobb eredményt. Ez következik abból, hogy míg a real-time RT-PCR

esetében a reakcióelegy összeállítása után zárt csőben folyik a mérés a kísérletező személy

minden további beavatkozása nélkül, addig a végpont RT-PCR-nél több lépés is szükséges még,

amíg a denzitometriás mennyiségi értékek meghatározhatóak. Ezek a lépések egyenként növelik

a bevitt hibát, rontva a megbízhatóságot. A sokkal nagyobb különbségek másik oka, hogy a

reakció befejezésekor a végpontján mért értékek nem csak a kiindulási minta mennyiségével,

hanem a reakciót befolyásoló tényezőkkel, mint például a PCR hatékonyságának változásával, a

kiindulási anyagok csökkenésével, gátló anyagok felhalmozódásával is kapcsolatosak. Sok

esetben mégis használható eredményt ad a végpont RT-PCR is, amikor az embriók különböző

kezelések hatására adott átlagos, nagymértékű reakcióját vizsgálják és nem az egyedi, finom

különbségek kimutatása a cél. Az eredményeim összefüggésben állnak a mások által

tapasztaltakkal. A real-time RT-PCR-re korábban meghatározott 0,4 % relatív szórás a Ct-re

számítva (Wittwer és mtsai. 1997.), vagy 0-5 % (Bustin 2000.) és 14 % (Schmittgen és mtsai.

2000.) az RNS mennyiségére számítva, valamint a végpont RT-PCR 14 % (Zhang és mtsai.

1997.) és 45 % (Schmittgen és mtsai. 2000.) relatív szórás értékei összevethetők a sajátommal:

CV = 19 % (real-time RT-PCR) és CV = 38 % (végpont RT-PCR). A kismértékű eltérés az

általam alkalmazott magas mintaszámmal (n=30) magyarázható.

Ezt a real-time RT-PCR módszert sikerült tovább fejlesztenem egy teljes génexpressziós

protokollá a petesejtek, embriók gyűjtésétől kezdve az RNS kinyerésén és átírásán keresztül a

mennyiségi meghatározásig, illetve az adatok helyes kiértékeléséig, valamint jellemeztem a

rendszer alkalmasságát, érzékenységét. A protokoll kidolgozása során a technikai hibák két fő

összetevőjét határoztam meg: a PCR a teljes hiba nagy részét képezte és hasonló arányban járult

hozzá az mRNS izolálás is, míg az RT lépésnek nem volt számottevő szerepe. A teljes hibát a 6-6

embrió mintában mért relatív szóráshoz viszonyítva megállapítható, hogy az egyedek közt

kimutatható különbségek lényegesen nagyobbak a teljes protokoll technikai hibájánál, vagyis a

66

mért különbségek valóban a köztük lévő biológiai különbségekből eredtek, nem a mérési hibák

összességéből. Felvethető ugyanakkor, hogy a preimplantációs stádiumú embriók rendkívül

rugalmasak és képesek átmenetileg a génexpresszió szélsőséges változásait is elviselni. Ilyen

összehasonlítást eddig az irodalomban nem írtak le, ezt először állapítottam meg. Az általam

kidolgozott módszer ennél fogva alkalmas a biológiai különbségek okainak feltárására és újabb

tényezők azonosítására is. A mennyiségi, egy sejten alapuló mRNS expressziós kísérletekkel

ezeket az alapvető kérdéseket lehet megcélozni.

Emellett más real-time RT-PCR módszereket is leírtak, melyek szintén megbízhatóak,

azonban többségében csak egyes lépései, mint például az RNS kinyerés, az RT, a PCR, vagy az

adatelemzés alkalmazhatóságát tárgyalják részletesen és nem adnak egy teljes átfogó

módszertant (Jeong és mtsai. 2005., Stahlberg és mtsai. 2004., Larionov és mtsai. 2005., Skern és

mtsai. 2005.). Egyik tanulmányban például kétlépcsős egyesített (multiplex) PCR módszert

dolgoztak ki, mely egyszerre 20 gén mérésére is alkalmas egyetlen sejtből (Peixoto és mtsai.

2004.). Egy másik módszer, a PurAmp protokoll szintén új próbálkozás az egyedi sejtekből

egyszerre történő DNS és RNS tisztítás után a real-time PCR-rel való mennyiségi

meghatározásra, azonban gyakorlati megvalósítása komolyabb laboratóriumi felkészültséget,

speciális felszerelést is igényel, mint a steril környezet, termosztálható mikroszkópos berendezés,

pontos nl-es nagyságrendű kimérés üvegkapillárissal (Hartshorn és mtsai. 2005.). Az értekezés

készítése közben jelent meg egy új közlemény, melyben teljes körűen leírnak többféle mRNS

mennyiségi meghatározására szolgáló real-time RT-PCR módszert (Nolan és mtsai. 2006.b).

Hasonlóan a kidolgozott protokollomhoz az alapvető technikai lépések egységesítését célozza

meg a bennük rejlő ismert, de általában figyelembe nem vett hibalehetőségek kiküszöbölésére.

Másik megközelítési lehetőség akár egy minta összes mRNS-ének, a teljes

génexpressziós mintázatnak a mennyiségi meghatározására, összehasonlítására a mikrocsipen

alapuló kísérletek. Ezek óriási hátránya jelenleg, hogy az egyedi sejtekből kinyerhető mRNS

mennyiség nem elég a kimutatáshoz, ezért a mérést megelőzően a kiindulási kevés nukleinsav

mennyiségét RNS polimerázzal vagy PCR-rel sokszorosítják, mely a különböző szekvenciák

eloszlásának tekintetében nagyfokú hibalehetőséget rejt magában (Kamme és Erlander 2003.;

Kurimoto és mtsai. 2006.; Hartmann és Klein 2006.). Végeredményben a real-time RT-PCR

módszer nagyobb érzékenységet, megbízhatóságot és mérési tartományt nyújt összehasonlítva

más alternatív génexpressziós módszerekkel (Bustin 2000., Peixoto és mtsai. 2004.).

Hangsúlyozni kell azonban, hogy az ezzel a módszerrel nyert adatok csupán

pillanatfelvételek arról, hogy az adott mRNS-ből mennyi található az adott időpontban, az adott

67

sejtben, embrióban, vagy szöveti mintában. Amellett, hogy az értelmezhető eredmények

megszületéséhez precízen kell megtervezni a kísérletet és kiértékelni a mért adatokat, a

szabályozó RNS-ek, fehérjék mennyiségéről, aktivitásáról, és lehetőség szerint a metabolizmus

funkcióinak méréséről, valamint az epigenetikai változásokról nyert információkat is szükséges

hozzátenni a változó mRNS szintekből történő minden további biológiai következtetés

levonásához, diagnosztikai jelzőként való alkalmazásához (Taylor és mtsai. 2003.; Nolan és

mtsai. 2006.b).

A protokoll ellenőrzése során jelentős egyedi különbségeket tudtam kimutatni a

négysejtes egér embriók blasztomer sejtjei között a Nanog és Pou5f1 expressziójában, valamint a

nyolcsejtes embrióknál a Nanog expressziójában. Hasonló vizsgálatokban korábban már találtak

különbségeket egyedi emberi blasztomer sejtekben a Pou5f1 expressziójában (Hansis és mtsai.

2001.). Mindkét gén a később kialakuló hólyagcsíra állapotú embrió belső sejtcsomójában (ICM)

kifejeződő transzkripciós faktor. Amennyiben következetesen tapasztalható az ICM specifikus

gének expressziós különbsége a blasztomer sejtek között, feltehető, hogy ezek a különbségek

nagyon korai jelei a sejtek egy bizonyos fejlődési irányban való elköteleződésének. Ehhez

hasonló következtetésekre jutottak mások is az egérben, melyben a különbségek okainak térbeli

polaritásokat feltételeznek. Ennek bizonyítása azonban további kutatásokat igényel (Zernicka-

Goetz 2002.).

5.2 Mélyhűtés

A mélyhűtés hatására előidézett molekuláris változások ismeretének hiányosságait tártam

fel különböző stádiumú egér embriókban két különböző vitrifikációs módszer

összehasonlításával (vitrifikáció szilárd felületen (SSV) és műszalmában (ISV)). Az ISV

módszernél az egysejtes embriókban megemelkedett expressziós aktivitást tapasztaltam a

különböző stressz válaszban szerepet játszó vizsgált géneknél a felmelegítést követően 3 órával.

Ezek a különbségek eltűntek 10 órára, valamint később a hólyagcsíra állapotban. Érdekessége,

hogy az eljárás képes volt már az embrionális genom aktiváció előtt is gyors, kiugró

génexpressziót indukálni, mely aztán hamar lecsengett. Ezek a változások korai jelei lehetnek az

ISV-n átesett embriók csökkent életképességének. A nyolcsejtes embriók esetében nem találtam

ilyen egyértelmű összefüggéseket. Ennek okai lehetnek, hogy a 8 blasztomer sejt sokkal

összetettebb rendszert képez, melyben az egyedi sejtek is eltérően reagálhatnak, kiegyenlítve

egymás expressziós aktivitását, és hogy ilyenkor már az embrionális genom teljes aktivitással

működik. Több gén bevonásával, esetleg az egyedi sejtek vizsgálatával tovább lehet finomítani

az eredményeket. Az SSV embriók morfológiailag nem különböztek a kontrollhoz képest, a

68

génexpresszióban mégis észleltem finom különbségeket. Összehasonlítva a két mélyhűtési

módszert az SSV hatására kevésbé változott a különböző stressz gének expressziója és a

morfológiai, életképességbeli megfigyelések alapján is ez bizonyult hatékonyabbnak.

A referenciának választott háztartási gén (Actb) mérési eredménye arra mutat, hogy az

ISV hatással volt az expressziójára. Elképzelhető, hogy közvetve kihatott a gén szintű reakcióra

is a nagy mennyiségben alkalmazott krioprotektáns anyag a sejtek vázszerkezetének

befolyásával. Az irodalomban többen leírták például az Actb és a Gapdh alkalmatlanságát, mint

referencia gén (Radonić és mtsai. 2004.). Ebből levonható a következtetés, miszerint az Actb gén

nem megfelelő referencia az embrió mélyhűtési vizsgálatokban, és több más háztartási gén

vizsgálata is szükséges a legalkalmasabb(ak) kiválasztásához.

5.3 Egér embriók tenyésztése és a parthenogenetikus aktiválás

Az egérben a kétsejtes embrióban zajlik le az EGA, ezért a korai és késői kétsejtes

stádiumok különválasztásával a várható génexpressziós aktivitás változások is nyomon

követhetőek. Érdekes, eddig nem vizsgált megfigyelést tettem, miszerint a korai és késői

kétsejtes stádiumok között a legtöbb háztartási gén aktivitása is jelentősen változik az egér

embrióban. E mögött az a jelenség áll, hogy az anyai RNS-eket felváltják az embrió genomjáról

átíródó RNS-ek. Különösen fontos ezért a két stádium elkülönített vizsgálata, hogy az ilyenkor is

stabil referencia géneket ki lehessen választani.

A tenyésztési körülményeknek a génexpressziós mintázatra gyakorolt hatása régóta

ismert (Rinaudo és Schultz 2004.), azonban a háztartási génekre ilyen kiterjedten és egyedi,

különböző stádiumú embriókon még nem vizsgálták egyszerre in vivo, in vitro tenyésztésben és

parthenogenetikus aktiválásban is. A hólyagcsírák között talált szignifikáns különbségeket

részben magyarázza, hogy az in vitro és parthenogenetikus hólyagcsírák sejtszáma is

alacsonyabb volt. További összehasonlító vizsgálatokra van szükség azonban, hogy ennek a

pontosabb biológiai okai feltáruljanak.

A parthenogenetikus aktiválás nem váltott ki nagy hatást a különböző háztartási gének

expressziójára a korai egyedfejlődés során. A nyolcsejtes állapotban szinte azonos mintázatot

mutatott, mint az in vivo embrióké, ugyanakkor az in vitro tenyésztés önmagában is magasabb

expressziót eredményezett. Elsőként írtam le a parthenogenetikusan aktivált embriók

génexpressziójának vizsgálatát. Az aktiváció a testi sejtes klónozási eljárásnak (SCNT) is fontos

része, így az eredmények megfelelő kontrollként szolgálhatnak a későbbiekben.

A vizsgálat alapján sikerült kiválasztani három olyan stabilan expresszáló referencia gént

69

(H2afz, Hprt1 és Ppia), amelyek viszonylag állandó szinten fejeződnek ki a különböző

stádiumokban, beleértve a korai és késői kétsejtes állapotokat is, valamint az in vivo, in vitro és

parthenogenetikusan aktivált embriókban. Nagy előnye a megbízhatóságot tekintve, hogy egyedi

embriókban mértem a gének expresszióját. Hasonló vizsgálatokat végeztek már egéren, de

egyikben sem vállalkoztak ilyen kiterjedt és részletes elemzésre (Jeong és mtsai. 2005.; Willems

és mtsai. 2006.). A három legstabilabb gén expressziós értékei alapján kiszámoltam azokat a

normalizációs faktor értékeket, melyekkel elvégezhető a vizsgált gének normalizálása. Fontos

hangsúlyozni, hogy ezeket az értékeket csak abban az esetben lehet felhasználni a

kiértékelésekben, ha ugyanezeket a módszereket, protokollt, ugyanezen embrió stádiumokat és

tenyésztési körülményeket alkalmazták. A gyakran referenciának használt Actb gén mutatkozott

a legkevésbé stabilnak, melyet alátámaszt a korábban leírt mélyhűtési kísérletben tapasztalt

expressziós változás is.

5.4 Nyúl embriók egyedfejlődése és tenyésztése

A korábban egérben elvégzett referencia gének kiválasztásának mintájára a nyúlban is

hasonlóképpen jártam el. Ezidáig ilyen vizsgálatot - egyszerre 10 referencia gén, 7 stádiumon, in

vivo és in vitro egyedi embriókban - nem végeztek el annak ellenére, hogy a normalizáláshoz

megfelelő helyes referencia génekre nagy szükség van. A nyúlban a nyolcsejtes embrióban zajlik

le az EGA, ezért itt a korai és késői nyolcsejtes stádiumok különválasztása volt indokolt. Az

egérnél tapasztalt jelenséget itt is tapasztaltam, mely szerint több háztartási gén a legalacsonyabb

expressziót az EGA alatt mutatta, vagyis a nyolcsejtes állapotban.

A két tenyésztési csoportban mért génexpressziós stabilitási értékek hasonlósága alapján

feltehető, hogy az in vitro körülmények nagyon jól közelítik az in vivo állapotot, illetve a nyúl

embriók kevésbé érzékenyek az in vitro tenyésztési eltérésekre a háztartási gének

expressziójának vonatkozásában. Érdekes eredményt adott az Actb gén, mely az in vivo

mintákban stabil, ellenben az in vitro mintákban az egyik legkevésbé stabil volt. Ez ismét felveti,

hogy mint azt korábban az egérnél is tapasztaltam, az Actb gén a nyúlban sem alkalmas

referenciának a különböző kezelések során. Ennek biológiai okainak kiderítése a jövőben

tervezett. A három választott referencia gén (H2afz, Hprt1 és Ywhaz) mért expressziós értékeiből

kiszámolhatók a normalizációs faktor értékek, melyek általánosan felhasználhatók a jövőben

nyúlon végzendő génexpressziós vizsgálatokban.

Munkám során sikerült először azonosítani a két gént (Pou5f1 és Nanog) nyúlban, majd

meghatározni a Pou5f1 gén expressziójának szövet és fejlődési stádium specifikus mintázatát. Az

70

embriókban kapott eredményből látszik, hogy a petesejtből származó mRNS mennyisége

lecsökkent a nyolcsejtes állapotra és az ekkor lezajló EGA alatt maradt a legalacsonyabb szinten,

majd már az embrió genomjáról szintetizálódva újra emelkedett. Nagyon hasonlít az

irodalomban található, emberben (Abdel-Rahman és mtsai. 1995., Cauffman és mtsai. 2005.),

egérben (Pan és mtsai. 2002.) és szarvasmarhában (van Eijk és mtsai. 1999.) leírt expressziós

mintázatokra, mely további igazolást ad a referencia gének helytállóságához, a génexpressziós

protokoll megerősítéséhez is. A feltételezett Pou5f1 cDNS részlet az összehasonlító szekvencia

elemzések alapján a többi fajban leírt hasonló génekkel mutatott csak hasonlóságot, a DNS kötő

POU doménen belül (Pan és mtsai. 2002.). Időközben az emberi genom projekt kiterjesztése más

fajokra, többek között a nyúlra is, felgyorsította a nyúlon, mint modellállaton végzett kutatások

ütemét és leírták a Pou5f1 teljes szekvenciáját is a nyúl genom szekvenálás eredményeként (Shi

és mtsai. 2008.). Az általam leírt szekvencia összehasonlításakor teljes egyezést mutatott vele,

mely megerősítette a Pou5f1 gén azonosítását. A Nanog szekvenciánál egérben és emberben

nemrég leírt pszeudogének jelenlétéből eredő ellentmondások miatt a további vizsgálatokat

felfüggesztettem (Booth és Holland 2004.).

A nyúlon folytatott embriológiai kísérleteim úttörő jellegűek, jelenleg igen csekély

információ áll rendelkezésre a nyúl embrió preimplantációs fejlődését irányító gének

expressziójáról. Közvetlen felhasználója a kutatócsoport nyúl klónozási csoportja, ahol a sejtmag

átültetéses kísérletekből nyert klónozott embriók fejlődési potenciáljának elemzéseben

nélkülözhetetlenek a kapott eredmények. Továbbiakban célom a két gén teljes kódoló régiójának

molekuláris klónozása, a szekvencia meghatározása, valamint az általuk kódolt fehérjék nyúl

embrióban mutatott aktivitásának in situ hibridizációval történő vizsgálata. Várakozásaim szerint

eredményeim a pluripotencia kialakításában szerepet játszó gének és mechanizmusok jobb

megértéséhez vezetnek. Hosszabb távon pedig a csoport által végzett molekuláris biológiai

kutatás fontos eredményekkel szolgálhat az orvosbiológiai és biotechnológiai tudományok

számára.

5.5 Egér és szarvasmarha összehasonlítása

A szarvasmarhában leírt, választott gének expressziós mintázata jól követte a várt kisebb

és embrionális genom aktiváció eseményeit. Ugyanez az egérben kevéssé volt szembetűnő.

Ennek egyik magyarázata lehet, hogy a kiválasztott gének fajspecifikus expressziós különbségeit

sikerült kimutatni. Másrészről az egér esetében nehezebb szétválasztani a két genom aktivációt,

mivel az EGA korán, már a kétsejtes állapotban lezajlik, így az egysejtes állapotban lehet csak a

kisebb genom aktivációt kimutatni. Itt további, különböző időpontokban kinyert egysejtes

71

embriókat is bevonok a vizsgálatba, melyek mérése és kiértékelése jelenleg még folyik.

Az egyedfejlődés korai szakaszában az egyes fajok közötti különbségek jelentősek

lehetnek a génexpresszió, és a molekuláris szintű újraprogramozódás folyamatainak

vonatkozásában is. A kérődzők és az egér génexpressziós mintázata közti különbségek

természetének és következményeinek feltárására nem csak a haszonállatok tenyésztése, hanem

az ember egyedfejlődésének jobb, nagy testű emlősökön való modellezése tekintetében is

szükség van. A szarvasmarha embriók egyedfejlődése több vonatkozásban is sokkal inkább

hasonlít az emberéhez, mint az egéré, például a petesejt érésének időzítése, és ciklikus

természete, az embrionális genom késői aktivációja, a magzat fiziológiája és fejlődése, a hosszú

terhesség, és az ikerterhesség (Taylor és mtsai. 2003.). Ezért felvethető, hogy az egér általánosan

mégsem használható modell szervezetként. A szarvasmarhán (kérődzőkön) végzett

génexpressziós vizsgálatok lényegesen informatívabbak az emberben hasonlóan lejátszódó

folyamatok modellezésére. Ellenben alátámasztják az egér használhatóságát azok a jelenlegi,

emberi genomban tárolt információ „lefordítására” irányuló kezdeményezések a betegségek

nagyon pontos modellezéséhez, melyek során az egér összes génjének funkcióját jellemzik

mutagenezissel, molekuláris vizsgálatokkal és fenotipizálással. Ezek az egerek olyan

biogyógyászati kísérletekbe vonhatók majd be, amelyek beteg embereken nem lennének

lehetségesek (Rosenthal és Brown 2007.). Az ilyen és ehhez hasonló fajok közti

összehasonlítások hozzájárulnak továbbá az egyedfejlődési folyamatok evolúciós változásainak

megértéséhez is.

5.6 Hiszton kód szabályozása

Először sikerült részletesen meghatározni az összes eddig ismert hiszton-deacetiláz és

néhány fontosabb hiszton acetil-transzferáz gén expressziós mintázatát az egér preimplantációs

egyedfejlődése alatt, különös hangsúllyal a korai és késői kétsejtes állapotok közt lezajló EGA-

ra. Az eredmények érdekessége, hogy szinte mindegyik gén aktívan jelen volt már a petesejtben

is, és a különböző gének jellegzetes expressziós mintázatokat mutattak. Különösen a HDAC

gének közül többnek az expressziója is fokozódott a kisebb genom aktivációban, másik

részüknek pedig csak a embrionális genom aktiváció alatt volt magas az expressziós szintje. Ez

arra enged következtetni, hogy a különböző HDAC gének jól szabályozottan, egymást váltva

töltik be funkciójukat a preimplantációs egyedfejlődés során. Elképzelhető, hogy funkcionálisan

gén fölösleg (redundancia) áll fenn, vagyis az egyik gén működésének meghibásodása esetén a

többi képes ellensúlyozni annak speciális szerepét. Ugyanakkor a HAT gének legtöbbje már a

petesejtben felhalmozva jelen volt, és később a fejlődés alatt nem expresszálódtak kivéve kettőt,

72

melyek az EGA alatt szintén aktív expressziós szintet mutattak.

Ismerve a hiszton-deacetiláz és hiszton acetil-transzferáz enzimek epigenetikai

újraprogramozódásban betöltött szerepét a kromatin és a nukleoszómák betömörítésén és

fellazításán keresztül, feltehetően fontos szabályozó funkciót látnak el a génexpresszióban és

végeredményben a normálisan működő embrionális genomot eredményezik. A teljes expressziós

mintázat leírása elősegíti a hiszton acetiláció szabályozásának megértését és ezáltal a kritikus

összetevők meghatározását az újraprogramozódás során.

Ehhez hasonló érdekes megfigyelést közöltek egy tanulmányban nemrégiben, miszerint a

petesejtben a hímivarsejt eredetű kromatinon a HAT aktivitás van túlsúlyban, ezzel szemben a

testi sejtből átültetett sejtmagban az ellenkezője, vagyis a HDAC dominál a HAT aktivitás fölött

(Yoshida és mtsai. 2007.). Ez azt jelzi, hogy a petesejt képes szabályozni a hiszton acetiláció

homeosztázisát a kétféle aktivitás egyensúlyának változtatásával. Mások mikrochip mérések és

génszabályozó hálózatok elemzésével jutottak arra a következtetésre, hogy az összes jelenlévő

HDAC közül csak a Hdac1-nek van központi szerepe az egérben kétsejtes állapotra jellemző

általános transzkripciós gátoltság kialakításában (Zeng és Schultz 2005.; Schultz 2005.). A

megkezdett kísérletek folytatása egyéb embrió technológiával előállított (például klónozott)

embriók bevonásával segíteni fog a jelenség pontosabb hátterének, szereplőinek feltárásában.

5.7 Gyakorlati felhasználás, távlatok

A fehérjék és nukleinsavak olyan kivételes tulajdonságokkal rendelkező anyagok,

amelyek kiválóan alkalmasak önszerveződő molekuláris rendszerek építésére. Érdemes ellesni az

élő szervezetektől a bennük található, alulról építkező, molekuláris nanotechnológiát használó

rendszerek szerveződési elveit, megfejteni működésük mechanizmusát, hogy ezután létre

lehessen hozni új nanoméretű biotechnológiai eszközöket, gyógyászati alkalmazásokat.

A preimplantációs egyedfejlődés során több olyan kritikus molekuláris esemény zajlik,

például az EGA és az első sejt differenciálódás, melyek mögött epigenetikai folyamatok állnak és

amelyekhez szorosan kapcsolódnak a gének expressziós változásai is. Ezek molekuláris szintű

vizsgálata és jellemzése segíteni fog a különböző módon előállított (in vitro tenyésztett,

mélyhűtött, parthenogenetikusan aktivált, klónozott) „mesterséges” embriók életképességének,

valamint a módszerek hatékonyságának javításában, a klónozási problémák megoldásában, a

rendellenes egyedfejlődés okainak feltárásában, betegségek alapokainak tisztázásában, és új

gyakorlati alkalmazásokban való felhasználásában. Az eredmények a szaporodásbiológiában és a

jövő gyógyászatában (klinikai felhasználásban, sejtterápiákban és a regeneráló gyógyításban),

73

valamint a gyógyszerkutatás és fejlesztés folyamatában hasznosulhatnak. A genomika, a

farmakogenetika alkalmazása, az új biotechnológiai kutatási módszerek és az adatbázisok

összekapcsolása ma már nem csupán új gyógyszer célpontok azonosításában kínál eredményekre

vezető, gyors előrejutási lehetőséget, hanem olyan új gyógyszer-hatóanyagok kifejlesztésében is,

amelyek a fejlődési rendellenességekben (mint például a szellemi visszamaradottság) és a rákos

elváltozásokban nélkülözhetetlen, megváltozott epigenetikai állapotokat okozó szabályozókat

céloznak meg. Ezáltal az új generációs, biztonságos és hatékony gyógyszerek kifejlesztése az

orvostudomány gyakorlatát tökéletesítik (Li 2002.; Shi és mtsai. 2003.; Roses 2005.).

Hazánkban a gödöllői kutatócsoport állított elő elsőként testi sejtből klónozott állatot.

Klonilla, a klónozott egér 2006. november 6-án született meg. Kézenfekvő, hogy a jövőben

számos epigenetikai újraprogramozódási folyamat és génexpressziós változás vizsgálata válik

lehetővé klónozott, különböző fejlődési stádiumú embriókon is, melyhez kész, teljesen

kidolgozott, validált molekuláris eszközrendszert sikerült felállítani. Ennek révén remélhetőleg

felgyorsul az emlősök egyedfejlődését szabályozó epigenetikai folyamatok megismerése.

A tudományos kihívás az egyedi molekulák szerepének leírásán túl az, hogy érthetővé

váljon a különböző fehérjék összeállása szabályozó komplexekké és hogy ezek a fehérje

komplexek hogyan célozzák meg a specifikus géneket és kromoszómális régiókat. A napjainkban

kezdődő poszt-genomikai, epigenomikai kutatások célja pedig megérteni a genom egészének

komplexitását, szerkezetét és rendszerként való működését (Mikkelsen és mtsai. 2007.; Barski és

mtsai. 2007.). Az értekezésben leírt eredmények minden bizonnyal hozzájárulnak majd ezeknek

az epigenomikai eredményeknek a finomításához és igazolásához is.

74

6. Következtetések

Az értekezésben leírt kísérletekből született új tudományos eredményeim röviden

összegyűjtve:

(1) Kidolgoztam egy teljes mennyiségi génexpressziós protokollt a primer tervezési

eljárástól kezdve az adatok helyes kiértékeléséig, mely az egyedi embriók között kimutatott

biológiai különbségeknél jóval alacsonyabb technikai hibája révén alkalmas egyedi sejtekből,

embriókból egyszerre 10-15 gén mRNS szintjének meghatározására is. Alkalmazásával lehetővé

válik a biológiai különbségek okainak felismerése, a génexpresszió finomabb különbségeinek

felfedése és az eredmények pontosabb statisztikai elemzése. A négy- és nyolcsejtes embriók

blasztomer sejtjei között jelentős expressziós különbségeket mutattam ki, melyek a bizonyos

fejlődési irányban való elköteleződésük korai jelei lehetnek.

(2) A két mélyhűtési módszer összehasonlításából kiderült, hogy a gyors fagyasztás

sokkal hatékonyabb szilárd felületen, mint műszalmában. A vizsgált gének expressziós

változásait sikerült összefüggésbe hozni az embriók morfológiai, és életképességben tapasztalt

eltéréseivel. Az egyéni embriók szintjén történő real-time RT-PCR módszer új lehetőséget nyújt a

mélyhűtés okozta molekuláris események megértéséhez, olyan kulcsfontosságú marker gének

azonosításához, melyek a mélyhűtési módszerek további fejlesztését segítik.

(3) Kimutattam, hogy az in vitro tenyésztésnek és a parthenogenetikus aktiválásnak

jelentős hatása van a háztartási gének expressziójára a preimplantációs egyedfejlődés során,

vagyis alapos körültekintéssel kell meghatározni minden kísérlet előtt a normalizáláshoz

alkalmazott legstabilabb referencia géneket a félrevezető következtetések levonásának elkerülése

érdekében. Az egér embriók esetében egységesen a H2afz, Hprt1 és Ppia géneket találtam

alkalmasnak a különböző preimplantációs stádiumokban.

(4) A nyúl embriókban a H2afz, Hprt1 és Ywhaz génekről sikerült igazolni, hogy

expressziójuk a legstabilabb a korai egyedfejlődés alatt az in vivo és in vitro mintákban.

Azonosítottam a Pou5f1 (Oct-4) transzkripciós faktort a nyúlban és igazoltam, hogy jelen van a

preimplantációs egyedfejlődése során hasonlóan más emlős fajokhoz.

(5) A szarvasmarhában és az egérben jelentős és feltehetőleg fajspecifikus génexpressziós

különbségeket sikerült kimutatni az embrionális genom aktivációhoz kapcsoltan, mely mutatja az

egér, mint modell állat korlátait. A különböző fajokból nyert génexpressziós mintázatok

összehasonlításából következtetni lehet a molekuláris szintű újraprogramozódás folyamatainak

eltéréseire, azok konzervált voltára, valamint az evolúciós változásokra is.

75

(6) A preimplantációs egyedfejlődés alatt több hiszton-deacetiláz és hiszton acetil-

transzferáz együttes expresszióját mutattam ki, mely arra világít rá, hogy nem csak egy-egy gén

felelős az újraprogramozódásért és az embrionális genom aktivációért, hanem feltehetőleg

közösen, egymást kiegészítve töltik be a szerepüket. A folyamat részletes megértéséhez még

további átfogó vizsgálatok szükségesek.

Összegzésül: A kutatócsoport általános céljaihoz sikerült megteremtenem a molekuláris

biológiai hátteret és információt nyerni a génexpressziós eszközrendszer segítségével több, az

embrió technológiákat támogató vizsgálatban. A munkám során elvégzett kísérletek eredményei

igazolják a felállított rendszer alapelveinek helyességét a többváltozós elemzésekre és

bizonyítékát adják a széles spektrumú alkalmazhatóságának. Nyilvánvaló azonban, hogy még

jelentős erőfeszítést igényel az emlősök egyedfejlődésében szerepet játszó epigenetikai

folyamatoknak, a betegségekben megnyilvánuló zavaruknak a megismerése, és mesterséges

befolyásolása.

Az újonnan létrehozott eszközökkel jelentős előrelépés várható, idézve a szakterület

úttörőjének véleményét (Vastag 2001.):

Sheep cloner Ian Wilmut recently said that for human cloning to succeed,

"we need a step as big as the one that produced Dolly".

If that step ever comes, it will likely involve the nascent field of epigenetics.

76

Köszönetnyilvánítás

Mindenekelőtt köszönöm családomnak kitartó támogatásukat: Feleségemnek, hogy

szívvel-lélekkel velem volt mindvégig, és mindhárom Gyerekemnek, akik időközben sorba

„bekapcsolódhattak” munkámba.

Köszönettel tartozom Dr. Dinnyés Andrásnak, vezetőmnek mind a kutatócsoportban

biztosított kutatási lehetőségek, mind a felelősségteljes feladat felvállalása tekintetében.

Külön megköszönöm Prof. Gráf Lászlónak, és az ELTE Biokémia Tanszékének, hogy

szakmai műhelyükben folytathattam tanulmányaimat és bár kísérletes munkámat Gödöllőn

végeztem, hozzájuk is ugyanolyan szervesen tartoztam.

Hálásan köszönöm a gödöllői Genetikai Újraprogramozás Csoport alapító tagjainak,

kutatótársaimnak, valamint a kutatócsoport külföldi partnereinek a kísérleti munkában nyújtott

mindennemű segítőkészségüket, név szerint: Dr. Adorján Márta, Dr. Balogh Emese, Bara

Sándorné, Dr. Bodó Szilárd, Deák Edit, Dr. Görhöny Botond, Kungl Györgyi, Polgár

Zsuzsanna, Táncos Zsuzsanna, különösen: Duangjai Boonkusol, Dr. Mamo Solomon, Lucie

Nemcova, Jiri Kanka, Joseph W. Carnwath.

Munkám létrejöttéhez nyújtott legmeghatározóbb támogatását külön megköszönöm

oktatóimnak: Tania Nolan, Vladimir Benes, Stephen A. Bustin, Mikael Kubista.

Köszönöm a „B.E.Sz.T.”-nek a lelkesítő háttér biztosítását:

Végezetül de nem utolsó sorban szeretném ajánlani jelen munkámat volt tanáraimnak,

Klotz Istvánnénak, Wittmayer Zsuzsannának, Bálint Miklósnak, és volt vezetőimnek, Olasz

Ferencnek, Csomor Katalinnak, Dr. Thaler Györgynek, akik tudtukon kívül segítettek a

doktori iskola megkezdéséhez. Megköszönöm nekik is közvetett hozzájárulásukat.

77

A Kárpátok tetején

Irodalomjegyzék

Abdel-Rahman B, Fiddler M, Rappolee D, Pergament E. 1995 Expression of transcription regulating genes in human preimplantation embryos. Hum Reprod.; 10(10):2787-92.

Adenot PG, Mercier Y, Renard JP, Thompson EM. 1997 Differential H4 acetylation of paternal and maternal chromatin precedes DNA replication and differential transcriptional activity in pronuclei of 1-cell mouse embryos. Development.; 124(22):4615-25.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002a DNA and Chromosomes (The Global Structure of Chromosomes); in Molecular Biology of the Cell (Fourth Edition, Garland Science) pp. 191-234.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002b Cell Chemistry and Biosynthesis (The Chemical Components of a Cell); How Cells Read the Genome: From DNA to Protein (From DNA to RNA); in Molecular Biology of the Cell (Fourth Edition, Garland Science) pp. 47-128.; pp. 299-374.

Alonso S, Minty A, Bourlet Y, Buckingham M. 1986 Comparison of three actin-coding sequences in the mouse; evolutionary relationships between the actin genes of warm-blooded vertebrates. J Mol Evol.; 23(1):11-22.

Altmann M, Müller PP, Pelletier J, Sonenberg N, Trachsel H. 1989 A mammalian translation initiation factor can substitute for its yeast homologue in vivo. J Biol Chem.; 264(21):12145-7.

Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.; 25(17):3389-402.

Antequera F. 2003 Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci.; 60(8):1647-58.

Aoki F, Worrad DM, Schultz RM. 1997 Regulation of transcriptional activity during the first and second cell cycles in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol.; 181(2):296-307.

Ayane M, Preuss U, Köhler G, Nielsen PJ. 1991 A differentially expressed murine RNA encoding a protein with similarities to two types of nucleic acid binding motifs. Nucleic Acids Res.; 19(6):1273-8.

Bachvarova R. 1985 Gene expression during oogenesis and oocyte development in mammals. Dev Biol; 1:453-524.

Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K. 2007 High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell.; 129(4):823-37.

Bartolomei MS, Bickmore AW. 2005 Editorial Hum Mol Genet.; 14 Spec No 1:R1-2.

Beard C, Li E, Jaenisch R. 1995 Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryonic cells. Genes Dev.; 9(19):2325-34.

Bengtsson M, Stahlberg A, Rorsman P, Kubista M. 2005 Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Res.; 15(10):1388-92.

Blewitt ME, Vickaryous NK, Paldi A, Koseki H, Whitelaw E. 2006 Dynamic reprogramming of DNA methylation at an epigenetically sensitive allele in mice. PLoS Genet.; 2(4):e49.

Board PG, Coggan M, Baker RT, Vuust J, Webb GC. 1992 Localization of the human UBC

78

polyubiquitin gene to chromosome band 12q24.3. Genomics.; 12(4):639-42.

Boiani M, Eckardt S, Scholer HR, McLaughlin KJ. 2002 Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev.; 16(10):1209-19.

Booth HA, Holland PW. 2004 Eleven daughters of NANOG. Genomics.; 84(2):229-38.

Braun RE. 2001 Packaging paternal chromosomes with protamine. Nat Genet.; 28:10-12.

Brown TA. 2002 Transcriptomes and Proteomes; in Genomes (2nd Edition, Wiley-Liss) pp. 69-92.

Bulfield G. 1978 Genetic variation in the activity of the histidine catabolic enzymes between inbred strains of mice: a structural locus for a cytosol histidine aminotransferase isozyme (Hat-1). Biochem Genet.; 16(11-12):1233-41.

Bustin SA, Nolan T. 2004 Chemistries; Instrumentation; The PCR Step; in A-Z of Quantitative PCR (Ed) Bustin SA. (International University Line Biotechnology Series, 5) pp. 215-278.; pp. 329-358.; pp. 397-438.

Bustin SA. 2000 Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol.; 25(2):169-93.

Bustin SA. 2002 Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol.; 29(1):23-39.

Bustin SA. 2004 Quantification of nucleic acids by PCR; in A-Z of Quantitative PCR (Ed) Bustin SA. (International University Line Biotechnology Series, 5) pp. 3-46.

Butte AJ, Dzau VJ, Glueck SB. 2001 Further defining housekeeping, or "maintenance," genes Focus on "A compendium of gene expression in normal human tissues". Physiol Genomics.; 7(2):95-6.

Carrozza MJ, Utley RT, Workman JL, Côté J. The diverse functions of histone acetyltransferase complexes. Trends Genet. 2003 Jun;19(6):321-9.

Cauffman G, Van de Velde H, Liebaers I, Van Steirteghem A. 2005 Oct-4 mRNA and protein expression during human preimplantation development. Mol Hum Reprod.; 11(3):173-81.

Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, Lewis JL, Torres I. 1989 An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil.; 86(2):679-88.

Cheong HT, Kanagawa H. 1993a Assessment of cytoplasmic effects on the development of mouse embryonic nuclei transferred to enucleated zygotes. Theriogenology.; 39(2):451-61.

Cheong HT, Takahashi Y, Kanagawa H. 1993b Birth of mice after transplantation of early cell-cycle-stage embryonic nuclei into enucleated oocytes. Biol Reprod.; 48(5):958-63.

Cheung P, Lau P. 2005 Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants. Mol Endocrinol.; 19(3):563-73.

Chrivia JC, Kwok RP, Lamb N, Hagiwara M, Montminy MR, Goodman RH. 1993 Phosphorylated CREB binds specifically to the nuclear protein CBP. Nature.; 365(6449):855-9.

Clegg KB, Piko L. 1983 Poly(A) length, cytoplasmic adenylation and synthesis of poly(A)+ RNA in early mouse embryos. Dev Biol.; 95(2):331-41.

Cleveland DW, Lopata MA, MacDonald RJ, Cowan NJ, Rutter WJ, Kirschner MW. 1980 Number and evolutionary conservation of alpha- and beta-tubulin and cytoplasmic beta- and gamma-actin genes using specific cloned cDNA probes. Cell.; 20(1):95-105.

79

Coleman DL. 1962 Effect of genic substitution on the incorporation of tyrosine into the melanin of mouse skin. Arch Biochem Biophys.; 96:562-8.

Creagan R, Tischfield J, Ricciuti F, Ruddle FH. 1973 Chromosome assignments of genes in man using mouse-human somatic cell hybrids: mitochondrial superoxide dismutase (indophenol oxidase-B, tetrameric) to chromosome 6. Humangenetik.; 20(3):203-9.

Crew FAE, Mirskaia L. 1931 The character of "hairless" in the mouse. J Genet; 25:17-24

Crick F. 1970 Central dogma of molecular biology. Nature.; 227(5258):561-3.

de Ruijter AJ, van Gennip AH, Caron HN, Kemp S, van Kuilenburg AB. 2003 Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochem J.; 370(Pt 3):737-49.

DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA, Trent JM. 1996 Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet.; 14(4):457-60.

Derry JM, Barnard PJ. 1989 Localisation of the Ccg-1. gene on the mouse X chromosome. Cytogenet Cell Genet.; 51:988.

Derry JM, Kerns JA, Francke U. 1995 RBM3, a novel human gene in Xp11.23 with a putative RNA-binding domain. Hum Mol Genet.; 4(12):2307-11.

Diachenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Mogadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert D. 1996 Suppression Subtracive Hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.; 93(12): 6025-6030.

Dinnyes A, Dai Y, Jiang S, Yang X. 2000 High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod.; 63(2):513-8.

Dinnyes A, De Sousa P, King T, Wilmut I. 2002 Somatic cell nuclear transfer: recent progress and challenges. Cloning Stem Cells.; 4(1):81-90.

Earle WR, Schilling EL, Stark TH, Straus NP, Brown MF, Sbelton E. 1943 Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Nat. Cancer Inst.; 4:165-212.

Eberharter A, Becker PB. 2002 Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics. EMBO Rep.; 3(3):224-9.

Eckert J, Niemann H. 1995 In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of bovine oocytes in protein-free media. Theriogenology.; 43(7):1211-25.

Edashige K, Sakamoto M, Kasai M. 2000 Expression of mRNAs of the aquaporin family in mouse oocytes and embryos. Cryobiology.; 40(2):171-5.

Edwards RG. 2003 Aspects of the molecular regulation of early mammalian development. Reprod Biomed Online.; 6(1):97-113.

Elowitz MB, Levine AJ, Siggia ED, Swain PS. 2002 Stochastic gene expression in a single cell Science.; 297(5584):1183-6.

Engels WR. 1993 Contributing software to the internet: the Amplify program. Trends Biochem Sci.; 18(11):448-50.

FDA: A Risk-Based Approach to Evaluate Animal Clones and Their Progeny (http://www.fda.gov/cvm/CloningRA_ChapterIV.htm)

80

Fiering S, Whitelaw E, Martin DI. 2000 To be or not to be active: the stochastic nature of enhancer action. Bioessays.; 22(4):381-7.

Fuks F. 2005 DNA methylation and histone modifications: teaming up to silence genes. Curr Opin Genet Dev.; 15(5):490-5.

Gal AB, Carnwath JW, Dinnyes A, Herrmann D, Niemann H, Wrenzycki C. 2006 Comparison of real-time polymerase chain reaction and end-point polymerase chain reaction for the analysis of gene expression in preimplantation embryos. Reprod Fertil Dev.; 18(3):365-371.

Gilbert SF. 2006 The early development of vertebrates: Fish, birds, and mammals; in Developmental Biology (Eighth Edition, Sinauer Associates, Inc., Publishers) pp. 325-372.

Graves KH, Moreadith RW. 1993 Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos. Mol Reprod Dev.; 36(4):424-33.

Greider CW. 1990 Telomeres, telomerase and senescence. Bioessays.; 12(8):363-9.

Grunstein M. 1997 Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature.; 389(6649):349-52.

Gutierrez-Adan A, Behboodi E, Murray JD, Anderson GB. 1997 Early transcription of the SRY gene by bovine preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 48(2):246-50.

Handschumacher RE, Harding MW, Rice J, Drugge RJ, Speicher DW. 1984 Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A. Science.; 226(4674):544-7.

Hansis C, Tang YX, Grifo JA, Krey LC. 2001 Analysis of Oct-4 expression and ploidy in individual human blastomeres. Mol Hum Reprod.; 7(2):155-61.

Harlow GM, Quinn P. 1982 Development of preimplantation mouse embryos in vivo and in vitro. Aust J Biol Sci.; 35(2):187-93.

Hartmann CH, Klein CA. 2006 Gene expression profiling of single cells on large-scale oligonucleotide arrays. Nucleic Acids Res.; 34(21):e143.

Hartshorn C, Anshelevich A, Wangh LJ. 2005 Rapid, single-tube method for quantitative preparation and analysis of RNA and DNA in samples as small as one cell. BMC Biotechnol.; 5(1):2.

Hartshorn C, Rice JE, Wangh LJ. 2003 Differential pattern of Xist RNA accumulation in single blastomeres isolated from 8-cell stage mouse embryos following laser zona drilling. Mol Reprod Dev.; 64(1):41-51.

Hayashi S, Yang J, Christenson L, Yanagimachi R, Hecht NB. 2003 Mouse preimplantation embryos developed from oocytes injected with round spermatids or spermatozoa have similar but distinct patterns of early messenger RNA expression. Biol Reprod.; 69(4):1170-6.

Hoffert KA, Anderson GB, Wildt DE, Roth TL. 1997 Transition from maternal to embryonic control of development in IVM/IVF domestic cat embryos. Mol Reprod Dev.; 48(2):208-15.

Holliday R. 2005 DNA methylation and epigenotypes. Biochemistry (Mosc).; 70(5):500-4.

Hubbard TJ, Aken BL, Beal K, Ballester B, Caccamo M, Chen Y, Clarke L, Coates G, Cunningham F, Cutts T, Down T, Dyer SC, Fitzgerald S, Fernandez-Banet J, Graf S, Haider S, Hammond M, Herrero J, Holland R, Howe K, Howe K, Johnson N, Kahari A, Keefe D, Kokocinski F, Kulesha E, Lawson D, Longden I, Melsopp C, Megy K, Meidl P, Ouverdin B, Parker A, Prlic A, Rice S, Rios D, Schuster M, Sealy I, Severin J, Slater G, Smedley D, Spudich G, Trevanion S, Vilella A, Vogel J, White S, Wood M, Cox T, Curwen V, Durbin R, Fernandez-Suarez XM, Flicek P, Kasprzyk A, Proctor G, Searle S, Smith J, Ureta-Vidal A, Birney E. 2007 Ensembl 2007. Nucleic Acids Res.; 35(Database issue):D610-7.

81

Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. 2005 Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun.; 6(4):279-84.

Jaenisch R, Bird A. 2003 Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet.; 33 Suppl:245-54.

Jenuwein T, Allis CD. 2001 Translating the histone code. Science.; 293(5532):1074-80.

Jeong BC, Hong CY, Chattopadhyay S, Park JH, Gong EY, Kim HJ, Chun SY, Lee K. 2004 Androgen receptor corepressor-19 kDa (ARR19), a leucine-rich protein that represses the transcriptional activity of androgen receptor through recruitment of histone deacetylase. Mol Endocrinol.; 18(1):13-25.

Jeong YJ, Choi HW, Shin HS, Cui XS, Kim NH, Gerton GL, Jun JH. 2005 Optimization of real time RT-PCR methods for the analysis of gene expression in mouse eggs and preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 71(3):284-9.

Jones PA, Takai D. 2001 The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science.; 293(5532):1068-70.

Kamme F, Erlander MG. 2003 Global gene expression analysis of single cells. Curr Opin Drug Discov Devel.; 6(2):231-6.

Kanka J. 2003 Gene expression and chromatin structure in the pre-implantation embryo. Theriogenology.; 59(1):3-19.

Kao HY, Downes M, Ordentlich P, Evans RM. 2000 Isolation of a novel histone deacetylase reveals that class I and class II deacetylases promote SMRT-mediated repression. Genes Dev.; 14(1):55-66.

Kao HY, Lee CH, Komarov A, Han CC, Evans RM. 2002 Isolation and characterization of mammalian HDAC10, a novel histone deacetylase. J Biol Chem.; 277(1):187-93.

Kasai M, Komi JH, Takakamo A, Tsudera H, Sakurai T, Machida T. 1990 A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J Reprod Fertil.; 89(1):91-7.

Kawai J, Shinagawa A, Shibata K, Yoshino M, Itoh M, Ishii Y, Arakawa T, Hara A, Fukunishi Y, Konno H, Adachi J, Fukuda S, Aizawa K, Izawa M, Nishi K, Kiyosawa H, Kondo S, Yamanaka I, Saito T, Okazaki Y, Gojobori T, Bono H, Kasukawa T, Saito R, Kadota K, Matsuda H, Ashburner M, Batalov S, Casavant T, Fleischmann W, Gaasterland T, Gissi C, King B, Kochiwa H, Kuehl P, Lewis S, Matsuo Y, Nikaido I, Pesole G, Quackenbush J, Schriml LM, Staubli F, Suzuki R, Tomita M, Wagner L, Washio T, Sakai K, Okido T, Furuno M, Aono H, Baldarelli R, Barsh G, Blake J, Boffelli D, Bojunga N, Carninci P, de Bonaldo MF, Brownstein MJ, Bult C, Fletcher C, Fujita M, Gariboldi M, Gustincich S, Hill D, Hofmann M, Hume DA, Kamiya M, Lee NH, Lyons P, Marchionni L, Mashima J, Mazzarelli J, Mombaerts P, Nordone P, Ring B, Ringwald M, Rodriguez I, Sakamoto N, Sasaki H, Sato K, Schönbach C, Seya T, Shibata Y, Storch KF, Suzuki H, Toyo-oka K, Wang KH, Weitz C, Whittaker C, Wilming L, Wynshaw-Boris A, Yoshida K, Hasegawa Y, Kawaji H, Kohtsuki S, Hayashizaki Y; RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team and the FANTOM Consortium. 2001 Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection. Nature.; 409(6821):685-90.

Kayano T, Fukumoto H, Eddy RL, Fan YS, Byers MG, Shows TB, Bell GI. 1988 Evidence for a family of human glucose transporter-like proteins. Sequence and gene localization of a protein expressed in fetal skeletal muscle and other tissues. J Biol Chem.; 263(30):15245-8.

82

Khochbin S, Verdel A, Lemercier C, Seigneurin-Berny D. 2001 Functional significance of histone deacetylase diversity. Curr Opin Genet Dev.; 11(2):162-6.

Kidder GM. 2002 Trophectoderm development and function: the roles of Na+/K(+)-ATPase subunit isoforms. Can J Physiol Pharmacol.; 80(2):110-5.

Ko MS, Kitchen JR, Wang X, Threat TA, Wang X, Hasegawa A, Sun T, Grahovac MJ, Kargul GJ, Lim MK, Cui Y, Sano Y, Tanaka T, Liang Y, Mason S, Paonessa PD, Sauls AD, DePalma GE, Sharara R, Rowe LB, Eppig J, Morrell C, Doi H. 2000 Large-scale cDNA analysis reveals phased gene expression patterns during preimplantation mouse development. Development.; 127(8):1737-49.

Ko MS. 2004 Embryogenomics of pre-implantation mammalian development: current status. Reprod Fertil Dev.; 16(2):79-85.

Kozak LP, McLean GK, Eicher EM. 1974 X linkage of phosphoglycerate kinase in the mouse. Biochem Genet.; 11(1):41-7.

Kreuzer KA, Lass U, Landt O, Nitsche A, Laser J, Ellerbrok H, Pauli G, Huhn D, Schmidt CA. 1999 Highly sensitive and specific fluorescence reverse transcription-PCR assay for the pseudogene-free detection of beta-actin transcripts as quantitative reference. Clin Chem.; 45(2):297-300.

Kurdistani SK, Tavazoie S, Grunstein M. 2004 Mapping global histone acetylation patterns to gene expression. Cell.; 117(6):721-33.

Kurimoto K, Yabuta Y, Ohinata Y, Ono Y, Uno KD, Yamada RG, Ueda HR, Saitou M. 2006 An improved single-cell cDNA amplification method for efficient high-density oligonucleotide microarray analysis. Nucleic Acids Res.; 34(5):e42.

Kuznetsov VA, Knott GD, Bonner RF. 2002 General statistics of stochastic process of gene expression in eukaryotic cells. Genetics.; 161(3):1321-32.

Larionov A, Krause A, Miller W. 2005 A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics.; 6(1):62.

Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. 2007 Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics.; 23(21):2947-8.

Lechniak D. 2002 Quantitative aspect of gene expression analysis in mammalian oocytes and embryos. Reprod Biol.; 2(3):229-41.

Levsky JM, Singer RH. 2003 Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol.; 13(1):4-6.

Li E, Beard C, Jaenisch R. 1993 Role for DNA methylation in genomic imprinting. Nature.; 366(6453):362-5.

Li E. 2002 Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet.; 3(9):662-73.

Lighten AD, Hardy K, Winston RM, Moore GE. 1997 Expression of mRNA for the insulin-like growth factors and their receptors in human preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 47(2):134-9.

Livak KJ, Schmittgen TD. 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods.; 25(4):402-8.

Livak KJ. 1997 ABI Prims 7700 Sequencer detection system. User bulletin 2. PE Applied Biosystems: 1-36.

83

Lowe DG, Moran LA. 1986 Molecular cloning and analysis of DNA complementary to three mouse Mr = 68,000 heat shock protein mRNAs. J Biol Chem.; 261(5):2102-12.

Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. 1997 Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature.; 389(6648):251-60.

Mahlknecht U, Bucala R, Verdin E. 1999 Assignment of the histone deacetylase gene (Hdac3) to mouse chromosome 18B3 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet.; 84(3-4):192-3.

Mann MR, Bartolomei MS. 2002 Epigenetic reprogramming in the mammalian embryo: struggle of the clones. Genome Biol.; 3(2):REVIEWS1003.

Marmorstein R, Roth SY. 2001 Histone acetyltransferases: function, structure, and catalysis. Curr Opin Genet Dev.; 11(2):155-61.

Mathews DH, Disney MD, Childs JL, Schroeder SJ, Zuker M, Turner DH. 2004 Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc Natl Acad Sci U S A.; 101(19):7287-92.

McGraw S, Robert C, Massicotte L, Sirard MA. 2003 Quantification of histone acetyltransferase and histone deacetylase transcripts during early bovine embryo development. Biol Reprod.; 68(2):383-9.

Memili E, First NL. 2000 Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species. Zygote.; 8(1):87-96.

Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, Lieberman E, Giannoukos G, Alvarez P, Brockman W, Kim TK, Koche RP, Lee W, Mendenhall E, O'Donovan A, Presser A, Russ C, Xie X, Meissner A, Wernig M, Jaenisch R, Nusbaum C, Lander ES, Bernstein BE. 2007 Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature.;448(7153):553-60.

Misawa K, Nosaka T, Morita S, Kaneko A, Nakahata T, Asano S, Kitamura T. 2000 A method to identify cDNAs based on localization of green fluorescent protein fusion products. Proc Natl Acad Sci U S A.; 97(7):3062-6.

Missero C, Serra C, Stenn K, Dotto GP. 1993 Skin-specific expression of a truncated E1a oncoprotein binding to p105-Rb leads to abnormal hair follicle maturation without increased epidermal proliferation. J Cell Biol.; 121(5):1109-20.

Mitalipov SM, White KL, Farrar VR, Morrey J, Reed WA. 1999 Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate. Biol Reprod.; 60(4):821-7.

Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S. 2003 The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell.; 113(5):631-42.

Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W. 2005 Epigenetic reprogramming in mammals. Hum Mol Genet.; 14 Spec No 1:R47-58.

Mullis KB, Faloona FA. 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol.; 155:335-50.

Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003a Summary of mouse development; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 31-140.

Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003b Cryopreservation, rederivation,

84

and transport of mice; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 599-628.

Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003c Parthenogenesis, pronuclear transfer, and mouse cloning; Assisted reproduction: ovary transplantation, in vitro fertilization, artificial insemination, and intracytoplasmic sperm injection; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 541-564.; pp. 565-598.

Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003d Appendix 1: Buffers and Solutions; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 725-734.

Nicolson GL, Yanagimachi R, Yanagimachi H. 1975 Ultrastructural localization of lectin-binding sites on the zonae pellucidae and plasma membranes of mammalian eggs. J Cell Biol.; 66(2):263-74.

Niemann H, Wrenzycki C, Lucas-Hahn A, Brambrink T, Kues WA, Carnwath JW. 2002 Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning Stem Cells.; 4(1):29-38.

Nightingale KP, O'Neill LP, Turner BM. 2006 Histone modifications: signalling receptors and potential elements of a heritable epigenetic code. Curr Opin Genet Dev.; 16(2):125-36.

Nishiyama H, Itoh K, Kaneko Y, Kishishita M, Yoshida O, Fujita J. 1997 A glycine-rich RNA-binding protein mediating cold-inducible suppression of mammalian cell growth. J Cell Biol.; 137(4):899-908.

Nolan T, Hands RE, Bustin SA 2006b Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nat Protoc.; 1(3):1559-82.

Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006a SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Anal Biochem.; 351(2):308-10.

Oren M, Levine AJ. 1983 Molecular cloning of a cDNA specific for the murine p53 cellular tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A.; 80(1):56-9.

Owen DJ, Ornaghi P, Yang JC, Lowe N, Evans PR, Ballario P, Neuhaus D, Filetici P, Travers AA. 2000 The structural basis for the recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase gcn5p. EMBO J.; 19(22):6141-9.

Palmieri SL, Peter W, Hess H, Scholer HR. 1994 Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol.; 166(1):259-67.

Pan GJ, Chang ZY, Schöler HR, Pei D. 2002 Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res.; 12(5-6):321-9.

Pantaleon M, Harvey MB, Pascoe WS, James DE, Kaye PL. 1997 Glucose transporter GLUT3: ontogeny, targeting, and role in the mouse blastocyst. Proc Natl Acad Sci U S A.; 94(8):3795-800.

Peixoto A, Monteiro M, Rocha B, Veiga-Fernandes H. 2004 Quantification of multiple gene expression in individual cells. Genome Res.; 14(10A):1938-47.

Peterson CL, Laniel MA. 2004 Histones and histone modifications. Curr Biol.; 14(14):R546-51.

Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE. 2004 UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem.; 25(13):1605-12.

85

Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. 2002 Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res.; 30(9):e36.

Pfaffl MW. 2001 A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res.; 29(9):e45.

Piko L, Clegg KB. 1982 Quantitative changes in total RNA, total poly(A), and ribosomes in early mouse embryos. Dev Biol.; 89(2):362-78.

Pravtcheva D, Rabin M, Bartolomei M, Corden J, Ruddle FH. 1986 Chromosomal assignment of gene encoding the largest subunit of RNA polymerase II in the mouse. Somat Cell Mol Genet.; 12(5):523-8.

Quevillon S, Mirande M. 1996 The p18 component of the multisynthetase complex shares a protein motif with the beta and gamma subunits of eukaryotic elongation factor 1. FEBS Lett.; 395(1):63-7.

Quivy V, Calomme C, Dekoninck A, Demonte D, Bex F, Lamsoul I, Vanhulle C, Burny A, Van Lint C. 2004 Gene activation and gene silencing: a subtle equilibrium. Cloning Stem Cells.; 6(2):140-9.

Radonić A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A. 2004 Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun.; 313(4):856-62.

Rall WF, Fahy GM. 1985 Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature.; 313(6003):573-5.

Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003 Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett.; 339(1):62-6.

Ran Q, Pereira-Smith OM. 2000 Identification of an alternatively spliced form of the Tat interactive protein (Tip60), Tip60(beta). Gene.; 258(1-2):141-6.

Raser JM, O'Shea EK. 2005 Noise in gene expression: origins, consequences, and control. Science.; 309(5743):2010-3.

Rasmussen R. 2001 Quantification on the LightCycler; in Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications (eds) Meuer S, Wittwer C, Nakagawara K. (Springer Press, Heidelberg) pp. 21-34.

Reik W, Santos F, Dean W. 2003 Mammalian epigenomics: reprogramming the genome for development and therapy. Theriogenology.; 59(1):21-32.

Rinaudo P, Schultz RM. 2004 Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction.; 128(3):301-11.

Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. 1997 Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem.; 245(2):154-60.

Rosenthal N, Brown S. 2007 The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol.; 9(9):993-9.

Roses AD. 2005 Applying technologies towards safe and effective medicines. Biotechniques.;39(4):563-4.

Roth WW, Bragg PW, Corrias MV, Reddy NS, Dholakia JN, Wahba AJ. 1987 Expression of a gene for mouse eucaryotic elongation factor Tu during murine erythroleukemic cell differentiation. Mol Cell Biol.; 7(11):3929-36.

86

Ruddle FH, Roderick TH. 1968 Allelically-determined isozyme polymorphisms in laboratory populations of mice. Ann N Y Acad Sci.; 151(1):531-9.

Rudenko L, Matheson JC, Sundlof SF. 2007a Animal cloning and the FDA--the risk assessment paradigm under public scrutiny. Nat Biotechnol.; 25(1):39-43.

Rudenko L, Matheson JC. 2007b The US FDA and animal cloning: risk and regulatory approach. Theriogenology.; 67(1):198-206.

Sakkas D, Batt PA, Cameron AW. 1989 Development of preimplantation goat (Capra hircus) embryos in vivo and in vitro. J Reprod Fertil.; 87(1):359-65.

Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001a Appendix 1: Preparation of Reagents and Buffers Used in Molecular Cloning; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. A1.1

Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001b In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 8.1-8.113.

Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001c Gel Electrophoresis of DNA and Pulsed-field Agarose Gel Electrophoresis; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 5.1-5.86.

Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001d Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning; Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA; Appendix 8: Commonly Used Techniques in Molecular Cloning; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 1.1-1.162.; pp. 6.1-6.62.; pp. A8.1

Santoro R, Li J, Grummt I. 2002 The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet.; 32(3):393-6.

Santos F, Dean W. 2004 Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction.; 127(6):643-51.

Scarano MI, Strazzullo M, Matarazzo MR, D'Esposito M. 2005 DNA methylation 40 years later: Its role in human health and disease. J Cell Physiol.; 204(1):21-35.

Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW. 2000 Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal Biochem.; 285(2):194-204.

Schöler HR, Hatzopoulos AK, Balling R, Suzuki N, Gruss P. 1989 A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J.; 8(9):2543-50.

Schuettengruber B, Simboeck E, Khier H, Seiser C. 2003 Autoregulation of mouse histone deacetylase 1 expression. Mol Cell Biol.; 23(19):6993-7004.

Schultz GA. 1986 Molecular bioology of the early mouse embryo. Biol Bull.; 171: 291-309.

Schultz RM. 2002 The molecular foundations of the maternal to zygotic transition in the preimplantation embryo. Hum Reprod Update.; 8(4):323-31.

Schultz RM. 2005 From egg to embryo: a peripatetic journey. Reproduction.; 130(6):825-8.

Selander RK, Hunt WG, Yang SY. 1969 Protein polymorphism and genie heterozygosity in two European subspecies of the house mouse. Evolution.; 23:379-90.

87

Seshagiri PB, McKenzie DI, Bavister BD, Williamson JL, Aiken JM. 1992 Golden hamster embryonic genome activation occurs at the two-cell stage: correlation with major developmental changes. Mol Reprod Dev.; 32(3):229-35.

Shi JJ, Cai DH, Chen XJ, Sheng HZ. 2008 Cloning and characterization of the rabbit POU5F1 gene. DNA Seq.; 19(1):56-61.

Shi W, Zakhartchenko V, Wolf E. 2003 Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation.; 71(2):91-113.

Sittman DB, Graves RA, Marzluff WF. 1983 Structure of a cluster of mouse histone genes. Nucleic Acids Res.; 11(19):6679-97.

Skern R, Frost P, Nilsen F. 2005 Relative transcript quantification by quantitative PCR: roughly right or precisely wrong? BMC Mol Biol.; 6(1):10.

Smith CM, Haimberger ZW, Johnson CO, Wolf AJ, Gafken PR, Zhang Z, Parthun MR, Gottschling DE. 2002 Heritable chromatin structure: mapping "memory" in histones H3 and H4. Proc Natl Acad Sci U S A.; 99 Suppl 4:16454-61.

Sonna LA, Fujita J, Gaffin SL, Lilly CM. 2002 Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. J Appl Physiol.; 92(4):1725-42.

Stahlberg A, Kubista M, Pfaffl M. 2004 Comparison of reverse transcriptases in gene expression analysis. Clin Chem.; 50(9):1678-80.

Steuerwald N, Cohen J, Herrera RJ, Brenner CA. 1999 Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by real-time rapid cycle fluorescence monitored RT-PCR. Mol Hum Reprod.; 5(11):1034-9.

Strahl BD, Allis CD. 2000 The language of covalent histone modifications. Nature.; 403(6765):41-5.

Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD, Collins FS, Wagner L, Shenmen CM, Schuler GD, Altschul SF, Zeeberg B, Buetow KH, Schaefer CF, Bhat NK, Hopkins RF, Jordan H, Moore T, Max SI, Wang J, Hsieh F, Diatchenko L, Marusina K, Farmer AA, Rubin GM, Hong L, Stapleton M, Soares MB, Bonaldo MF, Casavant TL, Scheetz TE, Brownstein MJ, Usdin TB, Toshiyuki S, Carninci P, Prange C, Raha SS, Loquellano NA, Peters GJ, Abramson RD, Mullahy SJ, Bosak SA, McEwan PJ, McKernan KJ, Malek JA, Gunaratne PH, Richards S, Worley KC, Hale S, Garcia AM, Gay LJ, Hulyk SW, Villalon DK, Muzny DM, Sodergren EJ, Lu X, Gibbs RA, Fahey J, Helton E, Ketteman M, Madan A, Rodrigues S, Sanchez A, Whiting M, Madan A, Young AC, Shevchenko Y, Bouffard GG, Blakesley RW, Touchman JW, Green ED, Dickson MC, Rodriguez AC, Grimwood J, Schmutz J, Myers RM, Butterfield YS, Krzywinski MI, Skalska U, Smailus DE, Schnerch A, Schein JE, Jones SJ, Marra MA; Mammalian Gene Collection Program Team. 2002 Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci U S A.; 99(26):16899-903.

Suen KL, Bustelo XR, Barbacid M. 1995 Lack of evidence for the activation of the Ras/Raf mitogenic pathway by 14-3-3 proteins in mammalian cells. Oncogene.; 11(5):825-31.

Surani MA, Barton SC, Norris ML. 1984 Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature.; 308(5959):548-50.

Taylor J, Fairburn H, Beaujean N, Meehan R, Young L. 2003 Gene expression in the developing embryo and fetus. Reprod Suppl.; 61:151-65.

Telford NA, Watson AJ, Schultz GA. 1990 Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol Reprod Dev.;

88

26(1):90-100.

Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, Pfaffl MW. 2003 Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up. Nucleic Acids Res.; 31(20):e122.

Tsunaka Y, Kajimura N, Tate S, Morikawa K. 2005 Alteration of the nucleosomal DNA path in the crystal structure of a human nucleosome core particle. Nucleic Acids Res.; 33(10):3424-34.

Tsunoda Y, Kato Y. 1998 Not only inner cell mass cell nuclei but also trophectoderm nuclei of mouse blastocysts have a developmental totipotency. J Reprod Fertil.; 113(2):181-4.

Turner BM. 2000 Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays.; 22(9):836-45.

Vajta G. 2000 Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Anim Reprod Sci.; 60-61:357-64.

van Eijk MJ, van Rooijen MA, Modina S, Scesi L, Folkers G, van Tol HT, Bevers MM, Fisher SR, Lewin HA, Rakacolli D, Galli C, de Vaureix C, Trounson AO, Mummery CL, Gandolfi F. 1999 Molecular cloning, genetic mapping, and developmental expression of bovine POU5F1. Biol Reprod.; 60(5):1093-103.

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. 2002 Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol.; 3(7):RESEARCH0034.

Vastag B. 2001 Epigenetics is seen as possible key to cloning. JAMA.; 286(12):1438-40.

Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995 Serial analysis of gene expression. Science.; 270(5235):484-7.

Verdel A, Khochbin S. 1999 Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases. Coordinate expression of differentiation-dependent chromatin modifiers. J Biol Chem.; 274(4):2440-5.

Verschure PJ, van der Kraan I, de Leeuw W, van der Vlag J, Carpenter AE, Belmont AS, van Driel R. 2005 In vivo HP1 targeting causes large-scale chromatin condensation and enhanced histone lysine methylation. Mol Cell Biol.; 25(11):4552-64.

Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. 1998 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature.; 394(6691):369-74.

Walker NJ. 2002 Tech.Sight. A technique whose time has come. Science.; 296(5567):557-9.

Willems E, Mateizel I, Kemp C, Cauffman G, Sermon K, Leyns L. 2006 Selection of reference genes in mouse embryos and in differentiating human and mouse ES cells. Int J Dev Biol.;50(7):627-35.

Wilmut I, Beaujean N, de Sousa PA, Dinnyes A, King TJ, Paterson LA, Wells DN, Young LE. 2002 Somatic cell nuclear transfer. Nature.; 419(6907):583-6.

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. 1997 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature.; 385(6619):810-3.

Winston F, Allis CD. 1999 The bromodomain: a chromatin-targeting module? Nat Struct Biol.; 6(7):601-4.

Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP. 1997 Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques.; 22(1):130-1, 134-8.

Wrenzycki C, Herrmann D, Carnwath JW, Niemann H. 1998 Expression of RNA from

89

developmentally important genes in preimplantation bovine embryos produced in TCM supplemented with BSA. J Reprod Fertil.; 112(2):387-98.

Xu W, Edmondson DG, Roth SY. 1998 Mammalian GCN5 and P/CAF acetyltransferases have homologous amino-terminal domains important for recognition of nucleosomal substrates. Mol Cell Biol.; 18(10):5659-69.

Yang W, Musci TS, Mansour SL.1997 Trapping genes expressed in the developing mouse inner ear. Hear Res.; 114(1-2):53-61.

Yang WM, Inouye C, Zeng Y, Bearss D, Seto E. 1996 Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3. Proc Natl Acad Sci U S A.; 93(23):12845-50.

Yoshida N, Brahmajosyula M, Shoji S, Amanai M, Perry AC. 2007 Epigenetic discrimination by mouse metaphase II oocytes mediates asymmetric chromatin remodeling independently of meiotic exit. Dev Biol.; 301(2):464-77.

Zeng F, Baldwin DA, Schultz RM. 2004 Transcript profiling during preimplantation mouse development. Dev Biol.; 272(2):483-96.

Zeng F, Schultz RM. 2005 RNA transcript profiling during zygotic gene activation in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol.; 283(1):40-57.

Zernicka-Goetz M. 1994 Activation of embryonic genes during preimplantation rat development. Mol Reprod Dev.; 38(1):30-5.

Zernicka-Goetz M. 2002 Patterning of the embryo: the first spatial decisions in the life of a mouse. Development.; 129(4):815-29.

Zhang CL, McKinsey TA, Lu JR, Olson EN. 2001 Association of COOH-terminal-binding protein (CtBP) and MEF2-interacting transcription repressor (MITR) contributes to transcriptional repression of the MEF2 transcription factor. J Biol Chem.; 276(1):35-9.

Zhang J, Desai M, Ozanne SE, Doherty C, Hales CN, Byrne CD. 1997 Two variants of quantitative reverse transcriptase PCR used to show differential expression of alpha-, beta- and gamma-fibrinogen genes in rat liver lobes. Biochem J.; 321 (Pt 3):769-75.

Zhang K, Sridhar VV, Zhu J, Kapoor A, Zhu JK. 2007 Distinctive Core Histone Post-Translational Modification Patterns in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE.; 2(11):e1210.

Zhang X, Kidder GM, Zhang C, Khamsi F, Armstrong DT. 1994 Expression of plasminogen activator genes and enzymatic activities in rat preimplantation embryos. J Reprod Fertil.; 101(1):235-40.

Zheng P, Patel B, McMenamin M, Paprocki AM, Schramm RD, Nagl NG Jr, Wilsker D, Wang X, Moran E, Latham KE. 2004 Expression of genes encoding chromatin regulatory factors in developing rhesus monkey oocytes and preimplantation stage embryos: possible roles in genome activation. Biol Reprod.; 70(5):1419-27.

Zhu X, Chang KH, He D, Mancini MA, Brinkley WR, Lee WH. 1995 The C terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem.; 270(33):19545-50.

90

Függelékek

I. Hiszton módosítások és funkcióik

A napjainkig leírt és ismert hiszton módosításokat és a hozzájuk rendelt feltételezett

funkciókat a 6. táblázat tartalmazza.

Hiszton Aminosav Módosítás Feltételezett funkcióH2A S1 P Mitózis

K5 Ac Transzkripció aktiválásaK9 Ac Transzkripció aktiválásaK119 U SpermiogenezisT120 P Mitózis

H2AX S139 P DNS hibajavításH2B K5 Ac Transzkripció aktiválása

K12 Ac Transzkripció aktiválásaS14 P Programozott sejthalálK15 Ac Transzkripció aktiválásaK20 Ac Transzkripció aktiválásaS32 P Programozott sejthalálK120 U Meiózis

H3 T3 P MitózisK4 Ac Transzkripció aktiválásaK4 Me Aktív eukromatin (tri-Me), transzkripció elongáció/memória (tri-Me), transzkripció aktiválásaK9 Ac Hiszton depozíció, transzkripció aktiválásaK9 Me Géncsöndesítés (tri-Me), DNS metiláció (tri-Me), imprintingS10 P Mitózis, meiózis, transzkripció aktiválásaT11 P MitózisK14 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás, transzkripció elongációR17 Me Transzkripció aktiválásaK18 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás, DNS replikációK23 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK27 Ac Transzkripció aktiválásaK27 Me Géncsöndesítés, X kromoszóma inaktiváció (tri-Me)S28 P MitózisK36 Me Transzkripció elongáció, géncsöndesítés?K79 Me Aktív eukromatin, transzkripció elongáció/memória? U Spermiogenezis

H4 S1 P MitózisR3 Me Transzkripció aktiválásaK5 Ac Hiszton depozíció, transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK8 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK12 Ac Hiszton depozíció, telomer csöndesítés, transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK16 Ac Transzkripció aktiválása, DNS hibajavításK20 Me Géncsöndesítés (mono-Me)K59 Me Géncsöndesítés?

6. táblázat: Az ismert hiszton módosítások.

Ac: acetiláció, Me: metiláció, P: foszforiláció, U: ubiquitináció.

91

II. Egy sejt RNS tartalma

Egy tipikus emlős sejt 10-30 pg RNS-t tartalmaz, mely nem több mint a sejt egészének 1

%-a. A többsége, mint a transzfer RNS (tRNS) és riboszómális RNS (rRNS) nem tartozik a

fehérjéket kódoló hírvivő RNS-ekhez (mRNS), melynek mennyisége csupán 1-5 %-ot tesz ki,

függően a sejt típusától és fiziológiás állapotától (39. ábra). Ez körülbelül 360000 molekulának

felel meg, mely 12000 különböző génről íródik át, átlagosan 10-100 példányban vannak jelen és

átlagos méretük 1900 nukleotid (7. táblázat). Egyes mRNS-ek a teljes mRNS tartalomnak a 3 %-

át is kiteszik (gyakoriak), míg a nagy hányaduk nem éri el a 0,01 %-ot sem (8. táblázat). Ezek a

ritka mRNS molekulák csupán 1-10 példányban találhatóak meg a sejtekben, de 11000-féle gén

termékei és összességében az mRNS állomány 45 %-át alkotják (Alberts és mtsai 2002.b)

Totál RNS 10-30 pg

rRNS (28S, 18S, 5S) 80-85 %

tRNS, snRNS, alacsony molekulasúlyú RNS-ek

10-15 %

mRNS (átlagos méret: 1900 nukleotid)

2 (1–5) % (360000 (200000-2000000) darab)

7. táblázat: Egy tipikus emlős sejt RNS tartalma.

Csoport Darab/sejt (gyakoriság)

mRNS féleség/sejt

Ritka <30 (<0,004 %) >11000

Közepes 100-500 (<0,1 %) 500-1000

Gyakori >10000 (<3 %) <10

8. táblázat: Az mRNS-ek megoszlása a gyakoriságuk alapján.

Ettől az átlagos megközelítéstől nagymértékben eltérhet a preimplantációs állapotú

embrió sejtek RNS tartalma. Folytatva az egér példáján, a petesejttől hólyagcsíra stádiumig

meghatározták egy embrió mRNS és totál RNS mennyiségét is: 9. táblázat (Piko és Clegg 1982.,

Clegg és Piko 1983.).

Stádium RNS mennyiség mRNS darabszám

petesejt 0,35-0,43 ng 17000000 (20 pg)

egysejtes nincs adat 24000000

kétsejtes 0,24 ng 7000000

szedercsíra (8-16 sejt) 0,69 ng 13000000

hólyagcsíra (32 sejt) 1,47 ng 34000000

13 napos embrió 450 µg (13 µg)

9. táblázat: Különböző fejlődési stádiumú egér embriók RNS-tartalma.

92

39. ábra: Az RNS-ek megoszlása.

Zölddel az eukarióta, kékkel a bakteriális, pirossal a közös RNS fajták vannak jelölve; snRNS: kis sejtmagi RNS; snoRNS: kis sejtmagvacskában található RNS; scRNS: kis citoplazmatikus RNS; tmRNS: transzfer-hírvivő RNS. (Forrás: Brown 2002.)

III. A vizsgált gének szekvencia adatai

A szekvencia adatokat külön csoportosítottam egérre (10. táblázat), szarvasmarhára (11.

táblázat) és nyúlra (12. táblázat).

Gén rövid neve

Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)

Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)

mRNS hossza (nukleotid)/exonok száma/fehérje hossza (aminosav)

Actb ENSMUSG00000029580 (5: 143,664,795-143,668,403)

ENSMUST00000031564 (NM_007393.3)

1889/6/375

Bmp7 ENSMUSG00000008999 (2: 172,695,191-172,765,794)

ENSMUST00000009143 (NM_007557.2)

1964/7/430

Cenpf ENSMUSG00000026605 (1: 191,464,495-191,511,965)

ENSMUST00000027900 (NM_001081363.1)

11093/19/2,98

Cirbp ENSMUSG00000045193 (10: 79,630,584-79,634,398)

ENSMUST00000105365 (NM_007705.2)

1258/7/172

Crebbp ENSMUSG00000022521 (16: 4,084,048-4,213,390)

ENSMUST00000023165 (NM_001025432.1)

7493/31/2441

Dazap2 ENSMUSG00000000346 (15: 100,446,057-100,451,162)

ENSMUST00000000356 (NM_011873.2)

1828/4/168

Eef1e1 ENSMUSG00000001707 (13: 38,737,567-38,750,897)

ENSMUST00000001757 (NM_025380.2)

1032/4/174

Eif1a ENSMUSG00000057561 (18: 46,757,358-46,769,862)

ENSMUST00000078079 (NM_010120.4)

2862/3/144

Eif4e ENSMUSG00000028156 (3: 138,189,155-138,220,563)

ENSMUST00000029803 (NM_007917.3)

2882/8/217

Ep300 ENSMUSG00000055024 (15: 81,416,644-81,482,507)

ENSMUST00000068387 (NM_177821.6)

8749/31/2412

Gapdh ENSMUSG00000057666 (6: 125,111,872-125,115,613)

ENSMUST00000073605 (NM_008084.2)

1242/7/337

Gcn5l2 ENSMUSG00000020918 (11: 100,566,062-100,573,766)

ENSMUST00000006973 (NM_001038010.1; NM_020004.4)

3028/18/829

H2afz ENSMUSG00000037894 (3: 137,527,505-137,529,882)

ENSMUST00000041045 (NM_016750.2)

1011/5/128

Hat1 ENSMUSG00000027018 (2: 71,227,314-71,279,679)

ENSMUST00000028408 (NM_026115.3)

1579/11/416

Hdac1 ENSMUSG00000028800 (4: 129,193,348-129,219,890)

ENSMUST00000102597 (NM_008228.2)

1971/14/482

Hdac2 ENSMUSG00000019777 (10: 36,694,350-36,721,694)

ENSMUST00000019911 (NM_008229.2)

2004/14/488

Hdac3 ENSMUSG00000024454 (18: 38,096,625-38,114,642)

ENSMUST00000043498 (NM_010411.2)

2005/15/428

Hdac4 ENSMUSG00000026313 (1: 93,829,334-94,044,970)

ENSMUST00000008995 (NM_207225.1)

3952/26/910

Hdac5 ENSMUSG00000008855 (11: 102,057,063-102,091,486)

ENSMUST00000107152 (NM_001077696.1; NM_010412.3)

3796/27/1115

Hdac6 ENSMUSG00000031161 (X: 7,507,256-7,524,953)

ENSMUST00000033501 (NM_010413.2)

4006/29/1152

Hdac7 ENSMUSG00000022475 (15: 97,623,119-97,662,102)

ENSMUST00000088402 (NM_019572.2)

4120/24/938

93

Gén rövid neve

Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)

Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)

mRNS hossza (nukleotid)/exonok száma/fehérje hossza (aminosav)

Hdac8 ENSMUSG00000067567 (X: 99,479,978-99,700,698)

ENSMUST00000087916 (NM_027382.3)

1936/11/377

Hdac9 ENSMUSG00000004698 (12: 34,737,166-35,213,213)

ENSMUST00000085463 (NM_024124.2)

3248/25/582

Hdac10 ENSMUSG00000062906 (15: 88,953,741-88,959,057)

ENSMUST00000082197 (NM_199198.1)

2335/20/666

Hdac11 ENSMUSG00000034245 (6: 91,106,798-91,124,682)

ENSMUST00000041736 (NM_144919.2)

2510/10/347

Hist2h2aa2 ENSMUSG00000063954 (3: 96,049,461-96,050,038)

ENSMUST00000074976 (NM_178212.1)

578/1/130

Hprt1 ENSMUSG00000025630 (X: 50,341,255-50,374,829)

ENSMUST00000026723 (NM_013556.2)

1341/9/218

Hspa1a ENSMUSG00000067283 (17: 35,106,945-35,108,873)

ENSMUST00000087328 (NM_010479.2)

1929/1/642

Htatip ENSMUSG00000024926 (19: 5,603,017-5,610,050)

ENSMUST00000025865 (NM_178637.1)

1964/14/513

Nanog ENSMUSG00000012396 (6: 122,657,611-122,664,651)

ENSMUST00000012540 (NM_028016.2)

2186/4/305

Pcaf ENSMUSG00000000708 (17: 53,706,296-53,812,045)

ENSMUST00000000724 (NM_020005.3)

4653/18/813

Polr2a ENSMUSG00000005198 (11: 69,547,612-69,571,795)

ENSMUST00000058470 (NM_009089.2)

6283/29/1970

Pou5f1 ENSMUSG00000024406 (17: 35,642,984-35,647,722)

ENSMUST00000025271 (NM_013633.2)

1346/5/352

Ppia ENSMUSG00000071866 (11: 6,315,782-6,319,796)

ENSMUST00000090749 (NM_008907.1)

810/5/164

Rbm3 ENSMUSG00000031167 (X: 7,720,398-7,722,862)

ENSMUST00000115620 (NM_016809.4)

579/6/154

Sfrs3 ENSMUSG00000071172 (17: 29,169,618-29,179,039)

ENSMUST00000037776 (NM_013663.4)

1294/6/164

Slc2a3 ENSMUSG00000003153 (6: 122,677,843-122,692,537)

ENSMUST00000032476 (NM_011401.3)

3717/10/493

Sod1 ENSMUSG00000022982 (16: 90,220,987-90,226,567)

ENSMUST00000023707 (NM_011434.1)

646/5/154

Sod2 ENSMUSG00000006818 (17: 13,200,705-13,210,985)

ENSMUST00000007012 (NM_013671.3)

3824/5/222

Taf1 ENSMUSG00000031314 (X: 98,728,098-98,794,864)

ENSMUST00000033676 (NM_001081008.1)

5739/38/1891

Tbp ENSMUSG00000014767 (17: 15,636,852-15,654,373)

ENSMUST00000080441 (NM_013684.2)

1656/7/260

Trp53 ENSMUSG00000059552 (11: 69,393,483-69,405,373)

ENSMUST00000108658 (NM_011640.2)

1742/11/390

Tubb4 ENSMUSG00000062591 (17: 57,219,489-57,227,205)

ENSMUST00000071135 (NM_009451.3)

2228/4/444

Ubc ENSMUSG00000008348 (5: 125,866,347-125,870,111)

ENSMUST00000091367 (NM_019639.4)

2109/2/658

10. táblázat: Egér szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)

94

Gén neve(Szarvasmarha gén

rövid neve)

Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)

Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia

szekvencia)

mRNS hossz (nukleotid)/exon száma/

fehérje hossz (aminosav)

Cenpf - - (XM_612376.3) -

Dazap2 (NP_001029873.1)

ENSBTAG00000004349 (5: 27,873,627-27,877,833)

ENSBTAT00000002573 (NM_001034701.1)

1855/4/168

Eif1a - - (AF051848.1) -

Eif4e ENSBTAG00000007883 (26: 8,979,376-8,980,152)

ENSBTAT00000010367 (NM_174310.3)

654/4/217

Hist2h2aa2 (Q2VT23_BOVIN)

ENSBTAG00000032456 (3: 18,496,498-18,496,890)

ENSBTAT00000046028 (XM_001255499.1)

393/1/130

Sfrs3 (NP_001029872.1)

ENSBTAG00000003197 (5: 100,918,030-100,918,524)

ENSBTAT00000004154 (NM_001034700.1)

495/1/164

11. táblázat: Szarvasmarha szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)

Gén neve(Nyúl gén rövid neve)

Ensembl gén azonosító Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia

szekvencia)

mRNS hossz (nukleotid)/exon száma/

fehérje hossz (aminosav)

Actb - - (X60733) -

Eef1e1 (EEF1E1) ENSOCUG00000012587 ENSOCUT00000012580 (-)

297/2/99

G6pdx (G6PD) ENSOCUG00000007866 ENSOCUT00000007866 (-)

1302/12/434

Gapdh - - (NM_001082253.1) -

H2afz (H2AV_RABIT) ENSOCUG00000001888 ENSOCUT00000001883 (AF030235.1)

381/5/126

Hprt1 (O46381_RABIT) ENSOCUG00000003186 ENSOCUT00000003188 (AF020294.1)

657/10/218

Pgk1 (PGK1) ENSOCUG00000014726 ENSOCUT00000014723 (-)

1203/11/401

Polr2a (POLR2A) ENSOCUG00000017929 ENSOCUT00000017930 (-)

4950/42/1650

Pou5f1 (ENSOCUG00000017160)

ENSOCUG00000017160 ENSOCUT00000017155 (NM_001099957.1)

1083/6/360

Ppia (PPIA_RABIT) ENSOCUG00000016662 ENSOCUT00000016662 (AF139893.1)

426/5/142

Ywhaz (YWHAZ) ENSOCUG00000000734 ENSOCUT00000000734 (-)

738/6/245

12. táblázat: Nyúl szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)

95

IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása

A nyúl embrió mintában kimutatott PCR termék szekvenciájának összevetése az NCBI

referencia szekvencia adatbázisával (Reference mRNA sequences) a BLASTN 2.2.18 program

segítségével (Basic BLAST: nucleotide blast: blastn (blastn)) a következő eredményre vezetett:

89 %-os hasonlóság az emberi Pou5f1 génnel, 88 %-os hasonlóság a csimpánz (Pan troglodytes)

és szarvasmarha Pou5f1 génnel, 84 %-os hasonlóság az egér és patkány Pou5f1 génnel (40. ábra)

(Altschul és mtsai. 1997.). Az így talált ortológ szekvenciák homológia viszonyait a CLUSTAL

2.0.5 multiple sequence alignment program segítségével (ClustalW2) lehetett meghatározni: 41.

ábra (Larkin és mtsai. 2007.).

________________________________________________________________________________NCBI/ BLAST/ blastn/ Job Title: Nucleotide sequence (385 letters)BLASTN 2.2.18 (Mar-02-2008) Database: NCBI Transcript Reference Sequences (1,381,018 sequences; 2,272,579,530 total letters)Length=385

Sequences producing significant alignments:

Accession Description Total score Max identgi|116235490|NM_203289.3

Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), transcript variant 2, mRNA

517 89%

gi|114588002|XM_001135162.1

PREDICTED: Pan troglodytes similar to POU-type homeodomain-containing DNA-binding protein, transcript variant 2 (LOC735657), mRNA

499 88%

gi|27807048|NM_174580.1

Bos taurus POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), mRNA

493 88%

gi|125490391|NM_013633.2

Mus musculus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA

421 84%

gi|57164004|NM_001009178.1

Rattus norvegicus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA

421 84%

Alignments

>gi|116235490|ref|NM_203289.3| Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), transcript variant 2, mRNALength=1155

GENE ID: 5460 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Homo sapiens](Over 10 PubMed links)

Score = 517 bits (572), Expect = 2e-144 Identities = 345/385 (89%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||| |||||||||| ||||||||||| || |||||||| || || |||||||||Sbjct 396 CTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAG 455

Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||||||Sbjct 456 ATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAAC 515

Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 ||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||||||||Sbjct 516 CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAG 575

Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||| ||||||||||||Sbjct 576 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGT 635

96

Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 |||||||||||||||||||| ||||||||||| |||| | | ||||||||||||||||||Sbjct 636 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAG 695

Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || | || ||||| ||| ||||||| || |||| ||||||||||| || |||||||||Sbjct 696 GCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCAT 755

Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||||||||||||||||| ||||Sbjct 756 TTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCC 780

>gi|114588002|ref|XM_001135162.1| PREDICTED: Pan troglodytes similar to POU-type homeodomain-containing DNA-binding protein, transcript variant 2 (LOC735657), mRNALength=1392

GENE ID: 735657 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Pan troglodytes]

Score = 499 bits (552), Expect = 5e-139 Identities = 341/385 (88%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||| |||||||||| |||||||| || || |||||||| || || |||||||||Sbjct 646 CTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGACGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAG 705

Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| ||||||Sbjct 706 ATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAAC 765

Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 ||||||||||||||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||| |||||||||Sbjct 766 CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCGGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAG 825

Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 ||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||| | ||||||||||Sbjct 826 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGCGTGGTTCTGT 885

Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 |||||||||||||||||||| |||||||||||||||| | | ||||||||||||||||||Sbjct 886 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGTGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAG 945

Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || | || ||| | ||| ||||||| || |||| ||||||||||| || |||||| ||Sbjct 946 GCTGCTGGGTCTTCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCTAT 1005

Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||||||||||||||||| ||||Sbjct 1006 TTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCC 1030

>gi|27807048|ref|NM_174580.1| Bos taurus POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), mRNALength=1615

GENE ID: 282316 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Bos taurus](10 or fewer PubMed links)

Score = 493 bits (546), Expect = 2e-137 Identities = 337/380 (88%), Gaps = 0/380 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 |||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||||||||| || ||||||Sbjct 898 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAG 957

Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || ||||| || |||||||| ||||||||||| ||||||||||| |||||||| ||||||Sbjct 958 ATATGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAAC 1017

Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 ||||||||||||||| |||||| ||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| Sbjct 1018 CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAA 1077

Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 || |||||||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||| |||||||| || Sbjct 1078 ATTAGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGC 1137

97

Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| ||||||||||||Sbjct 1138 AACCGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAG 1197

Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || | || ||||| ||| ||||||| || | || | ||||||||| || |||||||||Sbjct 1198 GCTGCTGGGTCTCCTTTCACAGGGGGACCCGTATCCTCTCCTCTGGCGCCAGGGCCCCAT 1257

Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGG 380 || |||||||||||||| ||Sbjct 1258 TTTGGTACCCCAGGCTACGG 1277

>gi|125490391|ref|NM_013633.2| Mus musculus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNALength=1346

GENE ID: 18999 Pou5f1 | POU domain, class 5, transcription factor 1[Mus musculus] (Over 100 PubMed links)

Score = 421 bits (466), Expect = 1e-115 Identities = 324/385 (84%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||||||||| |||| ||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||||Sbjct 638 CTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAG 697

Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||||| || |||||||||Sbjct 698 ATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAAC 757

Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 || ||||| | | |||||| |||||| ||| |||||||||| ||| | || ||||||Sbjct 758 CGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAG 817

Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 |||| ||||||||| | ||||| ||||| ||||| || ||||| || || |||||||||Sbjct 818 ATCACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGT 877

Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 ||||||||||||||||||||| ||||||| | ||| | |||||||||||| || | ||||Sbjct 878 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAG 937

Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 || || || | || ||| |||||||| || | || ||||||||| | || || ||||| Sbjct 938 GCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCAC 997

Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || || |||||||||||||| ||||Sbjct 998 TTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCC 1022

>gi|57164004|ref|NM_001009178.1| Rattus norvegicus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNALength=1141

GENE ID: 294562 Pou5f1 | POU domain, class 5, transcription factor 1[Rattus norvegicus] (10 or fewer PubMed links)

Score = 421 bits (466), Expect = 1e-115 Identities = 324/385 (84%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 60 ||||||||||||||| |||| ||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||Sbjct 577 CTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG 636

Query 61 ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC 120 || |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||||||| || || |||||||||Sbjct 637 ATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGGACTAGCATTGAGAAC 696

Query 121 CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG 180 || ||||| | ||| ||||||||||||| |||||||||||||| ||| | |||||||||Sbjct 697 CGTGTGAGGTGGAACCTGGAGAACATGTTTCTGCAGTGCCCGAAGCCCTCCCTGCAGCAG 756

98

Query 181 ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT 240 |||| ||| ||| ||||||| ||||| |||| || ||||| || ||||||||||||Sbjct 757 ATCACTAGCATTGCCAAGCAGCTTGGGCTGGAGAGGGATGTGGTTCGAGTGTGGTTCTGT 816

Query 241 AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG 300 ||||||||||||||||| ||| |||| |||| ||| | |||||||||||| || | ||||Sbjct 817 AACCGGCGCCAGAAGGGGAAAAGATCGAGCATTGAATATTCCCAACGAGAAGAGTATGAG 876

Query 301 GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT 360 ||| | || || ||| |||||||| || |||| ||||||||| | || || ||||| Sbjct 877 GCCGCGGGGAAACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTGTCCTTTCCTCTGCCCCCAGGCCCCCAC 936

Query 361 TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||| | ||||||||||| ||||Sbjct 937 TTTGGTGCTCCAGGCTATGGGAGCC 961________________________________________________________________________________

40. ábra: A feltételezett nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának elemzése.

Az ábra rövidített és egyszerűsített formában mutatja az NCBI adatbázisban talált leghasonlóbb referencia szekvenciákat, és az illeszkedésüket.

________________________________________________________________________________ClustalW2 Results

Scores Table

SeqA Name Len(nt) SeqB Name Len(nt) Score===============================================================1 nyúl 385 2 ember 1417 89 1 nyúl 385 3 egér 1324 84 1 nyúl 385 4 patkány 1059 84 1 nyúl 385 5 szarvasmarha 1615 87 1 nyúl 385 6 csimpánz 1389 89 2 ember 1417 3 egér 1324 81 2 ember 1417 4 patkány 1059 83 2 ember 1417 5 szarvasmarha 1615 85 2 ember 1417 6 csimpánz 1389 99 3 egér 1324 4 patkány 1059 93 3 egér 1324 5 szarvasmarha 1615 78 3 egér 1324 6 csimpánz 1389 81 4 patkány 1059 5 szarvasmarha 1615 81 4 patkány 1059 6 csimpánz 1389 83 5 szarvasmarha 1615 6 csimpánz 1389 86 ===============================================================

Alignment

CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment

ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGAGCTGGAAGTGAAGGCCCGCATGGGGGACCTGCACCGAGAGTCTAGGAGTCTGGGGGC 60egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------

ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha TGGAGAGGGGCCTGGGTGGAGATCCCTGGCTTTCCCCTTCCAGACACCACCGCCACCAGC 120egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------

ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha AGGCAAACACCCTCCGCCTCAGTTTCTCCCACCCCCACGGTCCCTTCCCCCCACCCATCC 180egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------

99

ember ------------------------------------------------------------csimpánz ------------------------------------------------------------nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha AGGGGGCGGGGCCAGAGGTCAAGGCTAGTGGGTGGGATTGGGGAGGGAGAGAGGTGTTGA 240egér ------------------------------------------------------------patkány ------------------------------------------------------------

ember ----TCCCTTCGCAAGCCCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTTCCTTCCCC 56csimpánz -----------------CCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTTCCTTCCCC 43nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCAGTCTCTAGGAGATCCCTCGTTTTCCTAGGCCCCCGGCTCGGGGTGCCTTCCTTCCCC 300egér -----------GTGAGCCGTCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTCGGGGTGCCCACCTTCCCC 49patkány ------------------------------------------------------------

ember ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGAT 116csimpánz ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGAT 103nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha ATGGCGGGACACCTCGCTTCTGACTTCGCCTTCTCGCCCCCGCCGGGCGGTGGAGGCGAT 360egér ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTCCTCACCCCCACCAGG---TGGGGGTGAT 106patkány ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCTGG---TGGGGGTGAT 57

ember GGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGC 176csimpánz GGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGC 163nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGGCCGGGAGGGCCAGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGATGAGCTTCCAAGGG 420egér GGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATTCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGG 166patkány GGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGACCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAGGGG 117

ember CCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATT 236csimpánz CCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATT 223nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha CCTCCCGGTGGGTCGGGGATCGGGCCGGGGGTTGTGCCTGGCGCCGAGGTGTGGGGGCTT 480egér CCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGG------------CTCAGAGGTATTGGGGATC 214patkány CCTCCAAGTGGGCCTGGAATCGGACCAGG------------TTCAGAGGTGCTGGGGATC 165

ember CCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT 296csimpánz CCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT 283nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha CCCCCGTGCCCCCCGCCCTATGACTTGTGTGGAGGGATGGCCTACTGTGCGCCGCAGGTT 540egér TCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTT 274patkány TCCCCGTGTCCCCCAGCATACGAGTTCTGTGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTT 225

ember GGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGA 356csimpánz GGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGA 343nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGAGTGGGGCCGGTGCCCCCAGGCGGCCTGGAGACCCCTCAGCCCGAGGGCGAGGCGGGA 600egér GGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGA 334patkány GGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTCTGCAGCCCGAGGGCCAGGCAGGA 285

ember GTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGT 416csimpánz GTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGT 403nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCCGGGGTGGAGAGCAACTCCGAGGGGGCCTCCCCGGACCCCTGCGCCGCACCCGCAGGC 660egér GCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAAT 394patkány GCACGAGTGGAGAGCAACTCGGAGGGAGCCTCCTCTGGGCCCTGTACTGCCCGCCCCAGC 345

ember GCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAA 476csimpánz GCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAA 463nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCCCCGAAGCTGGACAAGGAGAAGCTGGAGCCGAACCCTGAGGAGTCCCAGGACATCAAA 720egér GCCGTGAAGTTGGAGAAGG------TGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAA 448patkány GCCGTGAAGTTGGAGAAGG------TGGAACCTAGTCCCGAGGAGTCCCAGGATATGAAA 399

ember GCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTG 536csimpánz GCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTG 523nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GCTCTTCAGAAAGACCTTGAACAATTTGCCAAGCTCCTAAAGCAGAAGAGGATCACACTA 780egér GCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTG 508patkány GCCCTGCAGAAGGAGCTAGAGCAGTTTGCCAAGCTGCTGAAACAGAAGAGGATCACCTTG 459

100

ember GGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC 596csimpánz GGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC 583nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGATATACCCAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC 840egér GGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC 568patkány GGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC 519

ember CAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTG 656csimpánz CAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTG 643nyúl ---------------------------------------------------------CTG 3szarvasmarha CAAACGACTATCTGCCGTTTTGAGGCTTTGCAGCTCAGTTTCAAGAACATGTGTAAGCTG 900egér CAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTG 628patkány CAGACAACCATCTGCCGCTTCGAGGCCCTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTG 579 ***

ember CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATA 716csimpánz CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATA 703nyúl CGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAGATT 63szarvasmarha CGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAGATA 960egér CGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATA 688patkány CGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAACCTTCAGGAGATA 639 ****** ***** **** *********** ** ******** ** ** ** ********

ember TGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGA 776csimpánz TGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGA 763nyúl TGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAACCGA 123szarvasmarha TGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAACCGA 1020egér TGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGT 748patkány TGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGGACTAGCATTGAGAACCGT 699 ***** * ** ***** *********** *********** ** ** ** ********

ember GTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATC 836csimpánz GTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATC 823nyúl GTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAGATC 183szarvasmarha GTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAAATT 1080egér GTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATC 808patkány GTGAGGTGGAACCTGGAGAACATGTTTCTGCAGTGCCCGAAGCCCTCCCTGCAGCAGATC 759 ***** * * ****** **** *** ********** *** * ** ***** **

ember AGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC 896csimpánz AGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC 883nyúl AGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGTAAC 243szarvasmarha AGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGCAAC 1140egér ACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAAC 868patkány ACTAGCATTGCCAAGCAGCTTGGGCTGGAGAGGGATGTGGTTCGAGTGTGGTTCTGTAAC 819 * *** *** * ***** ***** **** ** ***** ** ** ***** ** ***

ember CGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCT 956csimpánz CGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGTGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCT 943nyúl CGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAGGCC 303szarvasmarha CGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAGGCT 1200egér CGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCT 928patkány CGGCGCCAGAAGGGGAAAAGATCGAGCATTGAATATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCC 879 ** *********** ** **** ** * ** * * ***** ** ** * ******

ember GCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTT 1016csimpánz GCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTT 1003nyúl ACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCATTTC 363szarvasmarha GCTGGGTCTCCTTTCACAGGGGGACCCGTATCCTCTCCTCTGGCGCCAGGGCCCCATTTT 1260egér ACAGG-ACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTT 987patkány GCGGGGAAACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTGTCCTTTCCTCTGCCCCCAGGCCCCCACTTT 939 * ** ** *** ******* * * ** * ******* * ** ** ***** **

ember GGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCT 1076csimpánz GGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCT 1063nyúl GGTACCCCAGGCTATGGCAGCC-------------------------------------- 385szarvasmarha GGTACCCCAGGCTACGGGGGGCCTCACTTCACTACTCTGTACTCTTCGGTCCCATTCCCT 1320egér GGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACT---CAGTCCCTTTTCCT 1044patkány GGTGCTCCAGGCTATGGGAGCCCCCATTTCACCACACTCTACT---CGGTCCCTTTTCCT 996 ** * ******** ** * *

ember GAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1136csimpánz GAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1123nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GAGGGTGAGGTCTTTCCCTCGGTGTCTGTCACCGCTCTGGGCTCCCCTATGCATGCAAAC 1380egér GAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1104patkány GAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCTGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC 1056

101

ember TGAGGTGCCTGCCC-TTCTAGGAATGGGGGACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGGGAAAGAA 1195csimpánz TGAGGTGCCTGCCC-TTCTAGGAATGGGGGACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGGGAAAGAA 1182nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha TGAGGTGCCTGATCACCCCAGGAATAGGGGGCAGAGGAAGGGGAG-AGCTAGGGAGAGAA 1439egér TGAGGCACCAGCCCTCCCTGGGGATGCTGTG-AGCCAAGGCAAGGGAGGTAGACAAGAGA 1163patkány TGA--------------------------------------------------------- 1059

ember AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCATTCACTAAGGAAGGAATT 1255csimpánz AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCATTCACTAAGGAAGGAATT 1242nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha C-CCTGGGGTTTGTACCAGG-CCTTTGGGATTAAGTTTTTCATTCACTAAGAAAGGAATT 1497egér ACCTGGAGCTTTGGGGTTAAATTCTTTTACTGAGGAGGGATTAAAAGCACAACAGGGGTG 1223patkány ------------------------------------------------------------

ember GGGAACACAAAGGGTGG-GGGCAGGGGAGTTTGGGGCAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG 1314csimpánz GGGAACACAAAGGGTGG-GGGCAGGGGAGTTTGGGGCAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG 1301nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha GGGAACACAATGGGTGTTGGGGCAGGGAGTTTGGGGAAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG 1557egér GGGGGTGGGATGGGGAAAGAAGCTCAGTGATGCTGTTGATCAGGAGCCTGGCCTGTCTG- 1282patkány ------------------------------------------------------------

ember TTCAATGATGCTCTTGATTTTAATCCC-ACATCATGTATCACTTTTTTCTTAAATAAAGA 1373csimpánz TTCAATGATGCTCTTGATTTTAATCCC-ACATCATGTATCACTTTTTTCTTAAATAAAGA 1360nyúl ------------------------------------------------------------szarvasmarha TTCAATGATGCTCTTGACTTTAATCCCCACATCACTCATCACTTTGTTCTTAAATAAA-- 1615egér -TCACTCATCATTTTGTTCTTAAATAAAGACTGGACACACAGT----------------- 1324patkány ------------------------------------------------------------

ember AGCCTGGGACACAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1417csimpánz AGCCTGGGACACAGTAGATAGACACACTT--------------- 1389nyúl --------------------------------------------szarvasmarha --------------------------------------------egér --------------------------------------------patkány --------------------------------------------________________________________________________________________________________

41. ábra: A feltételezett nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása.

A tervezett primerek szürke kiemeléssel vannak jelölve a megfelelő szekvenciákon.

102

ÖsszefoglalásAz emlősök egyedfejlődésének kezdetén számos kulcsfontosságú molekuláris esemény jól

szervezetten megy végbe a preimplantációs embrióban, többek között az embrionális genom aktiváció és

az első sejt differenciálódás. A háttérben a két ivarsejt genetikai információja és annak leolvasása,

epigenetikai szabályozása, mint a DNS metiláció, a genomi imprinting, vagy a kromatin szerkezet

átrendeződése és a hiszton fehérjék módosításai állnak, melyek a génexpresszió szabályozásán keresztül

alakítják ki az embriók fejlődési programját. A modern embrió technológiai módszerek során a

megtermékenyítés és természetes folyamatok helyett mesterséges beavatkozással sikerül beindítani az

embrió fejlődését és a genom epigenetikai újraprogramozódását. Ezek a folyamatok és betegségekben

megnyilvánuló zavaruk feltárhatók lesznek, valamint az embriológiai módszerek alacsony hatékonysága is

javítható lesz a normális és a különböző módon előállított emlősállatokban való tanulmányozásukkal,

melyek összességében a mai modern biotechnológiai kutatásokat is szolgálják.

Az értekezésben leírt kutatások eredményeként sikerült kifejleszteni és jellemezni egy olyan

érzékeny, real-time RT-PCR-en alapuló mennyiségi génexpressziós módszert, mely alkalmas egyedi

embriókból és sejtekből egyszerre 10-15 gén mRNS szintjének meghatározására is (Gal és mtsai. 2006.

Reprod Fertil Dev. 18(3): 365-371.). A protokoll segítségével többféle alkalmazásban vizsgáltam az

embrió technológiai módszerek hatását és a preimplantációs egyedfejlődésben részt vevő gének szerepét.

Feltehetőleg a korai elköteleződés jeleit tudtam kimutatni négy- és nyolcsejtes egér embriók

blasztomer sejtjeiben (Baji Gál és mtsai. 2005. Állattenyésztés és Takarmányozás 54(3): 285-292.).

Az egér embriók szilárd felületen és műszalmában történő mélyhűtése során sikerült visszavezetni

az életképességbeli és hatékonyságbeli eltéréseket különböző stressz gének expressziós változásaira

(Boonkusol és mtsai. 2006. Mol Reprod Dev. 73(6): 700-708.).

Meghatároztam az in vivo, in vitro tenyésztett és parthenogenetikusan aktivált különböző stádiumú

egér és nyúl embriókban is a stabilan expresszáló háztartási géneket, melyek a későbbiekben alkalmasak

referenciának a génexpressziós vizsgálatok során. Az egér esetén ezek: H2afz, Hprt1 és Ppia (Mamo és

mtsai. 2007. BMC Dev Biol. 7(1): 14). A nyúl esetében: H2afz, Hprt1 és Ywhaz (Mamo és mtsai. 2008.

BMC Mol Biol. benyújtva). A nyúlban először mutattam ki a Pou5f1 (Oct-4) transzkripciós faktor

jelenlétét a preimplantációs egyedfejlődés során (Kiss és mtsai. 2008. Mol Reprod Dev. benyújtva).

Összehasonlítottam az egér és szarvasmarha embriókban több korai egyedfejlődésben szerepet

játszó gén expresszióját. A fajok között talált különbségek jelentős eltérésekre vezethetnek vissza a

molekuláris szintű újraprogramozódás és az embrionális genom aktiváció folyamataiban is.

Átfogó kísérletben vizsgáltam a hiszton acetilációs mechanizmus szabályozását, melyben több

hiszton acetil-transzferáz és a hiszton-deacetiláz együttes jelenlétét mutattam ki az egér embriókban.

103

SummaryDuring mammalian embryo preimplantation development, a number of key molecular events take

place, including the embryonic genome activation and the first cell differentiation among others. The genetic

information of the two gametes and their epigenetic regulation like DNA methylation, genomic imprinting,

chromatin remodeling and histone modifications stand behind them which together control embryonic

developmental program through gene expression. Currently, the new modern embryo technologies can

substitute natural fertilization and these artificial interventions can induce embryo development and

epigenetic reprogramming of the genome. Therefore, study of these embryos will bring new knowledge

about the molecular processes, underlying causes of developmental disorders and will help to improve the

biotechnological procedures. The new scientific results described in this thesis work are summarized below.

I successfully worked out a full sensitive real-time RT-PCR protocol for studying gene expression

quantitatively which makes it suitable to determine mRNA level of 10-15 genes simultaneously even from

single cells and embryos (Gal et al. 2006 Reprod Fertil Dev. 18(3): 365-371.). With its application I

measured effects of the embryo technologies and selected genes expressed during preimplantation

development.

I could presumably measure a very early sign of cell fate determination in blastomere cells of 4-cell

and 8-cell stage mouse embryos (Baji Gal et al. 2005 (Hungarian Journal of) Animal Production 54(3):

285-292.).

Comparison of solid surface vitrification and in-straw vitrification revealed direct correlation

between expression of the studied genes, and morphological alterations and survival rates of the mouse

embryos (Boonkusol et al. 2006 Mol Reprod Dev. 73(6): 700-708.).

I determined the most stable housekeeping genes in in vivo, in vitro cultured and

parthenogenetically activated mouse and rabbit embryos that are suitable for further gene expression studies.

For mouse, I selected H2afz, Hprt1 and Ppia genes (Mamo et al. 2007 BMC Dev Biol. 7(1): 14). For rabbit,

I selected H2afz, Hprt1 and Ywhaz genes (Mamo et al. 2008 BMC Mol Biol. submitted). Moreover, I also

identified and detected successfully the transcription factor Pou5f1 (Oct-4) during rabbit preimplantation

development (Kiss et al. 2008 Mol Reprod Dev. submitted).

I compared bovine and mouse gene expression changes through preimplantation development, and

the species-specific differences identified might point out differences in molecular processes of

reprogramming and embryonic genome activation.

I studied extensively the regulation of histone acetilation mechanism and detected several histone

deacetylases and acetyltransferases simultaneously in mouse preimplantation stage embryos.

104